JPH09313190A - 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物 - Google Patents

治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物

Info

Publication number
JPH09313190A
JPH09313190A JP8360043A JP36004396A JPH09313190A JP H09313190 A JPH09313190 A JP H09313190A JP 8360043 A JP8360043 A JP 8360043A JP 36004396 A JP36004396 A JP 36004396A JP H09313190 A JPH09313190 A JP H09313190A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
cell
construct
rna
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8360043A
Other languages
English (en)
Inventor
Elazar Rabbani
ラバーニ イラザール
Jannis G Stavrianopoulos
ジー．スタブリアノポウラス ジャニス
James J Donegan
ジェイ．ドネガン ジェイムス
Dakai Liu
リゥ ダカイ
Norman E Kelker
イー．ケルカー ノーマン
Dean L Engelhardt
エル．エンゲルハルト ディーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enzo Therapeutics Inc
Original Assignee
Enzo Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enzo Therapeutics Inc filed Critical Enzo Therapeutics Inc
Publication of JPH09313190A publication Critical patent/JPH09313190A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/307—Circular oligonucleotides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は細胞内およびこのような細胞を含む生
物学的システムにおいて、生物学的な働きやプロセスの
変化をもたらしたり発現したりするために有用な構築物
の配列を提供することを課題とする。 【解決手段】実際には、これら構築物は化学修飾物およ
び/ またはリガンド付加物を生物学的機能とを結びつけ
るものである。該化学修飾物および/ またはリガンド付
加物はそれらの生物学的機能によって実質的に妨害され
ることなく該構築物に対して更なる特性を与える。この
ような更なる特性は、ヌクレアーゼ耐性、特異的細胞ま
たは細胞内の特異的部位に配置する特異細胞リセプター
をターゲットとし、そして該構築物と対象とする細胞と
の間の相互作用を、所望なればこのような相互作用を減
少するのみならず増大させることを含む。また本発明に
よれば方法とキットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞または細胞を
含んでいる生物学的システムの中の生物学的機能をもた
らしそして該生物学的機能に影響し、そしてそれを現す
ことが出来る核酸構築物、抱合体、およびベクターを含
む組成物に関するものである。本願中に引用または特定
されるすべての特許、特許刊行物、科学文献は、本発明
が属する技術分野の状態をより完全に述べるために、こ
こにこれらの全部を引用することによって組み入れられ
る。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】ウイル
スによって仲介される遺伝子デリバリーに代わるもう一
つの方法としては、核酸を直接デリバリーすることであ
る。このアプローチは転移の低効率、低安定性および細
胞特異性の欠如を含むいくつかの制限を有する。これら
制限のうちのいくつかのものに打克つために、他のアプ
ローチがなされた。これらのアプローチはポリリジンと
ヒストンのようなポリカチオン（Wu and Wu, US Patent
No. 5,166,320、その内容は文献としてここに組み入れ
られる）との非特異的イオンコンプレックスを含む。こ
れらはヒストンのようなポリカチオンまたはベース蛋白
質を介して核酸構築物と非特異的に結合する。しかしな
がら得られるコンプレックスは、依然としてコンプレッ
クスの均一性の欠如、核酸構築物の特異的領域に結合す
るポリカチオンに関する特異性の欠如、核酸のコンプレ
ックスの潜在的妨害、およびコンプレックスのタイミン
グの悪い解離またはこれら核酸ポリカチオンまたは核ポ
リペプチドコンプレックスの安定性の欠如を誘起するコ
ンプレックスのタイミングの良い解離の欠如を含むいく
つかの制限を受ける。
【０００３】細胞への核酸転移は種々の方法によって起
すことができる。このような方法は遊離核酸、核酸構築
物、またはウイルスのゲノムまたはバクテリオファージ
ベクターの一部としての核酸を利用することができる。
Wu et al..（米国特許第5,166,320 号）は、ポリカチオ
ンポリリジンとの非特異的な会合におけるポリヌクレオ
チドを利用した。これらのコンプレックスはコンプレッ
クスの濃度の欠如、核酸構築物の特異的領域に結合する
ポリカチオンに関する特異性の欠如、核酸とのコンプレ
ックスの潜在的妨害、およびコンプレックスのタイミン
グの悪い解離の可能性またはこれらの核酸またはヒスト
ンまたは核ポリペプチドコンプレックスの欠如を誘起す
るコンプレックスのタイミングの良い解離の欠如を含む
制限を受ける。この方法はウイルスベクターのデリバリ
ーを与えない。更に細胞転換効率はいまだ低い。生体外
における造血細胞へのレトロウイルスを仲介とした遺伝
子転換の方法は、フィブロネクチンまたはフィブロネク
チン断片の存在下において試みられた。フィブロネクチ
ンはレトロウイルスとは結合するが、他の如何なるウイ
ルス、核酸、または核酸構築物には結合しない。Willia
msとPatel, WO95/26200 （その内容は文献としてここに
取り入れられる）はフィブロネクチンの存在下におい
て、レトロウイルスによって造血細胞を転換した。この
方法におけるフィブロネクチンの使用は、いくらかのレ
トロウイルスベクターの使用に限られており、他のウイ
ルスベクターまたは他の核酸は使用されない。
【０００４】二つの主要な理由のために多重コンプレッ
クスを形成することが望ましい。このようなコンプレッ
クスの形成は、コンプレックス中のモノマーユニットの
集合した活性が得られるか、あるいは共同結合効果か高
局所濃度を生成する隣接効果を介して、個々の成分やモ
ノマーユニットに比較するとより強められた結合特性を
有する。ポリリガンドは通常モノマーユニットの結合と
比較した場合、相補的配列に対するポリヌクレオチド配
列の結合に見られるように、モノマー形状においてより
も重合した形状においてより高い結合親和性を有する。
多重コンプレックスはモノマー化合物の架橋によって直
接あるいはマトリックスを介してあるいは非共有結合の
形成を介して形成されている。例えば酵素のような所定
の化合物の直接的またはマトリックスを介する架橋によ
って形成される多重コンプレックスの例は、米国特許第
4,687,732 号（その内容は文献としてここに取り入れら
れている）中に記載されており、それらによって可視化
モノマーの多重単位から構成される可視化ポリマーはモ
ノマーの化学基と結合するカップリング試薬によってお
互いに共有的に結合せしめられる。例えばリガンド受容
体システムのような非共有結合の形成を介して形成され
る多重コンプレックスの例は、免疫学的試薬として通常
使用されるPAP （パーオキダーゼ−抗パーオキシダー
ゼ）コンプレックスやAPAAP(アルカリホスファターゼ−
抗アルカリホスファターゼ）コンプレックス、およびビ
オチン化部分の検出に使用されるストレプトアビジン−
ビオチン化酵素コンプレックスである。架橋または非共
有結合によって形成されるコンプレックスの場合は、モ
ノマー単位の機能と活性に影響するコンプレックスの中
のモノマー単位の機能と活性に影響するコンプレックス
の中のモノマー単位の空間配置や回りの化学的状態に関
する制限が存在し、コンプレックスのサイズが大きくな
るにつれ溶解度が影響を受ける。
【０００５】真核的プロセスによる原核遺伝子を制御す
る発現努力は、Schwartz et al. (1993 Gene 127:233,
ここに文献として取り入れられる）によって試みられ、
彼らは原核遺伝子の中へ真核遺伝子からのイントロン配
列を導入した。しかしながら、 mＲＮＡプロセシングが
可能な細胞の中へ導入された時、該遺伝子は挿入されて
いるイントロンにくっついているフランキングエクソン
配列の存在のために更なるアミノ酸が含まれる変更され
た蛋白質を発現した。このイントロンの単離の方法は、
イントロンにフランキングしているエクソン領域におけ
る内在制限酵素部位をあらかじめ存在させることを必要
とし、そしてイントロン挿入はイントロンを受け取る遺
伝子中に適当な制限酵素部位が存在することを必要とす
るので、このアプローチにおいてはこの制限は本来的に
存在するものである。それ故にＲＮＡからのイントロン
の削除の後においても、フランキングしているエクソン
配列は成熟ＲＮＡ分子のコード配列の一部として残存す
る。更に、受入れ遺伝子上のイントロン挿入のための位
置の数は適当な制限酵素部位の利用可能性によってきび
しく制限される。このアプローチによる遺伝子生産物の
変更は、該遺伝子生産物の機能に対する予知できない効
果を有し、そして特異的な例に対するこの方法の適用性
を強く制限する。Schwartz et al. の実施例において、
更なるアミノ酸は能力のある細胞中で合成された蛋白質
の活性にはっきりした効果を有しなかったが、それは更
なるアミノ酸が取り入れられる位置に依存するので、必
ずしも予知できるような特性ではない。例えば、Dunn e
t al. （1988 Gene 68:259, ここに文献として取り入れ
られる）によるT7ＲＮＡポリメラーゼのアミノ基末端の
中へ導入された小さいペプチドをコードしている短い配
列は、酵素活性に明確な効果を有しなかった。しかしな
がら、カルボキシ末端に近い位置への同じ配列の導入
は、酵素活性の殆んど完全な喪失を引き起こした。この
ようにして、Schwartz et al. の方法によるコード配列
の中へエクソンを導入することの結果として、余分のア
ミノ酸の取入れは、劇的な突然変異誘発性の効果をもた
らすことができた。
【０００６】原核生物的要素から誘導されるシステムは
哺乳動物細胞中において機能性生産物を生産することが
できる。E. Coli バクテリオファージ由来の酵素である
T7ＲＮＡポリメラーゼは、哺乳動物システム中において
一時的にあるいは安定的に発現された（Fuerst et al.,
1986 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 83:8122, その
内容は文献としてここに取り入れられる）。哺乳動物環
境中で合成される場合、T7プロモーターのコントロール
下において遺伝子に作用して機能性遺伝子生産物を与え
るために翻訳されることができる転写物を生産すること
ができる。大量のＲＮＡがT7プロモーターから転写され
ることができる（細胞あたり30,000ＲＮＡ分子までの,
Lieber et al. 1993, 文献として取り入れられる）。
【０００７】真核生物的システムでは、一つの構築物上
のポリメラーゼと別な構築物上のT7プロモーターとの二
重システムの使用によってのみ成功が達成されている。
この方法では、別々のプラスミドの連続のトランスフェ
クション（Lieber et al. 1989 Nucleic Acids Res 17.
8485 文献として取り入られる）、または共トランスフ
ェクション（Lieber et al. 1993 Methods Enzym, 217,
47. 文献として取り入れられる）、またはT7プロモータ
ーを含むプラスミドによるトランスフェクションの後の
T7ＲＮＡポリメラーゼをコードしている組み換えワクシ
ニアウイルスによる感染（Fuerst et al. 1986 Proc. N
at. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8122）が行われなければな
らない。T7ＲＮＡポリメラーゼはT7プロモーター配列を
含まないものとしてのみクローン化することができるの
で（Davenloo et al., 1984 Proc. Nat. Acad. Sci. U.
S.A. 81:2035, 文献として取り入れられる) 、単一構
築物中の両方の要素をクローン化する試みは、T7ＲＮＡ
ポリメラーゼで開始される下流のプロモーターからの転
写の合成はプラスミドの周りで継続して、細胞死をもた
らす自動触媒的カスケードを導くT7ＲＮＡポリメラーゼ
のより多量の合成を引き起こすという事実のために失敗
するように思われる。同じ性質を有するプロモーターの
削除の似通った技法は、バクテリオファージT3（Morris
et al. 1986Gene 41:193）およびSP6 （Kotani et al.
1987 Nucl. Acids Res. 15 2653,両方の刊行物共ここ
に文献として取り入れられる）ＲＮＡポリメラーゼのク
ローニングについて記述されている。しかしながら、こ
れらの要素の適合性は、構築物に対する二つの修飾、即
ちT7リゾチームの存在と抑制可能なT7lac プロモーター
の使用によるT7ＲＮＡポリメラーゼの阻害を付加するこ
とによって達成せられた。これらの制限の両方共が構築
物を得るために必要である。
【０００８】細胞中の遺伝子物質の導入は二つの方法に
よって行なわれる。一つの方法は細胞プロセスに直接作
用し、しかしそれ自体は複製されずあるいはいかなる核
酸も生成することができない核酸の外からの適用であ
る。細胞プロセスに環境するために達成されなければな
らないこれら分子の細胞内濃度は、外からの供給に依存
している。核酸デリバリーの別な方法は、それ自体は細
胞プロセスに作用されないけれども、細胞プロセスに作
用する細胞中の一本鎖核酸を生成する一次核酸構築物の
細胞中への導入である。この場合は導入された一次核酸
構築物は細胞核酸中に組み込まれることができるか、ま
たは染色体外状態で存在することができ、そしてそれは
組み込まれるかまたは染色体外状態かのいずれかにおい
て、それ自体のコピーを増やすことができる。該核酸構
築物は、一次核酸構築物中のプロモーター配列から遺伝
子発現および遺伝子複製の細胞プロセスに影響する一本
鎖核酸を生成することができる。このような核酸はアン
チセンス核酸、センス核酸、および蛋白質に翻訳される
ことができる転写物を含む。このような核酸の細胞内濃
度はプロモーター依存合成に制限される。一次核酸構築
物から生成される一本鎖核酸の効率は、それらの細胞中
の濃度、安定性、そして生成の持続時間に依存する。細
胞内濃度を達成するための現在の方法は合成を支配する
プロモーターへの依存によって制限される。
【０００９】アンチセンス療法の効率は、a)アンチセン
スＲＮＡの転写の速度、b)該ＲＮＡの細胞内位置、c)該
ＲＮＡ分子の安定性という三つの主な因子に殆んどの部
分依存する。以前の研究はこれら因子の各々については
行われていたが、単一のアプローチで三つ全部について
は行われていなかった。本発明は、安定なアンチセンス
ＲＮＡ配列の高核内濃度を達成するために、U1および他
のhnＲＮＡ中の核酸配列に代わりに用いられるAS配列を
利用するものである。U1, U2および他のsnＲＮＡは、蛋
白質分子と複合される核に配置するＲＮＡである（Dahl
bergとLund 1988 Structure and Function of Major an
d Minor Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles,
M. Birnstiel, Ed., Springer Verlag, Heidelberg, p
38:, ZieveとSautereau 1990 Biochemistry and Molecu
lar Biology 25:1, これらすべてはここに文献として
取り入れられる）。U1, U2および他のsnＲＮＡオペロン
の種々なプロモーターは非常に強くそして大量のＲＮＡ
を生成する。U1および他のsnＲＮＡは、細胞質にsnＲＮ
Ｐとして逆輸入される前に、特異的蛋白質が複合される
細胞質へ輸出するための信号を有する( 図41) 。snＲＮ
Ａは非常に安定な分子である。それらは特異的蛋白質と
複合された場合、snＲＮＰまたはスプライスソームを形
成する非常に高次の幹またはループ構造を形成する (図
43) 。ＲＮＡ転写物に作用し変更することによって遺伝
子発現に影響するアンチセンスおよび他の核酸分子は、
核へ閉じ込めることによってある有利性を誘起すること
ができる。高濃度は核の小容量中に維持されることがで
き、ターゲットＲＮＡとの相互作用は発現のためにそれ
らが用いられる前に起こり得、そしてメッセンジャー結
合リボゾームとは競合しないであろう。アンチセンス配
列を伝達する手段としてのアンチセンス配列のU2ＲＮＡ
への付加（Izant とSardelli 1988 Current Communicat
ions in Molecular Biology, Cold Spring Harbor, p14
1, ここに文献として取り入れられる）は、正常なU2転
写物の性質を変えた。U2転写域の5'末端の制限酵素部位
へアンチセンス配列を挿入することによって形成される
ハイブリッドU2分子は挿入サイズの増加と共にアンチセ
ンス効率の減少を示した。250 塩基よりも長いものを挿
入すると、アンチセンス効率は実質的に減少した。更に
ハイブリッドは、長さの増大に伴なう核中のハイブリッ
ドの割合が減少し、野生型の相当物と同程度の能率的に
は核の中に蓄積されない。
【００１０】YuとWeiner（1988 Current Communication
s in Molecular Biology, Cold Spring Harmor, p141,
その内容は文献として取り入れられる）は mＲＮＡのス
プライス位置を取り囲むターゲット配列に対する９塩基
アンチセンス配列を置換した。該アンチセンス置換はU1
ＲＮＡの5'末端で行われた。成熟細胞質ＲＮＡのターゲ
ットにされる種類の水準は該アンチセンス置換では影響
されなかった。構築物は単一転写単位中に一個以上のタ
ーゲット要素が含まれることによってアンチセンス効率
を増加するためにデザインされた。この方法において調
整された多重構築物は、核酸中の多重ターゲット位置中
に作用するものを支配する多くのターゲットを生成する
ことが出来る（Chen et al., 1992 Antisense Strategi
es, Annals of the New York Academy of Sciences660;
271: Zow et al. Gene 1994; 33, 両方共ここに文献と
して取り入れられる）。阻害に対する他のアプローチが
Lisziewicz et al.(1993 Proc Natl Acad Sci USA 90,
8000, 文献として取り入れられる）によって示されるよ
うに、多重転写物の中へ取り入れられることが出来、彼
らはHIV TAR の多重コピーを、同一転写物上のHIV gag
に対するアンチセンス配列と結合した。
【００１１】同一転写物上の１個以上のタ−ゲット要素
を含むことによる多重ターゲッティングの使用は、多重
ターゲット配列の同時的突然変異と云うありそうにもな
い出来事によるHIV のようなウイルスの高突然変異率を
消すための方法を提供する。しかしながら、これらデザ
インを完成する一般的手段は単一転写物上の生産物を含
むことである。このアプローチは次の制限を受ける。 ａ) 有効物として有用なＲＮＡ分子の総数は、単一プロ
モーターの強度によって制限される。 ｂ）細胞の安定な形質転換の間、組み込みによりアンチ
センス配列の発現の原因となる核酸鋳型配列を破壊させ
ることが出来る。 ｃ）多重転写物の使用は、転写物上に存在する一つの生
産物が一個の細胞位置中に存在するターゲットに作用
し、同一多重転写上に存在する他の生産物が別な細胞位
置中に存在するターゲットに作用する場合には好ましく
ない。これは細胞質中のHIV タット蛋白質に結合するよ
うに作用する多重TAR 配列が、核中で最も効果的なHIV
gag ＲＮＡに対するアンチセンス配列と共に同一の転写
物上に存在させるLisziewicz et al.(1993) によって報
告されたアプローチである。
【００１２】効率の良い抗ウイルスプロセスを見出すた
めに多くの努力が払われて来たが、現在では、ウイルス
の除去よりもむしろウイルス成長の抑制においてのみ成
功されている。追求されてきた努力の中には、免疫化ま
たは抗体あるいはウイルスまたは細胞上のウイルス受容
体部位と相互作用することによりウイルスによる細胞の
認識に干渉する蛋白質での処理によるウイルスが細胞に
侵入することを防ぐことによってウイルスの複製サイク
ルの開始を防止するための試みがある。これらの中には
高水準の可溶性CD4 による不成功であった処理も含まれ
る（Husson etal., 1992, 文献として取り入れられ
る）。加うるに、機能的蛋白質中へのウイルスポリペプ
チドの進行を防止するためのプロテアーゼインヒビター
と、ウイルスにコードされている逆転写酵素の活性とウ
イルス繁殖に必要な他の機能とを阻害することによるウ
イルス複製を妨害することが出来る種々のヌクレオシド
アナログを使用する細胞中へのウイルス侵入後のHIV 感
染と戦うための努力がなされている。ウイルス感染とウ
イルス複製サイクルの進行のステップは、病気のプロセ
スの薬理学的なあるいは免疫学的な干渉の可能性につい
て調査された。しかしながら、独立なそして効果的な治
療薬のように、免疫学的なそして小分子のインヒビター
はAIDSの進行を阻止する事に失敗し、効率と小分子治療
薬耐性を有するウイルスの発生という点から大きな問題
を残している。免疫学的なそして小分子治療剤の組合せ
の適用さえ成功をもたらしていない。
【００１３】機能の置き換えまたは新しい機能の導入の
いずれか一方のために細胞の中へ遺伝情報を導入するこ
とは、ウイルス感染の治療のための効果的な手段を提供
してきた。遺伝子治療のアプローチは、ウイルス複製プ
ロセスにおいて細胞内部に作用するメカニズムによっ
て、ウイルスに対する耐性を細胞に与えるために用いら
れててきた(Yu et al., Gene Therapy J, 13-16 [1994]
文献として取り入れられる）。これら研究の結果、試験
管内では遺伝治療の効率はウイルス濃度に鋭敏であるこ
とが判明した。試験管内実験では、ウイルスの細胞に対
する低比率では耐性の実質的な水準を示し、高比率では
見せかけだけの効率に終止符が打たれ次いでウイルス生
産が一気に激しく起こることによって特徴づけられる防
御線突破現象を示した(Sczakiel et al., 1992. J. Vio
l. 66;5576: Scakiel とPawlita 1990. J. Viol. 65;46
8.これらは文献として取り入れられる）。このように試
験管内ではある遺伝子的に処置された細胞のウイルス：
細胞比が低くなれば、高ウイルス：細胞比よりも生存時
間が長くなることが示される。機能の区分別けは真核細
胞中の制御されたプロセスにとって重大な意味を持つ。
例えば、核ＤＮＡの大部分が遺伝子情報の転写が起る核
の中に存在する染色体の中へ組織されている。核の中で
合成されるＲＮＡの大部分が、細胞質へ輸送され、そこ
で翻訳される。配置した機能のための他の細胞下区分は
ゴルジ装置、小胞体、核小体、ミトコンドリア、葉緑
体、および細胞膜を含む。このようにして、種々のメカ
ニズムが特異的細胞区分中に巨大分子を保持するためか
あるいは巨大分子を一つの細胞区分から他へ輸送するた
めに存在する。例えば、核から成熟した mＲＮＡが細胞
質中へ出ていくことにおいて、5'キャップの存在、イン
トロンの除去、およびポリＡ配列の付加はすべて再配置
を支配する信号の一因となると信じられている（文
献）。スプライスソームアセンブリー中に含まれる小さ
な核ＲＮＡ（snＲＮＡ）のようないくらかのＲＮＡは、
配列輸送によって再配置される（DahlbergとLund, 198
8, Structure and Function of Major and Minor Small
Ribonuclear Particles, M. Birnstiel, ed., Springe
r Verlag, Heidelberg, pg, 38, 文献として取り入れ
られる）。核中の転写の後、5'キャップおよび処理され
た3'末端の存在は、U1ＲＮＡを細胞質の中へ輸送するた
めの二つに分かれた信号をつくりだす。この点に、いく
らかのヌクレオチドの削除と5'キャップの過剰メチル化
による該ＲＮＡの更なるプロセシングが存在する。細胞
中に存在するスプライスソーム蛋白質の該UIＲＮＡのSm
領域への結合は過剰メチル化と組み合わさり、ＲＮＡを
核の中へもどす再配置の信号をつくり出すと信じられて
いる。殆どの mＲＮＡとの対比において、殆どの蛋白質
は細胞質中のそれらの合成位置から輸送される必要がな
い。しかしながら、転写、複製または他の核メンテナン
スにおいて役立ついくらかの蛋白質は、適正に役目を果
たすために核の中に存在せしめることを必要とする。こ
の場合には、蛋白質中に存在するポリペプチド信号配列
が細胞質から核の中への蛋白質の輸送を支配する。更に
他の蛋白質は細胞質または核において役に立っていない
が、リーダーと脂質親和性配列の存在を要求する細胞の
膜中に存在することを要求される。
【００１４】遺伝子治療へのアプローチとしてのターゲ
ット分子を支配することは、アンチセンスＲＮＡのよう
な活性剤を特別な細胞の場所においてターゲットと近接
して置くことの明白な目的のための配置に関する試みに
よって研究されて来た。例えば、いくらかの研究者は新
しく転写されたターゲットＲＮＡが働くのを妨害するた
めに核の中げ保持されるアンチセンスＲＮＡを発現する
ための核酸構築物をデザインした(IzantとSardelli, 19
88, Current Communication in Molecular Biology, D.
Melton, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cotten
とBirnstiel, 1989, EMBO Journal 8, 3861,文献として
取り入れられる) 。反対の効果はまたそこに存在せしめ
られるであろうＲＮＡの翻訳を妨害するために細胞質の
中への輸送を増強するための信号を含むための転写物を
デザインことによって達成された。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞あるいは
このような細胞を含む生物学的システムの中で生物学的
機能を保有する組成物で、化学的修飾によって保有され
ている生物学的機能に加えて更に有用な生物学的機能を
付加するであろう組成物を提供することによって、従来
の技術の上記制限に打克つものである。本発明は細胞の
中で生物学的機能を果たしそして処置が出来る核酸構築
物に関するものである。これらの構築物は化学的に修飾
された生物学的または合成的化合物を含むであろう。こ
れらの構築物は細胞中においてこれらの生物学的機能を
保有するが、しかしまた化学的修飾により更なる特性を
示すことが出来るであろう。これらの構築物は構築物内
で組み込まれた化学的修飾と生物学的機能を結合する。
本発明は特有な生物学的エレメントを取り入れたかまた
は構築物に新しい特性を導入する化学物質を取り入れた
か、あるいはその両方を取り入れた新規な構築物に関す
るものである。特有な生物学的要素は細胞中では新規な
能力( 非固有的) または新規な生産物( 人工的) を提供
する構築物の中で、合成、非固有的な異種構造か、ある
いは人工要素かのいずれかである。新規な能力は該構築
物が適合する細胞中において機能することを可能ならし
める異種のプロセシングエレメントのようなエレメン
ト、細胞の中での配置のための信号エレメント、および
多重独立生産カセットの導入によって与えられるが制限
は受けない。化学的修飾は生物学的機能を実質的に妨害
することなく構築物へ更なる特性を与える。このような
更なる特性は核酸分解酵素耐性に制限されることなく、
特異的細胞または細胞の特異的受容体をターゲッティン
グする能力、細胞の中での特異的な位置への配置の能
力、または構築物( またはウイルスまたはベクター) と
ターゲット細胞との間の一般的な様式の相互作用を増強
する能力または所望なればこのような相互作用を妨害ま
たは干渉するような能力であり得る。
【００１６】本発明はその機能、その細胞中での配置、
およびその寿命を定める構築物を創り出すか、あるいは
ウイルス、ベクターまたは構築物が細胞中へ侵入するの
に先立つウイルス、ベクターまたは構築物と細胞との相
互作用を調節するかいずれかのために生物学的要素と化
学的修飾とを組み合わせるものである。更に、本発明は
ターゲット細胞と核酸物質の間の一般的な相互作用と生
体内および試験管内において有用な多重コンプレックス
の組成物に備える方法と構造に関するものである。本発
明によって提供される組成物の中には、細胞中に存在す
る時に生産物を生産する構築物がある。該構築物は少な
くとも一個の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体ま
たは非核酸物質、またはこれらのいずれかの組合せから
なる。他の組成物は化学的修飾物またはリガンドからな
る物に非イオン的に結合される構築物である。細胞中に
存在する時、このような構築物は生産物を生産する。本
発明によって提供される他の組成物は、化学的修飾物ま
たはリガンドからなる物質に非イオン的に結合される構
築物である。細胞中に存在する時、このような構築物は
また生産物を生産する。
【００１７】本発明は(a) 核酸成分に対する少なくとも
一つのドメインと目的とする細胞への少なくとも一つの
ドメインとからなる非天然物質と、所望なれば(b) 核酸
成分と、所望なれば(c) 対象とする細胞、あるいは(b)
と(c) の両方からなる組成物を提供するものである。こ
の組成物において、核酸成分に対する一個または二個以
上のドメインは、細胞に対する一個または二個以上のド
メインとは異なる。対象とする細胞の中へ核酸成分を導
入するために、一つのキットが提供される。このキット
は包装された入れ物または一つの要素と三つの自由に選
択出来る要素の組合せからなる。第一の要素は核酸成分
に対する少なくとも一つのドメインと、対象とする細胞
に対するドメインとからなる非天然物質である。自由に
選択出来る要素は核酸成分、対象とする細胞、および緩
衝液と指示書とからなる。本発明によって提供される他
の組成物は対象とする細胞に対する少なくとも一個のド
メインからなり、このような一個または二個以上のドメ
インは、非二本鎖型の核酸成分に結び付く。キットはま
た対象とする細胞の中へ核酸成分を導入するために提供
される。該キットは包装されている入れ物または対象と
する細胞に対するドメインからなる物質と非二本鎖型で
ある核酸成分に結び付くドメインとの組合せからなる。
所望なれば緩衝液と指示書が備えられる。核酸成分に対
するドメイン、対象とする細胞に結び付くドメインから
なる物質からなる組成物がまた提供される。キットは対
象とする細胞の中へ核酸成分を導入するために提供され
る。包装されている入れ物または組合せにおいて、該キ
ットは核酸成分に対するドメイン、対象とする細胞に結
び付くドメインからなる物質からなる。また緩衝液およ
び指示書は所望ならば包含される。更に、一つまたはそ
れ以上の相互作用によって結び付けられる一個またはそ
れ以上のモノマー単位からなる多重コンプレックス組成
物が提供される。かくして、該モノマー単位は重合相互
作用を介して相互にまたは重合相互作用を介して結合マ
トリックスに、または両方の種類の相互作用の組合せで
結び付くであろう。また荷電ポリマーに結び付けられて
いる一個以上の成分からなる多重組成物が提供される。
この組成物において、該荷電ポリマーはポリカチオンポ
リマー、ポリイオンポリマー、ポリヌクレオチド、修飾
ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド類似体、ま
たは上記要素の如何なる組合せから選択される。
【００１８】本発明は細胞中に導入された時に非固有ポ
リメラーゼをコードしかつ発現する核酸構築物を提供す
る。該非固有ポリメラーゼは、構築物からの核酸配列の
一個以上のコピーを生成することが出来る。また細胞の
中へ導入された時、非固有プロセシング要素からなる核
酸生産物を生産する核酸構築物が提供される。適合性の
ある細胞中に含まれる場合、該プロセシング要素は実質
的にプロセシングの間に取り除かれる。本発明はまた細
胞中の核酸生産物を選択的に発現するプロセスを提供
し、該生産物は機能を果たすためにプロセシングを必要
とする。該プロセシングは第１に細胞の中に導入された
時、適合性のある細胞中に含まれた場合にプロセシング
の間に実質的に除去される非固有プロセシング要素から
なる核酸生成物を生成する核酸構築物を提供すること、
第２に該構築物を細胞中に導入することからなる。
【００１９】他の組成物は細胞中への導入において、核
酸生産物を生産することが出来る二次核酸成分または三
次核酸成分、あるいはその両方共を生成する一次核酸成
分からなる。該二次核酸成分、該三次核酸成分または核
酸生成物のいずれも一次核酸成分を生成する能力を有し
ない。ここにおいてはまた、真核細胞中に核酸生産物を
配置するためのプロセスが提供される。この配置プロセ
スは、第１に細胞内に存在する時、非天然核酸生産物を
生成する核酸成分からなる重要な組成物を提供すること
からなる。該非天然核酸生産物は、配置される物質部分
と対象とする核酸配列とからなる。プロセスの第２のス
テップでは、該組成物は真核細胞または真核細胞を含む
生物学的システムの中へ導入される。
【００２０】更に本発明によって、細胞の中へ導入され
た時に一個以上の特異的核酸配列を生成することができ
る核酸成分が提供される。このようにして生成された特
異的配列の各々は互いに実質的に非相同であって、細胞
内において対象とする一本鎖核酸の特異的部分と相補的
であるかまたは細胞中の対象とする特異的蛋白質に結合
する能力があるかいずれかである。本発明は更に対象と
するウイルスに対する細胞耐性を増強する方法を提供す
る。該方法は第１に、該ウイルスに表現型的な耐性を有
する形質転換された細胞、およびウイルスまたは細胞上
のウイルス特異的位置に結合することができる試薬を提
供することからなる。第２に該プロセスは対象とするウ
イルスに対する細胞耐性を増強するために細胞を含んで
いる生物学的システムへ、上記試薬を投与することから
なる。更に細胞の中へ導入された時、非天然生産物を生
産する核酸構築物が提供される。該核酸生産物は二つの
成分、第１に細胞成分に結合することができる結合成
分、第２にそれが非天然生産物に結合される時に該細胞
成分を転置することができる配置成分からなる。本発明
によって、細胞中の細胞成分の転置の方法が計画され
る。ここに、該プロセスは、第１に細胞の中へ導入され
た時、非天然生産物を生産する核酸構築物、細胞成分と
結合可能な結合成分と、非天然生成物に結合された場合
に該細胞成分の転のできる配置成分との二個の成分から
なる生産物それ自体を提供することからなる。該プロセ
スの第２のステップでは、核酸構築物は対象とする一個
の細胞または該細胞を含む生物学的システム、または対
象とする複数個の細胞の中へ導入される。
【００２１】定義 技術および／あるいは本発明で使用される述語の幾つか
の定義は以下のようである。 一次核酸構築物： 細胞の中で生産中心をつくりだす核
酸で構成される組成物。 生産中心： 細胞の中で他の生産中心をつくり出すかあ
るいは一本鎖核酸を生産することができる一次核酸構築
物から誘導される核酸である。 産出： 一次核酸構築物から生産中心の生成あるいは形
成、あるいはほかの産生中心から生産中心を生成あるい
は形成すること。 生産： 生産中心から一本鎖核分子を生成すること。 内在細胞システム： 一本鎖核酸生産物の機能と同じよ
うに生産および産出に使われる細胞内に存在する細胞性
プロセスおよび成分。このようなプロセス及び成分は細
胞に本来備わっているもの、あるいは人工的な方法ある
いは、たとえば、ウイルスによる感染により細胞に導入
されることができる。
【００２２】１．リガンドに仲介された遺伝子転移 本発明は限定された化学的に修飾された核酸構築物（Ｃ
ＨＥＮＡＣ）であり、細胞の中に導入されると、核酸を
生産する、細胞内の蛋白質を生産するあるいは細胞内で
の核酸あるいは蛋白質との相互作用のように生物学的に
機能することができる。該化学修飾は直接あるいは間接
に構築物に以下の性質の一つあるいは幾つかを付与す
る。a)目標の細胞への結合、b)核酸分解酵素耐性、c)細
胞内の核酸の導入のための機構の提供、d)細胞質内での
核酸分解酵素耐性の提供、e)細胞質から核への転移の促
進、f)細胞内でのより長い寿命の提供、g)細胞ＤＮＡへ
の組み込み信号の提供。本発明の中で当該核酸の生物学
的機能を実質的に妨害することなく上記の性質の一つあ
るいは二つ以上が提供されることができる。本発明は核
酸構築物に一つあるいは二つ以上のリガンドあるいは化
学修飾あるいは他の部分を核酸構築物につけ加えるため
に核酸の化学修飾を使用する。リガンドの付加あるいは
化学修飾により修飾された構築物はさらに他の部分と複
合することができ、このような部分としては天然のある
いは天然にはない、修飾されたあるいは修飾されていな
いオリゴあるいはポリペプチド；ポリカチオン；天然の
あるいは天然にはない、修飾されたあるいは修飾されて
いないオリゴあるいは多糖類類；多分子コンプレック
ス；不活性化されたウイルス；およびリガンドあるいは
化学的部分と複合できるすべての化学結合、付加、抱合
である。この発明の修飾された核酸構築物は植物、ヒト
および他の哺乳動物を含む真核細胞および原核細胞へ核
酸をデリバリーする方法を供与する。本発明はＣＨＥＮ
ＡＣの部位に化学修飾を配置する可能性を提供する。こ
のことはリガンドの付加あるいは化学修飾が生物学的機
能を破壊する可能性がある場合に生物学的機能に相当す
るＣＨＥＮＡＣの部分を上記の性質に相当する修飾され
る部位から分離することができるような組成物の構築を
可能にする。リガンドあるいは化学修飾が生物学的活性
を妨害する場合にはＣＨＥＮＡＣの化学的に修飾された
部分は細胞に導入されたあと修飾部分の置換あるいは消
失により構築物から引き離すことができる。
【００２３】一側面では、この発明は細胞中に存在する
と少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド、ヌクレオ
チド類似体および非核酸物質、あるいはこれらの組み合
わせからなる構築物である生成物を生産する。修飾され
たヌクレオチドは以下にさらに述べるように化学的に修
飾されたものでもいい。構築物中では、少なくとも一つ
あるいは二つ以上のヌクレオチド類似体はまた中軸、側
鎖あるいはその両者での修飾が可能である。非核酸物質
に関しては、この要素はまた構築物の一本の鎖あるいは
それが二本鎖である場合には両鎖に付加されうる。一つ
あるいは二つ以上の非核酸物質は多くの多様な形をとり
うる。これらには天然のポリマー、合成ポリマー、天然
のリガンドおよび合成リガンド、またいかなるまた全て
の上記の組み合わせが含まれる。ひとつあるいは二つ以
上の非核酸物質が天然のポリマーであるときには、都合
のいい部分が修飾されるかあるいは修飾されないことが
可能である。天然のポリマーはポリペプチド、蛋白質、
多糖類、脂肪酸および脂肪酸エステル、およびいかなる
また全てのこれらの組み合わせから選択されうる。本発
明で非核酸物質あるいは二つ以上の非核酸物質の合成ポ
リマー使用されるときには、同種ポリマーおよび異種ポ
リマーが適用されうる。このような同種ポリマーおよび
異種ポリマーはそれらが最終的に負電荷あるいは正電荷
をもっているとき多くの場合選択される。本発明の上記
の構築物が、少なくとも一つあるいは二つ以上の修飾さ
れたヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、核酸物質、リ
ガンドあるいはこれらのもののいかなるあるいは全ての
組み合わせたものを導入することで有用的に与えられる
さらなるそして付加的な生物学的活性を表すように選定
することができることは重要である。このような生物学
的活性は、核酸分解酵素耐性、細胞認識、細胞結合およ
び細胞（細胞質）内あるいは核内配置を含み、それ自身
多くの形をとりうる。
【００２４】ＣＨＥＮＡＣの核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、あ
るいはＲＮＡとＤＮＡの組み合わせ、即ちＤＮＡーＲＮ
ＡハイブリッドあるいはＤＮＡーＲＮＡキメラのような
キメラ核酸でありうる。ＣＨＥＮＡＣの核酸成分は一本
鎖あるいは二本鎖であり得る。核酸組成は全てあるいは
一部修飾された核酸あるいは核酸類似体でありうる。修
飾された核酸は核酸の相補的な部位に結合することがで
きまた糖、塩基あるいはリン酸基に化学的な修飾を持つ
ポリマーである。核酸類似体は相補的な核酸に結合で
き、これらの中軸がリボおよびデオキシリボ糖およびリ
ン酸グループ以外のものであるかあるいは側鎖グループ
が天然あるいは修飾された塩基以外のものであるポリマ
ーである。核酸類似体ポリマーの例にはペプチド核酸あ
るいは、1-(2'-デオキシ- β-D- リボフラノシル)-3-ニ
トロピロル（Nichols et al. 1994 Nature 369; 492,）
あるいは2'- デオキシネブラリンおよび2'- デオキシキ
サントシン（Eritja et al. 1986 Nucleic Acids Resea
rch 14; 8135）の様な識別力のない塩基類似体あるいは
一般の塩基を含む側鎖をもつポリマーを含む。これらの
出版物は文献としてここにとりいれる。修飾された核
酸、核酸類似体および最終的に負電荷および／あるいは
機能的なアミノグループをもつ他のポリマーは、これら
の性質が溶解性、特異性、酵素機能および結合を提供す
るので、本発明の実施を容易ならしめる。核酸の機能配
列のいくらかがプロモーター配列、ターミネーター配列
あるいはプライマー結合配列のような天然のあるいは修
飾された核酸配列であり得ることが望ましい。ＣＨＥＮ
ＡＣの核酸組成は一本鎖、二本鎖、部分的な二本鎖ある
いは三本鎖でもありうる。さらに、この組成は環状ある
いは線状あるいは分岐状が可能であり、またどの様なＤ
ＮＡあるいはＲＮＡの形もとりうる。それは二本鎖およ
び一本鎖の両方の部位を含むことができまた非相補的部
位即ち尾部を含むことができる。そのような尾部はさら
に相補的な核酸に結合されることが可能である。例え
ば、一本鎖核酸が、他の連続した二本鎖構造間のギャッ
プとしての一つあるいは二つ以上の一本鎖核酸の部位と
して存在することができる（図３、Gap 2 ）。選択的に
は、線状一本鎖核酸は尾部としてあるいは一方の端がＣ
ＨＥＮＡＣに結合し他の端が自由である線状の一本鎖核
酸として存在できる（図４及び６ａ）。ギャップと尾部
は一本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡあるいは修飾された核
酸、核酸類似体、多糖類、蛋白質および他の天然および
合成ポリマーを含む天然および合成の多数の他のポリマ
ーでありうる。この様な一本鎖部位は他の機能から生物
学的機能を分離する手段としてまた核酸の結合のための
相補的部位として働くことができる（実施例6bのよう
に）。
【００２５】核酸成分は構成塩基の間の3'-5' リン酸ジ
エステル結合が破壊されている一つあるいは二つ以上の
切れ目を持つことができる（図1bおよび2b参照）。リガ
ンドと化学的修飾は構成ヌクレオチドの糖、塩基および
リン酸残基の修飾により核酸、修飾された核酸あるいは
核酸類似体に結合される（Engelhardt etal., US Paten
t No. 5,260,433, 文献によりこの中に完全に取り入れ
られる）か多糖類、ポリペプチドおよび天然および合成
の多のポリマーのようなＣＨＥＮＡＣの非核酸部分に結
合されることができる。糖およびリン酸残基の修飾はリ
ガンドあるいは化学修飾および他の残基の末端への結合
のための好ましい場所となりうる。塩基残基の修飾はリ
ガンドあるいは化学修飾および他の残基の内部あるいは
末端への結合に使われうる。ピリミジンの５位（Ward e
t al. U.S.Patent No.4,711,955 および関連した部
門）やプリンの８および７位（Engelhardt et al., U.
S.Patent No. 5,241,060 および関連する分割特許；Sta
vrianopoulos, U.S.Patent No. 4,707,440 および関連
する分割特許）のような生物学的な機能を破壊しないよ
うな修飾は望ましい。上記米国特許および関連する分割
特許は文献としてここに組み入れられる。化学的な修飾
は尾部あるいはギャップのような構築物の特別の部位に
限られることもできるしあるいはＣＨＥＮＡＣ全体に分
散されることもできる。この様にして、構築物は例えば
ポリヌクレオチドの尾部からなるような末端のような少
なくとも一つの末端を含むことができる。この様な修飾
された核酸は細胞の中に導入された後除かれるか置換さ
れる。さらなる具体例として本発明は、上述したよう
に、修飾された核酸類似体、非核酸物質（あるいはこれ
らの組み合わせ）のひとつあるいは幾つかに共有あるい
は非共有結合で結合した少なくとも一つのリガンドから
なる構築物を提供する。このようなリガンドおよび化学
的修飾は共有および非共有的な作用を通してＣＨＥＮＡ
Ｃに直接に加えられることができる。共有的な付加は化
学的な方法（Engelhardt et al. ）および酵素的組み込
みで行われうる。非共有的付加は核酸配列、核酸構造、
蛋白質構造に基づき核酸ー核酸相互作用、抗原ー抗体相
互作用、疎水性相互作用および他の相互作用を通して行
われうる。ＣＨＥＮＡＣへの間接的付加はこれらの同じ
方法と相互作用により行われうる。本発明に含まれると
きには、このようなリガンドおよび二つ以上のリガンド
は本構築物のいかなる位置あるいはいかなる形に対して
も結合される。したがって、一つあるいは二つ以上のリ
ガンドは一本鎖部位、二本鎖部位、一本鎖の構築物の尾
部、構築物の尾部に相補的な配列あるいはこれらの位置
あるいは形の全ての組み合わせに対して結合されうる。
【００２６】天然あるいは合成のいかなる化学物質であ
れ、この発明に使われることができるリガンドあるいは
化学的修飾は20,000 m.w. 以下の低分子物質と同様に2
0,000m.w. 以上の高分子物質を含んでいる。一つあるい
は二つ以上のリガンドは高分子物質および低分子物質の
両方を含むことができる。利用されうる高分子物質はペ
プチドおよび蛋白質、核酸、多糖類、脂質、ポリアニオ
ン、ポリカチオンを含むポリマーおよび混合ポリマーを
含む多数の天然および合成ポリマーを含む。低分子物質
はオリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ
糖および高分子陰イオン、高分子カチオン、脂質および
混合ポリマーを含む合成ポリマーを含む。低分子物質は
モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチ
ド、オリゴ糖、単糖、糖および他の天然および組成物を
含む。
【００２７】リガンドおよび化学的修飾は核酸転移のた
めの以下のような有用な性質を提供する。1)細胞を目標
とするもの、2)細胞による取り込みを容易にするもの、
3)細胞内の配置をするもの、4)細胞核酸への取り込みを
容易にするもの、5)核酸分解酵素耐性を与えるもの。 １）利用されうる細胞を目標とするものは以下を含む。 ａ）細胞表面成分およびエピトープに対する抗体 ｂ）細胞表面成分に対して親和性を持つウイルス、ウイ
ルス成分あるいはウイルス成分の一部分。これらはＴ４
リンパ球のＣＤ４受容体に結合するＨＩＶのgp120 蛋白
質のような蛋白質を含む（Lever 1995 British Medical
Bulletin 51; 149, 文献としてここに組み入れ）。 ｃ）細胞表面に親和性を持つリガンド。これはホルモ
ン、レクチン、蛋白質、オリゴ糖および多糖類を含む。
たとえば、アシアロオロソムコイドはアシアロ糖蛋白質
受容体に結合し（Wu et al. 1989 J Biol Chem 269: 16
985,文献としてここに組み入れ）またトランスフェリン
はトランスフェリン細胞受容体に結合する（Wagner et
al. 1992 89; 6099,また文献としてここに組み入れ）。 ｄ）細胞表面に非特異的に結合するポリリジンのような
ポリカチオン（Wu and Wu ）。 ｅ）造血性細胞および他の細胞に結合するフィブロネク
チンのようなマトリックスス蛋白質（Ruoslahti et al.
1981 J. Biol. Chem. 256; 7277, 文献としてここに組
み入れ）。 ｆ）細胞表面に結合するレクチン。 ２）細胞による取り込みを容易にするものはアデノウイ
ルスのような不活性化ウイルス（Cristiano et al. 199
3 Proc Natl Acad Sci USA 90; 2122: Curiel etal. 19
91 Proc Natl Acad Sci USA 88; 8850,文献としてこれ
ら全てを組み入れ）；インフルエンザウイルスの血球凝
集蛋白質および、血球凝集素HA-2のN-末端の融合能のあ
るペプチドのような、それからできるペプチド断片のよ
うなウイルス成分（Wagner et al. 1992 Proc Natl Aca
d Sci USA 89; 7934, また文献としてここに組み入れ）
を含む。 ３）細胞内の配置が特異的なものとして以下を含む。 ａ）ヒストンのような核蛋白質 ｂ）細胞質蛋白質と会合し核に配置されsnRNA U1および
U2のような核酸種（Zieve and Sautereauj 1990 Bioche
mistry and Molecular Biology 25; 1, 文献として組み
入れ） ４）細胞核酸への取り込みを容易にするものは以下を含
む ａ）核酸のＤＮＡへの組み込みに機能する蛋白質。これ
らはインテグラーゼや部位特異的リコンビナーゼを含む
（Argos et al. 1986 EMBO Journ 5; 433,文献として組
み入れ）；および ｂ）特異的組み込みを促進する細胞ＤＮＡに相同的なヌ
クレオチド配列。 ５）デオキシヌクレオチド糖の2'位へのハロゲン原子グ
ループの付加を含めた構成ヌクレオチドの核酸分解酵素
耐性修飾を与えるもの（Braket et al., U.S.Patent Ap
plication serial No. 07/446,235,filed on December
4, 1989, 文献として組み入れ）。
【００２８】リガンドあるいは化学修飾はＣＨＥＮＡＣ
へ、ａ）直接の抱合により、ｂ）修飾されたヌクレオチ
ド三リン酸塩の酵素的な取り込みにより、ｃ）構成ヌク
レオチドに存在する反応性グループとの反応により、お
よび、ｄ）修飾された部分の取り込みのいずれかにより
導入されることができる。これらのプロセスは化学的お
よび酵素的方法の両者を含んでいる。酵素的な方法はプ
ライマー伸長、ＲＮＡおよびＤＮＡリゲーション、任意
開始（Kessler et al. 1990 Advances in Mutagenic Re
search, Vol. 1, Springer Verlag, pp 105-152 ）、切
断修復（Rigbyet al., 1977, J. Mol. Biol. 113, 23
7）、ポリメラーゼ連鎖反応（Saiki et al., 1985 Scie
nce 239, 487 ）、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラー
ゼを使うＲＮＡの標識法（Melton et al. 1984 Nucleic
Acids Research 12, 7035; Morriset al. 1986 Gene 4
1, 193 ）、ターミナルトランスフェラーゼによる末端
付加（Roychoudhury et al. 1979 Nucleic Acids Resea
rch 6, 1323 ）を含む。化学的方法（Kricka, 1995 Non
isotopic Probing, Blotting and Sequencing, Acadeic
Pressに記述されている）はアリルアミン、ブロモ、チ
オおよびアミノのような核酸中の活性化されたグループ
へのリガンドあるいは化学的修飾の直接の付加；核酸の
化学合成の間に化学的に修飾されたヌクレオチドの取り
込み（Cook etal. 1988 Nucleic Acids Research 16, 4
077; Stavrianopoulos U.S. Patent No. 4,707,440 お
よび関連する分割特許）、化学的な末端標識（Agrawal
et al. 1986 Nucleic Acids Research 14, 6777 ）；酵
素による核酸の標識（Jablonskiet al., 1986 Nucleic
Acids Research 14, 6115）を含む。上記出版物および
米国特許のすべては文献としてここに組み込む。ＣＨＥ
ＮＡＣはリガンドあるいは化学的修飾により修飾された
核酸断片を取り込むことにより調製することができる。
構築物はまた修飾されていない核酸断片と他の断片を一
緒に取り込ませることにより調製することもできる。構
築物中に取り込まれる断片は一本鎖、二本鎖あるいは一
本鎖、二本鎖の両領域を含むものでありうる。この様な
断片はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの結合物あるい
はキメラ核酸からなることができる。断片のすべてある
いは一部は修飾された核酸あるいは核酸類似体からなる
ことができる。断片のすべてあるいは一部は天然のある
いは合成のポリマーを含むことができる。断片は上記の
化学的方法および酵素的方法のいずれによっても調製す
ることができる。
【００２９】本発明はリガンドあるいは化学的修飾の配
置場所の選択法を提供する。この様なリガンドあるいは
化学的修飾が生物学的活性を妨害しないように、生物学
的活性をもった断片はＣＨＥＮＡＣ中で修飾された断片
から分離されることができる。また、修飾がある断片の
ある部分に限定されることができる。例えば、選択した
リガンドあるいは化学的修飾で標識した特異的なプライ
マーを構築物の限定された部位にハイブリダイズし、プ
ライマーの限られた場所にリガンドあるいは化学的修飾
を限定するために重合は修飾されていないヌクレオチド
の存在下で行うことができる。他の方法として、リガン
ドあるいは化学的な修飾を鎖の非プライマー部位に限定
するために、修飾されていないプライマーを修飾された
ヌクレオチドの存在下での合成に使用することができ
る。他の方法として、リガンドあるいは化学的修飾を含
むプライマーを使用することにより、鎖の至る所にある
いは尾部に対する相補性をとおして標識することが可能
である。構築物の生物学的活性の部位はＲＮＡ（本特許
の実施例２６に述べるようにアンチセンスＲＮＡあるい
はリボザイムのようなもの）あるいは蛋白質に翻訳され
るＲＮＡあるいはＤＮＡをコードするように特殊化する
ことができる。ＣＨＥＮＡＣの生物学的活性部位は細胞
内核酸配列とのハイブリダイズのための配列、細胞ＤＮ
Ａへの組み込み、終止配列、プライマー部位、プロモー
ター部位および修飾信号と配列を含むことができる。
【００３０】ひとつの選ばれた具体例では、本発明の構
築物は全体として陽電荷あるいは負電荷を持っている。
さらに、構築物は中性あるいは疎水性ですらありうる。
構築物が修飾されていないヌクレオチドと一つあるいは
それ以上のヌクレオチド類似体および非核酸物質あるい
は両者から選択されたすかなくともひとつの他の 構物
あるいは要素からなることができることは見過ごされる
べきではない。本発明のもう一つの重要な具体例は細胞
内に存在すると生産物を生産し、化学的な修飾あるいは
リガンドの付加あるいはその両者を含んでいるものに非
イオン的に結合している構築物である。他の上に述べた
構築物の場合におけるように、この構築物もまたポリヌ
クレオチドの尾部を含む末端のような少なくとも一つの
末端を含みうる。ポリヌクレオチドの尾部は相補的なポ
リヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるかハイ
ブリダイズしている。二本鎖核酸に対する抗体がつくら
れ、この様なハイブリダイズされたポリヌクレオチド尾
部の配列に結合されることができる。抗体はポリクロン
抗体あるいはモノクロン抗体を含みうる。
【００３１】２．普遍的な遺伝子のデリバリー 他の有用な熟語および定義として以下を含む： 核酸成分：生産物を生産できる細胞中にある化合物ある
いは組成物。組成物は一本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子およびキメラ核酸である
ポリヌクレオチド、修飾された核酸および核酸類似体；
核酸構築物および化学的に修飾された核酸構築物（例１
ー１３）；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レト
ロウイルスのような動物ウイルスおよび植物ウイルスお
よびバクテリオファージを含むウイルス；Ｔｉプラスミ
ドを含むプラスミド；あるいはパッケージング信号でウ
イルス粒子の中にカプセル化されたプラスミド誘導体を
含む細胞にデリバリーされることが望まれる核酸配列か
らなる。核酸成分は細胞内で産生されるかあるいは試験
管内で組み合わされるかあるいは化学的に産生されるか
あるいは組換えＤＮＡ技術で産生される。細胞内で核酸
成分からつくられる生産物はｍＲＮＡ、アンチセンスＲ
ＮＡあるいはＤＮＡ、リボザイムを含むポリヌクレオチ
ドであり得るしあるいは蛋白質あるいは蛋白質生産物で
ありうる。
【００３２】ドメイン：細胞あるいは核酸成分のいずれ
かに非共有結合で結合する部分をもつもの。 バインダー：バインダーは少なくとも一つのドメインを
含む担体あるいはマトリックスである。本発明は普遍的
で効率的な核酸転移のための組成物と方法を提供するこ
とにより従前の技術の限界を克服している。ウイルスベ
クターの中、核酸構築物のなかであるいはポリヌクレオ
チドとして、核酸は広範囲の細胞種に導入可能である。
さらに、この発明でのウイルスベクターの使用は特異的
なあるいは独特のウイルスに限ることなく広範囲のウイ
ルスベクターが使用可能である。この発明は二つの点で
普遍的である：１）いかなる核酸成分も生体内、試験管
内で摘要可能であるそして２）いかなる標的細胞使用さ
れうる。この発明の実施で、 １）核酸成分と標的細胞を非常に接近させ；そして ２）核酸成分と標的細胞の間に特異性を与える。 ３）細胞増殖、核酸の細胞による取り込み、核酸の細胞
内配置および細胞ＤＮＡへの核酸の組み込みを高めるす
ることを通して核酸の転移を促進する受容能因子を提供
することにより細胞への核酸の転移を増強する、ことが
可能である。本発明は細胞にＤＮＡをデリバリーするた
めの材料と方法を提供する。特異性および／あるいは近
接性は中間体である少なくとも一つのドメインからなる
バインダーを通して与えられる。もしバインダーが標的
細胞に対する少なくとも一つのドメインを持つならば、
バインダーは核酸成分にくっつけられる。もしバインダ
ーが核酸成分に対する少なくとも一つのドメインを持つ
ならば、そのときは、バインダーは標的細胞にくっつけ
られる。もしバインダーが核酸成分と標的細胞の両者に
対する少なくとも一つのドメインを持つならば、細胞に
対するドメインは核酸成分に対するドメインと異なって
いる。本発明の重要な具体例の一つは順番に核酸成分に
対する少なくとも一つのドメインと対象とする細胞に対
する少なくとも一つのドメインからなる非天然物からな
る組成物である。核酸成分に対する一つのあるいは二つ
以上のドメインは該細胞に対する一つあるいは二つ以上
のドメインとは異なっている。任意の要素がこの組成物
あるいは、核酸成分、対象とする細胞あるいはこの様な
核酸およびこの様な細胞の両者を含む非天然物に加えら
れる。勿論、このものはバインダーからなっている。さ
らに、非天然物のなかのバインダーとドメインは同じで
あってもいいし異なっていてもいい。バインダーは少な
くとも一つのドメインからなる支持体あるいはマトリッ
クスである。バインダーはポリマーのような天然あるい
は合成の支持体、マトリックスあるいは担体（あるいは
これらの組み合わせ）でありうる。バインダーは核酸成
分あるいは対象とする細胞あるいは両者に対する少なく
とも一つのドメインからなっている。この様にして、バ
インダーは単一の機能あるいは二つの機能を持つもので
ありうる。単一機能バインダーの場合には核酸成分かあ
るいは対象とする細胞のいずれにかに対する一つのドメ
インのみが存在する。二機能バインダーの場合には、一
つは核酸成分に対する他は対象とする細胞に対する少な
くとも二つのドメインが存在する。バインダー中に二つ
のドメインが存在する、即ち二機能バインダー、場合、
核酸成分に対するドメインは対象とする細胞に対するド
メインとは異なっている。ある場合にはドメインおよび
バインダーが、エピトープに結合する部分（Fab 領域）
と付加に対する支持体として機能するFc部分を持ってい
る抗体のように、同じ物であることができる。
【００３３】ドメインは細胞あるいは核酸成分のいずれ
かに結合する部分を含む物である。ドメインはオリゴペ
プチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖類、オリゴヌク
レオチドおよびポリヌクレオチドを含む天然あるいは合
成のポリマーでありうる。これらはモノクロン抗体、ポ
リクロン抗体、ポリアミンのようなポリカチオン、細胞
表面蛋白質に対するリガンド、細胞外マトリックスおよ
びリガンドとその結合する相手を含む。これらは生体内
で産生されるかあるいは試験管内で組み合わされるかあ
るいは化学的に生産されるかあるいは組換えＤＮＡ技術
で生産されることができる。ドメインは核酸ー核酸相互
作用、抗原ー抗体相互作用、受容体ーリガンド相互作
用、疎水性相互作用、多イオン相互作用および、核酸特
異性、核酸配列およびこの様な配列あるいは二次構造あ
るいはその組み合わせに特異的に結合できる蛋白質に基
づく他の相互作用を含む多様な相互作用を通して特異的
あるいは非特異的結合で細胞あるいはＮＡ物への結合を
提供する。リガンド結合対の間および相補的核酸配列の
間の相互作用は本発明の適用に好ましいものである。こ
れらは相補的な配列によって認識される核酸配列、抗体
による抗原、同列の糖により認識されるレクチン、受容
体により認識されるホルモン、酵素により認識される阻
害剤、補酵素ー酵素結合部位により認識される補酵素、
基質により認識される結合リガンドおよびこれらの組み
合わせを含む。抗体は有用なドメインとなる。モノクロ
ンおよびポリクロン抗体およびこれらの断片が使用され
うる。抗体は血清から、ハイブリドーマからおよび組換
えＤＮＡ法で得ることができる。二つのことなったエピ
トープに結合できる二つの特異性を持った抗体もまた有
用である。これらはハイブリッドハイブリドーマ（Stae
rz and Bevan 1986 Proc Natl Acad Sci USA 83; 1453
）、異なった特異性の抗体あるいは抗体断片を化学的
に抱合してつくられるヘテロ抗体（Fanger et al.1992
Critical Rev Immunol. 12; 101）、遺伝子工学でつく
られた二つの特異性を持った一本鎖の抗体（Gruber et
al. 1994 Journ Immunol 152; 5368）および遺伝子工学
でつくられたヂアボディー（Holliger et al. 1993 Pro
c Natl AcadSci USA 90; 6444）でありうる。ここにあ
げた全ての出版物はここに文献として組み入れられる。
【００３４】非特異的な細胞結合性を持つ有用なドメイ
ンとしてポリリジン、プロタミン、ヒストンあるいはこ
れらの部分あるいは断片を含むポリカチオンのようなポ
リイオン的性質を持った分子が含まれる。特異的な細胞
結合性を持った有用なドメインとして次のものが含まれ
る： １）天然の細胞の成分、エピトープあるいはリガンドに
対して結合親和性を持つもの。このような細胞結合ドメ
インとしてホルモン、単糖およびオリゴ糖、細胞の受容
体部位を認識するウイルス、フィブロネクチンとその断
片のような試験管内マトリックスス蛋白質、細胞蛋白質
およびその断片に対する抗体のような細胞受容体に特異
的なリガンドが含まれる。 ２）非天然的に導入されたリガンドに対して結合親和性
を持つものであり、そこでは、a)リガンドが細胞表面蛋
白質のチロシンあるいはアミノ基との反応によってのよ
うに化学的な方法で細胞に付加される、あるいは、b)リ
ガンドが非特異的に細胞に間接的に付加されるもの。非
特異的に核酸成分に結合する有用なドメインとして非共
有結合的に結合し、リガンド／受容体系を介さないもの
が含まれる。例としては核酸に結合するポリリジンおよ
びヒストンのようなポリカチオンである。特異的に核酸
成分に結合する有用なドメインとして次のものが含まれ
る： １）核酸成分の天然の成分、エピトープあるいはリガン
ドに結合親和性を持つもの。以下が含まれる。 a)二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、二本鎖および一本鎖ＲＮ
ＡあるいはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対する抗体を
含む核酸に対する抗体；１７塩基対の配列結合するラム
ダバクテリオファージのCro 蛋白質のような核酸に結合
性を持つ蛋白質（Anderson et al. 1981 Nature 290; 7
54, 文献として組み入れ）。 b)核酸成分のリガンドに対するエピトープあるいは受容
体に対する抗体。これらはウイルス蛋白質、細胞受容体
およびリンパ球のＣＤ４蛋白質のようなウイルス結合蛋
白質を含む。 ２）人工的な特異的な結合システム（ドメイン）が該リ
ガンドが対応する受容体を持っているような核酸成分に
対するリガンドを化学的に導入することにより形成でき
る。このような特異的なリガンドあるいはエピトープが
例えばベクターウイルス蛋白質のチロシンあるいはアミ
ノ基の化学的な修飾により人工的に導入されうる。二つ
のドメインを持つバインダーは天然に存在するしあるい
は合成的あるいは人工的に調製することができる。例え
ば、細胞結合能を持つ一つのドメインを持っているバイ
ンダーが核酸成分結合性を持つドメインと結合して二機
能バインダーを形成することができる。この結合は、1)
共有結合的付加、2)特異的な非共有結合的付加、および
3)非特異的、非共有結合的付加あるいは4)組換えＤＮＡ
法による融合ペプチドによりおこりうる。
【００３５】この発明の上に述べた組成物において核酸
成分は核酸、核酸構築物、ウイルス、ウイルス断片、ウ
イルスベクター、ヴィロイド、ファージ、プラスミド、
プラスミドベクター、細菌、細菌断片およびこれらの組
み合わせを含む多数の異なった形をとりうる。対象とす
る細胞は原核あるいは真核であり得る。この開示の他で
述べるように、ドメインは非共有結合的にあるいはバイ
ンダーを通してあるいはこれらの組み合わせで付加され
うる。非共有的な結合が用いられるところでは、イオン
的な相互作用および／あるいは疎水的な相互作用が望ま
しい。加うるに、非共有的結合はリガンドを結合する受
容体によって仲介されるような特異的なコンプレックス
のような特異的なコンプレックスからなることができ
る。リガンドを結合する受容体はそれ自身多くの形をと
りうる。適当なしかしこれに限定する必要はないこれら
を構成するものは相補的な配列により認識されるポリヌ
クレオチド配列；対応するモノクロンあるいはポリクロ
ン抗体により認識される抗原、抗原により認識される抗
体；対応する糖により認識されるレクチン；受容体によ
り認識されるホルモン；ホルモンにより認識される受容
体；酵素により認識される阻害剤；阻害剤により認識さ
れる酵素；補酵素ー酵素結合部位により認識される補酵
素；補酵素により認識される補酵素ー酵素結合部位；マ
トリックスにより認識される結合リガンド；あるいはこ
れらの組み合わせである。
【００３６】本発明の他の面は、上に述べたように、核
酸成分に対するドメインおよび対象とする細胞に対する
ドメインが天然物であり、バインダーが天然の結合部位
以外の方法で核酸成分に付加している組成物に関係して
いる。ここでは、他の具体例において、バインダーが修
飾されたフィブロネクチンあるいは修飾されたポリリジ
ンあるいはこの両者からなることができる。上記の組成
物に含まれるか会合している対象とする細胞は生物のよ
うな生物系に含まれうる。上記したように、核酸成分を
導入する方法もまた提供される。本質的には該方法は上
記組成物の全てを供給し、これらを適当な生物系に投与
することからなる。投与は生体内あるいは細胞外で行い
うる。本発明はまた対象とする細胞へ核酸成分を導入す
るキットを用意している。これらのキットはひとまとめ
にした容器あるいは組み合わせで核酸成分に対する少な
くとも一つのドメインおよび対象とする細胞に対する少
なくとも一つのドメインからなる非天然の物からなって
いる。所望なれば、核酸成分、対象とする細胞および緩
衝液および指示書がキットに含まれる。もう一つの重要
な具体例一つのあるいは二つ以上のドメインが二本鎖形
でない核酸成分に付加されている、対象とする細胞に対
する少なくとも一つのドメインからなる物からなる組成
物である。他の場合のように、このものはバインダーか
らなることができ、ドメイン中のバインダーは同じでも
いいし、異なっていてもいい。ほかの中でバインダーは
ポリマー、マトリックス、支持体あるいはこれらの組み
合わせからなりうる。対象とする細胞は原核細胞あるい
は真核細胞でありうる。上記したように、核酸成分は核
酸、核酸構築物、核酸抱合物、ウイルス、ウイルス断
片、ウイルスベクター、ヴィロイド、ファージ、プラス
ミド、プラスミドベクター、細菌および細菌断片あるい
はこれらの組み合わせを含むがこれに限定されない多数
の形をとりうる。ドメインは共有結合、非共有結合ある
いは両者からなりうる。非共有結合として望ましいのは
イオン相互作用および疎水性相互作用（あるいは両
者）、およびリガンド結合性の受容体により仲介される
特異的なコンプレックスのような特異的なコンプレック
スである。このようなリガンド結合性受容体は上に述べ
られている。組成物の一部である対象とする細胞は生物
の中に含まれることができる。この最後に述べた組成物
は細胞に核酸成分を導入するための方法において同様に
有用に適用されうる。このプロセスもまた上に述べられ
ている。
【００３７】対象とする細胞へ核酸成分を導入するため
のキットはこの組成物からつくることができる。このよ
うなキットはひとまとめにした容器あるいは組み合わせ
で、ドメインが非二本鎖形である核酸成分に付加せれて
いる、対象とする細胞に対するドメインからなる物から
なっている。緩衝液および指示書は所望によりより含ま
れる。この発明はまた、ドメインが対象とする細胞に付
加されている、核酸成分に対するドメインからなる物か
らなる組成物を提供する。この今述べた組成物のさらな
る具体例として、対象とする細胞を含めて細胞に核酸成
分を導入するための生物、方法、キットと同様に、物、
バインダー、ドメイン、核酸成分、対象とする細胞、ド
メインの共有結合および非共有結合、イオン的および疎
水的相互作用、特異的複合体（リガンド結合性受容体に
より仲介されるものを含む）、リガンド結合性受容体は
すべて上に種々に述べたとおりである。
【００３８】単一機能的バインダーに対する核酸成分の
付加 １）細胞に対するドメインをもつ単一機能バインダーへ
の核酸成分の共有結合的付加。 共有結合的付加はドメインあるいはバインダーに備わっ
ている反応性グループの間の直接のカップリングあるい
は二機能架橋剤の使用により起こすことができる。ま
た、このような共有結合的付加を容易にするために反応
性グループがドメインおよびバインダーに導入されるこ
とができる。たとえば、蛋白質に対する付加は反応性の
アミノグループあるいはチロシン残基を通して起こすこ
とができる。付加は蛋白質ー蛋白質の抱合によって行う
ことができる。共有結合的付加はまた多糖類に対してお
よび核酸に対して行うこともできる。核酸、修飾された
核酸あるいは核酸類似体に対する共有結合的付加は構成
ヌクレオチドの糖、塩基あるいはリン酸塩部分の修飾を
通して行うことができる（Engelhardt et al., US Pate
nt No. 5,260,433, 文献として組み入れられる）。ま
た、核酸類似体が核酸の中に、たとえばアルキルアミン
グループのように、反応性グループを与えるように導入
されることができ、そして以下に述べるように、二機能
カプラーとしてＮ−マレイミド トリーアミノカプロン
酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエステルを使い、蛋
白質をこれらに共有結合的に付加することができる。糖
とリン酸塩部分の修飾はリガンドおよび他の残基の末端
付加の望ましい部位である。塩基の修飾はリガンドおよ
び他の残基の内部あるいは末端への付加に利用されう
る。修飾は、ピリミジンの５位の特異的修飾のようにハ
イブリダイゼーションを壊さないような修飾を含むこと
ができる（Ward et al., U.S.Patent No. 4,711,955 お
よび関連する分割特許）。プリンの８および７位の修飾
（Engelhardt et al. U.S.Patent No. 5,241,060および
関連する分割特許）および（Stavrianopoulos, U.S.Pat
ent No. 4,707,440 および関連する分割特許）は望まし
いものである。一つの具体例では、構築物あるいは構築
物成分の化学的修飾は塩基、糖およびリン酸塩あるいは
三つのいかなるあるいは全ての組み合わせから独立に選
ばれた部位にたいして影響されうる。 単一機能バイン
ダーに対する核酸物の直接の共有結合的付加は、二本鎖
ＤＮＡ分子（核酸物）の細胞表面化合物に結合する抗体
（単一機能バインダー）への付加により示される。たと
えば、リンパ球のＣＤ４化合物に結合する抗体は、一級
アミンを反応性グループとして供給するためにアルキル
アミンを含むヌクレオチドの取り込みにより修飾された
二本鎖ＤＮＡ（核酸物）に共有結合的に付加されうる。
共有結合的付加は以下に述べるようにＮーマレイミド
トリーアミノカプロイン酸ーＮ−サクシニイミドを二機
能カプラーとして使って行うことができる。フィブロネ
クチンはまた細胞に核酸をデリバリーするために核酸成
分の共有結合的付加に利用されうる。例えば、フィブロ
ネクチン、フィブロネクチン断片あるいはフィブロネク
チン含有物はポリヌクレオチドあるいはウイルスベクタ
ーのいずれにも付加されうる。たとえば、フィブロネク
チンは核酸成分のアルキルアミノグループに共有結合的
に付加されうる。アデノウイルスのようなウイルスベク
ターの核酸成分もまた蛋白質ー蛋白質抱合により共有結
合的にフィブロネクチンに結合されうる。共有結合的付
加は以下に述べるようにＮ−マレイミド トリーアミノ
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエステルを
使い行われうる。 ２）細胞に対するドメインを持つ単一機能バインダーへ
の核酸物の特異的非共有結合的付加。 核酸成分に対する非共有的付加は相補的な核酸の結合を
通して起こりうる。細胞表面蛋白質に対する抗体からな
るバインダーは、以下に述べるようにＮ−マレイミド
トリーアミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニイミ
ドエステルを二機能カプラーとして使用し、ＤＮＡ中に
取り込ませたアルキルアミングループにより一本鎖ＤＮ
Ａに共有結合的にくっつけることができる。一本鎖ＤＮ
Ａは核酸成分の尾部の配列に対する相補性を通して付加
される。たとえば、ＣＤ４細胞リセプターに対する抗体
は、ＣＤ４＋細胞に核酸をデリバリーするために、構築
物の一本鎖の尾部に相補的な一本鎖ＤＮＡ分子に共有結
合的に付加されることができる。フィブロネクチンは核
酸成分の非共有結合的付加に用いるように修飾されるこ
とができる。フィブロネクチンはアデノウイルスのよう
なウイルスベクターに特異的に結合する抗体に共有結合
的に付加されることができる。フィブロネクチンと抗ア
デノウイルス抗体はＮ−マレイミド トリーアミノカプ
ロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエステルを下に
述べるように二機能カプラーとして使うことにより共有
結合的に付加される。 ３）細胞に対するドメインを持つ単一機能バインダーへ
の核酸物の非特異的非共有結合的付加。 これは、ポリヌクレオチド（核酸成分）に結合するポリ
リジンのようなドメインの非共有結合的付加により達成
されうる。ポリリジンは、本特許の実施例１に述べられ
ているように、トリラクチルリジルリジン（細胞に対す
るドメイン）の共有結合的結合により修飾されたＤＮＡ
オリゴマーからなる単一機能バインダーに付加すること
ができる。できあがったものは肝細胞に特異的に核酸を
デリバリーする。
【００３９】核酸成分に対するドメインをもった単一機
能バインダーへの細胞の付加 １）核酸成分に対するドメインを持つ単一機能バインダ
ーへの細胞の共有結合的付加。 核酸成分に対するドメインを持つバインダーは細胞に共
有結合的に付加されうる。たとえば、アデノウイルスに
対するモノクロン抗体は、細胞表面にアデノウイルス結
合部位を提供するように細胞に共有結合的に付加されう
る。抗体の共有結合的付加は二機能カプラーとしてＮ−
マレイミド トリーアミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ
サクシニイミドエステルを使用して行うことができる。
二機能カプラーの合成および蛋白質の共有結合的付加へ
のその使用を記載する。トリアミノカプロン酸を三倍過
剰の３−マレイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシサク
シニイミドエステルとｐＨ７．８で室温３時間反応させ
る。ｐＨを酢酸で４．０に調整し、溶液を凍結乾燥す
る。未反応の３−マレイミドプロピオン酸の反応性エス
テルを除くために、固形物をエタノールでほぐし、残っ
たエタノールは真空にして除く。固形の残滓をジメチル
ホルムアミドにとかし、不溶の塩をフィルターし、１．
１等量のジシクロヘキシルカルボサクシニイミドと室温
で一夜反応させる。ヒドロキシ尿素をフィルターで除
き、ジメチルホルムアミドは摂氏３５度で高真空で除去
する。未反応のジシクロカルボジイミドとＮ−ヒドロキ
シサクシニイミドを除くために、半個体の残滓をイソプ
ロパノールでほぐす。固形の残滓を無水エーテルで洗
い、エーテルの残りは真空で除き、Ｎ−マレイミドトリ
−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエ
ステルを残す（化合物Ｉ）。細胞表面のチオールグルー
プを可逆的にブロックするために細胞を Ellman 試薬で
処理する。細胞表面のアミノグループをｐＨ７．８の等
張リン酸緩衝液中で化合物Ｉと反応させる。細胞を室
温、５分、1000xgで遠心分離し、上清を捨てることによ
り過剰の化合物Ｉを除く。細胞をリン酸緩衝等張塩溶液
に再懸濁し、チオールグループが加えられている抗体と
１時間室温で反応させる。チオールグループはホモシス
テインチオラクトンとｐＨ９．０で反応させることで抗
体に加えられる。反応の終わりに、細胞表面のブロック
してあったチオールグループを復元するために、細胞を
０．５ｍＭシステインとリン酸緩衝塩溶液中で反応し、
リン酸緩衝塩溶液中で遠心により細胞を洗う。 ２）核酸成分に対するドメインを持つ単一機能バインダ
ーへの細胞の特異的非共有結合的付加。 これはビオチンのＮ−ヒドロキシサクシニイミドエステ
ル（Enzotin,Enzo Biochem,Inc）を使い、細胞表面蛋白
質へビオチンを共有結合的に付加することにより達成す
ることができる。アビジンに共有結合で付加されている
（Fc部分で）アデノウイルスに対する抗体からなるバイ
ンダーは、細胞表面へのアデノウイルスの結合をあたえ
るように細胞表面のビオチン分子に結合する。 ３）核酸成分に対するドメインをもつ単一機能バインダ
ーへの細胞の非特異的非共有結合的付加。 ポリリジンはアデノウイルスに対する抗体のFc部分に共
有結合的に付加されうる。ポリリジン／抗アデノウイル
ス抗体はアデノウイルスベクターに対する付加部位をを
与えるように細胞に結合する。
【００４０】二機能バインダーの仲介を通した核酸成分
の細胞への付加。 このような二機能バインダーは直接的にあるいはバイン
ダーまたはマトリックスを通してのいずれかで、二つの
ドメインの付加によりつくられうる。付加は共有結合
的、非共有結合的あるいは特異的非共有結合的であり得
る。核酸成分の細胞への特異的付加は二機能バインダー
の使用での使用で達成されうる。このようなバインダー
は核酸成分に対するドメインと細胞に対するドメインの
会合により作成されうる。たとえば、アデノウイルスに
対する抗体はFc部分でポリリジンに共有結合的に付加さ
れうる。 CD4のような細胞表面蛋白質に対する抗体はま
た二機能バインダーをつくるようにポリリジンに共有結
合的に付加されうる。二機能バインダーはまた二つの異
なった抗体に付加されている相補的核酸鎖のハイブリダ
イゼーションを通して非共有結合的に調製されることが
できる。アデノウイルスに対する抗体の Fab断片はポリ
チミジル酸（poly T）のようなホモポリマーの添加によ
り修飾されうる。 CD4のような細胞表面標識に対する抗
体の Fab断片もまたこのような、この場合にはポリアデ
ニル酸（poly A）、ホモポリマーの添加により修飾され
うる。二つの修飾された Fab断片は、ＣＤ４＋細胞への
アデノウイルスのデリバリーを提供するように、Ａ：Ｔ
塩基対をつくることにより繋がれることができる（ホモ
ポリマーポリヌクレオチドへの Fab断片の付加のための
実施例１６参照）。ドメインとバインダーに対するに加
えて、他の実体も核酸転移を増強するために用意されて
いる。核酸成分、バインダーあるいはドメインへの直接
的あるいは間接的付加がありうる。付加は上述の方法に
よりバインダーおよびドメインへの核酸成分の共有結合
的および非共有結合的付加に対して行われうる。これら
は以下を含んでいる。 １）細胞増殖を増強する実体：これらは、細胞増殖と細
胞の形質転換効率を増強する、フィブロネクチンのよう
な試験管内マトリックス蛋白質を含む。 ２）細胞の取り込みを容易にする物：これらはアデノウ
イルスのような不活性化ウイルス（Cristiano et al. 1
993 Proc Natl Acad Sci USA 90; 2122: Curielet at.
1991 Proc Natl Acad Sci USA 88; 8850,これら全ては
ここに文献として組み入れられる）、インフルエンザウ
イルスの凝集蛋白質およびそれらのペプチド断片である
凝集素ＨＡ−２ Ｎ末端融合ペプチド（Wagner et al.
1992 ProcNat Acad Sci USA 89; 7934,文献として組み
入れられる）を含む。 ３）細胞核酸への核酸の取り込みを容易にする物：これ
はインテグラーゼ部位特異的なレコンビナーゼを含む
（Argos et al. 1986 EMBO Journal 5; 433,また文献と
して取り入れられる）。 ４）核酸の細胞内配置に機能する物：これは、ヒストン
のような核内蛋白質および細胞質蛋白質と会合し核に配
置するｓｎＲＮＡ Ｕ１およびＵ２のような核酸種を含
む（Zieve and Sautereauj 1990 Biochemistry and Mol
ecular Biology 25; 1, 文献として組み入れられる）。
【００４１】核酸構築物、バインダーあるいはドメイン
に付加されない因子もまた核酸転移に対する細胞の受容
能を増加することにより核酸転移を容易にする。これら
は細胞増殖を促進するように働き、生体内あるいは生体
外での遺伝子転換の間、前あるいは後で標的細胞に加え
られる因子を含む。これらは以下を含んでいる： １）細胞増殖を刺激するＩＬ３、ＩＬ６、Ｅｐｏおよび
ＳＣＦのような増殖因子（Palsson et al., 1993 Biote
chnology 11; 368: Koller et al. 1993 Biotechnology
11; 358: Keller et al. 1993 Blood 82; 378, 両者と
もに文献として組み入れられる）および ２）たとえば、細胞増殖を促進する細胞結合マトリック
スを形成するフィブロネクチンのようなマトリックス蛋
白質、これらの断片あるいはこれらの部分を含んだ化合
物のような物。 本発明は、生体内あるいは生体外での一つあるいはそれ
以上のこのような作用を提供する。このような生体内あ
るいは生体外の作用は以下を含んでいる： １）核酸成分と標的細胞を非常に接近させること。 ２）核酸成分と標的細胞の間の相互作用に対して特異性
を与えること。 ３）核酸成分を標的細胞に導入することを容易にするこ
と。 ４）増殖因子、支持マトリックスおよび他の因子を提供
することにより形質転換される細胞の能力すなわち細胞
の受容能を増強すること。 ５）核酸成分および核酸成分誘導体の細胞内での配置、
組み込み、安定性を準備すること。 ６）細胞内で、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮ
Ａ、センスＲＮＡ、リポザイム、おとり、ｍＲＮＡおよ
び蛋白質を含む一つあるいはそれ以上の生産物を生産す
ることができる核酸成分あるいはその誘導体を提供する
こと。
【００４２】３．多重コンプレックス 本発明は個々の化合物がその単一活性を保持し、一方で
またお互いに集まった後の溶解性を保持している多重コ
ンプレックスを形成する新しい方法と組成物を提供す
る。このような多重コンプレックスは、多重の相互作用
を通してお互いに非共有結合的に結合しているかあるい
は、多重の相互作用によりマトリックスに非共有結合的
に結合しているかのいずれかの一つ以上のモノマー単位
からなっている。本発明は多重相互作用を通してお互い
に付加したあるいは多重相互作用を通して結合マトリッ
クスに付加したあるいは両相互作用の組み合わせで付加
した一つ以上のモノマー単位からなる多重コンプレック
ス組成物を提供する。モノマー単位のポリマーあるいは
オリゴマーは直鎖でも分岐でもありえ、またそれはホモ
ポリマーあるいはヘテロポリマーからなりうる。モノマ
ー単位は、たとえばウイルス、ファージ、細菌、細胞あ
るいは細胞性物質、組織、器官あるいは生物、あるいは
これらの組み合わせのような生物系の中の成分を認識す
ることができるもののような分析特異的単位からなりう
る。分析特異的単位は、蛋白質、多糖類、脂肪酸あるい
は脂肪酸エステルおよびポリヌクレオチド（直鎖あるい
は環状あるいは一本鎖）あるいはこれらの組み合わせか
らの誘導あるいは選択を含む多くの形をとることができ
る。分析特異的単位として、このような蛋白質は抗体
（ポリクロンおよびモノクロン）、ホルモン、増殖因
子、リンホカインあるいはサイトカインおよび細胞性マ
トリックス蛋白質あるいはこれらの組み合わせからなる
ことができる。モノマー単位は二つの要素からなる物で
ある。該第一要素は化合物である。該第二要素は、第二
のモノマー単位のポリマーあるいはオリゴマーにあるい
は結合マトリックスをつくり上げるポリマーあるいはオ
リゴマーのいずれかに、非共有結合的に結合するかコン
プレックスをつくるかあるいはハイブリダイズすること
ができるポリマー（あるいはオリゴマー）である。他の
ものの中で、モノマー単位は天然に存在する化合物、修
飾された天然の化合物、合成化合物および組み換え的に
生産された化合物あるいはこれらの化合物の組み合わせ
から選択されうる。該化合物は生体内あるいは生体外の
生物系の構成要素を認識し、結合することのできる分析
特異的単位でありうる。生物系は細胞、細胞成分、ウイ
ルス、ウイルス成分、循環物質、試験管内結合マトリッ
クスあるいはこれらの組み合わせからなることができ
る。化合物は天然に存在するもの修飾された天然化合
物、合成化合物あるいは組み換え産物でありうる。それ
は完全な蛋白質鎖あるいはＦ（ａｂ）断片、ヒトあるい
は他種由来のポリクロン又はモノクロン抗体でありう
る；それはリンホカイン、サイトカイン、ホルモン（例
えばインシュリン）あるいは増殖因子（たとえばエリス
ロポエチン）あるいは細胞性マトリックス蛋白質（たと
えばフィブロネクチン）でありうる；それはリガンド、
ベクター、細菌あるいはウイルスでありうる；それは単
糖、オリゴ糖、多糖類、ポリヌクレオチド、蛋白質ある
いは脂質でありうる。ポリマーは共有結合的あるいは非
共有結合的のいずれかで化合物に付加されることができ
る。該化合物は、化合物およびポリマー上の反応性グル
ープの抱合を通してポリマーに共有結合的に付加されう
る。化合物あるいはポリマーあるいは両者のいずれも抱
合が容易になるように化学的に修飾されうる。化合物あ
るいはポリマーのいずれもビオチンのようなリガンドが
一方に導入され、アビジンのようなリガンドに対する受
容体が他方に導入されるような修飾を受けうる。与えら
れた化合物に付加されているポリヌクレオチド部分はそ
れ自身に結合するあるいはお互いにハイブリダイズする
ことがないあるいは自分自身で相補的でないことが望ま
しい。多重構築物の中では、均質な成分あるいは不均質
な混合物または化合物上にあるポリマー部分が結合マト
リックス中の同じ結合ポリマーあるいはポリヌクレオチ
ドに結合するかハイブリダイズすることができるかぎり
は、該成分は均質でも不均質でもいい。モノマー単位を
形成するために化合物に付加されるポリマーはそれらが
お互いに非共有結合的に結合することができるという条
件で結合マトリックスからなる同じグループのポリマー
から選択されうる。結合マトリックスは、モノマー単位
のポリマーの直鎖部分に非共有結合的に結合できる一つ
以上の直鎖部分を持つ直鎖あるいは分岐状の多重化合物
からなる物である。直鎖部分はホモポリマー、ヘテロポ
リマーあるいは共ポリマー、合成ポリマー、天然ポリマ
ー、ポリヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチドあ
るいはポリヌクレオチド類似体あるいはポリイオン化合
物からなりうる。このようにして、ＤＮＡ結合マトリッ
クスはポリペプチド、ポリヌレオチド、および多糖類あ
るいはいかなる組合せからなるかあるいは選択されるこ
とができる。結合マトリックスはそれ自身は化合物ある
いは物に付加されてもいいしされなくてもいい。結合マ
トリックスが化合物あるいはリガンドに付加する例で
は、結合マトリックスは直接的（共有結合的）あるいは
間接的（非共有結合的）のいずれかで化合物に付加する
ための反応性グループを持つことが望ましい。結合マト
リックスの中に含まれるか化合物に付加されている望ま
しいポリマーは核酸のリン酸塩のバックボーンのよう
な、電荷をもったグループを持つ単一バックボーンを持
つものである。これらのポリマーの水素結合あるいはイ
オン状態は、米国特許No. 4,843,122 or EP 0 285 057
B1に記載されているキレートグループあるいは米国特許
No. 4,711,955 に記載されたアミノグループの導入のよ
うな、このようなポリマーの側鎖あるいはバックボーン
の適当なグループの化学的修飾によりさらに変化されう
る。これらの上記の米国および外国特許の全ての内容は
文献としてこの開示の中に組み入れられる。化合物に付
加されたポリマーおよび結合マトリックスのポリマーは
イオン的相互作用、水素結合、相補性あるいは双極子−
双極子相互作用を含む極性相互作用のいずれかを通して
お互いに非共有結合的に結合しうる。結合がイオン的相
互作用を通しての場合、モノマー単位がポリカチオン部
分を含んでいると、対応する結合マトリックスはポリア
ニオン部分を持たなければならない。モノマー単位がポ
リアニオン部分を持つならば、対応する結合マトリック
スはポリカチオン部分を持たなければならない。陽性に
荷電したポリマーの例としてプロタミンあるいはポリリ
ジン、可溶性ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロ
ースあるいはＤＥＡＥデキストラン（分岐した多糖類）
がありうる。陰性に荷電したポリマーの例はテイコイン
酸（ホスホジエステル架橋でお互いにつながったグリセ
リンまたはリビトール分子の多重鎖）、ポリグルタミン
酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸
（三つの陰性に荷電した硫酸グループをもつ分岐した多
糖類）である。結合が水素結合あるいは相補性を通して
いるとき、もしモノマー単位が付加されたポリヌクレオ
チドを持つとすると、対応する結合マトリックスは相補
的な核酸配列を持たなければならない。結合マトリック
スポリマーは可溶性であるために正味のイオン電荷ある
いは十分の極性を持ち、また反対の極性、電荷あるいは
相補性の他のポリマーに非共有結合的に結合する能力を
持つのが望ましい。このようなポリマーは一本鎖および
二本鎖ポリヌクレオチド、ＲＮＡあるいはＤＮＡ、修飾
されたものされないもの；ポリ核酸類似体あるいはこの
ような性質を示す全ての他のポリマーでありうる。二本
鎖核酸はまたポリアニオン的な結合マトリックスとして
ふるまうことができる。この場合には、単位ポリマーは
ポリリジンあるいはポリアミンのようなポリカチオン物
に付加される。このようなコンプレックスを構築する他
の方法は蛋白質−核酸相互作用を通すものである。核酸
に高い親和性レベルを示すポリペプチドは核酸ポリマー
に結合することにより、おたがいにコンプレックスとな
ることができるモノマー単位を形成するように望みの化
合物に付加されることができる。モノマー単位がＨＩＶ
ＴＡＲ蛋白質のように配列特異的に結合する蛋白質から
誘導される場合には核酸ポリマーの配列は結合配列の多
重体で成り立つことができる。しかしながら、モノマー
単位がヒストンのような配列に無関係なＤＮＡ結合蛋白
質である場合には核酸ポリマーの配列の選択には全く制
約がない。与えられた結合マトリックスの上の化合物の
最大の数を得るように、与えられた結合マトリックスの
中のモノマー単位の数を調節し、かつ多重コンプレック
ス構築物が最大に機能することを保証するために溶解度
を維持し、また立体的な障害をさけることにより与えら
れた多重コンプレックス化合物を適正化することができ
る。結合マトリックスへのモノマー単位の結合が二つの
反対に荷電したポリマーのイオン的相互作用を通しての
場合には、モノマー単位の結合マトリックスに対する割
合は多重コンプレックス化合物の正味の荷電あるいは荷
電の分布が溶解度を維持するのに十分であるように調節
されなければならない。このような多重コンプレックス
は、ほかのポリマーに結合できそして／あるいは他の化
合物のポリマーに結合できる個々の化合物にポリマーを
導入することによりつくられる。ポリヌクレオチドの場
合、結合は相補的な配列を通すものでありうる。ポリマ
ーは、安定な結合をつくるのに十分に長いホモポリマー
あるいはヘテロポリマーでありうる。ポリヌクレオチド
によりつくられる安定な結合においてはポリマーは約５
から数千ヌクレオチドの長さでありうる。これらの多重
コンプレックス単位の一つの側面は標的物に対して高い
親和性を持つコンプレックスの形成である。本発明の多
重抗体コンプレックスは標的抗原に対して単一の抗体よ
りもはるかに高い結合力をもつだろう。このようなコン
プレックスは化学療法的にまた試験管内での診断のため
に有用であろう。生体内ではこのようなコンプレックス
は抗ウイルス、抗細菌および抗腫瘍剤を含めより効果的
な免疫試薬として使いうるであろう。このような多重コ
ンプレックスの生体内での使用の場合、望ましいポリマ
ーはポリヌクレオチドあるいは修飾されたポリヌクレオ
チドであるが、それは核酸は免疫的により寛容であるか
らである。試験管内での診断に対してはこのような多重
コンプレックスはより感度のいい分析システムを開発す
るのに有用であろう。すべての診断システムの感度は信
号の感度および分析物と分析特異的単位との間の親和性
の二つの要素に依存している。もし親和力が十分に高く
ないならば、標的物とのシステムにおける飽和の結合を
いかに上げるかについて実際上のあるいは理論上の限界
があるであろう。さらに、このようなコンプレックスは
生体内あるいは試験管内で（開示に記載されているよう
に）効率的な遺伝子転換に使われうる。
【００４３】試験管内と同様に生体内での一定のレベル
の結合を得るためには結合対象の一定の濃度が要求され
る。細胞に結合することで細胞に生物学的効果の引き金
を引くことができる生物学的結合要素の多重コンプレッ
クスは対応するモノマー単位よりも標的細胞に対するは
るかに高い結合親和性を持つであろう。結果として、同
じ生理学的効果を達成するのに、モノマー単位に較べ
て、このような多重コンプレックスの必要量ははるかに
低い。このような生物学的コンプレックスの例はホルモ
ン、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、リガンド
である。インシュリンの多重コンプレックスは糖尿病の
扱いで、この方法で有用であろう。より強い生物学的な
作動体をつくるのに使われるのに加えて、本発明の多重
コンプレックスあるいはポリマー単位はウイルス、細
菌、カビのような病原因子あるいは毒素化合物に結合す
る化合物の多重コンプレックスあるいはポリマー単位を
つくるのに使われうる。これらの結合化合物は完全な蛋
白質またはＦ（ａｂ）断片、ヒトまたは他種由来のポリ
クロンまたはモノクロン抗体；あるいは病原因子あるい
は毒性化合物の受容体蛋白質でありうる。このようなポ
リマーあるいはコンプレックスの標的への結合はモノマ
ーの結合より強く、またこれらのポリマーあるいはコン
プレックスは病原因子あるいは毒性化合物のより低い濃
度を認識し、結合する。したがってこれらの組成物は、
感染および毒性に対してより効果的な化学療法的使用に
対して応用されることができる。これらの生産物は患者
の生体内へ投薬されるか、強く感染したあるいは毒性の
血液の中和のために生体外で使用されうる。これらのコ
ンプレックスの調製において、化合物の結合がその生物
学的機能あるいは効果を妨げないように、化合物を修飾
することができる。反応性グループあるいはオリゴマー
あるいはポリマーの共有結合的あるいはコンプレックス
を通しての望ましい付加は非破壊的化学によるものであ
る。結合は活性部位、結合部位あるいは機能的グループ
の中にはない化合物中の反応性グループを通してのもの
であり、また結合は分子の破壊を最少量にして最大の自
由を許すようなものである。所望ならば、適当な共同作
業的結合を与え、また強い立体障害をやわらげるよう
に、それとの空間配置を適化するためにモノマー単位が
マトリックスに結合する領域の性質を限定することによ
り、モノマー単位の空間配置を前もって決めることがで
きる。モノマー単位のこの型の配置の例は、実施例１８
からの図２３に示されており、ここではモノマー単位
が、Ｍ１３結合マトリックスの異なった部分に相補的な
特異配列に結合されている。これらの多重コンプレック
ス化合物はさらに、その生物学的機能を高めるか、その
溶解性を増すか、さらなる共同に働く包括的な結合を与
えるかあるいは試験管内および生体内で所望する細胞に
結合できる能力を与えるかいずれかのリガンド、受容
体、化学修飾のような多くの他の物を含みうる。このよ
うにして、本発明のもうひとつの側面は、上記したよう
に、結合マトリックスに付加される物から、さらになる
組成物である。このような物はリガンドあるいは結合マ
トリックスの結合を増加する化合物からなることができ
る。このような物の例は細胞マトリックス蛋白質（フィ
ブロネクチン）、レクチン、多糖類およびポリリジンあ
るいはヒストンのようなポリカチオンポリマーである。
上記のすべての組成物は、均一の形または組成物あるい
は不均一の形または組成物として系統化されうる。上記
の多重コンプレックス組成物（およびそのいろいろの具
体例）は細胞作動体を細胞にデリバリーするためのプロ
セスに有用に適用されることができる。このようなプロ
セスでは、組成物のモノマー単位が細胞作動体からなっ
ている多重コンプレックス組成物が提供され、組成物は
生体内あるいは生体外のいずれかで投与される。さら
に、多重コンプレックス組成物は細胞へ遺伝子あるいは
遺伝子断片をデリバリーするプロセスに適用されること
ができる。ここでは、モノマー単位がデリバリーされる
べき遺伝子あるいは遺伝子断片から成っている。多重コ
ンプレックス組成物が提供され、場合に応じて、生体内
あるいは生体外のいずれかで組成物が投与される。他の
有用な多重組成物は荷電ポリマーに付加された一つ以上
の成分からなっている。荷電ポリマーはポリカテオンポ
リマー、ポリイオンポリマー、ポリヌクレオチド、修飾
されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体とこ
れらの組合せから選択される。このような成分はたとえ
ば抗体（ポリクロンあるいはモノクロン）、Ｆ（ａ
ｂ’）2 断片あるいは両者のような蛋白質から成りう
る。抗体は、酵素からなる標的に、さらにコンプレック
スをつくることができる。
【００４４】４．イントロン不活性 本発明は次の二つを提供する。(1) 細胞の中へ導入され
た構築物から作られる核酸配列の中にプロセシング要素
を導入することにより、条件付きの核酸のプロセシング
のための一般的な合成物。該生産された核酸は適合細
胞、すなわちプロセシング要素の除去によりＲＮＡをプ
ロセシングできる細胞、の中でプロセシングされる。該
ＲＮＡは不適合の細胞すなわちプロセシング要素の除去
によりＲＮＡをプロセシングできない細胞の中ではプロ
セシングされない。そして(2) 細胞にとって非固有の少
なくとも二つのオペロンあるいは転写単位をもつ一つの
核酸構築物が該細胞に導入されたとき、結果として蛋白
質遺伝子産物を詰め込んでいるオペロンの一つの蛋白質
遺伝子産物を生ずるような2 組の生物学的機能。本発明
は適合細胞中でのみ遺伝子発現が許される、非固有なあ
るいはヘテロなプロセシング要素の使用により、遺伝子
の条件付き不活性化の能力のための新しい方法と構築物
を提供する。方法は不適合の細胞に存在するときには遺
伝子の不活性化が起きるように、所望の遺伝子のコーデ
ィング部位の中にヘテロなプロセシング要素を導入する
ことを利用する。イントロンはほとんどの遺伝子に多く
の場所で挿入されることができる。ヘテロなプロセシン
グ要素はフランキング配列をもたず、そしてそのために
挿入にあたってそれ以外の配列が導入されることはな
い。望ましい具体例では、遺伝子産物は不適合の細胞中
では存在しないか、不活性化されている。しかし適合細
胞に導入されると、機能的なＲＮＡ分子を生じ、翻訳に
より遺伝子は変更のない蛋白質を生産する。重要な具体
例の中には、細胞内に導入されたとき非固有のポリメラ
ーゼ、構築物から1 コピー以上の核酸配列をつくり出す
ことのできるポリメラーゼ、を発現する核酸構築物があ
る。この構築物はさらに非固有ポリメラーゼに対する認
識部位からなることができる。このような認識部位は非
固有ポリメラーゼに対するプライマーに相補的であるこ
とができる。プライマーは転移ＲＮＡ(tＲＮＡ) からな
るのが望ましい。ある具体例では、非固有ポリメラーゼ
はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転
写酵素および上記酵素のいかなる組合せから選ばれたも
のからなっている。ＲＮＡポリメラーゼは、T3, T7およ
びSP6 あるいはこれらの組合せのバクテリオファージＲ
ＮＡポリメラーゼからなるのが望ましい。更に、上記構
築物はＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターからな
ることができる。構築物から生産される核酸は、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ＤＮＡ- ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ- Ｒ
ＮＡキメラあるいはこれらの組合せを含むが、これに限
定されない多くの形をとることができる。ＤＮＡあるい
はＲＮＡはセンスあるいはアンチセンスあるいは両方か
らなることができる。
【００４５】本発明のもう一つの重要な側面は、細胞に
導入されたとき、適合細胞の中ではプロセシング要素が
プロセシングの間に、実質上除かれてしまうような非固
有のプロセシング要素からなる核酸生産物をつくり出す
核酸構築物に関連する。プロセシング要素は、イントロ
ン、ポリアデニル化信号およびキャッピングエレメント
あるいは上記の組合せを含むが、これに限定されないＲ
ＮＡプロセシング要素からなることができる。核酸生産
物は一本鎖であることができ、またそれはアンチセンス
ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、センスＲＮＡ、センスＤ
ＮＡ、リボザイムおよび蛋白質結合性核酸配列およびこ
れらのいかなるものの組合せからなることができる。蛋
白質結合性核酸配列は、望ましくは、ウイルスの構築あ
るいはウイスル複製に必要とされる蛋白質を結合するお
とりからなるものである。本発明では、また細胞の中で
核酸生産物、その機能が出るのに更なるプロセシングが
必要とされるような生産物、を選択的に発現するための
プロセスが提供される。プロセスは、第一のステップと
して、適合細胞の中ではプロセシング要素がプロセシン
グの間に実質上除かれてしまう非固有のプロセシング要
素からなる核酸生産物を生産する核酸構築物を提供する
ことからなる。第二のステップはこの構築物を細胞に導
入することからなっている。ＲＮＡプロセシング要素の
ようなプロセシング要素、核酸生産物および生体内、生
体外で構築物を導入するステップはすべて前に記載され
ている。重要なことは、このプロセスでは構築物が細胞
を含めた生物学的システムに導入されることができるこ
とである。この生物学的システムは生物、器官、組織、
培養物( 細胞あるいは組織) およびこれらの組合せから
なることができる。
【００４６】本発明は、条件付きの遺伝子不活性のため
のヘテロな要素を含めてプロセシング要素の利用の一般
的方法を提供する。制限酵素部位よりはむしろ、しばし
ば存在する配列、(C/A)AGGスプライス後の結合配列が挿
入部位として使われている。この部位はイントロンの切
り出しの結果としてできるコンセンサス配列から結果し
ている。スプライスされるコンセンサスなスプライス配
列は(C/A)AG * GUであり、スプライスを受け取るコンセ
ンサス配列は(U/e) N N(C/U)AG* G であり、*がスプラ
イス部位を表している(Mount 1982 Nucl. Acids Res. 1
0, 459) 。この配列のしばしばの存在は、プロセシング
要素の挿入のための多くの潜在部位を提供する。遺伝子
のコーディング領域においてこれらの部位のどれに挿入
しても適合細胞におけるプロセシング要素のその後の除
去には影響しないはずである。フランキングエクソン配
列をもたないプロセシング要素配列のみが導入され、し
たがってプロセシングにより、元のコーディング配列が
できることが許されているので、プロセシングされた m
ＲＮＡからつくられた蛋白質はアミノ酸配列あるいは酵
素活性に変化のないことが示されるはずである。更に、
プロセシング要素の挿入部位は遺伝子発現に影響ないよ
うにみえる。Maeda とOshima (1990 Nucl. Acids Res.
18:4671 文献として組み入れられる) は付加されている
ドナーエキソンの3'末端に保存された塩基をもつβ- グ
ロビンイントロンを含むＤＮＡの制限酵素断片として単
離した固有のイントロンをβ- グロビンの cＤＮＡコピ
ーの種々の部位に導入すると、その故それはβ- グロビ
ンコーディング配列の中でのイントロン配置に関係な
く、正常にスプライスされることを示した。これはスプ
ライス提供体とスプライス受容体に対して確認されたコ
ンセンサス配列および受容エクソンの5'末端での特異な
配列の特別な要求性はないということと一致する。ヘテ
ロなプロセシング要素の挿入が、不適合の細胞中に存在
するときすべての場合に遺伝子を不法活性するのではな
いことが可能である。スプライシングはバクテリオファ
ージT4の原核細胞系で観察されているけれども(Chu et
al. 1984 Proc. Nat. Acad. Sci USA 81:3049,文献とし
て組み入れられる) 、この場合にはセルフ- スプライシ
ングのイントロン(Chu et al. 1985 J. Biol. Chem. 26
0:10680)によるもので、したがって適合細胞に適用され
るプロセスとは、無関係のものである。したがって、原
核細胞環境では、イントロンはセルフ- スプライシング
イントロンが使われない限り、 mＲＮＡの中に留まるは
ずである。加えて、イントロン中の塩基の数が3 の倍数
であるならば、読み取り枠は同じのままであり、イント
ロン配列から導かれた付加されたアミノ酸をもつフュー
ジョン蛋白質が可能なものとして生産される。これらの
余分の塩基は、余分のアミノ酸の性質と蛋白質のコーデ
ィング配列の中の挿入部位により、標的蛋白質の活性を
変えたり変えなかったりする。不活性化の望ましい形は
フレームがずれる変異または/ あるいは停止コドンを導
入するヘテロプロセシング要素の使用である。
【００４７】本発明はまた、細胞に対して固有ではない
遺伝子の、このように導入された遺伝子の蛋白質生産物
が導入された非固有遺伝子から生産された他の蛋白質と
反応したり、影響したりするような細胞の中への導入を
提供する。非固有遺伝子の導入からできた非固有蛋白質
遺伝子生産物は、他の非固有蛋白質に、重合；活性化；
輸送を早めること; 拮抗阻害; アロステリック相互作
用;リン酸化，脱リン酸化，メチル化，脱メチル化，蛋
白質分解，核酸分解活性，糖添加およびその他を含む化
学的修飾を含む種々のプロセスにより影響を与える。非
固有遺伝子はＲＮＡ、ＤＮＡあるいはＤＮＡおよびＲＮ
Ａとして細胞に導入され得る。非固有遺伝子は一つの核
酸構築物の上にお互いにつながってあるい異なる構築物
上で別々に導入されることができる。非固有遺伝子の細
胞内への導入は遺伝子デリバリーのための多くの方法の
どれによっても行なうことができる。
【００４８】本発明は次の利益を提供する。 a)本発明は、このような遺伝子が宿主細胞に致死的であ
るかもしれないとき、あるいは宿主細胞に存在する遺伝
子が危険をもたらすときの遺伝子の条件付き不活性のた
めの有用性をもっている。このように、細菌の細胞壁を
破壊する酵素をコードする遺伝子のようにクローン化が
不可能な遺伝子は、イントロン挿入で不活性化され、こ
のようにして細菌の中で、この形でクローン化されるこ
とができる。破傷風、毒素、リジン、シュードモナス毒
素、大腸菌エンテロトキシン、コレラ毒素および他の植
物、動物、微生物の毒素を含む毒性産物をコードしてい
る遺伝子は不活性化されそして不適当の細胞の中で安定
にそして安全に維持されそして適合細胞の中で変更され
ない遺伝子生産物をつくり出すために活性化されること
ができる。これは細胞を殺す遺伝子治療への特別の応用
をもっている。
【００４９】b)本発明は、適合細胞では発現が実現して
いる、ポリメラーゼ触媒の不適合の細胞での不活性化の
ための有用性を提供する。これは、種々のポリメラーゼ
プロモーターの制御のもとで、ＲＮＡあるい蛋白質のい
ずれの多数の遺伝子生産物の発現への応用をもってい
る。細胞にとって固有あるいは非固有の、この方法で用
いうるポリメラーゼは、T3、T7、およびSP6 からのＲＮ
Ａポリメラーゼを含む。
【００５０】c)本発明は通常不適合な遺伝子を同じ核酸
構築物上に一緒にクローン化することを提供する。たと
えば、一つの構築物がT7プロモーターに誘導される選ば
れた転写物T7ＲＮＡポリメラーゼの生産との配列を持つ
ようにデザインすることができる。別々の構築物として
ではなく、同じ核酸構築物の上にこのような遺伝子をク
ローン化することを提供する。たとえば、一つの構築物
がT7プロモーター誘導の選ばれた転写物の産生とT7ＲＮ
Ａポリメラーゼの配列をもつようにデザインすることが
できる。別々の構築物としてではなく、同じ核酸構築物
の上にこのような遺伝子をクローン化することができる
ことは次の利益を与える。 i)二つの遺伝子の共形質転換効率は100%である。 ii)T7ＲＮＡポリメラーゼと選ばれたT7誘導転写物の核
酸配列の場合には全体の機能単位は、たとえば4.7 キロ
ベース、あるいはそれ以下の挿入のみを受けいれ、機能
を保持するアデノ関連ウイルスのようにあるサイズ以下
の挿入のみを受け入れることができるベクターにクロー
ン化するのに十分に小さい。(Muzyczka 1992 in Curren
t Topics in Microbiology and Immunology,SpringerVe
rlag, Heiderberg, 158;97, 文献として組み入れられ
る) 。
【００５１】d)この発明のもう一つの応用は、導入され
た遺伝子および/ あるいは遺伝子産物が遺伝子治療応用
のための有用な細胞内プロセスを生むような、細胞内で
の非固有遺伝子あるいは蛋白質生産物の相互作用を提供
する。本発明の一つの応用では、有用な遺伝子産物の転
写に導くT7プロモーターをもまた含んでいる構築物中
で、イントロンがT7ＲＮＡポリメラーゼをコードしてい
る配列に導入されている。前に討議したように、T7プロ
モーターの制御のもとで遺伝子合成のためにT7ポリメラ
ーゼを使うことは、適合細胞中で、しかし常に、別々の
構築物上に二つの機能単位をおくという背景で行われて
きた、すなわち、T7ＲＮＡポリメラーゼと、T7プロモー
ターの制御を受ける遺伝子は二つのシステムとして使わ
れている。本発明は( 実施例参照) 、スプライス後の結
合配列(C/A)AGGをもつ部位の最後の二つのG の間にイン
トロンを正確に導入することによる( プロセシング要素
を通常もっていない) 遺伝子の条件付き不活性を記載し
ている。この配列をもつ部位へのイントロンの導入は、
機能的スプライス提供体と機能的スプライス受容体とを
つくりだす。したがってこの修飾をもった構築物は大腸
菌細胞の中ではT7ＲＮＡポリメラーゼのいかなる発現も
ないが、正常なコード配列が、適合細胞に導入された後
の転写物から回復されることができる。このことによ
り、ポリメラーゼをコードする配列中にヘテロプロセシ
ング要素を導入することにより、不適合細胞に対する致
死性を避け、T7ＲＮＡポリメラーゼとたとえば、T7プロ
モーターに導かれるアンチセンスの両方をもつ一つの構
築物を構築することが許される。適合細胞中で、ポリメ
ラーゼの正常な発現が起きるが、致死性はその環境の性
質により無効となるはずである。第一に、大腸菌の致死
性の原因と信じられている環状プラスミドの転写による
自己触媒的カスケードは、染色体ＤＮＡに組み込まれる
ことによりできる安定な形質転換動物細胞では起きな
い。第二に構築物の環状組み込みの存在により、T7プロ
モーターからT7終結部分配列を過ぎて、ポリメラーゼの
コーディング配列へのランオフ転写は、プロセシング、
移動、翻訳のための適当な信号の欠如により非常に低い
効率で翻訳されるであろうＲＮＡを生産するはずであ
る。アンチセンスＲＮＡのような、T7に導かれるＲＮＡ
の生産を可能にしている本発明の同じ利点はT7ＲＮＡポ
リメラーゼに導かれる蛋白質の生産に適用されることが
できる。
【００５２】５．ヘアピン構築物 遺伝子物質の細胞への導入は二つの方法で行うことがで
きる。一つの方法は、細胞内プロセスに直接に働くが、
それ自身は複製しないしまたいかなる核酸も生産しない
核酸の外部からの適用である。細胞内プロセスに影響を
与えるために達成されるべきこれらの分子の細胞内濃度
は外部からの供給に依存する。核酸デリバリーのもう一
つの方法は、それ自身は細胞内プロセスに働かないが、
細胞内プロセスに働く一本鎖核酸を細胞内につくりだす
一次核酸構築物を細胞内に導入することである。この場
合には、導入された一次核酸構築物は細胞内核酸に組み
込まれるか、あるいは染色体外の状態で存在することが
できる。そしてそれは組み込まれるか、あるいは染色体
外の状態のいずれもそれ自身のコピーを増やすことがで
きる。核酸構築物は、一次核酸構築物のプロモーター配
列から、遺伝子の発現および遺伝子の複製の細胞内プロ
セスに影響する一本鎖核酸を生産することができる。こ
のような核酸はアンチセンス核酸、センス核酸および蛋
白質に翻訳されることができる転写物を含む。このよう
な核酸の細胞内濃度はプロモーター依存合成により制約
を受ける。 定義 一次核酸構築物: 細胞の中で生産中心をつくりだす核酸
で構成される組成物。 生産中心: 細胞の中で他の生産中心をつくりだすかある
いは一本鎖核酸を生産することができる一次核酸構築物
から誘導される核酸。ここで使われているように、生産
中心という用語は、一次核酸構築物から生産されること
のできる二次の核酸成分を包含するように意図されてい
る。また、二次核酸成分から生産されるかもしれないい
かなる核酸成分に加えて、二次核酸成分から生産される
三次核酸成分も包含している。 産出: 一次核酸構築物からの生産中心の生成あるいは形
成、あるいは他の生産中心から生産中心を生成あるいは
形成すること。しかしながら生産中心は一次核酸構造物
を生産することはできない。 生産: 生産中心から一本鎖核酸分子を生成すること。 内在細胞システム: 一本鎖核酸生成物の機能と同じよう
に、生産および産出に使われることのできる細胞内に存
在する細胞性プロセスおよび成分。このようなプロセス
および成分は細胞に固有なものであるいか、あるいは人
工的な方法、あるいはたとえばウイルスによる感染によ
り細胞に導入されることができる。
【００５３】一次核酸構築物から生産される一本鎖核酸
の有効性は、細胞内でのそれらの濃度、安定性および生
産の存続期間に依存する。細胞内濃度を達成するための
現在の方法はプロモーターに導かれる合成に依存するこ
とで制限されている。本発明は、一本鎖核酸が、細胞内
でつくられ又該細胞中の一次核酸構築物から導かれる鋳
型から細胞内でつくられる新しい組成構築物と方法を提
供する。この発明は更に、細胞内に導入されたとき、そ
れぞれが一本鎖核酸産物の生産ができる一つあるいは二
つ以上の生産中心を産出する一次核酸構築物を提供す
る。本発明の一側面は、増巾を通して一本鎖核酸の高い
細胞内レベルを達成する方法を提供することである。こ
のような増巾は一次核酸構築物からの一つ以上の生産中
心の産出およびそれぞれの生産中心から一つあるいは二
つ以上の一本鎖核酸の産出により起きる。しかしながら
生産中心は一次核酸構築物を生産することはできない。
このようにして、本発明の重要な具体例は、細胞に導入
されたとき核酸産物あるいは三次核酸成分あるいは両方
を生産することができる二次核酸成分を生産することが
できる一次核酸成分を含む組成物に関係する。二次およ
び三次核酸成分と核酸生産物は、一次核酸成分をつくり
だすことはできない。この組成物では細胞は勿論原核細
胞あるい真核細胞であり得る。本組成物では、一次核酸
成分は核酸、核酸構築物、核酸抱合物、ウイルス、ウイ
ルス断片、ウイルスベクター、ウイロイド、ファージ、
ファ−ジベクター、プラスミド、プラスミドベクター、
細菌および細菌断片あるいはこれらのいかなる組合せを
含む。一次核酸構築物は一本鎖あるいは二本鎖核酸( あ
るいは部分的に二本鎖のものさえも) からなるかあるい
は一本鎖および二本鎖核酸両方からなっている。そして
核酸はＲＮＡ、ＤＮＡあるいはＲＮＡとＤＮＡの組合せ
であり得る。核酸は未修飾であり得るし、あるいは所望
の性質を与えるために修飾されることもできる。たとえ
ば核酸分解酵素耐性、内在細胞システムとの相互作用、
細胞内配置および本開示に述べられているように核酸構
築物に対して他の性質を与えるために、修飾された塩基
が組み込まれることができる。さらに、一次核酸化合物
はＤＮＡ、ＲＮＡあるいは両者との組合せで同じように
使われることができる核酸類似体を含むことができる。
一次核酸構築物は細胞内で、染色体ＤＮＡに組み込まれ
てあるいは染色体外の物として存在し得る。一次核酸構
築物は、染色体の組み込まれた一部として、細胞分裂の
間に染色体ＤＮＡと一緒に複製されることができ、又そ
れは複製開始点およびその他のようにＤＮＡ複製エレメ
ントを含んだ染色体外要素の一部として複製されること
ができる。一次核酸構築物は、生産中心の産出および引
き続いての一本鎖生産物の生産のための配列情報を含ん
でいる。このように、この目的のための多数の望ましい
要素が一次核酸構築物中にコードされることができる。
生産中心および一次核酸構築物は、これらの要素の一つ
あるいすべてを含むことができる。これらはプロモータ
ーおよびエンハンサー; プライマー結合部位; イントロ
ン信号、ポリA 配列、キャッピングを決める配列および
停止配列のようなプロセシング要素: 細胞内配置信号を
決める配列; 細胞内蛋白質に親和性をもつ配列のような
制御要素を含む。一次核酸構築物はまた生産中心を産出
するのに働く蛋白質の合成のための配列を含む。たとえ
ば生産中心を産出するのに働く核酸ポリメラーゼのため
の配列が一次核酸構築物中に存在することできる( 本特
許の実施例20参照) 。一次核酸構築物は、内在細胞シス
テムに存在する核酸合成触媒の働きを通して生産中心を
産出することができる。生産中心はＲＮＡ、ＤＮＡある
いはＲＮＡおよびＤＮＡの組合せであり得る。これらは
一本鎖、二本鎖であり、あるいは一本鎖および二本鎖領
域を含むことができる。生産中心は他の生産中心を産出
することができそして/ または生物学的活性をもつ一本
鎖核酸を直接あるいは内在細胞システムを通して生産す
ることができる。生産中心は、アンチセンスＲＮＡ配
列、アンチセンスＤＮＡ配列、リボザイム配列および蛋
白質に翻訳されることのできる mＲＮＡのような、多く
の一本鎖核酸を生産することができる。生物学的活性を
促進する所望の性質がまた組み込まれることができる。
このようにしてＲＮＡプロセシング信号、細胞内配置を
決める配列、細胞内蛋白質を結合する配列および他の機
能が一本鎖核酸産物の中に組み込まれることができる。
生産中心として、二次核酸成分および三次核酸成分( た
とえば四次核酸成分のような他のこれに続く成分も同様
に) はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ- ＲＮＡハイブリッドお
よびＤＮＡ−ＲＮＡキメラあるいは上記の組合せからな
り得る。上記組成物がさらに信号プロセシング配列を含
むとき、このような配列はプロモーター、開始点、停止
点、イントロンおよび細胞内配置要素あるいはこれらの
組合せから運ばれることができる。このような信号プロ
セシング配列は、一次核酸成分、二次核酸成分、核酸生
産物および三次核酸あるいはこれらの組合せから選ばれ
たものを含む組成物のいかなる要素の中にも含まれるこ
とができる。核酸生産物は勿論、アンチセンスＲＮＡ、
アンチセンスＤＮＡ、リボザイムおよび蛋白質結合性核
酸配列あるいはこれらの組合せからなるものを含め、一
本鎖であることができる。蛋白質結合性核酸配列として
望ましいのは、ウイスル複製に必要とされる蛋白質を結
合するおとり配列である。これら上記の組成物で、いか
なる成分あるいは核酸生産物の生産もベクター、ウイス
ルベクター、ファージベクター、プラスミドベクターお
よびこれらの組合せを含む望ましいベクターにより媒介
されることができる。本組成物は原核あるいは真核であ
る細胞に組み入れられることができる。組成物は、生体
内あるいは生体外のいずれかでこれらの細胞に導入され
ることができる。
【００５４】また、本発明の意図するものは組成物から
つくられる二次核酸成分、三次核酸成分、あるいは核酸
生産物を含む生産中心である。 一次核酸構築物からの生産中心の産出。 他の生産中心からの生産中心の産出および生産中心から
の一本鎖核酸の生産はこれらの構造の中に存在する配列
( 上記したように) および内在細胞システムに由来する
多くのプロセスにより進むことができる。これらのプロ
セスに含まれる内在細胞システムはＲＮＡポリメラー
ゼ、ＲＮＡプロセシング酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、逆
転写酵素、リボヌクレアーゼH 、エンドヌクレアーゼ、
リボザイムを含むエキソヌクレアーゼ、核酸修復に含ま
れる酵素、核酸リガーゼ、プライマーとして働く細胞内
核酸、および核酸の修復、転写、翻訳、核酸の細胞内配
置、核酸の輸送、核酸の細胞内核酸への組み込み、およ
び他のものに含まれる物を含んでいる。
【００５５】産出および生産のための要素は； 1)単一あるいは多重のプロモーター、2)自己プライミン
グプロセス、3)一つあるいはそれ以上のプライマー結合
部位および、4)多重プライミング、を含む。 1)産出および生産のためのプロモーターは生産中心の中
あるいは一次核酸構築物の中に一つあるいは二つ以上の
コピーで存在することができる。このようなプロモータ
ー配列は、たとえば細胞に導入された二本鎖ＤＮＡ一次
核酸構築物中でのように、既に存在し機能的な形で存在
することができる。機能的なプロモーター配列は、細胞
への一次核酸構築物の導入に続いてつくることもでき
る。たとえば、( それらが一本鎖リボ核酸として存在し
ているために) 機能的でないプロモーター配列を含む一
本鎖ＲＮＡ一次核酸構築物は、細胞の中で該一次核酸構
築物から二本鎖ＤＮＡ生産中心に産出されることによ
り、機能的なプロモーター配列に変換されることができ
る。この産出は、リジル tＲＮＡがプライマーとして働
くHIV プライマー結合部位のようなプライマー結合部位
の一次核酸構築物中での存在および内在細胞システムと
して逆転写酵素により達成されることができる。この方
法での二本鎖ＤＮＡの生成は機能的プロモーターを形成
する。機能的プロモーターの配列はまた一本鎖一次核酸
構築物の中に、自己相補的形成からの二本鎖領域の形成
により生成されることできる。たとえばプロモーターお
よびその制御下にあるコーデイン配列に対するセンスお
よびアンチセンス配列の両方が一本鎖ＤＮＡ核酸生産物
あるいは生産中心に存在することができる。同じ分子の
これらの領域の自己ハイブリダイゼーションがこの一本
鎖分子の形成された二本鎖領域に機能的プロモーターを
生成する。
【化１】
【００５６】2)自己プライミングプロセスにより一本鎖
一次核酸構築物は核酸を産出し、あるいは直鎖の一本生
産中心は核酸を産出あるいは生産する。このプロセスで
は、このような分子の3'末端が分子の他のどこかに配置
する相補的領域とハイブリダイズすることができ、相補
的核酸の合成のためのプライマーとして働くことができ
る。たとえば、直鎖一本鎖ＲＮＡ3'末端は逆転写酵素の
ようなポリメラーゼのプライマーとして働くことができ
る。
【化２】
【００５７】3)一つあるいは二つ以上のプライマー部位
配列が一次核酸構築物あるいは生産中心に含まれうる。
リジル tＲＮＡをプライマーとして利用できるHIV のよ
うなレトロウイスルのプライマー結合部位のための配列
が、一本鎖ＲＮＡ一次核酸構築物あるいは生産中心に一
つあるいは二つ以上のコピー数で含まれうる。リジルt
ＲＮＡは内在細胞システムとして供給される。逆転写酵
素の存在で、相補的ＤＮＡの産出および生産がこのプラ
イマー部位から進む。 4)多重プライミングプロセスが生産と産出のために利用
されうる。たとえば一つのＤＮＡ鎖と一つのＲＮＡ鎖か
らなる二本鎖一次核酸構築物はヌクレアーゼによりＲＮ
Ａ鎖中に限られた部分の加水分解的な裂け目をもつよう
に作用される。できる断片は逆転写酵素のような内在的
細胞プロセスにより触媒されるＤＮＡ合成の生産と産出
のプライマーとして働くことができる。
【００５８】６．U1アンチセンスシステム 本発明は、細胞中に存在するとき、配置本体部分と核酸
配列の二つの要素から成る非天然の核酸生産物を生産す
る核酸成分からなる重要な組成物を提供する。望ましく
は、配置本体部分は非天然核酸生産物の配置を与えるに
充分である。さらに、配置本体部分は細胞内あるいは核
内への配置信号配列を含むのが望ましい。対象となる核
酸配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
およびＤＮＡ−ＲＮＡキメラあるいはこれらの組合せを
含むがこれに限らない種々の形からなりうる。ＲＮＡか
らなるときには、核酸配列は蛋白質とコンプレックスを
作りうる核内配置ＲＮＡからなるのが望ましい。このよ
うな核内配置ＲＮＡの中には、いわゆるｓn ＲＮＡがあ
る。snＲＮＡとして望ましいのはU1あるいはU2あるいは
両者である。非天然核酸生産物は勿論一本鎖であること
ができ、またそれはアンチセンスＲＮＡ、アンチセンス
ＤＮＡ、センスＲＮＡ、センスＤＮＡ、リボザイム及び
蛋白質結合核酸配列から選ばれたものを含む種々の要素
あるいは形からなりうる。ほかで述べるように、このよ
うな蛋白質結合配列は、ウイルス会合あるいは複製に含
まれるかあるいは必要とされる蛋白質を結合するおとり
配列を含むのが望ましい。本組成物の他の側面では、非
天然の核酸生産物はアンチセンスＲＮＡあるいはアンチ
センスＤＮＡからなりうるそして配置本体部分は核内配
置信号配列からなっている。さらに本組成物の他の側面
では、非天然の核酸生産物はアンチセンスＲＮＡあるい
はアンチセンスＤＮＡからなり、そして配置本体部分は
細胞質内配置信号配列を含んでいる。さらにまた他の側
面は、非天然の核酸生産物がセンスＲＮＡあるいはセン
スＤＮＡからなり、配置本体部分が細胞質内配置信号配
列からなる組成物に関係している。
【００５９】他で述べられるように、核酸成分は、たと
えば核酸、核酸構築物、核酸抱合物、ウイルス、あるい
は断片、ヴィロイド、ファージ、プラミド、ベクター、
細菌あるいは断片、およびこれらのいかなる組合せのよ
うに、種々の形をとることが出来る。このような核酸
は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドおよ
びＤＮＡ−ＲＮＡキメラおよびこれらの組合せからなり
うる。核酸は修飾されることが出来る； 細胞は原核細
胞あるいは真核細胞でありうる。核酸生産物の生産はウ
イルスベクター、ファージベクターあるいはプラスミド
ベクターあるいはこのような組合せのようなベクターに
より仲介される。他で述べられるように、本組合せは原
核細胞あるいは真核細胞でありうる細胞に組み入れられ
るかあるいはデリバリーーされることができる。細胞へ
の導入は、生体外あるいは生体内で可能である。本発明
はまた、組成物が導入される細胞を含めた生物学的シス
テム（生物、器官、組織、培養物）を意図している。
【００６０】本発明は真核細胞中で核酸生産物を配置さ
せるプロセスを意図している。このプロセスでは、上記
重要な組成物が提供され、真核細胞あるいはこのような
細胞を含む生物学的システムに適性に導入される。配置
本体部分の特徴、核酸生産物、方法、このプロセスでの
生体外および生体内での導入は全て上に記載されてい
る。本発明は、アンチセンスＲＮＡの担体としてのsnＲ
ＮＡの利用しつつ、核への配置に対するsnＲＮＡの有利
な特色を保つための方法と組成物を記載する。本発明
は、snＲＮＡから配列の除去及びアンチセンスあるいは
センス配列のような望ましい配列とのそれらの置換を利
用する。snＲＮＡ配列部分の置換の部位を正確に選択す
れば安定性と核への再移入の特性は変わらない。ヒトU1
オペロンのクローンのBcl I および Ｂsp E II による
消化は( 図41) はU1ＲＮＡによって作られるA およびB
ループの形成に含まれる49塩基の配列を除去する( 図4
1) 。この配列の除去はこのようにして外来配列を加え
るための場所を作りまた、あるsnＲＮＰ蛋白質の結合を
除き、それにより結合蛋白質による大きな立体障害もな
くアンチセンス阻害が利用できるようになる外来配列を
可能にする。A およびB ループを除去しても、再移入信
号を維持するのに重要であるC およびD ループの形成は
依然として許されている( 図41) 。スプライスソーム蛋
白質結合と同じように3'- 末端の二次構造の引き続いて
の存在はＲＮＡの安定性を維持する効果をまた持ってい
る。本発明はU2を含めsnＲＮＡの他の種類にも適用され
うる。本発明のための記載されたように作られたU1構築
物は遺伝子デリバリーに適用できるいかなる方法によっ
ても、核酸構築物のすべてあるいは一部として細胞にデ
リバリーされることができる。
【００６１】７．多重カセット構築物 遺伝子治療への応用を持つ本発明は、細胞に導入された
とき別々の機能単位から一つ以上の特異的な物の合成を
導く核酸物質あるいはカセットである。それぞれの生産
物の合成はカセットの中にあるそれ自身の開始信号から
開始される。多重標的が一つの多重カセット構築物の中
に独立のカセットを含ませることにより達成できる。多
重カセットの利点は： a) それぞれが他とは独立に形成され、生産物の全数は
それぞれの開始部位により細胞内に生成された生産物の
合計になる。 b) 独立に生成された生産物による標的との相互作用は
他の独立に生成される生産物に影響を持たない。 c) 一つのカセットからの発現を破壊する組み込み結果
は構築物中の他のカセットに影響しない。 d) カセットにあるそれぞれの生産物実体は核内はある
いは細胞質内への配置のための適当な信号の使用により
異なった場所に導かれることができる。核の中で働く生
産物が細胞質で働く物と同じ構築物中につながれている
状況では、多重カセット構築物では、それによりそれぞ
れが作用の最も効果的な場所に蓄積することが許される
ように、二つの物の独立の合成が可能である。この発明
は、細胞に導入したとき一つ以上の特異的核酸配列の生
産が可能である核酸成分を提供する。このようにして生
産されたそれぞれのこのような特異的配列は、おたがい
に実質上非相同的であり、そして細胞の中で対象となる
一本鎖核酸の特定の部分と相補的であるかあるいは細胞
の中で対象となる特定の蛋白質に結合することができる
かいずれかである。この成分中では、対象となる一本鎖
核酸は同じポリヌクレオチド配列の一部あるいは異なっ
たポリブクレオチド配列の一部でありうる。対象となる
一本鎖核酸はウイルス配列かなりうる。本核酸成分は核
酸、核酸構築物、核酸抱合物、ウイルスまたは断片、フ
ァージ、プラスミド、細菌または断片、ベクター( ウイ
ルス、ファージ、プラスミド) およびこれらの組合せの
いかなるものから誘導されるかまたは選択されることが
出来る。核酸はＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸類似体( また
はこれらの組合せ) からなりうる。ＤＮＡおよびＲＮＡ
は修飾されることが出来る。これに加えて、核酸成分は
一つ以上のプロモーターあるいは一つ以上のイニシエー
ターあるいは両方からなりうる。さらに、特異的な核酸
配列生産物が異なったプロモーター、異なったイニシエ
ーターあるいは両者の組合せのいずれかから独立に生産
されることが出来る。さらにまた、特異的核酸配列生産
物はウイルスまたは細胞性ＤＮＡに相補的であるかある
いはウイルスまたは細胞性蛋白質と結合することができ
るかあるいはこの両事象の組合せであることができる。
相補性特異的核酸配列生産物はアンチセンスとして働く
ことができる。ウイルスあるいは細胞性蛋白質は他で述
べた配置蛋白質あるいはおとり蛋白質からなることがで
きる。このような配置蛋白質は核内配置蛋白質あるいは
細胞質内配置蛋白質からなることが望ましい。特異的核
酸配列生産物はアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮ
Ａ、リボザイムおよび蛋白質結合性核酸配列あるいはこ
れらの組合せからなりうる。核酸成分はさらに、細胞に
対象となる核酸あるいは対象となる蛋白質を含む成分を
デリバリーする方法を含むことができる。このようなデ
リバリーの方法はこの開示中で他で述べたように一般的
技術として知られている。
【００６２】多重カセット構築物はＲＮＡあるいはＤＮ
Ａとして調製されることができる。核酸は修飾されたあ
るいはされない核酸としてあるいは蛋白質、脂質あるい
は他の分子とコンプレックスを形成した修飾されたある
いはされないＲＮＡまたはＤＮＡとしてあるいはシュー
ドヴイリオン、バクテリオファージあるいは他のウイル
スデリバリーシステムの成分としての修飾されたあるい
はされないＲＮＡまたはＤＮＡとして細胞にデリバリー
されうる。多重カセット構築物はこの応用で述べたよう
に遺伝子転移に一般的に使われる方法により標的細胞に
デリバリーされることができる。多重カセット構築物中
の独立の合成単位、すなわちカセットの存在は生産物、
合成開始信号および他の要素の選択を通して細胞に対し
て生産物の提示の多様性を提供する。多重カセット構築
物は種々の生産物をコードするようにデザインできる。
このようにして、カセットはＲＮＡ、ＤＮＡあるいは蛋
白質の合成をコードするようにデザインされることがで
き、またこのようなカセットは一つの多重カセット構築
物の中にいろいろの組合せで組み立てられることができ
る。要素は、望むならば、細胞の中の生産物の合成、特
性と性質および活性を独立にまた異なるように制御する
ように、それぞれのカセットの中に組み込まれることが
できる。このような要素はプロモーター、エンハンサー
配列、イントロンのようなＲＮＡプロセシング要素、核
内あるいは細胞質内配置信号のような細胞内配置要素、
および mＲＮＡにポリA の付加を与えるポリA 附加信号
を含む。それぞれのカセットによって生産される有用な
生産物実体はアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡ、リボ
ザイム、アンチセンスＤＮＡ、ウイルス複製に必要な蛋
白質と結合するおとりのような蛋白質分子に結合する核
酸配列; 酵素; 毒素分子; ＲＮＡと蛋白質分子の細胞内
配置に働く蛋白質; ＤＮＡポリメラーゼ; 逆転写酵素;
ＲＮＡポリメラーゼおよびこのようなＲＮＡポリメラー
ゼに対する関連したプロモーターの制御下にある核酸配
列;(インターフェロンのような) 細胞にウイルス耐性を
与える蛋白質; 抗体および/ あるいはその断片; 細胞分
裂を止める蛋白質; ウイルス、ホルモン、増殖因子およ
び細胞表面で作用する他の薬剤に対する細胞リセプター
を含む細胞膜に配置している蛋白質を含む。
【００６３】生産物の細胞内合成はプロモーターあるい
は開始要素の選択により制御されることができる。この
ようにして、生産物の時間を決めた合成を与えるように
誘導できるプロモーターの制御のもとにその合成が起き
るような生産物に対する配列を含むようなカセットがデ
ザインされることができる。これは、たとえば、生産物
実体の持続的な生産が宿主の細胞あるいは生物に有害で
あるか、その短時間の効果は有益である場合の応用に都
合がいい。たとえば、細胞分裂を停止させる生産物の誘
導は、ウイルスの複製がこのような細胞プロセスに依存
しているウイルスへの耐性を細胞に与えることができ
る。後で細胞プロセスを回復するために、誘導を停止す
ることができる。誘導は、たとえば抗体、ホルモンおよ
び亜鉛のような重金属のような小分子によって誘導され
るプロモーターの使用により仲介されることができる。
代わって、生産物あるいは一つ以上のそれの持続的な生
産が有益である場合には、誘導的でないプロモーターが
利用されうる。プロモーターはまたその効率にもとづい
て選ばれることが出来る。生産物の高レベルが必要とさ
れる場合には、高い効率で転写を開始するプロモーター
が利用されうる。代わって、生産物の低レベルが望まし
いときには、より効率の低いプロモーターが使われう
る。同じ多重カセット構築物から生産される独立に合成
された生産物は同じ標的部位で働きうる。たとえば、有
効性を増すために、HIV の核酸の高可変性部位の配列の
ように配列可変性が示されているウイルスの核酸標的部
位に対してつくられる一連のアンチセンスＲＮＡ生産物
は野生株HIV 集団でみられる優勢に存在する配列を含む
ようにデザインすることができる。同じ多重カセット構
築物から生産される独立に合成された生産物はまた別々
の標的部位で働きうる。たとえば、ＲＮＡアンチセンス
転写物は特定の遺伝子生産物をコードする mＲＮＡに対
して誘導されることができ、そして異なったアンチセン
ス転写物がもうひとつの遺伝子生産物をコードする mＲ
ＮＡに対して誘導されることができる。
【００６４】８．ウイルス耐性 本発明は、ウイルス−細胞相互作用を妨げ、これにより
細胞中での抗ウイルス遺伝子治療を高めることにより遺
伝子治療によるウイルスに対する耐性を増すように働く
薬剤の使用を含んでいる。ウイルスの部位と細胞表面に
ある特定の場所との相互作用、すなわちウイルス−細胞
相互作用および細胞外ウイルスの免疫学的薬剤に対する
感受性は補足的な処理に対する基礎を与える。この方法
により、ウイルスの効果的レベルを下げるように働く薬
剤はアンチセンスを用いる遺伝子治療処理に有益とな
る。遺伝子治療の補足として、上記の薬剤は、筋肉内、
静脈内、腹腔内、吸入あるいは他の適当な方法で、遺伝
子治療処置の前、同時あるいは後のいずれかで患者に投
与されることが出来る。ウイルスと標的細胞の相互作用
を妨げることのできる薬剤の例は以下を含む： a) ウイルスのエピト−プおよびウイルスを結合する細
胞性蛋白質に対する抗体。後者の例は、例えばHIV によ
って認識されるCD4 受容体のようにウイルスによって認
識される細胞性リセプターである。 b) ウイルスとコンプレックスを形成する物の生産を刺
激する薬剤。これらは、一般的刺激剤として使われるこ
とのできる免疫応答を促進するアジュバントおよび特異
的反応を誘導するのに使うことが出来るウイルス抗原を
含む。 c) 標的細胞に結合し、ウイルスと拮抗するかさもなく
ば細胞へのウイルスの侵入を遅らせる薬剤。細胞への結
合に含まれている、HIV に対するgp120 蛋白質のような
ウイルス蛋白質はこのように利用されうる。ウイルス蛋
白質に対する抗体もまたこのように働くことが出来る。
本発明の実施で、プロテアーゼ阻害剤あるいはヌクレオ
チド類似体のような小分子をさらに投与することで、更
なる促進が達成されうる。追加の処理は本発明の応用に
前後あるいは同時のいずれでも適用することが出来る。
本発明はウイルス感染および他の細胞内病原体の感染の
処理に応用をもっている。
【００６５】このようにして、本発明は対象となるウイ
ルスに対する細胞の耐性を増加するプロセスを提供す
る。プロセスは二つのステップから成る。第一に、表現
型としてウイルスに耐性の形質転換細胞および、ウイル
スあるいはウイルス−特異的な細胞上の部位に対して結
合することのできる試薬が提供される。第二に、対象と
なるウイルスに対する細胞の耐性を増加するために細胞
を含めた生物学的システムへ試薬が投与される。生物学
的システムは生物、器官、組織あるいはこれらの組合せ
からなることができ、ウイルス耐性の細胞は原核細胞あ
るいは真核細胞でありうる。このような細胞はさらにア
ンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、センスＲＮ
Ａ、センスＤＮＡ、リボザイムおよび蛋白質結合性核酸
配列、あるいはこれらの組合せから選ばれた配列を含む
ことが出来る。ウイルス結合試薬は抗体、ウイルス結合
蛋白質、細胞受容体蛋白質及びウイルス結合蛋白質の生
産を刺激することの出来る薬剤を含むしかしこれに限ら
れない種々の形をとることができる。抗体は勿論、対象
となるウイルスのエピト−プに特異的であるポリクロン
あるいはモノクロン抗体を含むことが出来る。ウイルス
結合蛋白質はCD4 受容体を含むことが望ましい； 細胞
受容体はgp24蛋白質を含むのが望ましい。加わうるに、
生産を刺激する薬剤は免疫応答を促進するアジュバント
およびウイルス抗原あるいは両者から選択される。試薬
は細胞に対して生体内あるいは生体外で投与されること
が出来る。その上、本発明のプロセスはさらに、プロテ
アーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体あるいは両者のよう
な追加的ウイルス耐性促進薬剤の投与からなることが出
来る。本プロセスの実行において追加的ウイルス耐性促
進薬剤は結合試薬が投与される前、後、あるいはほぼ同
時に投与されることができる。また、上記したプロセス
のいずれによっても得られているような増加したウイル
ス耐性をもつ生物学的システムが本発明により意図され
ている。
【００６６】９．転置 細胞成分をある細胞内の場所からほかに輸送するように
働く生産物、転置薬剤、を生産する構築物の導入により
細胞内の位置で細胞内生産物の濃度を変える新しい方法
である。転置薬剤は、それにより転置薬剤が細胞成分と
結合することができる特異的あるいは親和的ドメインを
含んでいる。細胞成分の転置は結合した転置薬剤によっ
て仲介される。結果とする共−配置は細胞成分を機能的
な場所とは異なる場所に輸送する。構築物の遺伝子生産
物をアンチセンス活性に都合のよい細胞内の場所に配置
させようとした以前の研究(Izant and Sardelli, 1988,
Cotten and Birstiel, 1989, 両出版物の内容はここに
文献として組み入れられる) と対照的に、本発明は、ウ
イルス性あるいは細胞性プロセスに含まれる高分子の転
置によりウイルス性あるいは細胞性プロセスを破壊する
ように働く。このようにして、転置薬剤上の親和性ドメ
インの存在により、標的分子は結合され、それから転置
薬剤により決められた細胞内の場所に輸送される。本発
明の応用はＲＮＡの発現のための配列を含む核酸構築物
の細胞内への導入を通している。転置薬剤として働くＲ
ＮＡはそれ自身親和性ドメインに対する配列を含むそし
て細胞性核酸分子あるいは蛋白質をそれらが正常には存
在しない細胞内の場所に輸送する。これにかえて、ＲＮ
Ａは標的ＲＮＡ分子と結合することができ、ＲＮＡ転置
薬剤及びそのハイブリダイズした標的ＲＮＡを本来でな
い細胞内の場所に輸送する蛋白質と結合することによっ
てそれが機能できない他の細胞内の場所に一緒に働くこ
とが出来る。また、ＲＮＡは翻訳されたとき親和性ドメ
インをもつ蛋白質転置薬剤を生ずる配列を含むことが出
来る。本発明では、標的と転置薬剤との相互作用は活発
なステップをおびる。これが有用である例は細胞質から
核への輸送を決める信号を含むＲＮＡである。このよう
なＲＮＡ転置薬剤の細胞質ＲＮＡあるいは蛋白質への結
合は、標的の核への共- 配置をもたらす。これらの輸送
される物はそれらが本来ない細胞内の場所に存在するた
めに機能できないであろう。同様な方法で、特定のＲＮ
Ａ配列あるいは他の蛋白質に対する親和性ドメインをも
つ蛋白質転置薬剤が、その配列の中に存在する核配置信
号をそれがまた持つようにデザインされることが出来
る。この方法で、正常には細胞質内に存在する標的が核
の中に配置されるであろう。
【００６７】本発明は、細胞に導入されたとき、非天然
の生産物を生産する核酸構築物を提供する。非天然の核
酸生産物は二つの要素から成っている：細胞成分に結合
することの出来る結合成分； および生産物に結合した
とき細胞成分を転置することが出来る配置成分。この構
築物からの生産物は蛋白質あるいは核酸あるいは両者か
らなりうる。蛋白質は、細胞の内側の細胞成分に対する
抗体、例えばポリクロンあるいはモノクロンの抗体から
なりうる。このような細胞成分は、次のような核酸、蛋
白質、ウイルス、ファージ、他の構築物からの生産物、
代謝物およびアロステリック化合物あるいはこれらの組
合せを含むがこれに限定されないいかなるものからなり
うる。蛋白質から成るときには、細胞成分はウイルス性
あるいは非ウイルス性酵素、遺伝子サプレッサー、癌遺
伝子のようなリン酸化された蛋白質あるいはこれらの組
合せからなりうる。本構築物から生産される生産物の結
合成分は核酸、蛋白質、および結合性のものあるいはこ
れらの組合せから選ばれる。核酸は、細胞成分に対する
相補的な配列および核酸結合蛋白質に対する配列あるい
は両者から選ばれた配列からなることが出来る。蛋白質
は抗体、受容体および核酸結合蛋白質あるいはその組合
せから選ばれる。結合性のものは代謝物を結合すること
が出来る。配置成分は核内配置物、細胞質内配置物およ
び細胞膜配置物あるいはこれらの組合せから選択可能で
ある。構築物中の配置成分は核酸配列、幹およびループ
構造のような核酸構造、およびペプチドあるいはオリゴ
ペプチドあるいはこれらの組合せから選ばれた構成要素
を含むことが出来る。
【００６８】本発明はさらに、細胞成分の細胞内での転
置のプロセスを提供する。このプロセスでは、細胞内に
導入されたとき、非天然の生産物を生産する核酸構築物
が提供され、この生産物は二つの要素を含んでいる。第
一に、細胞成分に結合できる結合成分があり、そして第
二に、生産物に結合したとき細胞成分を転置することが
出来る配置成分がある。核酸構築物は対象となる細胞あ
るいは対象となる細胞を含む生物学的システムに導入さ
れる。次のものは制限するためではなく例示のために示
された候補となる組合せのリストあるいは要約である。
再配置薬剤とその標的の可能な組合せが示されている。
【００６９】細胞性高分子の転置のための本発明の応用
は、U1配列の一部分が( 前述した)HIVゲノムの一部に独
特な配列に置き換えられているU1snＲＮＡ分子の核酸配
列を持つ核酸構築物の使用である。この場合、snＲＮＰ
蛋白質と会合したU1ＲＮＡは転置薬剤として働き、HIV
アンチセンス配列は親和性ドメインに相当する。U1の正
常な細胞内プロセシングの一部としてのU1の核への回帰
は、標的HIV m ＲＮＡにハイブリダイズしていると、HI
V ＲＮＡを配置する、そしてそれが細胞質内で翻訳され
ることができないようにする。本発明のU1 RNAを使用す
るもう一つの応用はU1配列の一部に対するHIV パッケイ
ジング信号配列の置換である。形質転換細胞に用いられ
た核酸構築物の一部として置換U1の導入は、U1 RNA配列
と親和性信号としてHIV パッケイジング配列をもつ転置
薬剤の合成を提供する。この場合の転置薬剤はビリオン
形成に対応する必要HIV 蛋白質に結合し、それらを細胞
質から核に輸送し、それによってウイルスＲＮＡのパッ
ケイジングを阻害する。
【００７０】本発明のもう一つの応用は、親和性ドメイ
ンとしてHIV RNA のスプライス部位に特異的な配列と、
転置薬剤として働くHIV Rev 蛋白質分子に結合するため
の親和性ドメインとしてHIV のRev 応答要素(RRE) に対
する配列を含むA ＲＮＡ分子を生産する核酸構築物の使
用である。HIV 感染細胞では、Rev 蛋白質転置薬剤はＲ
ＮＡ上のRRE 配列に結合し、つぎにそれはHIV RNA のス
プライス部位に結合する。コンプレックスはRev 蛋白質
により細胞質に輸送されそこではスプライスされていな
いHIV mRNAは機能できない。本発明の他の応用はウイル
ス複製に必須の蛋白質の転置に対するＲＮＡ信号の使用
である。HIV Rev 蛋白質は主に核小体に見出される。し
かしながら、RRE 配列を持つＲＮＡの存在では、Rev 蛋
白質は主に細胞質に見出される。したがって、RRE 配列
を持つＲＮＡ転置薬剤の細胞内生産のための配列をも核
酸構築物の存在はRev 蛋白質を核から積極的に除き、細
胞質への再配置を誘導し、それがウイルスＲＮＡを輸送
に利用されないようにする。ここでは転写物中のRRE 配
列は親和性ドメインとして働く。以下の多くの実施例は
本発明の種々の側面を例示するため述べられているが、
上の請求項により特別に述べられている本発明の範囲を
いかなる形でも限定するものではない。
【００７１】
【発明の実施の形態】
〔実施例１〕リガンドと化学修飾物とが一個のセグメン
トの一つの領域中に存在する二個のセグメントCHENACの
調製。 (i) 構築物の説明 一つの構築物は、修飾されていない鎖セグメントと修飾
されたプライマーセグメントから調製される( 図1a) 。
修飾されていない一本鎖サークルは生物学的機能に対す
る所望の配列を含むプラスミドから誘導され、それはま
たF1パッケージング信号を含む（この性質のプラスミド
は、種々の市販材料から利用できる）。このプラスミド
を含む一個のE. coli 宿主はファージ粒子中に一括され
た一本鎖ＤＮＡを得るために、M13 ヘルパーファージに
よってインフェクションされる。ＤＮＡはそれから種々
の通常用いられている方法によって調製されることが出
来る。オリゴマープライマーは、アリルアミンホスホラ
ミダイト（Cook et al.の方法、1988によって調製され
た）で合成され、それから下記するようにトリラクチル
リシルリジンで修飾される。修飾されていないセグメン
トは、修飾されたプライマーセグメントと相補的な配列
を含む。ターゲット細胞に対して該構築物を曝露した
後、ガラクトース部分はこれらの天然受容体との結合を
提供し、そして該複合体を細胞の中へ送り込む。本実施
例では、該プライマーは該構築物をCHENAC( 図1b中の黒
塗り領域によって示される）の修飾されていない領域中
の生物学的機能を特定する配列を発現せしめる二本鎖型
（図1b）に変換するために、細胞中でＤＮＡポリメラー
ゼによって伸長される。この実施例では、該構築物の生
物学的機能領域はリガンドと化学修飾物とを担持してい
る領域から分離されている。 (ii)ラクチルイソチオジアナートの調製 p-ニトロフェニルβ-D- ラクトピラノシド（トロレトリ
サーチケミカル社、カタログ#50385）はRafestin et a
l. によって記述された方法（FEBS Letters 40,62-66,
1974）によってp-イソチオシアノ- β-Dラクトピラノシ
ドへ変換される。 (iii) トリラクチル誘導体の調製 0.7 g のリシルリジンジハイドロクロライド（シグマケ
ミカル) は、30 ml のH2O に溶解される。ステップ(i)
からのp-イソチオシアノ- β-Dラクトピラノシドの4g(
約8mM)が添加され、反応は室温で４時間攪拌しつつ行な
われる。この間、混合物のpHは9.0 に調節され、0.2M N
aOH の添加によってその値に維持される。反応の終点
で、容量はH2O で500ml に調節され、DEAE-DE52 セルロ
ースカラム（前もってpH9.0 に調節され、それから0.05
M トリスバッファー、pH9.0 で平衡にされている）上に
負荷された。未反応のリシルリジンがカラムに吸着され
ずに残存し、そしてカラムを0.01M LiClで洗浄すること
によって取り除かれる。生成物は0.1M LiCl と共に流出
され、カラムからのフラクションは260nm でUV吸収で分
析される。ピークは集められそして真空下にH2O が蒸発
せられる。乾固分はLiClを除去するために、エタノール
／エーテル(3:1) 混合液と共に粉砕され、固形生成物が
残る。トリラクチルリシルリジンの収率は約80% であ
る。 (iv)トリラクチルリシルリジンの活性化 ステップ（iii)で調製された0.5 g のトリラクチルリシ
ルリジン(0.25 mM) は30 ml の乾燥ジメチルホルムアミ
ド中に溶解される。1gのN-ハイドロキシサクシニミドが
添加され、次いで50 mg のジシクロヘキシルカルボジイ
ミドが添加される。反応は室温で一晩進められる。次の
日に、真空によって蒸発せしめられる。残渣は未反応の
ジシクロヘキシルカルボジイミドと過剰のN-ハイドロキ
シサクシニミドとを除去するために25 ml のイソプロパ
ノールで30分間、夫々室温で2 回粉砕される。生成物は
それからアブソリュートエーテルでフィルター上で洗浄
され、該エーテルは除去され、生成物は更なる精製をす
ることなく用いられる。 (v) 核酸部分のラクトシル化 図1 に示されるプライマーとしてデザインされるオリゴ
マー1mg は0.7 M LiCl, 0.1 M 重炭酸塩バッファー(pH
7.8)中に溶解される。ステップ(iii) で調製された20 m
g のトリラクチルリシルリジン活性エステル( アリルア
ミン基の数と比較すると試薬の約10倍過剰) は1ml のジ
メチルホルムアミドに添加溶解され、該混合液は室温で
6 時間攪拌された。該混合液は真空下蒸発され、次いで
1 mlのH2O に溶解される。該溶液は遠心分離によって不
溶物質を除去され、上澄液はG50カラムクロマトグラフ
にかけられ、そしてＤＮＡフラクションが結合された。
【００７２】〔実施例２〕実施例１の二本鎖変形 実施例１からの図１ａに記載されている構築物は再び使
用されるが、ＤＮＡをターゲット細胞に曝露するに先立
って、該プライマーは該構築物を図１ｂに示される相補
的な二本鎖ＤＮＡ分子に変換するために、試験管内でク
レノフ酵素（ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノーフラグメ
ント）の作用によって伸長される。プライマー伸長は鎖
の置き換えを防ぐために、例えばプライマーの5'末端の
部分で新しく合成される鎖が停止するように14℃で合成
を行なうと云うような適当な条件下に行なわれる。
【００７３】〔実施例３〕一個のセグメントが分散され
たリガンドおよび化学修飾物をもつ二個のセグメントCH
ENACの調製 (i) 構築物の記載 一つの構築物は、修飾されていない鎖セグメントと修飾
されているプライマーセグメントから調製される( 図
２）。該修飾されているセグメントは、それが前述され
たようにアリルアミンデオキシウリジン塩基を含むよう
に化学的合成によって調製されたＤＮＡオリゴマーであ
る。a)インフルエンザから誘導された融合のペプチド(L
ear およびDeGrado, 1987, J. Biol. Chem. 262:6500)
と、b)細胞の核への局在を促進するペプチド（Kalderon
e et at. 1984, Cell 39:499) に対する配列を含むペプ
チドが合成される。該ペプチドは下記する方法によって
アリルアミン部分へ結合せられる。該修飾されているプ
ライマーは、修飾されていないセグメントの領域に対し
て相補的である。該プライマーは修飾されていないセグ
メントにハイブリダイズされ、そして修飾されていない
セグメントの配列を鋳型として使用してラクチルデオキ
シウリジントリホスフェイト前駆体を含むヌクレオシド
トリホスフェイト混合物( 下記) の存在下にクレノー酵
素によって伸長される。新生鎖の合成( 重合) は伸長が
プライマーの5'末端の位置で停止するように、14℃で行
われた( 図2b) 。 (ii)ＤＮＡプライマー中への付加のためのポリペプチド
の合成 融合ペプチド(Gly-Phe-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-L
eu-Glu-Gly-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Ala-Gly) をコー
ドしている配列と、核局在ペプチドをコードしている配
列は各々のカルボキシ終端上に加えられる追加のシステ
イン基によって、化学的に合成される。 (iii) ペプチドのアリルアミンへの添加 アリルアミン修飾核酸は0.7MLiCl、重炭酸塩バッファー
(pH7.9) 中で、３マレイミドプロピオン酸N-ハイドロキ
シサクシニミドエステルの10倍過剰量と反応され、そし
て室温で40分間インキュベイトされる。該反応の終点
で、pHが酢酸によって6.0 に調節される。未反応NHS エ
ステル（およびその加水分解生成物）はｎ−ブタノール
で2 回抽出することによって除去される。ＤＮＡは−70
℃で4 容量のエタノールで沈殿せしめられる。ペレット
はそれから最小濃度1mg/mlで酢酸ソーダバッファー(pH
6.0) 中に再懸濁せしめられる。誘導されたＤＮＡは、
ステップ(ii)からのチオール含有融合／および核局在ペ
プチドの所望の量と混合され、そして室温で6 時間反応
せしめられる。ＤＮＡ上の未反応のマレイミド残渣はβ
−メルカプトエタノールの添加によって除去される。 (iv)ラクチルデオキシUTP の合成 １０μモルのアリルアミノデオキシUTP(Enzo Biochem
社) は0.7M塩化リチウム、0.2M重炭酸ソーダ、pH7.8 の
6ml 中に溶解させめられ、そして2ml のヂメチルホルム
アミド中に溶解されているラクチルイソチオシアナート
（前述）の20μモルと混合される。該混合物は25℃で40
分間反応され、それから蒸留水で100ml に希釈され、そ
して100ml ベッドボリュームDEAEセファデックスA25 カ
ラム上に負荷された。該カラムは0.05M 重炭酸トリエチ
ルアンモニウムバッファー(pH7.8)）の100ml で洗浄さ
れ、そして生成物は0.05M-0.6M重炭酸トリエチルアンモ
ニウムバッファー(pH7.8) の直線勾配で流出された。29
0nm に最大UA吸収を示すフラクションが収集され、そし
て重炭酸トリエチルアンモニウムは、ロータリーエバポ
レータ−中35℃で真空除去された。ラクチルデオキシUT
P を含む固体残渣は10mMトリスバッファーpH8.0 中に溶
解されそしてＤＮＡポリメラーゼの基質として使用され
る。
【００７４】〔実施例４〕一つのセグメントが分散され
たリガンドとリボヌクレオチドの取り込みによる化学修
飾をもつ二個のセグメントCHENACの調製 一本鎖ＤＮＡ構築物は実施例1 で記述されたようにして
誘導される。ＲＮＡからなる第２の鎖は、ＲＮＡポリメ
ラーゼとリボヌクレオチド混合物とでStavrianopoulos
et al.によって記述された方法(1972, Proc. Nat. Aca
d. Sci. 69; 2609)に従ってＤＮＡ鋳型をインキュベイ
ションすることによって作られた。修飾されたリボヌク
レオチドの二つのタイプのもの; ラクチル−UTP とアリ
ルアミンUTP がこの混合物中に含まれる。該アリルアミ
ンUTP は市販品（Enzo Biochem社)であり、ラクチルUTP
は出発物質としてアリルアミンUTP のリボ誘導体が用
いられること以外は実施例１におけるラクチル−デオキ
シ−UTP に関して前述されたようにして合成される。該
ＲＮＡ鎖は合成さた後、メルティングによってＤＮＡ鋳
型鎖から分離され、それからアリルアミンヌクレオチド
が実施例３において前述したようにして融合ペプチドの
添加によって更に修飾せしめられた。該鎖はそれから再
アニーリングを行なうことによって図３に示される最終
構造を形成せしめられる。
【００７５】〔実施例５〕修飾一本鎖尾部を含む三つの
セグメントCHENACの調製 (i) 構築物の説明 この構築物は二つの修飾されていない相補的ＤＮＡセグ
メント（セグンメント1 と2 ）と一つの修飾セグメント
（セグメント3 ）から調製せられる。セグメント1 およ
びセグメント2 はお互いにハイブリッド化されてセグメ
ント3 と相補的な開裂されている領域を有する開裂され
ているサークルを形成する。これらセグメントの最終的
な組立は、図４に示される。個々の成分の生成と、それ
らを最終的な構築物中へ組み立てる方法は以下に与えら
れる。 (ii)ギャップのあるサークルの調製 a) セグメント1 は実施例１において前述したと同様に
してプラスミドＤＮＡから調製される。しかしながら、
この特殊な実施例では、最初のプラスミドはF(+)パッケ
ージング信号を含む。一本鎖ＤＮＡは殆どの制限酵素に
とって適当な基質ではないので、該環状一本鎖の小さい
部分は適当な制限酵素部位と相補的なオリゴでハイブリ
ッド化することによって、二本鎖型にトランスフォーム
される。この実施例では、該制限酵素はSma I であり、
該オリゴは末端でビオチニル化ヌクレオチドの包接(Coo
k et al. 1988)によって修飾された。酵素分解の後、該
SmaI 分解された二本鎖ＤＮＡは不安定化され、そして
ビオチニル化オリゴは非常に低い親和性を有している。
切断された一本鎖線状ＤＮＡの精製は、分解物をストレ
プアビジンカラムを通し結合しない物質を収集すること
によって行われる。 b) セグメント2 は二つの相補的なオリゴヌクレオチド
(GAP-1とGAP-2)の調製、およびこれらをハイブリッド化
してその配列が構築物中に裂け目を作る修飾されていな
い二重鎖オリゴヌクレオチドを形成することによって調
製される。最初のプラスミドは、それがF(-)パッケージ
ング信号を含むことを除いては、セグメント1 を作るた
めに用いられたと同様なものである。該導入されたオリ
ゴヌクレオチド(GAP-1/GAP-2) は、制限酵素分解とリゲ
ーションによる挿入を促進するために、制限酵素Sma I
に対する末端の制限部位を含んでいる。適当な部位の中
へ挿入されているオリゴヌクレオチドをもったプラスミ
ドをクローニングした後、環状一本鎖セグメント2 ＤＮ
Ａは図5 に示されるようにして得られる。 c) セグメント1 および2 はお互いにアニーリングされ
て、そこで、一本鎖領域がGAP-2 配列を含んでいる開裂
されているサークルを形成する。ステップii-a,ii-b お
よびii-cの全プロセスは図5 に示される。 (iii) セグメント3 の合成 セグメント3 は、末端に添加されたSma I 部位を有しな
い点でこのオリゴマーと異なる、GAP-1 と同様なオリゴ
マーを合成することにより、またアリルアミン部分と合
成されることにより調製される。オリゴマーの合成の
後、アリルアミン修飾ヌクレオチドは更に、前記したト
リラクチルリシルリジンの添加によって修飾される。セ
グメント3 は更に下記のステップによって処理される。 (iv)修飾3'尾部のセグメント3 に対する付加 ラクトシル化オリゴマー( セグメント3)の1mg は0.2Mカ
ゴジレイト(pH6.8) 、1mM デオキシチミヂントリホスフ
ェイト、0.3mM アリルアミンデオキシウリジントリホス
フェイト、1mM 塩化コバルト、1mM β- メルカプトエタ
ノール、および末端トランスファラーゼの40,000単位を
含む反応混合液の10ml中に溶解せしめられる。該混合液
は2 時間35℃でインキュベイトされ、そしてEDTAの添加
によって停止せしめられる。酵素はpH6.0 のホスホセル
ロースカラムに吸着することによって除去され、そして
通過した流出液が集められ、エタノールで沈殿され、0.
1mM EDTAの2ml 中に再溶解せしめられる。最終生成物は
アリルアミン基を含む塩基が約1/4 入っているpoly-dT
尾部を有している。融合ペプチドはそれから前記したよ
うにアリルアミン部分上に添加される。 (v) 最終組立 図4 に示される最終構築物は、ステップ(ii-c)において
作成された開裂したサークルを、GAP-1 および GAP-2配
列の相補性を介してステップ(iv)において作成された尾
部を有するオリゴマーとハイブリッド化することによっ
て形成された。
【００７６】〔実施例６〕リガンドを含むホモポリマー
へハイブリッドすることが出来る非修飾一本鎖尾部を含
む三つのセグメントCHENACの調製 この構築物は、セグメント3 に対するオリゴマーの合成
の後に、ラクチル誘導体の代わりにアリルアミン誘導体
に融合ペプチドが添加され、そして3'尾部の合成が非修
飾dATP存在下に行われた以外は、実施例5 に記述された
構築物と同様な方法で作られた。前実施例と同様に、セ
グメント1,セグメント2 およびセグメント3 は3'一本鎖
尾部を有する二重鎖サークルを形成するようにお互いに
組み立てられた。しかしながら、図6 に示されるよう
に、セグメント4 がコンプレックスに添加されると云う
更なるステップが付け加えられた。このセグメントは、
TTPとラクチル-dUTP の3:1 比の混合物の存在下で、前
述したと同様な条件を採用して、ターミナルトランスフ
ェラーゼによりチミンテトラヌクレオチドの伸長によっ
て形成せられた。コンプレックスへのセグメント4 のハ
イブリダイゼイションは、図6 に示される最終的な構築
物を結果として生じる。
【００７７】〔実施例７〕ＲＮＡ誘導CHENACの構築 図7 に示されるような適当な構造を有する構築物が作ら
れる。対象とする配列の合成を支配するT7プロモーター
の使用によって、転写が試験管内に行われた。該転写物
は、a)ラクチル化ＤＮＡプライマー( 前述したようにし
て調製された)と相補的な配列を表す配列ＡＢ、b)生体
内での転写物の合成を支配するためのCMV プロモーター
を表す配列ＣＤ、c)CMV プロモーターによる転写の後に
発現されるであろう生物学的機能に対する配列を表す配
列ＥＦ、および d)その相補的配列が逆転写酵素のため
のプライマーとしての細胞 tＲＮＡlys を結合するため
にHIV によって使用されたものと同様なプライマー結合
部位となるようにデザインされた配列ＧＨを含む。試験
管内におけるＲＮＡの転写の後、修飾されたプライマー
は図7 に示されるように該ＲＮＡとアニールされてコン
プレックスを形成する。このコンプレックスは、リガン
ド/ リセプター相互作用を介して該ＲＮＡターゲット細
胞に結合するために生体内、生体外、または該試験管内
のいずれにおいても、使用されることが出来た。エンド
サイトシスの後、該ＲＮＡのある部分は更なる処理と活
性のために細胞質中で利用可能であるべきである。図8
は逆転写酵素活性の存在下で起こるであろう道筋を示
す。この活性は、既に存在するこの活性を有する( 本質
的にあるいはレトロウイルス感染によって) 細胞をター
ゲットとすることによるか、あるいはこの分野の専門家
によって知られている種々な方法のいずれかによって与
えられることが出来る。図8 に示されるステップの最終
結果は、所望の生物学的活性を与える転写を生成するこ
とが出来るＤＮＡの二本鎖線状片である。
【００７８】〔実施例８〕多重プライマーを有するＲＮ
Ａ誘導CHENACの構築 図9 に示される適当な構造を有する構築物が作られる。
転写は対象とする配列の合成を支配するT7プロモーター
の使用によって、試験管内で行われる。この実施例の構
築物は、単一修飾プライマーよりもむしろ多重プライマ
ーとアニールされるであろうＲＮＡを生産することを意
図された以外は、実施例8 に記載されたものと同様であ
る。これらプライマーの一個またはそれ以上が修飾され
得る。本実施例では、転写は a) ラクチル化ＤＮＡプラ
イマー( 前記したようにして調製された) と相補的な配
列を表す配列ＡＢ、b)付加された融合ペプチド( 前記し
たようにして調製された）を有する修飾ＤＮＡプライマ
ーと相補的な配列を表す配列ＣＤ、c)非修飾プライマー
である配列ＥＦ、d)生体内での転写物の合成を支配する
ためのCMV プロモーターを表す配列ＧＨ、e)CMV プロモ
ーターによる転写の後に発現されるであろう生物学的機
能のための配列を表す配列ＩＪＫ、および f) その相補
的配列がHIV によって逆転写酵素に対するプライマーと
しての細胞 tＲＮＡlys を結び付けるために使用された
ものと同様なプライマー結合部位であるようにデザイン
される配列ＬＭ、を含む。明確にするために、印を付け
られた修飾は図10中には記されていない。試験管内での
該ＲＮＡの転写の後、上記プライマーは該ＲＮＡとアニ
ールされて図9 に示されるコンプレックスを形成する。
このコンプレックスは該ＲＮＡをリガンド/ リセプター
相互作用を介してターゲット細胞に結合するために、生
体内、生体外または試験管内のいずれかにおいても使用
されることが出来た。該リガンド修飾プライマーは該コ
ンプレックスの取り込みを促進し、そしてエンドサイト
シスの後、融合ペプチド修飾プライマーは、エンドゾー
ムからの該ＲＮＡの遊離を促進するであろう。図10は逆
転写活性の存在下に起こる道筋を示す。この活性は、既
に存在するこの活性( 本質的にあるいはレトロウイルス
感染によって) を有する細胞をターゲットにすることに
よるか、あるいはこの分野の専門家が知っている種々の
方法のいずれかによりそれを導入することによって図10
に示したこのステップの最終結果は、所望の生物活性を
与える転写物を生産することのできる一連の二本鎖線状
直鎖ＤＮＡ片（それぞれは試験管内でつくられるコンプ
レックスからのプライマーのひとつから開始される）で
ある。
【００７９】〔実施例９〕１−セグメント一本鎖CHENAC
の構築 構築物は図11に示した特有の構造を持つ。転写は配列の
合成を指示するT7プロモーターを使用することで試験管
内で行われる。転写産物はJK配列をもつ、これは転写産
物の合成を支持するCMV プロモーターを含む生物学的機
能を示す配列と同様にラクチルリジルリジンの修飾ＤＮ
Ａプライマー（前述したように調製した）に相補的な配
列を示し、また生物学的機能を示す配列はCMV プロモー
ターによる転写後に発現し、その配列あるいはそれらの
配列は tＲＮＡ結合部位に相補的である。このサンプル
は cＤＮＡがトリラクチルリジルリジンの修飾されたＤ
ＮＡセグメントをプライマーとして試験管内で逆転写酵
素を用いて合成される点で二つの前述のサンプルとは異
なる。得られたＤＮＡ/ ＲＮＡ二本鎖分子はRNaseH 処
理し、一本鎖ＤＮＡ CHENAC を得た。このコンプレック
スは生体内、生体外あるいは試験管内でＤＮＡ CHENAC
がリガンド/ レセプター相互作用を通して標的細胞に結
合するために使用することができると思われる。エンド
サイトーシス後、ＤＮＡのいくつかの部位はプロセシン
グや活性よりもむしろサイトプラズムにおいて利用され
る。図12にはサイトプラズムへＤＮＡが放出された後に
起こると思われる二つの可能な経路を示す。図12は図8
に見られるものと同様の経路で、ここではＤＮＡ CHENA
C の3'末端に一つの tＲＮＡ結合部位があるため構築物
が作られる。細胞のメカニズムによる生体内での開始と
伸長により一つの二本鎖ＤＮＡ分子が得られる。図12b
は CNMACの3'末端に多数の tＲＮＡ結合部位があるため
構築物が作られる経路を示す。これらは利用できる同一
のあるいは異なった tＲＮＡ種のどちらかである。三つ
のtＲＮＡプライマー配列( 図12ｂに示した) をもつ CN
MACからの伸長は二本鎖ＤＮＡ分子と二つの一本鎖ＤＮ
Ａ分子の合成を導く。後の二つの分子はもしリガンドの
修飾プライマーを選んだ配列は同様に tＲＮＡプライマ
ー配列に似ているのなら二本鎖分子に変換することがで
きる。図12a に示したものと経路が似ているため構築物
が得られるとき、a)JK配列がリガンドの修飾プライマー
に相補的配列を示す b)AB 配列がCMV プロモーター配列
を示す c)CDEF 配列がCMV プロモーターによる転写後に
発現する生物学的機能を示す配列を示す、また d)GH 配
列は相補的な配列はHIV が逆転写酵素のプライマーとし
て細胞の tＲＮＡlys に結合するために利用する一つに
似ているプライマー結合部位であるために得られるにお
いて構築物は転写産物を与える。図12b に示したものと
経路が似ているため構築物が得られるとき、a)JK配列が
リガンドの修飾プライマーに相補的な配列を示すb)A配
列がCMV プロモーター配列を示す。 c)B配列がCMV プロ
モーターによる転写後に発現する生物学的機能を示す配
列を示す、またd)CD,EF またGHがプライマーとして利用
される tＲＮＡのプライマー結合部位である配列に相補
的は配列を示すにおいて構築物は転写産物を与える。こ
の実施例と前述した実施例7 と実施例8 における経路の
最終的な結果の主な違いは後の二つの実施例は生体内で
の逆転写酵素の存在に依存する一方で、この実施例は標
的細胞への結合やとりこみより前に試験管内での逆転写
酵素活性を与える。
【００８０】〔実施例１０〕各鎖上の一部分をもつ二本
鎖 CHENAC の調製 構築物は図13に示した特有の構造をもつ。転写は配列の
合成を指示するT7プロモーターを使用することで試験管
内で行われる。転写生産物は a) ラクチルリジルリジン
の修飾ＤＮＡプライマー( 前述したように調製した) に
相補的な配列を示すAB配列、b)生体内での転写生産物の
合成を指示するCMV プロモーターを示すCD配列、 c)CMV
プロモーターによる転写後に発現する生物学的機能を示
すEF配列、そして d) 付着した融合誘導ペプチド( 前述
したように調製した) を持つ第二の修飾プライマーの配
列に同一のGH配列をもつ。図10において、ラクチルリガ
ンドは最初のプライマー上のXXで示し、融合誘導ペプチ
ドは第二のプライマーのZZで示してある。ＤＮＡは逆転
写酵素の鋳型として転写生産物を、プライマーとしてト
リラクチルリジルリジンの修飾ＤＮＡセグメントを用い
ることで試験管内で合成した。得られたＲＮＡ/ ＤＮＡ
二本鎖分子はRNase H 処理し、一本鎖ＤＮＡを得た。融
合誘導ペプチドをもつ第二のプライマーはＤＮＡの第二
の相補鎖を調製するためにプライマーとして用いた。こ
のコンプレックスは生体内、生体外あるいは試験管でＤ
ＮＡ CHENAC がリガンド/ レセプター相互作用を通して
標的細胞に結合するために使用することができると思わ
れる。リガンドの修飾プライマーはコンプレックスの取
り込みを促進し、エンドサイトーシス後に融合誘導ペプ
チド修飾プライマーはエンドソームからのＤＮＡの放出
を促進するだろう。
【００８１】〔実施例１１〕二重特異性抗体を構成する
二元機能結合剤 組み換えＤＮＡの方法はリンフォサイトのCD4 プロテイ
ン、マウス白血病ウイルス( 図14) に特異性のある二重
特異性抗体の調製に利用した。抗体はハイブリッドハイ
ブリドーマの生産のためにStaerzとBevan(1985 Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 83;1453)の手順に従ってマウスモ
ノクローナル抗体から調製した。 抗体の修飾 ヒドラジングループは過ヨウ素酸あるいはガラクトース
オキシダーゼを用いた酸化とその後のヒドラジンとの反
応後炭水化物の一部に抗体を誘導する。ガラクトースオ
キシダーゼを抗体の酸化に用いたとき、下記のように遊
離ガラクトースグループを分解する必要がある。抗体は
ペルオキシダーゼの存在下でガラクトースオキシダーゼ
により酸化する。反応の最後に混合物はLucifer Yellow
CH (Aldrich) と反応しG50 カラムを通す。もしカラム
からの溶出液が蛍光を発するのなら、これは抗体が遊離
のガラクトース残基を含み、ガタクトースオキシダーゼ
が抗体活性化に利用できることを示している。10mgの抗
体を0.1M酢酸バッファー(pH5.0) に溶解し、1.0 μmol
のNaIO4 とともに4 ℃で30分間酸化させた。余分な過ヨ
ウ素酸塩は、0.05M 酢酸バッファーでのSephadex G50(P
harmacia) クロマトグラフィーにより取り除いた。タン
パクの画分は、室温で30分間1.0 μmol の酢酸ヒドラジ
ン(pH5.0) と合わせて反応させた。pHを炭酸ナトリウム
で9.0 に上げ、内容物を0 ℃に冷やし、10μmol の水酸
化ホウ素ナトリウムを10分間隔で三つの部分に加えた。
還元はさらに60分間継続され、その抗体は55% の硫酸ア
ンモニウムで沈澱させた。0 ℃で2 時間後反応溶液を1
0,000×g で30分間遠心分離した。沈澱は1ml の酢酸バ
ッファー(pH5.5) で溶解し、冷却しながら、0.1M酢酸バ
ッファーで透析した。1 μmol の3-マレイミドプロピオ
ン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを0.5ml のジ
メチルスルフォキシドに溶解し、透析物に加えて室温で
30分間インキュベートさせた。余分なマレイミドは、Se
phadex G50クロマトグラフィーにより取り除き、結合し
た抗体の画分はチオール含有リガンドとpH6.5 、室温で
一時間反応させた。引き続き、結合した抗体を適当な孔
サイズの分子ふるいクロマトグラフィーにより、未反応
リガンドと分離した。5'末端にチオール基をつけてオリ
ゴヌクレオチドを合成するか、あるいはpH9.0 でホモシ
アニン チオラクトンによる反応で核酸の5'末端か3'末
端のアリルアミン基にチオール基を付加させた。
【００８２】〔実施例１２〕細胞にとってのドメインと
なるCD4 細胞表面蛋白質に対する抗体と、核酸成分にと
ってのドメインとなる一本鎖ＤＮＡ分子からなる分岐結
合剤（図15) 長さが120 塩基で5'末端にアリルアミン基付加による修
飾を含んだ一本鎖ＤＮＡを、化学的にCook et al. によ
る方法(1988 Ｎucleic Acid Res 16;4077)で調製した。
また、アリルアミン基は実施例11に示すようにチオール
化されていた。3'末端側70塩基は、アデノ関連ウイルス
ＤＮＡの一本鎖領域に相補的であった。その一本鎖ＤＮ
Ａは、実施例１１に示すようにF(ab')2 フラグメントに
結合していて、図15で示されるようにアデノ関連ウイル
スにアニールする。
【００８３】〔実施例１３〕二重特異的な抗体( あるい
は二重特異的な抗体のF(ab')2 からなる結合剤は核酸成
分の一本鎖ＤＮＡドメインに結合していた( 図16) 実施例11に示されたように、ハツカネズミのCD34細胞表
面蛋白質に対するモノクローナル抗体とハツカネズミの
アデノウイルスに対する抗体から、二重特異的な抗体を
調製した。実施例12に示されるような一本鎖ＤＮＡは、
二重特異的抗体( あるいは二重特異的抗体のF(ab')2 フ
ラグメント) に結合し、アデノ関連ウイルスにアニール
した。不活性化されたアデノウイルスは、細胞の錯体摂
取を促進するために抗体に結合している(Cristiano et
al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90;2122: Curiel et
al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88;8850) 。
【００８４】〔実施例１４〕アデノ関連ウイルスＤＮＡ
と肝臓細胞結合ドメイン、不活性化アデノウイルスから
なる結合剤( 図17) ラクチルオリゴリジン10量体の調製 オリゴリジンはカ
ルボキシル末端にシステイン残基を持った状態で合成し
た。チオール基はエールリッヒ試薬でブロックし、アミ
ノ基は室温で0.1M重炭酸バッファー(pH9.0) 、20% ジメ
チルフォルムアミド中の3 倍過剰のラクチルイソチオシ
アネートと反応させた。反応溶液はG50カラムでクロマ
トグラフし、ラクチル−オリゴリジン画分は合わせて凍
結乾燥した。その固体は、保護されたチオール基の凍結
が溶けないように1mM ジチオスレイトール2ml で溶解
し、過剰なジチオスレイトールや遊離したエーリッヒ試
薬を取り除くために再びG50 カラムでクロマトグラフさ
れた。全ての操作は、チオール基の空気酸化を防ぐため
アルゴン飽和バッファーで行った。合わせたラクチルオ
リゴリジン画分は、合わせてすぐにマレイミド誘導抗体
( 以下参照) あるいは、実施例12にあるような核酸含有
チオール混合液中の蛋白質と反応させた。
【００８５】〔実施例１５〕アデノ関連ウイルスＤＮＡ
と肝細胞結合のためのドメインに結合したＤＮＡとの抗
体結合剤 長さ100 塩基で5'末端にチオール基を持った一本鎖ＤＮ
Ａ分子を化学的に合成し、アリルアミン基は分子の5'末
端50塩基の間、10塩基間隔で散在させ、分子の3'末端50
塩基はアデノ関連ウイルスＤＮＡに相同性がある。チオ
ール基のブロック後、ラクチル基を実施例11に示したよ
うに付加した。チオール基はその後露出させ、ラクチル
基で修飾された一本鎖ＤＮＡにアデノウイルスのモノク
ローナル抗体を加え、実施例12に示したようにアデノウ
イルス関連ウイルスＤＮＡとアニールさせた。
【００８６】〔実施例１６〕核酸ハイブリダイゼーショ
ンによる多重結合抗体の調製 (i) ホモポリマーの調製 5'末端にアミン基を持ったオリゴ(dA)とオリゴ(dT)を化
学的に合成した。より長い分子は、図19と図20のNAに描
かれたようにターミナルトランスフェラーゼと適当なdN
TP前駆体の反応で、プライマーとしてアミン含有オリゴ
を用いることで調製した。 (ii)ホモポリマーリンカーの調製 1,2 ジアミノ-4- ブロモ-5- ヒドロキシシクロヘキサン
は合衆国特許番号4,707,440 により調製し、そこでの(1
1-5 の) 反応産物はステップ(4-7) で化合物Iを生産す
るためにN-ブロモスクシンイミドと反応させた。( この
合成における様々なステップは図19と20に示した。) 化
合物I はアルゴン環境下、pH8.0 、90℃で5 倍過剰のジ
チオスレイトールと2 時間反応させた。反応溶液はpH1.
0 に酸性化し、余分なジチオスレイトールはペルオキシ
ドーフリーのエーテルにより、エーテル層にチオールが
検出されなくなるまで取り除かれた。化合物IIを含む水
層は次のステップに用いられた。 (iii) ホモポリマーへのリンカーの結合 核酸の5'アミノ基は、0.2M重炭酸ナトリウムバッファー
(pH7.8) と0.7M塩化リチウム、30% ジメチルフォルムア
ミド中で3-マレイミドプロピオン酸 N- ヒドロキシスク
シンイミドエステルと25℃で40分間反応させた。反応溶
液のpHは、2.0M酢酸で5.5 にして、余分な活性エステル
はn-ブタノール抽出で取り除いた。生産物である化合物
III は-70 ℃で2 時間、4 倍量のエタノールで沈殿させ
た。遠心分離し、沈殿は0.7M塩化リチウムで溶解して、
即座に過剰な化合物IIと室温でpH6.0 、30分間反応させ
ることで化合物IVを生産する。この化合物は、前のステ
ップにあるようなエタノール沈殿で過剰な化合物IIから
分離した。化合物IVは過剰な3-マレイミドプロピオン酸
N- ヒドロキシスクシンイミドエステル( 化合物III で
示したような）と反応させ化合物V を生産した。この生
産物は4 倍量のエタノールで2 回沈殿させ、使用するま
で-70 ℃で沈殿として保存した。 (iv)抗体の調製 Fab'-SH フラグメントは、F(ab')2 抗体を0.5Mジチオス
レイトールでpH7.5(Taizo Nitta,Hideo yagita, Takach
ika Azuma, Kiyoshi Sato and Ko Okumura EurJ.Immuno
l 1989 19:1437-1441) 、アルゴン環境下で還元するこ
とにより調製した。pHは6.0 に下げられ、F(ab')2 の酸
化を防ぐためにアルゴン環境下で、完全脱気バッファー
を用いたG50 クロマトグラフィーによりジチオスレイト
ールから抗体を分離した。 (v) ホモポリマーの抗体フラグメントへの結合 ステップ(iv)からの蛋白フラクションは、コンパウンド
VIを形成するために、常にアルゴン環境下でヌクレアー
ゼ反応を防ぐための2mM EDTA存在下にて、2:1の比率で
ステップ(iii) からのコンパウンドV と結合・反応させ
た。4 ℃一晩インキュベート後、フリーなチオール残基
をブロックするためにエチルマレイミドを反応溶液に加
え、蛋白質は硫酸アンモニウムで沈殿された(60%飽和)
。沈殿は最小量のtris-HClバッファー(pH7.8) に溶解
し、反応生産物から結合物を分離するためにG100カラム
でクロマトグラフした。 (vi)抗体マルチマーを得るためのホモポリマーとのアニ
ーリング 0.2M NaCl,0.5M Tris-Hcl(ph7.8),1mM EDTA でアニーリ
ングを行った。図21は全行程の概要を示している。図21
に示す最後のステップでは、(a) は、1:1 の割合で共に
結合する各タイプの分子の一つだけが必要不可欠である
ことに対して、A ホモポリマーとT ホモポリマーの両方
が十分に短いという例を示している。(b) の図は、A ホ
モポリマーがT ホモポリマーよりずっと長いように合成
された状況を示している、またこの状況では、大多数の
抗体が複合体に一緒にリンクすることが出来る。
【００８７】〔実施例１７〕核酸ハイブリダイゼーショ
ンによる多重結合インシュリンの調製 アミノ基を持つオリゴT(前述されているようにして調製
した) は、0.7M LiCl、0.1M重炭酸ナトリウムバッファ
ー(pH7.8) 、3 倍過剰のスベリン酸ビス(N- ヒドロキシ
スクシンイミド) エステルを含んだ30% フォルムアミド
で室温15分間反応させた。2M酢酸の添加でpHはpH5.0 に
下げ、過剰な活性エステルはn-ブタノールで2 回抽出し
た。核酸は4 倍量エタノールで-70 ℃にて沈殿し、遠心
分離後の沈殿は冷たい0.7Mtiu 塩化リチウムー0.1M重炭
酸ナトリウム溶液(pH7.8) に溶解し、固体インシュリン
を1:1 の割合で加え、結合を4 ℃一晩で起こさせた。生
産物はG75 カラムでの分子ふるいクロマトクロマトグラ
フィーにより反応物から分けられた。多重結合複合体は
早期に描かれたように、T につながれたインシュリン分
子とポリA 結合剤のハイブリダイゼーションにより形成
された。この実施例のステップは図22に示した。
【００８８】〔実施例１８〕特異的な配列を用いた核酸
ハイブリダイゼーションによる多重結合インシュリンの
調製 1 グループの核酸配列は、知られているバクテリオファ
ージM13 の一本鎖配列から選択した。これらは、核酸5'
末端にアミノ基を持つように人工的に合成し、オリゴマ
ーは個々に活性化して実施例17に示すようにインシュリ
ンに結合させた。混合液はそれぞれのオリゴマー/ イン
シュリン複合体から成り、ファージ分子由来のM13 ＤＮ
Ａ(+鎖) と混合されている。生産物は分子ふるいクロマ
トグラフィーにより反応液から分離した。この実施例は
図23に示してある。
【００８９】〔実施例１９〕T7プロモーターに制御され
るアンチセンス配列と同じようにT7 ＲＮＡポリメラー
ゼを発現する真核ベクターの合成 (A) イントロンとイントロン挿入部位 SV40スモールT イントロンをいくつかのＤＮＡベクター
に利用されていて、3つのリーディング鎖のすべてに存
在する終始コドンとその小サイズのためにこの特例に選
ばれた。スプライシングのドナーとアクセプターの共通
配列は、イントロン配列と同じようにエキソン配列によ
って部分的に作られた。Mac ＤＮＡSISプログラム(Hita
chi,Inc) を用いたコンピューター検索では、早期にに
示したようなポスト- スプライシングの分岐点である(C
/A)AGG配列を持つT7ＲＮＡポリメラーゼのコード配列(M
ount,1982 Nucleic Acids Research 10,459)内に19の異
なる部位の同一配列を認めた。これらの部位のいくつか
はイントロン挿入部位に適合するが、この例では、T7部
位がSV40イントロンの側面に位置するいくつかのエキソ
ン配列によく類似しているものとして選ばれた。図24は
T7ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子配列中の、この部位を取り
囲む配列と、引き続くSV40ウィルスイントロンのこの部
位への挿入を示している。図24はまた、この融合や、通
常のT7をコードする配列を再構成するための、引き続く
イントロン以外のスプライシングから作られたm ＲＮＡ
を示している。 (B) T7をコードしている配列へのイントロン配列の融合 イントロンの導入と、T7プロモーターから制御される配
列と同様に中断されるT7ＲＮＡポリメラーゼを持つベク
ターの生産の方法は、図25に示した。図25のように、こ
の構築物の創作は、T7ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の各セ
グメント( イントロン挿入予定部位の左右) のPCR 増幅
や、真核イントロンのPCR 増幅により実行できる。これ
らの部分は、下に示すようなクローニングステップを用
いて結合させ、PCR 産物は次の配列を加えずにフラグメ
ントの正確な結合を行うための"スプライシング- バイ-
オーバーラップ- エクステンション"(SOE)を参考にし
て融合することができることは、以前に示されている(H
orton et al1990 Bio Techniques 8: 528; Horton et a
l., 1989 Gene 77:61)。しかし、PCR 反応は異なるセグ
メントを作ることを必要とするのに加えて、SOE 法はセ
グメント結合のための二次PCR におけるプライマーとし
て、これらのPCR 生産物の使用を伴う。多様なセグメン
トの融合のために、一連の連続PCR が行われた。エラー
の頻度を低くするため温度安定性ＤＮＡポリメラーゼを
選んでも、最終産物の合成は、いくつかの配列が多様サ
イクル増幅ステップに従うことを求め、そこでは最終産
物に望ましくない変異を起こす機会が増加する。この理
由のため、発明者が望むべき生産物を得るために最終生
産物のシーケンスを助言した(Horton et al.,1990)。こ
の実施例では方法は、最終融合生産物を形成するための
セグメントのリゲーションによって、それぞれのセグメ
ントを作るための第一段階PCR だけを要する物を用い
た。適切な産物を形成するための遺伝子セグメントとイ
ントロンの融合は、" スティッキーエンド" の生産を見
込んで、PCR プライマーの5'末端に制限酵素配列を付加
することによって行われた(Scharf et al.,1986 Scienc
e 233:1076)。この融合の正確に定義された末端ポイン
トを与えるために、回文ではない配列を認識し、あいま
いな定義で一本鎖を残すように認識配列の外側を切る制
限酵素(Bsa IとBsm B1) を用いた。この方法は、適切な
PCR プライマーのデザインにより使用者に選択されるい
くつかの点で配列の結合を許す。 (C) 融合に用いられるそれぞれのセグメントの合成 T7ＲＮＡポリメラーゼはT7ゲノムの3171-5822 塩基によ
りコードされ(Dunn and Studier, 1983 J.Mol.Biol.16
6:47)、この配列はジーンバンクでアクセスナンバーV01
146,J02518,あるいはX00411で利用可能である。この情
報に基づいて6 個の異なるオリゴを合成した。これらの
オリゴの使用とそれらの配列は、図26に示す。TSP1とTS
P2は相補的な12塩基でアニールし、完全な二本鎖ＤＮＡ
分子を形成するように増幅した( 図27) 。コンディショ
ンは次のとおり：150pM のTSP1,150PMのTSP2,1×NEB バ
ッファー#2(New England Biolabs,inc.),200mMのDNTP,1
3 ユニットの配列v2.0(U.S. Biochemicals,Inc.),37 ℃
で75分間。TSP3と4 は、T7ゲノムＤＮＡと共に"Left"フ
ラグメントを合成するための鋳型としてPCR 反応(Saiki
et al,1985 Science 230,1350) に用いた。試薬のコン
ディションは次の通りである：100ng のT7鋳型を含む10
0 μl ボリューム(Sigma Chemical Co.),IμMのTSP3,I
μM のTSP4,1mMのMgCl2,1 ×PCR バッファー,250μM の
dNTP,2.5ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼ。温度サイ
クルコンディションは：(1)94 ℃で50秒,(2)50℃で25
秒,(3)72℃で3 分の16サイクル。同様のコンディション
を、"Right" 末端をTSP-5 とTSP-6 オリゴマーで作ると
きに用いた。但し、推定生産物の長さ(2Kb以上) のた
め、Taq エクステンダー(Stratagene,Inc)を加え、通常
のPCRバッファーの代わりにTaq エクステンダーバッフ
ァーを加えた。イントロン部分形成のためにINT-1 とIN
T-2 を共にPCR 反応に用いた。コンディションはT7の"L
eft"フラグメント合成に用いたものと同じであり、SV40
クローンは鋳型として用いられ、アンプリコンの小サイ
ズのためサイクルコンディションは伸長タイムの72℃で
1 分だけであった。図27は、オリゴTSP1とTSP2の伸長に
より作られた短い二本鎖ＤＮＡ部分の合成と、完全な(N
LS+)T7ＲＮＡポリメラーゼを生成するための右末端のTS
P3/TSP4 PCR 産物とのコンビネーションを示している。
結果的な核酸とアミノ酸の配列は、この実施例で与えら
れる構築物として通常の野生型T7ＲＮＡポリメラーゼ配
列と同様に、図28に示した。そして、この構築プロセス
の間に5'末端で行われた修飾は： a)ATG 開始コドンの周辺配列がKozak コンセンサス配列
(Kozak 1984 Cell 44: 283) のように変えられ、遺伝子
生産物の翻訳効率が増加した。この変化は以前にも、T7
ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に導入されてい
た。 b)TSP1/TSP2 伸長生産物のTSP3/TSP4 PCR 生産物への融
合は、通常のT7ＲＮＡポリメラーゼ蛋白配列の10番目と
11番目の塩基の間に9 アミノ酸の挿入を持ち込んだ。こ
の配列は以前にKalderone らにより、ヌクレアーゼへの
輸送のための信号であることが示されている(1984 Cell
39: 499) 。そして、Lievber ら(1989)により最初の10
アミノ酸の置換としてT7ＲＮＡポリメラーゼへ導入さ
れ、Dunnら(1988)により人工的に作られたEcoR1 部位を
挿入された。この実施例で用いた核酸局在信号(NLS) を
生じる方法は、通常の蛋白構造変化への不安は最小限で
済む。NLS をコードしているアミノ酸コドンは図28で大
きなタイプサイズで示してある。 (D) 真核生物の発現ベクターのT7ＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子の最終的な構築物を形成するための断片の組合せ 図29にこのプロセスで使用した様々なステップを示す。
使用を容易にするために、3 つの断片(PCR #1, PCR #2,
PCR #3)はそれぞれTAクローニングキットを使い、製造
者の説明に従ってプラスミドベクター(PCR II)にクロー
ン化した。PCR #1(T7 ＲＮＡポリメラーゼの左末端）は
PCR IIにクローン化し、pL-1を得た。この構築物はPCR
生産物を除くためにBsm B1とSpe 1 で消化し、TSP 1/TS
P2 伸長産物( 詳細は図27) はEcoR1 とBsa I で消化し
た。プライマーのデザインのために、Bsm B1とBsa I で
できた一本鎖末端はお互いに相補的で、これらの断片の
リゲーションにより一方の末端のEcoR1 末端ともう一方
の末端のSpe I 末端で一つの断片を形成する。M13 ベク
ター、mp18をEcoR1 とXba I で消化するとEcoR1/Spe I
断片が挿入でき、pL-2を形成する。PCR #2(SV40 イント
ロン) はPCR IIにクローン化し、pINT-1を得た。この構
築物はEcoR1 とSpe I で消化し、M13 ベクター(EcoR1と
Xba I で消化したmp18) にトランスファーし、pINT-2を
つくった。PCR #3(T7 ＲＮＡポリメラーゼの右末端）は
PCR IIにクローン化し、pR-1を得た。この構築物はEcoR
1 とSpe I で消化し、セルフリゲートしてpR-2をつくっ
た。このステップはpR-1に存在する過剰のEcoR1 とSpe
I 部位を排除するために加えられた。図25に示したよう
に、pL-2, pINT-2とpR-2のエレメントは融合し、完全な
イントロンを含んでいるT7ＲＮＡポリメラーゼをつくっ
た。これはpL-2をBsm toBsaI で、pINT-2をBsm B1で、p
R-2をBsa I とSpe I で消化することでなされた。これ
ら3 つのインサートのリゲートは一方の末端がHind III
と他方の末端がSpe Iと親和性のある一つのフラグメン
トができる。このフラグメントは同じステップで前にHi
nd IIIとSpe I で消化したpRC/rsv(from Invitrogen In
c.) にクローン化した。図29にみられるように、この最
終生産物はpINT-3である。この特定の真核生物のベクタ
ーはRSV プロモーターが造血性セルラインで特に活性化
することが示されているため選ばれた。pRC/RSV のHind
III末端とpL-2のBsm B1で消化してできた末端とのリゲ
ーションは、最終生産物pINT-3のHind III部位を再構成
しない。 (E) アンチセンス配列 アンチセンス配列ののターゲットをテストするために、
HIV ゲノムにおける3つの異なるターゲットが選ばれ
た：(A)5' の共通先端、(B)Tat/Revのコード配列、(C)T
at/Revのスプライシングアクセプター部位。(A) のアン
チセンス配列はJoshi らの論文(1991 J.Virol.65, 553
4) から得た；(B) のアンチセンス配列はSzakiel ら(19
90 Biochem Biophys Res Comm 169,213) からとられ、
(C) のアンチセンス配列は我々でデザインした。オリゴ
の配列とHIV ゲノムでの位置は図30に示した。それぞれ
のオリゴは、1 ペアののオリゴのアニーリングが、Bam
H1部位と両立できる"sticky ends" を持った二本鎖分子
を与えるようにデザインした。オリゴはまた、BamH 1部
位挿入後に分子の位置づけが容易に確認できるようにデ
ザインした。結果的なクローンは、アンチHIV 配列A,B,
C に対してそれぞれ、pTS-A,pTS-B,pTS-C と呼んだ。 (F) T7ターミネーターのクローニング T7ＲＮＡポリメラーゼによる転写終結配列は、T7ゲノム
における塩基番号24,159での遺伝子10b 蛋白の末端と塩
基番号24,227での遺伝子11産物の開始コドンの間の配列
によりコードされていて(Dunn and Studier 1983 J.Mo
l.Biol.166 ,427) 、ジーンバンクアクセス番号V01146,
J02518 もしくはX00411。この情報をもとに、TER-1 とT
ER-2 を合成し( 配列は図30に示した。) 、138bp の二
本鎖を得るためにPCR 反応に用いた。この138bp の二本
鎖は24,108から24,228までのT7配列を持ち、片側にXba
I 部位と別側にPst I 部位を持っている。増幅の試薬コ
ンディションはTSP3/TSP4 に描かれたようであるが、温
度サイクルコンディションは：(1)94 ℃で50秒、(2)50
℃で25秒、(3)72 ℃で1 分の16サイクル。図30に示すよ
うに、ターミネーターはPCR IIベクターでクローン化さ
れ、Xba I/Pst I 切断後M13 ベクターにトランスフェク
トされた。 (G) T7が作用したアンチセンス転写ユニットの形成 アンチセンス配列を含むクローン(pTS-A, pTS-B, pTS-
C) はEcoR1 とPst I で消化し、一方でT7ターミネータ
ーを含むクローン（pTER-2) はXba とPst I で消化し
た。これらはEcoR1 とPst I で消化しておいたpIBI30(I
BI, Inc.) とリゲートし、図30に示したアンチセンス転
写ユニットをつくった、これはT7プロモーターから転写
し、T7ターミネーターで停止したアンチセンス配列をも
つ。得られたクローンはアンチ-HIV配列、A, B, C それ
ぞれpTS-A1, pTS-B1, pTS-C1と名付けた。 (H) アンチセンス転写生産物のpINT-3へのトランスファ
ー 現在の発明の本質において、アンチセンス転写ユニット
を作用させるT7がpINT-3にトランスファーし、T7ポリメ
ラーゼ/ プロモーターの一つの構築物をつくることがで
きる。これはSpe I とSph I で消化しプラスミドベクタ
ーLIT-38(New England Biolabs, Inc.) からポリリンカ
ーをトランスファーし、Xba I とSph Iで消化しておい
たmp18へポリリンカーインサートをリゲートすることで
M13 ファージベクターLIT φ2 をつくった。これとその
後のステップは図31に示す。T7が作用したアンチセンス
配列を含むクローンpTS-A1, pTS-B1, pTS-C1はEcoRV と
Pst I で消化した。それらはEcoRV とPst I で消化して
おいたLIT φ2 ベクターにリゲートした。得られたクロ
ーンはT7が作用したアンチセンス配列を含むファージベ
クターでそれぞれpTS-A2, pTS-B2, pTS-C2と名付けた。
これらのクローンはNhe I とBsp1201 で消化し、Spe I
とNot I で消化しておいたpINT-3ベクター(図29) にリ
ゲートした。得られたクローンpRT-A, pRT-B, pRT-C は
RSV プロモーターにより作用したT7ＲＮＡポリメラーゼ
をコードする配列を含み、機能的なポリメラーゼ酵素を
つくるためにスプライシングされるSV40イントロン配列
も含み、その上、それぞれの構築物はT7プロモーターで
働きT7ターミネーターで停止したHIV アンチセンス配列
を含む。
【００９０】〔実施例２０〕T7ＲＮＡポリメラーゼも発
現させる一つの構築物から派生したT7でコントロールさ
れた転写生産物からできたタンパクの発現 前述の実施例に利用したpINT-3ベクターはT7コントロー
ルしたタンパク合成のための発現ベクターとして利用す
るために修飾することができる。この目的のために、pI
NT-3ベクターはT7ターミネーターとポリリンカーの中間
にT7プロモーターが必要である。これらの一部分の配置
の最適な部位はXho I とBam H1部位のあるpINT-3のT7Ｒ
ＮＡポリメラーゼのポリA 信号の後であ。ベクター内に
他のXhoI とBam H1部位もあることから、もしこの領域
を含む小さなセグメントが分離するならこの特定のセグ
メントの操作をすることができ、適当な核酸はXho I と
Bam H1部位の間に導入され、セグメントは後方に置き換
えられる。この構築物をつくるために使ったステップは
図32と33に示してある。 a)ポリリンカーの導入 Xho /Bam H1 挿入部位を含むセグメントはpINT-3の期限
であるpRC/RSV プラスミドから派生した。これはpRC/RS
V をXba I とXma I で消化し、適当なフラグメントを前
にXba I とXma I で消化したpUC18(New England Biolab
s, Inc.)プラスミドにトランスファーし、pEXP-1ベクタ
ーを得た。次にXho I とBam H1で消化し、ポリリンカー
はオリゴマーPL-1とPL-2( シーケンスは図32に示す) と
ともにリゲートすることで挿入した。合成されたプラス
ミドはpEXP-2と名付け、新しいポリリンカーを含んだ制
限酵素部位は図32に示してある。 b)T7プロモーターとT7ターミネーターの導入 プロモーターはTPR-1 とTPR-2 オリゴマー( シーケンス
は図B-10に示す) とリゲートすることにつづいてNco I
とBam H1で消化し、挿入することでpEXP-3をつくった。
典型的なT7プロモーターコンセンサス配列(Dunn and St
udier, 1983)は使われなかった。というのはそれはいく
つからセルライン(Sandig et al., 1993Gene 131;255)
で真核生物のプロモーターとして機能し、Lieber et a
l. (1993)から派生した配列はT7ＲＮＡポリメラーゼの
存在下で良く機能し、非存在下では働かないままである
ため置換される。ベクターpEXP-3はSpe I とPst で消化
し、pEXP-4ベクターをつくるために前述の実施例のpTER
-1構築物から派生したT7ターミネーターフラグメントと
リゲートした。Xba/Xma セグメントは短いポリリンカー
とT7ターミネーターを含むために修飾した。図33に示す
ようにリゲートした後にpINT-3とpEXP-4をXba I/Xma I
で消化することでpINT-3の修飾されていないセグメント
を置換し、ベクターpINI-4をつくった。 c)タンパクをコードする配列の新しいT7発現ベクターへ
の導入 完全なlac Z 配列をコードする遺伝子はpZeoSVLacZ(Inv
itrogen, Inc.)をAgeI とCla I で消化することで得ら
れた。これは前にBsp E1とCla I で消化しておいたpINT
-4にリゲートし、pINT-LacZ をつくった。真核生物の細
胞に導入後、RSV プロモーターはT7ＲＮＡポリメラーゼ
の合成をコントロールし、次にT7プロモーターがβ- ガ
ラクトシダーゼの合成に作用する。
【００９１】〔実施例２１〕一本鎖アンチセンスを生産
するための生産中心を伝達する一次核酸構築物 一次核酸構築物は図３４および図３５に示され、それに
よる細胞への導入に引き続いて自己プライミングやマル
チプライミングとＲＮＡ分解酵素H と逆転写酵素活性を
含む一連の出来事は、一本鎖ＤＮＡアンチセンス分子の
生産を導く。この場合、核酸構築物は生産中心のマルチ
コピーと、別個の3'末端と共にヘアピン構造を有するＲ
ＮＡ転写物（構造34a, 図34) を作り出す。逆転写酵素
存在下において3'末端のヘアピンがプライマーとして分
子の5'末端まで働き、してＤＮＡとＲＮＡの両方から成
るヘアピン構造（構造34b)を生じる自己プライミングが
起こる。マルチプライミング工程により、ＲＮＡ分解酵
素H 、ウイルス逆転写酵素の一部としてか生来の細胞シ
ステムからかどちらかがＤＮＡに結合したＲＮＡの分解
を始める。もし十分なＲＮＡ分解酵素H 活性があるか逆
転写酵素活性が十分に高ければ分解は完全に行われ、Ｒ
ＮＡの分解の開始は鋳型としてＤＮＡ部分を使って伸長
するためのプライマーとして保存されている。前者にお
いてＲＮＡ分解酵素H による分解の最終的な結果は二本
鎖5'ＲＮＡ末端と一本鎖ＤＮＡ分子（構造34c)であり;
後者( 構造34d)において、プライミングは a)34fや34g
のような分子シリーズの生産を引き起こし、一本鎖ＤＮ
Ａ部分の長さはプライミング開始部位に依存する、b)構
造34e のような生産中心の伝達を引き起こす。構造34g
は、例えば、Z 一本鎖ＤＮＡ部分として表される塩基配
列がアンチセンス塩基配列である場合、生物学的に変更
遺伝子として働くであろう。ＲＮＡ分解酵素H 逆転写酵
素の活性を通して、構造34e はさらに処理されて一本鎖
ＤＮＡ分子（構造35h, 35i, 35j, 図35) を生産し、も
し、その塩基配列X', Y', Z'がその目的のために設計さ
れていればアンチセンスＤＮＡとして働くであろう。こ
の発明によるアンチセンスＤＮＡ分子の生産は、細胞内
でアンチセンスＤＮＡを合成するための方法をはじめて
示したことを表している。
【００９２】〔実施例２２〕方向性のある転写能力のあ
るＤＮＡ生産中心を作り出すために逆転写されるＲＮＡ
生産中心を伝達する一次核酸構築物 本実施例において実施例21に記載した自己プライミング
やマルチプライミングの同じ工程が一本鎖ＤＮＡヘアピ
ン構造の伝達により起こる（図36) 。実施例21におい
て、構造36b, 36c, 36d(図36) は一本鎖ＲＮＡの生産の
ための生産中心として働く。この場合、これは逆転写酵
素やＲＮＡ分解酵素H が、多くの一本鎖ＲＮＡ分子の生
産を支配する二本鎖ＤＮＡ生産中心へと変化させるため
増幅現象として現れる。
【００９３】〔実施例２３〕一本鎖ＲＮＡを生産するた
めの二重ヘアピン生産中心を伝達する一次核酸構築物 本実施例において、二本鎖ＤＮＡ一次核酸構築物( 構造
37a,図37) は一本鎖生産中心が、そこから伝達され、5'
末端と3'末端にヘアピン構造を形成するように設計され
ている。3'末端からの自己プライミングによる伸長の
後、ＲＮＡ分解酵素H や逆転写酵素により触媒されて一
本鎖ヘアピン末端を有する二本鎖ＤＮＡ(構造38b,図38)
の伝達を引き起こすさらなるステップが起こる。これ
はさらに処理され、ＤＮＡ連結酵素の働きにより共有結
合的に閉環した分子(38c) を生じたり、逆転写酵素の働
きにより大きな線状分子(38d) を形成する。これら生産
中心中におけるプロモーターとコード配列の存在は、一
本鎖ＲＮＡの生産を供給する。実施例22にみられるよう
に、これはＲＮＡ転写物を生産する各々の生産中心がそ
れ自身、単一の転写物から派生することによる増幅現象
である。
【００９４】〔実施例２４〕誘導的細胞破壊の能力を有
する生産中心を産生する核酸構築物 本実施例において( 図39) は生来の細胞システムの細胞
への導入の結果として一本鎖核酸の生産を提供する。こ
の場合、生産中心( 構造39b)の産生へ導く出来事は逆転
写酵素の存在により引き起こされる。ここで、生産中心
における一本鎖核酸の生産は致死生産物、ジフテリア毒
素を生産するために翻訳されるｍＲＮＡであり、逆転写
酵素依存性の殺細胞現象を引き起こす。ウイルス感染TA
T 活性化(Harrison et al.により観察された) の非存在
下でのジフテリア毒素のような毒性遺伝子産物の低レベ
ルでの合成の抑制は毒素をコードする部分のコードして
いない鎖中に人工的に挿入したイントロン(39a) を使用
することにより行われる。この方法では毒素塩基配列の
転写は活性を有する生産物を生産したい。活性を有する
毒素の生産はアンチセンス転写物がスプライシングされ
て逆転写酵素の鋳型として使用されたときにのみ起こ
る。ＲＮＡ分解酵素H と逆転写酵素により仲介される活
性の結果は、イントロン塩基配列が除かれて毒素の鋳型
として働く二本鎖ＤＮＡ生産中心(39c) である。さらな
る改善として、二本鎖ＤＮＡ生産中心（構造39b 中ABC
と示した領域) をHIV LTR にすることができる。この場
合、毒素の生産はウイルス感染により提供される二つの
出来事に依存する。
【００９５】〔実施例２５〕一本鎖ＲＮＡ生産のための
二本鎖ＤＮＡ生産中心を作り出すためのｔＲＮＡプライ
マーの使用 本実施例は二本鎖ＤＮＡ生産中心を広げるため一本鎖Ｒ
ＮＡ生産中心中にプライマー結合部位の存在を利用し
た。この方法では、プライマーとしてリジンｔＲＮＡを
利用するHIV プライマー結合部位のようなレトロウイル
スのプライマー結合部位から派生する塩基配列を二本鎖
ＤＮＡ生産中心からＤＮＡの合成を開始するためのＲＮ
Ａ生産中心( 図40、構造40b と40c)中の端(XとY とした
部分) の近くに挿入することができる。構造40d のよう
な生成した生産中心は、前述したように、アンチセンス
ＲＮＡとして利用したり、タンパク質を生産するために
翻訳したりする一本鎖ＲＮＡを生産する機能を有する二
本鎖ＤＮＡ分子である。
【００９６】〔実施例２６〕U1遺伝子の転写物中に導入
したアンチセンス部分を有するプラスミドの構築 本実施例で使用したプロセスの全ては図41に示した。U1
遺伝子はプラスミドpHSD-4(Manser and Gesteland 1982
Cell 29;257) 中に存在する。3 対の異なるデオキシオ
リゴヌクレオチドを合成し、その塩基配列を図42に示し
た。プラスミドのBcl/Bsp 末端と同じ部位を形成するた
め、突出した一本鎖とこれら3 対をハイブリダイズし
た。プラスミド中のBcl/Bsp 末端はU1をコードする塩基
配列から49塩基除いた後も残っている。各塩基配列を挿
入し、pHSD-4のU1をコードする部分まで発現させたと
き、U1はHIV ゲノムの一部分に対するアンチセンスＲＮ
Ａとして現れる。Bcl 1とBsp E1で消化後、49塩基対部
分はU1遺伝子の転写部分から除かれる。オリゴヌクレオ
チド対はプラスミドのBcl/Bsp 末端と同じ突出末端を形
成するように設計されている。各オリゴヌクレオチド対
の連結反応(HVA-1 + HVA-2, HVB-1 + HVB-2, HVC-1 + H
VC-2) により72bp挿入されたpDU1-A, 66bp挿入されたpD
U1-B, 65bp挿入されたpDU1-Cを構築した。コントロール
としてHIV に関連しない配列である二つのオリゴマー(H
VD-1とHVD-2)もまた61bp挿入されたpDU1を構築するため
U1オペロン中に挿入した。はじめに記載したように、ク
ローン化の方法の設計は、アンチセンス塩基配列の核配
置のためのU1転写物により供与される信号の利用を可能
とする新たな塩基配列の挿入を可能にするものである。
上記の塩基配列の挿入がU1転写物の再輸送に応答するU1
部分に意図しない変化が生じているかどうかを検査する
ため、通常のU1とキメラの新規分子の予想される構造を
比較するため、MacDNASIS プログラム(Hitachi, Inc.)
を用いてコンピュータ解析を行なった。図43にもみられ
るように、5'末端の変化( 新しい塩基配列が導入されて
いる) にも関わらず、Sm部分と同様にループIII やIVは
乱されていないことを確認することができる。
【００９７】〔実施例２７〕U1 sn ＲＮＡの一部として
3つのアンチセンス塩基配列を発現するマルチカセット
構築物の構築 本実施例で使用した様々なステップは図44に示した。本
実施例で使用した様々な構築物、pDU1(A), pDU1(B), pD
U1(C), pGK-neoは本特許の実施例26に記載した。"B" ア
ンチセンスをU1転写物中にはめ込んだプラスミドpDU1
(B) をSma I とHind IIIで消化した。"A" アンチセンス
とU1オペロンを含む部分はpDU1(A) のHincII とHind II
Iによる消化により単離し、2 つの分離した"A" と"B"
アンチセンス塩基配列のオペロンを有するpDU1(A,B) を
構築するためにpDU1(B) 中に連結した。この構築物をSm
a I とHind IIIで消化し(2重オペロンを単離するため)
、あらかじめHinc II とHind IIIで消化しておいた"C"
アンチセンスを含むU1オペロンを有するpDU1(C) 中に
連結した。生成した構築物、pDU1(A,B,C) は"A","B","
C" の各アンチセンス塩基配列を含む3 つの分離したオ
ペロンを有する。形質導入後にこの構築物の存在を選択
することを可能にするため、ネオマイシン耐性遺伝子を
含む部分をベクターpGK-neo からHind IIIとSma I によ
る消化により切り出し、pDU1(A,B,C) 中に連結してpNDU
1(A,B,C)を構築した。pDU1(A,B,C) とpNDU1(A,B,C)構築
物中の3 つのオペロンの順序を図46に示す。
【００９８】〔実施例２８〕3 つのT7ＲＮＡプロモータ
ーを有するアンチセンス発現マルチカセット構築物の構
築 本実施例で使用した様々なステップは図45に示した。プ
ラスミドLIT28(New England Biolabs, Inc.)由来のポリ
リンカーをBgl IIとHind IIIで消化したM13 ベクター中
に移して、あらかじめBam H1とHind IIIで消化したM13m
p18 に連結してファージベクターLIT φ1 を構築した。
T7プロモーター、"B" アンチセンス塩基配列、T7ターミ
ネーターを有するpTS-B(実施例19に記載した) をEcoRV
とHind IIIで消化し、EcoRV とHind IIIで消化したLIT
φ1 に連結して"B" アンチセンスT7オペロンを有するフ
ァージベクターTOP302を構築した。プラスミドLIT38(Ne
w England Biolabs Inc.) 由来のポリリンカーをSpe I
とSph I で消化したM13 ベクター中に移して、あらかじ
めXba I とSph I で消化したM13mp18 に連結してファー
ジベクターLIT φ2 を構築した。T7プロモーター、"A"
アンチセンス塩基配列、T7ターミネーターを有するpTS-
A(実施例19に記載した) をEcoRV とPST I で消化し、Ec
oRV とPst I で消化したLIT φ2 に連結して"A" アンチ
センスT7オペロンを有するファージベクターTOP414を構
築した。TOP302をMlu I とBsi WIで消化して、Mlu I と
Bsr G1で消化したTOP414中に連結してTOP302とTOP414の
T7オペロンを結合し、"A" アンチセンスT7オペロンと"
B" アンチセンスT7オペロンの両方を有するファージベ
クターTOP501を構築した。T7プロモーター、"C" アンチ
センス塩基配列、T7ターミネーターを有するpTS-A(実施
例19に記載した) をSph I とHind IIIで消化した。TOP5
01をSph I とHindIIIで消化してpTS-C2中に連結し、単
一構築物中に"A" アンチセンスT7オペロン、"B" アンチ
センスT7オペロン、"C" アンチセンスT7オペロンを有す
るTRI 101を構築した。TRI 101 構築物中の3 つのオペ
ロンの順序は図46に示した。この構築物とT7ＲＮＡポリ
メラーゼを発現するベクター( 実施例19に記載したT7Ｒ
ＮＡポリメラーゼを含むイントロンをこの目的に使用で
きる) を同時形質導入すると3 つ全てのアンチセンス転
写物を生体内で生産できる。
【００９９】〔実施例２９〕3 つのT7ＲＮＡプロモータ
ーとT7ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するアンチセンス
発現マルチカセット構築物の構築 前述の実施例はＲＮＡポリメラーゼを含む構築物と2 つ
目のT7プロモーターを含む構築物との同時形質導入によ
りT7からの転写物を発現させる通常の方法を利用してい
るけれども、この発明の応用として同一構築物上の両方
( ポリメラーゼとプロモーター) を有する方法を記載す
る。本実施例はT7機動アンチセンス転写物のマルチオペ
ロンと同様にT7ＲＮＡポリメラーゼを有する単一構築物
の例証である。本実施例の様々なステップは図47に示さ
れる。プラスミドpTS-C(上記) をEcoRV とPst I で消化
し、あらかじめEcoRV とPst I で消化しておいたM13 ベ
クターLIT φ2(上記) に連結して、"C" アンチセンスT7
オペロンを有するファージベクターTOP601を構築した。
はじめの方に記載したように、構築物pINT-3はコード領
域の中に挿入されているSV40イントロンを有するT7ＲＮ
Ａポリメラーゼを含んでいる; 真核生物中ではRSV プロ
モーターによる発現とその後の細胞の通常のスプライシ
ング機構によるイントロンの切り出しが存在する。T7ア
ンチセンスオペロンを挿入するために、pINT-3をSpe I
とNotIで消化した。3 つのT7アンチセンスオペロンを、
あらかじめPst I とNhe I で消化したTOP601、Mlu I で
消化したTOP302、Bpu120 1とMlu I とNsi I で消化した
TOP414とSpe/Not pINT-3ＤＮＡの同時連結により３重挿
入物として挿入した。結果として得られたクローンを異
なるアンチセンスオペロンの位置のダイヤグラムと共に
図47に示した。
【０１００】〔実施例３０〕 細胞中の抗HIV U1構築物のテスト: ウイルス増殖の阻害: a)安定な形質転換細胞系の作成:U937細胞(Laurence, et
al., 1991, J.Virol, 65:214-219) をリポフェクチン
(BRL Inc.)を使用してメーカーが示したプロトコ−ルに
したがい、上記の様々なU1構築物で形質転換した。形質
転換後、培養細胞を二つに分けた。片方はプールしたク
ローン群を得るために使い、他方は個々のクローンを得
るために使用した。個々のクローンを得るために 1×10
4 の細胞当量を96ウェルの組織培養プレートの各ウェル
に植えつけ、安定な形質転換体を 600 microgram/ml の
G418(GibcoBRL) 存在下で10% のウシ胎児血清( 熱不活
性化)(Gibco BRL)を補足したDMEM(Gibco BRL) 培地中の
増殖により選択した。G418を含む培地は3 日から4 日毎
に交換し、 3週間のインキュベートの後、薬剤耐性細胞
を各ウェルから吸引により培養ディッシュに移して更に
増殖させた。プールしたクローン群を得るために、 1×
106 の細胞をT-25フラスコ(Corning) に植えつけ、G418
存在下で増殖させた。 b)細胞系の特徴 ＲＮＡを耐性クローンかもしくは耐性プールクローン群
からホットフェノール法(Soeiro and Darnell, 1969,
J. Mol. Biol. 44:551-562)により抽出した。このＲＮ
ＡはGenius System (Boehringer Mannheim) が付随した
プロトコールを使用するドットブロットにおいて使用さ
れた。この解析に使用されたプローブは、Xma I および
BamHI 部位の中にクローン化したpBlueScript (Stratag
ene)中の三つの挿入物(A,B,C) のクローンから作られた
リボプローブである。このクローンはセンスの向きに挿
入したＲＮＡを生産する。この解析の結果からU1クロー
ンで形質転換してG418に耐性を示し、テストしたすべて
の細胞はアンチセンス挿入ＲＮＡを発現したことを示し
ている。比較ドットブロット解析を酵母ＲＮＡ(Boehrin
ger Mannheim) と同様に親U937細胞系からのＲＮＡを用
いて行なった。これらのドットはアンチセンス挿入ＲＮ
Ａの存在を示さなかった。上記のクローンpBlueScript
12, pBlueScript 34, pBlueScript 56, pBlueScript 78
を使って試験管内で合成したアンチセンスＲＮＡは本章
で記載したセンスプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンにより陽性を示した。このことからこれらのテスト
した形質転換細胞群はHIV ウイルス塩基配列からのアン
チセンスＲＮＡを実際に発現していると結論付けた。 C)HIV チャレンジ実験No.1:0.5 ×106 の 3つの構築物
で形質転換したプールしたクローン化細胞を、Laurence
et al. の方法(1991, J. Virol, 65:214-219)を用いて
37℃で 2時間 2 microgram/ml のポリブレン存在下でウ
イルス/ 細胞比が0.15となるようなHIV 存在下でインキ
ュベートした。細胞をその後洗浄し、1ml の培養液(RPM
I 1640+10%ウシ胎児血清、Flow Labs)に懸濁して二つに
分けた(0.5ml/ ウェル) 。3 から4 日毎に3/4 の培養液
を除き、新しい培地に交換した。感染 6日後、これらの
細胞試料を、メーカー(DuPont)のプロトコ−ルに従って
p24 ELISA 抗原捕捉を用いたHIV ウイルスによる感染の
程度を検査した。この実験のコントロールの培養細胞は
HIV に対するアンチセンス塩基配列をもたないクローン
で形質転換した細胞を使用した。この実験の結果を表 1
に示す。
【０１０１】
【表１】 コントロールのクローンと比較するとプールしたクロー
ンの試料はp24 の生産の阻害を示した。プールしたクロ
ーン2.10.16 の場合、コントロールと比較してその阻害
の程度は50% に近かった。このプールしたクローン群の
細胞をさらに下記のように検査した。感染後18日で培養
液中のp24 の濃度は上記のように測定された。この測定
の結果を表 2に報告する。
【０１０２】
【表２】 この表はコントロールのプールしたクローン群や親細胞
系のどちらと比較してもプールしたクローン群の細胞中
のp24 抗原生産の約95% が阻害されていることを示して
いる。ウイルス感染24日目、トリパンブルー色素排除に
よる検査をすると、コントロールのプールしたクローン
群は17% が増殖可能であり、多数のシンシチウム(HIV感
染の特徴である多核巨大細胞）を含んでいた。2.10.16
とラベルしたプールしたクローン群は40から60% が増殖
可能であり、シンシチウムはみられなかった。24日後、
コントロールのプールしたクローンの培養細胞とプール
したクローンの培養細胞をフィコール勾配分離(Pharmac
ia) に供した。この操作によりルーチンの維持操作とし
て 3から 4日毎に死細胞から生細胞を分離した。35日目
に、プールしたクローン群には生細胞は存在していた一
方で、コントロールのプールした培養細胞中の生細胞は
消滅した。プールしたクローン群のこれらの生細胞のp2
4 抗原存在を分析したところ、2.10.16 を名付けた培養
細胞系は培養液中にバックグラウンド以上にp24 抗原存
在を示さなかった。(0.039ODと比較して0.032+/-0.08O
D) 。この実験において、HIV に感染した細胞は 2OD以
上のp24 抗原量を示した。このように今回の分離プロト
コールによって、ウイルスの阻害程度は99%以上であっ
た。 d)HIV チャレンジ実験No.2:本実験において、2.10.16
として同定したプールしたクローン群( 始めのチャレン
ジの31日より）を、コントロールのプールしたクローン
群や親細胞系U937と同様に上記のようにHIV BAL 株にウ
イルス/ 細胞比が0.10となる様に再び感染させた。感染
後、上記のように細胞を維持した。感染 9日後と12日後
に上記のようにp24 抗原を測定した。その結果を表 3に
報告する。
【０１０３】
【表３】 この表は親細胞系と比較してプールしたクローン群がp2
4 抗原の生産を約66%阻害していることを示している。
これらの細胞を上記のように 3日から 4日毎にフィコー
ル勾配を用いて死細胞から生細胞を分離して維持したと
ころ、21日目にHIV に感染させた親細胞系と比較して2.
10.16 細胞系ではp24 抗原の生産は確かめられなかっ
た。( ここに比較として2.10.16 のプールしたクローン
群のODは0.009 と感染していない親細胞系と−じであ
り、感染した場合、感染した親細胞系は2OD 以上であっ
た。) e)HIV ウイルスによる 3回のチャレンジ後の2.10.16 細
胞系のさらなる特徴:本実験において、2.10.16R1(2 回
目のチャレンジ実験の21日目より) として同定したプー
ルしたクローン群と親細胞系U937を上記のようにHIV BA
L 株により再度感染させた。感染後、上記のように細胞
を維持した。感染14、27、42日目に、上記のように親細
胞系U937と同様にプールしたクローン群(2.10.16R2とす
る) のp24 抗原を測定した。その結果を表4 に報告す
る。
【０１０４】
【表４】 この表は27日までに親細胞は培養液から消滅したことを
示している。これはウイルス感染が細胞を絶滅させると
いう結論と一致している。プールしたクローン化細胞群
2.10.16R2 ではこれらの培養上清中のp24 抗原量は分析
法の感度以下であった。このようにオリジナルのプール
したクローン化細胞の3 回目のチャレンジにおいてウイ
ルスの増殖は確かめられなかった。親細胞系U937は表層
抗原CD4+を有することで知られている。本親株と3 回の
選択後のプールしたクローン株である2.10.16 R2株を、
マウスCD4+抗体(Becton Dickenson)の結合を蛍光ヤギ抗
マウス抗体(Tago)を用いた測定によりCD4+抗原の存在を
フローサイトメーター中で分析した。図48にみられるよ
うに、CD4+抗原は親株にも2.10.16R2 -HIV耐性細胞株に
も表層に存在した。これは、この細胞が吸着蛋白質の消
失、特にCD4+抗原の消失によりHIV ウイルスの感染に耐
性であるとして選択されたのではないことを明らかにし
ている。gag 抗原、p24 の生産に基づくウイルスの増殖
の証明が遺伝的にアンチセンスを有するプールした細胞
株がウイルスの増殖をさせないことを示す一方で、さら
に全てのHIV-1,2 を視覚的に検出する標準Cetus プライ
マーを用いたgag 遺伝子(p24抗原をコードする部分) を
コードする部分を同定するＤＮＡPCR 分析(Applied Bio
Systems)を用いてウイルスがこの細胞群に存在していな
いことが明らかとなった。EtBr染色したＤＮＡのUV照射
を示す図49にみられるように、 +コントロール( キット
中に提供されたＤＮＡを使用して）が予想されるサイズ
のバンドを示している一方で、2.10.16 R2ＤＮＡの増幅
産物の数種の希釈物はその様なバンドを示さなかった。
これらのデータはアンチセンス構築物を使って、それら
のCD4+表現型を維持した細胞系を創出できることを示し
ている。p24 抗原生産やCetus 社の迅速ＤＮＡPCR キッ
トによる測定で示したように、これらの細胞系が HIVウ
イルスの増殖をさせない。加えて、これらの細胞株は複
数個の HIVウイルスの感染でも生存することを示してい
る。
【０１０５】〔実施例３１〕 細胞中での抗 HIV U1 構築物のテスト: ベータ- ガラクトシダーゼ活性の合成の阻害: a)ベータ- ガラクトシダーゼの上流に標的配列Ａを有す
る真核細胞ベクター標的ＤＮＡのセグメントＡ(HIVのta
r 塩基配列より) を上記のように単離した。このセグメ
ントをLacZをコードする配列とSV40エンハンサー、プロ
モーター、ポリＡ１号配列を有する真核細胞ベクターpS
V LacZ(Invitrogen)のKpn1, BamH1 部位にクローン化し
た。クローニングサイトはこれらの配列中に存在する。
塩基配列のクローン化を添付図( 図50) に図解する。 b)安定に形質導入したU937細胞中のベータ- ガラクトシ
ダーゼ活性の発現:U937細胞を上記のようにリポフェク
チン法を使用して形質転換した。この実験において陽性
クローンはゼオシン耐性として選択した。５つの形質導
入細胞群を単離した。これらの細胞は、1.形質導入して
いないU937細胞; 2. HIV Aクローン単独で形質転換した
U937細胞; 3. HIV Aクローンで形質導入した後、U1アン
チセンスA クローンで形質導入したU937細胞( クローン
の記載は上記参照-2度目の形質導入はG418耐性として選
択した); 4. HIV A クローンとU1アンチセンスABC クロ
ーン( クローンの記載は再度上記参照) とで同時形質導
入したU937細胞; 5. HIV AクローンとU1-null DNA クロ
ーン( クローンの記載は再度上記参照) とで同時形質導
入したU937細胞である。U937( 安定に形質導入したもの
も形質導入していないものも) の対数増殖期の細胞を10
mM Mg++と 1 mM Ca++を含む 1×PBS で洗浄して培地を
除いた。洗浄した細胞を 2% ホルムアミドと0.05% グル
タルアルデヒドを含むPBS 中で室温で軽く(5分間) 固定
した。固定液を除き、該細胞をPBS で 2回洗浄して固定
液を除いた。洗浄した固定化細胞を 1 mg/mlのX-gal を
含む染色溶液(5 mM フェロシアニドと2 mM塩化マグネシ
ウムを含むPBS)に懸濁し、37℃で 2時間から一晩インキ
ュベートした。該細胞を40×の顕微鏡で調べた。この実
験の結果を図51( データ下部) に図解する。酵素ベータ
- ガラクトシダーゼの陽性生産を形質導入した細胞の細
胞質中の青色沈着の生産により分析した。細胞系 2と 5
の細胞の細胞質中には青色のスポットが検出される一方
で細胞系1 、3 、4 には青色は検出されなかった。これ
らのデータはHIV A クローンのみの細胞系 2やHIV A ク
ローンとnullＤＮＡコントロールの両方の細胞系 5にみ
られた酵素ベータ- ガラクトシダーゼの生産はアンチセ
ンスU1 AクローンがHIV Aクローンと同時形質導入した
とき( 細胞系3)やアンチセンスU1 ABCクローンがHIV A
クローンと同時形質導入したとき( 細胞系4)のどちらも
みられないことを示している。このように酵素ベータ-
ガラクトシダーゼを発現するHIV A クローンを有する細
胞系内におけるアンチセンスA 配列の存在はこの酵素の
生産を妨げる。 c)抽出液中のベータ- ガラクトシダーゼ活性の発現:可
溶化分析による酵素活性測定( 図51、データ上部) のた
め、対数増殖期培養細胞から超音波破砕か凍結融解の繰
り返しのどちらかにより抽出液を調製した。対数増殖期
の細胞(5×106cells/ml)を10 mM Mg++と1 mM Ca ++を含
むPBS で洗浄して培地を除いた。洗浄した細胞を250 mM
トリス塩酸緩衝液(pH7.5) に懸濁し、3 回凍結融解を行
なうか代わりに最大出力で 5分間超音波破砕した。粗溶
解液を遠心分離し、ラクトースアナログONPG(Sigma) の
加水分解により上清中で酵素活性を測定した。この基質
が酵素により切断されると黄色のONP 化合物を生じる。
このようにベータ- ガラクトシダーゼ活性は420 nmにお
ける吸光度の変化をみることでモニターできる。形質導
入していない細胞からの抽出液37℃で一晩インキュベー
トしても色が生じなかったのに対して、HIV A クローン
を安定に形質導入した細胞からの抽出液は37℃、30分以
内に黄色を呈した。5 つの細胞系をこの可溶化分析によ
り分析し、その結果を表5 に報告する。この表からU1抗
-A形質導入細胞は測定可能な量のベータ- ガラクトシダ
ーゼ活性を有していないことが判明した。( 系2 、5 と
系3 を比較せよ。) また、U1抗-ABCクローンも測定可能
な量のベータ- ガラクトシダーゼ活性を示さないことが
判明した。( 系2 、5 と系4 を比較せよ。) これらの結
果は塩基配列中にA 標的をクローン化したクローンのベ
ータ- ガラクトシダーゼ活性の生産へのU1抗-Aと抗ABC
クローンの影響のin situ 分析から得られた結果を確か
めるものである。
【０１０６】〔実施例３２〕無症候性HIV 陽性患者に対
して病因歴; 身体検査, CBCs, 分画計測（differential
counts), 血小板計数をふくむ血液化学; グルコース、
カルシウム、タンパク質、アルブミン、尿素、リン酸を
含む血液化学; 血中尿素窒素と血中クレアチン; 尿検
査; 心電図と胸部 X線写真; p24 抗原レベル; CD4 計
数; viral load検出のためのPCR を含む処理前評価が行
われた。基礎データを得るために細胞摘出に 4週間先立
ち、毎週p24 抗原とCD4 計数、PCR を行ない、処理期間
中 2週間毎にこれらの検査を続けた。患者から採血し、
Ficoll-Hypaque遠心分離により末梢血単核細胞を赤血球
や好中球から分離した。洗浄後、マウス抗ヒトCD8-コー
トフラスコ(CELLector TM Flasks, Applied Immune Sci
ences)の使用によりPBMCs をCD8 + 細胞から除去した。
フラスコの表面に吸着しなかった細胞をフローサイトメ
トリーにより分析し、無血清培地中でOKT3抗体により活
性化した。OKT3活性化細胞を60units/mlのIL-2を含む新
しい培地に1-2 ×105cells/ml となるように再懸濁し
た。細胞は約 2×106 まで増殖した。HIV と正反対のア
ンチセンスＲＮＡの発現のための塩基配列を含むレトロ
ウイルスベクターをpackaging cell line 中で増殖させ
た。構築したＤＮＡ( 例 F1に記載) をネオマイシン耐
性マーカーを有するレトロウイルスベクターLNL6に導入
した。細胞を約105 の濃度になるように培養液に懸濁し
てMOI が約1.0 となるようにレトロウイルスベクター感
染細胞の培養上清と混合することにより形質導入した。
5mg/mlの硫酸プロタミンを加え、混合液を37℃で 6時間
インキュベートした。細胞を 3回洗浄し、培養培地を含
むG418に移した。この形質導入工程は 3日連続して毎日
繰り返した。G418選択培地中で7 日後、G418を除き、細
胞を増殖因子( 上記) 存在下で増殖させた。充分量の細
胞が得られたら、細胞を集め、生理食塩水で洗浄、懸濁
して患者に注入した。細胞表現型はフローサイトメトリ
ー測定により測定した。このアンチセンス処理は可溶化
CD4 タンパク質による処理により補足される。(Husson
et al., 1992) の方法によるHIV 治療の施与後すぐに施
与を開始する。この補足遺伝子治療はAZT の同時投与に
よりさらに補足される。上記記載の本発明の詳細な説明
により当業者にとって明白な多種変更利用が可能であろ
う。そのような利用はすべて以下の請求項において述べ
られるように本発明の範囲および精神に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】中へ取り入れることによるリガンドと他の部分
の核酸プライマーの核酸構築物への配置された結合を表
すものである。
【図２】修飾された核酸プライマーからの伸長によるリ
ガンドの、核酸構築物への分散結合を表すものである。
【図３】修飾されたリボヌクレオチドプレカーサーを利
用する相補的ＲＮＡ鎖の合成によるリガンドの核酸構築
物への分散された結合を説明するものである。
【図４】また3'尾部の中に取り入れられる有用な部分を
含む修飾された核酸部分によって開裂されたサークルの
ハイブリッド化による核酸構築物との配置された結合を
説明するものである。
【図５】図４に示されるような開裂されたサークルの調
製を説明するものである。
【図６】その中に核酸が取り入れられる有用なリガンド
と、ハイブリッド化した修飾されていない3'尾部によっ
て修飾された核酸部分による開裂されたサークルのハイ
ブリッド化による核酸構築物との配置された結合を説明
するものである。
【図７】ＲＮＡが生体内で二重鎖ＤＮＡセグメントの中
へトランスフォームされる修飾されたプライマーによる
ＲＮＡのセグメントの細胞中への導入のためのプロセス
を示すものである。
【図８】ＲＮＡが生体内で二重鎖ＤＮＡセグメントの中
へトランスフォームされる修飾されたプライマーによる
ＲＮＡのセグメントの細胞中への導入のためのプロセス
を示すものである。
【図９】ＲＮＡが生体内で二重鎖ＤＮＡセグメントの中
へトランスフォームされる修飾されたプライマーによる
細胞中へのＲＮＡのセグメントの導入のためのプロセス
を示すものである。
【図１０】ＲＮＡが生体内で二重鎖ＤＮＡセグメントの
中へトランスフォームされる修飾されたプライマーによ
る細胞中へのＲＮＡのセグメントの導入のためのプロセ
スを示すものである。
【図１１】その配列の一部としての修飾されたヌクレオ
チドを有する単一鎖ＤＮＡのセグメント導入のためのプ
ロセスを説明するものである。
【図１２】細胞中へ導入された後の図１１からの修飾さ
れた単一鎖ＤＮＡの寿命を説明するものである。
【図１３】各々の鎖状の配列の一部としての修飾された
ヌクレオチドを有する二重鎖ＤＮＡのセグメントの導入
のためのプロセスを説明するものである。
【図１４】レトロウイルス粒子を結合するための親和性
を有する一つの部分、およびＣＤ３４抗原を結合するた
めの親和性を有する他の部分とを有する二価の抗体バイ
ンダーを説明するものである。
【図１５】ＣＤ３４抗原に対する親和性によるＤＮＡの
Ｆ（ａｂ’）2 抗体フラグメントの各部分への共有結合
を示すものである。
【図１６】（Ａ）は、ＡＡＶベクターＤＮＡ分子をＣＤ
３４リセプターへ結合することを促進するための二価の
抗体のアデノウイルス結合部分へのＤＮＡの共有結合を
表すものである。（Ｂ）はＦ（ａｂ’）フラグメントが
完全な抗体蛋白質の代わりに用いられている以外は図１
６（Ａ）と同様な説明である。
【図１７】ハイブリッド化を介してアデノウイルスが結
合しているウイルス（ＡＡＶ）ベクターＤＮＡ分子に結
合することができるＤＮＡの共有結合により修飾されて
いる一つの部分と、ラクチル基の付加により修飾された
オリゴリジンの共有結合によって修飾された他の部分と
を有するアデノウイルススパイク蛋白質に対する一価抗
体を説明するものである。
【図１８】抗体の各部分がハイブリッド化によってＡＡ
ＶベクターＤＮＡへ結合されているラクトシル化ＤＮＡ
分子の共有結合により修飾されたアデノウイルススパイ
ク蛋白質に対する一価抗体を示すものである。
【図１９】核酸部分を抗体に結合するために有用な試薬
を製造するための合成ステップを記述するものである。
【図２０】核酸部分を抗体に結合するために有用な試薬
を製造するための合成ステップを記述するものである。
【図２１】核酸ホモポリマーのハイブリッド化によるＦ
（ａｂ’）2 抗体フラグメントの多重化のための方法を
表すものである。
【図２２】核酸ホモポリマーのハイブリッド化によるイ
ンスリン分子の多重化のためのプロセスを表すものであ
る。
【図２３】核酸ヘテロポリマーの結合マトリクスでのハ
イブリッド化によるインスリン分子の多重化のためのプ
ロセスを表すものである。
【図２４】生体内でのスプライシングのために適当な信
号を再構成するＳＶ４０イントロン配列の導入と、T7Ｒ
ＮＡポリメラーゼに対する正常なｍＲＮＡ転写の生成を
示すものである。
【図２５】イントロンの導入のプロセスと、それに続く
T7発現ベクターを示すものである。
【図２６】オリゴマーと、T7ＲＮＡポリメラーゼをコー
ドしている配列を含むＳＶ４０イントロンの合成のため
に使用されるそれらの生成物を示すものである。
【図２７】核局在信号のためのヌクレオチド配列の導入
のプロセスを表すものである。
【図２８】正常T7ＲＮＡポリメラーゼに対するヌクレオ
チド配列と、核配置信号に対して挿入される配列を有す
るT7ＲＮＡポリメラーゼとの5'末端の比較である。
【図２９】T7ＲＮＡポリメラーゼ転写を含むイントロン
の合成を支配するクローンを集めるためのクローニング
方法によるＰＣＲ発信フラグメントの集合のためのプロ
セスを示すものである。
【図３０】HIV アンチセンス配列のための配列とT7で支
配される転写単位へのそれらのクローニングのためのプ
ロセスを示すものである。
【図３１】T7ＲＮＡポリメラーゼを含むイントロンを含
むクローンの中へT7によって支配されるアンチセンスの
組合せのためのクローニングステップを示すものであ
る。
【図３２】該ＤＮＡ配列と、蛋白質発現ベクターを作る
ための次のクローニングステップを示すものである。
【図３３】図３２からのポリリンカー配列と、T7プロモ
ーターと、T7で支配される蛋白質発現ベクターを作るた
めのT7ターミネーターとの組合せのためのプロセスを示
すためのものである。
【図３４】単一鎖アンチセンスＤＮＡを生じるための生
成センターとしての役目をする一次核酸構築物のデザイ
ンを表すものである。
【図３５】単一鎖アンチセンスＤＮＡを生じるための生
成センターとしての役目をする一次核酸構築物のデザイ
ンを表すものである。
【図３６】転写を支配することができる二次核酸構築物
をを生ずる一次核酸構築物のデザインを表すものであ
る。
【図３７】二重ヘアピン生産物センター（二次核酸構築
物）を生ずる一次核酸構築物のデザインを表すものであ
る。
【図３８】二重ヘアピン生産物センター（二次核酸構築
物）を生ずる一次核酸構築物のデザインを表すものであ
る。
【図３９】誘導可能な自己破壊が可能である生産センタ
ー（二次核酸構築物）を生ずる一次核酸構築物のデザイ
ンを表すものである。
【図４０】転写可能な二次核酸構築物を生体内で作るた
めのｔＲＮＡプライマーを用いる一次核酸構築物のデザ
インを表すものである。
【図４１】U1転写領域からの正常な配列の削除と正常な
配列による置き換えのプロセスを示すものである。
【図４２】HIV アンチセンス配列を作るためのオリゴマ
ー配列と、U1オペロンを含むクローン中のU1転写配列に
対する置き換えとしてのこれらオリゴマーの挿入を示す
ものである。
【図４３】HIV アンチセンス配列置換によるU1転写のた
めのコンピューターによって発信された第２構造予測で
ある。
【図４４】U1オペロンを含む多重HIV アンチセンスを含
むクローンを作るためのクローニングのプロセスを表す
ものである。
【図４５】T7で支配される転写を含む多重独立HIV アン
チセンスを含むクローンを構成するためのクローニング
ステップを表すものである。
【図４６】図４４および図４５において記述される多重
オペロン構築物の最終的な構造を示すものである。
【図４７】ＲＮＡポリメラーゼを含むT7イントロンをコ
ードするベクターの中へ多重T7アンチセンスオペロンを
挿入するためのクローニングステップを表すものであ
る。
【図４８】抗−ＣＤ４＋抗体のHIV 抗性Ｕ９３７細胞へ
の結合を測定する流動細胞計測法のデーターを表すもの
である。
【図４９】チャレンジした後のウイルス抗性細胞ライン
（２．１０．１６）中のHIV の不存在を示すギャグ領域
のＰＣＲ増幅を示すものである。
【図５０】インディケーターとしてベータ−ガラクトシ
ダーゼ活性を使用することによるHIV アンチセンス鎖の
潜在的な阻害を試験するためのモデルシステムを表すも
のである。
【図５１】インサイチュ検定のみならず酵素検定による
ベータ−ガラクトシダーゼ活性におけるHIV アンチセン
ス鎖の効果を示すデーターの表である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年４月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４９】 チャレンジした後のウイルス抗性細胞ライ
ン（２．１０．１６）中のＨＩＶの不存在を示すギャグ
領域ＰＣＲ増幅を示す電気泳動写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５１】 インサイチュ検定のみならず酵素検定によ
るベーターガラクトシダーゼ活性におけるＨＩＶアンチ
センス鎖の効果を示すデータの図表である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ // Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ Ｃ１２Ｐ 21/08 38/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ジャニス ジー．スタブリアノポウラス アメリカ合衆国 ニューヨーク 11706 ベイ ショアー，サウス クリントン ア ヴェニュー 99 (72)発明者 ジェイムス ジェイ．ドネガン アメリカ合衆国 ニューヨーク 11561 ロング ビーチ，イースト ブロードウェ イ 210 (72)発明者 ダカイ リゥ アメリカ合衆国 ニューヨーク 11714 ベスページ，パトリシア コート ２ (72)発明者 ノーマン イー．ケルカー アメリカ合衆国 ニューヨーク 10016 ニューヨークイースト サーティス スト リート 343 (72)発明者 ディーン エル．エンゲルハルト アメリカ合衆国 ニューヨーク 10025 ニューヨーク，リバーサイド ドライブ 173

Claims (69)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞中に存在するとき産物を生産する一本
    鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、あるいは三本鎖形状にあ
    る、非自然的に生ずる線状、環状、あるいは分枝状であ
    る構築物であって、該構築物は少なくとも一つの修飾さ
    れたヌクレオチド、あるいはバックボーン、サイド鎖、
    あるいはその両方上に修飾されたヌクレオチド類似体、
    あるいは非核酸物質、あるいは上記の組合せからなる。
  2. 【請求項２】少なくとも一つの末端を有し、該末端は相
    補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる
    か、またはハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド尾部
    からなる請求項１に記載の構築物
  3. 【請求項３】該構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−Ｒ
    ＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、あるいは上
    記の組合せからなる請求項１に記載の構築物
  4. 【請求項４】該非核酸部分は一本鎖、あるい該配列セグ
    メントの両方の鎖に結合され、そして更に天然のあるい
    は合成ポリマー、天然あるいは合成リガンドから、ある
    いはそれらの組合せから選択される請求項１に記載の構
    築物
  5. 【請求項５】該構築物は、該修飾されたヌクレオチド、
    該ヌクレオチド類似体、該核酸部分、リガンド、あるい
    は上記の組合せによって与えられる更なる生物学的活性
    を発現し、ヌクレアーゼ耐性、細胞識別、細胞結合、そ
    して細胞あるいは核配置、あるいは上記の組合せから選
    択される請求項１に記載の構築物
  6. 【請求項６】細胞中に存在するとき生産物を生産する構
    築物であって、該構築物は化学的修飾あるいはリガンド
    からなる部分に非イオン的に結合されていることを特徴
    とする請求項１に記載の構築物
  7. 【請求項７】少なくとも一つの末端を有し、該末端は相
    補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされるかま
    たはハイブイリダイズ可能なポリヌクレオチド尾部から
    なる請求項６に記載の構築物
  8. 【請求項８】該ハイブリダイズされたポリヌクレオチド
    尾部配列に結合される抗体であって、該抗体はポリクロ
    ンあるいはモノクロン抗体である請求項６に記10の構築
    物
  9. 【請求項９】(a) 少なくとも一個の核酸成分に対するド
    メインと、対象とする少なくとも一個の原核または真核
    細胞に対するドメインとからなる非自然部分と、(b) 該
    核酸成分とからなり、該核酸成分は該細胞に対する一個
    または二個以上のドメインとは異なっていることを特徴
    とする組成物
  10. 【請求項１０】該部分はバインダーからなり、該バイン
    ダーと該ドメインとは同一かまたは異なっており、そし
    て該バインダーはポリマー、マトリックス、支持体、ま
    たは上記のいかなるものの組合せである請求項９に記載
    の組成物
  11. 【請求項１１】該ドメインは共有的または非共有的、ま
    たはバインダーを介して、またはこれらの組合せによっ
    て結合されており、上記非共有的な結合はイオン相互作
    用および疎水的相互作用、またはそれらの組合せから選
    択されるか、あるいはリガンド結合受容体によって仲介
    される特異的コンプレックスからなる請求項９に記載の
    組成物
  12. 【請求項１２】該核酸成分に対するドメインと対象とな
    る該細胞が天然のものであり、該バインダーが該核酸成
    分に天然の結合部位以外で付加されたおり、また該バイ
    ンダーが修飾されたフィブロネクチンあるいはポリリジ
    ンあるいは両者からなる請求項９に記載の組成物
  13. 【請求項１３】対象となる該細胞が生物の中に含まれて
    いる、あるいはさらに対象となる細胞からなる請求項９
    に記載の組成物
  14. 【請求項１４】(a) 請求項９に記載の組成物を提供する
    こと、および(b) 生体内あるいは生体外で該組成物を投
    与すること、からなる細胞に核酸成分を導入することを
    特徴とする方法
  15. 【請求項１５】対象となる細胞に核酸成分を導入するた
    めのキットであり、該キットは一まとめにした容器ある
    いは組合せで、(a) 該核酸成分に対する少なくとも一つ
    のドメインと、対象となる該細胞に対するドメインから
    なる非天然部分と、(b) 核酸成分からなり、必要に応じ
    て(c) バッファーと指示書が添付されていることを特徴
    とするキット
  16. 【請求項１６】対象となる原核あるいは真核細胞に対す
    る少なくとも一つのドメインからなっており、該一つあ
    るいは二つ以上のドメインが非二本鎖形である核酸成分
    に付加されている部分からなることを特徴とする組成物
  17. 【請求項１７】該部分はバインダーからなり、該バイン
    ダーと該ドメインと同一あるいは相異なっており、また
    該バインダーはポリマーマトリックス、支持体、あるい
    は上記のいかなるものの組合せである請求項１６に記載
    の組成物
  18. 【請求項１８】該ドメインが共有結合および非共有結
    合、あるいはこれらの組合せから選択され、そして該非
    共有結合はイオン相互作用または疎水性相互作用あるい
    はこれらの組合せから選択されるかあるいは該非共有結
    合はリガンド結合性受容体により仲介される特異的なコ
    ンプレックスを含むような請求項１６に記載の組成物
  19. 【請求項１９】さらに対象となる該細胞を含むかあるい
    は対象となる該細胞が生物の中にある請求項１６に記載
    の組成物
  20. 【請求項２０】(a) 請求項１６に記載の組成物を提供す
    ることおよび(b) 該組成物を生体内あるいは生体外で投
    与することからなることを特徴とする細胞に核酸成分を
    導入する方法
  21. 【請求項２１】対象となる細胞に核酸成分を導入するた
    めのキットであり、該キットは一まとめにした容器ある
    いは組合せで、(a) 対象となる細胞に対するドメインか
    らなり、該ドメインが非二本鎖形である核酸成分に付加
    されている部分からなり、必要に応じて(b) バッファー
    と指示書が添付されていることを特徴とするキット
  22. 【請求項２２】核酸成分に対するドメインからなり、該
    ドメインが対象となる原核あるいは真核細胞に付加され
    ている部分からなることを特徴とする組成物
  23. 【請求項２３】該部分がバインダーからなり、該バイン
    ダーおよびドメインは同じであるか異なっており、そし
    て該バインダーがポリマー、マトリックス、支持体、あ
    るいは上記のいかなるものの組合せから選択される請求
    項２２に記載の組成物
  24. 【請求項２４】該ドメインが共有結合および非共有結合
    あるいはこれらの組合せから選択され、そして該非共有
    結合がイオン相互作用および疎水相互作用あるいはこれ
    らの組合せから選択されるかまたは該非共有結合がリガ
    ンド結合性受容体により仲介される特異的コンプレック
    スである請求項２２に記載の組成物
  25. 【請求項２５】さらに対象となる細胞からなり、あるい
    は対象となる該細胞が生物の中に含まれている請求項２
    １に記載の組成物
  26. 【請求項２６】細胞へ核酸成分を導入する方法であり、
    該方法は(a) 請求項２５に記載の核酸成分を提供するこ
    と、そして(b) 該組成物を生体内あるいは生体外で投与
    することからなることを特徴とする方法
  27. 【請求項２７】対象となる細胞へ核酸成分を導入するた
    めのキットであり、該キットは一まとめにした容器ある
    いは組合せになっており、(a) 該核酸成分に対するドメ
    インからなり、該ドメインは対象となる細胞に付加され
    ており、必要に応じて(b) バッファーと指示書が添付さ
    れることを特徴とするキット
  28. 【請求項２８】一個または二個以上のモノマー単位から
    なっている均質あるいは不均質の多重コンプレックス組
    成物であり、該モノマー単位は(a) ポリメリックの相互
    作用を介してお互いに、または(b) ポリメリック相互作
    用を介して結合マトリックスに、あるいは(c) (a) と
    (b) との両方に付加されていることを特徴とする多重コ
    ンプレックス組成物
  29. 【請求項２９】該モノマー単位のポリマーあるいはオリ
    ゴマーが直状あるいは分岐状であり、また該モノマー単
    位のポリマーあるいはオリゴマーがホモポリマーあるい
    はヘテロポリマーからなっており、該モノマー単位は、
    ウイルス、ファージ、細菌、細胞あるいは細胞性物質、
    組織、器官および生物、またはこれらの組合せから選択
    された生物学的システムにおける成分を認識できる分析
    −特異単位からなっている請求項２８に記載の組成物
  30. 【請求項３０】該モノマー単位が天然に存在する化合
    物、修飾された天然の化合物、合成化合物および組み換
    え的に生産された化合物あるいはこれらの組合せから選
    択される請求項２８に記載の組成物
  31. 【請求項３１】該結合マトリックスが天然に存在する化
    合物、修飾された天然の化合物、合成化合物および組み
    換え的に生産された化合物から選択されており、また該
    結合マトリックスがポリペプチド、ポリヌクレオチドお
    よび多糖類あるいはこれらの組合せから選ばれた構成要
    素からなる請求項２８に記載の組成物
  32. 【請求項３２】該ポリメリック相互作用がイオン相互作
    用、水素結合、双極子相互作用、あるいは上記の組合せ
    から選択されており、該イオン相互作用がポリカチオン
    相互作用あるいはポリイオン相互作用を含む請求項２８
    に記載の組成物
  33. 【請求項３３】生体内あるいは生体外で細胞効果を細胞
    あるいは生物に含まれる細胞にデリバリーするプロセス
    であり、該プロセスは該モノマー単位が細胞作動体を含
    む請求項２８に記載の多重コンプレックス組成物を提供
    すること、および該組成物を投与するこからなることを
    特徴とするプロセス
  34. 【請求項３４】生体内あるいは生体外で遺伝子あるいは
    その断片を細胞あるいは生物に含まれる細胞にデリバリ
    ーするプロセスであり、該プロセスは、該モノマー単位
    が該遺伝子あるいは遺伝子断片を含む請求項２８に記載
    の多重コンプレックス組成物を提供すること、および該
    組成物を投与することからなることを特徴とするプロセ
    ス
  35. 【請求項３５】荷電ポリマーに付加された一個以上の成
    分からなる多重な組成物であり、該荷電ポリマーがポリ
    カチオンポリマー、ポリイオンポリマー、ポリマー、ポ
    リヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチドおよびポ
    リヌクレオチド類似体あるいは上記の組合せから選択さ
    れていることを特徴とする組成物
  36. 【請求項３６】該成分が蛋白質からなり、該蛋白質がポ
    リクロンあるいモノクロン抗体およびF(ab')2 断片ある
    いは両者から選択され、必要ならば該抗体が更に酵素か
    らなる標的とコンプレックスをつくっている請求項３５
    に記載の多重組成物
  37. 【請求項３７】細胞に導入されたとき、本来備わってい
    ないポリメラーゼをコードし発現する核酸構築物であ
    り、該ポリメラーゼは該構築物から１コピー以上の核酸
    配列を生産することができることを特徴とする核酸構築
    物
  38. 【請求項３８】更に該本来備わっていないポリメラーゼ
    に対する認識部位を含んでおり、該認識部位が該本来備
    わっていないポリメラーゼに対するプライマーに相補的
    であり、該プライマーは転移ＲＮＡ(tＲＮＡ) からなっ
    ており、該本来備わっていないポリメラーゼはＤＮＡポ
    リメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素ある
    いはこれらの組合せから選択されるメンバーからなり、
    該ＲＮＡポリメラーゼはT3、T7、およびSP6 あるいはこ
    れらの組合せから選択されるバクテリオファージＲＮＡ
    ポリメラーゼからなる請求項３７に記載の構築物
  39. 【請求項３９】細胞に導入されたとき、本来備わってい
    ないプロセシング要素からなる核酸生産物を生産する核
    酸構築物であり、該プロセシング要素はプロセシングの
    間に相当量除かれることを特徴とする核酸構築物
  40. 【請求項４０】該プロセシング要素が、イントロン、ポ
    リアデニル酸付加信号およびキャッピング要素あるいは
    上記の組合せから選択されるＲＮＡプロセシング要素か
    らなる請求項３９に記載の構築物
  41. 【請求項４１】該核酸生産物がアンチセンスＲＮＡ、ア
    ンチセンスＤＮＡ、センスＲＮＡ、センスＤＮＡ、リボ
    ザイムおよび蛋白質結合核酸配列、あるいは上記の組合
    せから選択され、該蛋白質結合核酸配列がウイルス会合
    あるいはウイルス複製に必要とされる蛋白質を結合する
    おとりを含む請求項４０に記載の構築物
  42. 【請求項４２】細胞中で機能をもつためにプロセシング
    を必要とする核酸生産物を選択的に発現するプロセスで
    あり、該プロセスは、(i) 適合細胞中で、プロセシング
    要素がプロセシングの間に相当量除かれる本来備わって
    いないプロセシング要素からなる核酸生産物を細胞に導
    入されたとき、生産する核酸構築物を提供すること、お
    よび(ii)生体内あるいは生体外で核細胞の中に該構築物
    を導入することからなることを特徴とするプロセス
  43. 【請求項４３】一次核酸成分からなる組成物であって、
    原核あるい真核細胞に導入されると、核酸生産物あるい
    は三次核酸成分あるいは両者を生産することができる二
    次核酸成分を生産し、該一次核酸成分が該二次あるいは
    三次成分あるいは該核酸生産物に含まれていないことを
    特徴とする組成物
  44. 【請求項４４】該一次核酸成分が核酸、核酸構築物、核
    酸抱合物、ウイルス、ウイルス断片、ウイルスベクタ
    ー、ヴイロイド、ファージ、プラスミド、プラスミドベ
    クター、細菌および細菌断片あるいは上記の組合せから
    選択されており、そして該一次核酸成分が一本鎖、二本
    鎖、部分的二本鎖であり、該一次核酸成分がＤＮＡ、Ｒ
    ＮＡ、および核酸類似体、あるいはこれらの組合せから
    選択され、該ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは両者が修飾され
    ている請求項４３に記載の組成物
  45. 【請求項４５】該二次核酸成分あるいは該三次核酸成分
    が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドおよ
    びＤＮＡーＲＮＡキメラ、あるいは上記の組合せから選
    択される請求項４３に記載の組成物
  46. 【請求項４６】更に信号プロセシング配列からなり、該
    信号プロセシング配列は、プロモーター、イニシエータ
    ー、ターミネーター、イントロンおよび上記の組合せか
    ら選択されており、該信号プロセシング配列が該一次核
    酸成分、該二次核酸成分、該核酸生産物および該三次核
    酸成分あるいは上記の組合せから選択される要素に含ま
    れている請求項４３に記載の組成物
  47. 【請求項４７】該核酸生産物がアンチセンスＲＮＡ、ア
    ンチセンスＤＮＡ、リボザイムおよび蛋白質結合核酸配
    列あるいは上記の組合せから選択され、該蛋白質結合核
    酸配列がウイルス会合あるいはウイルス複製に必要とさ
    れる蛋白質を結合するおとりからなる、そして該成分あ
    るい核酸生産がウイルスベクター、ファージベクターお
    よびプラスミドベクターあるいはこれらの組合せから選
    択されたベクターにより仲介される請求項４３に記載の
    組成物
  48. 【請求項４８】請求項４３に記載の組成物を含む原核あ
    るいは真核細胞であり、該組成物が生体内あるいは生体
    外で該細胞に導入されている細胞
  49. 【請求項４９】請求項４３に記載の組成物から生産され
    る二次あるいは三次核酸成分あるいは核酸生産物
  50. 【請求項５０】原核あるいは真核細胞中に存在すると
    き、非天然核酸生産物を生産する核酸成分を含む重要な
    組成物であり、該生産物は(i) 配置体の部分および（i
    i) 対象となる核酸配列を含むことを特徴とする組成物
  51. 【請求項５１】該配置体の部分(i) が該非天然核酸生産
    物の配置を許すに十分であり、該配置体の部分(i) が細
    胞質あるいは核配置信号配列を含んでいる請求項５０に
    記載の組成物
  52. 【請求項５２】該対象となる核酸配列（ii) がＤＮＡ、
    ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ−Ｒ
    ＮＡキメラ、あるいは上記の組合せから選択され、該Ｒ
    ＮＡが蛋白質分子とコンプレックスをつくった核配置Ｒ
    ＮＡからなり、該核配置ＲＮＡがSnＲＮＡからなり、該
    SnＲＮＡがU1あるいはU2あるいは両者からなる請求項５
    ０に記載の組成物
  53. 【請求項５３】該非天然核酸生産物がアンチセンスＲＮ
    Ａ、アンチセンスＤＮＡ、センスＲＮＡ、センスＤＮ
    Ａ、チボザイムおよび蛋白質結合核酸配列から選１０
    れ、該蛋白質結合核酸配列がウイルス会合あるいはウイ
    ルス複製に必要な蛋白質を結合するおとりからなる請求
    項５０に記載の組成物
  54. 【請求項５４】該非天然核酸生産物がアンチセンスＲＮ
    ＡあるいはアンチセンスＤＮＡからなり、該配置体の部
    分(i) が核配置信号配列あるいは細胞質配置信号配列か
    らなるような、あるいは該非天然核酸生産物がセンスＲ
    ＮＡあるいはセンスＤＮＡからなり、該配置体の部分
    (i) が細胞質配置信号配列からなるような請求項５０に
    記載の組成物
  55. 【請求項５５】請求項５０に記載の組成物を含む原核あ
    るいは真核細胞であり、該組成物が該細胞に生体内ある
    いは生体外で導入されていることを特徴とする細胞
  56. 【請求項５６】請求項５０に記載の細胞を含む生物学的
    システムであり、該システムは生物、器官、組織および
    培養物あるいはこれらの組合せから選択されることを特
    徴とするシステム
  57. 【請求項５７】真核細胞中で核酸成分の配置のためのプ
    ロセスであり、該プロセスが(a) 細胞中に存在すると
    き、(i) 配置体および(ii)対象となる核酸配列からなる
    非天然核酸生産物を生産する核酸成分からなる重要な組
    成物を提供し、(b) 該組成物を該細胞あるいは該細胞を
    含む生物学的システムに導入することからなることを特
    徴とするプロセス
  58. 【請求項５８】細胞中に導入されると、一個以上の特異
    な核酸配列を生産することができる核酸成分であり、こ
    のようにして生産された該特異的配列のそれぞれがお互
    いに相当に非相同的であり、そして細胞中の対象となる
    一本鎖核酸の特定の蛋白質に結合できるかいずれかであ
    ることを特徴とする核酸成分
  59. 【請求項５９】該成分が核酸、核酸構築物、核酸抱合
    物、ウイルス、ウイルス断片、ウイルスベクター、ファ
    ージ、プラスミド、細菌および細菌断片、あるいは上記
    のいかなる組合せから誘導されるか選択され、該核酸が
    ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、あるいはこれらの
    組合せから選択され、そして該ＤＮＡあるいはＲＮＡが
    修飾される請求項５８に記載の核酸成分
  60. 【請求項６０】一個以上のプロモーターあるいは一個以
    上のイニシエーターあるいは両者のいずれかからなり、
    それぞれの該特異的核酸配列生産物が、異なるプロモー
    ター、異なるイニシエーターあるいは両者の組合せのい
    ずれかから独立に生産されることができ、該特異的核酸
    配列生産物がウイルス性あるいは細胞性ＲＮＡに相補的
    であるかあるいはウイルス性あるいは細胞性蛋白質に結
    合するか、あるいは上記の組合せのいずれかであり、該
    相補的な特異的核酸配列生産物がアンチセンスとして働
    くことができる請求項５８に記載の核酸成分
  61. 【請求項６１】該ウイルス性あるいは細胞性蛋白質が配
    置蛋白質あるいはおとり蛋白質からなり、該配置蛋白質
    が該配置蛋白質あるいは細胞蛋白質配置蛋白質からな
    り、該おとり蛋白質がウイルス会合あるいはウイルス複
    製に必要な蛋白質を結合するような請求項５８に記載の
    核酸成分
  62. 【請求項６２】対象となるウイルスに対する細胞の耐性
    を増加するプロセスであり、該プロセスは(a)(i)該ウイ
    ルスに表現型的に耐性の形質転換原核あるいは真核細胞
    および(ii)該ウイルスあるいは該細胞上のウイルス特異
    的部位に結合することのできる試薬を提供すること、お
    よび(b) 対象となるウイルスに対する該細胞の耐性を増
    加するために該試薬を該細胞を含めた生物学的システム
    に生体内あるいは生体外で投与することを含むことを特
    徴とするプロセス
  63. 【請求項６３】該生物学的システムが、生物、器官、お
    よび組織あるいはこれらの組合せから選択され、該ウイ
    ルス耐性細胞(i) がアンチセンスＲＮＡ、アンチセンス
    ＤＮＡ、センスＲＮＡ、センスＤＮＡ、リボザイムおよ
    び蛋白質結合核酸配列、あるいは上記の組合せから選択
    され、該ウイルス結合試薬(ii)がモノクロンあるいはポ
    リクロン抗体、ウイルス結合蛋白質、細胞受容体蛋白質
    およびウイルス結合蛋白質を刺激することのできる薬
    剤、あるいは上記の組合せである請求項６２に記載のプ
    ロセス
  64. 【請求項６４】該追加のウイルス耐性促進薬剤(iii) が
    プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、あるいはこ
    れらの組合せから選択され、追加のウイルス耐性促進薬
    剤(iii) が該結合試薬(ii)の投与の前あるい後あるいは
    ほぼ同時に投与される請求項６２に記載のプロセス
  65. 【請求項６５】請求項６２に記載のプロセスによりつく
    られた増加したウイルス耐性細胞をもつことを特徴とす
    る生物学的システム
  66. 【請求項６６】細胞に導入されたとき、非天然生産物を
    生産する核酸構築物であり、該生産物が二つの成分(i)
    一細胞性成分に結合できる結合成分と(ii)該生産物に結
    合したとき該細胞成分を転置することができる配置成分
    からなることを特徴とする核酸構築物
  67. 【請求項６７】該生産物が蛋白質あるいは核酸あるいは
    両者の組合せからなり、該蛋白質がポリクロンあるいは
    モノクロンからなり、該ポリクロンあるいはモノクロン
    抗体が細胞内の細胞成分に対してつくられている請求項
    ６６に記載の構築物
  68. 【請求項６８】該細胞性成分が核酸、蛋白質、ウイル
    ス、ファージ、他の構築物からの生産物、代謝物、およ
    びアロステリック化合物あるいは上記の組合せから選択
    され、該蛋白質がウイルス性あるいは非ウイルス性酵
    素、遺伝子サプレッサー、リン酸化蛋白質あるいは上記
    の組合せから選択され、該リン酸化蛋白質が癌遺伝子か
    らなる請求項６６に記載の構築物
  69. 【請求項６９】細胞中で細胞内成分の転置のためのプロ
    セスであり、該プロセスは(i) 細胞に導入されたとき、
    非天然生産物を生産する核酸構築物であり、該生産物が
    二つの成分(i) 細胞成分に結合することができる結合成
    分と(ii)該生産物に結合したとき該細胞内成分を転置で
    きる配置成分である核酸構築物を提供すること、および
    (ii)対象となる細胞あるいは対象となる細胞を含む生物
    学的システムに該核酸構築物を導入することからなるこ
    とを特徴とするプロセス
JP8360043A 1995-12-15 1996-12-16 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物 Pending JPH09313190A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57444395A 1995-12-15 1995-12-15
US08/574,443 1995-12-15

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007044471A Division JP2007135605A (ja) 1995-12-15 2007-02-23 核酸構築物
JP2009034845A Division JP2009100782A (ja) 1995-12-15 2009-02-18 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物
JP2009165373A Division JP2009232862A (ja) 1995-12-15 2009-07-14 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH09313190A true JPH09313190A (ja) 1997-12-09

Family

ID=24296155

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8360043A Pending JPH09313190A (ja) 1995-12-15 1996-12-16 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物
JP2007044471A Pending JP2007135605A (ja) 1995-12-15 2007-02-23 核酸構築物
JP2009034845A Pending JP2009100782A (ja) 1995-12-15 2009-02-18 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物
JP2009165373A Pending JP2009232862A (ja) 1995-12-15 2009-07-14 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007044471A Pending JP2007135605A (ja) 1995-12-15 2007-02-23 核酸構築物
JP2009034845A Pending JP2009100782A (ja) 1995-12-15 2009-02-18 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物
JP2009165373A Pending JP2009232862A (ja) 1995-12-15 2009-07-14 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物

Country Status (5)

Country Link
US (8) US20030104620A1 (ja)
EP (2) EP2042606A1 (ja)
JP (4) JPH09313190A (ja)
CA (4) CA2279673A1 (ja)
DE (1) DE69637683D1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001025400A (ja) * 1999-05-12 2001-01-30 Bunshi Biophotonics Kenkyusho:Kk 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法
JP2010200760A (ja) * 2002-03-12 2010-09-16 Enzo Life Sciences Inc リアルタイム核酸検出法と組成物
US10144957B2 (en) 2002-03-12 2018-12-04 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2279673A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acids for therapeutic and diagnostic uses
JP2001518804A (ja) 1997-03-21 2001-10-16 エンゾー セラピューティクス インコーポレイテッド ベクターおよびウイルスベクター、およびこれらを増殖するためのパッケージング細胞株
US8703480B1 (en) 1997-03-21 2014-04-22 Enzo Therapeutics, Inc. Biological function effecting viral vectors and chimeric cells useful as packaging cell lines and target cells
US6555367B1 (en) 1997-10-10 2003-04-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CN101818145A (zh) 1998-03-20 2010-09-01 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
WO2000074635A2 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Mirus Corporation Delivery of single stranded dna for expression
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US6995258B1 (en) * 2000-05-25 2006-02-07 City Of Hope Nucleolar targeting of therapeutics against HIV
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
US6989261B2 (en) 2001-12-20 2006-01-24 Eli Lilly And Company Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
US7049121B2 (en) 2001-12-20 2006-05-23 Applied Molecular Evolution Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
CA2487274A1 (en) * 2002-05-06 2003-11-13 Nucleonics Inc. Spermine chemically linked to lipids and cell-specific targeting molecules as a transfection agent
EP1532159A4 (en) * 2002-06-20 2009-10-21 Univ Maryland Biotech Inst MALEIMIDES CLUSTERS ON SCAFFOLDING FOR PLURIVALENT PEPTIDE ASSEMBLIES
US20100144038A1 (en) * 2003-03-04 2010-06-10 Masato Miyake Composition And Method For Increasing Efficiency Of Introduction Of Target Substance Into Cell
US20040265870A1 (en) * 2003-04-09 2004-12-30 Invitrogen Corporation Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules
WO2005026356A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified gene-silencing nucleic acid molecules and uses thereof
US7951580B2 (en) * 2004-04-21 2011-05-31 The Regents Of The University Of California Automated, programmable, high throughput, multiplexed assay system for cellular and biological assays
US7695954B2 (en) * 2004-10-04 2010-04-13 The Regents Of The University Of California Micropatterned plate with micro-pallets for addressable biochemical analysis
EP2010668A4 (en) * 2006-04-10 2009-04-29 Univ California SYSTEMS AND METHOD FOR THE EFFICIENT COLLECTION OF INDIVIDUAL CELLS AND CELL COLONIES AND FOR THE QUICK PRODUCTION OF STABILIZED TRANSFECTANTS
WO2009015361A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 The Regents Of The University Of California Use of photosensitized epon epoxy resin 1002f for mems and biomems applications
US9487745B2 (en) 2007-07-27 2016-11-08 The Regents Of The University Of California Micro-patterned plate composed of an array of releasable elements surrounded with solid or gel walls
US20090162845A1 (en) * 2007-12-20 2009-06-25 Elazar Rabbani Affinity tag nucleic acid and protein compositions, and processes for using same
CA2947741A1 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Thetis Pharmaceuticals Llc Compositions and methods relating to ionic salts of peptides
WO2019036682A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. RNA VARIANTS POLYMERASE
US12428641B2 (en) 2017-09-15 2025-09-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation RNA molecules
AU2019269066B2 (en) * 2018-05-18 2022-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Targeted intracellular delivery of large nucleic acids
US12416639B2 (en) 2018-12-21 2025-09-16 Jingjie PTM Biolab (Hangzhou) Co., Inc. Reagents and methods for detecting protein lysine lactylation
AU2020224103A1 (en) 2019-02-20 2021-09-16 Modernatx, Inc. Rna polymerase variants for co-transcriptional capping

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995028494A1 (en) * 1994-04-15 1995-10-26 Targeted Genetics Corporation Gene delivery fusion proteins

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4847240A (en) * 1978-01-16 1989-07-11 The Trustees Of Boston University Method of effecting cellular uptake of molecules
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5241060A (en) 1982-06-23 1993-08-31 Enzo Diagnostics, Inc. Base moiety-labeled detectable nucleatide
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US5260433A (en) 1982-06-23 1993-11-09 Enzo Diagnostics, Inc. Saccharide specific binding system labeled nucleotides
CA1209501A (en) * 1982-09-16 1986-08-12 Nikos Panayotatos Expression vector
US4687732A (en) 1983-06-10 1987-08-18 Yale University Visualization polymers and their application to diagnostic medicine
US4707440A (en) 1984-01-30 1987-11-17 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay
US4843122A (en) 1984-01-30 1989-06-27 Enzo Biochem, Inc. Detectable molecules, method of preparation and use
US5288609A (en) * 1984-04-27 1994-02-22 Enzo Diagnostics, Inc. Capture sandwich hybridization method and composition
US4795706A (en) 1985-01-31 1989-01-03 Eli Lilly And Company Novel expression control sequences
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5128256A (en) * 1987-01-12 1992-07-07 Stratagene DNA cloning vectors with in vivo excisable plasmids
US5811088A (en) * 1987-02-20 1998-09-22 Emory University Antiinfective compounds and methods of use
US5166320A (en) 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
EP0331939B1 (en) * 1988-02-16 2001-11-14 Greatbatch Gen-Aid, Ltd Modified cells having resistance to retroviral infection
US5429948A (en) * 1988-03-02 1995-07-04 Gentest Corporation Human cell line stably expressing 5cDNAS encoding procarcinogen-activating enzymes and related mutagenicity assays
US5633152A (en) * 1988-06-24 1997-05-27 Carnegie Institution Of Washington Method of controlling viral growth
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5144019A (en) * 1989-06-21 1992-09-01 City Of Hope Ribozyme cleavage of HIV-I RNA
IT1230297B (it) * 1989-07-05 1991-10-18 Carmelo Lo Duca Siringa utilizzabile una sola volta.
HUT62654A (en) * 1990-05-28 1993-05-28 Univ Osaka Res Found Process for producing plasmid capable of expressing retrovirus gene and processing it after translation, as well its expression products
US5196348A (en) * 1990-06-11 1993-03-23 Air Products And Chemicals, Inc. Perfluoro-crown ethers in fluorine magnetic resonance spectroscopy of biopsied tissue
AU652566B2 (en) * 1990-06-18 1994-09-01 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Eukaryotic expression vector system
GB9016973D0 (en) * 1990-08-02 1990-09-19 Medical Res Council Viral growth inhibition
US5595978A (en) * 1990-08-16 1997-01-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and method for treatment of CMV retinites
CA2072758A1 (en) 1990-09-14 1992-03-15 Kenneth Francis Buechler Antibodies to complexes of ligand receptors and ligands and their utility in ligand-receptor assays
US5171217A (en) * 1991-02-28 1992-12-15 Indiana University Foundation Method for delivery of smooth muscle cell inhibitors
JP3220180B2 (ja) * 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
DK0593618T3 (da) * 1991-06-27 1998-11-23 Genelabs Tech Inc Screeningsassay til påvisning af DNA-bindende molekyler
EP0597010A4 (en) 1991-07-31 1996-12-27 Rhone Poulenc Rorer Int Transgenic protein production.
DE59209203D1 (de) * 1991-08-28 1998-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Primer für matrizenabhängige enzymatische nukleinsäuresynthesen
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5413999A (en) 1991-11-08 1995-05-09 Merck & Co., Inc. HIV protease inhibitors useful for the treatment of AIDS
DE69232435T2 (de) * 1991-12-18 2002-07-18 New England Biolabs, Inc. Rekombinante thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie
US5827935A (en) * 1992-05-27 1998-10-27 City Of Hope Chimeric tRNAlys -ribozyme molecules
US5587308A (en) * 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6503755B1 (en) * 1992-10-13 2003-01-07 Armand Keating Particle transfection: rapid and efficient transfer of polynucleotide molecules into cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) * 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
DE69333930T8 (de) 1993-01-22 2007-02-22 The Regents Of The University Of Colorado, Boulder Lokalisierung von therapeutischen mitteln
DE69434067T2 (de) * 1993-03-08 2006-03-02 Merck & Co., Inc. Menschliche neuronale nikotin-acetylcholin-rezeptor-verbindungen und methoden ihres einsatzes
EP0752853B1 (en) * 1993-03-10 2005-09-21 Smithkline Beecham Corporation Human brain phosphodiesterase
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5591601A (en) * 1993-05-14 1997-01-07 Ohio University Edison Animal Biotechnology Institute DNA polymerase gene expression system utilizing an RNA polymerase co-delivered with the gene expression vector system
WO1994027643A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Targeted Genetics Corporation Envelope fusion vectors for use in gene delivery
DE4318387A1 (de) * 1993-06-03 1994-12-08 Bayer Ag Rekombinante Foamy Virus Vektoren für medizinische und diagnostische Anwendungen sowie Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Foamy Virus Vektoren
CA2162925A1 (en) * 1993-06-18 1995-01-05 Witold Filipowicz Chimeric plant genes possessing independent regulatory sequences
US5739309A (en) * 1993-07-19 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens
US5532130A (en) * 1993-07-20 1996-07-02 Dyad Pharmaceutical Corporation Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
US5547862A (en) * 1993-07-29 1996-08-20 Ambion Inc. Vectors containing multiple promoters in the same orientation
GB9317380D0 (en) * 1993-08-20 1993-10-06 Therexsys Ltd Transfection process
US5683869A (en) * 1993-09-03 1997-11-04 Duke University Method of nucleic acid sequencing
GB9319772D0 (en) 1993-09-24 1993-11-10 Therexsys Ltd Therapeutic agent
JPH0799976A (ja) * 1993-09-30 1995-04-18 Takeda Chem Ind Ltd 修飾オリゴヌクレオチド
US5614559A (en) * 1993-11-23 1997-03-25 Procept Inc. Compound for inhibiting HIV infectivity
US5712384A (en) * 1994-01-05 1998-01-27 Gene Shears Pty Ltd. Ribozymes targeting retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US5576201A (en) * 1994-01-14 1996-11-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells
US5561043A (en) * 1994-01-31 1996-10-01 Trustees Of Boston University Self-assembling multimeric nucleic acid constructs
US5686278A (en) 1994-03-25 1997-11-11 Indiana University Foundation Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer
CA2158926A1 (en) * 1994-05-13 1995-11-14 Douglas J. Jolly Compositions and methods for targeting gene delivery vehicles
WO1995032225A1 (en) * 1994-05-23 1995-11-30 The Salk Institute For Biological Studies Method for site-specific integration of nucleic acids and related products
US5733781A (en) * 1994-07-19 1998-03-31 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
US6538107B1 (en) * 1994-09-30 2003-03-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. G protein coupled receptor protein production, and use thereof
US5734039A (en) 1994-09-15 1998-03-31 Thomas Jefferson University Antisense oligonucleotides targeting cooperating oncogenes
CA2279673A1 (en) 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acids for therapeutic and diagnostic uses
US5814500A (en) * 1996-10-31 1998-09-29 The Johns Hopkins University School Of Medicine Delivery construct for antisense nucleic acids and methods of use
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US5989814A (en) * 1997-04-01 1999-11-23 Reagents Of The University Of California Screening methods in eucaryotic cells
JP2002516256A (ja) * 1998-05-26 2002-06-04 アイ・シー・エヌ・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド 二環式糖成分を有する新規ヌクレオシド
US6242589B1 (en) * 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
JP5179697B2 (ja) * 2001-07-10 2013-04-10 ジョンソン・アンド・ジョンソン・リサーチ・プロプライエタリー・リミテッド 造血前駆細胞を遺伝的に改変する方法及び改変された細胞の使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995028494A1 (en) * 1994-04-15 1995-10-26 Targeted Genetics Corporation Gene delivery fusion proteins

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001025400A (ja) * 1999-05-12 2001-01-30 Bunshi Biophotonics Kenkyusho:Kk 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法
JP2010200760A (ja) * 2002-03-12 2010-09-16 Enzo Life Sciences Inc リアルタイム核酸検出法と組成物
JP2014198056A (ja) * 2002-03-12 2014-10-23 エンゾ ライフ サイエンシズ、インコーポレイテッド リアルタイム核酸検出法と組成物
US10144957B2 (en) 2002-03-12 2018-12-04 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes

Also Published As

Publication number Publication date
EP0779365A2 (en) 1997-06-18
US20080248564A1 (en) 2008-10-09
US20010007767A1 (en) 2001-07-12
JP2009100782A (ja) 2009-05-14
US8735145B2 (en) 2014-05-27
CA2190304A1 (en) 1997-06-16
US20010006814A1 (en) 2001-07-05
US20010006816A1 (en) 2001-07-05
US20030087434A1 (en) 2003-05-08
EP0779365A3 (en) 1999-11-24
CA2279675A1 (en) 1997-06-16
DE69637683D1 (de) 2008-10-30
CA2279673A1 (en) 1997-06-16
US20080108139A1 (en) 2008-05-08
US20030104620A1 (en) 2003-06-05
JP2007135605A (ja) 2007-06-07
JP2009232862A (ja) 2009-10-15
US20010006815A1 (en) 2001-07-05
CA2279669A1 (en) 1997-06-16
US8846893B2 (en) 2014-09-30
EP2042606A1 (en) 2009-04-01
EP0779365B1 (en) 2008-09-17
US8742090B2 (en) 2014-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8735145B2 (en) Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses
KR20220090512A (ko) 액체암의 치료를 위한 조성물 및 방법
JPH05506991A (ja) 新規タンパク質―ポリカチオン結合体
Westaway et al. Virion encapsidation of tRNA3Lys-ribozyme chimeric RNAs inhibits HIV infection
US20250302993A1 (en) Enzyme, complex, recombinant vector, therapeutic agent for genetic disorder, and polynucleotide
JPH07303485A (ja) Ｈｃｖアンチセンスｒｎａ、それを含む発現ベクター、及び該ｒｎａ又は発現ベクターを含むｈｃｖ関連疾患治療剤
CN110257424B (zh) 一种定点编辑ccr5基因的方法
US20240082327A1 (en) Retroviral vectors
US8703480B1 (en) Biological function effecting viral vectors and chimeric cells useful as packaging cell lines and target cells
US20250177574A1 (en) Retroviral vectors
US20030036056A1 (en) Inhibitors and target molecule co-localization
WO2024163805A1 (en) Methods and compositions for genomic integration
AU774551B2 (en) Vectors for delivering viral and oncogenic inhibitors
CZ200475A3 (cs) Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader
PL175143B1 (pl) Konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060829

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20061124

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20061129

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070223

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070320

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070618

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070621

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070921

A072 Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination]

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A072

Effective date: 20080122

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080818

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080829

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080903

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090218

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090319

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090714

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20090821

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20091023

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110615

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110620

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110722

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110728