JPH092958A - ＩｇＥ産生促進組成物及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ＩｇＥ産生促進組成物及びこのＩｇＥ産生促
進組成物を用いたＩｇＥ含量の高い血清の製造法を提供
する。 【構成】 酪酸ナトリウム、２−ヒドロキシアゾナフタ
レン−３, ４′, ６−トリスルホン酸ナトリウム、６−
ヒドロキシ−５−（２−メトキシ−５−メチル−４−ス
ルホナートフェニルアゾ）ナフタレン−２−スルホン
酸、２′，４′，５′，７′−テトラブロモ−３，４，
５，６−テトラクロロフルオレセイン二ナトリウム、
３，６−（ジエチルアミノ）キサンチリウム−９−
（２，４−ベンゼンジスルホン酸）ナトリウム、二酸化
チタン、クロロフィリン鉄ナトリウム等から選択される
低分子化合物を含むＩｇＥ産生促進組成物。このＩｇＥ
産生促進組成物を実験動物に投与してＩｇＥを産生さ
せ、ＩｇＥ含量の高い血清を分離、回収する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＥ産生促進組成物
に関する。また、本発明は、ＩｇＥ産生促進組成物を用
いてＩｇＥ含量の高い血清を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、アレルギーを有する人の数は増加
の一途をたどっており、アレルギーは大きな社会問題と
なっている。このアレルギーを発症させる要因として、
遺伝的な背景の他に、環境的な背景、例えば、衛生状
態、食生活、住環境、大気汚染、ストレスなどが大きく
関与していると言われている。そして、アレルギー発症
に密接に関係している分子のひとつとして、イムノグロ
ブリンＥ（ＩｇＥ）が知られており、このＩｇＥを産生
するアレルギーモデル系を開発し、アレルギー疾患に関
連する研究に役立てようとする研究が活発に行われてい
る[Imaoka et al.,Exp. Anim., vol.42, no.1, pp.61-6
5, 1993] 。

【０００３】また、ＩｇＥの産生を単にアレルギー発症
モデル系の作製手段として用いるのみならず、アレルゲ
ン特異的ＩｇＥに対してアレルゲン非特異的ＩｇＥの比
率を増加させることによりアレルギーの発症を抑制でき
る可能性もあり、いわゆる、ＩｇＥワクチンとしての応
用についても検討されている現状にある。

【０００４】現在、実験動物にＩｇＥを産生させる手段
としては、百日咳菌アジュバント、フロイント完全アジ
ュバント（ＦＣＡ）あるいはアラムアジュバントなどを
用い免疫する方法が一般的に行われている。百日咳菌ア
ジュバントは、百日咳菌 (Bordetella pertussis)の菌
体成分からなり、この菌体成分中のリポポリ多糖（ＬＰ
Ｓ）や百日咳菌毒素が免疫システムを非特異的に刺激す
る。また、ＦＣＡは、鉱物油、乳化剤及び結核菌(Mycob
acterium tuberculosis) の菌体成分からなり、この鉱
物油及び乳化剤で抗原をエマルジョン化することによ
り、抗原を投与部位に長く滞留させ代謝による分解を受
け難くすると共に、結核菌(Mycobacteriumtuberculosi
s) の菌体成分中のムラミルジペプチド（ＭＤＰ）が免
疫システムを非特異的に刺激する。これらのアジュバン
トでは、菌体成分が強力な免疫応答促進作用を示すた
め、アジュバント効果が非常に高い。しかし、菌体成分
による副作用、例えば、ツベルクリン過敏症、肉芽腫、
アジュバント関節炎などを引き起こし易く、これらのア
ジュバントの取扱に際しては、吸引や粘膜との接触を避
けるなど特別な注意を要する。

【０００５】一方、アラムアジュバントは、抗原を吸着
し沈澱物として存在する水酸化アルミニウムゲルからな
り、抗原・水酸化アルミニウムゲル複合体が投与部位に
長く滞留しアジュバント効果を示す。このアラムアジュ
バントは、上述したような百日咳菌アジュバントやＦＣ
Ａなどで見られる副作用は殆ど認められず、ヒトに用い
ることのできる唯一のアジュバントとして知られてい
る。また、このアラムアジュバントは、百日咳菌アジュ
バントと同時に用いられることもあり、百日咳菌アジュ
バントによる免疫システムに対する非特異的な刺激効果
が付加されるが、百日咳菌 (Bordetella pertussis)の
菌体成分による副作用が生じるという問題がある。

【０００６】すなわち、百日咳菌アジュバント、ＦＣＡ
あるいは百日咳菌アジュバント添加アラムアジュバント
などの菌体成分を用いたアジュバントは、いずれも強力
なアジュバント効果を示すが、これらのアジュバントの
使用に際しては、上述したような副作用を考慮しなけれ
ばならない。また、アラムアジュバント単体でも、菌体
成分を含む百日咳菌アジュバントあるいはＦＣＡなどと
比べ副作用は弱いものの、最近ではアルミニウムの毒性
も問題視されており、より安全性の高いアジュバントが
望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
問題を鑑み、副作用が少なく、かつ、ＩｇＥ産生促進効
果の高い物質を見出すべく鋭意研究を進めていたとこ
ろ、次の低分子化合物を用いることにより、副作用が少
なく、かつ、ＩｇＥの産生を促進できることを見出し、
本発明を完成するに至った。 （１）酪酸ナトリウム （２）２−ヒドロキシアゾナフタレン−３, ４′, ６−
トリスルホン酸ナトリウム （３）６−ヒドロキシ−５−（２−メトキシ−５−メチ
ル−４−スルホナートフェニルアゾ）ナフタレン−２−
スルホン酸 （４）２−ヒドロキシアゾナフタレン−４′，６，８−
トリスルホン酸三ナトリウム （５）２−ヒドロキシ−６−スルホナートナフタレン−
１−アゾ（４′−ベンゼンスルホン酸）二ナトリウム （６）２′，４′，５′，７′−テトラヨードフルオレ
セイン二ナトリウム水和物 （７）２′，４′，５′，７′−テトラブロモ−３，
４，５，６−テトラクロロフルオレセイン二ナトリウム （８）３，６−（ジエチルアミノ）キサンチリウム−９
−（２，４−ベンゼンジスルホン酸）ナトリウム （９）３−〔Ｎ−エチル−Ｎ−〔４−〔〔４−〔Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−スルホナートベンジル）アミノ〕フェ
ニル〕（２−スルホナートフェニル）メチレン〕−２，
５−シクロヘキサジエニリデン〕アンモニオメチル〕ベ
ンゼンスルホン酸二ナトリウム （１０）二酸化チタン （１１）クロロフィリン鉄ナトリウム （１２）クロロフィリン銅ナトリウム したがって、本発明は、上記（１）〜（１２）の物質を
含有するＩｇＥ産生促進組成物を提供することを課題と
する。また、本発明は、このＩｇＥ産生促進組成物を実
験動物に投与してＩｇＥ含量の高い血清を製造する方法
を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従来、ＩｇＥの産生につ
いては、上述したようなアジュバントによる促進作用の
みならず、種々の因子による促進作用も報告されてい
る。例えば、間接喫煙によるＩｇＥ応答促進の可能性
[柳澤及び長井, 日衛誌, vol.48, pp.698-706, 1993]
、酪酸のＩｇＥ応答修飾作用 [山本ら, 消化器と免疫,
vol.29, pp.43-48,1994] 、排気ガスや水銀によるＩｇ
Ｅ応答促進作用[A.Prouvost-Danon et al.,J.Immunol.,
vol.126, no.2, pp.699-702, 1981]などである。しか
し、これらのＩｇＥ産生促進物はいずれも有害な物質で
あったり使用条件が限られていたりする。そこで、本発
明者らは、高い安全性を有すると共に、高いＩｇＥ産生
促進効果を有する物質を見出すべく、広く低分子化合物
を対象としてスクリーニングを行った。

【０００９】スクリーニングについては、マウスやラッ
トなどの実験動物を用い、卵白アルブミン、ブタ回虫抽
出抗原、カサガイヘモシアニン、ウシγグロブリン、ブ
タ草抽出物、細菌性αアミラーゼ、スギ花粉、βラクト
グロブリン、αラクトアルブミンなどの任意の抗原、あ
るいは、これらの抗原にジニトロフェニル（ＤＮＰ）基
をハプテンとして結合させたものをスクリーニングしよ
うとする物質と共に実験動物の腹腔内に投与し、血清中
のＩｇＥ量を測定するという方法が一般的に行われてい
るが、本発明では、ＤＮＰ基でハプテン化した卵白アル
ブミン（ＤＮＰ−ＯＶＡ）を抗原とし、スクリーニング
しようとする物質とを混合してマウスの腹腔内に投与す
ることにより行った。このスクリーニングの結果を試験
例として以下に示す。

【００１０】なお、本発明では、血清中のＩｇＥ量の測
定はＥＬＩＳＡ法によった。すなわち、ＥＬＩＳＡ用プ
レートに抗マウスＩｇＥ抗体を固定化し、ウシ血清アル
ブミンでブロッキングした後、最適濃度に希釈した血清
試料を添加して血清中のＩｇＥを抗マウスＩｇＥ抗体に
結合させた。次に、ビオチンで標識した抗マウスＩｇＥ
抗体を添加した後、アビジン標識酵素を加えて酵素活性
を測定することにより血清中のＩｇＥ量を求めた[M.Sak
aguchi et al., J.Immunol.Methods, vol.116,pp.181-1
87, 1989]。

【００１１】

【試験例】６週齢BALB/cマウス（メス）５〜８匹を一群
とし、スクリーニングを行った。なお、被験物質は以下
の（１）から（１６）である。 （１）抗原10μg （２）抗原10μg を含むアラムアジュバント4.5mg （３）抗原10μg と３−カルボナート−５−ヒドロキシ
−１−（４−スルホナートフェニル）−１Ｈ−ピラゾー
ル−４−アゾ−（４′−ベンゼンスルホン酸）三ナトリ
ウム１mgの混合物 （４）抗原10μg とピレン１mgの混合物 （５）抗原10μg と酪酸ナトリウム１mgの混合物 （６）抗原10μg と２−ヒドロキシアゾナフタレン−
３, ４′, ６−トリスルホン酸ナトリウム１mgの混合物 （７）抗原10μg と６−ヒドロキシ−５−（２−メトキ
シ−５−メチル−４−スルホナートフェニルアゾ）ナフ
タレン−２−スルホン酸１mgの混合物 （８）抗原10μg と２−ヒドロキシアゾナフタレン−
４′，６，８−トリスルホン酸三ナトリウム１mgの混合
物 （９）抗原10μg と２−ヒドロキシ−６−スルホナート
ナフタレン−１−アゾ（４′−ベンゼンスルホン酸）二
ナトリウム１mgの混合物 （１０）抗原10μg と２′，４′，５′，７′−テトラ
ヨードフルオレセイン二ナトリウム水和物１mgの混合物 （１１）抗原10μg と２′，４′，５′，７′−テトラ
ブロモ−３，４，５，６−テトラクロロフルオレセイン
二ナトリウム１mgの混合物 （１２）抗原10μg と３，６−（ジエチルアミノ）キサ
ンチリウム−９−（２，４−ベンゼンジスルホン酸）ナ
トリウム１mgの混合物 （１３）抗原10μg と３−〔Ｎ−エチル−Ｎ−〔４−
〔〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホナートベンジ
ル）アミノ〕フェニル〕（２−スルホナートフェニル）
メチレン〕−２，５−シクロヘキサジエニリデン〕アン
モニオメチル〕ベンゼンスルホン酸二ナトリウム１mgの
混合物 （１４）抗原10μg と二酸化チタン１mgの混合物 （１５）抗原10μg とクロロフィリン鉄ナトリウム１mg
の混合物 （１６）抗原10μg とクロロフィリン銅ナトリウム１mg
の混合物

【００１２】上記の被験物質をリン酸緩衝化生理食塩水
(pH 7.0) 0.3mlに溶解又は分散し、マウスの腹腔内に１
回目の投与を行い、１回目の投与から14日後、１回目の
投与と全く同様にして２回目の投与を行った。そして、
２回目の投与から７日後、マウスの眼底静脈から少量の
血液を採取し、血清を分離、回収した後、ＥＬＩＳＡ法
により血清中のＩｇＥ量を測定した。その結果を表１に
示す。

【００１３】

【表１】 ────────────────────────────── 実験群 被験物質 血清中ＩｇＥ量(ng/ml±S.D.) ────────────────────────────── １ （１） 388± 176 ２ （２） 3887±2362 ３ （３） 432± 192 ４ （４） 521± 209 ５ （５） 1603±1221 ６ （６） 1480± 840 ７ （７） 1783±1375 ８ （８） 1524± 997 ９ （９） 1015± 684 １０ （１０） 2701±2123 １１ （１１） 1979±1835 １２ （１２） 2316±1729 １３ （１３） 1675± 418 １４ （１４） 2562± 766 １５ （１５） 2834± 950 １６ （１６） 1920±1032 ──────────────────────────────

【００１４】この結果、実験群２のアラムアジュバント
より効果は弱いが、被検物質（５）〜（１６）にＩｇＥ
産生促進能があることが判った。また、被検物質（３）
及び（４）とスクリーニングに供した他の化合物につい
ては、明確なＩｇＥ産生促進効果は認められなかった。
なお、被検物質（５）〜（１６）中に含まれる各低分子
成分は、毒性のない物質として知られている。

【００１５】このように、本発明は、上述のスクリーニ
ングにより得られたＩｇＥ産生促進組成物であり、好ま
しくは、卵白アルブミン、ブタ回虫抽出抗原、カサガイ
ヘモシアニン、ウシγグロブリン、ブタ草抽出物、細菌
性αアミラーゼ、スギ花粉、βラクトグロブリン、αラ
クトアルブミン、カゼインなどの任意の抗原、あるい
は、これらの抗原にＤＮＰ基をハプテンとして結合させ
たものと、上記した低分子化合物を含むＩｇＥ産生促進
組成物である。

【００１６】このＩｇＥ産生促進組成物を、ラットやマ
ウスなどの実験動物の血清中にＩｇＥを産生させるため
に用いる場合、ＩｇＥ産生促進組成物の投与量は、用い
る実験動物により異なるが、マウスの場合は１回の投与
につき、上記した低分子化合物を含む組成物１〜８mg、
好ましくは、上記した抗原１〜10μg 及び低分子化合物
を含む組成物３〜６mgとすれば良い。

【００１７】また、本発明のＩｇＥ産生促進組成物は、
腹腔内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内
投与などの投与法により投与すれば良いが、１回目の投
与を行った後、14日目前後に２回目の投与を行うことが
好ましい。このようにＩｇＥ産生促進物質を実験動物に
投与することにより、血清中のＩｇＥ産生量は１回目の
投与後10〜14日目から上昇が認められ、35日目位まで上
昇し続けた後定常値となる。なお、ＩｇＥ産生促進組成
物の１回投与でも若干の効果は認められるが、その効果
は弱い。

【００１８】このようにして得られたＩｇＥ含量の高い
血清は、アレルギーモデルを作成する際に利用すること
ができる。例えば、本発明のＩｇＥ産生促進組成物を用
いてマウス血清中に産生させたＩｇＥは、ラットの皮膚
に感作能を有するので、ラットを用いて受動皮膚アナフ
ィラキシー反応（ＰＣＡ反応）を行うことができる。す
なわち、ＩｇＥ含量の高いマウスの血清を適当な濃度に
希釈し、その希釈した血清 100μl を刈毛したラットの
背中に皮内注射して24時間感作させた後、抗原１mgを１
％エバンスブルー１mlと共に静脈注射し、30分後に皮膚
面の青色斑の大きさや反応を起こす血清の最大希釈値を
指標として判定する。

【００１９】また、マウスやラットに限らず任意の実験
動物を用い、能動皮膚アナフィラキシー反応（ＡＣＡ反
応）を行うこともできる。このＡＣＡ反応は、ある抗原
で感作した動物の皮膚に少量の抗原を皮内注射して反応
性をみる方法であるが、この際、実験動物に何らかの処
理を行うことで、アレルギーに関する様々な検討が可能
となる。例えば、抗ヒスタミン剤などの抗アレルギー薬
の検討、あるいは、栄養状態やストレスなどのアレルギ
ー反応に対する影響などの研究が可能となる。そして、
このような検討を行う際に、ＩｇＥ含量の高い血清を使
用することが必要であり、本発明の方法で得られたＩｇ
Ｅ含量の高い血清は有用である。以下に実施例を示し、
本発明を詳しく説明する。

【００２０】

【実施例１】ＤＮＰ−ＯＶＡ抗原10μg と３−〔Ｎ−エ
チル−Ｎ−〔４−〔〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ス
ルホナートベンジル）アミノ〕フェニル〕（２−スルホ
ナートフェニル）メチレン〕−２，５−シクロヘキサジ
エニリデン〕アンモニオメチル〕ベンゼンスルホン酸二
ナトリウム、二酸化チタン、クロロフィリン鉄ナトリウ
ム、クロロフィリン銅ナトリウム各4mg とをリン酸緩衝
化生理食塩水(pH 7.0)0.3mlに溶解、分散し、６週齢のB
ALB/cマウス（メス）の腹腔内に１回目の投与を行い、
１回目の投与から14日後、１回目の投与と全く同様にし
て２回目の投与を行った。そして、２回目の投与から７
日後、マウスの眼底静脈から血液を採取し、遠心分離(1
5,000rpm、10分）してＩｇＥ含量の高い血清を調製し
た。

【００２１】このようにして調製したＩｇＥ含量の高い
血清を生理食塩水で20倍希釈し、その希釈した血清 100
μl を刈毛した８週齢のWistar系ラット（メス）の背中
に皮内注射して24時間感作させた後、抗アレルギー剤で
あるインタール（クロモグリク酸ナトリウム、藤沢薬品
工業製）を静脈内投与した群と生理食塩水を投与した対
照群に分けた（各群５匹）。５分後、ＤＮＰ−ＯＶＡ抗
原１mgを１％エバンスブルー１mlと共に静脈注射し、30
分後に皮膚面の青色斑の大きさを測定した。その結果、
表２に示したように、インタールの有効性が評価でき、
本発明のＩｇＥ産生促進組成物が薬剤評価に有用である
ことが確認できた。

【００２２】

【表２】 ───────────────────────────────── 実験群 青色斑直径(cm ±S.D.) ───────────────────────────────── 対照群 2.7 インタール投与群（投与量: 5mg/kg) 2.4±0.5 インタール投与群（投与量:25mg/kg) 1.9±0.4 インタール投与群（投与量:50mg/kg) 1.5±0.4 ─────────────────────────────────

【００２３】

【実施例２】カゼイン抗原10μg と２′，４′，５′，
７′−テトラヨードフルオレセイン二ナトリウム水和
物、２′，４′，５′，７′−テトラブロモ−３，４，
５，６−テトラクロロフルオレセイン二ナトリウム、
３，６−（ジエチルアミノ）キサンチリウム−９−
（２，４−ベンゼンジスルホン酸）ナトリウム各4mg を
リン酸緩衝化生理食塩水(pH 7.0) 0.3mlに溶解、分散
し、８週齢のWistar系ラット（メス）の四肢に皮下注射
した。14日後、同様にして追加の皮下注射を行った。そ
して、追加の皮下注射から７日後、カゼイン及びその分
解物を抗原とした能動皮膚アナフィラキシー反応を行っ
た。なお、カゼイン分解物は、0.05％アジ化ナトリウム
を含むリン酸緩衝化生理食塩水(pH 8.0)に溶解したカゼ
イン1gに対し10,000U/mgの活性を有するキモトリプシン
５mgを添加し、37℃で24時間反応させた後、pH 4.6で酸
沈澱処理して回収した上清を凍結乾燥したものを用い
た。１％エバンスブルー１mlを静脈注射し、５分後、0.
1mg/ml濃度に調製したカゼイン又はカゼイン分解物の溶
液20μl を刈毛したラットの皮膚に皮内投与した。そし
て、30分後に皮膚面の青色斑の大きさを測定した。その
結果、表３に示したように、カゼインを分解することで
抗原性が低下することが評価でき、本発明のＩｇＥ産生
促進組成物が抗原性評価に有用であることが確認でき
た。

【００２４】

【表３】 ────────────────────────── 実験群 青色斑直径(cm ±S.D.) ────────────────────────── カゼイン投与 2.6 カゼイン分解物投与 1.6±0.3 ──────────────────────────

【００２５】

【発明の効果】本発明のＩｇＥ産生促進組成物を用いる
ことにより、血清中でＩｇＥの産生を強力に促進するこ
とができる。しかも、本発明のＩｇＥ産生促進組成物
は、従来のアジュバントに見られるような副作用がな
く、また、低分子化合物のため免疫原性がないので、ア
ジュバント自体に対する抗体が産生されることにより生
じる交差反応の心配もない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/40 Ａ６１Ｋ 31/40 31/52 31/52 31/655 31/655 33/24 33/24 // Ａ６１Ｋ 39/39 39/39

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の（１）〜（１２）の物質を一種以上
   含有することを特徴とするＩｇＥ産生促進組成物。 （１）酪酸ナトリウム （２）２−ヒドロキシアゾナフタレン−３, ４′, ６−
   トリスルホン酸ナトリウム （３）６−ヒドロキシ−５−（２−メトキシ−５−メチ
   ル−４−スルホナートフェニルアゾ）ナフタレン−２−
   スルホン酸 （４）２−ヒドロキシアゾナフタレン−４′，６，８−
   トリスルホン酸三ナトリウム （５）２−ヒドロキシ−６−スルホナートナフタレン−
   １−アゾ（４′−ベンゼンスルホン酸）二ナトリウム （６）２′，４′，５′，７′−テトラヨードフルオレ
   セイン二ナトリウム水和物 （７）２′，４′，５′，７′−テトラブロモ−３，
   ４，５，６−テトラクロロフルオレセイン二ナトリウム （８）３，６−（ジエチルアミノ）キサンチリウム−９
   −（２，４−ベンゼンジスルホン酸）ナトリウム （９）３−〔Ｎ−エチル−Ｎ−〔４−〔〔４−〔Ｎ−エ
   チル−Ｎ−（３−スルホナートベンジル）アミノ〕フェ
   ニル〕（２−スルホナートフェニル）メチレン〕−２，
   ５−シクロヘキサジエニリデン〕アンモニオメチル〕ベ
   ンゼンスルホン酸二ナトリウム （１０）二酸化チタン （１１）クロロフィリン鉄ナトリウム （１２）クロロフィリン銅ナトリウム
2. 【請求項２】 抗原と請求項１記載のＩｇＥ産生促進組
   成物を実験動物に投与してＩｇＥを産生させた後、血清
   を分離、回収することを特徴とするＩｇＥ含量の高い血
   清の製造法。