JPH09288009A

JPH09288009A - 光学測定装置

Info

Publication number: JPH09288009A
Application number: JP10256296A
Authority: JP
Inventors: Kenji Yasuda; 賢二安田; Shinichiro Umemura; 晋一郎梅村
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1996-04-24
Publication date: 1997-11-04

Abstract

(57)【要約】【目的】微粒子をプローブとして用い、プローブを非
接触に捕獲して試料近傍を走査して、試料とプローブの
相互作用力の大きさをｎｍオーダーの分解能で観測する
装置を提供すること。【構成】プローブ微粒子の光学トラップのための機構
と、試料観察、解析のための機構からなる。レーザー光
源６で発生させた単色の平行光は対物レンズ５によって
集束光とされ蛍光微粒子１８が捕獲される。蛍光微粒子
１８は、光の集束点の移動により、溶液中を移動させら
れる。移動させながら微粒子の蛍光の偏光強度を連続的
に測定して移動した軌跡上に存在する試料２０の表面形
状が計測される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光学トラップを用
いた光学測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】光学顕微鏡技術は、細胞内の構成要素の
時間変化などの情報を、生体試料が生きた状態のまま直
接観察できる主力技術の一つである。最近の光学顕微鏡
観察技術の進歩は、対象試料の屈折率に依存した観察手
法の場合の分解能限界を、蛍光物質の発光現象を利用す
ることでサブナノメートルの領域まで拡張させることに
成功し、従来、電子顕微鏡でしか観察することのできな
かった蛋白質一分子の振る舞いを、試料固定のプロセス
を経ることなく、生きた状態のまま観察することが可能
となりつつある。

【０００３】また、生きた状態のまま試料を観察するこ
とができることから、試料の特定の要素の経時変化、例
えばpHの変化やカルシウムイオン濃度の変化などを、蛍
光物質の蛍光強度の変化に置き換えることで、時間分解
能と空間分解能をあわせ持った情報を取り出すことも可
能となりつつある。また、蛍光色素を特定の蛋白質に結
合させ、その蛍光色素の偏光を直交する２枚の偏光板で
観察することで、その蛋白質の配向、回転などの機能性
蛋白質の構造変化の情報を直接得ることができる。これ
らの技術については木下一彦らがジャーナル・オブ・セ
ル・バイオロジー (Journal of Cell Biology) 第１１
５巻６７−７１頁（１９９１年）で詳しく報告してい
る。

【０００４】集束光を用いた微粒子の捕獲技術はアーサ
ー・アシュキンらによって提案され、光学トラップ装置
として特許出願されている（特開平２−９１５４５）。
光学トラップでは、ポリスチレン球等の微粒子を光の集
束点に捕獲し、この集束点を移動させることで溶液中で
特定の微粒子を移動させることが可能となっている。ま
た、蛍光色素を付加したポリスチレン球なども実用化さ
れており、特に、表面にカルボキシル基あるいはアミノ
基を付加したポリスチレン球の表面に、反応残基を持つ
蛍光色素を共有結合させることで、任意の蛍光色素を付
けたポリスチレン球を作ることができる。

【０００５】ところで、走査型トンネル顕微鏡、走査型
原子間力顕微鏡などでは、プローブ針と試料の間のトン
ネル電流、原子間力を一定とするようにプローブ針の高
さを帰還制御し、そのプローブの高さを記録して試料の
表面形状を高い分解能で観察している。また、プローブ
となる蛋白質を付加したポリスチレン球を光トラップ
し、この微粒子が光ピンセットによって作り出されたポ
テンシャル勾配をどの程度登るかポテンシャル勾配の極
小点からの微粒子の変位量を顕微鏡観察することによっ
て、プローブが受けている外力を見積もる研究もネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３７７巻２５１頁から２５４頁
に報告されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来の技術では、試料
とプローブとの相互作用の力の大きさを見積もるのにプ
ローブ針を用いており、走査型トンネル顕微鏡、走査型
原子間力顕微鏡などでは、プローブ針と試料の間のトン
ネル電流、原子間力を一定とするようにプローブ針の高
さをピエゾアクチュエーターで帰還制御し、そのプロー
ブの高さを記録して試料の表面形状を観察したりしてい
るが、これら従来の技術では、プローブ針を用いるた
め、細胞等の生物試料の表面形状を細胞膜を破壊するこ
となく測定することは困難であった。

【０００７】また、光ピンセットを用いた微粒子の変位
量観察から求めた相互作用力測定技術においても、プロ
ーブを付加した微粒子を光ピンセットで捕獲し、光ピン
セットが作り出すポテンシャル場を走査し、そのときの
微粒子の位置を観察すれば細胞膜を破壊することなく細
胞中の相互作用力分布を測定することは可能となるが、
従来の光学顕微鏡の空間分解能では、特に深さ方向（Ｚ
軸方向）に関する微粒子の動きをｎｍレベルで観測する
ことは難しかった。

【０００８】本発明は、光学的な異方性を持つ微粒子に
プローブを付加して用い、プローブを非接触に捕獲した
状態で、ＡＦＭと同様に、試料近傍を走査して、試料と
プローブの相互作用力の大きさをｎｍオーダーの分解能
で観測する手段を有する装置を提供することを目的とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
には、光学的な異方性を持つ微粒子の一端にプローブを
その重心から偏心した位置に付加し、また、偏光を持っ
た蛍光色素を前記プローブの表面に付着させ、集束光を
用いた光学トラップ装置を用いて前記微粒子を捕獲し、
この集束点を移動させることでこの微粒子の位置を移動
（走査）させ、溶液中の任意の位置における蛍光微粒子
のプローブと試料との相互作用力によって、プローブ微
粒子が傾く割合を、このプローブ微粒子が発生する蛍光
強度の成分の変化を分析して見積もる。

【００１０】

【発明の実施の形態】偏光を持つ蛍光色素を付加した光
学的な異方性を持つ微粒子を光学トラップによって捕獲
し、この光学トラップの集光点を移動させることで、微
粒子を溶液中で自在に移動させることができる。このと
き、微粒子の重心より偏心した位置に特定のプローブを
付着させることで、プローブと試料との相互作用の大き
さに応じて、光学トラップ中で微粒子は傾く。この傾き
の大きさを、微粒子表面に付着した蛍光色素の偏光の直
交する２成分の強度の比の変化、あるいは、偏光の一つ
の成分の強度の全体の強度に対する比の変化から見積も
ることができる。

【００１１】実施例図１に、本発明の代表的な実施例の装置構成図を示す。
本装置は、集束光を試料溶液中に作り出す機構と、試料
観察、解析のための機構からなる。

【００１２】集束光を試料溶液中に作り出す機構は、以
下のような構成になっている。レーザー光源６で発生さ
せた単色の平行光は、半透鏡７で対物レンズ５に導入さ
れる。導入されたレーザー光は対物レンズ５の働きで試
料を含む溶液４中に集束される。また、この集束された
レーザー光の集束点の位置は、半透鏡７を走査機構１５
によって動かすことによって移動させることができ、試
料をＸ−Ｙ方向に走査することができる。走査機構１５
による半透鏡７の動かし方は、半透鏡の傾きを変えるこ
と、半透鏡を試料台（試料を載せた台）と平行にあるい
は垂直に移動させることのいずれでもよい。また、試料
台をレーザー光の光軸方向に移動させることでＺ方向へ
の移動を与えることができる。

【００１３】この集束光を試料溶液中に作り出す機構の
レーザー光源６の波長を、蛍光物質の励起波長の２倍波
長で用いれば２光子吸収の原理によって、試料溶液中の
光の集束点近傍のみの蛍光色素を選択的に励起させるこ
とができる。

【００１４】また、対物レンズ５による集束光を試料溶
液中に作り出す機構を用いることでその焦点位置に微粒
子の光トラップを行うことができる。すなわち、その集
束点の近傍に集束レーザー光が生み出す勾配力場が発生
することから、この勾配力場によって溶液中に浮遊する
蛍光微粒子１８は捕獲される。図２に、このような集束
光によって蛍光微粒子１８が捕獲された様子を示す。試
料２０は２枚のカバーグラス１７、１７２の間の溶液４
中に置かれる。本実施例では、試料２０は集束レーザー
光の透過に対しては溶液４と同等であり、集束レーザー
光の蛍光微粒子１８に対する捕獲作用にとってみればな
んら影響するところはない。対物レンズ５を通じて集束
したレーザー光にトラップされた蛍光微粒子１８は集束
レーザー光の位置を移動させることで移動することがで
きる。

【００１５】この蛍光微粒子１８は光学的な異方性、す
なわち、機械的に対称な中心機械軸を持っており、この
中心機械軸が集束レーザー光の中心光軸に一致するとき
はその状態で安定した状態となる。しかし、中心機械軸
と中心光軸とが一致しないときは、両者が一致する方向
に蛍光微粒子１８はトルクを受ける。さらに蛍光微粒子
１８には、その中心機械軸の重心から偏心した位置、す
なわち、中心機械軸の先端部分にプローブ１９が付加さ
れている。プローブ１９は抗体や疎水性微粒子等の材料
を主体に形成されており、励起光を受けて偏光した蛍光
を発する。蛍光微粒子１８がＸ−Ｙ方向に走査されて試
料２０とぶつかると、蛍光微粒子１８は集束レーザー光
にトラップされた状態にあるから、プローブ１９が試料
２０の表面に沿って持ち上げられ、光学トラップ中での
蛍光微粒子１８の傾きが変化し、プローブ１９も蛍光微
粒子１８とともに傾くことになる。その結果、蛍光の縦
偏光と横偏光との強度の比が変化することになる。

【００１６】図３に、実際に試料２０上を蛍光微粒子１
８で走査する場合の様子をより具体的に示す。点線は前
記微粒子の重心の位置の高さを示す。前記蛍光微粒子は
試料２０と接する前は１８１、１８２に示すように、水
平に保たれているが、プローブ１９が試料２０に接する
ことによって１８３、１８４のように試料表面と微粒子
の重心との距離に応じて傾いてゆく。したがって、この
蛍光微粒子１８のプローブ１９の傾きの大きさを見積も
ることで、試料２０と微粒子１８の重心との距離の情報
を得ることができる。

【００１７】試料表面の状況を、ＡＦＭと同様に、試料
の凹凸に応じて追従して検出する様子を図４に示す。図
４では、蛍光微粒子１８の高さ情報から微粒子１８の傾
きが一定となるように、試料ステージの高さをピエゾア
クチュエーター２１で制御する。たとえば、蛍光微粒子
１８がカバーガラス１７の表面に接している状態におい
て、ある傾きを持つように設定する。この状態から、蛍
光微粒子１８を走査のために水平方向に移動させると、
プローブ１９が試料２０により持ち上げられると符号１
８６で示す位置の蛍光微粒子１８はより大きく傾く。こ
の傾きを検出し、試料ステージの高さをピエゾアクチュ
エーター２１により、対物レンズ５のほうに移動させ、
蛍光微粒子１８の傾きを元に戻す。逆に、蛍光微粒子１
８が試料２０の表面に沿って下がってくるときは、蛍光
微粒子１８の傾きは小さくなる。この傾きの減少を検出
し、試料ステージの高さをピエゾアクチュエーター２１
により、対物レンズ５から離れる方向に移動させ、蛍光
微粒子１８の傾きを元に戻す。この様にして蛍光微粒子
１８が図に示す１８７、１８８の位置からさらに１８９
の位置の方向に走査されると、試料ステージの対物レン
ズ５に対する相対位置変化は試料の凹凸に応じて追従し
たものとして検出できることになる。

【００１８】図４に示す線２３は、このようにして得ら
れる試料ステージの対物レンズ５に対する相対位置変化
を示す線であるが、図では、カバーグラス１７の位置を
固定して示してあるので、逆転したものとして示されて
いる。したがって、この試料ステージの対物レンズ５に
対する相対位置変化を変位測定部２２で測定すれば、試
料の形状変化に追従した信号を得ることができる。勿
論、試料ステージの対物レンズ５に対する相対位置変化
は、試料ステージの位置を制御する為にピエゾアクチュ
エーター２１に対して与えられる信号がこれを表わして
いるから、これを表面形状信号として利用するものとす
れば、変位測定部２２は省略することもできる。

【００１９】試料観察、解析の機構は以下のような構成
になっている。水銀ランプ、ハロゲンランプ等の励起用
の照射光源１より放射された白色光は反射鏡２でコンデ
ンサー３に導入される。コンデンサー３を通過した光は
試料を含む溶液４に入射し、蛍光微粒子１８のプローブ
１９を励起するとともに、対物レンズ５を通過して半透
鏡８に達する。半透鏡８で分割された光の一方は、レー
ザー光源の波長の光を遮断するフィルター８１を通して
テレビカメラ１１０に送られる。テレビカメラ１１０で
撮られた試料を含む溶液の全体像は、そのまま、画像記
憶部１２、画像処理解析部１３、モニター１４に送られ
る。半透鏡８で分割された光のもう一方は、半透鏡９を
経て、蛍光微粒子１８のプローブ１９が発する蛍光のみ
を透過するフィルター９１通過後に偏光子９２で特定の
直線偏光成分のみを通過させ、その後段のテレビカメラ
１１１で、プローブ１９の蛍光強度を計測される。半透
鏡９で分割された光のもう一方は、反射鏡１０を経て、
蛍光微粒子１８のプローブ１９が発する蛍光のみを透過
するフィルター１０１通過後に偏光子９２と直交させる
ように配置した偏光子１０２を通過させ、その後段の像
をテレビカメラ１１２でプローブ１９の蛍光強度が計測
される。そして、テレビカメラ１１１と１１２で捕えた
蛍光微粒子のそれぞれの偏光強度の比を観察することで
微粒子１８の傾きの割合を画像処理解析部１３で検出す
ることができる。

【００２０】この画像処理解析部１３で検出された微粒
子１８の傾きに応じて、この傾きを元に戻すように制御
すれば、図４で説明したように試料表面を追従する計測
ができる。

【００２１】なお、図１の実施例では、プローブ１９か
らの偏光を異なる向きの二つの偏光子で検出して微粒子
１８の傾きを検出するものとしたが、これを、例えば、
偏光子１０２を省略して、テレビカメラ１１２では蛍光
微粒子の蛍光の強度を検出するものとし、テレビカメラ
１１１で捕えた蛍光微粒子の偏光強度とテレビカメラ１
１２で捕えた蛍光微粒子の蛍光の強度との比を観察する
ことで微粒子１８の傾きの割合を画像処理解析部１３で
検出するものとすることもできる。

【００２２】また、レーザー光源６の波長を蛍光物質の
励起波長の２倍波長で用いれば、このレーザー光の集束
点で捕獲された蛍光微粒子１８のプローブ１９の蛍光色
素を、２光子吸収の機構で選択的に励起させることがで
きる。この集束点における２光子吸収によって、蛍光微
粒子の一部、光の集束点近傍のみを選択的に励起させる
ことができ、この結果、蛍光微粒子の発光点の空間分解
能を高めることができる。

【００２３】なお、本発明の実施については、原理的に
は、試料を保持する溶液中には蛍光微粒子が一つだけに
なるようにすることが必要であるが、これは、たとえ
ば、以下のようにして実現できる。すなわち、図２で示
すように蛍光微粒子１８がトラップされる前には、溶液
中には多数の蛍光微粒子１８が入った溶液をカバーグラ
ス１７、１７２内に満たす。ついで、トラップ用の光を
照射して、図２の状態になった後、トラップ用の光を照
射し続けながら、溶液の材質は同じであるが、蛍光微粒
子１８が入っていない溶液でカバーグラス１７、１７２
内を置換する。

【００２４】

【発明の効果】本発明は、生物試料を破壊することな
く、走査、計測することが可能であり、従来の光学顕微
鏡の空間分解能を超える分解能で観察することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例の装置構成を示すブロック図。

【図２】光学トラップによる蛍光微粒子の捕獲を説明す
る模式図。

【図３】光学トラップされた蛍光微粒子が試料表面を移
動する様子を説明する模式図。

【図４】光学トラップされた蛍光微粒子が試料表面を表
面形状に追従して移動する様子を説明する模式図。

【符号の説明】

１…照射光源：２、１０…反射鏡：３…コンデンサー：
４…試料を含む溶液：５…対物レンズ：６…レーザー光
源：７、８、９…半透鏡：８１、９１、１０１…フィル
ター：９２、１０２…偏光子：１１０、１１１、１１２
…テレビカメラ：１２…画像記憶部：１３…画像処理解
析部：１４…モニター：１５…走査機構：１７、１７２
…カバーグラス：１８…蛍光微粒子：１９…プローブ：
２０…試料：２１…ピエゾアクチエーター：２２…変位
測定部。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】溶液中に保持された試料と、該溶液中に配
置され、光学的な異方性を持ち、その重心の位置から偏
心した位置にプローブを付加した微粒子と、前記微粒子
を捕獲するための所定の波長領域の光束を発生させる光
源と、所定の領域に前記光束を集光させ前記微粒子を捕
獲する手段と、前記集光点を移動させる手段と、前記微
粒子に付加した蛍光色素を励起する所定の波長領域の光
源と、前記微粒子の蛍光のみを通過させ、これを複数分
岐させる光路と、その各光路の後段に配置された複数の
異なる向きの偏光子と、前記微粒子の蛍光のそれぞれの
偏光の強度の比から微粒子の傾きを計測する手段とを具
有することを特徴とする光学測定装置。
【請求項２】前記偏光子が一つとされ、前記一つの偏光
の強度と微粒子の蛍光全体の強度の比から微粒子の傾き
を計測する請求項１記載の光学測定装置。
【請求項３】計測された前記微粒子の傾きが一定となる
ように、前記試料の保持位置を制御する手段を有する請
求項１または２記載の光学測定装置。
【請求項４】前記微粒子に付加した蛍光色素を励起する
光源の波長が所定の励起波長の２倍の波長領域の光束を
発生させる光源である請求項１、２または３記載の光学
測定装置。