JPH09328620A - 化学発光性基含有カルボジイミド化合物 - Google Patents
化学発光性基含有カルボジイミド化合物Info
- Publication number
- JPH09328620A JPH09328620A JP8149553A JP14955396A JPH09328620A JP H09328620 A JPH09328620 A JP H09328620A JP 8149553 A JP8149553 A JP 8149553A JP 14955396 A JP14955396 A JP 14955396A JP H09328620 A JPH09328620 A JP H09328620A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- compound
- formula
- chemiluminescent
- carbodiimide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C267/00—Carbodiimides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
- C07D219/02—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with only hydrogen, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸検出法又はイムノアッセイ法における測
定用標識として、短時間で効率よく標識することがで
き、天然由来の核酸にも標識可能であり、且つ高感度な
分析が可能な新規化学発光性基含有カルボジイミド化合
物を提供することを課題とする。 【解決手段】 下記式で代表される化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物またはその四級アンモニウム塩を、
核酸検出法又はイムノアッセイ法における標識物質とし
て用いる。 【化１】
定用標識として、短時間で効率よく標識することがで
き、天然由来の核酸にも標識可能であり、且つ高感度な
分析が可能な新規化学発光性基含有カルボジイミド化合
物を提供することを課題とする。 【解決手段】 下記式で代表される化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物またはその四級アンモニウム塩を、
核酸検出法又はイムノアッセイ法における標識物質とし
て用いる。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な化学発光性
基含有カルボジイミド化合物に関する。詳しくは、本発
明は、高感度で且つ標識が容易な検出試薬である新規な
化学発光性基含有カルボジイミド化合物及びその製造方
法、並びにそれを使用した核酸検出法又はイムノアッセ
イ法に関するものである。
基含有カルボジイミド化合物に関する。詳しくは、本発
明は、高感度で且つ標識が容易な検出試薬である新規な
化学発光性基含有カルボジイミド化合物及びその製造方
法、並びにそれを使用した核酸検出法又はイムノアッセ
イ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から、種々の生物学的分析において
は、検出可能な特定の標識物質を利用して目的物質を検
出する分析方法が開発されている。例えば、標識物質で
標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核
酸検出法では、先ず、プローブとして用いる核酸（ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ）を標識し、これをハイブリッド形成条件
下で、調べるべき核酸を含む試料と接触させる。試料中
に、プローブとして用いた核酸に相補的な塩基配列を有
する核酸が存在すれば、これとプローブが結合（ハイブ
リダイズ）し、核酸−核酸ハイブリッドが形成される。
このハイブリッドの標識物質を検出することにより目的
の核酸を検出することができる。また、標識物質で標識
した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において
は、例えば測定対象が抗原であるときは、その抗原に特
異的に結合する抗体を標識し、次いで抗原−抗体複合体
を形成させ、該複合体に含まれる標識物質を検知するこ
とによって、測定対象の抗原を検出することができる。
は、検出可能な特定の標識物質を利用して目的物質を検
出する分析方法が開発されている。例えば、標識物質で
標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核
酸検出法では、先ず、プローブとして用いる核酸（ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ）を標識し、これをハイブリッド形成条件
下で、調べるべき核酸を含む試料と接触させる。試料中
に、プローブとして用いた核酸に相補的な塩基配列を有
する核酸が存在すれば、これとプローブが結合（ハイブ
リダイズ）し、核酸−核酸ハイブリッドが形成される。
このハイブリッドの標識物質を検出することにより目的
の核酸を検出することができる。また、標識物質で標識
した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において
は、例えば測定対象が抗原であるときは、その抗原に特
異的に結合する抗体を標識し、次いで抗原−抗体複合体
を形成させ、該複合体に含まれる標識物質を検知するこ
とによって、測定対象の抗原を検出することができる。
【０００３】このような核酸検出法やイムノアッセイ法
における標識物質としては、放射性物質、ビオチンやジ
ゴキシゲニン化合物等の非放射性の標識物質、蛍光物
質、化学発光物質等が挙げられる。これらのうち、化学
発光物質は、検出感度が高い等の理由から、標識物質と
して有望である。
における標識物質としては、放射性物質、ビオチンやジ
ゴキシゲニン化合物等の非放射性の標識物質、蛍光物
質、化学発光物質等が挙げられる。これらのうち、化学
発光物質は、検出感度が高い等の理由から、標識物質と
して有望である。
【０００４】化学発光物質の標識方法としては、例え
ば、アミノリンカーが結合した核酸とアミノ基反応性基
含有化学発光物質とを反応させて核酸に化学発光物質を
標識する方法が知られている（Clinical Chemistry, Vo
l.35, No.8, p1588-1594, 1989）。
ば、アミノリンカーが結合した核酸とアミノ基反応性基
含有化学発光物質とを反応させて核酸に化学発光物質を
標識する方法が知られている（Clinical Chemistry, Vo
l.35, No.8, p1588-1594, 1989）。
【０００５】しかしながら、このような方法において
は、アミノリンカーが結合した核酸を調製する必要があ
り、操作が煩雑となるばかりでなく、天然に存在する核
酸に化学発光物質を直接結合させて標識することができ
ないという欠点があった。
は、アミノリンカーが結合した核酸を調製する必要があ
り、操作が煩雑となるばかりでなく、天然に存在する核
酸に化学発光物質を直接結合させて標識することができ
ないという欠点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸検出法
又はイムノアッセイ法における測定用標識として、短時
間で効率よく標識することができ、また天然由来の核酸
にも標識可能であり、且つ高感度な標識物質である新規
化学発光性基含有カルボジイミド化合物を提供すること
を課題とする。
又はイムノアッセイ法における測定用標識として、短時
間で効率よく標識することができ、また天然由来の核酸
にも標識可能であり、且つ高感度な標識物質である新規
化学発光性基含有カルボジイミド化合物を提供すること
を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】カルボジイミド化合物が
核酸と反応することは知られている。例えば、カルボジ
イミド化合物は核酸中の水素結合を形成していないグア
ニン及びチミンと反応して付加体を形成することが報告
されている［P. T. Gilham, J. Amer. Chem. Soc., 84,
688(1962)］。
核酸と反応することは知られている。例えば、カルボジ
イミド化合物は核酸中の水素結合を形成していないグア
ニン及びチミンと反応して付加体を形成することが報告
されている［P. T. Gilham, J. Amer. Chem. Soc., 84,
688(1962)］。
【０００８】本発明者らは、簡便で効率的な核酸及び蛋
白質への化学発光性基導入法に関して鋭意研究を重ねた
結果、カルボジイミド基の核酸、蛋白質等への高い反応
性を利用して、カルボジイミド化合物に化学発光性基を
導入することにより、上記課題を解決できることを見出
し、本発明に到達した。
白質への化学発光性基導入法に関して鋭意研究を重ねた
結果、カルボジイミド基の核酸、蛋白質等への高い反応
性を利用して、カルボジイミド化合物に化学発光性基を
導入することにより、上記課題を解決できることを見出
し、本発明に到達した。
【０００９】すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で
表される化学発光性基含有カルボジイミド化合物に関す
る。
表される化学発光性基含有カルボジイミド化合物に関す
る。
【００１０】
【化６】 Ｂ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｌ−ＣＬ ・・・（Ｉ）
【００１１】［式（Ｉ）中、Ｂはカルボジイミド基に結
合する一価の有機基を表し、ＣＬは化学発光性基を表
し、Ｌはカルボジイミド基と前記化学発光性基とを連結
するリンカーを表す。］
合する一価の有機基を表し、ＣＬは化学発光性基を表
し、Ｌはカルボジイミド基と前記化学発光性基とを連結
するリンカーを表す。］
【００１２】また、本発明は、下記一般式（ＩＶ）で表
されるカルボジイミド基含有化合物と、下記一般式
（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物とを反
応させる工程を含む、前記化学発光性基含有カルボジイ
ミド化合物の製造方法に関する。
されるカルボジイミド基含有化合物と、下記一般式
（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学発光性化合物とを反
応させる工程を含む、前記化学発光性基含有カルボジイ
ミド化合物の製造方法に関する。
【００１３】
【化７】
【００１４】［式（ＩＶ）中、Ｂは前記一般式（Ｉ）に
おけるのと同義である。Ｒ’は炭素数１〜６の直鎖もし
くは分岐のアルキル基、ｐは１〜１２の整数を表す。］
おけるのと同義である。Ｒ’は炭素数１〜６の直鎖もし
くは分岐のアルキル基、ｐは１〜１２の整数を表す。］
【００１５】
【化８】ＣＬ−Ｘ ・・・（Ｖ）
【００１６】［式（Ｖ）中、ＣＬは前記一般式（Ｉ）に
おけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子を表す。］
おけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００１７】また、本発明は、標識物質で標識した核酸
を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法に
おいて、前記標識物質として、前記化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法に関
する。
を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法に
おいて、前記標識物質として、前記化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法に関
する。
【００１８】更に、本発明は、標識物質で標識した抗原
又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識
物質として、前記化学発光性基含有カルボジイミド化合
物を用いることを特徴とする方法に関する。
又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識
物質として、前記化学発光性基含有カルボジイミド化合
物を用いることを特徴とする方法に関する。
【００１９】一般式（Ｉ）で表される本発明の化学発光
性基含有カルボジイミド化合物は、核酸塩基に対して高
い反応性を示すカルボジイミド基と、高感度な検出反応
性を示す化学発光性基とを同時に有する化合物であり、
核酸検出法やイムノアッセイ法等における標識物質とし
て有用である。
性基含有カルボジイミド化合物は、核酸塩基に対して高
い反応性を示すカルボジイミド基と、高感度な検出反応
性を示す化学発光性基とを同時に有する化合物であり、
核酸検出法やイムノアッセイ法等における標識物質とし
て有用である。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。
明する。
【００２１】（１）本発明の化学発光性基含有カルボジ
イミド化合物 本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、上
記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。すなわち、化
学発光性基（ＣＬ）が、リンカー（Ｌ）を介してカルボ
ジイミド基に結合した構造を有するものであればよい。
このようなカルボジイミド化合物のうち、好ましいもの
として以下に示す一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙
げられる。
イミド化合物 本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、上
記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。すなわち、化
学発光性基（ＣＬ）が、リンカー（Ｌ）を介してカルボ
ジイミド基に結合した構造を有するものであればよい。
このようなカルボジイミド化合物のうち、好ましいもの
として以下に示す一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙
げられる。
【００２２】
【化９】
【００２３】［式（ＩＩ）中、Ｒは水素原子又は炭素数
１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、Ｘはハロゲン
原子、ｐは１〜１２の整数を表す。Ｂ及びＣＬは各々前
記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、Ｘはハロゲン
原子、ｐは１〜１２の整数を表す。Ｂ及びＣＬは各々前
記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
【００２４】ここで、前記式（ＩＩ）中、化学発光性基
ＣＬは化学発光性を示す物質から誘導されるものであれ
ば特に限定されず、かかる化学発光性を示す物質として
は、例えばアクリジニウム誘導体、ルミノール誘導体、
イソルミノール誘導体、ジオキセタン誘導体等の、公知
の方法により検出可能な種々の化学発光物質から選ぶこ
とができる。また、それ自体は必ずしも化学発光性を示
すものではないが、化学発光物質へ容易に変換できる化
合物を用いてもよい。
ＣＬは化学発光性を示す物質から誘導されるものであれ
ば特に限定されず、かかる化学発光性を示す物質として
は、例えばアクリジニウム誘導体、ルミノール誘導体、
イソルミノール誘導体、ジオキセタン誘導体等の、公知
の方法により検出可能な種々の化学発光物質から選ぶこ
とができる。また、それ自体は必ずしも化学発光性を示
すものではないが、化学発光物質へ容易に変換できる化
合物を用いてもよい。
【００２５】これらのうち特に好ましいものは、下記式
（ＣＬ）で表される化学発光性基群から選ばれる基であ
る。尚、式中、Ｍｅはメチル基を表し、ＦＳＯ3 -はフル
オロスルホネートイオンを表す（以下、同様）。
（ＣＬ）で表される化学発光性基群から選ばれる基であ
る。尚、式中、Ｍｅはメチル基を表し、ＦＳＯ3 -はフル
オロスルホネートイオンを表す（以下、同様）。
【００２６】
【化１０】
【００２７】前記式（ＩＩ）中、Ｂは一価の有機基であ
れば特に限定されないが、好ましくは下記一般式（Ｂ）
で示した有機基群から選ばれる有機基、又はジメチルア
ミノ基、ジエチルアミノ基等の３級アミノ基若しくはそ
れらの４級アンモニウム基である。式（Ｂ）中、ｋは、
１〜１２の整数であり、好ましくは３〜６である。
れば特に限定されないが、好ましくは下記一般式（Ｂ）
で示した有機基群から選ばれる有機基、又はジメチルア
ミノ基、ジエチルアミノ基等の３級アミノ基若しくはそ
れらの４級アンモニウム基である。式（Ｂ）中、ｋは、
１〜１２の整数であり、好ましくは３〜６である。
【００２８】
【化１１】
【００２９】［式（Ｂ）中、ｋは１〜１２の整数を表
す。Ｒ0は有機基を表す。］
す。Ｒ0は有機基を表す。］
【００３０】このような本発明のカルボジイミド化合物
としては、具体的には下記一般式（ＩＩＩ）で表される
化合物又はその四級アンモニウム塩が挙げられる。
としては、具体的には下記一般式（ＩＩＩ）で表される
化合物又はその四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３１】
【化１２】
【００３２】前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の
四級アンモニウム塩としては、下記一般式（ＩＩＩ’）
で表される化合物が挙げられる。式（ＩＩＩ’）中Ｔｓ
Ｏ-は、トルエンスルホン酸イオンを表す。
四級アンモニウム塩としては、下記一般式（ＩＩＩ’）
で表される化合物が挙げられる。式（ＩＩＩ’）中Ｔｓ
Ｏ-は、トルエンスルホン酸イオンを表す。
【００３３】
【化１３】
【００３４】（２）本発明の化学発光性基含有カルボジ
イミド化合物の製造方法 本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド
は、前記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含
有化合物と、前記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有
化学発光性化合物とを反応させる工程を含む方法により
製造される。すなわち、一般式（ＩＶ）で表されるカル
ボジイミド基含有化合物は、末端にアルキルアミノ基を
有するものであり、一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含
有化学発光性化合物の末端ハロゲン原子（Ｘ）と反応
し、リンカー（一般式（Ｉ）中のＬ）が形成される。こ
の反応を以下の反応式に示す。
イミド化合物の製造方法 本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド
は、前記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含
有化合物と、前記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有
化学発光性化合物とを反応させる工程を含む方法により
製造される。すなわち、一般式（ＩＶ）で表されるカル
ボジイミド基含有化合物は、末端にアルキルアミノ基を
有するものであり、一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含
有化学発光性化合物の末端ハロゲン原子（Ｘ）と反応
し、リンカー（一般式（Ｉ）中のＬ）が形成される。こ
の反応を以下の反応式に示す。
【００３５】
【化１４】
【００３６】一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド
基含有化合物及び一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有
化学発光性化合物は、各々所望する化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することが
できる。例えば、一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイ
ミド基含有化合物の具体例としては、Ｎ−（３−ジメチ
ルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピ
ルカルボジイミド、１−エチル−３，３−ジメチルアミ
ノプロピルカルボジイミド、ビス−（３，３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド等が挙げられる。この
ようなカルボジイミド基含有化合物は、下記反応式で示
すように、先ず、ジアルキルアミノ基含有イソチオシア
ネート化合物（反応式中、ａ）をアルキルアミン（ｂ）
と反応させてチオ尿素化合物（ｃ）を合成した後、得ら
れたチオ尿素化合物について、酸化水銀、酸化鉛等を触
媒として脱硫反応を行うことにより得られる。
基含有化合物及び一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有
化学発光性化合物は、各々所望する化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することが
できる。例えば、一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイ
ミド基含有化合物の具体例としては、Ｎ−（３−ジメチ
ルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピ
ルカルボジイミド、１−エチル−３，３−ジメチルアミ
ノプロピルカルボジイミド、ビス−（３，３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド等が挙げられる。この
ようなカルボジイミド基含有化合物は、下記反応式で示
すように、先ず、ジアルキルアミノ基含有イソチオシア
ネート化合物（反応式中、ａ）をアルキルアミン（ｂ）
と反応させてチオ尿素化合物（ｃ）を合成した後、得ら
れたチオ尿素化合物について、酸化水銀、酸化鉛等を触
媒として脱硫反応を行うことにより得られる。
【００３７】
【化１５】
【００３８】ここで用いるジアルキルアミノ基含有イソ
チオシアネート化合物及びアルキルアミンは、所望する
カルボジイミド基含有化合物の構造に応じて適宜選択す
ることができる。例えば、ジアルキルアミノ基含有イソ
チオシアネート化合物としては、３−ジメチルアミノプ
ロピルイソチオシアネート、３−（４−モルホリノ）プ
ロピルイソチオシアネート等が挙げられる。また、アル
キルアミンとしては、Ｎ−（３−アミノプロピル）モル
ホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン等が挙げら
れる。
チオシアネート化合物及びアルキルアミンは、所望する
カルボジイミド基含有化合物の構造に応じて適宜選択す
ることができる。例えば、ジアルキルアミノ基含有イソ
チオシアネート化合物としては、３−ジメチルアミノプ
ロピルイソチオシアネート、３−（４−モルホリノ）プ
ロピルイソチオシアネート等が挙げられる。また、アル
キルアミンとしては、Ｎ−（３−アミノプロピル）モル
ホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン等が挙げら
れる。
【００３９】次に、一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含
有化学発光性化合物としては、下記式（Ｖ’）で表され
るアクリジニウムエステルの臭素体、ヨウ素体、塩化物
等が挙げられる。
有化学発光性化合物としては、下記式（Ｖ’）で表され
るアクリジニウムエステルの臭素体、ヨウ素体、塩化物
等が挙げられる。
【００４０】
【化１６】
【００４１】これらのハロゲン含有化学発光性化合物
は、公知の方法により検出可能な種々の化学発光物質を
２−ブロモエチルアミン、２−イオドエチルアミン、２
−クロロエチルアミン等のハロゲン化試薬と反応させる
ことにより得ることができる。このような化学発光物質
としては、下記式（Ｖ’’）に示したアクリジニウムの
コハク酸イミドエステル誘導体、ｐ−ニトロフェノール
誘導体等の化学発光物質エステル誘導体等が挙げられ
る。
は、公知の方法により検出可能な種々の化学発光物質を
２−ブロモエチルアミン、２−イオドエチルアミン、２
−クロロエチルアミン等のハロゲン化試薬と反応させる
ことにより得ることができる。このような化学発光物質
としては、下記式（Ｖ’’）に示したアクリジニウムの
コハク酸イミドエステル誘導体、ｐ−ニトロフェノール
誘導体等の化学発光物質エステル誘導体等が挙げられ
る。
【００４２】
【化１７】
【００４３】これらの個々の反応工程は、例えば通常用
いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、
塩化メチレン等の溶媒を用いて、公知の方法により行わ
れる。
いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、
塩化メチレン等の溶媒を用いて、公知の方法により行わ
れる。
【００４４】本発明においては、このようにして得られ
る前記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有
化合物と前記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学
発光性化合物とを、ジメチルホルムアミド、塩化メチレ
ン等の通常用いられる溶媒を用いて反応させることによ
り所望の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を得る
ことができる。
る前記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジイミド基含有
化合物と前記一般式（Ｖ）で表されるハロゲン含有化学
発光性化合物とを、ジメチルホルムアミド、塩化メチレ
ン等の通常用いられる溶媒を用いて反応させることによ
り所望の化学発光性基含有カルボジイミド化合物を得る
ことができる。
【００４５】更に、得られる化学発光性基カルボジイミ
ド化合物を、ジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−ト
ルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチ
ル、ヨウ化エチル、ジメチル硫酸等と反応させることに
より、所望の四級アンモニウム塩とすることができる。
ド化合物を、ジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−ト
ルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチ
ル、ヨウ化エチル、ジメチル硫酸等と反応させることに
より、所望の四級アンモニウム塩とすることができる。
【００４６】以上述べた方法により得られる本発明の化
学発光性基含有カルボジイミド化合物は、核酸検定法や
イムノアッセイ法において標識物質として好適に使用す
ることができる。その場合は、標識しようとするＤＮＡ
等の核酸又は抗原もしくは抗体等のタンパク質ととも
に、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物
を、溶媒中で混合させる等の方法で接触させることによ
り、前記核酸又はタンパク質に結合させることができ
る。すなわち、本発明の化学発光性基含有カルボジイミ
ド化合物を、核酸塩基と高い反応性を示すカルボジイミ
ド基において核酸又はタンパク質と結合させることによ
り、高感度な検出試薬として働く化学発光性物質をこれ
らに付加し、標識とすることができるのである。よっ
て、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物と
核酸又はタンパク質と結合させる場合には、カルボジイ
ミド基が反応しやすい条件下、例えばｐＨ７．５〜８．
５程度のアルカリ性の条件下で両者を接触させるのが好
ましい。
学発光性基含有カルボジイミド化合物は、核酸検定法や
イムノアッセイ法において標識物質として好適に使用す
ることができる。その場合は、標識しようとするＤＮＡ
等の核酸又は抗原もしくは抗体等のタンパク質ととも
に、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物
を、溶媒中で混合させる等の方法で接触させることによ
り、前記核酸又はタンパク質に結合させることができ
る。すなわち、本発明の化学発光性基含有カルボジイミ
ド化合物を、核酸塩基と高い反応性を示すカルボジイミ
ド基において核酸又はタンパク質と結合させることによ
り、高感度な検出試薬として働く化学発光性物質をこれ
らに付加し、標識とすることができるのである。よっ
て、本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物と
核酸又はタンパク質と結合させる場合には、カルボジイ
ミド基が反応しやすい条件下、例えばｐＨ７．５〜８．
５程度のアルカリ性の条件下で両者を接触させるのが好
ましい。
【００４７】（３）本発明の核酸検定法 本発明の化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、標
識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーション
による核酸の検出法において、標識物質として用いるこ
とができる。すなわち、化学発光性基含有カルボジイミ
ド化合物で標識された核酸は、ハイブリダイゼーション
用のプローブとして用いることができる。測定対象であ
る核酸にプローブをハイブリダイズさせて、核酸−核酸
ハイブリッドを形成させ、系から遊離のプローブを除去
した後にハイブリッドに含まれる標識物質を検知するこ
とによって、測定対象の核酸を検出することができる。
本発明においては、標識物質である化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物は、化学発光測定装置、フォトカウ
ンター等を用いて化学発光強度等を測定することにより
検知することができる。測定対象である核酸は、通常、
ナイロンメンブレン、ニトロセルロース等の膜に固定化
されて用いられる。
識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーション
による核酸の検出法において、標識物質として用いるこ
とができる。すなわち、化学発光性基含有カルボジイミ
ド化合物で標識された核酸は、ハイブリダイゼーション
用のプローブとして用いることができる。測定対象であ
る核酸にプローブをハイブリダイズさせて、核酸−核酸
ハイブリッドを形成させ、系から遊離のプローブを除去
した後にハイブリッドに含まれる標識物質を検知するこ
とによって、測定対象の核酸を検出することができる。
本発明においては、標識物質である化学発光性基含有カ
ルボジイミド化合物は、化学発光測定装置、フォトカウ
ンター等を用いて化学発光強度等を測定することにより
検知することができる。測定対象である核酸は、通常、
ナイロンメンブレン、ニトロセルロース等の膜に固定化
されて用いられる。
【００４８】本発明の核酸の検出法におけるハイブリダ
イゼーションは、核酸プローブの標識に化学発光性基含
有カルボジイミド化合物を用いる以外は、コロニーハイ
ブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーショ
ン、ドットブロットハイブリダイゼーション、サザンハ
イブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーショ
ン等の、通常の核酸のハイブリダイゼーションと特に変
わるところはない。測定対象である核酸は、ＤＮＡであ
ってもＲＮＡであってもよく、プローブに用いる核酸も
またＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
イゼーションは、核酸プローブの標識に化学発光性基含
有カルボジイミド化合物を用いる以外は、コロニーハイ
ブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーショ
ン、ドットブロットハイブリダイゼーション、サザンハ
イブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーショ
ン等の、通常の核酸のハイブリダイゼーションと特に変
わるところはない。測定対象である核酸は、ＤＮＡであ
ってもＲＮＡであってもよく、プローブに用いる核酸も
またＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００４９】プローブに用いる核酸の標識は、上記の方
法によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを
標識することによって行うことが好ましいが、標識され
たヌクレオチドをポリメラーゼ反応によってポリヌクレ
オチド又はオリゴヌクレオチドに取り込ませることによ
って行うこともできる。
法によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを
標識することによって行うことが好ましいが、標識され
たヌクレオチドをポリメラーゼ反応によってポリヌクレ
オチド又はオリゴヌクレオチドに取り込ませることによ
って行うこともできる。
【００５０】（４）本発明のイムノアッセイ法 本発明の前記化学発光性基含有カルボジイミド化合物
は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノア
ッセイ法において、前記標識物質として用いることがで
きる。
は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノア
ッセイ法において、前記標識物質として用いることがで
きる。
【００５１】測定対象が抗原であるときは、その抗原に
特異的に結合する抗体を標識し、抗原−抗体複合体を形
成させ、系から遊離の抗体を除去した後に複合体に含ま
れる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原
を検出することができる。本発明においては、標識物質
である化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、化学
発光測定装置、フォトカウンター等を用いて化学発光強
度等を測定することにより検知することができる。ま
た、抗原に特異的に結合する第１の抗体を固相化してお
き、これに抗原を結合させ、抗原に特異的に結合する第
２の抗体を標識したものを結合させてもよい。この場
合、第１の抗体と第２の抗体は、同一のポリクローナル
抗体を用いてもよく、異なるモノクローナル抗体を用い
てもよい。さらに、一方をポリクローナル抗体とし、他
方をモノクローナル抗体としてもよい。各々の方法にお
いて、標識した抗体の代わりに未標識の抗体を用い、こ
れを抗原に結合させた後に、前記抗体に結合する二次抗
体を標識したものをさらに結合させてもよい。二次抗体
は、抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリンで前記
動物と異なる動物を免疫することによって得られる。
特異的に結合する抗体を標識し、抗原−抗体複合体を形
成させ、系から遊離の抗体を除去した後に複合体に含ま
れる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原
を検出することができる。本発明においては、標識物質
である化学発光性基含有カルボジイミド化合物は、化学
発光測定装置、フォトカウンター等を用いて化学発光強
度等を測定することにより検知することができる。ま
た、抗原に特異的に結合する第１の抗体を固相化してお
き、これに抗原を結合させ、抗原に特異的に結合する第
２の抗体を標識したものを結合させてもよい。この場
合、第１の抗体と第２の抗体は、同一のポリクローナル
抗体を用いてもよく、異なるモノクローナル抗体を用い
てもよい。さらに、一方をポリクローナル抗体とし、他
方をモノクローナル抗体としてもよい。各々の方法にお
いて、標識した抗体の代わりに未標識の抗体を用い、こ
れを抗原に結合させた後に、前記抗体に結合する二次抗
体を標識したものをさらに結合させてもよい。二次抗体
は、抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリンで前記
動物と異なる動物を免疫することによって得られる。
【００５２】測定対象が抗体であるときは、その抗原に
特異的に結合する抗原を標識し、抗原−抗体複合体を形
成させ、系から遊離の抗原を除去した後に複合体に含ま
れる標識物質を検知することによって、測定対象の抗体
を検出することができる。また、測定対象である抗体に
特異的に結合する抗体が得られる場合には、その抗体を
標識したものを用い、抗体−抗体複合体を形成させても
よい。
特異的に結合する抗原を標識し、抗原−抗体複合体を形
成させ、系から遊離の抗原を除去した後に複合体に含ま
れる標識物質を検知することによって、測定対象の抗体
を検出することができる。また、測定対象である抗体に
特異的に結合する抗体が得られる場合には、その抗体を
標識したものを用い、抗体−抗体複合体を形成させても
よい。
【００５３】本発明のイムノアッセイ法は、抗原又は抗
体の標識に化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用
いる以外は、通常のイムノアッセイ法と特に変わるとこ
ろはなく、抗原又は抗体の固相化、抗原抗体反応、洗浄
操作等は、通常行われているのと同様にして行えばよ
い。また、イムノアッセイ法の態様も、直接法、間接
法、競合法等、いずれの態様も適用され得る。
体の標識に化学発光性基含有カルボジイミド化合物を用
いる以外は、通常のイムノアッセイ法と特に変わるとこ
ろはなく、抗原又は抗体の固相化、抗原抗体反応、洗浄
操作等は、通常行われているのと同様にして行えばよ
い。また、イムノアッセイ法の態様も、直接法、間接
法、競合法等、いずれの態様も適用され得る。
【００５４】
【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。
【００５５】
【実施例１】以下に示す方法で、本発明の化学発光性基
含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、各々の反応
について、各項において反応式を示す。
含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、各々の反応
について、各項において反応式を示す。
【００５６】（１）チオ尿素化合物の合成（反応式
（１）） ３−（ジメチルアミノプロピル）イソチオシアネート
１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン１５ｍ
ｌに溶解し、氷浴で冷却した。これにＮ−（３−アミノ
プロピル）モルホリン１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加
え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加えた後、
塩化メチレンで抽出し（５ｍｌ×３回）、無水炭酸カリ
ウムで乾燥した後、濃縮してＮ−（３−ジメチルアミ
ノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルチオ
尿素（下記反応式（１）中、化合物−１。以下同様。）
２．７ｇを得た（収率９８％）。
（１）） ３−（ジメチルアミノプロピル）イソチオシアネート
１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン１５ｍ
ｌに溶解し、氷浴で冷却した。これにＮ−（３−アミノ
プロピル）モルホリン１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加
え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加えた後、
塩化メチレンで抽出し（５ｍｌ×３回）、無水炭酸カリ
ウムで乾燥した後、濃縮してＮ−（３−ジメチルアミ
ノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルチオ
尿素（下記反応式（１）中、化合物−１。以下同様。）
２．７ｇを得た（収率９８％）。
【００５７】
【化１８】
【００５８】（２）カルボジイミド基含有化合物の合成
（反応式（２）） Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モ
ルホリノ）プロピルチオ尿素（化合物−１）２．７ｇ
（１０ｍｍｏｌ）をアセトン３５ｍｌに溶解し、酸化水
銀４．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加えて、還流下、２時間
撹拌した。放冷後、反応混合物をろ過した後、溶媒を留
去して粗生成物を得た。減圧蒸留により、Ｎ−（３−ジ
メチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プ
ロピルカルボジイミド（化合物−２）１．５ｇを得た
（収率６０％）。このものの沸点（ｂ．ｐ．）は１２５
〜１２８℃／０．２ｍｍＨｇであった。
（反応式（２）） Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モ
ルホリノ）プロピルチオ尿素（化合物−１）２．７ｇ
（１０ｍｍｏｌ）をアセトン３５ｍｌに溶解し、酸化水
銀４．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加えて、還流下、２時間
撹拌した。放冷後、反応混合物をろ過した後、溶媒を留
去して粗生成物を得た。減圧蒸留により、Ｎ−（３−ジ
メチルアミノ）プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プ
ロピルカルボジイミド（化合物−２）１．５ｇを得た
（収率６０％）。このものの沸点（ｂ．ｐ．）は１２５
〜１２８℃／０．２ｍｍＨｇであった。
【００５９】
【化１９】
【００６０】（３）化学発光物質の臭素体の合成（反応
式（３）） アクリジニウムのコハク酸イミドエステル誘導体（化合
物−３）４０ｍｇ（０．０８５ｍｍｏｌ）を１Ｎホウ酸
ナトリウム緩衝液とメタノールの１：１混合液１ｍｌに
溶解させた。この溶解液に２−ブロモエチルアミン塩酸
塩１８ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を加え、１８時間反応
させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にかけた。カラムは商品名Puracil C-18（ウォータ
ース社製）を用い、水：メタノールの６０：４０〜４
０：６０の勾配をかけ、紫外吸収３８０ｎｍを追跡し
た。１２分のピークを分取し、分取分を凍結乾燥し、ア
クリジニウムエステルの臭素体（化合物−４）を２７ｍ
ｇ得た。
式（３）） アクリジニウムのコハク酸イミドエステル誘導体（化合
物−３）４０ｍｇ（０．０８５ｍｍｏｌ）を１Ｎホウ酸
ナトリウム緩衝液とメタノールの１：１混合液１ｍｌに
溶解させた。この溶解液に２−ブロモエチルアミン塩酸
塩１８ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を加え、１８時間反応
させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にかけた。カラムは商品名Puracil C-18（ウォータ
ース社製）を用い、水：メタノールの６０：４０〜４
０：６０の勾配をかけ、紫外吸収３８０ｎｍを追跡し
た。１２分のピークを分取し、分取分を凍結乾燥し、ア
クリジニウムエステルの臭素体（化合物−４）を２７ｍ
ｇ得た。
【００６１】
【化２０】
【００６２】（４）化学発光性基含有カルボジイミド化
合物の合成（反応式（４）） アクリジニウムエステルの臭素体（化合物−４）２７ｍ
ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌ
中に溶解し、これにＮ−３−ジメチルアミノプロピル−
Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化
合物−２）１２ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）が溶解してい
るジメチルホルムアミド溶液２ｍｌを加え、１８時間室
温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、残った反応混合
物を少量のジメチルホルムアミドに溶解させ、これをジ
メチルエーテル中に滴下した。析出した黄色結晶を濾別
後、乾燥させ、アクリジニウムエステル基を含有するカ
ルボジイミド化合物（化合物−５）を２０ｍｇ得た。
合物の合成（反応式（４）） アクリジニウムエステルの臭素体（化合物−４）２７ｍ
ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌ
中に溶解し、これにＮ−３−ジメチルアミノプロピル−
Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化
合物−２）１２ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）が溶解してい
るジメチルホルムアミド溶液２ｍｌを加え、１８時間室
温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去し、残った反応混合
物を少量のジメチルホルムアミドに溶解させ、これをジ
メチルエーテル中に滴下した。析出した黄色結晶を濾別
後、乾燥させ、アクリジニウムエステル基を含有するカ
ルボジイミド化合物（化合物−５）を２０ｍｇ得た。
【００６３】
【化２１】
【００６４】（５）化学発光性基含有カルボジイミド化
合物の四級アンモニウム塩の合成（反応式（５）） アクリジニウムエステル基を含有するカルボジイミド化
合物（化合物−５）２０ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を
ジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解し、ｐ−トルエンス
ルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）５ｍｇ（０．０２５ｍｍ
ｏｌ）が溶解しているジメチルホルムアミド溶液２ｍｌ
を加え、１８時間室温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去
し、残った反応混合物を少量のジメチルホルムアミドに
溶解させ、これをジメチルエーテル中に滴下した。析出
した白色結晶を濾別後、乾燥させ、アクリジニウムエス
テル基を含有するカルボジイミド化合物の四級アンモニ
ウム塩（化合物−６）を１３ｍｇ得た。
合物の四級アンモニウム塩の合成（反応式（５）） アクリジニウムエステル基を含有するカルボジイミド化
合物（化合物−５）２０ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を
ジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解し、ｐ−トルエンス
ルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）５ｍｇ（０．０２５ｍｍ
ｏｌ）が溶解しているジメチルホルムアミド溶液２ｍｌ
を加え、１８時間室温で撹拌した。反応溶媒を減圧留去
し、残った反応混合物を少量のジメチルホルムアミドに
溶解させ、これをジメチルエーテル中に滴下した。析出
した白色結晶を濾別後、乾燥させ、アクリジニウムエス
テル基を含有するカルボジイミド化合物の四級アンモニ
ウム塩（化合物−６）を１３ｍｇ得た。
【００６５】
【化２２】
【００６６】
【実施例２】前記実施例１において合成された化合物−
６を用いて、以下に示す方法により、ＤＮＡに化学発光
性基を導入して化学発光物質標識ＤＮＡを作製した。
６を用いて、以下に示す方法により、ＤＮＡに化学発光
性基を導入して化学発光物質標識ＤＮＡを作製した。
【００６７】反応溶液［ファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１
８複製型：宝酒造株式会社）１μｇ；０．１Ｍ ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，５）；０．２５％ＳＤＳ；０．１Ｍの
アクリジニウムエステル基含有カルボジイミド化合物の
四級アンモニウム塩（化合物−６）］を８５℃で１分間
インキュベートした。次に、未反応の化学発光性基含有
カルボジイミド化合物（化合物−６）を除去するため
に、試料の１／９倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量の
冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で４５分間静置
した。遠心機（国産社製、Ｈ−１５００ＦＲ）により、
４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心して上層を除去
し、７０％エタノール５００μｌを加えて更に４℃、１
２０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。上層を除去し
た後、１００μｌの滅菌水に沈殿を溶解し、ＤＮＡ濃度
をＵＶ測定器（UV-VISIBLE RECORDING SPECTROPHOTOMET
ER UV-2100：島津製作所）によって調べ、−２０℃で保
存した。
８複製型：宝酒造株式会社）１μｇ；０．１Ｍ ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，５）；０．２５％ＳＤＳ；０．１Ｍの
アクリジニウムエステル基含有カルボジイミド化合物の
四級アンモニウム塩（化合物−６）］を８５℃で１分間
インキュベートした。次に、未反応の化学発光性基含有
カルボジイミド化合物（化合物−６）を除去するため
に、試料の１／９倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量の
冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で４５分間静置
した。遠心機（国産社製、Ｈ−１５００ＦＲ）により、
４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心して上層を除去
し、７０％エタノール５００μｌを加えて更に４℃、１
２０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。上層を除去し
た後、１００μｌの滅菌水に沈殿を溶解し、ＤＮＡ濃度
をＵＶ測定器（UV-VISIBLE RECORDING SPECTROPHOTOMET
ER UV-2100：島津製作所）によって調べ、−２０℃で保
存した。
【００６８】
【実施例３】実施例２で得られた化学発光標識ＤＮＡを
用いて、以下に述べるようにしてＤＮＡの検出を行っ
た。
用いて、以下に述べるようにしてＤＮＡの検出を行っ
た。
【００６９】ファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型Ｄ
ＮＡ：宝酒造（株）製）を１００ｐｇ／ｍｌから０．１
ｐｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００℃で１０分間熱
変性させ、９６ウェルマイクロタイタープレートに吸着
固定した。洗浄後、１００μｌのプレハイブリダイゼー
ション溶液［５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デン
ハーツ（Denhardt's）溶液（０．０２％ポリビニルピロ
リドン、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ）、
２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、５０
％ホルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮ
Ａ］を加え、６０℃で２時間インキュベートした。
ＮＡ：宝酒造（株）製）を１００ｐｇ／ｍｌから０．１
ｐｇ／ｍｌとなるように希釈し、１００℃で１０分間熱
変性させ、９６ウェルマイクロタイタープレートに吸着
固定した。洗浄後、１００μｌのプレハイブリダイゼー
ション溶液［５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デン
ハーツ（Denhardt's）溶液（０．０２％ポリビニルピロ
リドン、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ）、
２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、５０
％ホルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮ
Ａ］を加え、６０℃で２時間インキュベートした。
【００７０】次いで１００μｌのハイブリダイゼーショ
ン溶液［５×ＳＳＣ、１×デンハーツ溶液、２５ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、４５％ホルムア
ミド、０．２ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ、実施例
２で作製した化学発光物質標識ＤＮＡプローブ １０ｎ
／ｍｌ］を加え、４２℃で一晩インキュベートした。反
応混合物から上清を除去後、５０℃の０．２×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳを加え、５分間インキュベート（洗浄）
した。この操作を５回繰り返した。
ン溶液［５×ＳＳＣ、１×デンハーツ溶液、２５ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、４５％ホルムア
ミド、０．２ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ、実施例
２で作製した化学発光物質標識ＤＮＡプローブ １０ｎ
／ｍｌ］を加え、４２℃で一晩インキュベートした。反
応混合物から上清を除去後、５０℃の０．２×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳを加え、５分間インキュベート（洗浄）
した。この操作を５回繰り返した。
【００７１】マイクロタイタープレートを個々のウェル
に切り離し、化学発光測定装置（ルミネッセンスリーダ
ーＢＬＲ−３０１：アロカ（株）製）に設置し、０．５
％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液１２０μｌを加え、
次いで０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロ
ライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液１２０μｌ
を加え、生じる化学発光を２秒間測定したところ、０．
１ｐｇ／ｍｌの未標識ＤＮＡを検出することができた。
に切り離し、化学発光測定装置（ルミネッセンスリーダ
ーＢＬＲ−３０１：アロカ（株）製）に設置し、０．５
％過酸化水素／０．１規定硝酸溶液１２０μｌを加え、
次いで０．１２５％セチルトリメチルアンモニウムクロ
ライド／０．２５規定水酸化ナトリウム溶液１２０μｌ
を加え、生じる化学発光を２秒間測定したところ、０．
１ｐｇ／ｍｌの未標識ＤＮＡを検出することができた。
【００７２】
【実施例４】本発明の化学発光性基含有カルボジイミド
化合物を標識物質として、以下に示す方法で、化学発光
物質標識タンパク質を作製した。
化合物を標識物質として、以下に示す方法で、化学発光
物質標識タンパク質を作製した。
【００７３】反応溶液［抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）
（Anti-RABBIT-IgG(goat)、VECTER LABORATORIES社製）
１００μｇ；０．１Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）；
０．１Ｍの化学発光性基含有カルボジイミド化合物（実
施例１で得られた化合物−６）］を氷上で１０分間静置
した。全量の０．３％になるように１０％ＳＤＳを加
え、マイクロ遠心チューブ（商品名ウルトラフリーＣ３
ＬＧＣ；ミリポア(MILLIPORE)社製）を用いて、５００
０ｒｐｍで１５分間遠心し、未反応のカルボジイミド化
合物を取り除いた。さらに、フィルターカップに１００
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍ
ＭのＮａＣｌを各々５０μｌ加え、５０００ｒｐｍで１
０分間遠心した。同様の操作を再度行い、残渣をエッペ
ンドルフチューブに移し、１００ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭのＮａＣｌで０．１
Ｍの溶液に調整した後、４℃で保存した。
（Anti-RABBIT-IgG(goat)、VECTER LABORATORIES社製）
１００μｇ；０．１Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）；
０．１Ｍの化学発光性基含有カルボジイミド化合物（実
施例１で得られた化合物−６）］を氷上で１０分間静置
した。全量の０．３％になるように１０％ＳＤＳを加
え、マイクロ遠心チューブ（商品名ウルトラフリーＣ３
ＬＧＣ；ミリポア(MILLIPORE)社製）を用いて、５００
０ｒｐｍで１５分間遠心し、未反応のカルボジイミド化
合物を取り除いた。さらに、フィルターカップに１００
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍ
ＭのＮａＣｌを各々５０μｌ加え、５０００ｒｐｍで１
０分間遠心した。同様の操作を再度行い、残渣をエッペ
ンドルフチューブに移し、１００ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭのＮａＣｌで０．１
Ｍの溶液に調整した後、４℃で保存した。
【００７４】
【実施例５】実施例４で作製した化学発光物質標識タン
パク質の希釈系列を作り、化学発光測定装置（ルミネッ
センスリーダーＢＬＲ−３０１：アロカ（株）製）専用
のバイアルに１０μｌずつ分注した。このバイアルを前
記化学発光装置に設置し、０．５％過酸化水素／０．１
規定硝酸溶液３００μｌを加え、次いで０．１２５％セ
チルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定
水酸化ナトリウム溶液３００μｌを加え、生じる化学発
光を２秒間測定したところ、０．１ｐｇ／ｍｌの化学発
光物質標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）を検出すること
ができた。
パク質の希釈系列を作り、化学発光測定装置（ルミネッ
センスリーダーＢＬＲ−３０１：アロカ（株）製）専用
のバイアルに１０μｌずつ分注した。このバイアルを前
記化学発光装置に設置し、０．５％過酸化水素／０．１
規定硝酸溶液３００μｌを加え、次いで０．１２５％セ
チルトリメチルアンモニウムクロライド／０．２５規定
水酸化ナトリウム溶液３００μｌを加え、生じる化学発
光を２秒間測定したところ、０．１ｐｇ／ｍｌの化学発
光物質標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）を検出すること
ができた。
【００７５】
【発明の効果】本発明の化学発光性基含有カルボジイミ
ド化合物を用いれば、簡便な操作で高感度な核酸検出及
びイムノアッセイ法を行うことができる。
ド化合物を用いれば、簡便な操作で高感度な核酸検出及
びイムノアッセイ法を行うことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 和子 東京都足立区西新井栄町１−18−１ 日清 紡績株式会社東京研究センター内
Claims (6)
- 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で表される化学発光性
基含有カルボジイミド化合物。 【化１】 Ｂ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｌ−ＣＬ ・・・（Ｉ） ［式（Ｉ）中、Ｂはカルボジイミド基に結合する一価の
有機基を表し、ＣＬは化学発光性基を表し、Ｌはカルボ
ジイミド基と前記化学発光性基とを連結するリンカーを
表す。］ - 【請求項２】 下記一般式（ＩＩ）で表される化合物で
ある、請求項１記載の化学発光性基含有カルボジイミド
化合物。 【化２】 ［式（ＩＩ）中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６の直鎖
もしくは分岐のアルキル基、Ｘはハロゲン原子、ｐは１
〜１２の整数を表す。Ｂ及びＣＬは各々前記一般式
（Ｉ）におけるのと同義である。］ - 【請求項３】 下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物
又はその四級アンモニウム塩である、請求項１又は２記
載の化学発光性基含有カルボジイミド化合物。 【化３】 ［式（ＩＩＩ）中、Ｍｅはメチル基を表す。］ - 【請求項４】 下記一般式（ＩＶ）で表されるカルボジ
イミド基含有化合物と、下記一般式（Ｖ）で表されるハ
ロゲン含有化学発光性化合物とを反応させる工程を含
む、請求項１〜３のいずれかに記載の化学発光性基含有
カルボジイミド化合物の製造方法。 【化４】 ［式（ＩＶ）中、Ｂは前記一般式（Ｉ）におけるのと同
義である。Ｒ’は炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のア
ルキル基、ｐは１〜１２の整数を表す。］ 【化５】ＣＬ−Ｘ ・・・（Ｖ） ［式（Ｖ）中、ＣＬは前記一般式（Ｉ）におけるのと同
義であり、Ｘはハロゲン原子を表す。］ - 【請求項５】 標識物質で標識した核酸を用いるハイブ
リダイゼーションによる核酸の検出法において、前記標
識物質として、請求項１〜３のいずれかに記載の化学発
光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴と
する方法。 - 【請求項６】 標識物質で標識した抗原又は抗体を用い
るイムノアッセイ法において、前記標識物質として、請
求項１〜３のいずれかに記載の化学発光性基含有カルボ
ジイミド化合物を用いることを特徴とする方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14955396A JP3807781B2 (ja) | 1996-06-11 | 1996-06-11 | 化学発光性基含有カルボジイミド化合物 |
| US08/858,127 US5912344A (en) | 1996-06-11 | 1997-05-19 | Chemiluminescent group-containing carbodiimide compound |
| EP97303431A EP0812823B1 (en) | 1996-06-11 | 1997-05-20 | Chemiluminescent group-containing carbodiimide compound |
| DE69706098T DE69706098T2 (de) | 1996-06-11 | 1997-05-20 | Carbodiimid-Verbindungen die eine chemilumineszierende Gruppe enthalten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14955396A JP3807781B2 (ja) | 1996-06-11 | 1996-06-11 | 化学発光性基含有カルボジイミド化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09328620A true JPH09328620A (ja) | 1997-12-22 |
| JP3807781B2 JP3807781B2 (ja) | 2006-08-09 |
Family
ID=15477686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14955396A Expired - Fee Related JP3807781B2 (ja) | 1996-06-11 | 1996-06-11 | 化学発光性基含有カルボジイミド化合物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5912344A (ja) |
| EP (1) | EP0812823B1 (ja) |
| JP (1) | JP3807781B2 (ja) |
| DE (1) | DE69706098T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013510934A (ja) * | 2009-11-16 | 2013-03-28 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド | 両性イオン含有アクリジニウム化合物 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10058502B2 (en) | 2015-12-31 | 2018-08-28 | L'oreal | Nail polish compositions |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4895955A (en) * | 1988-05-27 | 1990-01-23 | Lifecodes Corporation | Non-radioactive carbodiimide precursor to nucleic acid probes |
| JPH06271581A (ja) * | 1993-03-15 | 1994-09-27 | Isamu Yamamoto | ビオチン誘導体およびその使用 |
| JP3583489B2 (ja) * | 1994-12-22 | 2004-11-04 | 日清紡績株式会社 | カルボジイミド誘導体 |
-
1996
- 1996-06-11 JP JP14955396A patent/JP3807781B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-05-19 US US08/858,127 patent/US5912344A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-20 EP EP97303431A patent/EP0812823B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-20 DE DE69706098T patent/DE69706098T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013510934A (ja) * | 2009-11-16 | 2013-03-28 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド | 両性イオン含有アクリジニウム化合物 |
| US9575062B2 (en) | 2009-11-16 | 2017-02-21 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Zwitterion-containing acridinium compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69706098D1 (de) | 2001-09-20 |
| DE69706098T2 (de) | 2002-04-18 |
| EP0812823A1 (en) | 1997-12-17 |
| EP0812823B1 (en) | 2001-08-16 |
| US5912344A (en) | 1999-06-15 |
| JP3807781B2 (ja) | 2006-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5767267A (en) | DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers | |
| CA1341637C (en) | Chemiluminescent acridinium salts | |
| EP0533200B1 (en) | Preparation and use of novel activated carbamates | |
| JPH0678289B2 (ja) | 非放射性生物学的プロ−ブ | |
| JPH0786096B2 (ja) | 高感度発光分析方法 | |
| US6506567B2 (en) | Water-soluble flourescent intercalator compound | |
| JP3583489B2 (ja) | カルボジイミド誘導体 | |
| WO2003076938A1 (en) | Novel fluorescent label compounds | |
| US6171520B1 (en) | Reagents for labeling SH groups, process for the preparation of them and method for labeling with them | |
| JP3807781B2 (ja) | 化学発光性基含有カルボジイミド化合物 | |
| EP0808829B1 (en) | Fluorescent group-containing carbodiimide compound | |
| JP2002327130A (ja) | 新規蛍光色素及び核酸の測定方法 | |
| JP3008690B2 (ja) | リガンドまたはレセプターの測定法 | |
| US5616731A (en) | Photochemical labelling of nucleic acids with digoxigenin reagents and their use in gene probe test systems | |
| EP1223226B1 (en) | Novel fluorescent dye and method of measuring nucleic acid | |
| JP3851706B2 (ja) | 蛍光性基含有カルボジイミド化合物 | |
| JP3798064B2 (ja) | カルボジイミド基含有ジゴキシゲニン誘導体 | |
| JPH05255264A (ja) | 標識剤および標識されたリガンドの製法 | |
| JP3174729B2 (ja) | アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法 | |
| US20250230179A1 (en) | Phosphoramidite compounds and methods for preparing synthetic nucleic acids | |
| JPH06158039A (ja) | 化学発光性標識剤 | |
| CN120794989A (zh) | 一种特异荧光探针及其在检测化合物与维甲酸X受体α结合能力中的应用 | |
| CN108689925B (zh) | 基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针 | |
| CN120289321A (zh) | 一种氨肽酶n荧光探针及其制备方法和应用 | |
| JP2002281978A (ja) | Ｄｎａプローブアレイを用いた標的ｄｎａのノンラベル検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060110 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060313 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060425 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060516 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |