JPH05255264A - 標識剤および標識されたリガンドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標識の際、リガンドの活性低下や標識物の収率低下を
きたさないようなアクリジニウム系標識剤を得ること。 【構成】 ４−｛２−（メチルスルホニル−４−フェニ
ルジメチルスルホニウム）オキシカルボニルエチル｝フ
ェニル−１０−アクリジニウム−９−カルボン酸エステ
ルフルオロスルホン酸塩に代表される化学発光性を有す
る水溶性アクリジニウム化合物からなる標識剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法もしくはハ
イブリダイゼーションアッセイ法用標識剤およびそれを
用いた標識されたリガンドの製法に関するものである。
更に詳しくは化学発光性アクリジニウム化合物からなる
標識剤およびこの標識剤を用いた標識されたリガンドの
製法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】化学発光性アクリジニウム化合物として
は、『イアン・ウィークス他、クリニカル・ケミストリ
ー、第２９巻、１４７４頁、１９８３年発行』に記載の
４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）
フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボン
酸エステル・フルオロスルホン酸塩が広く知られてお
り、免疫測定法などにおいて、標識リガンド用の標識剤
として用いられている。

【０００３】

【本発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
アクリジニウム化合物は水に不溶であるため、この化合
物をリガンドに標識させる反応において、この化合物を
ＤＭＦ、アセトニトリル、ジオキサンなどのような水溶
性有機溶剤に一旦溶解した後、リガンド水溶液と反応さ
せなくてはならず、このため有機溶剤によるリガンドの
活性低下あるいは標識リガンドの収率低下という重大な
問題を発生させている。

【０００４】

【課題を解決させるための手段】本発明者らは、上記問
題点を解消すべく鋭意検討を行った結果、水溶性アクリ
ジニウム化合物を用いれば上記標識の際の問題を解消で
きることを見いだし本発明に到達した。すなわち本発明
は、化学発光性を有する水溶性アクリジニウム化合物
（Ａ）からなる免疫測定法もしくはハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ法用標識剤；ならびにこの標識剤とリガン
ドを水性媒体中で反応させることを特徴とする標識され
たリガンドの製法である。

【０００５】本発明において、該水溶性アクリジニウム
化合物（Ａ）としては下式一般式化２で示される化合物
が挙げられる。

【０００６】

【化２】

【０００７】［式中Ｒ₁は水素原子、炭素数１〜１０の
アルキル基、ベンジル基又はアリール基、−Ｒ₂−は−
Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ−ＳＯ₂−又は−Ｎ（ＳＯ₂−Ｐ
ｈ）−｛−Ｐｈはハロゲン原子で置換されていてもよい
フェニル基｝、Ｒ₃〜Ｒ₁₀はそれぞれ水素原子又はハロ
ゲン原子、ｎは１〜５の整数、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂はそれぞれ水
素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、ベンジル基又は
アリール基、Ｘ^-、Ｙ^-はそれぞれアニオンを表す。］

【０００８】ここでＲ₁のうち炭素数１〜１０のアルキ
ル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペ
ンチル基などが、アリール基としてはフェニル基などが
挙げられるが、以上Ｒ₁として例示したものおよび水素
原子、ベンジル基のうち好ましいものは、メチル基、エ
チル基、ベンジル基およびフェニル基である。

【０００９】−Ｒ₂−は−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｓ
Ｏ₂−又は−Ｎ（ＳＯ₂−Ｐｈ）−｛−Ｐｈはハロゲン原
子で置換されていてもよいフェニル基｝から選ばれる
が、これらのいずれを用いることも可能である。

【００１０】Ｒ₃〜Ｒ₁₀は、それぞれ水素原子又はハロ
ゲン原子（フッ素、臭素、塩素、ヨウ素など）から選ば
れるが、これらのいずれを用いることも可能である。

【００１１】ｎは１〜５の整数である。

【００１２】Ｒ₁₁、Ｒ₁₂のうち、炭素数１〜１０のアル
キル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、
ペンチル基などが、アリール基としてはフェニル基など
が挙げられるが、以上Ｒ₁₁、Ｒ₁₂として例示したものお
よび水素原子、ベンジル基のうち好ましいものは、メチ
ル基、エチル基、ベンジル基およびフェニル基である。

【００１３】アニオンＸ^-、Ｙ^-としては、特に限定はな
いが、好ましいものはフルオロスルホン酸イオン、メタ
ンスルホン酸イオン、フルオロメタンスルホン酸イオ
ン、トリフルオロメチルスルホン酸イオンおよびハロゲ
ンイオン（フッ素イオン、臭素イオン、塩素イオン、ヨ
ウ素イオンなど）である。またＸ^-、Ｙ^-は同じであって
も、異なっていてもよい。

【００１４】上記水溶性アクリジニウム化合物（Ａ）の
具体例としては下記化３で示される化合物である４−
｛２−（４−ジメチルスルホニオフェニル）オキシカル
ボニルエチル｝フェニル−１０−アクリジニウム−９−
カルボン酸エステルフルオロスルホン酸・メチルスルホ
ン酸塩（Ａ−１）や下記化４で示されるＮ−フェニルス
ルホニル−［４−｛２−（４−ジメチルスルホニオフェ
ニル）｝オキシカルボニルエチル］フェニル−１０−メ
チルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオロスル
ホン酸・メチルスルホン酸塩（Ａ−２）などが挙げられ
る。

【００１５】

【化３】

【００１６】

【化４】

【００１７】該水溶性アクリジニウム化合物（Ａ）は通
常結晶性の粉末であり、本発明の標識剤も通常（Ａ）そ
のものである。

【００１８】該水溶性アクリジニウム化合物（Ａ）の製
法の代表例として、上記化合物（Ａ−１）、（Ａ−２）
の製法を例示すると、下記化５および化６に示すような
反応工程となる。

【００１９】

【化５】

【００２０】すなわちアクリジンカルボン酸（ａ）に塩
化チオニルなどを反応させてアクリジンカルボン酸塩化
物（ｂ）とし、さらにこれと４−ヒドロキシフェニルプ
ロピオン酸ベンジルエステルと反応させてエステル
（ｃ）を生成させる。これを臭化水素／酢酸混液で処理
して遊離のカルボン酸（ｄ）とし、これと４−ヒドロキ
シフェニルジメチルスルホニウム・メチルスルフェイト
のような化合物をＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド）などの脱水縮合剤を用いてエステル化反
応を行うことによって化合物（ｅ）が得られる。この化
合物（ｅ）をメチルフルオロスルフォネートと反応させ
ることによって目的物（Ａ−１）が得られる。

【００２１】

【化６】

【００２２】すなわち、Ａ−１の合成で得られた中間体
であるアクリジンカルボン酸塩化物（ｂ）と（Ｎ−フェ
ニルスルホニル）ベンジルオキシカルボニルエチルアニ
リンを反応させてアミド（ｆ）を生成させる。これを臭
化水素／酢酸混液で処理し遊離のカルボン酸（ｇ）と
し、これと４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウ
ム・メチルスルフェイトのような化合物をＤＣＣなどの
脱水縮合剤を用いてエステル化反応を行うことによって
化合物（ｈ）が得られる。この化合物（ｈ）をメチルフ
ルオロスルフォネートと反応させることによって目的物
（Ａ−２）が得られる。

【００２３】本発明の標識剤を用い、本発明の方法によ
って標識することができるリガンドとしては抗原、抗
体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、ビオチン、核
酸、核酸を含む分子などが挙げられる。本発明の方法に
より標識する反応は、リガンド中に存在するか、又はリ
ガンドを化学的に修飾することによって導入されたアミ
ノ基と本発明の標識剤との間の脱水縮合反応によって進
行し、アクリジニウム標識リガンドを得ることができ
る。

【００２４】本発明の方法により標識する反応の条件と
しては、通常リガンド１モル当り（Ａ）の１〜５０モル
を室温下（１０〜３０℃）で１５分程度反応させること
によって標識されたリガンドが得られる。しかしなが
ら、この条件に限定されることなく、標識されるリガン
ドの性質によって最適条件を設定することが重要であ
る。

【００２５】また本発明の方法において、標識する反応
は水性媒体中で行われるが、この水性媒体としては水そ
のものであるか、もしくはリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液などの水性媒体が好適に
用いられる。

【００２６】かくして得られるアクリジニウム標識リガ
ンドは、下記＜１＞〜＜３＞に例示するような、化学発
光免疫測定法や化学発光ハイブリダイゼーションアッセ
イ法に用いることが出来る。

【００２７】＜１＞『イアン・ウィークス他、クリニカ
ル・ケミストリー、第２９巻、１４８０頁、１９８３年
発行』には、α−フェトプロテイン（以下ＡＦＰと略
す）のサンドイッチ免疫測定において抗ＡＦＰ抗体と４
−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フ
ェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸
エステル・フルオロスルホン酸塩とを反応させて得られ
たアクリジニウム標識抗ＡＦＰ抗体を用いる方法が記載
されている。

【００２８】＜２＞競合法免疫測定については、『イア
ン・ウィークス他、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、第１３３巻、３６６頁、１９８６年発行』にやはり
４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）
フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボン
酸エステル・フルオロスルホン酸塩を標識用化合物とし
た遊離Ｔ４の測定に関する記載がある。

【００２９】＜３＞遺伝子診断の分野においても、『ジ
ェー・ライル他、クリニカル・ケミストリー第３５巻、
１５８８頁、１９８９年発行』に４−（２−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボン酸エステル・フルオロ
スルホン酸塩とオリゴＤＮＡとを反応させることによっ
て得られたプローブを用いる白血病診断に関する記載が
ある。

【００３０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。

【００３１】実施例１ ４−｛２−（４−ジメチルスルホニオフェニル）オキシ
カルボニルエチル｝フェニル−１０−アクリジニウム−
９−カルボン酸エステルフルオロスルホン酸・メチルス
ルホン酸塩（Ａ−１）の合成

【００３２】合成は、下記の通りの方法で実施した。そ
の合成スキームは前記化５の通りである。アクリジン−
９−カルボン酸（ａ）（シグマ社製）（５．０ｇ）を塩
化チオニル（半井テスク製）（７５ｍｌ）に懸濁し、混
合物を約４時間還流下に攪拌した後、過剰の塩化チオニ
ルを減圧除去しアクリジン−９−カルボン酸塩化物
（ｂ）を得た。

【００３３】（ｂ）（２．４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水
ピリジン（３０ｍｌ）中に懸濁し、４−ヒドロキシフェ
ニルプロピオン酸ベンジルエステル（９．７ｇ、１０ｍ
ｍｏｌ）を添加し、室温で一昼夜攪拌した。次いで反応
液を１規定塩酸水溶液に加え、黄色の結晶物を得た。濾
過により結晶物を分離し、さらにフィルター上において
結晶物を水で洗浄した。この結晶を減圧乾固し、さらに
ベンゼン／シクロヘキサンから再結晶して４−（２−ベ
ンジルオキシカルボニルエチル）フェニル−９−アクリ
ジンカルボン酸エステル（ｃ）を得た。 元素分析 計算値 Ｃ：７８．１％ Ｈ：５．０％
Ｎ：３．０％ 実測値 Ｃ：７７．５％ Ｈ：５．２％ Ｎ：３．１％

【００３４】（ｃ）（０．４６ｇ、１ｍｍｏｌ）を１０
ｍｌの臭化水素／酢酸混液（４５／５５ ｗ／ｗ）に溶
解し、５０〜５５℃で攪拌した。この反応液を１００ｍ
ｌの水中に投入することにより黄色結晶が得られた。こ
の結晶を濾別し、水で洗浄した後、減圧乾固した。さら
にアセトニトリル／クロロホルム（１／１ ｖ／ｖ）か
ら再結晶し、４−（２−カルボキシエチル）フェニル−
９−アクリジンカルボン酸エステル（ｄ）を得た。 元素分析 計算値 Ｃ：７４．４％ Ｈ：４．６％
Ｎ：３．８％ 実測値 Ｃ：７５．１％ Ｈ：４．５％ Ｎ：３．６％

【００３５】（ｄ）（０．３７ｇ、１ｍｍｏｌ）とサン
セラーＤＳＰ（４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホ
ニウム・メチルスルフェイト、三新化学製）（０．２７
ｇ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、氷冷下
Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（半井テスク
製）（０．２０ｇ、１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で２時
間、さらに室温で一昼夜攪拌・反応した。析出したジシ
クロヘキシルウレアを濾別し、濾液を減圧除去し、残渣
を酢酸エチルに溶解し、これを水で洗浄した。酢酸エチ
ル層をとり、これに無水硫酸ナトリウムを加え、一昼夜
放置した。

【００３６】無水硫酸ナトリウムを濾別し、濾液を減圧
濃縮した。この残渣にエーテル／石油エーテルを加える
ことにより４−｛２−（メチルスルフェート・ｐ−ジメ
チルスルホニオフェニル）オキシカルボニルエチル｝フ
ェニル−９−アクリジンカルボン酸エステル（ｅ）を得
た。 元素分析 計算値 Ｃ：６２．０％ Ｈ：４．７％
Ｎ：２．３％ 実測値 Ｃ：６３．１％ Ｈ：４．５％ Ｎ：２．２％

【００３７】（ｅ）（０．３１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を
無水アセトニトリルに溶解し、これに０．５ｍｌのメチ
ルフルオロスルフォネートを加え、室温で２０時間攪拌
した。析出した結晶を濾別し、無水ベンゼンを用いてフ
ィルター上で洗浄し、その結晶を減圧乾固して４−｛２
−（メチルスルフェート・ｐ−ジメチルスルホニオフェ
ニル）オキシカルボニルエチル｝フェニル−１０−メチ
ルアクリジニウム−９−カルボン酸エステルフルオロス
ルホン酸・メチルスルホン酸塩（Ａ−１）を得た。 元素分析 計算値 Ｃ：５３．１％ Ｈ：４．３％
Ｎ：１．９％ 実測値 Ｃ：５３．８％ Ｈ：４．６％ Ｎ：２．０％

【００３８】実施例２ Ｎ−フェニルスルホニル［４−｛２−（４−ジメチルス
ルホニオフェニル）｝オキシカルボニルエチル］フェニ
ル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミド
・フルオロスルホン酸・メチルスルホン酸塩（Ａ−２）
の合成

【００３９】合成は、下記の通りの方法で実施した。そ
の合成スキームは前記化６の通りである。

【００４０】Ａ−１の合成で得られた中間体である
（ｂ）（２．４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３
０ｍｌ）中に懸濁し、（Ｎ−フェニルスルホニル）ベン
ジルオキシカルボニルエチルアニリン（３．６ｇ、１０
ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一昼夜攪拌した。次いで反
応液を１規定塩酸水溶液に加え、黄色の結晶物を得た。
濾過により結晶物を分離し、さらにフィルター上におい
て結晶物を水で洗浄した。この結晶物を減圧乾固し、さ
らにベンゼン／シクロヘキサンから再結晶してＮ−フェ
ニルスルホニル｛４−（２−ベンジルオキシカルボニル
エチル）｝フェニル−９−アクリジンカルボキサミド
（ｆ）を得た。 元素分析 計算値 Ｃ：７２．０％ Ｈ：４．７％
Ｎ：４．７％ 実測値 Ｃ：７１．１％ Ｈ：４．６％ Ｎ：５．０％

【００４１】（ｆ）（０．６０ｇ、１ｍｍｏｌ）を１０
ｍｌの臭化水素／酢酸混液（４５／５５ ｗ／ｗ）に溶
解し、５０〜５５℃で攪拌した。この反応液を１００ｍ
ｌの水中に投入することにより黄色結晶が得られた。こ
の結晶を濾別し、水で洗浄した後、減圧乾固した。さら
にアセトニトリル／クロロホルム（１／１ ｖ／ｖ）か
ら再結晶し、Ｎ−フェニルスルホニル｛４−（２−カル
ボキシエチル）｝フェニル−９−アクリジンカルボキサ
ミド（ｇ）を得た。 元素分析 計算値 Ｃ：６８．２％ Ｈ：４．３％
Ｎ：５．５％ 実測値 Ｃ：６７．４％ Ｈ：４．１％ Ｎ：５．６％

【００４２】（ｇ）（０．５１ｇ、１ｍｍｏｌ）とサン
セラーＤＳＰ（０．２７ｇ、１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５
ｍｌ）に溶解し、氷冷下Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（０．２０ｇ、１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下
で２時間、さらに室温で一昼夜攪拌・反応した。析出し
たジシクロヘキシルウレアを濾別し、濾液を減圧除去し
た。残渣を酢酸エチルに溶解し、これを水で洗浄した。
酢酸エチル層をとり、これに無水硫酸ナトリウムを加
え、一昼夜放置した。

【００４３】無水硫酸ナトリウムを濾別し、濾液を減圧
濃縮した。この残渣にエーテル／石油エーテルを加える
ことによりＮ−フェニルスルホニル［４−｛２−（４−
ジメチルスルホニオフェニル）｝オキシカルボニルエチ
ル］フェニル−９−カルボキサミド・メチルスルホン酸
塩（ｈ）が得られた。 元素分析 計算値 Ｃ：６０．２％ Ｈ：４．５％
Ｎ：３．７％ 実測値 Ｃ：６１．０％ Ｈ：４．５％ Ｎ：３．６％

【００４４】（ｈ）（０．３８ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を
無水アセトニトリルに溶解し、これに０．５ｍｌのメチ
ルフルオロスルフォネートを加え、室温で２０時間攪拌
した。析出した結晶を濾別し、無水ベンゼンを用いてフ
ィルター上で洗浄し、その結晶を減圧乾固してＮ−フェ
ニルスルホニル［４−｛２−（４−ジメチルスルホニオ
フェニル）｝オキシカルボニルエチル］フェニル−１０
−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミド・フルオ
ロスルホン酸・メチルスルホン酸塩（Ａ−２）を得た。 元素分析 計算値 Ｃ：５３．７％ Ｈ：４．２％
Ｎ：３．２％ 実測値 Ｃ：５４．０％ Ｈ：４．４％ Ｎ：３．５％

【００４５】実施例３ アクリジニウム標識抗ＴＳＨ抗体の調製

【００４６】抗ＴＳＨモノクローナル抗体（２ｍｌ、タ
ンパク量として約３．７ｍｇ）を０．０２ｍｏｌ／ｌ
（以下Ｍと略す）、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液を用いて
透析した。また、実施例１で合成した化合物（Ａ−１）
（１ｍｇ）を試験管にとり、０．０２Ｍ、ｐＨ８．０の
リン酸緩衝液（１ｍｌ）で溶解した。透析終了した抗体
溶液に先に調製した溶液（８０μｌ）を加え、室温で約
１５分間反応した。反応終了したならば、０．０２Ｍ、
ｐＨ８．０のリン酸緩衝液で緩衝化したセファデックス
Ｇ−２５カラムに先の反応混合物をチャージし精製し
た。

【００４７】精製終了後、各フラクションのタンパク活
性と化学発光活性の両方を有するフラクションを集め、
濃縮し、防腐剤としてアジ化ナトリウムを０．１％とな
る様に添加して使用時まで２〜１０℃で保存した。これ
を「標識物１」とした。

【００４８】実施例４ （Ａ−１）に代えて（Ａ−２）を用いた以外は実施例３
と同様にして、Ａ−２を抗ＴＳＨモノクローナル抗体に
導入し、「標識物２」を得た。

【００４９】比較例 同様にアクリジニウム−Ｉ（４−（２−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルア
クリジニウム−９−カルボン酸エステル・フルオロスル
ホン酸塩、同仁化学研究所製）を用い、ウィークス等の
方法に従って抗ＴＳＨモノクローナル抗体にアクリジニ
ウム化合物を導入し、これを「標識物３」とした『クリ
ニカル・ケミストリー、第２９巻、１４８０頁、１９８
３年発行』。

【００５０】使用例 標識物１、２と標識物３の性能比較

【００５１】(1)それぞれの発光量の比較 標識物１、２および３のそれぞれタンパク量として２μ
ｇ分を１２×７５ｍｍのガラス製試験管に分注し、アロ
カ製、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサン
プルホルダーにセットした。発光反応液Ａ（０．３％過
酸化水素含有０．１規定塩酸水溶液）と発光反応液Ｂ
（オクチルフェノールエチレンオキサイド１０モル付加
物０．５％含有０．２規定水酸化ナトリウム水溶液）の
それぞれ２５０μｌを順次加え、化学発光反応を行っ
た。測定値は５秒間の積分値として得た。その際の、そ
れぞれの標識物からの発光量を下記表１に示したが、標
識物１と２からの発光量の方が標識物３からの発光量の
約２〜３倍多く、このことからも本発明のアクリジニウ
ム化合物の高い発光反応性が確認された。

【００５２】

【表１】

【００５３】(2)ＴＳＨの免疫測定におけるそれぞれの
性能の比較 抗ＴＳＨ抗体の試験管内壁への固定化 炭酸緩衝液（０．０２Ｍ）ｐＨ９．５に抗ＴＳＨモノク
ローナル抗体（実施例２で使用したモノクローナル抗体
とは別のエピトープを認識する。）を５０μｇ／ｍｌと
なるよう溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管（１
２×７５ｍｍ）にこのＴＳＨ抗体含有炭酸緩衝液を各５
００μｌずつ分注し、４℃で４８時間反応させ抗体を試
験管内壁に固定化した。反応終了後、アスピレーターを
用いて試験管内の液を除去した。生理食塩水１ｍｌで試
験管内を３回洗浄し、さらに１％牛血清アルブミン（以
下ＢＳＡと略す）を含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐ
Ｈ７．２）１ｍｌを加え、使用時まで４℃で保管した。

【００５４】アクリジニウム標識抗体液の調製 実施例２で得られた標識物１、２および３を１％ＢＳＡ
含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）で各標識
物のタンパク濃度が２μｇ／ｍｌとなるよう溶解した。

【００５５】標準液 精製ヒトＴＳＨを１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０
２Ｍ、ｐＨ７．２）で０．５、１、３、５、１０、２
５、５０μIU／ｍｌとなるよう希釈調製した。

【００５６】測定法 (1)で調製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを用いて試験管
内を１回洗浄した。洗浄した試験管に標準液または試料
（血清または血漿）１００μｌをサンプリングし、１％
ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）５
００μｌを加え、よく攪拌し、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。反応終了後、反応液をアスピレーターを
用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操
作した。この操作を３回繰り返し試料中の未反応物を除
去した。

【００５７】先の試験管にで調製した標識物１、２お
よび３の溶液それぞれ５００μｌを加え、よく攪拌し、
３７℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、反
応液をアスピレーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍ
ｌを加え再び同様に操作した。この操作を３回繰り返し
未反応の標識物１、２を除去した。

【００５８】洗浄の終了した先の試験管をアロカ製、ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホル
ダーにセットし、発光反応液Ａ、発光反応液Ｂのそれぞ
れ２５０μｌを順次加え、化学発光反応を行った。測定
値は５秒間の積分値として得た。

【００５９】それぞれの標識物を用いた場合の標準液を
検体として用いた各標準液濃度における発光量を下記表
２に示した。また各標準液濃度における発光量をグラフ
用紙にプロットし図１に示した様な検量線が得られた。
それによると免疫測定における発光量も標識物１、２を
用いた場合の方が標識物３を用いた場合より多く、本結
果から本発明のアクリジニウム化合物の高い標識反応性
が確認された。

【００６０】

【表２】

【００６１】

【発明の効果】本発明の標識剤を用いることにより、抗
原、抗体などに代表されるリガンドへのアクリジニウム
標識を水性媒体中で実施することができる。それによ
り、リガンドの活性あるいは標識リガンドの収率低下と
いったこれまでの問題を解決することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】使用例にて得られたＴＳＨの化学発光免疫測定
法による検量線である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化学発光性を有する水溶性アクリジニウ
   ム化合物（Ａ）からなるリガンドの標識剤。
2. 【請求項２】 （Ａ）が下式一般式化１で示される化合
   物である請求項１記載の標識剤。 【化１】 ［式中Ｒ₁は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、
   ベンジル基又はアリール基、−Ｒ₂−は−Ｏ−、−ＮＨ
   −、−ＮＨ−ＳＯ₂−又は−Ｎ（ＳＯ₂−Ｐｈ）−｛−Ｐ
   ｈはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル
   基｝、Ｒ₃〜Ｒ₁₀はそれぞれ水素原子又はハロゲン原
   子、ｎは１〜５の整数、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂はそれぞれ水素原
   子、炭素数１〜１０のアルキル基、ベンジル基又はアリ
   ール基、Ｘ^-、Ｙ^-はそれぞれアニオンを表す。］
3. 【請求項３】 免疫測定法用又はハイブリダイゼーショ
   ンアッセイ用である請求項１又は２記載の標識剤。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか記載の標識剤と
   リガンドとを水性媒体中で反応させることを特徴とする
   標識されたリガンドの製法。