JPH09296004A - 内毒血症または敗血症の予防に有効な新規の効力のある非毒性リポ多糖体の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 内毒血症または敗血症の予防に有効な新規の
効力のある非毒性ＬＰＳの調製方法を提供する。 【解決手段】 １）標準条件下に通常の普通培地におい
て補助ＭＴＣＣ１９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕ
ｍ属の細菌を増殖させるステップと、 ２）周知の方法で細菌を分離した後、炭素および窒素源
を除く同一の増殖培地で反復洗浄するステップと、 ３）７０〜９０℃の温度下に親油性溶媒で細菌を抽出す
るステップと、 ４）得られた物質を冷却し、繰り返し遠心分離するステ
ップと、 ５）ステップ（ｄ）から得られた上清を透析するステッ
プと、 ６）ステップ（ｅ）から得られた透析物質を凍結乾燥す
るステップと、 ７）極性溶媒で凍結乾燥物質を処理し、リポ多糖体を沈
降させるステップと、 ８）リポ多糖体を濾過し、乾燥するステップと、からな
る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、内毒血症または敗
血症の予防に有効な新規の効力のある非毒性リポ多糖体
（ＬＰＳ）の調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】二重かつ非対称に構成された膜である大
腸菌、腸炎菌等のグラム陰性菌のいわゆる外膜は、優勢
な成分としていくつかの蛋白質およびクラスmacroamphi
ophiles、リポ多糖体（ＬＰＳ）からなるが、こうした
細菌の生存力は細胞外膜上のＬＰＳ配列によってのみ左
右される蛋白質である。１個の細菌の細胞は、４．９μ
ｍ²の面積を占める約３．６．１０⁶ＬＰＳ分子を含有す
る。このために、その相互作用は標的で容易である。本
発明による方法で調製されているリポ多糖体は、生物活
性物質であると共に、ヒト病原体を含むグラム陰性菌の
内毒素との病態生理学的相互作用を予防するために有効
である。このリポ多糖体は補助Ｎｏ．ＭＴＣＣ１９７９
を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属に属する新しい細菌
から調製され、チャンディガルの国立培養センターＩＭ
ＴＥＣに保管される。

【０００３】グラム陰性病原体に感染すると、循環に放
出されるＬＰＳは、ヒトなど宿主と多様な生理学的・病
態生理学的相互作用を媒介し、特に生存の危険を来す。
ヒトにおけるグラム陰性菌感染症のＬＰＳを原因とする
病態生理学的疾患として、発熱（３８．６℃）、頻拍
（９０拍／分）、頻呼吸（呼吸数＞２０回／分）、アシ
ドーシス（ｐＨ７．３）、動脈低酸素血（ｐｐｏ＝７５
ｍｍ Ｈｇ）（１）が挙げられる。米国だけで毎年５０
万人が敗血症に罹り、うち１７万５千人が死亡している
（２）。人口がはるかに多いインドの事情はさらに深刻
であることが予想されるため、敗血症の予測症例は高
く、死亡率に対する影響は大きい。通常、敗血性ショッ
クの発現を認める院内または集中治療室内の患者は、診
断後７２時間以内に死亡することがある（３）。

【０００４】網内細胞に対するＬＰＳ作用により産生さ
れるメディエーターのなかには、インターロイキン６お
よび８のほか、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインター
ロイキン−１（ＩＬ−１）が含まれる。しかし、ＴＮＦ
αおよびＩＬ−１は敗血症の重要な因子である。

【０００５】ヒトに対する敗血症の大きな影響を理解す
ることにより、有効な抗敗血症薬の市場は、ニューヨー
クシティーのＯｐｐｅｎｈｅｕｎｅｒ＆Ｃｏ．Ｉｎｃの
アナリストによると年間５億ドルになると考えられる
（４）。急進展する市場は、現在可能性のある抗敗血症
薬を開発中の２０社余りにとって大きな収入源になると
みられる。しかし、こうした利益を得る道は一直線とい
うわけではない。

【０００６】１９８０年代半ばに、カリフォルニア州エ
メリービルのＣｅｎｔｏｃｏｒ、ＸｏｍａおよびＣｈｉ
ｒｏｎの３社が、敗血症の発生に重要な役割を果たす内
毒素の毒性成分であるリピドＡに対するモノクローン抗
体の開発を開始した。単球およびマクロファージの受容
体に結合することにより、内毒素のリピドＡは、サイト
カインとして知られる強力なメディエーターの放出を誘
発する。敗血症を引き起こす前にリピドＡの過剰を（抑
制する）抗体を使用するという考えは、製品を臨床試験
用にしたＸｏｍａ社およびＣｈｉｒｏｎ社により利用さ
れたが、これは失敗に終わった。しかし、モンタナ州ハ
ミルトンのＲｉｈｉＩｍｍｕｎｅケミカル社は、グラム
陰性型およびグラム陽性型の細菌との感染が認められる
ときに過剰に刺激されることのない宿主および免疫系に
耐性のある良性のリピドＡを開発した。抗内毒素活性の
ためのもう一つの方法は、白血球に存在する自己蛋白質
であって、内毒素に結合し、体そのものの活動に追随す
る殺菌性／浸透性増大蛋白質（ＢＰＩ）と呼ばれる物質
の使用である。開発したのは、カリフォルニア州パロア
イトのＩｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社
であり、同剤はマウスにおいて優れた成績を示してい
る。グラム陽性菌や真菌など敗血症を引き起こす病原体
のシフトにより、現在の焦点はＴＮＦやＩＬ−１など免
疫メディエーターに向けられている。

【０００７】Ｓｙｎｅｒｇｅｎ社のＡｎｔｒｉｌ（ＩＬ
−１の受容体拮抗薬）は単球により産生される蛋白質で
あり、好中球の受容体に結合することによりＩＬ−１の
作用を抑制する効果があり、すでに罹患した患者におい
て良好な結果が得られる。英国のＣｈｉｒｏｎ社やスイ
スのＨｏｆｆｍａｎｎ−ｌａ−Ｒｏｃｈｅ社など数社
は、ＴＮＦ−結合抗体を用いた有望な成績が得られたた
め、現在、臨床試験が行われている。

【０００８】しかし、抗ＴＮＦ受容体による方法は、敗
血症患者における死亡率の増大が報告されているため、
奏功しなかった（５）。しかしながら、抗サイトカイン
による方法には依然として多くの擁護者がいるが、なか
にはこの方法では同時に１種類の化学薬品だけしか誘発
されないと不満を訴える擁護者もいる。それでも、１つ
の因子を制御することのより、他の効果を上昇させ、Ｉ
Ｌ−１濃度が上昇するような免疫系において、ＴＮＦが
充分な冗長度を有するものとなる。

【０００９】敗血症に対するこのような効果的な治療に
は、ＴＮＦとＩＬ−１の両方に対して作用する多種類の
作用物質が必要である、とカリフォルニア州立大学の細
胞生物学者・エリクソンは述べている。メリーランド州
ロックビルのＥｎｔｅｒＭｅｄ社は、「抗敗血症ワクチ
ン」を用いてこの方向に進み、患者自身が免疫応答を備
えるようにしている。ワクチンは脂質とコレステロール
を材料とする小嚢に包まれたリピドＡからなり、開発の
過程にある。したがって、「抗敗血小ワクチン」の方向
において考え得る方法は、大腸菌のＬＰＳと免疫学的に
交差反応するが、きわめて高い用量では致死率を示すこ
とのない天然に生じる非毒性ＬＰＳを用いて試みられ
る。別の見方をすれば、これでグラム陰性菌の毒性ＬＰ
Ｓまたは内毒素により誘発される致命的なショックが予
防される。

【００１０】現状の技術において、以下に示すさまざま
な標準的方法がある。

【００１１】Ａ．１．トリクロロ酢酸による抽出。

【００１２】三塩化酢酸（ＴＡＣ）による細胞の抽出
が、組織学的に内毒素分離のための最初の方法である。
これは高度に免疫原性のＬＰＳ蛋白質−りん脂質錯体で
ある。

【００１３】５倍の重量の氷冷水中に懸濁した細胞を４
℃下に３時間、等量の０．５Ｎ ＴＣＡで処理する。懸
濁液を遠心分離し、上清を希釈水酸化ナトリウムで中和
し、２倍の量の水で沈降させた錯体を透析し、遠心分離
して細胞片を除去すると共に凍結乾燥する。

【００１４】２．エチレングリコールによる抽出。

【００１５】エチレングルコールにより、細胞から遊離
多糖および／または全Ｏ−抗原錯体を選択的に抽出す
る。抽出条件はきわめて緩やかであり、抽出物質の変性
または変異のリスクは低い。アセトンで乾燥させた細胞
を、１０部の新鮮な蒸留ジエチレングリコールにより、
室温で毎日数時間、攪拌して抽出する。抽出物を濾過
し、透析すると共に遠心分離する。最後に−１０℃でア
セトンを添加してＯ−抗原錯体を沈降させる。さらに、
飽和した硫酸アンモノウムの１％水溶液で分画すること
により精製を行う。この方法は時間がかかり、収率が低
い。

【００１６】３．加熱したフェノールによる抽出。

【００１７】上述した２つの抽出法は有効であるが、１
９６５年にＷＥＳＴＰＨＡＬとＪＡＮＮにより達成され
た分離法が最も多く用いられる。抽出された物質は蛋白
質がわずかに含まれている。Ｓ＆Ｒ型のＬＰＳの抽出法
としては充分であるが、Ｒ変異菌については不完全であ
ることが多い。

【００１８】４．ジメチルスルフォキシオド（ＤＭＳ
Ｏ）による抽出。

【００１９】高温（＞６０℃）で蛋白質によりＬＰＳを
抽出する。この抽出物から、蛋白質を含まないＬＰＳ
が、Ｏ−アセチル化により得ることができ、その後にク
ロロホルムで精製することができる。最後に、ＤＭＳＯ
（室温でアセトン中２％）で脱アセチル化する。脱アセ
チル化時に一部のエステル結合脂肪酸をリピドＡから除
去することが可能である。

【００２０】５．フェノールクロロホルム石油エーテル
（ＰＣＰ）による抽出。

【００２１】フェノール水による方法では、Ｒ変異菌に
存在する多量の疎水性内毒素が抽出されないことが多
い。フェノールクロロホルム−石油エテール（２：５：
８ ｖ／ｖ／ｖ）の混合液に均質化された乾燥菌を遠心
分離し、上清を採取する。気化により上清からクロロホ
ルムおよび石油エーテルを除去する。水を滴下して加
え、残ったフェノール中のＬＰＳを沈降させる。この沈
降物を遠心分離した後、石油エーテルで洗浄し、さらに
４時間、１０５，０００で超遠心分離により精製する。

【００２２】Ｂ．電気透析 ＳおよびＲの両形態から分離した内毒素は通常、Ｎ
ａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺など多くの一価陽イオンおよ
び二価陽イオンのほか、スペルミジン、スペルミン等の
一部のポリアミンと結合している。これらの陽イオンは
ＬＰＳの溶解度および凝結に対して強力な影響を示す。
ＬＰＳの電気透析が導入され、関連塩基で中和すること
により塩に置換することができた。ＬＰＳのトリエチル
アミン塩は水溶性がきわめて高い。この塩は超遠心分離
において沈降されず、変性生物学的活性を示す。中和さ
れていない電気透析ＬＰＳ調製液は長時間にわたって不
安定となり、自己溶解により保存時に爆発する。

【００２３】ガラクトースアミン感作されていないマウ
スにおいて、大腸菌の毒性ＬＰＳの致死量は８０μｇ／
マウスであり、本発明による非毒性ＬＰＳの致死量は３
０μｇ／マウスである。

【００２４】Ｒ．ＳｐｈｅａｒｏｉｄｅｓやＲ．ｃａｐ
ｓｕｌａｔｕｓのＬＰＳなどその他の非毒性ＬＰＳは、
新規に認められた用量よりも高い用量で発熱性であり致
死的であることが報告された。

【００２５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｃｏｐｐｅ
ｒ ｍｉｎｅｓ地域の土壌から単離されたＡｃｉｄｐｈ
ｉｌｌｕｍ属に属する新しい菌株から新規のリポ多糖体
を調製する方法を提供することを主な目的とする。

【００２６】また、本発明は、内毒素症を来す毒性ＬＰ
Ｓ作用を媒介する作用物質であるが、それ自体は非毒性
作用物質としての新規のリポ多糖体を調製する方法を提
供することを目的とする。

【００２７】

【課題を解決するための手段】このように、本発明によ
れば、上述した内毒素ショックに有効な新規の非毒性リ
ポ多糖体を調製するための方法であって、 １）標準条件下に通常の普通培地において補助ＭＴＣＣ
１９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属の細菌を増
殖させるステップと、 ２）周知の方法で細菌を分離した後、炭素および窒素源
を除く同一の増殖培地で反復洗浄するステップと、 ３）７０〜９０℃の温度下に親油性溶媒で細菌を抽出す
るステップと、 ４）得られた物質を冷却し、繰り返し遠心分離するステ
ップと、 ５）ステップ（ｄ）から得られた上清を透析するステッ
プと、 ６）ステップ（ｅ）から得られた透析物質を凍結乾燥す
るステップと、 ７）極性溶媒で凍結乾燥物質を処理し、リポ多糖体を沈
降させるステップと、 ８）リポ多糖体を濾過し、乾燥するステップと、からな
る方法が得られる。

【００２８】細菌培養株は、グルコースおよび酵母抽出
物を含有する合成培地において増殖させ、７２〜１２０
時間にわたって３０〜３９℃の温度でインキュベートす
ることができる。

【００２９】細胞の増殖後、約３０〜１０分間にわたり
４０００〜１００００ｒｐｍの遠心分離で回収した後、
グルコースと酵母抽出物を除く増殖に用いた同一の培地
で洗浄する。

【００３０】次に細菌の細胞を４炭素を超えない芳香族
フェノールまたは脂肪族アルカノールなど加熱した親油
性溶媒および水で処理する。さらに上記の混合液を６０
〜１２０分間強く攪拌した。その後、混合液を氷で２〜
１２℃の温度に冷却する。次にそれぞれ１５〜３０分
間、４０００〜１００００ｒｐｍで遠心分離した。

【００３１】上記の方法を３回繰り返す。すべての上清
を２〜５日間、徹底的に透析した。この物質を沈降さ
せ、濃度１．５％〜２．５％の溶液の形で２〜４℃の温
度下に４〜６時間、１０５，０００〜１７０，０００ｒ
ｐｍで超遠心分離にかけた。全体の方法で使用した水は
発熱性がなく、環境からの汚染を回避するよう留意し
た。遠心分離を繰り返して行い、ほぼ精製されたＬＰＳ
を得た。次にこれをエタノールなど極性溶媒で処理し、
２０〜４５分間、８５００〜１４０００ｒｐｍの速度で
遠心分離により採取した沈降物を得た後、凍結乾燥して
冷蔵庫に保存した。

【００３２】本発明において調製される非毒性ＬＰＳ
（ＮＴＬＰＳ）は、グラム陰性菌から以前に報告された
ＮＴＬＰＳ源としてのＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍの周知の
菌株と異なるＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ菌からの他に類型
をみないＬＰＳである（６）。

【００３３】通常、リピドＡの基本構造は、鎖の長さが
程度が異なる４〜８個のアシル鎖を有する。ＬＰＳの構
造機能関連の比較研究（７）では、大腸菌の多様な変形
が明らかにされており、それらの生物活性はいくつかの
顕著な特徴を示した。より多くのβヒドロキシル化およ
びより少数の脂肪アシル鎖により、１０⁷の係数で生物
活性が劇的に低下した。本発明により調製された非毒性
ＬＰＳはβヒドロキシル化脂肪酸アシル鎖の割合が高
く、その非毒性が原因とみられるミリスチン酸鎖である
が、ＮＴＬＰＳは大腸菌のＬＰＳと免疫学的に交差反応
性である。

【００３４】この非毒性ＬＰＳ（すなわちＭＴＣＣ１９
７９株からのＧＳ１８ｈ ＬＰＳ）の組成は以下の通り
である。

【００３５】 Ａ． 糖 全体に占める割合（％） ガラクトース ７７．３ グルコース ９．０６ マンノース ３．４ Ｌ−Ｄ ヘプトース １．２ Ｂ． 脂肪酸 全体に占める割合（％） Ｒ−ＯＨ−Ｃ１４：０ ５８．３ Ｃ１６：０ １１．９５ Ｃ１２：０ ３．７５ Ｃ１６：１ １４．６３ 本発明による非毒性ＬＰＳは、電気泳動的に大腸菌のＬ
ＰＳに比べて、低分子量の成分からなる。大腸菌との免
疫学的交差反応性の程度が高いことは、構造的に大腸菌
のＬＰＳときわめて緊密な関係のある物質であることを
示す。

【００３６】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明につい
て詳細に述べるが、これらは本発明の範囲を制限するも
のではない。

【００３７】実施例１ ＭＴＣＣ１９７９の菌株を培養し、回収すると共に以下
の条件下に７０ｎｍｓ（湿重量）、４ｇｍｓ（乾燥重
量）を計量した。

【００３８】 維持パラメータ 条件 培養リットル（２日間） ５ ｌ（リットル） 細菌細胞の重量 ４ ｇｍｓ（乾燥重量） 発熱物質を含まない水の量 ７０ ｍｌ 蒸留フェノールの量 ７０ ｍｌ 温度 ６８ ℃ 攪拌時間 ３０ 分 遠心分離の速度 １０５，０００ ｇ 遠心分離の持続時間 ４ 時間 得られた未精製ＬＰＳ １００ ｍｇ 得られた精製ＬＰＳ ７５ ｍｇ 実施例２ 培養リットル（２日間） ５ ｌ（リットル） *細菌細胞の重量 ６ ｇｍｓ（乾燥重量） （高いグルコース濃度） （２ ｇｍｓ．／ｌ） 発熱物質を含まない水の量 ７０ ｍｌ 蒸留フェノールの量 ７０ ｍｌ 温度 ６８ ℃ 攪拌時間 ３０ 分 遠心分離の速度 １０５，０００ ｇ 得られた未精製ＬＰＳ １３０ ｍｇ 得られた精製ＬＰＳ １０５ ｍｇ 実施例３ 培養リットル（２日間） ２．５ ｌ（リットル） 細菌細胞の重量 ２ ｇｍｓ 発熱物質を含まない水の量 ３５ ｍｌ 蒸留フェノールの量 ３５ ｍｌ 抽出温度 ７５ ℃ 遠心分離の持続時間 ３０ 分 遠心分離の速度 １０５，０００ ｇ 遠心分離の持続時間 ４ 時間 得られた未精製ＬＰＳ ５２ ｍｇ 得られた精製ＬＰＳ ３８ ｍｇ 本発明により精製されたリポ多糖体の非毒性の実験的所
見。それぞれ５匹からなる２群のマウスについて、本発
明により精製されたリポ多糖体と大腸菌のリポ多糖体を
投与して生存率の試験を行った。

【００３９】１群には生理的食塩水のみを注射し、別の
１群にはＬＰＳを注射した。５日間に死亡例は認められ
なかった。５日目に両群に毒性ＬＰＳを注射した結果、
生理的食塩水群は７２時間以内に死亡したが、非毒性リ
ポ多糖体群は完全に生存し、死亡例は認められなかっ
た。注射はすべてマウスに軽く麻酔した後に行った。

【００４０】

【発明の効果】本発明による方法で調製されたＬＰＳす
なわちリポ多糖体の毒性は、周知のＬＰＳに比べて１５
０〜２００分の１であり、大腸菌のＬＰＳに比べて２０
０万分の１、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰＳに比
べて１５０〜２００分の１である。この非毒性ＬＰＳは
内毒血症に対する予防薬として使用することがが勧めら
れる［Ｓａｎｄｏｚ ｐｈａｒｍａなどの会社は、毒性
ＬＰＳの拮抗的活性を有する毒性のきわめて少ない合成
リピドＡの調製液を積極的に販売している。］

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アブヒジット ナヤク インド国 カルカッタ−700 032 マリッ ク ロード ラジャ エス．シー．４ イ ンディアン インスティテュート オブ ケミカル バイオロジー内 (72)発明者 パタキ チャラン バンドヨパジャイ インド国 カルカッタ−700 032 マリッ ク ロード ラジャ エス．シー．４ イ ンディアン インスティテュート オブ ケミカル バイオロジー内 (72)発明者 スマンタ バス インド国 カルカッタ−700 032（番地な し） インディアン アソシエイション フォー ザ カルテベイション オブ サ イエンス内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 内毒血症の予防に有効な新規の非毒性リ
   ポ多糖体すなわちリポ多糖体の調製方法であって、 ａ．標準条件下に通常の普通培地において補助ＭＴＣＣ
   １９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属の細菌を増
   殖させるステップと、 ｂ．周知の方法で細菌を分離した後、炭素および窒素源
   を除く同一の増殖培地で反復洗浄するステップと、 ｃ．７０〜９０℃の温度下に親油性溶媒で細菌を抽出す
   るステップと、 ｄ．得られた物質を冷却し、繰り返し遠心分離するステ
   ップと、 ｅ．ステップ（ｄ）から得られた上清を透析するステッ
   プと、 ｆ．ステップ（ｅ）から得られた透析物質を凍結乾燥す
   るステップと、 ｇ．極性溶媒で凍結乾燥物質を処理し、リポ多糖体を沈
   降させるステップと、 ｈ．リポ多糖体を濾過し、乾燥するステップと、を含む
   方法。
2. 【請求項２】 普通培地には炭素源としてグルコース、
   ガラクトースなど六炭糖および酵母抽出物、硫酸アンモ
   ニウムなどの窒素源、リン酸マグネシウム二カリウム、
   塩酸カリウムなどのミネラルを含む請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 細菌の分離は、４０００〜１０，０００
   ｒｐｍでの遠心のほか、高速遠心、膜濾過、長時間重力
   沈降などの方法で実施する請求項１乃至２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 使用する親油性溶媒にはフェノールブタ
   ノールおよび水が含まれる請求項１乃至３に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 リポ多糖体の凍結乾燥はフリーズドライ
   法で実施される請求項１乃至４に記載の方法。
6. 【請求項６】 沈降に使用する極性溶媒は、炭素原子が
   ４個を超えない低脂肪族鎖のアルカノールなどである請
   求項１乃至５記載の方法。