JPH09296003A - レバナーゼを用いたバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 セルロース生産菌を用いて、安価な糖源であ
るシュクロースから経済的にかつ高収率でバクテリアセ
ルロースを生産すること。 【解決手段】 セルロース生産菌をレバナーゼを含む培
地中で培養し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積さ
せ、該物質を回収することから成る該セルロース性物質
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、セルロース性物質
を生産する能力を有する微生物（この微生物を以後「セ
ルロース生産菌」と称する。）、特に酢酸菌をレバナー
ゼを含む培地中で培養し、該セルロース性物質（以下、
「バクテリアセルロース」又は「ＢＣ」という。）を製
造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＢＣは可食性であり無味無臭である為、
食品分野で利用されるほか、水系分散性に優れているの
で食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地
の強化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加
物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値がある。
ＢＣは木材パルプ等から製造されるセルロースに較べ、
フィブリルの断片幅が２桁程度も小さいことを特徴とす
る。従って、ＢＣの離解物はミクロフィブリルのかかる
構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補
強剤として各種の産業用用途がある。このようなセルロ
ース性離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い
引張弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的特徴に
基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材と
しての応用がある。従来より、アセトバクター属に属す
る微生物のようなセルロース生産菌を培養して、セルロ
ースを生産する方法は知られている。例えば、特開昭６
２−２６５９９０号公報、特開昭６３−２０２３９４号
公報及び特公平６−４３４４３号公報等に、その記載が
ある。セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされ
ている栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキ
ス、燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／He
strin 培地（Schramm ら，J. General Biology, ll,pp.
123〜129, l954 ）が知られている。

【０００３】また、上記栄養培地の他に、コーンスチー
プリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を加えた培地が知ら
れているが、これら天然栄養素（ペプトン、酵母エキ
ス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれる特定成分がセ
ルロース生成促進に関与していることは知られていな
い。培地中の特定栄養素によるセルロース生成促進因子
として、現在知られているものにはイノシトール、フィ
チン酸及びピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）（特公平５
−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協誌，第４２巻，
第３号，第２３７〜２４４頁）等があるが、セルロース
生成量はまだ不十分であり、またこれらの振盪もしくは
通気攪拌培養における効果も明確ではなかった。また、
本出願人は、カルボン酸又はその塩（特願平５−１９１
４６７号）、インベルターゼ（特願平５−３３１４９１
号）、メチオニン（特願平５−３３５７６４号）及びサ
ポニン（特願平６−２１４３３４号）を培地中に添加す
ることによって、セルロース性物質の生産性が向上する
ことを見い出している。更にＰＱＱ非生成株（特願平６
−１２７９９４号）、サルファ剤耐性株（特願平６−１
５１７２９号）、ピリミジンアナログ耐性株（特願平６
−１５８２０１号）及びＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐
性株（特願平６−１６７５７３号）を用いてセルロース
性物質の生産性が向上することも見い出されている。
又、特表平４−５０３４５６号公報には、セルロースシ
ンターゼオペロン由来の少なくとも一種の遺伝子を酢酸
菌に導入してセルロース生産を高める方法が記載されて
いる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、酢酸菌
は菌体外レバンシュクラーゼを有しており、シュクロー
スを糖源とすると、多量のレバンを生成するため、特に
安価な糖源であるシュクロースを用いて上記栄養培地で
振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合に、得られる
セルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満足のい
くものではなかった。そこで、セルロース生産菌を用い
て、安価な糖源であるシュクロースから経済的にかつ高
収率でバクテリアセルロースを生産するために、シュク
ロース代謝に関する酵素の遺伝子をセルロース生産菌に
導入して該菌を形質転換する方法（国際公開(WO95/3227
9)や、菌体外インベルターゼ遺伝子及び分泌遺伝子をセ
ルロース生産菌に導入して該菌を形質転換する方法（本
願と同一の出願人による特願平７−２５２０２１）がす
でに提案されている。本発明者らは、更に種々の研究を
行ない、今回、レバナーゼ酵素をセルロース生産菌を培
養する際の培地に添加することによって、上記の目的が
達成できることを見いだし、本発明を完成することがで
きたのである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、セル
ロース生産菌をレバナーゼを含む培地中で培養し、培地
中にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質を回収す
ることから成る該セルロース性物質の製造方法に係わ
る。レバナーゼの培地中の最終濃度は、その他の培養条
件を考慮して当業者が適宜決めることができる。また、
培養の全期間に渡って、レバナーゼを含む培地中で培養
する必要はなく、一定期間に限って、レバナーゼを培地
中に添加することも可能である。レバナーゼ〔Ｅ．Ｃ．
３．２．１．６５〕は、レバンの２，６−β−Ｄフルク
トフラノシド結合を加水分解する酵素であり、この酵素
を生産、分泌する微生物として、 Bacillus subtilis
(Kunst. F. et al., Biochimie 59巻 287-292頁（1977
年))、Arthrobacter属細菌（Avigad, G. & Bauer, S.,
Meth. Enzymol. 8巻621-625頁（1966年), Murakami,
M. et al., Agric. Biol. Chem. 54巻 2247-2255頁 (19
90年))、 Streptococcus属細菌（Burne R.A. et al.,
J. Bacteriol.169巻 4507-4517頁（1987年), Takahash
i, N. et al., Infect. Immun. 47巻 271-276頁 (1985
年))、 Actinomyces属細菌（Igarashi, T., Infect. Im
mun. 55巻 3001-3005頁（1987年))、 Kluyveromyces属
菌（Snyder, H. et al., Antonievan Leeuwenhook 26
巻 433-452頁（1960年))、 Penicillium属カビ（Negor
o,H., J. Ferment. Technol. 56巻 102-107頁（1978
年))等が広く知られている。本発明では、使用するレバ
ナーゼの由来に特に制限はないが、好ましくは例えば、
バチルス（Bacillus) 及びアルスロバクター（Arthroba
cter）等の種から得られたものを使用することができ
る。更に、本発明は、上記方法によって得ることのでき
るセルロース性物質に係わる。

【０００６】上記本発明において使用される菌株は、例
えば、ＢＰＲ２００１株に代表されるアセトバクター・
キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタ
ンス（Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentan
s）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylin
um) ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナ
ムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリアヌ
ス（A. pasteurianus) ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバ
クター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクタ
ー・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター
・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌、並びにそ
れらの菌株より各種突然変異処理及び遺伝子組み換え技
術などによって誘導・育種して得られた菌株、更にそれ
らからＮＴＧ（ニトロソグアニジン）等を用いる公知方
法によって変異処理して創製される各種変異株である。

【０００７】この中でも、ＢＰＲ２００１株と命名され
た株の分類学的性質は、形態は桿菌、グラム染色性は陰
性、胞子形成能は陰性、酸素に対する態度は好気性、カ
タラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、エタノール
からの酢酸生成は陽性、酢酸塩の酸化は陽性、乳酸塩の
酸化は陽性である。更に、かかるＢＰＲ２００１株から
得られたＰＱＱ非生成株を用いるとより好ましい。かか
るＰＱＱ非生成株の一例であるＢＰＲ３００１ｃ株は１
９９４年５月２日付で通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託
番号ＦＥＲＭＰ−１４２９７を付され、その後１９９５
年５月１２日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１００）に移管されている。その他、前述した各
種変異株、即ち、サルファ剤耐性株（ＢＰＲ３００１Ｄ
株；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３０，１９９４年５
月２５日付）、ピリミジンアナログ耐性株（ＢＰＲ３０
０１Ｉ株；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６２，１９９
４年６月１０日付）及びＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐
性株（ＢＰＲ３００１Ｎ株；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４３６１，１９９４年６月１０日付）も、夫々、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託
センターに寄託され、本発明に於いて、用いることがで
きる。尚、ＢＰＲ２００１株は、平成５年２月２４日に
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生
物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
３４６６）、その後１９９４年２月７日付で特許手続上
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄
託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４５）に移管されて
いる。

【０００８】本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロースを含み、グルコース、
フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ガラクト
ース、マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレ
ングリコール及びエタノール等を併用して使用すること
もできる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解物、
シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、サト
ウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロース
に加えて使用することもできる。

【０００９】また、窒素源としては硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用す
ることができ、或いは Bact-Peptone 、Bact-Soytone、
Yeast-Extract 、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用し
てもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、
脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−１Ｈピロ
ロ〔２，３−５〕−キノリン−４，５−ジオンを添加し
てもよい。生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異
株を使用する場合には、要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシ
ウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、前述のセルロース生成促進因子を適宜培
地中に添加することもできる。培養のｐＨは３ないし７
に、好ましくは５付近に制御する。培養温度は１０〜４
０℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で行う。培養槽に
供給する酸素濃度は１〜１００％、望ましくは２１〜８
０％であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合及
び培地に対する菌体の接種等は培養方法に応じて当業者
が適宜選択し得るものである。

【００１０】本発明方法では、培養形式に制限を受け
ず、静置、振盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよ
い。振盪もしくは通気攪拌下での培養であってもセルロ
ース生産性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴
の１つである。また、培養操作方法についても、いわゆ
る回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連
続発酵法のいずれも使用することができる。更に、これ
ら培養形式、培養操作方法に適宜、修正又は変更を加え
た方法も使用することができる。更に攪拌手段としては
従来公知の手段、例えばインペラー、エアーリフト発酵
槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の組
合せ等から任意に選択することができる。本発明の方法
によって生成されるセルロース性物質はそのまま回収し
てもよく、さらに本物質中に含まれる菌体等のセルロー
ス性物質以外の物質を取り除く処理をほどこしてもよ
い。不純物を取り除くためには水洗、加圧脱水、希酸洗
浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素な
どの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素
による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸な
どの界面活性剤による処理、常温から２００℃の範囲の
加熱洗浄などを単独及び併用してほどこすことによりセ
ルロース性物質から不純物を除去することができる。

【００１１】このようにして得られた本発明でいうセル
ロース性物質とは、セルロース及び、セルロースを主鎖
としたヘテロ多糖を含むもの及びβ−１，３、β−１，
２等のグルカンを含むものである。ヘテロ多糖の場合の
セルロース以外の構成成分はマンノース、フラクトー
ス、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラムノ
ース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等で
ある。なおこれ等の多糖が単一物質である場合もあるし
２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下の実施例により、本発明をさ
らに詳細に説明する。 実施例１ レバナーゼ酵素液の調製方法 土壌より取得したサンプルから、レバンを唯一の炭素源
とする寒天プレート培地（０．３％ ＮａＮＯ₃ 、
０．１％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、 ０．０５％ ＭｇＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ、 ０．０５％ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ、
０．１％レバン（ｐＨ５．５））での生育を指標とし
て、レバナーゼを培地中に分泌するレバン分解菌２５−
Ｂ−１株を得た。この株の同定を行なったところ、Arth
robacter属に属することが明らかとなった。この株は新
規であり、１９９６年４月２３日付で通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに
寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９７を付され
ている。この株を上記液体培地で３０℃で一晩振盪培養
し、菌体を除いた上清をレバナーゼ酵素液とした。

【００１３】実施例２ レバナーゼを添加した培地によ
るセルロース生産性酢酸菌によるセルロースの生産 グリセロールストックより培地１００mlを仕込んだ７５
ml容ルーフラスコにＢＰＲ３００１ｃ株を植菌し２８℃
で３日間静置培養した。培養後ルーフラスコをよく振っ
て菌体をセルロース膜よりはがした後、菌液１２．５ml
を７５mlの培地を含む５００ml縦型バッフルフラスコに
植菌し、２８℃、１８０ｒｐｍ、３日間培養した。培地
は、ＣＳＬ−Ｓｕｃを用いた。後に、０．００７７U/ml
のレバナーゼ酵素液３．７５ml添加して最終濃度を３．
９mU/ml とし、更に、３日間同条件下で、フラスコ培養
を継続した。

【００１４】

【表１】 ＣＳＬ−Ｓｕｃ培地 成分 最終濃度（ｍＭ） （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ２５ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ７．３ ＭｇＳＯ₄ １．０ ＦｅＳＯ₄ ０．０１３ ＣａＣｌ₂ ０．１０ Ｎａ₂ ＭｏＯ₄ ０．００１ ＺｎＳＯ₄ ０．００６ ＭｎＳＯ₄ ０．００６ ＣｕＳＯ₄ ０．０００２ ビタミン混合物（下記） １０ml／１ 炭素源 適量 ＣＳＬ 適量 消泡剤 ０．０１ｖ／ｖ％ 最終ｐＨ＝５．０±０．２ （特に指定しない限り、シュクロース ４０ｇ／ｌ、 ＣＳＬ ２０ml／ｌ）

【００１５】

【表２】 ビタミン混合物 化合物 ｍｇ／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣ１ ４０ チアミンＨＣ１ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１６】得られた結果を以下の表３に示す。

【００１７】

【表３】 表：レバナーゼ添加によるセルロース生産の変化 ──────────────────────────────────── ｐＨ セルロース(%) 残糖(%) 収率(%) 多糖(%) ──────────────────────────────────── 対照 5.40 5.40 0.18 (F) 0.13 12.7 5.54 (S) 0.05 レバナーゼ 4.80 5.82 0.56 (F) 0.54 13.8 2.66 添加 (S) 0.02 ──────────────────────────────────── 注： (F) はフラクトース、(S) はシュクロースを意味する。

【００１８】尚、レバナーゼ酵素の活性単位は、村上等
の方法（Oyo Toshitsu Kagaku 41巻173-180頁（1994
年））に従って測定されたもので、１分間に１μmol の
還元糖を生ずる酵素量を１単位（Ｕ）とした。又、多糖
の濃度は、セルロースを除去した培養上清に２倍量のエ
タノールを加えて生じた沈殿の全糖量をフェノール硫酸
法(M.Dubois, et al., Anal. Chem.,56巻，350-356 頁
（1956年））によって測定した。尚、セルロース量（ｇ
／ｌ）は、培養終了後、フラスコ内の固形物を集積し、
水洗して培地成分を除去した後、１％ＮａＯＨ水溶液中
で１１０℃、２０分間処理して菌体を除去した。さら
に、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロースを水洗
した後、８０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定
することで求めた。また収率（％）は以下のようにして
求めた。 収率（％）の計算 収率は、対消費糖収率として以下のように計算した。 Ｙ_BC＝ＢＣ／（ＲＣ_MF−ＲＣ_BF）＊１００ Ｙ_BC ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ） ＲＣ_MF：培地の糖濃度（ｇ／ｌ） ＲＣ_BF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／ｌ）

【００１９】

【効果】レバナーゼを培養する際に培地に添加すること
により、レバンが培地に蓄積することを抑制し、バクテ
リアスルロースの生産量及び収率の向上が図られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神尾 好是 宮城県仙台市泉区住吉台東２丁目１−１ (72)発明者 阿部 直樹 宮城県多賀城市丸山１丁目18−19−14

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース生産菌をレバナーゼを含む培
   地中で培養し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積さ
   せ、該物質を回収することから成る該セルロース性物質
   の製造方法。
2. 【請求項２】 レバナーゼがバチルス又はアルスロバク
   ター種から得られたものである請求項１記載の製造方
   法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の方法によって得
   ることのできるセルロース性物質。
4. 【請求項４】 レバナーゼを生産するArthrobacter属２
   ５−Ｂ−１株。