JPH0931095A - 複合糖質の製法 - Google Patents
複合糖質の製法Info
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- JPH0931095A JPH0931095A JP7203945A JP20394595A JPH0931095A JP H0931095 A JPH0931095 A JP H0931095A JP 7203945 A JP7203945 A JP 7203945A JP 20394595 A JP20394595 A JP 20394595A JP H0931095 A JPH0931095 A JP H0931095A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 糖鎖の転移反応を利用して複合糖ペプチドの
簡便な製造方法を提供する。 【構成】 エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖を下記式（化１） 【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）で示されるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ
Ａｃ）残基を有する合成基質（糖鎖受容体）に転移させ
ることにより複合糖ペプチドを製造する方法。 【効果】 望み通りの天然にはない複合糖質を合成で
き、生理活性複合糖ペプチドの製造に有効である。
簡便な製造方法を提供する。 【構成】 エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖を下記式（化１） 【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）で示されるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ
Ａｃ）残基を有する合成基質（糖鎖受容体）に転移させ
ることにより複合糖ペプチドを製造する方法。 【効果】 望み通りの天然にはない複合糖質を合成で
き、生理活性複合糖ペプチドの製造に有効である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ペプチドの合成反
応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた生理活性複
合糖ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に
応用される。
応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた生理活性複
合糖ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に
応用される。
【０００２】
【従来の技術】糖質および複合糖質は生物の細胞、体液
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収分解等
の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を持
つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュー
プラスミノーゲンアクチベーターがあり、動物細胞を用
い遺伝子工学的に作られたこれら糖タンパク質が医薬と
して利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖
鎖を持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは
糖ペプチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖
のＡｓｎにＧｌｃＮＡｃを介して結合している。
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収分解等
の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を持
つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュー
プラスミノーゲンアクチベーターがあり、動物細胞を用
い遺伝子工学的に作られたこれら糖タンパク質が医薬と
して利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖
鎖を持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは
糖ペプチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖
のＡｓｎにＧｌｃＮＡｃを介して結合している。
【０００３】タンパク質あるいは生理活性ペプチド等に
糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換え
ることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立
つことが期待される。糖鎖を酵素的に改変する方法とし
ては、１）転移酵素あるいはエキソグリコシダーゼによ
る方法と、２）エンドグリコシダーゼによる方法が考え
られる。
糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換え
ることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立
つことが期待される。糖鎖を酵素的に改変する方法とし
ては、１）転移酵素あるいはエキソグリコシダーゼによ
る方法と、２）エンドグリコシダーゼによる方法が考え
られる。
【０００４】１）の方法としては、例えばＤ．Ｈ．ジョ
ジアッセ（D. H. Joziasse）ら［ヨーロピアン ジャー
ナル オブ バイオケミストリー（Eur. J. Bioche
m.)、 第１９１巻、第７５〜８３頁（１９９０）］の報
告があるが、これは糖鎖の非還元末端からの逐次反応で
ある。また、最近、Ｍ．シャスター（M. Schuster）ら
［ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサエテ
イ（J. Amer. Chem. Soc.）、第１１６巻、第１１３５
〜１１３６頁（１９９４）］は数種のグリコシルトラン
スフェラーゼを組み合わせた糖鎖の固相合成法を報告し
ている。
ジアッセ（D. H. Joziasse）ら［ヨーロピアン ジャー
ナル オブ バイオケミストリー（Eur. J. Bioche
m.)、 第１９１巻、第７５〜８３頁（１９９０）］の報
告があるが、これは糖鎖の非還元末端からの逐次反応で
ある。また、最近、Ｍ．シャスター（M. Schuster）ら
［ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサエテ
イ（J. Amer. Chem. Soc.）、第１１６巻、第１１３５
〜１１３６頁（１９９４）］は数種のグリコシルトラン
スフェラーゼを組み合わせた糖鎖の固相合成法を報告し
ている。
【０００５】一方、２）のエンドグリコシダーゼを用い
た糖転移反応としては、Ｒ．Ｂ．トリムブル（R. B. Tr
imble）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（J. Biol. Chem.）、第２６１巻、第１２００
０〜１２００５頁（１９８６）］のフラボバクテリウム
メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningoseptic
um）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼ（エンド−Ｆ）に関するもの、Ｒ．Ｍ．バーデールス
（R. M. Bardales）ら［ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６４巻、
第１９８９３〜１９８９７頁（１９８９）］のディプロ
コッカス ニューモニエ（Diprococcuspneumoniae）由
来のエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに
関するものがあり、前者はグリセロールが受容体に、ま
た後者はグリセロール、ｐ−ニトロフェノール、セリ
ン、スレオニン等が受容体になるという報告である。そ
の後、竹川ら［特開平５−６４５９４号（１９９３）］
およびＫ．タケガワ（K. Takegawa）ら［ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Che
m.）、第２７０巻、第３０９４〜３０９９頁（１９９
５）］がアルスロバクタープロトホルミエ（Arthrobact
er protophormiae）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）による糖質への糖鎖転
移反応を、また、Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）ら［バ
イオケミカル バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、第２
０３巻、第２４４〜２５２頁（１９９４）］はムコール
ヒエマリス（Mucor hiemalis）由来のエンド−Ｍによ
る糖質への糖鎖転移反応を報告した。
た糖転移反応としては、Ｒ．Ｂ．トリムブル（R. B. Tr
imble）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（J. Biol. Chem.）、第２６１巻、第１２００
０〜１２００５頁（１９８６）］のフラボバクテリウム
メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningoseptic
um）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼ（エンド−Ｆ）に関するもの、Ｒ．Ｍ．バーデールス
（R. M. Bardales）ら［ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６４巻、
第１９８９３〜１９８９７頁（１９８９）］のディプロ
コッカス ニューモニエ（Diprococcuspneumoniae）由
来のエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに
関するものがあり、前者はグリセロールが受容体に、ま
た後者はグリセロール、ｐ−ニトロフェノール、セリ
ン、スレオニン等が受容体になるという報告である。そ
の後、竹川ら［特開平５−６４５９４号（１９９３）］
およびＫ．タケガワ（K. Takegawa）ら［ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Che
m.）、第２７０巻、第３０９４〜３０９９頁（１９９
５）］がアルスロバクタープロトホルミエ（Arthrobact
er protophormiae）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）による糖質への糖鎖転
移反応を、また、Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）ら［バ
イオケミカル バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、第２
０３巻、第２４４〜２５２頁（１９９４）］はムコール
ヒエマリス（Mucor hiemalis）由来のエンド−Ｍによ
る糖質への糖鎖転移反応を報告した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】複合糖質は糖鎖部分と
糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラ
ミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付
与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆ
る糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内
での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強さ
れたり天然にない生物機能が付加されれば医薬品に応用
した場合に有用である。また、複合糖質における糖鎖の
もつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手段がなかっ
たために、十分には解明されていないが、その役割の解
析のための重要な手段を提供する。
糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラ
ミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付
与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆ
る糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内
での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強さ
れたり天然にない生物機能が付加されれば医薬品に応用
した場合に有用である。また、複合糖質における糖鎖の
もつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手段がなかっ
たために、十分には解明されていないが、その役割の解
析のための重要な手段を提供する。
【０００７】糖質あるいは複合糖質に糖鎖を新たに付加
あるいは改変する方法としては、エキソグリコシダーゼ
またはグリコシルトランスフェラーゼを用いた糖残基を
一つ一つ逐次的に付加する酵素法が考えられる。また、
エンド−Ａやエンド−Ｍ等のエンドグリコシダーゼによ
る方法は複合糖鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転
移させる、より効率的な方法を提供する。
あるいは改変する方法としては、エキソグリコシダーゼ
またはグリコシルトランスフェラーゼを用いた糖残基を
一つ一つ逐次的に付加する酵素法が考えられる。また、
エンド−Ａやエンド−Ｍ等のエンドグリコシダーゼによ
る方法は複合糖鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転
移させる、より効率的な方法を提供する。
【０００８】天然の糖タンパク質あるいは糖ペプチドの
糖鎖は、通常Ｎ結合型糖鎖として、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）は
セリンまたはスレオニンを示す］のアミノ酸配列のペプ
チド鎖のＡｓｎのアミド基に結合したＧｌｃＮＡｃを介
して結合している。即ちこのアミノ酸配列のＡｓｎに、
末端にＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖が付加され更に修
飾を受けてＮ結合型複合糖鎖は生合成される。従って、
天然にはこのアミノ酸配列のＡｓｎに結合した糖鎖以外
のＮ結合型糖鎖は見出されていない。
糖鎖は、通常Ｎ結合型糖鎖として、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）は
セリンまたはスレオニンを示す］のアミノ酸配列のペプ
チド鎖のＡｓｎのアミド基に結合したＧｌｃＮＡｃを介
して結合している。即ちこのアミノ酸配列のＡｓｎに、
末端にＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖が付加され更に修
飾を受けてＮ結合型複合糖鎖は生合成される。従って、
天然にはこのアミノ酸配列のＡｓｎに結合した糖鎖以外
のＮ結合型糖鎖は見出されていない。
【０００９】上述の酵素による糖鎖の付加あるいは改変
には糖鎖受容体であるタンパク質あるいはペプチドにＧ
ｌｃＮＡｃ残基があることが必要であり、糖鎖の付加あ
るいは改変は、従来、天然の糖タンパク質あるいは糖ペ
プチドの糖鎖をエンドグリコシダーゼあるいはエキソグ
リコシダーゼによりＧｌｃＮＡｃ残基を残して切り取っ
た後に別の糖タンパク質から調製した糖鎖を付け換える
ものに限られていた。
には糖鎖受容体であるタンパク質あるいはペプチドにＧ
ｌｃＮＡｃ残基があることが必要であり、糖鎖の付加あ
るいは改変は、従来、天然の糖タンパク質あるいは糖ペ
プチドの糖鎖をエンドグリコシダーゼあるいはエキソグ
リコシダーゼによりＧｌｃＮＡｃ残基を残して切り取っ
た後に別の糖タンパク質から調製した糖鎖を付け換える
ものに限られていた。
【００１０】タンパク質やペプチドの中にはＡｓｎ−Ｘ
−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列があっても糖鎖の付かないも
のも多く、例えばカルシトニンなどはその一例である。
またＡｓｎがあってもこの配列が無ければ生合成段階で
の糖鎖の付加はできない。
−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列があっても糖鎖の付かないも
のも多く、例えばカルシトニンなどはその一例である。
またＡｓｎがあってもこの配列が無ければ生合成段階で
の糖鎖の付加はできない。
【００１１】Ａｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃを結合した糖ペ
プチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ペプチド）を化学的に
合成できれば、上述の酵素法によりＡｓｎに結合したＧ
ｌｃＮＡｃ残基に糖鎖を付加した新しい複合糖ペプチド
を合成できる。この場合、ペプチド側にはＡｓｎ−Ｘ−
Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列は必ずしも必要とせずＡｓｎの
みあればよい。また、Ａｓｎに類縁のアミノ酸であるグ
ルタミン（Ｇｌｎ）にＧｌｃＮＡｃ残基を付けた糖ペプ
チドを合成すれば、同様の複合糖ペプチドの合成が期待
できる。
プチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ペプチド）を化学的に
合成できれば、上述の酵素法によりＡｓｎに結合したＧ
ｌｃＮＡｃ残基に糖鎖を付加した新しい複合糖ペプチド
を合成できる。この場合、ペプチド側にはＡｓｎ−Ｘ−
Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列は必ずしも必要とせずＡｓｎの
みあればよい。また、Ａｓｎに類縁のアミノ酸であるグ
ルタミン（Ｇｌｎ）にＧｌｃＮＡｃ残基を付けた糖ペプ
チドを合成すれば、同様の複合糖ペプチドの合成が期待
できる。
【００１２】ペプチドの合成は固相合成法による残基数
が数十個のものまでの合成が工業的に実用化されてい
る。
が数十個のものまでの合成が工業的に実用化されてい
る。
【００１３】本発明は、糖を結合したアミノ酸を少なく
とも１個含むペプチド即ち合成基質を化学的に合成し、
この足がかりの糖残基へ糖あるいは糖鎖を酵素的に転移
させれば新しい複合糖ペプチドが合成できるとの考えに
基づき開発されたものである。
とも１個含むペプチド即ち合成基質を化学的に合成し、
この足がかりの糖残基へ糖あるいは糖鎖を酵素的に転移
させれば新しい複合糖ペプチドが合成できるとの考えに
基づき開発されたものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基を有する
合成基質の合成と、２）ＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成
基質（糖鎖受容体）への酵素による糖鎖の転移反応の２
つの構成からなる。
発明は１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基を有する
合成基質の合成と、２）ＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成
基質（糖鎖受容体）への酵素による糖鎖の転移反応の２
つの構成からなる。
【００１５】本発明にいうＧｌｃＮＡｃ残基を有する合
成基質とは、下記式（化１）
成基質とは、下記式（化１）
【００１６】
【化１】（式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、
ペプチドあるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護し
たペプチドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、
アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキ
シル基を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２で
ある。）で示される化合物である。
ペプチドあるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護し
たペプチドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、
アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキ
シル基を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２で
ある。）で示される化合物である。
【００１７】本発明にいう合成基質とは、人為的に合成
される物質をいい、天然に存在する糖タンパク質あるい
は糖ペプチドのグリコシダーゼおよびプロテアーゼ等の
酵素分解処理により調製されるＧｌｃＮＡｃ残基を有す
る遊離のペプチドは（化１）の物質からは除外される。
される物質をいい、天然に存在する糖タンパク質あるい
は糖ペプチドのグリコシダーゼおよびプロテアーゼ等の
酵素分解処理により調製されるＧｌｃＮＡｃ残基を有す
る遊離のペプチドは（化１）の物質からは除外される。
【００１８】（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する
合成基質の合成は如何なる方法によってもよいが、例え
ばＴ．イナヅ（T. Inazu）ら［ペプチド ケミストリー
１９９３（Peptide Chemistry 1993 ）、第１０１〜
１０４頁（１９９４）］の報告した方法に準じて合成さ
れる。
合成基質の合成は如何なる方法によってもよいが、例え
ばＴ．イナヅ（T. Inazu）ら［ペプチド ケミストリー
１９９３（Peptide Chemistry 1993 ）、第１０１〜
１０４頁（１９９４）］の報告した方法に準じて合成さ
れる。
【００１９】例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基を有するヒト絨
毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のβサブユニットの部
分ペプチドｈＣＧ（β１２−１６）［Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ］（Ｉｌｅはイソロ
イシン、Ａｌａはアラニン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｌｅ
ｕはロイシンを示す。）の合成を例にとると、予め、Ｎ
末端を保護（９−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル、Ｆｍｏｃ）したアスパラギンのアミド基にＧｌｃＮ
Ａｃが結合したＦｍｏｃ−Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ誘導体
を合成しておき、ペプチドの固相合成の段階でＡｓｎの
代わりに用いてペプチド合成を行うと、ＡｓｎにＧｌｃ
ＮＡｃ残基が結合したｈＣＧ（β１２−１６）ペプチド
［Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ］が合成される。
毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のβサブユニットの部
分ペプチドｈＣＧ（β１２−１６）［Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ］（Ｉｌｅはイソロ
イシン、Ａｌａはアラニン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｌｅ
ｕはロイシンを示す。）の合成を例にとると、予め、Ｎ
末端を保護（９−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル、Ｆｍｏｃ）したアスパラギンのアミド基にＧｌｃＮ
Ａｃが結合したＦｍｏｃ−Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ誘導体
を合成しておき、ペプチドの固相合成の段階でＡｓｎの
代わりに用いてペプチド合成を行うと、ＡｓｎにＧｌｃ
ＮＡｃ残基が結合したｈＣＧ（β１２−１６）ペプチド
［Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ］が合成される。
【００２０】本発明の方法では、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列がなくても、アミノ酸配列の
中にＡｓｎがあればＡｓｎの代わりにＧｌｃＮＡｃがア
ミド基に結合したＡｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ）を用
いてペプチド合成することにより、任意のＧｌｃＮＡｃ
−Ａｓｎ−ペプチドが合成できる。このＡｓｎに結合し
たＧｌｃＮＡｃに糖鎖を転移させて天然にはない複合糖
ペプチドを合成することが可能となる。
（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列がなくても、アミノ酸配列の
中にＡｓｎがあればＡｓｎの代わりにＧｌｃＮＡｃがア
ミド基に結合したＡｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ）を用
いてペプチド合成することにより、任意のＧｌｃＮＡｃ
−Ａｓｎ−ペプチドが合成できる。このＡｓｎに結合し
たＧｌｃＮＡｃに糖鎖を転移させて天然にはない複合糖
ペプチドを合成することが可能となる。
【００２１】ＧｌｃＮＡｃがアミド基に結合したグルタ
ミン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ）をＧｌｎに代えて用いる
ことによりＧｌｃＮＡｃがＧｌｎに結合したペプチド
（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ペプチド）が合成される。
（化１）のｎが２の化合物がこれに当たる。
ミン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ）をＧｌｎに代えて用いる
ことによりＧｌｃＮＡｃがＧｌｎに結合したペプチド
（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ペプチド）が合成される。
（化１）のｎが２の化合物がこれに当たる。
【００２２】（化１）のＲ1 にある末端アミノ酸のαア
ミノ基の保護基としては、例えば、９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、第３ブチルオキ
シカルボニル（Ｂｏｃ）基、３−ニトロ−２−ピリジン
スルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベンジルオキシカルボニ
ル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮＳ）基等が用いられ
る。
ミノ基の保護基としては、例えば、９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、第３ブチルオキ
シカルボニル（Ｂｏｃ）基、３−ニトロ−２−ピリジン
スルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベンジルオキシカルボニ
ル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮＳ）基等が用いられ
る。
【００２３】Ｎ末端アミノ酸の保護基は糖鎖転移反応後
に常法により外すか、あるいは予め保護基を外した後に
糖鎖転移反応に供してもよい。
に常法により外すか、あるいは予め保護基を外した後に
糖鎖転移反応に供してもよい。
【００２４】（化１）のＲ2 にあるカルボキシル基の保
護基としては、第３ブチル（Ｂｕt）基、ベンジル（Ｂ
ｚｌ）基あるいはメチル（Ｍｅ）基等であるが、水への
溶解性を上げるために保護基を外し、遊離型で用いるこ
とが多い。
護基としては、第３ブチル（Ｂｕt）基、ベンジル（Ｂ
ｚｌ）基あるいはメチル（Ｍｅ）基等であるが、水への
溶解性を上げるために保護基を外し、遊離型で用いるこ
とが多い。
【００２５】本発明の第２の構成は、糖鎖受容体である
合成基質への糖鎖供与体からの糖鎖の転移反応による付
加である。
合成基質への糖鎖供与体からの糖鎖の転移反応による付
加である。
【００２６】エンドグリコシダーゼの存在下、下記式
（式１）：Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式１）［式中、Ｘは複合
糖鎖、Ｙは糖質あるいは複合糖質、Ｚは（化１）に示し
た合成基質］で表される転移反応を行うことを特徴とす
る。
（式１）：Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式１）［式中、Ｘは複合
糖鎖、Ｙは糖質あるいは複合糖質、Ｚは（化１）に示し
た合成基質］で表される転移反応を行うことを特徴とす
る。
【００２７】本発明に用いるエンドグリコシダーゼとし
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド−Ａ
やエンド−Ｍ等が用いられる。該酵素は下記式（式
２）：Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（ペ
プチドまたはタンパク質）（式２）（式中Ｒは複合糖鎖
を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）結合型糖鎖のキトビ
オース部分（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）の間を加水
分解するが、この時に適当な糖鎖受容体があると、受容
体に糖鎖（Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ）部分が転移する。（式
１）の反応はそれを利用したものである。
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド−Ａ
やエンド−Ｍ等が用いられる。該酵素は下記式（式
２）：Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（ペ
プチドまたはタンパク質）（式２）（式中Ｒは複合糖鎖
を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）結合型糖鎖のキトビ
オース部分（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）の間を加水
分解するが、この時に適当な糖鎖受容体があると、受容
体に糖鎖（Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ）部分が転移する。（式
１）の反応はそれを利用したものである。
【００２８】エンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応
の糖鎖受容体となるのは、通常、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（Ｔｈｒ）配列を含むペプチドのＡｓｎに結合したＧｌ
ｃＮＡｃ残基である。
の糖鎖受容体となるのは、通常、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（Ｔｈｒ）配列を含むペプチドのＡｓｎに結合したＧｌ
ｃＮＡｃ残基である。
【００２９】Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）の配列がな
くても、Ａｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基を有するペ
プチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ペプチド）であればエ
ンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応の糖鎖受容体に
なり得ることが分かった。また、ペプチドのＮ末端αア
ミノ基及びＣ末端カルボキシル基は遊離型でなく、いず
れかあるいは両末端とも保護されていても反応が進行し
た。
くても、Ａｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基を有するペ
プチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ペプチド）であればエ
ンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応の糖鎖受容体に
なり得ることが分かった。また、ペプチドのＮ末端αア
ミノ基及びＣ末端カルボキシル基は遊離型でなく、いず
れかあるいは両末端とも保護されていても反応が進行し
た。
【００３０】更に驚くべきことに、天然には存在しない
グルタミン（Ｇｌｎ）に結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含
むペプチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ペプチド）のＧｌ
ｃＮＡｃ残基にもＡｓｎの場合と同様に糖鎖の転移反応
が起きることが分かった。
グルタミン（Ｇｌｎ）に結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含
むペプチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ペプチド）のＧｌ
ｃＮＡｃ残基にもＡｓｎの場合と同様に糖鎖の転移反応
が起きることが分かった。
【００３１】（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する
合成基質はかかる知見に基づき調製されたものであり、
この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応を行う本発
明を完成させた。
合成基質はかかる知見に基づき調製されたものであり、
この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応を行う本発
明を完成させた。
【００３２】酵素の糖鎖供与体の基質特異性について
は、エンド−Ａは高マンノース型糖鎖のみに作用する
が、エンド−Ｍは高マンノース型のみならず複合型糖鎖
や混成型糖鎖にも作用する。
は、エンド−Ａは高マンノース型糖鎖のみに作用する
が、エンド−Ｍは高マンノース型のみならず複合型糖鎖
や混成型糖鎖にも作用する。
【００３３】これらの酵素の本来の機能は加水分解であ
り、（式１）のＺの代わりに水が入り加水分解反応が転
移反応とともに副反応として進行する。また、（式１）
で生成した転移反応生成物（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｚ）は
加水分解反応の基質となり再分解を受ける。
り、（式１）のＺの代わりに水が入り加水分解反応が転
移反応とともに副反応として進行する。また、（式１）
で生成した転移反応生成物（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｚ）は
加水分解反応の基質となり再分解を受ける。
【００３４】糖鎖転移反応を効率よく行わせるには加水
分解反応を抑えて（式１）の反応を優先的に行わせるこ
とが必要である。与酵素量を減らし、基質である糖鎖供
与体（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ）と糖鎖受容体（Ｚ）の仕
込濃度を、そのモル比を１近くにしつつ高濃度にするこ
とにより反応の場（酵素の活性中心）における水の影響
を排して転移反応を効率よく進行させることができる。
分解反応を抑えて（式１）の反応を優先的に行わせるこ
とが必要である。与酵素量を減らし、基質である糖鎖供
与体（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ）と糖鎖受容体（Ｚ）の仕
込濃度を、そのモル比を１近くにしつつ高濃度にするこ
とにより反応の場（酵素の活性中心）における水の影響
を排して転移反応を効率よく進行させることができる。
【００３５】反応系で重要な点は、反応を酵素律速条件
下で行うことである。即ち糖鎖供与体から受容体への糖
鎖転移反応の速度が与酵素量に依存し、その速度を最大
にするに必要な最少量の酵素量になるように酵素の添加
量を制限して反応する。例えばエンド−Ｍの場合、糖鎖
供与体に対して５００ユニット（Ｕ）／モル（供与体）
以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与体）程度
の酵素量を加える。なおここで、酵素の１ユニット
（Ｕ）は、ヒトトランスフェリン由来のアシアロ複合型
糖鎖のダンシル化（ＤＮＳ）誘導体を加水分解して、３
７℃、１分間に１マイクロモル（μｍｏｌ）のＮ−アセ
チルグルコサミニル−アスパラギンのＤＮＳ誘導体（Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ＤＮＳ）を生成させるに必要な酵
素量である。
下で行うことである。即ち糖鎖供与体から受容体への糖
鎖転移反応の速度が与酵素量に依存し、その速度を最大
にするに必要な最少量の酵素量になるように酵素の添加
量を制限して反応する。例えばエンド−Ｍの場合、糖鎖
供与体に対して５００ユニット（Ｕ）／モル（供与体）
以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与体）程度
の酵素量を加える。なおここで、酵素の１ユニット
（Ｕ）は、ヒトトランスフェリン由来のアシアロ複合型
糖鎖のダンシル化（ＤＮＳ）誘導体を加水分解して、３
７℃、１分間に１マイクロモル（μｍｏｌ）のＮ−アセ
チルグルコサミニル−アスパラギンのＤＮＳ誘導体（Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ＤＮＳ）を生成させるに必要な酵
素量である。
【００３６】糖鎖供与体と受容体の仕込濃度を著しく高
めることも重要である。与酵素量を制限しつつ両基質を
高濃度に仕込むことにより、糖鎖転移反応が促進され副
反応が抑えられて反応収率は飛躍的に向上する。その濃
度は、糖鎖供与体が１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７
５ｍＭがよい。また糖鎖受容体は２．５ｍＭ以上、望ま
しくは７．５〜３５ｍＭ程度がよい。糖鎖受容体の濃度
は高い方が望ましいが、合成基質の溶解度が低い場合に
は２．５ｍＭ程度の濃度でも用いられる。
めることも重要である。与酵素量を制限しつつ両基質を
高濃度に仕込むことにより、糖鎖転移反応が促進され副
反応が抑えられて反応収率は飛躍的に向上する。その濃
度は、糖鎖供与体が１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７
５ｍＭがよい。また糖鎖受容体は２．５ｍＭ以上、望ま
しくは７．５〜３５ｍＭ程度がよい。糖鎖受容体の濃度
は高い方が望ましいが、合成基質の溶解度が低い場合に
は２．５ｍＭ程度の濃度でも用いられる。
【００３７】本発明に用いる糖鎖供与体としては、高マ
ンノース型、複合型、混成型いずれの糖鎖も用いられ
る。高マンノース型糖鎖は例えば卵白アルブミン等か
ら、またシアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトト
ランスフェリンや牛フェツイン等から調製され、シアリ
ダーゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖
鎖が調製される。酵素的あるいは化学的に修飾された糖
鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることができ
る。
ンノース型、複合型、混成型いずれの糖鎖も用いられ
る。高マンノース型糖鎖は例えば卵白アルブミン等か
ら、またシアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトト
ランスフェリンや牛フェツイン等から調製され、シアリ
ダーゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖
鎖が調製される。酵素的あるいは化学的に修飾された糖
鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることができ
る。
【００３８】本発明の反応は、基質の糖鎖供与体、糖鎖
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。先述のごとく、糖鎖供
与体の濃度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍ
Ｍ、糖鎖受容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは
７．５〜３５ｍＭになるように加える。酵素量は５００
Ｕ／モル（供与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／
モル（供与体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場
合、２〜１０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液とし
ては、ｐＨ５〜８程度、濃度２５〜２００ｍＭ、望まし
くは５０〜１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エ
ンド−Ｍの場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度５０〜
１００ｍＭの酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行わ
れる。基本的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍ
Ｍ、糖鎖受容体１０ｍＭ、エンド−Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよ
び６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。先述のごとく、糖鎖供
与体の濃度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍ
Ｍ、糖鎖受容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは
７．５〜３５ｍＭになるように加える。酵素量は５００
Ｕ／モル（供与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／
モル（供与体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場
合、２〜１０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液とし
ては、ｐＨ５〜８程度、濃度２５〜２００ｍＭ、望まし
くは５０〜１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エ
ンド−Ｍの場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度５０〜
１００ｍＭの酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行わ
れる。基本的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍ
Ｍ、糖鎖受容体１０ｍＭ、エンド−Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよ
び６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。
【００３９】反応温度は通常、室温〜５０℃程度、好ま
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。
【００４０】生成した複合糖質は公知の手段に従って反
応終了液から容易に分離精製することが出来る。例え
ば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹
脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離
し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
応終了液から容易に分離精製することが出来る。例え
ば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹
脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離
し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
【００４１】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００４２】
【実施例１】 高マンノース型糖鎖のＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ
への糖鎖転移反応：糖鎖供与体として、卵白アルブミン
をプロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過更
にＤｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製し
て得た高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡ
ｃ）2−Ａｓｎ（分子量１６５１）を１μｍｏｌ（終濃
度２５ｍＭ）、糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ
−Ｆｍｏｃ（分子量５５８）を４００ｎｍｏｌ（同１０
ｍＭ）、エンド−Ｍを１６０μＵ（同４ｍＵ／ｍｌ）加
え、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）４０μｌ中
で３７℃、１８時間反応させた。加熱処理により反応停
止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈し反応生成物をＨ
ＰＬＣで分析した。４．０％の反応収率（対糖鎖受容
体、モル比）でＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転
移反応生成物が得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分取
し、質量分析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］１７３２にシグ
ナルが観察され、（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａ
ｓｎからＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応
生成物、即ち（Ｍａｎ）6 −（ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓ
ｎ−Ｆｍｏｃ（分子量１７３４）であることが確認され
た。
への糖鎖転移反応：糖鎖供与体として、卵白アルブミン
をプロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過更
にＤｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製し
て得た高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡ
ｃ）2−Ａｓｎ（分子量１６５１）を１μｍｏｌ（終濃
度２５ｍＭ）、糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ
−Ｆｍｏｃ（分子量５５８）を４００ｎｍｏｌ（同１０
ｍＭ）、エンド−Ｍを１６０μＵ（同４ｍＵ／ｍｌ）加
え、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）４０μｌ中
で３７℃、１８時間反応させた。加熱処理により反応停
止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈し反応生成物をＨ
ＰＬＣで分析した。４．０％の反応収率（対糖鎖受容
体、モル比）でＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転
移反応生成物が得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分取
し、質量分析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］１７３２にシグ
ナルが観察され、（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａ
ｓｎからＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応
生成物、即ち（Ｍａｎ）6 −（ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓ
ｎ−Ｆｍｏｃ（分子量１７３４）であることが確認され
た。
【００４３】
【実施例２】 ヒトトランスフェリン由来シアロ糖鎖のＧｌｃＮＡｃ−
Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応： 糖鎖供与体として、
ヒトトランスフェリン（生化学工業）をプロナーゼ処
理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過を繰り返して得た
Ａｓｎ残基のみを有するシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ、分子量２３３８）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）
とＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ ４００ｎｍｏｌ
（同１０ｍＭ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２
５）２４μｌに溶解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む
酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で６時間反応した。反
応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成
物をＨＰＬＣで分析した。転移反応生成物が反応６時間
で４．５％の収率で得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分
取により単離し、質量分析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］２
５６１にシグナルが観測され、ジシアロ２本鎖複合型糖
鎖がＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃに転移した化合物
（分子量２５６０）であることが確認された。
Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応： 糖鎖供与体として、
ヒトトランスフェリン（生化学工業）をプロナーゼ処
理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過を繰り返して得た
Ａｓｎ残基のみを有するシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ、分子量２３３８）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）
とＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ ４００ｎｍｏｌ
（同１０ｍＭ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２
５）２４μｌに溶解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む
酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で６時間反応した。反
応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成
物をＨＰＬＣで分析した。転移反応生成物が反応６時間
で４．５％の収率で得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分
取により単離し、質量分析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］２
５６１にシグナルが観測され、ジシアロ２本鎖複合型糖
鎖がＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃに転移した化合物
（分子量２５６０）であることが確認された。
【００４４】
【実施例３】 ヒトトランスフェリン由来アシアロ糖鎖のＧｌｃＮＡｃ
−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応： 糖鎖供与体とし
て、ヒトトランスフェリン由来のシアロ糖ペプチド（Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を外した
アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ、分子量１７５
６）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＧｌｃＮＡｃ−
Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解
し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを
加え、３７℃で６時間反応した。反応停止後反応液を蒸
留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析
した。転移反応生成物が反応６時間で８．０％の収率で
得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質
量分析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］１９８３にシグナルが
観測され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−
Ａｓｎ−Ｆｍｏｃに転移した化合物（分子量１９７８）
であることが確認された。
−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応： 糖鎖供与体とし
て、ヒトトランスフェリン由来のシアロ糖ペプチド（Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を外した
アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ、分子量１７５
６）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＧｌｃＮＡｃ−
Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解
し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを
加え、３７℃で６時間反応した。反応停止後反応液を蒸
留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析
した。転移反応生成物が反応６時間で８．０％の収率で
得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質
量分析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］１９８３にシグナルが
観測され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−
Ａｓｎ−Ｆｍｏｃに転移した化合物（分子量１９７８）
であることが確認された。
【００４５】
【実施例４】 ヒトトランスフェリン由来アシアロ糖鎖のＧｌｃＮＡｃ
−Ａｓｎ−Ｎｐｙｓへの糖鎖転移反応：糖鎖受容体とし
てのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎの３−ニトロ−２−ピリジン
スルフェニル（Ｎｐｙｓ）誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
ｎ−Ｎｐｙｓ）（分子量４８９）はＡｓｎのαアミノ保
護基をＮｐｙｓ基にした化合物として合成した。糖鎖供
与体として実施例３と同様に調製したアシアロ糖ペプチ
ド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）を用いた。アシアロ糖ペプチド
（ＴＦ−ＡＳＧＰ）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）と
ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｎｐｙｓ ５００ｎｍｏｌ（同
１２．５ｍＭ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２
５）２４μｌに溶解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む
酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。
反応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生
成物をＨＰＬＣで分析したところ、転移反応生成物が
７．０％の収率で得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分取
し、質量分析したところ、分子量１９１０に相当するイ
オンピーク（ｍ／ｚ）観察され、トランスフェリン由来
のアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−
Ｎｐｙｓに転移した化合物であることが確認された。
−Ａｓｎ−Ｎｐｙｓへの糖鎖転移反応：糖鎖受容体とし
てのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎの３−ニトロ−２−ピリジン
スルフェニル（Ｎｐｙｓ）誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓ
ｎ−Ｎｐｙｓ）（分子量４８９）はＡｓｎのαアミノ保
護基をＮｐｙｓ基にした化合物として合成した。糖鎖供
与体として実施例３と同様に調製したアシアロ糖ペプチ
ド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）を用いた。アシアロ糖ペプチド
（ＴＦ−ＡＳＧＰ）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）と
ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−Ｎｐｙｓ ５００ｎｍｏｌ（同
１２．５ｍＭ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２
５）２４μｌに溶解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む
酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。
反応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生
成物をＨＰＬＣで分析したところ、転移反応生成物が
７．０％の収率で得られた。反応生成物をＨＰＬＣ分取
し、質量分析したところ、分子量１９１０に相当するイ
オンピーク（ｍ／ｚ）観察され、トランスフェリン由来
のアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−
Ｎｐｙｓに転移した化合物であることが確認された。
【００４６】
【実施例５】 ヒトトランスフェリン由来複合型糖鎖の合成ペプチドへ
の転移反応： 糖鎖受容体として、ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン（ｈＣＧ）のβ鎖の部分ペプチドｈＣＧ（β１
２−１６）のＡｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃを付けたペプチ
ド［Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ａｌ
ａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ］、［ＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ
（β１２−１６）−Ｆｍｏｃ］（分子量９５６）（Ｉｌ
ｅはイソロイシン、Ａｌａはアラニン、Ｔｈｒはスレオ
ニン、Ｌｅｕはロイシンを示す）を先のＴ．イナヅらの
方法に準じて合成して用いた。糖鎖供与体のシアロ糖ペ
プチド（ＴＦ−ＳＧＰ）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍ
Ｍ）、受容体としてＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β１２−１
６）−Ｆｍｏｃを４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、
エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加
え、３７℃で３時間反応させた。反応停止後反応液を蒸
留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析
したところ、ジシアロ糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β
１２−１６）−Ｆｍｏｃに転移した化合物（分子量２９
５９）の生成が認められた。糖鎖供与体としてアシアロ
糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）を用いると、アシアロ糖
鎖がＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β１２−１６）−Ｆｍｏｃ
に転移した化合物（分子量２３７６）が得られた。
の転移反応： 糖鎖受容体として、ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン（ｈＣＧ）のβ鎖の部分ペプチドｈＣＧ（β１
２−１６）のＡｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃを付けたペプチ
ド［Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ａｌ
ａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ］、［ＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ
（β１２−１６）−Ｆｍｏｃ］（分子量９５６）（Ｉｌ
ｅはイソロイシン、Ａｌａはアラニン、Ｔｈｒはスレオ
ニン、Ｌｅｕはロイシンを示す）を先のＴ．イナヅらの
方法に準じて合成して用いた。糖鎖供与体のシアロ糖ペ
プチド（ＴＦ−ＳＧＰ）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍ
Ｍ）、受容体としてＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β１２−１
６）−Ｆｍｏｃを４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、
エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加
え、３７℃で３時間反応させた。反応停止後反応液を蒸
留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析
したところ、ジシアロ糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β
１２−１６）−Ｆｍｏｃに転移した化合物（分子量２９
５９）の生成が認められた。糖鎖供与体としてアシアロ
糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）を用いると、アシアロ糖
鎖がＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β１２−１６）−Ｆｍｏｃ
に転移した化合物（分子量２３７６）が得られた。
【００４７】
【実施例６】 高マンノース型糖鎖の合成ペプチドへの転移反応： 糖
鎖供与体として、卵白アルブミン由来の高マンノース型
糖鎖（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ（分子量
１６５１）を、糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ残基を有
するヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のβ鎖の部
分ペプチドｈＣＧ（β１２−１６）［ＧｌｃＮＡｃ−ｈ
ＣＧ（β１２−１６）−Ｆｍｏｃ］を用い、実施例５と
同様の反応条件下で３時間反応させたところ、高マンノ
ース型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β１２−１６）−
Ｆｍｏｃに転移した化合物（分子量２１３２）の生成が
認められた。
鎖供与体として、卵白アルブミン由来の高マンノース型
糖鎖（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ（分子量
１６５１）を、糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ残基を有
するヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のβ鎖の部
分ペプチドｈＣＧ（β１２−１６）［ＧｌｃＮＡｃ−ｈ
ＣＧ（β１２−１６）−Ｆｍｏｃ］を用い、実施例５と
同様の反応条件下で３時間反応させたところ、高マンノ
ース型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−ｈＣＧ（β１２−１６）−
Ｆｍｏｃに転移した化合物（分子量２１３２）の生成が
認められた。
【００４８】
【実施例７】 高マンノース型糖鎖のＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃ
への糖鎖転移反応：糖鎖受容体のＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ
−Ｆｍｏｃ（分子量５７２）はＡｓｎの代わりにＧｌｎ
（グルタミン）が入った化合物としてＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎ−Ｆｍｏｃの合成法に準じて合成した。酵素反応に
はナトリウム塩にして用いた。糖鎖供与体として高マン
ノース型糖鎖（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ
（分子量１６５１）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）、
糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃ（分
子量５７２）を２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）、エンド−
Ｍを１６０μＵ（同４ｍＵ／ｍｌ）加え、６０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．２５）４０μｌ中で３７℃、３時間
反応させた。反応停止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに希
釈し反応生成物をＨＰＬＣで分析した。転移反応生成物
が７．５％の収率で得られた。転移反応生成物をＨＰＬ
Ｃ分取し、質量分析したところ、分子量１７４８に相当
するイオンピーク（ｍ／ｚ）が認められ、（Ｍａｎ）6
−（ＧｌｃＮＡｃ）2−ＡｓｎからＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌ
ｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応生成物、即ち（Ｍａｎ）6−
（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃであることが確
認された。
への糖鎖転移反応：糖鎖受容体のＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ
−Ｆｍｏｃ（分子量５７２）はＡｓｎの代わりにＧｌｎ
（グルタミン）が入った化合物としてＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎ−Ｆｍｏｃの合成法に準じて合成した。酵素反応に
はナトリウム塩にして用いた。糖鎖供与体として高マン
ノース型糖鎖（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ
（分子量１６５１）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）、
糖鎖受容体としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃ（分
子量５７２）を２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）、エンド−
Ｍを１６０μＵ（同４ｍＵ／ｍｌ）加え、６０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．２５）４０μｌ中で３７℃、３時間
反応させた。反応停止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに希
釈し反応生成物をＨＰＬＣで分析した。転移反応生成物
が７．５％の収率で得られた。転移反応生成物をＨＰＬ
Ｃ分取し、質量分析したところ、分子量１７４８に相当
するイオンピーク（ｍ／ｚ）が認められ、（Ｍａｎ）6
−（ＧｌｃＮＡｃ）2−ＡｓｎからＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌ
ｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応生成物、即ち（Ｍａｎ）6−
（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃであることが確
認された。
【００４９】
【実施例８】 ヒトトランスフェリン由来複合型糖鎖のＧｌｃＮＡｃ−
Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応： 糖鎖供与体として、
ヒトトランスフェリンから調製したシアロおよびアシア
ロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰおよびＴＦ−ＡＳＧＰ）を
１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ
−Ｆｍｏｃを２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）を０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、エンド
−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加え、３７
℃で３時間反応した。反応停止後反応液を蒸留水で１ｍ
ｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析した。転移
反応生成物がＴＦ−ＳＧＰの場合５．０％、ＴＦ−ＡＳ
ＧＰの場合１３．７％の収率で得られた。転移反応生成
物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分析の結果、ＴＦ
−ＳＧＰの転移反応生成物には分子量２５７４に相当す
るイオンピークが、またＴＦ−ＡＳＧＰの転移反応生成
物には分子量１９９２に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ
［Ｍ−Ｈ］ １９９２）が観測され、各々ジシアロ２本
鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃに転移
した化合物およびアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮ
Ａｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃに転移した化合物であることが
確認された。
Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃへの転移反応： 糖鎖供与体として、
ヒトトランスフェリンから調製したシアロおよびアシア
ロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰおよびＴＦ−ＡＳＧＰ）を
１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ
−Ｆｍｏｃを２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）を０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、エンド
−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加え、３７
℃で３時間反応した。反応停止後反応液を蒸留水で１ｍ
ｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析した。転移
反応生成物がＴＦ−ＳＧＰの場合５．０％、ＴＦ−ＡＳ
ＧＰの場合１３．７％の収率で得られた。転移反応生成
物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分析の結果、ＴＦ
−ＳＧＰの転移反応生成物には分子量２５７４に相当す
るイオンピークが、またＴＦ−ＡＳＧＰの転移反応生成
物には分子量１９９２に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ
［Ｍ−Ｈ］ １９９２）が観測され、各々ジシアロ２本
鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃに転移
した化合物およびアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌｃＮ
Ａｃ−Ｇｌｎ−Ｆｍｏｃに転移した化合物であることが
確認された。
【００５０】
【実施例９】 ヒトトランスフェリン由来アシアロ糖鎖のＧｌｃＮＡｃ
−Ｇｌｎ−ＤＮＳへの糖鎖転移反応：糖鎖受容体として
ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎのダンシル化（ＤＮＳ）誘導体
（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ＤＮＳ）（分子量５８５）は
Ｇｌｎのαアミノ基をＤＮＳ基で保護した化合物として
合成した。糖鎖供与体としてアシアロ糖ペプチド（ＴＦ
−ＡＳＧＰ）を用い、実施例４と同様の反応条件で３時
間反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ分取し、質量分析
したところ、分子量２００４に相当するイオンピーク
（ｍ／ｚ）観察され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌ
ｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ＤＮＳに転移した化合物であること
が確認された。
−Ｇｌｎ−ＤＮＳへの糖鎖転移反応：糖鎖受容体として
ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎのダンシル化（ＤＮＳ）誘導体
（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ＤＮＳ）（分子量５８５）は
Ｇｌｎのαアミノ基をＤＮＳ基で保護した化合物として
合成した。糖鎖供与体としてアシアロ糖ペプチド（ＴＦ
−ＡＳＧＰ）を用い、実施例４と同様の反応条件で３時
間反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ分取し、質量分析
したところ、分子量２００４に相当するイオンピーク
（ｍ／ｚ）観察され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＧｌ
ｃＮＡｃ−Ｇｌｎ−ＤＮＳに転移した化合物であること
が確認された。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、ＧｌｃＮＡｃ残基を有す
る合成基質に酵素的に糖鎖を付加して新規複合糖ペプチ
ドを容易に合成することが可能となった。糖鎖受容体の
ペプチドはペプチド鎖のアミノ酸配列の中にアスパラギ
ン（Ａｓｎ）あるいはグルタミン（Ｇｌｎ）があればＧ
ｌｃＮＡｃ残基を介してＮ結合型糖鎖を付加することが
でき、天然には無い全く新しい複合糖ペプチドを合成で
きる。付加する糖鎖は高マンノース型、シアル酸を含む
複合型糖鎖いずれでもよく、望み通りの複合糖ペプチド
を合成できる。非天然のみならず天然のものも無論合成
可能である。本発明は、医薬への応用とともに複合糖質
の糖鎖の果たしている生理的役割を解明するための研究
手法を提供する。
る合成基質に酵素的に糖鎖を付加して新規複合糖ペプチ
ドを容易に合成することが可能となった。糖鎖受容体の
ペプチドはペプチド鎖のアミノ酸配列の中にアスパラギ
ン（Ａｓｎ）あるいはグルタミン（Ｇｌｎ）があればＧ
ｌｃＮＡｃ残基を介してＮ結合型糖鎖を付加することが
でき、天然には無い全く新しい複合糖ペプチドを合成で
きる。付加する糖鎖は高マンノース型、シアル酸を含む
複合型糖鎖いずれでもよく、望み通りの複合糖ペプチド
を合成できる。非天然のみならず天然のものも無論合成
可能である。本発明は、医薬への応用とともに複合糖質
の糖鎖の果たしている生理的役割を解明するための研究
手法を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｂ
Claims (9)
- 【請求項１】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をＮ−アセチルグルコサミン（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）残基を有する合成基質（糖鎖受容体）に転
移させることにより複合糖ペプチドを製造する方法。 - 【請求項２】ＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質が、下
記式（化１）で示される化合物である請求項１に記載の
方法。 【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）。ただし、天然に存在する複合糖質の酵素分解に
より調製される物質を除く。 - 【請求項３】ＧｌｃＮＡｃの結合するアミノ酸がアスパ
ラギン（Ａｓｎ）である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】ＧｌｃＮＡｃの結合するアミノ酸がグルタ
ミン（Ｇｌｎ）である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基の保護基が９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）
基、第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、３−ニ
トロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベン
ジルオキシカルボニル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮ
Ｓ）基である請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基の保護基
が第３ブチル（Ｂｕt ）、ベンジル（Ｂｚｌ）あるいは
メチル（Ｍｅ）基である請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】エンドグリコシダーゼがエンド−β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】酵素律速条件下で反応を行う請求項１に記
載の方法。 - 【請求項９】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をＮ−アセチルグルコサミン（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）残基を有する合成基質（糖鎖受容体）に転
移させることにより製造される複合糖ペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20394595A JP3776952B2 (ja) | 1995-07-18 | 1995-07-18 | 複合糖質の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20394595A JP3776952B2 (ja) | 1995-07-18 | 1995-07-18 | 複合糖質の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0931095A true JPH0931095A (ja) | 1997-02-04 |
| JP3776952B2 JP3776952B2 (ja) | 2006-05-24 |
Family
ID=16482285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20394595A Expired - Fee Related JP3776952B2 (ja) | 1995-07-18 | 1995-07-18 | 複合糖質の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3776952B2 (ja) |
-
1995
- 1995-07-18 JP JP20394595A patent/JP3776952B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3776952B2 (ja) | 2006-05-24 |
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