JP2527064B2 - 酵素の安定化法、安定化剤及び酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、サイクロデキストリングリコシルトランス
フェラーゼ（CGTase）、グルコアミラーゼ（GA）、β−
グルコシダーゼ（GD）、α−アミラーゼ、β−アミラー
ゼ、マルトオリゴ糖生成酵素等の酵素を安定化する方法
等に関する。

CGTaseは、澱粉からサイクロデキストリンを製造する
のに工業的規模で通常用いられている酵素である。サイ
クロデキストリンは、各種食品に増量剤等として広く用
いられている物質であり、また医薬品の安定化を高めた
り臭い物質の脱臭に応用が広い包接化合物を製造するの
に必須の物質であり、従って、CGTaseを安定化すること
は、工業上、非常に意義の高い技術である。

また、GAは、澱粉からグルコースを製造する際に日常
的に用いられる酵素であって、GAの安定化は極めて意義
の大きい技術である。

更にその他の本発明に係る酵素は、医薬品製造や廉価
にして品質の高い食品の提供に欠くことのできない極め
て応用度の高い物質であって、これらの酵素を安定化す
ることは、工業上極めて意義の大きいものである。

［従来の技術］ 酵素反応の技術についての近年の技術的進歩は目覚ま
しく、まさに隔世の感がある。

また、ここ数年、ことにキトサンビーズを応用した固
定化酵素法は、例えば溶液中での酵素反応等のこれまで
の従来方法に比べ使用酵素量が少なくて済む点や効率的
な反応を行うことができる点で格段の効果があることが
知られてきた。

キトサンビーズ応用の固定化酵素法については複数の
特許出願がなされており、例えば、特開昭63−196290号
公報には、多孔質のキトサンビーズに、サイクロデキス
トリングルカノトランスフェラーゼを固定化させた後、
さらに架橋剤で架橋処理する技術が開示されている。

［発明が解決しようとする課題］ 上記酵素の効率的応用方法については、多くの研究が
なされていたが、酵素そのものの安定化については、必
ずしも充分な成果が得られていたわけではない。酵素は
使用時間とともにその活性を喪失してゆくものであり、
例えばCGTaseにあっては数日で活性が半減し、数十日経
過すれば全く活性を失うのが通常であった。

固定化酵素にしても、このような場合には、酵素その
ものを新しく供給する以外に方法はなかった。本発明が
解決しようとする技術的困難性は、この点にあった。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、技術課題を解決する目的で鋭意研究を
重ねた結果、僥倖ではあったが、次の一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素、低級アルキル、フェニルアルキ
ル、フェニルアルケニル、フェニルアルキニル、フェノ
キシアルキル、フェノキシアルケニル、又はフェノキシ
アルキニルを表す。ここにおけるフェニルとは置換若し
くは無置換のものを含むものとする。）で表されるＮ−
置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコースオリゴ
マーの存在下に酵素反応をさせることにより、上記課題
がみごとに解決する事実に遭遇した。

本発明者らは、更に興味深いことに、上記一般式
〔Ｉ〕で表される化合物又はそのグルコースオリゴマー
の存在下に、いったん酵素反応を行った酵素が、その後
〔Ｉ〕又はそのグルコースオリゴマーの存在しない状態
においても活性化された酵素の高活性率を維持し続ける
という事実をも発見し、本発明を完成した。

従って、本発明の特徴の一つは、〔Ｉ〕又はそのグル
コースオリゴマーの存在下に酵素反応を実行することに
よって、酵素を安定化する方法にあり、いま一つの特徴
は、〔Ｉ〕又はそのグルコースオリゴマーの存在下に酵
素反応を実行することによって安定化された酵素そのも
のにある。

本発明において適用する固定化酵素の製造法について
例示すると、架橋剤をまずキトサンビーズと反応させ
て、キトサンビーズ表面のアミノ基に架橋を形成させ
る。その後、本発明に係る酵素を架橋剤の末端に固定す
る。

本発明に係る架橋剤として、例えば、グルタールアル
デヒド等を用いることができる。

本発明に係るキトサンビーズとしては、例えば、キト
パール（富士紡績（株）製）BCW−1000シリーズ等を使
用することができる。

本発明に係る固定化酵素を生成させるためには、例え
ば、適当な温度（例、室温）で適当な緩衝液（例、pH6.
0の0.1M酢酸バッファ）中に上記キトサンビーズを加
え、緩やかに振盪し、適当な濃度（例、25m/v％）のグ
ルタールアルデヒドを加え、適当な時間（例、１〜48時
間）、緩やかに振盪した後、濾過し、水洗した後、適当
な緩衝液（例、pH6.0の0.025M酢酸バッファ）中で、適
当な濃度（例、１〜500mg/ml）のCGTase溶液を加え、適
当な時間（例、１〜48時間）緩やかに振盪した後、濾過
し水洗して得ることができる。

上記の方法は、本発明者らによって初めて確立された
手法であって、これにより上記特開昭63−196290号公報
に開示された技術を使用しなくても固定化酵素法を実施
することができる。

例えば、固定化CGTaseにおいては、55℃で413日経過
しても初期活性の90％以上を保持することができ、固定
化GAでは、55℃で43日経過しても初期活性の80％以上、
50℃、175日では80％以上、40℃、133日では90％以上を
保持することができる。

この事実がいかなる理由により生じるかについては必
ずしも定かではないが、〔Ｉ〕はこれらの酵素の基質
（例えば、澱粉、デキストリン、マルトオリゴ糖、マル
トース糖）の構成糖であるグルコースと構造類似の擬似
糖（シュードピペリジノース）であることから、酵素と
の関係において何らかの機能が発揮されているものと推
測することができる。

以下に、本発明の構成を更に詳しく説明する。

本発明の要旨は、酵素を反応させるにあたって、上記
一般式〔Ｉ〕で表される化合物又はそのグルコースオリ
ゴマーを存在させるという、そのただ一点にある。

この場合の酵素は、溶存状態でも固定化されたもので
もどちらでもよいが、通常工業的な目的では固定化酵素
が用いられる。

本発明に係る〔Ｉ〕で表される化合物は公知の物質で
あって、例えば、特公昭56−099195号公報、特公昭60−
2038号公報、特公昭61−2076号公報、特公昭62−242691
号公報等に開示された方法により取得することができ
る。

本発明に係るグルコースオリゴマーとは、次の一般式
〔II〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から24までの整数を
表す）で表すことができる。

本発明に係る一般式〔Ｉ〕及び〔II〕におけるＲに示
される低級アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プ
ロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec
−ブチル、tert−ブチル等を挙げることができる。

フェニルアルキルにおけるアルキルの炭素数は、１〜
５のものを挙げることができる。この場合にはフェニル
は置換若しくは無置換のものも含むものである。

フェニルアルケニルにおけるアルケニルの炭素数は、
２〜５のものを挙げることができる。この場合にはフェ
ニルは置換若しくは無置換のものも含むものである。

フェニルアルキニルにおけるアルキニルの炭素数は、
２〜５のものを挙げることができる。この場合にはフェ
ニルは置換若しくは無置換のものも含むものである。

フェノキシアルキルにおけるアルキルの炭素数は、１
〜５のものを挙げることができる。この場合にはフェニ
ルは置換若しくは無置換のものも含むものである。

フェノキシアルケニルにおけるアルケニルの炭素数
は、２〜５のものを挙げることができる。この場合には
フェニルは置換若しくは無置換のものも含むものであ
る。

フェノキシアルキニルにおけるアルキニルの炭素数
は、２〜５のものを挙げることができる。この場合には
フェニルは置換若しくは無置換のものも含むものであ
る。

本発明に係る酵素の安定化にあたっては、例えば以下
のようにして実行することができる。

固定化酵素の安定化にあたっては、上記したようにし
て取得した固定化酵素に、本発明化合物を加える。本発
明化合物を基質とするときには、基質そのものを加える
だけで本発明の安定化を実行することができる。基質が
本発明化合物ではないときには、本発明化合物によって
安定化された固定化酵素について、酵素反応を実行する
ことができる。

本発明化合物を加えた後、例えば、通常の酵素反応を
実行する温度で、通常の時間程度反応させる。

［実施例］ 以下に、本発明に係る参考例及び実施例を掲げて、本
発明を更に詳しく説明する。

参考例１ CGTaseの固定化（１） 10の富士紡績社製キトパールBCW−3010を2.5w/v％
グルタールアルデヒドを含む0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）4
0に、室温で24時間浸漬処理した後、充分にイオン交
換水で洗浄した。ついでキトパール1ml当り蛋白質20mg
相当のCGTase〔林原生物化学研究所社製。バチルス・ス
テロサーモフィリス（Bacillus stearothermophilus）
由来〕を加えて、さらに酢酸緩衝液（pH6.0）を最終濃
度が0.025Mになるように加えて、全液量が30になるよ
うにした。このまま室温で24時間浸漬してその後イオン
交換水で充分洗浄して、固定化CGTaseを得た。得られた
ビーズの蛋白吸着量は、19.5mg/ml（ビーズ）であっ
た。

参考例２ CGTaseの固定化（２） 参考例１と同様にして、蛋白質吸着量5mg/ml（ビー
ズ）となるように、バチルス・ステロサーモフィリス
（Bacillus stearothermophilus）由来のCGTaseを固定
化した。

参考例３ GAの固定化 天野製薬社製グルコザイムNL−３を透析した後、60〜
65mg/mlの蛋白質濃度にしたものをGA水溶液として用い
た。

富士紡績社製キトパールBCW−3010の１を2.5w/v％
グルタールアルデドを含む50mM酢酸緩衝液（pH5.0）３
に室温で24時間浸漬処理した後、充分イオン交換水で
洗浄した。ついで、キトパール1ml当たり蛋白質100mg相
当のGA水溶液を加え、さらに水を加えて、全液量が３
になるようにした。このまま室温で24時間浸漬して、そ
の後イオン交換水で充分洗浄して固定化GAを得た。得ら
れたビーズの蛋白質吸着量は、12.8mg/ml（ビーズ）で
あった。

参考例４ モラノリン産生菌の培養 澱粉２％、大豆粉１％、塩化カリウム0.05％、硫酸マ
グネシウム七水和物0.05％、食塩0.2％、炭酸カルシウ
ム0.35％（pH7.2）の組成の培地200mlを、500ml容三角
フラスコに取り、常法通り滅菌後、これにストレプトミ
セス・ラベンデュレ（Streptomyces lavendulae）SEN−
158株の斜面培養から数白金耳胞子を接種し、27℃で３
日間、200回転で振盪培養し、これを種培養液とした。

澱粉８％、大豆粉３％、酵母エキス1.5％、塩化カリ
ウム0.05％、硫酸マグネシウム七水和物0.05％、食塩0.
1％、炭酸カルシウム0.15％（pH7.2）の組成の培地250
を、420容ジャーファーメンターに入れ、常法通り
滅菌後、種培養液2.4を接種した。これを100回転／
分、通気量125／分、27℃で10日間培養した。培養液
中のモラノリンを高速液体クロマトグラフィーによって
定量した結果、約3500μg/mlのモラノリンが含まれてい
た。

参考例５ モラノリン含有培養液の部分精製 参考例４の方法で得た培養液を限外濾過膜（クラレ社
製 UF Module;MU−6303−HG）にかけ、通過液を更に逆
浸透膜（東洋紡社製ホローファイバー;HR−5155 F1）に
かけ濃縮した非通過液を部分精製品とした。

参考例６ モラノリン含有培養液の部分精製品の糖転移反応 参考例４と同様の方法で培養した培養液（2000）を
参考例５の方法で処理した部分精製品（150；モラノ
リン約7kg含有）を420容ジャーファーメンターと50
容カラムを連結した反応装置のジャーファーメンターに
加えた。更にアミコールNo.6L 70kgを加え加温溶解し
た。6Nの水酸化ナトリウムでpHを9.0に調整した後、水
を加えて全容を280とした。参考例１の方法で製造し
た固定化CGTase 30をカラムに充填し、３／分の流
速で循環させながら55℃で48時間反応させてモラノリン
の糖転移反応液を得た。

実施例１ 固定化CGTaseの安定化（モラノリンの糖転移反応） モラノリン2.5w/v％、アミコールNo.6L〔日澱化学社
製〕25w/v％、pH未調整の水溶液100mlに、参考例１で得
た固定化CGTaseを10ml加え、55℃で回転振盪を続けた。
一定時間経過後にグラスフィルターでビーズ（固定化CG
Tase）を濾過し充分水洗した後、次のようにして固定化
CGTaseの酵素活性を測定した。

（固定化CGTaseの酵素活性測定法） モラノリン2.5w/v％、アミコールNo.6L 25w/v％、pH
未調整の水溶液10mlにビーズ（55℃で一定時間経過後の
洗浄固定化CGTase）1mlを加え、55℃で24時間反応させ
た。反応液3mlを強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W
×２（H⁺）7mlに通過させ、充分水洗後、0.5Nアンモニ
ア水で溶出し、溶出液を減圧下に濃縮乾固して、3mlの
水に溶かし、その10μを高速液体クロマトグラフィー
に注入して分析し、未反応のモラノリンの濃度を求め
た。高速液体クロマトグラフィーの分析条件は、カラム
（Nucleosil 5NH₂、５μｍ、4mm i.d.×25cm）、展開溶
媒（アセトニトリル−水＝70:30）、検出器（日立655A
−30,RI検出器）、データプロセッサー（日立Ｄ−200
0）。

55℃で回転振盪を開始した時点の反応進行率を100と
した場合の一定時間経過後の相対的な反応進行率を上記
式により算出し、この値をもって酵素活性保持率とし
た。結果を表１に示す。固定化CGTaseが本発明に係るモ
ラノリンによって酵素活性が安定化された事実が明白で
ある。

実施例２ 固定化CGTaseの安定化（Ｎ−メチルモラノリンの糖転移
連続反応） 直径1cmのジャケット付きカラムに参考例１で得た固
定化CGTaseの20mlを充填し、Ｎ−メチルモラノリン1.5w
/v％、可溶性澱粉9w/v％、pH未調整の溶液を160ml/日の
通過速度で55℃で連続的に通過反応させ、経時的に通過
液の反応進行率を求めた。反応進行率、活性保持率は実
施例１と同様にして求めた。その結果、140日を経過し
ても、ほぼ100％の活性を保持していることが判った。

実施例３ 固定化CGTaseの安定化（モラノリン、モラノリンのグル
コースオリゴマー） 参考例２で得た固定化CGTaseの1mlにモラノリン（2.5
w/v％）、モラノリンのグルコースオリゴマー（混合
物）（5.0w/v％）を加え、全容10mlで55℃で振盪した。

モラノリンのグルコースオリゴマーとは、以下のもの
をいう。

モラノリン3w/v％、アミコールNo.6L 30w/v％を水に
溶かし、pH未調整で全容を500mlとした後、参考例１で
得た固定化CGTase 50mlを加え55℃で48時間反応させた
後、ガラスフィルターで濾過して固定化酵素を除き、濾
液を強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W×２（H⁺）2
00mlのカラムを通過させ充分水洗した後、0.5Nアンモニ
ア水１で溶出し、溶出液を減圧下に濃縮乾固して、再
び適当量の水に溶解させ、強酸性イオン交換樹脂ダイヤ
イオンSA−11A（OH^-）100mlのカラムにかけ、水で溶出
させ、この通過液と溶出液とを合わせ減圧下に濃縮乾固
し、この手順で得られたモラノリンの糖転移反応液の塩
基性フラクションをモラノリンのグルコースオリゴマー
という。

調整時の酵素活性を100としたときの残存酵素活性保
持率（％）を表２に示した。酵素活性の測定方法等はす
べて実施例１と同様にした。

モラノリン、モラノリンのグルコースオリゴマーにCG
Taseの活性を保持する作用があることが明白である。

実施例４ 固定化酵素CGTaseの安定化（Ｎ−置換モラノリン、Ｎ−
置換グルコシルモラノリン） 参考例１で得た固定化CGTase 1mlに、Ｎ−置換モラノ
リン（0.5w/v％）、Ｎ−置換グルコシルモラノリン（0.
5w/v％）を加え、全容10mlで55℃で14日間振盪した後、
残存酵素活性を測定した。最初の酵素活性を100とした
ときの残存酵素活性率を表３に示した。酵素活性の測定
方法は実施例１と同じである。

本発明化合物が、良好なる安定化作用を示しているこ
とは明白である。

実施例５ 固定化GAの安定化（モラノリンの等転移反応液） 参考例６の方法によって製造した未反応のモラノリ
ン、未反応のアミコールNo.6L、オリゴグルコシルモラ
ノリンを含む反応液を、硫酸を用いてpH5.2に調整した
水溶液を、参考例３で得た固定化GA 20mlを充填した直
径1cmのジャケット付カラムに480ml/日の通過速度で、5
0℃で連続的に通過反応させた。一定時間反応させた
後、カラム内の固定化GAをとり、追の方法で酵素活性を
測定し、反応開始時の酵素活性を100％としたときの活
性保持率（安定性）を求めた。結果を表４に示した。
（固定化GAの活性測定法） 固定化GAの一定量（湿重量30〜80mg）を、Ｇ−２のグ
ラスフィルター上にとり、軽く吸引して水分を濾過した
後、グラスフィルター上の固定化GAをレンズペーパー上
に乗せて過剰の水分を除去した後、栓つきサンプル瓶に
入れ、固定化GAの湿重量を求めた。次に、固定化GAを10
mlの５％マルトース溶液（0.05M酢酸緩衝液、pH4.6）に
加え、37℃で20分間インキュベートした。反応液の100
μを0.05Nの水酸化ナトリウム中に加え、反応を停止
させた。

この反応停止液の10μを用いてグルコースを定量し
た。グルコースの定量は、ダイヤカラーGC（小野薬品社
製）を用いて行った。

活性は次のように定義した。１分間に１μＭのグルコ
ースを生成させる酵素活性を１ユニットとした。ブラン
クには反応液のかわりに基質と等容に混合した0.05N水
酸化ナトリウムを用いた。

このとき、固定化GAの活性は、5.56×OD_SA/OD_STD/固
定化GAの質重量。ここでOD_SAは、サンプル（固定化GA）
の500nmの吸光度、OD_STDは、1mg/mlのグルコース水溶液
の500nmの吸光度を意味する。表４で活性保持率の値が
変動しているが、これは測定誤差である。本発明化合物
の固定化GAに対する安定化作用が明白である。

実施例６ 固定化GAの安定化（モラノリンの糖転移反応液） 実施例５と同様にして40℃で実験した。結果を表５に
示した。

実施例７ GA（水溶液）での安定化（モラノリン、Ｎ−メチルモラ
ノリン） モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンは、グルコアミラ
ーゼの酵素活性を阻害するので溶液状グルコアミラーゼ
に対する安定化効果は次のようにして検討した。酵素は
生化学工業社製のリゾプス・ニベウス（Rhizopus niveu
s）由来の試薬グルコアミラーゼを用いた。

酵素5mgを1mlの0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）に溶解した
ものに、モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンを6000μg/
mlとなるように溶解させ、ネジ口試験管に入れて50℃に
てインキュベートした。それぞれの酵素液は、測定時に
0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）で100倍に希釈してその100μ
をとり、５％マルトース液（0.05M酢酸緩衝液、pH4.
6）400μを加えて40℃で20分間反応させる。その反応
液の100μをとり、0.05Nの水酸化ナトリウム100μ
を加えて反応を停止させる。この中から更に100μを
とり、3.0mlのグルコース測定試薬ダイヤカラーGCを加
えて、37℃で30分間静置し発色させ、その後氷冷し、50
0nmで吸光度を測定しグルコース量を測定した。このグ
ルコース産生量を阻害剤共存下で酵素活性とした。初め
の酵素活性（グルコース産生量）を100としたときの相
対的な酵素活性を求めた。結果を図１に示した。本発明
化合物の酵素安定化作用が明白である。

実施例８ 固定化GAの安定化（モラノリン、Ｎ−アルキルモラノリ
ン） 参考例３の方法で調製した固定化GA5mlに、0.1M酢酸
緩衝液（pH5.0）10mlを加えて気密性のサンプル瓶に入
れた。このとき、モラノリン、Ｎ−アルキルモラノリン
を100mMとなるように溶解しておき、55℃でインキュベ
ートして残存酵素活性を実施例５に記載した方法で測定
した。結果を図２に示した。本発明化合物の酵素安定化
作用が明白である。

実施例９ モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンによるβ−グルコシ
ダーゼの安定化 β−グルコシダーゼに対するモラノリン、Ｎ−メチル
モラノリンの安定化効果を検討した。試験検体は、
（１）がβ−グルコシダーゼ（300μg/ml）0.2M緩衝液1
mlのみ、（２）がβ−グルコシダーゼ（300μg/ml）0.2
M緩衝液1mlにモラノリン塩酸塩を6mg/ml加えたもの、
（３）がβ−グルコシダーゼ（300μg/ml）0.2M緩衝液1
mlにＮ−メチルモラノリン塩酸塩を6mg/ml加えたもの、
である。これらの試験検体を、60℃に保ち、経時的に残
存酵素活性を測定した。

酵素活性の測定は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グ
ルコサイドを基質として400nmの吸光度を測定する方法
を用いた。

すなわち、0.014Mのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グ
ルコサイド200μと、検体より経時的にサンプリング
した酵素液を適当量に希釈したものの200μと0.2Mの
酢酸緩衝液（pH4.5）600μを、30℃で15分間反応さ
せ、0.1M炭酸二ナトリウム2mlを加えて反応を停止させ
た後、発色させ、400nmでその発色を測定する。反応開
始時の吸光度を100として、各時間の吸光度の相対比を
残存活性とした。

結果を図３に示す。モラノリン、Ｎ−メチルモラノリ
ンの安定化効果が明白である。

実施例10 安定化された固定化CGTase 参考例６の方法で糖転移反応を実施した後の固定化CG
Taseの一部を取り、徹底的に水洗した固定化CGTase5ml
に、0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）を10ml加えて気密性のサ
ンプル瓶に入れ、60℃で保存して残存酵素活性を経時的
に測定した。

一方、参考例１の方法で調製した固定化CGTaseについ
ても、同様に保存して残存酵素活性を測定した。酵素活
性測定方法は、文献記載の方法を用いた（Y.Ezure;Agri
c.Biol.Chem.,49,2159（1985））。その結果、11日保存
後において、参考例１で調製した固定化CGTaseは、約28
％の酵素活性しか残存していなかったが、糖転移反応
後、徹底的に洗浄した固定化CGTaseは、約91％の酵素活
性が残存していた。

実施例11 α−アミラーゼの安定化（モラノリンのグルコースオリ
ゴマー） α−アミラーゼ（生化学工業社製）を200μg/mlとな
るように0.2Mの酢酸緩衝液（pH6.0）に溶解し、これに
モラノリンのグルコースオリゴマーを6000μg/mlとなる
ように入れた。60℃でインキュベートし、経時的に残存
活性を測定した。α−アミラーゼの残存活性は、１％可
溶性澱粉を基質として、0.2M酢酸緩衝液（pH5.5）中で4
0℃、15分間反応させて得られた反応液を3,5−ジニトロ
サリチル酸法（京大農芸化学実験書。第９刷、第２巻、
619頁）で測定した。初発時の酵素活性に対する残存率
（％）と時間との関係を図４に示した。コントロール
は、モラノリンのグルコースオリゴマーを全く加えない
ものとした。

本発明に係るモラノリンのグルコースオリゴマーのα
−アミラーゼに対する安定化作用が明白である。

実施例12 β−アミラーゼの安定化（モラノリン） 大豆由来のβ−アミラーゼを500μg/mlの濃度となる
ように0.02M酢酸緩衝液（pH4.8）に溶解させたのち、60
00μg/mlとなるようにモラノリンを加えた。65℃でイン
キュベートして、経時的に残存活性を測定した。コント
ロールは、モラノリンを全く加えないものとした。

β−アミラーゼの活性の測定は、実施例11と同様の3,
5−ジニトロサリチル酸法によった。結果を図５に示し
た。

本発明に係るモラノリンのβ−アミラーゼに対する安
定化作用が明白である。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例７の結果を示す。縦軸は活性の残存率
（％）を、横軸は時間（日）を、それぞれ表す。○はコ
ントロールを、●はモラノリンを、△はＮ−メチルモラ
ノリンを、それぞれ表す。 図２は実施例８の結果を示す。縦軸は活性の残存率
（％）を、横軸は時間（日）をそれぞれ表す。●はコン
トロールを、○はモラノリンを、▲はＮ−メチルモラノ
リンを、■はＮ−エチルモラノリンを、□はＮ−（ｎ−
プロピル）モラノリンを、▼はＮ−（ｎ−ブチル）モラ
ノリンを、▽はＮ−（ｎ−アミル）モラノリンを、それ
ぞれ表す。 図３は実施例９の結果を示す。縦軸は活性の残存率
（％）を、横軸は時間（時間）を、それぞれ表す。○は
コントロールを、●はモラノリンを、△はＮ−メチルモ
ラノリンを、それぞれ表す。 図４は実施例11の結果を示す。縦軸は活性の残存率
（％）を、横軸は時間（時間）をそれぞれ表す。○はコ
ントロールを、●はモラノリンのグルコースオリゴマー
を、それぞれ表す。 図５は実施例12の結果を示す。縦軸は活性の残存率
（％）を、横軸は時間（時間）をそれぞれ表す。○はコ
ントロールを、●はモラノリンを、それぞれ表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/20 Ｃ１２Ｐ 19/20 19/22 19/22 (72)発明者 杉山 信 京都府京都市南区吉祥院西ノ庄門口町14 番地 日本新薬株式会社内 審査官 冨永 みどり

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素を基質に作用させるにあたって、次の
   一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素、低級アルキル、フェニルアルキ
   ル、フェニルアルケニル、フェニルアルキニル、フェノ
   キシアルキル、フェノキシアルケニル、又はフェノキシ
   アルキニルを表す。ここにおけるフェニルとは置換若し
   くは無置換のものを含むものとする。）で表されるＮ−
   置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコースオリゴ
   マーの存在下に反応させることを特徴とする、酵素の安
   定化法。
2. 【請求項２】酵素が、サイクロデキストリングリコシル
   トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、β−グルコシ
   ダーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びマルト
   オリゴ糖生成酵素からなる群から選択される一つの酵素
   である、請求項１記載の安定化法。
3. 【請求項３】酵素が、固定化酵素である、請求項１記載
   の安定化法。
4. 【請求項４】次の一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素、低級アルキル、フェニルアルキ
   ル、フェニルアルケニル、フェニルアルキニル、フェノ
   キシアルキル、フェノキシアルケニル、又はフェノキシ
   アルキニルを表す。ここにおけるフェニルとは置換若し
   くは無置換のものを含むものとする。）で表されるＮ−
   置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコースオリゴ
   マーを含有することを特徴とする、酵素の安定化剤。
5. 【請求項５】次の一般式〔１〕 （ここにＲは、水素、低級アルキル、フェニルアルキ
   ル、フェニルアルケニル、フェニルアルキニル、フェノ
   キシアルキル、フェノキシアルケニル、又はフェノキシ
   アルキニルを表す。ここにおけるフェニルとは置換若し
   くは無置換のものを含むものとする。）で表されるＮ−
   置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコースオリゴ
   マーを、酵素とともに存在させることを特徴とする、固
   定化酵素。
6. 【請求項６】酵素が、サイクロデキストリングリコシル
   トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、β−グルコシ
   ダーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及びマルト
   オリゴ糖生成酵素からなる群から選択される一つの酵素
   である、請求項５記載の固定化酵素。