JPH09313196A

JPH09313196A - 固定化酵素による配糖体の製造方法

Info

Publication number: JPH09313196A
Application number: JP1675697A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Kunieda; 勉国枝; Hironori Murase; 博宣村瀬
Original assignee: CCI Corp
Current assignee: CCI Corp
Priority date: 1996-03-27
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 1997-12-09
Anticipated expiration: 2017-01-30
Also published as: JP3809686B2

Abstract

(57)【要約】【課題】水溶性の生理活性に優れた配糖体を効率よく
得る製造方法を提供する。【解決手段】多孔質キトサンビーズに糖転移作用を触
媒する酵素を固定化させた固定化酵素を用いて、水酸基
を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを有機
溶媒共存下において結合させることにより、生理活性に
優れた水溶性配糖体を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、固定化酵素を用い
た各種配糖体の製造方法に関するものである。詳しく述
べると、本発明は、有機溶媒共存下において、多孔質キ
トサンビーズに固定化したα−グルコシダーゼを用い
て、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と
糖とを反応させることにより、生理活性に優れた様々な
水溶性配糖体を製造する方法に関するものである。ま
た、本発明は、バチルスステアロサーモフィラス（Ba
cillus stearothermophylus,以下同様につき括弧内を省
略する）由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビ
ーズに固定化することにより、有機溶媒共存下において
も長期間安定である固定化酵素を調製し、該固定化酵素
を用いて、生理活性および化学的安定性に優れた水溶性
配糖体を製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、食品や化粧品等の分野においては
糖転移作用を触媒する酵素を利用して生理活性に優れた
物質等を製造する技術が注目されている。

【０００３】上記糖転移作用を有する代表的な酵素とし
てはα−グルコシダーゼがあるが、このα−グルコシダ
ーゼは、α−グルコシド結合を持つ基質の非還元末端側
から加水分解し、α−グルコースを生成する加水分解酵
素（エキソグリコシダーゼ）の総称であるが、一方で、
糖転移作用を触媒する酵素であることは既に知られてい
る。α−グルコシダーゼの糖転移作用を利用して有用物
質を製造する方法としては、例えば、α−１，６−グル
コシド結合反応を触媒するα−グルコシダーゼをマルト
ースに作用させるとイソマルトースやパノース等の分枝
オリゴ糖を生成することが知られている［澱粉科学，２
６巻，頁５９〜６７（１９７９年）］。

【０００４】一方、酵素の使い捨てによる不経済性及び
酵素の安定性の確保等の観点から、水溶性の酵素を水不
溶性の担体などに固定化することにより、酵素反応工程
を連続化し、酵素を繰り返して使用する研究が進展し、
既に実用化されているものもある。しかしながら、高い
酵素活性を保ちかつ安定で、また汎用性の広い酵素の固
定化法は未だ開発されていないのが現状である。

【０００５】このような酵素の固定化法としては、これ
まで、担体結合法、架橋法、及び包括法等が知られてい
る。また、担体としては、セルロース、澱粉、寒天、ア
ルギン酸ソーダ及びゼラチンなどの天然高分子、または
それらの誘導体、あるいはポリアクリルアミド、ポリエ
チレングリコール、ポリアミノポリスチレン及びポリビ
ニルアルコール等の合成高分子等の有機物、さらには、
粘土、アルミナ、ガラス、セラミック及びステンレス等
の無機物等が用いられている。従来から、食品や化粧品
等の分野においては、弱塩基性アニオン交換樹脂、弱酸
性カチオン交換樹脂等のイオン交換樹脂や多孔質の合成
吸着樹脂等を利用した固定化法が広く用いられていた。
さらに、これらの方法に加えて、近年、キチンやキトサ
ンが新しい素材として魅力のある天然高分子資源として
期待され研究されてきたことに伴い、キトサンビーズを
応用した固定化法が注目を集めている。キトサンビーズ
に固定化した酵素を用いて有用物質を製造する方法とし
ては、例えば、キトサンビーズを用いて固定化したシク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼをマルトー
ス等に作用させ転移糖を製造する技術が開示されている
（特公平７−７１４８９号公報）。

【０００６】しかしながら、上記方法を始めとして、一
般に糖転移作用を触媒する酵素を用いて有用な物質を製
造する場合、転移率の確保や酵素の安定性等の点からそ
の反応は水溶液中で行われ、従って、その反応の基質と
なる物質もほとんどが水溶性の物質であり、水に難溶な
物質は上記反応には基質として用いることが困難である
という問題があった。

【０００７】このような従来の問題点を考慮して、本発
明者らは、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた
物質を何らかの方法で水溶性にすることができれば、そ
の物質の用途は飛躍的に拡大すると考え、糖転移作用を
触媒する酵素を用いて、水酸基を有する水に難溶な抗酸
化物質と糖とを有機溶媒の存在下において反応させるこ
とにより、新規な水溶性抗酸化剤を製造する技術を開発
した（特開平７−１１８２８７号公報）。上記公報は、
クロマノール配糖体を製造するにあたって有機溶媒中に
溶解させた、下記一般式（２）：

【０００８】

【化２】

【０００９】（ただし、式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³ および
Ｒ⁴は同一または異なる水素原子または低級アルキル
基、Ｒ⁵は水素原子、低級アルキル基または低級アシル
基を表わし、およびｎは０〜４の整数である）で表わさ
れる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコ
ール」と称する）と、糖溶液とを糖転移作用を触媒する
酵素の存在下で反応させることにより、下記一般式
（３）：

【００１０】

【化３】

【００１１】（ただし、式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³ および
Ｒ⁴は同一または異なる水素原子または低級アルキル
基、Ｒ⁵は水素原子、低級アルキル基または低級アシル
基、Ｘは単糖残基またはオリゴ残基を表わし、糖残基の
水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基
で置換されていてもよく、およびｎは０〜４の整数であ
り、ｍは１〜６の整数である）で示されるクロマノール
配糖体を製造する方法を開示するものである。

【００１２】しかしながら、上記方法は、酵素を糖溶液
と２−置換アルコール溶液との混合溶液中に直接添加す
る方法であり、反応液中で酵素が溶液の状態で存在して
いるため、酵素の再使用ができず使い捨てとなってしま
い、高価な酵素の使い捨てによる経済性の面から工業的
に実施するには不充分であるという欠点があった。ま
た、実際に工業化を考えた場合、反応液中の２−置換ア
ルコールの濃度をさらに高め、かつ、転移率を上げる必
要があるが、本発明者らの調査の結果、上記特開平７−
１１８２８７号公報に開示される方法で用いられる酵素
は、有機溶媒の濃度の増加に伴い安定性が減少すること
が明らかとなった。そのため、２−置換アルコールの量
を増やすために反応系における有機溶媒の濃度を高める
ことは困難であり、有機溶媒存在下における酵素の安定
性の面からも工業的に実施するには不充分であるという
欠点を有するものであった。したがって、工業化に適す
るだけの転移率を達成し得る水溶性クロマノール配糖体
の製造方法は十分確立されているとは言えないものであ
った。

【００１３】さらに、糖転移反応を触媒する酵素をキト
サンビーズに固定化した例は多数報告されているが、本
発明によるα−グルコシダーゼをキトサンビーズに固定
化した例はいまだ報告されていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、新規な固定化酵素を用いた配糖体の製造方法を
提供することである。

【００１５】また、本発明の他の目的は、α−グルコシ
ダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化し、その固定化
酵素を用いて水酸基を有する水に難溶性の生理活性に優
れた物質と糖とを結合させ、水溶性の生理活性に優れた
配糖体を効率よく製造する技術を提供することにある。

【００１６】また、本発明のさらなる他の目的は、バチ
ルスステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダー
ゼを多孔質キトサンビーズに固定化することにより、有
機溶媒共存下において長期間安定な固定化酵素を調製
し、該固定化酵素を用いて、化学的安定性及び生理活性
に優れた配糖体を効率よく製造する技術を提供すること
にある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記諸目
的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、多孔質キト
サンビーズにα−グルコシダーゼを固定化することによ
り、該酵素が極めて効果的に担体上に吸着され、有機溶
媒との共存下においても酵素の高活性が保持および発現
されることを見い出した。さらに、本発明者らは、この
ようにして得られた固定化酵素を用いることにより、水
酸基を有する水に難溶な物質についても糖と結合させて
各種配糖体を有機溶媒との共存下においても効率よく製
造することが可能であることを見い出した。

【００１８】さらにまた、本発明者らは、上記目的を達
成するためにさらに鋭意研究を重ねた結果、多孔質キト
サンビーズにバチルスステアロサーモフィラス由来の
α−グルコシダーゼを固定化することにより、高濃度の
有機溶媒の共存下においても、酵素の高活性が長期間保
持および発現されることをも発見した。

【００１９】これらの知見に基づいて、本発明を完成す
るに至った。

【００２０】すなわち、上記諸目的は下記（１）から
（７）のいずれかにより達成される。

【００２１】（１）多孔質キトサンビーズにα−グル
コシダーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、水酸基
を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを有機
溶媒共存下において反応させ、生理活性に優れた水溶性
配糖体を生成することを特徴とする各種配糖体の製造方
法。

【００２２】（２）上記固定化酵素は多孔質キトサン
ビーズを架橋剤で架橋処理した後に酵素を固定化させた
ものである前記（１）記載の方法。

【００２３】（３）上記多孔質キトサンビーズの粒径
が０．５〜３．０ｍｍである前記（１）または（２）記
載の方法。

【００２４】（４） α−グルコシダーゼの多孔質キト
サンビーズ上への固定化量が、該多孔質キトサンビーズ
１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇである前
記（１）から（３）いずれかに記載の方法。

【００２５】（５）上記配糖体が下記一般式（１）：

【００２６】

【化４】

【００２７】［ただし、式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³ および
Ｒ⁴は同一または異なる水素原子または低級アルキル基
を表わし、Ｒ⁵ は水素原子、低級アルキル基または低級
アシル基を表わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコ
ース残基中の水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の
低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシ
ル基で置換されていてもよい）を表わし、ｎは０〜４の
整数である］で表わされるクロマノール配糖体である前
記（１）から（４）いずれかに記載の方法。

【００２８】（６）上記糖がα−グルコシル糖化合物
である前記（１）から（５）いずれかに記載の方法。

【００２９】（７）上記α−グルコシダーゼがバチル
スステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermoph
ylus) 由来である前記（１）から（６）いずれかに記載
の方法。

【００３０】

【発明の実施の形態】本発明の固定化酵素による配糖体
の製造方法は、固定化担体としての多孔質キトサンビー
ズにα−グルコシダーゼを固定化させ、得られた固定化
酵素を用いて有機溶媒共存下で水酸基を有する水に難溶
な生理活性に優れた物質を糖と結合させることによっ
て、生理活性に優れた水溶性の配糖体を生成することを
特徴とするものである。

【００３１】以下、本発明について詳細に説明する。

【００３２】本発明において固定化担体として用いられ
る多孔質キトサンビーズは、カニやエビなどの甲殻類の
殻、蚕などの昆虫の甲皮、おきあみやいかなどの軟体動
物の殻や骨骼由来のキチンを４０〜５０％水酸化ナトリ
ウム溶液中で１００〜１２０℃、４〜５時間処理するこ
とによりキチンをＮ−脱アセチル化し、このＮ−脱アセ
チル化物を水洗、乾燥してキトサンを得、さらにこのよ
うにして得られたキトサンを粒状化及び多孔質化して表
面積を大きくして吸着能を高めることによって得られ
る。このような多孔質キトサンビーズの具体例として
は、例えば、キトパールＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−
２６１０、ＢＣＷ−３０１０、ＢＣＷ−３５１０（商品
名；富士紡績株式会社製）等が挙げられる。

【００３３】また、本発明において使用される多孔質キ
トサンビーズの粒径は、特に制限されないが、圧力損失
や粒子表面積等を考慮すると、０．５〜３．０ｍｍが好
ましく、さらに好ましくは、０．５〜１．５ｍｍであ
る。

【００３４】本発明によるα−グルコシダーゼとして
は、ほぼ全ての起源由来のα−グルコシダーゼを用いる
ことができ、精製酵素や粗酵素の別を問わない。具体例
としては、東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属(Sac
charomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、オリエン
タル酵母工業株式会社製のサッカロマイセスセロビイ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のα−グルコシダ
ーゼ、天野製薬株式会社製のアスペルギルスニガー(A
spergillus niger) 由来のα−グルコシダーゼ、和光純
薬工業株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces
sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、シグマ（ＳＩＧＭ
Ａ）社製のベーカーズイースト（Ｂａｋｅｒｓｙｅ
ａｓｔ）由来のα−グルコシダーゼ、東洋紡績株式会社
製のバチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearo
thermophylus) 由来のα−グルコシダーゼ等のバチルス
(Bacillus)属由来のα−グルコシダーゼなどが挙げられ
る。上記α−グルコシダーゼのうち、有機溶媒に対する
優れた安定性および強い転移活性を考慮すると、バチル
スステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダー
ゼ、特に特開平５−３０８９６４号に開示されたバチル
スステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ
が好ましく使用される。

【００３５】本発明による多孔質キトサンビーズの担体
にα−グルコシダーゼを固定化させることにより固定化
酵素を製造する方法としては、水または適当な緩衝液中
で担体と酵素とを接触させる方法を用いることができ
る。以下に、多孔質キトサンビーズの担体としてキトパ
ールＢＣＷ−２５１０を用いた際の固定化方法の一実
施態様を示す。キトパールＢＣＷ−２５１０１ｇ
（湿重量）を１０〜１００ｍＭの各種緩衝液（ｐＨ５．
０〜７．０）で充分に平衡化した後、担体１ｇ（湿重
量）に対して、α−グルコシダーゼ０．０１〜１００ｍ
ｇ（比活性２０単位／ｍｇ）、好ましくは１〜１００ｍ
ｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇを同緩衝液１ｍｌに溶
解したものを添加し、充分に混合する。次いで、４〜６
０℃、好ましくは１０〜４０℃にて、１〜２４時間、好
ましくは２〜１５時間静置するか、または０．５〜１０
時間、好ましくは１〜５時間往復振盪処理（５０〜１８
０ｒｐｍ、好ましくは１００〜１４０ｒｐｍ）した後、
濾紙またはガラスフィルターで濾過し、続いて水または
緩衝液で酵素が溶出しなくなるまで洗浄する。なお、上
記実施態様において、特に酵素としてバチルスステア
ロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを用いた際
には、当該α−グルコシダーゼの添加量は、担体１ｇ
（湿重量）に対して、０．０１〜１０ｍｇ（比活性６６
１単位／ｍｇ）、好ましくは０．１〜１ｍｇである。

【００３６】本発明において、α−グルコシダーゼの多
孔質キトサンビーズの担体上への固定化量は、多孔質キ
トサンビーズの架橋処理の有無、使用する多孔質キトサ
ンビーズの種類や量及び酵素の使用量等によって異なる
が、通常、多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当た
り、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍ
ｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇである。また、本発明
において、バチルスステアロサーモフィラス由来のα
−グルコシダーゼを使用する際の担体への固定化量は、
通常、多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、
０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇであ
る。

【００３７】上記実施態様において使用される緩衝液と
しては、生化学及び生物学の分野において一般的に使用
される緩衝液であればよく、具体的には、炭酸−炭酸水
素塩系、リン酸第一塩−リン酸第二塩系、及び両性イオ
ンであるタンパク質やアミノ酸などの緩衝作用による緩
衝液等が挙げられ、これらを目的とするｐＨによる適宜
選択して使用する。

【００３８】本発明において、多孔質キトサンビーズを
用いて上記方法により本発明による固定化酵素を得るこ
とができるが、この際、該固定化酵素をさらに改善する
ことを目的として、多孔質キトサンビーズを架橋剤で前
処理した担体を固定化担体として用いることが好まし
い。このように架橋剤で前処理した担体を用いると、さ
らに有機溶媒共存下においてより高い糖転移活性を示す
固定化酵素を得ることができるという利点がある。

【００３９】本発明において用いられる架橋剤として
は、キトサンビーズと接触したときにキトサンビーズの
アミノ基と結合する能力を有するものであれば、特に制
限されずに使用することができる。この場合、使用でき
る架橋剤の例としては、例えば、グルタルアルデヒド、
エピクロロヒドリン、ビスジアゾベンシジン、ヘキサメ
チレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネート、
ヘキサメチレンジイソチオシアネート及びＮ，Ｎ−エチ
レンビスマレインイミド等が挙げられる。これらの架橋
剤は、単独であるいは２種以上を組み合わせて用いるこ
とができる。これらのうち、グルタルアルデヒド及びエ
ピクロロヒドリンが好ましい。

【００４０】前処理の方法としては、水または上記した
緩衝液中、担体に架橋剤を接触させる方法を用いること
ができる。架橋剤の濃度は、担体に対して、通常、０．
０１〜５（ｖ／ｖ）％の範囲が好ましい。多孔質キトサ
ンビーズの担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０を
およびグルタルアルデヒドを架橋剤として用いた際の前
処理方法の一実施態様を以下に示す：キトパールＢＣ
Ｗ−２５１０１ｇ（湿重量）を２（ｖ／ｖ）％グルタ
ルアルデヒド（以下、「ＧＬＡ」と略す）溶液２ｍｌ中
に浸透させ、４〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃に
て、０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間静置する
か、または０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間往復
振盪処理（５０〜１８０ｒｐｍ、好ましくは１００〜１
４０ｒｐｍ）した後、濾紙またはガラスフィルターで濾
過し、過剰のＧＬＡを除去・洗浄する方法が挙げられ
る。

【００４１】また、上記実施態様におけるα−グルコシ
ダーゼの多孔質キトサンビーズ上への固定化量は、処理
条件や使用する担体の種類等によって異なるが、例え
ば、ＧＬＡ処理したキトパールＢＣＷ−２５１０を固定
化担体として用いる場合、キトパールＢＣＷ−２５１０
１ｇ（湿重量）に対して、上記と同様に緩衝液中で、
０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ、よ
り好ましくは５〜５０ｍｇである。特に上記態様におい
て、α−グルコシダーゼとしてバチルスステアロサー
モフィラス由来のものを使用する際には、固定化量は、
キトパールＢＣＷ−２５１０１ｇ（湿重量）に対し
て、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇで
ある。酵素の固定化担体上への固定化処理は、ＧＬＡに
よる架橋処理と同様の条件で静置または振盪処理によっ
て行なうことができる。この際、未吸着の酵素は、酵素
の溶出がなくなるまで、濾紙またはガラスフィルターで
洗浄を行なうことにより除去することができる。

【００４２】上記のような方法により固定化した場合の
見掛け上の固定化率（％）を、次式により算出した。

【００４３】

【数１】

【００４４】また、酵素の固定化法としては、上記に述
べたほかに、多孔質キトサンビーズ担体をカラムに充填
した後、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液を２〜３時間通液さ
せ、滅菌蒸留水で充分洗浄した後、酵素溶液を通液させ
ることにより固定化する方法を採用することができる。

【００４５】本発明による糖転移反応に使用される糖
は、目的とする配糖体の種類などによって異なるが、例
えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオ
ース、コージビオース、ニゲロース、トレハロース、パ
ノース、イソマルトース、及びイソマルトトリオース等
が挙げられ、これらのうち、マルトースからマルトテト
ラオース位の低分子のマルトオリゴ糖が好ましく、特に
マルトースが好ましい。また、糖の添加濃度は、１〜７
０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３０〜６０（ｗ／ｖ）％で
ある。

【００４６】本発明による固定化酵素を用いて製造され
る配糖体としては、使用される糖及び基質の種類によっ
て様々であるが、例えば、各種クロマノール配糖体、フ
ラボノール配糖体、フラバノン配糖体、フラボン配糖
体、サポニン配糖体、及びカテキン配糖体等が挙げら
れ、これらのうち、好ましくは、特開平７−１１８，２
８７号公報に開示されているような、下記一般式
（１）：

【００４７】

【化５】

【００４８】［ただし、式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³ および
Ｒ⁴は同一または異なる水素原子または低級アルキル基
を表わし、Ｒ⁵は水素原子、低級アルキル基または低級
アシル基を表わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコ
ース残基中の水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の
低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシ
ル基で置換されていてもよい）を表わし、およびｎは０
〜４の整数である］で表わされるクロマノール配糖体が
挙げられる。この際、例えば、上記一般式（１）で表わ
されるクロマノール配糖体を製造する際には、下記一般
式（２）：

【００４９】

【化６】

【００５０】（ただし、式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³ 、
Ｒ⁴、Ｒ⁵およびｎは、それぞれ、上記と同様である）
で表わされる２−置換アルコールが基質として使用さ
れ、上記基質とマルトースからマルトテトラオース位の
マルトオリゴ糖などの上述した糖を本発明による固定化
酵素の存在下で反応させることによって、上記一般式
（１）で表わされるクロマノール配糖体（以下、単に
「クロマノール配糖体」と称する）が製造できる。

【００５１】上記一般式（１）及び（２）において、Ｒ
¹、Ｒ²、Ｒ³ およびＲ⁴は、同一または異なる水素原
子または低級アルキル基を表わすものであるが、低級ア
ルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜
８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例
えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチ
ル基、ヘキシル基、ヘプチル基、及びオクチル基等が挙
げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好まし
い。同様にして、Ｒ⁵は、水素原子、低級アルキル基ま
たは低級アシル基を表わすものであるが、これらのう
ち、低級アルキル基を表わす際には、上記Ｒ¹、Ｒ²、
Ｒ³ およびＲ⁴における場合と同様であり、また、低級
アシル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜
１０、より好ましくは１〜８の低級アシル基であり、例
えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソ
ブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル
基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等が挙げら
れ、これらのうち、アセチル基及びプロピオニル基が好
ましい。さらに、上記一般式（１）において、Ｘは、グ
ルコース、またはグルコース残基中の水酸基の水素原子
が炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子
数が１〜１０の低級アシル基で置換されたもの等が挙げ
られ、これらのうち、グルコースが好ましく使用され
る。さらに、上記一般式（１）及び（２）において、ｎ
は０〜４、好ましくは０〜２の整数である。

【００５２】本発明による糖転移反応に使用される基質
としては、水酸基を有する水に難溶で生理活性に優れた
物質であれば特に制限されず、目的とする配糖体の種類
によって異なるが、例えば、上記一般式（２）で表わさ
れる２−置換アルコール類、フラボノール、フラバノ
ン、フラボン、サポゲニン、及びカテキン等が挙げられ
る。これらのうち、水酸基を有する水に難溶な抗酸化剤
である、上記一般式（２）で表わされる２−置換アルコ
ール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）が
基質として好ましく使用される。この２−置換アルコー
ルは、公知物質であり、特公平１−４３７５５号公報や
特公平１−４９１３５号公報等に開示された方法により
得ることができる。また、例えば、一般式（２）におい
てＲ¹、Ｒ²、Ｒ³ 及びＲ⁴がＣＨ₃ であり、Ｒ⁵がＨ
であり、ｎが１である２−置換アルコールは、トロロッ
クスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジ
エチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容
易に得ることができる。

【００５３】本発明による固定化酵素を用いてクロマノ
ール配糖体を製造する際には、２−置換アルコールを糖
溶液に溶解させることが望ましい。また、上記製造工程
においては、有機溶媒を共存させることが望ましく、こ
の際添加される有機溶媒としては、例えば、ジメチルス
ルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノー
ル、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げ
られる。これらのうち、α−グルコシダーゼの糖転移活
性を高めることを考慮すると、ジメチルスルホキシド及
びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。添加する
有機溶媒の濃度は、１〜５０（ｖ／ｖ）％であり、反応
効率を考慮すると、５〜３５（ｖ／ｖ）％が好ましい。

【００５４】上記実施態様において、基質としての２−
置換アルコールの濃度は、反応液中において飽和濃度若
しくはそれに近い濃度にすることが望ましく、特に、
０．５〜１０（ｖ／ｖ）％の範囲内であることが望まし
い。

【００５５】本発明による反応条件としては、ｐＨが、
４．５〜７．５、好ましくは５．０〜６．５であり、反
応温度が、１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃であ
り、さらには、反応時間が、１〜５０時間、好ましくは
１〜４０時間、より好ましくは２〜２４時間である。特
に、バチルスステアロサーモフィラス由来のα−グル
コシダーゼを使用する際の反応条件としては、ｐＨが、
４．５〜７．５、好ましくは５．０〜７．５であり、反
応温度が、１０〜７０℃、好ましくは３０〜７０℃であ
り、さらには、反応時間が、１〜５０時間、好ましくは
２〜４０時間である。但し、これらの反応条件は使用す
る固定化酵素の種類や量等により影響を受ける。

【００５６】本発明による固定化酵素を用いてクロマノ
ール配糖体を製造する場合の製造方法は、特に限定され
ないが、例えば、固定化酵素をカラムに充填し、上記し
たようなｐＨおよび温度の反応条件下で、基質として２
−置換アルコールおよび糖溶液の混合液をカラムに連続
通液することにより、クロマノール配糖体を効果的に製
造することができる。

【００５７】または、本発明において調製された固定化
酵素を反応液中に直接添加し、振盪等の方法を用いて、
反応液中に固定化酵素を分散させながら反応を行うこと
によって、クロマノール配糖体を効率的に製造してもよ
い。

【００５８】さらに、本発明による固定化酵素を用いて
製造されるクロマノール配糖体（一般式（１））は、下
記一般式（４）で表わされるもののほかに糖残基の異な
るものも含む混合物（すなわち、一般式（１）中のＸで
表わされた糖残基の異なった各種クロマノール配糖体が
共存する混合物）であることもあるが、このような場合
には、クロマノール配糖体の混合物をグルコアミラーゼ
（ＥＣ３．２．１．３）処理することにより、一般式
（４）で示されるクロマノール配糖体を選択的に得るこ
とができる。ここで、本発明におけるグルコアミラーゼ
（ＥＣ３．２．１．３）処理とは、上述のクロマノー
ル配糖体の酵素法による合成反応により得られたクロマ
ノール配糖体の混合物を含む反応系溶液中のα−グルコ
シダーゼを失活させた後、該溶液中に糖化酵素の一種で
あるグルコアミラーゼ（＝エキソ−１，４−α−Ｄ−グ
ルコシダーゼ、ＥＣ３．２．１．３）を添加し、さら
に反応を続けることをいう。

【００５９】

【化７】

【００６０】グルコアミラーゼ処理に用いられる酵素と
しては、有機溶媒に対する安定性に優れたグルコアミラ
ーゼ（ＥＣ３．２．１．３）があり、具体的には、東
洋紡績株式会社製のリゾプス属(Rhizopus sp.,以下同様
につき括弧内を省略する）由来のグルコアミラーゼ、お
よびナガセ生化学工業株式会社製のリゾプス属(Rhizopu
s sp.,以下同様につき括弧内を省略する）由来のグルコ
アミラーゼなどが挙げられる。添加される酵素量として
は、例えば、上述した東洋紡績株式会社製のバチルス
ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを失
活させた後の反応液１５ｍｌに添加する場合には、５〜
４０Ｕ、好ましくは１０〜３０Ｕである。なお、この際
「１Ｕ」とは、基質に可溶性澱粉を用いて３０分間に１
０ｍｇのグルコースを遊離させることのできる酵素量と
して定義される酵素の１単位である。

【００６１】また、上記実施態様において、グルコアミ
ラーゼ処理における反応温度は、２０〜７０℃、好まし
くは３０〜６０℃であり、反応時間は、１〜４０時間、
好ましくは１０〜３０時間である。ただし、上述したグ
ルコアミラーゼ処理による反応を行う際の条件は、使用
する酵素量により若干の影響を受ける。

【００６２】反応終了後は、目的とするクロマノール配
糖体を含む反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社製）を担
体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理するこ
とにより、高純度のクロマノール配糖体が得られる。

【００６３】上述のようにして得られた本発明による固
定化酵素は、固定化前の酵素と比較すると、至適温度曲
線はほぼ同様の傾向を示すものの、至適ｐＨ曲線は固定
化することによりやや酸性側での活性が増大する傾向が
あることが示された。

【００６４】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限され
るものでないことはいうまでもない。

【００６５】参考例１：α−グルコシダーゼ(α-glucos
idase, EC 3.2.1.20)の活性測定法４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７
℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加
え、同温度条件下において２０分間反応させた後５分間
の煮沸処理により反応を停止させた。次に、上記反応に
よるグルコースの生成量をグルコース測定キット（和光
純薬工業株式会社製）を用いて測定した。なお、１Ｕは
上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加
水分解を触媒する酵素量とした。

【００６６】実施例１多孔質キトサンビーズである、キトパールＢＣＷ−２
５１０、ＢＣＷ−２６１０、ＢＣＷ−３０１０及びＢＣ
Ｗ−３５１０（富士紡績株式会社製）、弱塩基性アニオ
ン交換樹脂である、アンバーライトＩＲＡ−９３ＺＵ
（オルガノ株式会社製）及びＤＥＡＥ−トヨパール（東
ソー株式会社製）、強塩基性アニオン交換樹脂である、
Ｑ−セファロース（ファルマシア株式会社製）を、それ
ぞれ、担体として用いた。上記各担体１ｇ（湿重量）
に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東
洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces
sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、１００Ｕ／ｍｌ（タ
ンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて
２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を
行なった。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が
溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体
への酵素の見掛け上の固定化率を上記「発明の実施の態
様」において記載した式により計算し、その結果を表１
に示す。

【００６７】次に、このようにして得られた固定化酵素
各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１
ｍｌおよびジメチルスルホキシドで（本明細書中では、
「ＤＭＳＯ」ともいう）調製した５（ｗ／ｖ）％の下記
式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．
２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間（１
２０ｒｐｍ）振盪することにより、反応を行なった。こ
の時の２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転
移率を表２に示す。なお、転移率は、２−置換アルコー
ルの減少の割合として記載した。

【００６８】

【化８】

【００６９】実施例２東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyc
es sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、１００Ｕ／ｍｌ
（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌの代わりに東洋
紡績株式会社製のバチルスステアロサーモフィラス由
来のα−グルコシダーゼＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／
ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを使用する
以外は、実施例１と同様の操作を行い、バチルスステ
アロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを多孔質
キトサンビーズに固定化した。

【００７０】次に、このようにして得られた固定化酵素
各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）で調製した４０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１
ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）
％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール
溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０
時間（１２０ｒｐｍ）振盪することにより、反応を行っ
た。このときの、２−置換アルコールのクロマノール配
糖体への転移率を下記表２に示す。

【００７１】

【表１】

【００７２】

【表２】

【００７３】表１及び表２に示される結果から、サッカ
ロマイセス属由来のα−グルコシダーゼおよびバチルス
ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ双
方について、固定化率に関しては、キトパール及び各種
イオン交換樹脂間で大きな相違はないものの、転移率は
キトパールを使用した場合の方が各種イオン交換樹脂を
使用した場合に比べて有意に大きく、これより、キトパ
ールを固定化担体として用いた固定化酵素が酵素吸着能
に対して糖転移活性に優れていることが判る。

【００７４】実施例３担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０及びＢＣＷ−
３５１０、各１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチル
スステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ
ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１
ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１
２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この
際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなる
まで振盪洗浄を行うことにより、除去した。

【００７５】次に、このようにして得られた固定化酵素
各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液と
ＤＭＳＯで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示
されるＲＳ−２−置換アルコール溶液の両者の量を下記
表３に示されるように変えて混合した溶液中に添加し、
４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）すること
により反応を行った。この時の、２−置換アルコールの
クロマノール配糖体への転移率を下記表３に示す。

【００７６】

【表３】

【００７７】表３に示される結果から、キトパールＢ
ＣＷ−２５１０を固定化担体として用いた場合、ＤＭＳ
Ｏ濃度及び２−置換アルコール濃度を高くしても、高い
転移率を示すことが分かった。

【００７８】実施例４（１）ＧＬＡ未処理固定化酵素の調製担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−３
０１０、各１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカ
ロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシ
ダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐ
ｍ）することにより、固定化を行なった。未吸着の酵素
は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行
ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を
実施例１と同様にして算出し、結果を表４に示す。

【００７９】（２）ＧＬＡ処理固定化酵素の調製担体として、キトパールＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−
３０１０、各１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％
ＧＬＡ溶液２ｍｌ中にそれぞれ入れ、３０℃において２
時間振盪処理（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上に
ＧＬＡ処理した担体を集め、この濾紙を５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回洗浄を行なった。

【００８０】次に、このようにしてＧＬＡ処理された担
体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸衝撃液（ｐＨ６．
５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス
属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）由来のα−
グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０
ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１
２０ｒｐｍ）し、固定化を行なった。未吸着の酵素は、
緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない
除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を実施
例１と同様にして算出し、結果を表４に示す。

【００８１】

【表４】

【００８２】表４のから、キトパールＢＣＷ−２５１
０及びＢＣＷ−３０１０の両方について、ＧＬＡ処理に
より酵素の固定化率が改善されることが示される。

【００８３】（３）固定化酵素の安定性の評価上記（１）及び（２）において調製した、ＧＬＡ未処理
固定化酵素およびＧＬＡ処理固定化酵素、各５０ｍｇ
（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調
製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌおよびジ
メチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式
（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２
ｍｌの混合溶液に加え、４０℃で２０時間振盪（１２０
ｒｐｍ）することにより、反応を行なった。反応終了
後、この反応液を濾過して固定化酵素を回収し、同様の
条件において糖転移反応をさらに２回繰り返し、それぞ
れの反応における転移率を求め、この結果から反応液中
における各固定化酵素の安定性を評価した。その結果を
表５に示す。

【００８４】

【表５】

【００８５】表５に示される結果から、ＧＬＡ処理する
ことにより反応液中のジメチルスルホキシドに対する、
α−グルコシダーゼの安定性は飛躍的に向上することが
分かった。また、キトパールＢＣＷ−２５１０を固定
化担体として用いた場合の転移率が最も高いことから、
キトパールＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用い
ることが好ましいことが示された。

【００８６】実施例５（１）ＧＬＡ未処理固定化酵素の調製担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０１ｇ（湿重
量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し
た東洋紡績株式会社製のバチルスステアロサーモフィ
ラス由来のα−グルコシダーゼＡＧＨ−２１１、１０
０Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加
え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することに
より、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝
液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことに
より、除去した。この結果、担体への酵素の固定化率は
７５％であった。

【００８７】（２）ＧＬＡ処理固定化酵素の調製担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０を１ｇ（湿重
量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中に入
れ、３０℃において２時間振盪（１２０ｒｐｍ）した。
処理後、濾紙上にＧＬＡ処理した担体を集め、この濾紙
を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回
洗浄を行った。

【００８８】次に、このようにしてＧＬＡ処理された担
体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルスステア
ロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼＡＧＨ−
２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍ
ｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐ
ｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着
の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗
浄を行うことにより、除去した。この結果、担体への酵
素の固定化率は９５％であった。

【００８９】（３）固定化酵素の安定性の評価上記（１）及び（２）において調製した、ＧＬＡ未処理
固定化酵素及びＧＬＡ処理固定化酵素、各５０ｍｇ（湿
重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製し
た３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液０．９６ｍｌ及びジ
メチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式
（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２
４ｍｌの混合溶液に加え、４０℃で２０時間振盪（１２
０ｒｐｍ）することにより反応を行った。反応終了後、
反応液を濾過して固定化酵素を回収し、同様の条件にお
いて糖転移反応をさらに繰り返し、それぞれの反応にお
ける転移率を求め、この結果から反応液中における各固
定化酵素の安定性を評価した。その結果を下記表６に示
す。

【００９０】

【表６】

【００９１】上記（１）および（２）に示される結果か
ら、ＧＬＡ処理により酵素の固定化率が改善され、ま
た、表６に示される結果から、ＧＬＡ処理することによ
り反応液中のジメチルスルホキシドに対する、α−グル
コシダーゼの安定性は飛躍的に向上することが示され
る。

【００９２】実施例６（１）担体のＧＬＡ処理固定化担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０を用
い、この担体、１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）
％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振
盪処理（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ
処理された担体を集め、この濾紙について５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回振盪洗浄を行な
った。

【００９３】（２）α−グルコシダーゼの固定化上記（１）によって得られたＧＬＡ処理担体１ｇ（湿重
量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し
た東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharom
yces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ
（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０
℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）し、固定化を行なっ
た。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなる
まで振盪洗浄を行なった。このようにして得られた固定
化酵素は、担体１ｇ（湿重量）当たり、２００Ｕのα−
グルコシダーゼを見かけ上固定化していた。

【００９４】（３）クロマノール配糖体の合成上記（２）によって得られた固定化酵素１ｇ（湿重量）
を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４
０％（ｗ／ｖ）マルトース溶液２０ｍｌおよびジメチル
スルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）
で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４ｍｌの混合
溶液に加え、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐ
ｍ）することにより、反応を行なった。このときの２−
置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４
０％であった。

【００９５】次に、この反応液を濾過することにより固
定化酵素を回収した後、反応液を３０％メタノール溶液
で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラム
にのせ、非吸着物を３０％メタノールで溶出した後、さ
らに、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶
出させた。このようにして得られたクロマノール配糖体
画分をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル：メ
タノール＝５：１（ｖ／ｖ）］処理することによって、
クロマノール配糖体として下記式（６）で示される２−
（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８
−テトラメチルクロマン−６−オール（一般式（１）の
ｎ＝１、Ｒ¹＝Ｒ²＝Ｒ³ ＝Ｒ⁴＝ＣＨ₃ 、Ｒ⁵＝Ｈに
相当する）が高純度で約７０ｍｇ得られた。

【００９６】

【化９】

【００９７】このようにして得られた２−（α−Ｄ−グ
ルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチ
ルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図１
に示す。

【００９８】また、上記化合物の¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−
ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりで
ある。

【００９９】¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−
ｄ₆）：１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）１．９７（ｓ，３Ｈ）２．０２（ｓ，３Ｈ）２．０４（ｓ，３Ｈ）２．５１（ｂｒｏａｄｔ，２Ｈ）３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）７．３９（ｓ，１Ｈ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆、
プロトンデカップリングスペクトル）：１１．７１１．７１２．６１９．７および１９．８２２．２および２２．４２８．２６０．６および６０．８７０．０および７０．１７１．２および７１．５７１．９７２．６および７２．９７３．１７３．８および７３．９９８．７および９８．８１１６．６および１１６．７１２０．１および１２０．２１２０．７および１２０．８１２２．５１４４．２１４５．１質量スペクトル（ＦＡＢ）ｍ／ｚ３９８（分子イオンピーク）比旋光度

【０１００】

【外１】

【０１０１】実施例７（１）担体のＧＬＡ処理固定化担体としてキトパールＢＣＷ−２５１０を用
い、この担体８０ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）
％ＧＬＡ溶液１６０ｍｌ中に入れ、３０℃において２時
間振盪（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ
処理された担体を集め、この濾紙について５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．５）２４００ｍｌで３回振盪洗浄を
行った。

【０１０２】（２）α−グルコシダーゼの固定化上記（１）によって得られたＧＬＡ処理担体８０ｇ（湿
重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解
した東洋紡績株式会社製のバチルスステアロサーモフ
ィラス由来のα−グルコシダーゼＡＧＨ−２１１、１
００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を８０ｍ
ｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）して、
固定化を行った。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶
出しなくなるまで振盪洗浄を行った。このようにして得
られた固定化酵素は、担体１ｇ（湿重量）当たり、１０
０Ｕのα−グルコシダーゼを見掛け上固定化していた。

【０１０３】（３）クロマノール配糖体の合成上記（２）によって得られた固定化酵素８０ｇ（湿重
量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製し
た３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１５００ｍｌ及びジ
メチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式
（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール３７５ｍｌ
の混合溶液に加え、４０℃において２０時間振盪（１２
０ｒｐｍ）することにより反応を行った。この時の２−
置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約８
７％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は糖部
分の構造が異なるものの混合物（すなわち、一般式
（１）のｎ＝１、Ｒ¹＝Ｒ²＝Ｒ³＝Ｒ⁴＝ＣＨ₃ 、Ｒ
⁵ ＝Ｈで、かつＸで表わされる糖残基の異なった各種ク
ロマノール配糖体が共存する混合物）であった。この反
応液を１５分間煮沸処理することにより、α−グルコシ
ダーゼを失活させ、２４，０００Ｕの東洋紡績株式会社
製のリゾプス属由来のグルコアミラーゼを添加し、５０
℃において２４時間反応させることにより、反応液中の
クロマノール配糖体はほぼ、一般式（７）で示されるク
ロマノール配糖体１種類になった。この反応液を１５分
間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活さ
せた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４
（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物
を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液で
クロマノール配糖体を溶出させた。このようにして得ら
れたクロマノール配糖体画分をシリカゲルクロマトグラ
フィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））
処理することにより、クロマノール配糖体として下記一
般式（７）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−
６−オール（一般式（１）のｎ＝１、Ｒ¹＝Ｒ²＝Ｒ³
＝Ｒ⁴＝ＣＨ₃、Ｒ⁵＝Ｈに相当する）を約２０ｇ得
た。

【０１０４】

【化１０】

【０１０５】このようにして得られた一般式（７）で示
されるクロマノール配糖体の赤外線吸収スペクトルを図
２に示す。

【０１０６】また、上記化合物の¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−
ＮＭＲ、質量分析及び比施光度の結果は以下のとおりで
ある。

【０１０７】¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）１．９７（ｓ，３Ｈ）２．０２（ｓ，３Ｈ）２．０４（ｓ，３Ｈ）２．５１（ｂｒｏａｄｔ，２Ｈ）３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）７．３９（ｓ，１Ｈ）¹³ Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆、
プロトンデカップリングスペクトル）：１１．７１１．７１２．６１９．７および１９．８２２．２および２２．４２８．２６０．６および６０．８７０．０および７０．１７１．２および７１．５７１．９７２．６および７２．９７３．１７３．８および７３．９９８．７および９８．８１１６．６および１１６．７１２０．１および１２０．２１２０．７および１２０．８１２２．５１４４．２１４５．１質量スペクトル（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ３９８（分子イオンピーク）比施光度

【０１０８】

【外２】

【０１０９】

【発明の効果】上述したように、本発明の固定化酵素に
よる配糖体の製造方法を用いて、糖転移作用を触媒する
酵素を多孔質キトサンビーズに効果的に固定化すること
により、（１）酵素活性を実質的に失活させることな
く、安定な固定化酵素を得ることができ；（２）有機溶
媒共存下においても酵素の活性を長期にわたり安定して
維持でき；（３）使い捨てにすることなく、連続使用で
きるようになり；（４）本発明による固定化酵素を用い
ることにより、配糖体の生産効率を高めることができ；
さらに、（５）合成された配糖体への異種タンパク質の
混入を防ぎ、高品質の配糖体を収率よく合成することが
できるようになった。

【０１１０】また、糖転移作用を触媒する酵素としてバ
チルスステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダ
ーゼを用いることにより、有機溶媒共存下においても長
期間安定である固定化酵素が調製でき、さらに、このよ
うにして得られた固定化酵素を用いることにより生理活
性および化学的安定性に優れた水溶性配糖体を製造でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例６で得られた２−（α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロ
マン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。

【図２】実施例７で得られた２−（α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロ
マン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多孔質キトサンビーズにα−グルコシダ
ーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、水酸基を有す
る水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを有機溶媒共
存下において反応させ、生理活性に優れた水溶性配糖体
を生成することを特徴とする各種配糖体の製造方法。
【請求項２】該固定化酵素は多孔質キトサンビーズを
架橋剤で架橋処理した後に酵素を固定化させたものであ
る請求項１記載の方法。
【請求項３】該多孔質キトサンビーズの粒径が０．５
〜３．０ｍｍである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】 α−グルコシダーゼの多孔質キトサンビ
ーズ上への固定化量が、該多孔質キトサンビーズ１ｇ
（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇである請求項
１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】該配糖体が下記一般式（１）：【化１】［ただし、式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一ま
たは異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ
⁵は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表
わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコース残基中の
水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の低級アルキル
基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換さ
れていてもよい）を表わし、ｎは０〜４の整数である］
で表わされるクロマノール配糖体である請求項１から４
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】該糖がα−グルコシル糖化合物である請
求項１から５のいずれか１項に記載の方法。