JPH0930984A - アルドースリダクターゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アスチルビン類、タキシフォリン、またはア
スチルビン類を含有する黄杞葉抽出物を有効成分として
含有するアルドースリダクターゼ阻害剤。 【効果】 高血糖状態になると亢進するソルビトール経
路の律速酵素であるアルドースリダクターゼの作用を阻
害することにより、各種糖尿病合併症の予防と治療に有
効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖尿病合併症であ
るニューロパシー、白内障、網膜症、腎障害等の起因酵
素とされているアルドースリダクターゼの活性を阻害す
る作用を有し糖尿病合併症の予防と治療に有効な、アル
ドースリダクターゼ阻害剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ニューロパシー、白内障、網膜症、腎障
害等の糖尿病合併症は、高血糖によって異常になったポ
リオール代謝、すなわちソルビトール経路の活性化によ
るものとされている。

【０００３】ソルビトール経路はグルコースとフルクト
ースの相互転換経路と考えられ、全身組織に見いだされ
ていて、高血糖状態になると急激に亢進する。その律速
酵素はアルドースリダクターゼである。この経路では中
間代謝産物としてソルビトールが生成し、生成したソル
ビトールは代謝されにくくまた細胞壁を通過しないの
で、ソルビトール経路の活性亢進とともにソルビトール
の細胞内蓄積が進む。その結果、細胞内浸透圧の亢進→
細胞膨化→酸素欠乏というメカニズムで細胞障害が起こ
ると考えられている。実際、糖尿病患者の赤血球のソル
ビトールは高い値を示し、合併症と密接に結び付いてい
るという報告がある。

【０００４】したがって、糖尿病の合併症にはソルビト
ール経路の律速酵素であるアルドースリダクターゼの作
用を阻害することによりソルビトールの細胞内蓄積を抑
制するのが最も有効な対策となる。

【０００５】このような観点から、近年、アルドースリ
ダクターゼ阻害作用を有する物質の探求が進められ、合
成物質・エパレルスタットが開発されたほか、桂皮、芍
薬、桑、甘草等の抽出物が有効であると報告されてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性が高い天然物を原料とする新規なアルドースリダクタ
ーゼ阻害剤を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明が提供することに
成功したアルドースリダクターゼ阻害剤は、アスチルビ
ン、ネオアスチルビン、イソアスチルビン、ネオイソア
スチルビンおよびタキシフォリンが強いアルドースリダ
クターゼ阻害作用を示すという新規な知見に基づくもの
であって、これらの化合物の１種または２種以上を有効
成分とするものである。

【０００８】アスチルビン、ネオアスチルビン、イソア
スチルビンおよびネオイソアスチルビンは、タキシフォ
リンをアグリコンとする、互いに立体異性体の関係にあ
るジヒドロフラボノール配糖体である（以下、これらの
立体異性体群をアスチルビン類という）。

【０００９】アスチルビン類は後述するように黄杞葉に
多量に含まれているので、アスチルビン類を含有する黄
杞葉抽出物もまた、本発明のアルドースリダクターゼ阻
害剤の構成成分とすることができる。

【００１０】上記本発明のアルドースリダクターゼ阻害
剤の有効成分は、アルドースリダクターゼ活性に対して
不拮抗阻害形式を示すことが確認されている。

【００１１】

【発明の実施の形態】アスチルビン類は、クルミ科の常
緑高木である黄杞（コウキ，Engelhardtiachrysolepi
s）の葉の部分に含まれているほか、ネジキ（Lyonia ov
alifolia）、センリョウ（Chloranthus glaber)、ケナ
シサルトリイバラ（Smilax glabra）、チダケサシ（Ast
ilbe microphylla)、トリアシショウマ(Astilbe odonto
phylla)等にも含まれていることが確認されており、こ
れらの植物体から抽出するのが最も簡単な入手方法であ
る。

【００１２】黄杞葉は特にアスチルビン類の含有率が高
い抽出物を与える。しかも、中国南部で古くから甘茶の
一種として利用されたり普通の茶に配合されたりしてお
り、安全性に問題がない。したがって、本発明のアルド
ースリダクターゼ阻害剤の原料としてきわめて有利なも
のである。

【００１３】以下、黄杞葉を原料にして本発明のアルド
ースリダクターゼ阻害剤を製造する方法につき詳述す
る。

【００１４】黄杞葉からアスチルビン類を抽出するのに
使用可能な溶媒の例としては、メタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、ブタノール等、炭素原子数１〜
４の低級アルコール；酢酸エチル等の低級脂肪酸エステ
ル；プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、
グリセリン等の多価アルコール；水等があり、これらの
混合物を用いることもできる。

【００１５】重量比で５〜１５倍程度の抽出溶媒に乾燥
した黄杞葉を浸漬し、常温ないし還流加熱下に可溶性成
分を溶出させると、アスチルビン類を含有する抽出液が
得られる。溶媒を留去して得られる抽出物は、そのま
ま、あるいは簡単な脱臭処理、脱色処理等を施すだけで
も、アルドースリダクターゼ阻害剤として使用すること
ができる。

【００１６】この抽出物に、液液分配抽出、クロマトグ
ラフィー、イオン交換樹脂処理等、任意の精製処理を施
してアスチルビン類の含有率を高めれば、アルドースリ
ダクターゼ阻害活性がより強く、使い易いものとなる。

【００１７】また、塩酸、硫酸等の鉱酸、あるいはヘス
ペリジナーゼ、ナリンギナーゼ、アントシアナーゼ等の
加水分解酵素を用いて上記抽出物または精製物を加水分
解処理すると、アスチルビン類の全部または一部が加水
分解されてタキシフォリンになり、タキシフォリン含有
率の高いものを得ることができる。

【００１８】アスチルビン類を含有する黄杞葉抽出物お
よびそれから有利に得られるアスチルビン類やタキシフ
ォリンは、それら単独で、あるいは２種以上を併用し
て、さらには他のアルドースリダクターゼ阻害物質と併
用して、本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤とする
ことができる。併用可能なアルドースリダクターゼ阻害
物質の例としては、桑、甘草、イカリソウ、ギムネマ、
桂皮、芍薬、大棗、生姜、蒼朮、附子等の抽出物があ
る。

【００１９】本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤に
は、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、散剤、液剤、シロ
ップ剤等、任意の剤形を採用することができ、製剤化に
当たっては賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、安定剤、
矯味・矯臭剤、香料等の助剤を必要に応じて適宜配合す
ることができる。

【００２０】本発明品の安全性に関してマウスを用いた
急性毒性試験を行なったが、黄杞葉抽出物は１g/kgを、
アスチルビンは５g/kgを、それぞれ経口投与しても死亡
例は認められなかった。また変異原性について、突然変
異に直接関与しているumu-遺伝子の発現を指標とする試
験法により試験したが、黄杞葉抽出物は６０〜０.０９m
g/mlの範囲で、またアスチルビン類は２０〜０.０３mg/
mlの範囲で、いずれも代謝活性剤Ｓ-９mixの有無にかか
わらず変異原性は認められなかった。

【００２１】以上により、本発明のアルドースリダクタ
ーゼ阻害剤の安全性はまったく問題がないと考えられ
る。

【００２２】本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤の
好適投与量は、アスチルビン類として約５〜５００mg／
日である。

【００２３】本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤
は、任意の飲食品、化粧品等に配合または付着させてお
き、日常的な飲食等を通じて体内に摂取されるようにし
てもよい。本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤の有
効成分であるアスチルビン類は水に溶けやすく、しかも
弱い甘味を有するだけなので、風味に悪影響を及ぼすお
それなしに飲食品に配合することができる。

【００２４】

【実施例】

実施例１ 黄杞葉の乾燥粉砕物２００ｇを２リットルの熱水で２時
間抽出し、得られた抽出液を減圧下に濃縮して３２ｇの
熱水抽出物を得た。また、熱水の代わりに９０容積％エ
タノールを用いたほかは上記と同様にして、３４ｇのエ
タノール抽出物を得た。上記熱水抽出物およびエタノー
ル抽出物についてアスチルビン類を定量した結果を表１
に示す。

【００２５】

【表１】 アスチルビン類の含有率（％） 化合物 熱水抽出物 エタノール抽出物 アスチルビン ３.８７ １３.１１ ネオアスチルビン ２.２８ １.２０ イソアスチルビン ０.８１ ０.９６ ネオイソアスチルビン ２.７１ １.０１

【００２６】次に、上記エタノール抽出物を２００mlの
水に懸濁させ、２００mlのクロロホルムで３回抽出し、
続いて２００mlの酢酸エチルで３回抽出した。得られた
酢酸エチル抽出物をさらに高速液体クロマトグラフィー
（カラム：TSKgel ODS-120T,21.5mm×30cm；溶出溶媒：
アセトニトリル／0.05％トリフルオロ酢酸＝20：80）に
より分離し、アスチルビン２.２９ｇ、ネオアスチルビ
ン０.２２ｇ、イソアスチルビン０.２１ｇ、ネオイソア
スチルビン０.１８ｇを得た。

【００２７】また、得られたアスチルビン０.５ｇを５
０mlの水に溶解し、５０mlの４Ｎ塩酸を加え、沸騰水浴
上で２時間加熱したのち中和、５０mlの酢酸エチルで３
回抽出することにより、タキシフォリン０.２１ｇを得
た。

【００２８】上述のようにして得られた熱水抽出物、エ
タノール抽出物、アスチルビン、ネオアスチルビン、イ
ソアスチルビン、ネオイソアスチルビンおよびタキシフ
ォリンについて、下記の方法でアルドースリダクターゼ
の活性阻害率を求めた。

【００２９】〔アルドースリダクターゼ活性阻害率測定
法〕アルドースリダクターゼの調製：１０mMβ-メルカ
プトエタノールを含む135mMリン酸緩衝液（pＨ7.0）に
ブタ水晶体を入れてホモジナイズ後、10,000×ｇで３０
分間遠心分離した。得られた上清液を７５％飽和となる
ように硫酸アンモニウムを加えた後、10,000×ｇで１０
分間遠心分離した。得られた沈殿物を前記緩衝液に溶解
し、さらに10,000×ｇで１０分間遠心分離し、その上清
液を粗アルドースリダクターゼ溶液とした。

【００３０】アルドースリダクターゼ活性阻害率の測
定：下記の酵素反応液を調製する。 ３mMグリセルアルデヒド溶液 （400mM硫酸リチウムを含むpＨ6.2の50mMリン酸緩衝液使用) ９００μl 粗アルドースリダクターゼ溶液 ５０μl 試料溶液（濃度０.１％） ５０μl

【００３１】この酵素反応液（試料濃度は50μg/mlにな
る）を３７℃で２分間加温した後、２.５mMのＮＡＤＰ
Ｈ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸）５０μlを添加し、ＮＡＤＰＨの吸収波長３４０nm
の吸光度を測定する（アルドースリダクターゼはＮＡＤ
ＰＨを補酵素としてグリセルアルデヒドをポリオールに
還元する酵素であり、この反応に伴って、ＮＡＤＰＨは
ＮＡＤＰに変化する。したがって、生成したＮＡＤＰＨ
が少なく、測定される吸光度の変化量が小さければ、ア
ルドースリダクターゼの活性が阻害されていることにな
る）。また、コントロールとして、試料溶液の代わりに
水を加えた場合について、同様の操作を行う。なお、上
記操作において３７℃で２分間加温する酵素反応の開始
前にも、吸光度を測定する。

【００３２】測定結果から、下記の計算式によりアルド
ースリダクターゼ活性の阻害率を算出する。 阻害率（％）＝〔１−（Ａ₀−Ａ₁）／（Ａ₂−Ａ₃）〕×
１００ 但し、Ａ₀：酵素反応開始前の吸光度 Ａ₁：酵素反応後の吸光度 Ａ₂：コントロール；酵素反応開始前 Ａ₃：コントロール；酵素反応後 その結果を表２に示す。

【００３３】

【表２】試 料 阻害率（％） 黄杞葉熱水抽出物 ５６ 黄杞葉エタノール抽出物 ５１ アスチルビン ５６ ネオアスチルビン ５８ イソアスチルビン ５９ ネオイソアスチルビン ５５ タキシフォリン ８４

【００３４】実施例２ 赤血球中のソルビトール蓄積に対する本発明アルドース
リダクターゼ阻害剤構成成分の作用を次の方法で調べ
た。

【００３５】まず健常人の静脈から採取した血液をヘパ
リン処理し、生理食塩水で３回遠心洗浄する。得られた
赤血球は、ヘマトクリット値が３０％前後になるように
生理食塩水に懸濁させる。この赤血球懸濁液１mlと、28
mMグルコース（Krebs-Ringer緩衝液使用）３.９mlおよ
び試料溶液（濃度0.25％）１００μlを混合し（試料濃
度は５０μg/mlになる）、５％二酸化炭素下、３７℃で
６０分間反応させる。６％過塩素酸３mlを加えて反応を
止め、４℃・２０００×ｇで１０分間遠心分離して除蛋
白を行う。その後、上清液に２.５Ｍ炭酸カリウムを加
えて中和した後、赤血球中のソルビトール量を、ソルビ
トールデヒドロゲナーゼ法を用いて定量する。

【００３６】ソルビトールデヒドロゲナーゼ法：１ml中
に50mMグリシン緩衝液（pＨ9.4）および０.２mMＮＡＤ
（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）と
０.６４ユニットのソルビトールデヒドロゲナーゼを含
むように調製した酵素反応液に、前記除蛋白上清液０.
５mlを加えて反応させる。この反応によって生じたＮＡ
ＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
の量を、励起波長３６６nm、蛍光波長４５２nmで検出す
る（この反応は細胞内のソルビトールとＮＡＤをソルビ
トールデヒドロゲナーゼによってフラクトースとＮＡＤ
Ｈに変換させる反応であるから、反応後のＮＡＤＨ量が
多ければソルビトールの含有量が多いということにな
る。）。コントロールとして、試料溶液の代わりに水を
加えた場合について同様の操作を行う。

【００３７】コントロールのソルビトール含有量を１０
０％として計算した結果を表３に示す。赤血球中にソル
ビトールが蓄積するのをアスチルビン類等が阻害したこ
とがわかる。

【００３８】

【表３】 試 料 赤血球中ソルビトール含有量（％） コントロール １００ 黄杞葉熱水抽出物 ６７ 黄杞葉エタノール抽出物 ６８ アスチルビン ６９ ネオアスチルビン ６５ イソアスチルビン ６７ ネオイソアスチルビン ６９ タキシフォリン ３２

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば古くから飲料に利用され
て来た黄杞葉を原料とする新規なアルドースリダクター
ゼ阻害剤が提供された。この阻害剤は安全性が高く、不
快な味やにおいも無いので、これを配合した糖尿病合併
症予防・治療作用を有する飲食物を提供し日常的な摂取
を容易にすることも可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/70 Ａ６１Ｋ 31/70 // Ｃ０７Ｄ 311/28 Ｃ０７Ｄ 311/28

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスチルビン、ネオアスチルビン、イソ
   アスチルビン、ネオイソアスチルビンおよびタキシフォ
   リンからなる群から選ばれた化合物の１種または２種以
   上を有効成分として含有することを特徴とするアルドー
   スリダクターゼ阻害剤。
2. 【請求項２】 アスチルビン、ネオアスチルビン、イソ
   アスチルビンおよびネオイソアスチルビンからなる群か
   ら選ばれた化合物の１種または２種以上を含有する黄杞
   葉抽出物を有効成分として含有することを特徴とするア
   ルドースリダクターゼ阻害剤。