JPH0937780A - 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 - Google Patents
耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ｐＨ６．０の緩衝液中で、５０〜６０℃のい
ずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上の活
性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、および
その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素を
用いるβ−グルコース−１−リン酸およびトレハロース
の製造方法。 【効果】 この酵素を用いて高い反応温度で酵素反応を
行うことにより、β−グルコース−１−リン酸またはト
レハロースを、雑菌汚染の低減、反応時間の短縮化を図
りつつ、工業的に有利に製造することができる。
ずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上の活
性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、および
その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素を
用いるβ−グルコース−１−リン酸およびトレハロース
の製造方法。 【効果】 この酵素を用いて高い反応温度で酵素反応を
行うことにより、β−グルコース−１−リン酸またはト
レハロースを、雑菌汚染の低減、反応時間の短縮化を図
りつつ、工業的に有利に製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な熱安定性に優れ
たマルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造
に使用する菌、およびその使用方法に関するものであ
り、さらに詳しくは、バチルス属に属する好熱性細菌が
産生する高い熱安定性を有する新規なマルトースホスホ
リラーゼ、その製造方法、該好熱性細菌、および該酵素
を用いるβ−グルコース−１−リン酸またはトレハロー
スの製造方法に関する。
たマルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造
に使用する菌、およびその使用方法に関するものであ
り、さらに詳しくは、バチルス属に属する好熱性細菌が
産生する高い熱安定性を有する新規なマルトースホスホ
リラーゼ、その製造方法、該好熱性細菌、および該酵素
を用いるβ−グルコース−１−リン酸またはトレハロー
スの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆
虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定
なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００
５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質で
ある。従来、トレハロースを調製する方法としては、酵
母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細菌によ
る発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られてい
る。しかし、これらの方法で調製したトレハロースは、
大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除去工
程が複雑である等の理由から製造コストが高くなり、非
常に高価であるため食品用途には利用することができな
かった。
虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定
なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３−５００
５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質で
ある。従来、トレハロースを調製する方法としては、酵
母からの抽出法（特開平５−２９２９８６）、細菌によ
る発酵法（特開平５−２１１８８２）等が知られてい
る。しかし、これらの方法で調製したトレハロースは、
大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除去工
程が複雑である等の理由から製造コストが高くなり、非
常に高価であるため食品用途には利用することができな
かった。
【０００３】一方、安価にトレハロースを調製する有効
な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、マ
ルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼ
を用いた同時反応法がある（特公昭６３−６０９９
８）。この方法は２種類のホスホリラーゼがそれぞれマ
ルトースとトレハロースに作用して可逆的に加リン酸分
解し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じ
る反応を利用したもので、安価な原料であるマルトース
に両酵素を同時に作用させるとトレハロースが生成する
というものである。
な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、マ
ルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼ
を用いた同時反応法がある（特公昭６３−６０９９
８）。この方法は２種類のホスホリラーゼがそれぞれマ
ルトースとトレハロースに作用して可逆的に加リン酸分
解し、グルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じ
る反応を利用したもので、安価な原料であるマルトース
に両酵素を同時に作用させるとトレハロースが生成する
というものである。
【０００４】これまでに知られているマルトースホスホ
リラーゼとしては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ８２８
７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８
１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバチルス・サンフ
ランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒ
ａｎｃｉｓｃｏ）（特開平１−９１７７８）、ラクトバ
チルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ）ＤＭＳ２００５４、ＮＣＩＢ８８３６、８５
６１、８５６２、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＭＳ
２０１７４、微工研菌寄第４６２８号、ラクトバチルス
・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅ
ｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ラクトバチルス・フエルメン
テユム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔ
ｕｍ）ＤＭＳ２００５２、ストレプトコックスｓｐｅ
ｃ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）微工
研菌寄第４６２４号、微工研菌寄第４６２５号、微工研
菌寄第４６２６号、微工研菌寄第４６２７号（特公昭６
０−５４０３６）、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏ
ｎａｓ）ＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，６９（臨時増
刊号），２８，１９９５；Ｏｙｏ Ｔｏｓｈｉｔｓｕ
Ｋａｇａｋｕ，４２（１），１９〜２５，１９９５）が
生産するものが挙げられる。
リラーゼとしては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ８２８
７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７（１２），２８
１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバチルス・サンフ
ランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒ
ａｎｃｉｓｃｏ）（特開平１−９１７７８）、ラクトバ
チルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ）ＤＭＳ２００５４、ＮＣＩＢ８８３６、８５
６１、８５６２、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＭＳ
２０１７４、微工研菌寄第４６２８号、ラクトバチルス
・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅ
ｒｉ）ＤＳＭ２００１６、ラクトバチルス・フエルメン
テユム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔ
ｕｍ）ＤＭＳ２００５２、ストレプトコックスｓｐｅ
ｃ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃ．）微工
研菌寄第４６２４号、微工研菌寄第４６２５号、微工研
菌寄第４６２６号、微工研菌寄第４６２７号（特公昭６
０−５４０３６）、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏ
ｎａｓ）ＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，６９（臨時増
刊号），２８，１９９５；Ｏｙｏ Ｔｏｓｈｉｔｓｕ
Ｋａｇａｋｕ，４２（１），１９〜２５，１９９５）が
生産するものが挙げられる。
【０００５】これらの内、酵素の理化学的性質について
詳細に調べられているのはラクトバチルス・ブレビスＡ
ＴＣＣ８２８７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７
（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバ
チルス・サンフランシスコ（特開平１−９１７７８）、
およびプレシオモナスＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，
６９（臨時増刊号），２８，１９９５）が生産するもの
だけである。これらの酵素の熱安定性は、いずれも４０
℃以下と低く、これらの酵素を用いてトレハロース製造
を行った場合、反応温度が低いため製造工程での雑菌汚
染の可能性が高いといった問題があり、工業的製造条件
で利用するのは困難である。
詳細に調べられているのはラクトバチルス・ブレビスＡ
ＴＣＣ８２８７（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３７
（１２），２８１３〜２８１９，１９７３）、ラクトバ
チルス・サンフランシスコ（特開平１−９１７７８）、
およびプレシオモナスＳＨ−３５（日本農芸化学会誌，
６９（臨時増刊号），２８，１９９５）が生産するもの
だけである。これらの酵素の熱安定性は、いずれも４０
℃以下と低く、これらの酵素を用いてトレハロース製造
を行った場合、反応温度が低いため製造工程での雑菌汚
染の可能性が高いといった問題があり、工業的製造条件
で利用するのは困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】トレハロースを安価
に、且つ、工業的規模で製造する方法としてはマルトー
スを原料としてマルトースホスホリラーゼとトレハロー
スホスホリラーゼを用いた酵素法が最も有効であると考
えられる。一方、工業的に酵素反応で生産を行う場合、
雑菌汚染の低減の目的から、反応温度の高温化が一般的
に採られている。また、反応温度の高温化は、基質と生
産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くす
ることができる、酵素反応速度が早くなり反応時間の短
縮化ができる等の利点があり、コスト的にも有利であ
る。このように高温での酵素反応でトレハロースの製造
を行うためには、高い熱安定性を有する耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼが要求される。しかし、前述のラク
トバチルス属およびプレシオモナス属起源のマルトース
ホスホリラーゼは熱安定性は必ずしも高くない。従っ
て、実際の高温酵素反応に適する酵素、具体的には５５
℃以上で安定な酵素の提供が求められていた。
に、且つ、工業的規模で製造する方法としてはマルトー
スを原料としてマルトースホスホリラーゼとトレハロー
スホスホリラーゼを用いた酵素法が最も有効であると考
えられる。一方、工業的に酵素反応で生産を行う場合、
雑菌汚染の低減の目的から、反応温度の高温化が一般的
に採られている。また、反応温度の高温化は、基質と生
産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くす
ることができる、酵素反応速度が早くなり反応時間の短
縮化ができる等の利点があり、コスト的にも有利であ
る。このように高温での酵素反応でトレハロースの製造
を行うためには、高い熱安定性を有する耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼが要求される。しかし、前述のラク
トバチルス属およびプレシオモナス属起源のマルトース
ホスホリラーゼは熱安定性は必ずしも高くない。従っ
て、実際の高温酵素反応に適する酵素、具体的には５５
℃以上で安定な酵素の提供が求められていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは高い熱安定
性を有し、マルトースからグルコースとβ−グルコース
−１−リン酸を生成する耐熱性マルトースホスホリラー
ゼを自然界より探索した結果、好熱性バチルス属細菌が
上記目的にかなう酵素をよく生産することを見出し、本
発明を完成した。そして、このような菌株を液体培養す
ることにより耐熱性マルトースホスホリラーゼを生産さ
せ、これを必要に即して精製、純化或いは固定化するこ
とにより、トレハロースの製造に利用することができる
ことを見出した。すなわち、本発明は、新規な耐熱性マ
ルトースホスホリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素の
製造に使用する菌、および該酵素を用いるβ−グルコー
ス−１−リン酸およびトレハロースの製造方法を提供す
るものである。
性を有し、マルトースからグルコースとβ−グルコース
−１−リン酸を生成する耐熱性マルトースホスホリラー
ゼを自然界より探索した結果、好熱性バチルス属細菌が
上記目的にかなう酵素をよく生産することを見出し、本
発明を完成した。そして、このような菌株を液体培養す
ることにより耐熱性マルトースホスホリラーゼを生産さ
せ、これを必要に即して精製、純化或いは固定化するこ
とにより、トレハロースの製造に利用することができる
ことを見出した。すなわち、本発明は、新規な耐熱性マ
ルトースホスホリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素の
製造に使用する菌、および該酵素を用いるβ−グルコー
ス−１−リン酸およびトレハロースの製造方法を提供す
るものである。
【０００８】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼ
の性質は以下の通りである。耐熱性マルトースホスホリ
ラーゼとしては実施例１で得たバチルスｓｐ．ＲＫ−１
より調製したものを使用した。なお、マルトースホスホ
リラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４
ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）０．０６ｍｌ、２W/V ％マルトース０．６ｍ
ｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、１５分反応
後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、こ
の反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検
査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純薬工業
（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、
５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該
測定値から反応液中の生成グルコース量を測定した。生
成したグルコースの量から、１分間に１μｍｏｌのマル
トースを加リン酸分解する酵素量を求め、これを１単位
とした。またホスホリラーゼであることを確認するため
反応終了後の反応液を陰イオン交換カラムで分離後、示
差屈折計を検出手段とする高速液体クロマトグラフィー
によりβ−グルコース−１−リン酸を定量した。
の性質は以下の通りである。耐熱性マルトースホスホリ
ラーゼとしては実施例１で得たバチルスｓｐ．ＲＫ−１
より調製したものを使用した。なお、マルトースホスホ
リラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液０．４
ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）０．０６ｍｌ、２W/V ％マルトース０．６ｍ
ｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、１５分反応
後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次に、こ
の反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコース検
査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純薬工業
（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、
５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、該
測定値から反応液中の生成グルコース量を測定した。生
成したグルコースの量から、１分間に１μｍｏｌのマル
トースを加リン酸分解する酵素量を求め、これを１単位
とした。またホスホリラーゼであることを確認するため
反応終了後の反応液を陰イオン交換カラムで分離後、示
差屈折計を検出手段とする高速液体クロマトグラフィー
によりβ−グルコース−１−リン酸を定量した。
【０００９】（１）作用 式（１）で示すように、マルトースを可逆的に加リン酸
分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作用
させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−
リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リ
ン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を
生成する。
分解する。すなわち、リン酸存在下でマルトースに作用
させると、等モルのグルコースとβ−グルコース−１−
リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−１−リ
ン酸に作用させると、等モルのトレハロースとリン酸を
生成する。
【００１０】
【化１】
【００１１】（２）基質特異性 トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、スクロース、ｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−グルコシド等を基質として加リン酸分解反応を行っ
たところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほと
んど認められなかった（表１）。 （３）至適温度 ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した（図１）。 （４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベート
し、残存活性を測定したところ、６０℃、１５分間処理
で無処理の８０％以上の活性を示した（図２）。
ルトース、セロビオース、スクロース、ｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−グルコシド等を基質として加リン酸分解反応を行っ
たところ、マルトース以外にはグルコースの生成がほと
んど認められなかった（表１）。 （３）至適温度 ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中で各種温度（４０〜８５℃）で反応させたとこ
ろ、マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜
７０℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５
０％以上を示した（図１）。 （４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でインキュベート
し、残存活性を測定したところ、６０℃、１５分間処理
で無処理の８０％以上の活性を示した（図２）。
【００１２】（５）至適ｐＨ ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０
〜８．０）または２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐ
Ｈは６．０〜７．０であった（図３）。 （６）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）と１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベー
トし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素は
ｐＨ５．５〜８．０で安定であった（図４）。 （７）分子量 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテ
ク（株））を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子
量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万であ
った。また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標準タン
パク質との相対移動度から分子量を求めた値は７．５万
〜９．５万であった。上記ゲルろ過クロマトグラフィー
とＳＤＳゲル電気泳動の結果より、本酵素は通常２量体
を形成しているものと考えられる。 （８）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。 （９）等電点 精製酵素をＭｏｎｏ Ｐ ＨＲ５／２０カラム（ファル
マシア バイオテク（株））による等電点クロマトグラ
フィーにかけ、展開緩衝液で活性が溶出された画分のｐ
Ｈから、等電点は４．７〜５．１であった。 （１０）阻害剤 １ｍＭのＨｇＣｌ2 で９９％、ＺｎＳＯ4 で３７％の活
性阻害が見られた（表２）。
〜８．０）または２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐ
Ｈは６．０〜７．０であった（図３）。 （６）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）と１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）を用いて４℃で２４時間インキュベー
トし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素は
ｐＨ５．５〜８．０で安定であった（図４）。 （７）分子量 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイオテ
ク（株））を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子
量を求めた結果、本酵素の分子量は１５万〜１９万であ
った。また、ＳＤＳゲル電気泳動により、各種標準タン
パク質との相対移動度から分子量を求めた値は７．５万
〜９．５万であった。上記ゲルろ過クロマトグラフィー
とＳＤＳゲル電気泳動の結果より、本酵素は通常２量体
を形成しているものと考えられる。 （８）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。 （９）等電点 精製酵素をＭｏｎｏ Ｐ ＨＲ５／２０カラム（ファル
マシア バイオテク（株））による等電点クロマトグラ
フィーにかけ、展開緩衝液で活性が溶出された画分のｐ
Ｈから、等電点は４．７〜５．１であった。 （１０）阻害剤 １ｍＭのＨｇＣｌ2 で９９％、ＺｎＳＯ4 で３７％の活
性阻害が見られた（表２）。
【００１３】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼ
および従来公知の微生物由来のマルトースホスホリラー
ゼの酵素学的性質を比較して表３および表４に示す。表
３および表４から明らかなように、本発明の耐熱性マル
トースホスホリラーゼは、既知のマルトースホスホリラ
ーゼと比べ、少なくとも起源とする菌種、至適温度及び
熱安定性が異なるので、新規であると判断された。
および従来公知の微生物由来のマルトースホスホリラー
ゼの酵素学的性質を比較して表３および表４に示す。表
３および表４から明らかなように、本発明の耐熱性マル
トースホスホリラーゼは、既知のマルトースホスホリラ
ーゼと比べ、少なくとも起源とする菌種、至適温度及び
熱安定性が異なるので、新規であると判断された。
【００１４】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼ
は耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微生
物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性マル
トースホスホリラーゼを採取することによって製造され
る。製造に使用される微生物としてはバチルス属に属
し、耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微
生物であればいずれの微生物でもよい。具体的には、本
発明者らが茨城県の土壌より分離したＲＫ−１株、およ
び千葉県の土壌より分離したＭＫ−１株が挙げられる。
これらの菌株の菌学的性質は表５に示す通りである。こ
れらの性質より、「バージェーズ・マニュアル・オブ・
システマティック・バクテリオロジー」ＶＯＬ２（１９
８６）に基づき、両菌株ともバチルス属に属する細菌で
あると同定したが、種については、これまでに報告され
たものと性状が一致せず、新規な種であると判断した。
すなわち、上記バージェース・マニュアルによると、バ
チルス属の菌で増殖可能な培養温度がＲＫ−１株と一致
するものは、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇ
ｕｌａｎｓ）およびバチルス・リッケンフォリミス
（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。しかし、
バチルス・リッケンフォリミスはｐＨ５．７および７％
ＮａＣｌで増殖する、プロピオン酸塩、クエン酸塩を利
用する、ゼラチンを液化するといった性質を示すためＲ
Ｋ−１株とは異なると判断できる。また、バチルス・コ
アギュランスはｐＨ５．７で増殖し、５％ＮａＣｌで増
殖しないことからＲＫ−１株と異なると判断できる。ま
た、増殖可能な培養温度がＲＫ−１株と一致するＭＫ−
１株も、上記の点のいくつか等においてバチルス・コア
ギュランスおよびバチルス・リッケンフォリミスと異な
る。両菌株とも５５℃の温度で増殖可能であったため、
好熱性細菌であり、それぞれバチルスｓｐ．ＲＫ−１、
バチルスｓｐ．ＭＫ−１と命名した。これらＲＫ−１株
およびＭＫ−１株は、通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ１５０４４およびＦ
ＥＲＭ Ｐ１５０４５として寄託されている。
は耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微生
物を栄養培地に培養し、培養物から生成した耐熱性マル
トースホスホリラーゼを採取することによって製造され
る。製造に使用される微生物としてはバチルス属に属
し、耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微
生物であればいずれの微生物でもよい。具体的には、本
発明者らが茨城県の土壌より分離したＲＫ−１株、およ
び千葉県の土壌より分離したＭＫ−１株が挙げられる。
これらの菌株の菌学的性質は表５に示す通りである。こ
れらの性質より、「バージェーズ・マニュアル・オブ・
システマティック・バクテリオロジー」ＶＯＬ２（１９
８６）に基づき、両菌株ともバチルス属に属する細菌で
あると同定したが、種については、これまでに報告され
たものと性状が一致せず、新規な種であると判断した。
すなわち、上記バージェース・マニュアルによると、バ
チルス属の菌で増殖可能な培養温度がＲＫ−１株と一致
するものは、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇ
ｕｌａｎｓ）およびバチルス・リッケンフォリミス
（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。しかし、
バチルス・リッケンフォリミスはｐＨ５．７および７％
ＮａＣｌで増殖する、プロピオン酸塩、クエン酸塩を利
用する、ゼラチンを液化するといった性質を示すためＲ
Ｋ−１株とは異なると判断できる。また、バチルス・コ
アギュランスはｐＨ５．７で増殖し、５％ＮａＣｌで増
殖しないことからＲＫ−１株と異なると判断できる。ま
た、増殖可能な培養温度がＲＫ−１株と一致するＭＫ−
１株も、上記の点のいくつか等においてバチルス・コア
ギュランスおよびバチルス・リッケンフォリミスと異な
る。両菌株とも５５℃の温度で増殖可能であったため、
好熱性細菌であり、それぞれバチルスｓｐ．ＲＫ−１、
バチルスｓｐ．ＭＫ−１と命名した。これらＲＫ−１株
およびＭＫ−１株は、通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ１５０４４およびＦ
ＥＲＭ Ｐ１５０４５として寄託されている。
【００１５】本発明で使用する微生物は野性株に限ら
ず、野性株例えば上記野性株を紫外線、エックス線、放
射線、薬品〔ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホ
ネート）等〕等を用いる既知の人工的変異手段で変異し
た変異株も、耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を
有する限り使用できる。
ず、野性株例えば上記野性株を紫外線、エックス線、放
射線、薬品〔ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル メタンスルホ
ネート）等〕等を用いる既知の人工的変異手段で変異し
た変異株も、耐熱性マルトースホスホリラーゼ産生能を
有する限り使用できる。
【００１６】本発明に使用する栄養培地としては炭素
源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要
とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然
培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマル
トース、グルコース、フラクトース、糖 、デンプン、
デキストリン、グリセリン等の炭水化物等が用いられ
る。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタ
ミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物
が用いられる。
源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要
とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然
培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマル
トース、グルコース、フラクトース、糖 、デンプン、
デキストリン、グリセリン等の炭水化物等が用いられ
る。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタ
ミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物
が用いられる。
【００１７】窒素源としてはペプトン、ポリペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆
粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタ
ブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用できる。無機
物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム等が用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微
量栄養素を必要に応じ使用する。
肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆
粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタ
ブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用できる。無機
物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム等が用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微
量栄養素を必要に応じ使用する。
【００１８】次に本発明においては培地中にマルトース
をマルトースホスホリラーゼの誘導物質として存在せし
めることなしに、耐熱性マルトースホスホリラーゼを生
産することが可能であるが、マルトースの存在によっ
て、耐熱性マルトースホスホリラーゼの生成量を増加せ
しめることができる場合がある。
をマルトースホスホリラーゼの誘導物質として存在せし
めることなしに、耐熱性マルトースホスホリラーゼを生
産することが可能であるが、マルトースの存在によっ
て、耐熱性マルトースホスホリラーゼの生成量を増加せ
しめることができる場合がある。
【００１９】培養法としては液体培養法（振盪培養法も
しくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培
養法が最も適している。培養温度は３０〜６０℃の範囲
で行うことができるが、５０〜５５℃が好適である。ｐ
Ｈは６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件
によって変わってくるが、通常１５〜４８時間程度であ
り、耐熱性マルトースホスホリラーゼの生成が確認され
たとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停
止する。
しくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌培
養法が最も適している。培養温度は３０〜６０℃の範囲
で行うことができるが、５０〜５５℃が好適である。ｐ
Ｈは６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件
によって変わってくるが、通常１５〜４８時間程度であ
り、耐熱性マルトースホスホリラーゼの生成が確認され
たとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停
止する。
【００２０】このようにして得られた培養物から本発明
の耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取するには、ま
ず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と
菌体画分に分画する。耐熱性マルトースホスホリラーゼ
は前述の両画分に検出されるが、主に培養液画分から得
られるので、この画分をさらに、限外ろ過、塩析、透
析、溶媒沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性
クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等の周知
の単離・精製方法の単独或いは組み合わせに付すことに
より、耐熱性マルトースホスホリラーゼの濃縮或いは精
製標品を得ることができる。本発明の耐熱性マルトース
ホスホリラーゼの単離・精製の具体例を実施例１に示
す。
の耐熱性マルトースホスホリラーゼを採取するには、ま
ず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と
菌体画分に分画する。耐熱性マルトースホスホリラーゼ
は前述の両画分に検出されるが、主に培養液画分から得
られるので、この画分をさらに、限外ろ過、塩析、透
析、溶媒沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性
クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等の周知
の単離・精製方法の単独或いは組み合わせに付すことに
より、耐熱性マルトースホスホリラーゼの濃縮或いは精
製標品を得ることができる。本発明の耐熱性マルトース
ホスホリラーゼの単離・精製の具体例を実施例１に示
す。
【００２１】本発明は、また、ｐＨ６．０の緩衝液中
で、５０〜６０℃のいずれかの温度で１５分処理後に無
処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホス
ホリラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリ
ン酸塩とを、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５
〜８．０で反応させることを特徴とするβ−グルコース
−１−リン酸の製造方法に関する。この場合に用いられ
る耐熱性マルトースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．
０の緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５０〜６０℃のいずれかの
温度で、好ましくは５５〜６０℃のいずれかの温度で、
特に６０℃で、１５分処理後に無処理の８０％以上の活
性を有するものが好適に用いられる。具体的には上記
（１）〜（１０）の酵素化学的性質のうち、少なくとも
（１）〜（６）、または少なくとも（１）〜（７）の性
質を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は精製酵素
であっても、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方
法に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有した粗酵素であ
ってもよい。粗酵素としては上記培養液画分等の耐熱性
マルトースホスホリラーゼ含有画分から塩析または溶媒
沈澱により沈澱させた粗酵素、またはこれをさらに前記
のような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙
げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定
化した固定化酵素を用いることも可能である。
で、５０〜６０℃のいずれかの温度で１５分処理後に無
処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホス
ホリラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリ
ン酸塩とを、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５
〜８．０で反応させることを特徴とするβ−グルコース
−１−リン酸の製造方法に関する。この場合に用いられ
る耐熱性マルトースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６．
０の緩衝液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５０〜６０℃のいずれかの
温度で、好ましくは５５〜６０℃のいずれかの温度で、
特に６０℃で、１５分処理後に無処理の８０％以上の活
性を有するものが好適に用いられる。具体的には上記
（１）〜（１０）の酵素化学的性質のうち、少なくとも
（１）〜（６）、または少なくとも（１）〜（７）の性
質を有する酵素が挙げられる。これらの酵素は精製酵素
であっても、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方
法に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有した粗酵素であ
ってもよい。粗酵素としては上記培養液画分等の耐熱性
マルトースホスホリラーゼ含有画分から塩析または溶媒
沈澱により沈澱させた粗酵素、またはこれをさらに前記
のような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙
げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定
化した固定化酵素を用いることも可能である。
【００２２】マルトースとしてはマルトースまたはマル
トース含有物（例えばマルトース高含有糖液）を用いる
ことができる。リン酸塩としてはリン酸三カリウム（も
しくはナトリウム）、リン酸水素二カリウム（もしくは
ナトリウム）、リン酸二水素カリウム（もしくはナトリ
ウム）等の水溶性リン酸塩を用いることができる。水性
媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液として
は酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を
用いることができる。
トース含有物（例えばマルトース高含有糖液）を用いる
ことができる。リン酸塩としてはリン酸三カリウム（も
しくはナトリウム）、リン酸水素二カリウム（もしくは
ナトリウム）、リン酸二水素カリウム（もしくはナトリ
ウム）等の水溶性リン酸塩を用いることができる。水性
媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液として
は酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を
用いることができる。
【００２３】酵素の使用量については、特に制限ない
が、マルトース１ｇに対し、０．１〜５０単位、好まし
くは１〜２０単位使用するのが適当である。リン酸およ
び／またはリン酸塩はマルトースに対して、特に制限な
いが、０．１〜１０倍モル、好ましくは０．５〜２倍モ
ル使用するのが適当である。なお、緩衝液がリン酸
（塩）を含有する緩衝液、例えばリン酸カリウム・クエ
ン酸緩衝液の場合には系中のリン酸およびリン酸塩の総
量が上記範囲であればよい。上記反応は雑菌汚染を避け
ると共に収率を上げるため５５〜７０℃、好ましくは５
５〜６５℃、さらに好ましくは６０〜６５℃でおこな
う。ｐＨは一般に４．５〜８．０、好ましくは５．０〜
６．０で行うのが適当である。さらに具体的には、温度
５５〜６０℃ではｐＨ４．５〜５．０で、温度６０〜６
５℃ではｐＨ５．０〜５．５で、温度６５〜７０℃では
ｐＨ５．５〜６．５で行うのが、雑菌汚染の防止上さら
に好ましい。上記条件下で十分なβ−グルコース−１−
リン酸の生成が見られた時点で反応を終了するが、反応
は通常１〜１４４時間で終了する。
が、マルトース１ｇに対し、０．１〜５０単位、好まし
くは１〜２０単位使用するのが適当である。リン酸およ
び／またはリン酸塩はマルトースに対して、特に制限な
いが、０．１〜１０倍モル、好ましくは０．５〜２倍モ
ル使用するのが適当である。なお、緩衝液がリン酸
（塩）を含有する緩衝液、例えばリン酸カリウム・クエ
ン酸緩衝液の場合には系中のリン酸およびリン酸塩の総
量が上記範囲であればよい。上記反応は雑菌汚染を避け
ると共に収率を上げるため５５〜７０℃、好ましくは５
５〜６５℃、さらに好ましくは６０〜６５℃でおこな
う。ｐＨは一般に４．５〜８．０、好ましくは５．０〜
６．０で行うのが適当である。さらに具体的には、温度
５５〜６０℃ではｐＨ４．５〜５．０で、温度６０〜６
５℃ではｐＨ５．０〜５．５で、温度６５〜７０℃では
ｐＨ５．５〜６．５で行うのが、雑菌汚染の防止上さら
に好ましい。上記条件下で十分なβ−グルコース−１−
リン酸の生成が見られた時点で反応を終了するが、反応
は通常１〜１４４時間で終了する。
【００２４】反応終了後、反応液の加熱による酵素の失
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせて、
β−グルコース−１−リン酸を得ることができる。
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせて、
β−グルコース−１−リン酸を得ることができる。
【００２５】本発明は、また、ｐＨ６．０の緩衝液中
で、５０〜６０℃のいずれかの温度で１５分処理後に無
処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホス
ホリラ−ゼ、および耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
の存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩と
を、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０
で反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法
に関する。上記において耐熱性マルトースホスホリラー
ゼとしては、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方
法におけると同様のものを用いることができる。耐熱性
トレハロースホスホリラーゼとしては、上記反応温度の
いずれかで、および上記ｐＨ範囲のいずれかで、耐熱性
マルトースホスホリラーゼの助力の下に、マルトースと
リン酸もしくはリン酸塩からトレハロースを産生し得る
ものであればよい。しかしながら、好適には、ｐＨ６．
０の緩衝液中で５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ま
しくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、さらに好まし
くは６０〜６５℃のいずれかの温度で、特に６５℃で、
１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有する耐熱
性トレハロースホスホリラーゼを用いることができる。
かかる性質を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
の例として、本発明者らによって見出されたバチルス・
ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
５６７）が産生する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
を挙げることができる。この耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼの製造例を実施例４（粗酵素）および参考例１
（精製酵素）に示す。この精製酵素の至適温度、熱安定
性、至適ｐＨおよびｐＨ安定性は以下の通りである。
で、５０〜６０℃のいずれかの温度で１５分処理後に無
処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホス
ホリラ−ゼ、および耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
の存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩と
を、水性媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０
で反応させることを特徴とするトレハロースの製造方法
に関する。上記において耐熱性マルトースホスホリラー
ゼとしては、上記β−グルコース−１−リン酸の製造方
法におけると同様のものを用いることができる。耐熱性
トレハロースホスホリラーゼとしては、上記反応温度の
いずれかで、および上記ｐＨ範囲のいずれかで、耐熱性
マルトースホスホリラーゼの助力の下に、マルトースと
リン酸もしくはリン酸塩からトレハロースを産生し得る
ものであればよい。しかしながら、好適には、ｐＨ６．
０の緩衝液中で５０〜６５℃のいずれかの温度で、好ま
しくは５５〜６５℃のいずれかの温度で、さらに好まし
くは６０〜６５℃のいずれかの温度で、特に６５℃で、
１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有する耐熱
性トレハロースホスホリラーゼを用いることができる。
かかる性質を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
の例として、本発明者らによって見出されたバチルス・
ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
５６７）が産生する耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
を挙げることができる。この耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼの製造例を実施例４（粗酵素）および参考例１
（精製酵素）に示す。この精製酵素の至適温度、熱安定
性、至適ｐＨおよびｐＨ安定性は以下の通りである。
【００２６】（１）至適温度 ４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたとこ
ろ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃
〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約
５０％以上を示した（図６）。 （２）熱安定性 １０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中でインキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、６５℃、１５分間処理で無処理の９５％以上の活性
を示した（図７）。 （３）至適ｐＨ ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０
〜７．７）及び２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．
７〜９．０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至
適ｐＨは６．５〜７．５であった（図８）。 （４）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）及び１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）を用いて６０℃で２４時間インキュベ
ートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素
はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図９）。
０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたとこ
ろ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃
〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約
５０％以上を示した（図６）。 （２）熱安定性 １０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）中でインキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、６５℃、１５分間処理で無処理の９５％以上の活性
を示した（図７）。 （３）至適ｐＨ ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０
〜７．７）及び２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．
７〜９．０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至
適ｐＨは６．５〜７．５であった（図８）。 （４）ｐＨ安定性 １００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
０〜８．０）及び１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）を用いて６０℃で２４時間インキュベ
ートし、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、本酵素
はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図９）。
【００２７】耐熱性トレハロースホスホリラーゼは耐熱
性マルトースホスホリラーゼと同様、精製酵素であって
も粗酵素であってもよく、これらの精製酵素、粗酵素は
耐熱性マルトースホスホリラーゼの場合と同様にして得
ることができる。マルトース、リン酸もしくはリン酸
塩、および水性媒体としては、上記β−グルコース−１
−リン酸の製造方法におけると同様のものを用いること
ができる。
性マルトースホスホリラーゼと同様、精製酵素であって
も粗酵素であってもよく、これらの精製酵素、粗酵素は
耐熱性マルトースホスホリラーゼの場合と同様にして得
ることができる。マルトース、リン酸もしくはリン酸
塩、および水性媒体としては、上記β−グルコース−１
−リン酸の製造方法におけると同様のものを用いること
ができる。
【００２８】酵素の使用量については、特に制限ない
が、マルトース１ｇに対して、各酵素とも、０．１〜５
０単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが適当であ
る。また、耐熱性マルトースホスホリラーゼと耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼとの使用比率は特に制限ない
が、単位の比で前者：後者＝１：５〜５：１、好ましく
は１：２〜２：１が適当である。なお、トレハロースホ
スホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液
０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２w/v ％トレハロース
０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、２
０分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。
次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グル
コース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光
純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応さ
せた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測
定し、該測定値から生成グルコース量を求めた。またト
レハロースホスホリラーゼ活性の定義については、上記
測定条件下で１分間に１μｍｏｌのトレハロースを加リ
ン酸分解する酵素量を１単位とした。
が、マルトース１ｇに対して、各酵素とも、０．１〜５
０単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが適当であ
る。また、耐熱性マルトースホスホリラーゼと耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼとの使用比率は特に制限ない
が、単位の比で前者：後者＝１：５〜５：１、好ましく
は１：２〜２：１が適当である。なお、トレハロースホ
スホリラーゼ活性は以下のように測定した。酵素溶液
０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２w/v ％トレハロース
０．６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、２
０分反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させた。
次に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グル
コース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光
純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応さ
せた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測
定し、該測定値から生成グルコース量を求めた。またト
レハロースホスホリラーゼ活性の定義については、上記
測定条件下で１分間に１μｍｏｌのトレハロースを加リ
ン酸分解する酵素量を１単位とした。
【００２９】耐熱性マルトースホスホリラーゼと耐熱性
トレハロースホスホリラーゼはマルトースに対して同時
に添加して反応を行ってもよく、マルトースにまず耐熱
性マルトースホスホリラーゼを作用させ、ついで耐熱性
トレハロースホスホリラーゼを添加して反応を行っても
よい。耐熱性トレハロースホスホリラーゼを後から添加
する場合、添加時期については特に制限ないが、効率
上、β−グルコース−１−リン酸の生成が最大になる時
点までには添加するのが好ましい。リン酸もしくはリン
酸塩のマルトースに対して、特に制限はないが、０．０
０１〜１倍モル、好ましくは０．００５〜０．５倍モル
使用するのが適当である。反応温度、反応ｐＨ、反応時
間はβ−グルコース−１−リン酸の製造の場合と同様に
して行うことができる。反応終了後のトレハロースの単
離・精製は活性炭処理、イオン交換処理、エタノール晶
出処理等の手段を適宜組み合わせて行うことができる。
トレハロースホスホリラーゼはマルトースに対して同時
に添加して反応を行ってもよく、マルトースにまず耐熱
性マルトースホスホリラーゼを作用させ、ついで耐熱性
トレハロースホスホリラーゼを添加して反応を行っても
よい。耐熱性トレハロースホスホリラーゼを後から添加
する場合、添加時期については特に制限ないが、効率
上、β−グルコース−１−リン酸の生成が最大になる時
点までには添加するのが好ましい。リン酸もしくはリン
酸塩のマルトースに対して、特に制限はないが、０．０
０１〜１倍モル、好ましくは０．００５〜０．５倍モル
使用するのが適当である。反応温度、反応ｐＨ、反応時
間はβ−グルコース−１−リン酸の製造の場合と同様に
して行うことができる。反応終了後のトレハロースの単
離・精製は活性炭処理、イオン交換処理、エタノール晶
出処理等の手段を適宜組み合わせて行うことができる。
【００３０】
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。 実施例１ バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）
による耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造及び精製
は以下のようにして行った。 （培養）酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v ％、
マルトース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．０）１０
０ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入
れ、１２１℃、２０分間オートクレープ殺菌したもの
に、バチルスｓｐ．ＲＫ−１を１白金耳植菌し、５５℃
にて１６時間振盪培養したものを種培養液とした。容量
５Ｌのファーメンターに、種培養の場合と同組成の培地
約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種培養
液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０に保
持しながら１８時間通気攪拌培養した。
する。 実施例１ バチルスｓｐ．ＲＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４４）
による耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造及び精製
は以下のようにして行った。 （培養）酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v ％、
マルトース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．０）１０
０ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入
れ、１２１℃、２０分間オートクレープ殺菌したもの
に、バチルスｓｐ．ＲＫ−１を１白金耳植菌し、５５℃
にて１６時間振盪培養したものを種培養液とした。容量
５Ｌのファーメンターに、種培養の場合と同組成の培地
約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種培養
液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０に保
持しながら１８時間通気攪拌培養した。
【００３１】（粗酵素の調製）培養終了後、培養物を遠
心分離して菌体を除去し、上清に硫安を４０〜６０％飽
和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分
離によって回収して、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、濃縮後
約３００単位／ｍｌの粗酵素液を２０ｍｌ得た。 （イオン交換クロマトグラフィー）１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥ
ＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めた
カラムに、粗酵素液を添加し、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌ
の上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活
性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩
後、さらに、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い
精製度を上げた。
心分離して菌体を除去し、上清に硫安を４０〜６０％飽
和になるよう溶解し、生じたタンパク質の沈澱を遠心分
離によって回収して、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行い、濃縮後
約３００単位／ｍｌの粗酵素液を２０ｍｌ得た。 （イオン交換クロマトグラフィー）１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＴＳＫｇｅｌＤＥ
ＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東ソー（株））を詰めた
カラムに、粗酵素液を添加し、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌ
の上昇濃度勾配によって溶出し、溶出液を分取した。活
性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩
後、さらに、一連の同じクロマトグラフィー操作を行い
精製度を上げた。
【００３２】（ゲル濾過クロマトグラフィー）０．２Ｍ
ＮａＣｌを溶解した１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
によって平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム
（ファルマシア バイオテク（株））に、上記部分精製
酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取し
た。活性のある画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩
した。 （等電点クロマトグラフィー）２５ｍＭビス・トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．１）によって平衡加したＭｏｎｏＰ
ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア バイオテク
（株））に、上記部分精製酵素液を添加し、ｐＨ４．０
に調整した展開緩衝液（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ）（ファ
ルマシア バイオテク（株））で溶出し、溶出液を分取
した。活性のある画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱
塩した。 （ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動）上記精
製酵素溶液をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、ゲルをＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染
色してタンパク質のバンドを調べたところ、一本のバン
ドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認で
きた。
ＮａＣｌを溶解した１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
によって平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム
（ファルマシア バイオテク（株））に、上記部分精製
酵素液を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取し
た。活性のある画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩
した。 （等電点クロマトグラフィー）２５ｍＭビス・トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．１）によって平衡加したＭｏｎｏＰ
ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア バイオテク
（株））に、上記部分精製酵素液を添加し、ｐＨ４．０
に調整した展開緩衝液（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ）（ファ
ルマシア バイオテク（株））で溶出し、溶出液を分取
した。活性のある画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱
塩した。 （ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動）上記精
製酵素溶液をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、ゲルをＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染
色してタンパク質のバンドを調べたところ、一本のバン
ドしか検出されず、単一タンパク質であることが確認で
きた。
【００３３】（マルトースホスホリラーゼの確認）上記
精製酵素液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２w/v ％マルトース０．
６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、１５分
反応後、１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次
に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコ
ース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純
薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させ
た後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて、反
応液中のグルコース量を測定した。また、反応停止液の
一部を陰イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー〔ＴＳＫｇｅｌ ＳＡＸ（１５０×６．０ｍｍ
φ）（東ソー（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水
溶液（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム
温度３０℃〕で分離後、示差屈折計〔Ｓｈｏｄｅｘ（昭
和電工（株））〕でβ−グルコース−１−リン酸を検出
し、定量した。その結果、反応停止液中のグルコース含
量とβ−グルコース−１リン酸含有量は等しく、精製酵
素はマルトースホスホリラーゼであることが確認され
た。
精製酵素液０．４ｍｌと０．５Ｍリン酸クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）０．０６ｍｌ、２w/v ％マルトース０．
６ｍｌ、蒸留水０．１４ｍｌを混合し、６０℃、１５分
反応後、１０分間の煮沸によって反応を停止させた。次
に、この反応停止液から０．０２ｍｌを採取し、グルコ
ース検査試薬（グルコースＣII−テストワコー；和光純
薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させ
た後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて、反
応液中のグルコース量を測定した。また、反応停止液の
一部を陰イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー〔ＴＳＫｇｅｌ ＳＡＸ（１５０×６．０ｍｍ
φ）（東ソー（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水
溶液（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム
温度３０℃〕で分離後、示差屈折計〔Ｓｈｏｄｅｘ（昭
和電工（株））〕でβ−グルコース−１−リン酸を検出
し、定量した。その結果、反応停止液中のグルコース含
量とβ−グルコース−１リン酸含有量は等しく、精製酵
素はマルトースホスホリラーゼであることが確認され
た。
【００３４】実施例２ バチルスｓｐ．ＭＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５０４５）
による耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造は以下の
ようにして行った。酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン
２w/v ％、マルトース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ
７．０）１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤー
フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺
菌したものに、バチルスｓｐ．ＭＫ−１を１白金耳植菌
し、５５℃で１６時間振盪培養したものを種培養液とし
た。容量５Ｌのファーメンターに、種培養の場合と同組
成の培地約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした
後、種培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜
７．０に保持しながら４８時間通気攪拌培養した。培養
終了後、培養物を遠心分離して菌体を分離した。この菌
体を洗浄後、１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、超音波処理
によって細胞を破砕し、遠心分離によって固形分を除去
して粗酵素液２０ｍｌを調製した。この粗酵素液は約１
０単位／ｍｌのマルトースホスホリラーゼ活性を有して
いた。
による耐熱性マルトースホスホリラーゼの製造は以下の
ようにして行った。酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン
２w/v ％、マルトース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ
７．０）１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤー
フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺
菌したものに、バチルスｓｐ．ＭＫ−１を１白金耳植菌
し、５５℃で１６時間振盪培養したものを種培養液とし
た。容量５Ｌのファーメンターに、種培養の場合と同組
成の培地約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした
後、種培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜
７．０に保持しながら４８時間通気攪拌培養した。培養
終了後、培養物を遠心分離して菌体を分離した。この菌
体を洗浄後、１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、超音波処理
によって細胞を破砕し、遠心分離によって固形分を除去
して粗酵素液２０ｍｌを調製した。この粗酵素液は約１
０単位／ｍｌのマルトースホスホリラーゼ活性を有して
いた。
【００３５】実施例３ 実施例１で調製した耐熱性マルトースホスホリラーゼ粗
酵素液（硫安分画段階のもの）を用いて、基質のマルト
ースに作用させβ−グルコース−１−リン酸の生産を試
みた。反応液はマルトース濃度３０w/v ％、酵素１０u/
g 、リン酸濃度０．５Ｍ、ｐＨ６．０となるように１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で調整し、６０℃
で４時間反応を行った。反応の停止は１０分間１００℃
に加熱して行った。反応終了後、反応液の一部を陰イオ
ン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー〔Ｔ
ＳＫｇｅｌ ＳＡＸ（１５０×６．０ｍｍφ）（東ソー
（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ
５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０
℃〕で分離後、示差屈折計〔Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工
（株））〕に付して、β−グルコース−１−リン酸の定
量を行ったところ、β−グルコース−１−リン酸が４．
６w/v ％生成していた。反応液をイオン交換カラムＴＳ
Ｋｇｅｌ ＳＡＸ（２００×５５ｍｍφ）（東ソー
（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ
５．０）、流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎの条件でクロマト
グラム分離し、β−グルコース−１−リン酸画分を分取
した。この溶液を２０％ＮａＯＨでｐＨを８．５に調整
した後、２倍容量のエタノールを加え０〜４℃に２４時
間放置して、沈澱してくるβ−グルコース−１−リン酸
２ナトリウム塩を遠心分離により回収した。その結果、
収率９０％で純度９５％以上のβ−グルコース−１−リ
ン酸２ナトリウム塩を得た。
酵素液（硫安分画段階のもの）を用いて、基質のマルト
ースに作用させβ−グルコース−１−リン酸の生産を試
みた。反応液はマルトース濃度３０w/v ％、酵素１０u/
g 、リン酸濃度０．５Ｍ、ｐＨ６．０となるように１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で調整し、６０℃
で４時間反応を行った。反応の停止は１０分間１００℃
に加熱して行った。反応終了後、反応液の一部を陰イオ
ン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー〔Ｔ
ＳＫｇｅｌ ＳＡＸ（１５０×６．０ｍｍφ）（東ソー
（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ
５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０
℃〕で分離後、示差屈折計〔Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工
（株））〕に付して、β−グルコース−１−リン酸の定
量を行ったところ、β−グルコース−１−リン酸が４．
６w/v ％生成していた。反応液をイオン交換カラムＴＳ
Ｋｇｅｌ ＳＡＸ（２００×５５ｍｍφ）（東ソー
（株））、溶離液０．１Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ
５．０）、流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎの条件でクロマト
グラム分離し、β−グルコース−１−リン酸画分を分取
した。この溶液を２０％ＮａＯＨでｐＨを８．５に調整
した後、２倍容量のエタノールを加え０〜４℃に２４時
間放置して、沈澱してくるβ−グルコース−１−リン酸
２ナトリウム塩を遠心分離により回収した。その結果、
収率９０％で純度９５％以上のβ−グルコース−１−リ
ン酸２ナトリウム塩を得た。
【００３６】実施例４ （耐熱性トレハロースホスホリラーゼの調製）肉エキス
０．１２w/v ％、ポリペプトン０．４w/v ％、ＮａＣｌ
０．２w/v％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、
１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、バ
チルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）を１白金耳植菌し、５５℃で１６時間
振盪培養したものを種培養液とした。容量５Ｌのファー
メンターに、酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v
％、トレハロース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．
０）約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種
培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０
に保持しながら４０時間通気攪拌培養した。培養終了
後、培養物を遠心分離して菌体を分離し、上清に硫安を
８０％飽和になるように溶解し、析出したタンパク質を
遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行
い、濃縮後、トレハロースホスホリラーゼ活性約２２０
単位／ｍｌの粗酵素液を２０ｍｌ得た。
０．１２w/v ％、ポリペプトン０．４w/v ％、ＮａＣｌ
０．２w/v％を含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに入れ、
１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したものに、バ
チルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）を１白金耳植菌し、５５℃で１６時間
振盪培養したものを種培養液とした。容量５Ｌのファー
メンターに、酵母エキス１w/v ％、ポリペプトン２w/v
％、トレハロース１w/v ％を含有する培地（ｐＨ７．
０）約３Ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃とした後、種
培養液２v/v ％を接種し、５５℃、ｐＨ６．０〜７．０
に保持しながら４０時間通気攪拌培養した。培養終了
後、培養物を遠心分離して菌体を分離し、上清に硫安を
８０％飽和になるように溶解し、析出したタンパク質を
遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ緩衝液に対して透析を行
い、濃縮後、トレハロースホスホリラーゼ活性約２２０
単位／ｍｌの粗酵素液を２０ｍｌ得た。
【００３７】（マルトースからトレハロースの生成反
応）このようにして調製した耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼ粗酵素液と実施例１で調製した耐熱性マルトー
スホスホリラーゼ粗酵素（硫安分画段階のもの）を用い
て、基質のマルトースに作用させトレハロースへ変換さ
せた。すなわち、表６に示す、マルトース濃度（２０ま
たは３０w/w ％）、リン酸濃度（５〜３００ｍＭ）、各
酵素量（１〜１０単位／g)（各酵素は同じ単位量使用し
た）、温度・ｐＨ・時間条件で酵素反応を行った。な
お、ｐＨ調整は酢酸緩衝液で行った。反応の停止は１０
分間１００℃に加熱して行った。反応終了後、各反応液
を、ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー
（株））、溶離液アセトニトリル／水（７８／２４）、
流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折
計Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））を検出手段とする高
速液体クロマトグラフィーに付して、各反応液の糖組成
を定量した。また、β−グルコース−１−リン酸は反応
液を、実施例１と同様の陰イオン交換カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表６
に示す。反応温度６０〜７０℃、ｐＨ５．０〜６．０の
反応条件で１８〜６５％の収率でマルトースがトレハロ
ースに変換された。
応）このようにして調製した耐熱性トレハロースホスホ
リラーゼ粗酵素液と実施例１で調製した耐熱性マルトー
スホスホリラーゼ粗酵素（硫安分画段階のもの）を用い
て、基質のマルトースに作用させトレハロースへ変換さ
せた。すなわち、表６に示す、マルトース濃度（２０ま
たは３０w/w ％）、リン酸濃度（５〜３００ｍＭ）、各
酵素量（１〜１０単位／g)（各酵素は同じ単位量使用し
た）、温度・ｐＨ・時間条件で酵素反応を行った。な
お、ｐＨ調整は酢酸緩衝液で行った。反応の停止は１０
分間１００℃に加熱して行った。反応終了後、各反応液
を、ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｏ８０カラム（東ソー
（株））、溶離液アセトニトリル／水（７８／２４）、
流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折
計Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工（株））を検出手段とする高
速液体クロマトグラフィーに付して、各反応液の糖組成
を定量した。また、β−グルコース−１−リン酸は反応
液を、実施例１と同様の陰イオン交換カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表６
に示す。反応温度６０〜７０℃、ｐＨ５．０〜６．０の
反応条件で１８〜６５％の収率でマルトースがトレハロ
ースに変換された。
【００３８】実施例５ （トレハロース含有糖液、トレハロース高含有糖液及び
その粉末の製造）コーンスターチにα−アミラーゼを作
用させた澱粉液化液に枝切り酵素（天野製薬（株）販売
／プルラナーゼ「アマノ」）とβ−アミラーゼ（長瀬産
業（株）販売／β−アミラーゼ）を作用させて調製した
マルトース高含有糖液（固形分３０w/w ％、固形分当た
りのマルトース純度８０％）に、実施例１で調製したバ
チルスｓｐ．ＲＫ−１の耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ粗酵素液（硫安分画段階のもの）と実施例４で調製し
たバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１の耐熱性
トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液をそれぞれ固形分
１ｇ当たり１０単位になるように加え、さらに、リン酸
濃度１０ｍＭになるようにリン酸カリウムを加えて、６
０℃、ｐＨ５．０で７２時間反応させ、次いで１００℃
で１０分間加熱して酵素を失活させた。
その粉末の製造）コーンスターチにα−アミラーゼを作
用させた澱粉液化液に枝切り酵素（天野製薬（株）販売
／プルラナーゼ「アマノ」）とβ−アミラーゼ（長瀬産
業（株）販売／β−アミラーゼ）を作用させて調製した
マルトース高含有糖液（固形分３０w/w ％、固形分当た
りのマルトース純度８０％）に、実施例１で調製したバ
チルスｓｐ．ＲＫ−１の耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ粗酵素液（硫安分画段階のもの）と実施例４で調製し
たバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１の耐熱性
トレハロースホスホリラーゼ粗酵素液をそれぞれ固形分
１ｇ当たり１０単位になるように加え、さらに、リン酸
濃度１０ｍＭになるようにリン酸カリウムを加えて、６
０℃、ｐＨ５．０で７２時間反応させ、次いで１００℃
で１０分間加熱して酵素を失活させた。
【００３９】この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換
樹脂で脱塩した後、濃度約７０％まで濃縮し、トレハロ
ース含有糖液を得た。この糖液を実施例４と同様に高速
液体クロマトグラフィーによって分析したチャートを図
５に示す。固形分当たりの割合（w/w)はグルコース１．
５％、トレハロース６４．５％、マルトース１８．０
％、マルトトリオース１１．２％、その他マルトオリゴ
糖４．８％であった。また、前記反応液に固形分１ｇ当
たり１単位になるようにグルコアミラーゼ（生化学工業
販売／グルコアミラーゼ）を加え、５５℃で８時間反応
させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せた。この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で
脱塩した後、濃度約５０％まで濃縮し、ナトリウム型イ
オン交換カラムで分離を行い、トレハロース画分を分取
した。この分取した糖液を濃縮し、固形分７０％で固形
分当たり９２％のトレハロースを含有するトレハロース
高含有糖液を得た。さらに、このトレハロース高含有糖
液を濃縮後乾燥することにより粉末トレハロースを得る
ことができた。
樹脂で脱塩した後、濃度約７０％まで濃縮し、トレハロ
ース含有糖液を得た。この糖液を実施例４と同様に高速
液体クロマトグラフィーによって分析したチャートを図
５に示す。固形分当たりの割合（w/w)はグルコース１．
５％、トレハロース６４．５％、マルトース１８．０
％、マルトトリオース１１．２％、その他マルトオリゴ
糖４．８％であった。また、前記反応液に固形分１ｇ当
たり１単位になるようにグルコアミラーゼ（生化学工業
販売／グルコアミラーゼ）を加え、５５℃で８時間反応
させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せた。この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂で
脱塩した後、濃度約５０％まで濃縮し、ナトリウム型イ
オン交換カラムで分離を行い、トレハロース画分を分取
した。この分取した糖液を濃縮し、固形分７０％で固形
分当たり９２％のトレハロースを含有するトレハロース
高含有糖液を得た。さらに、このトレハロース高含有糖
液を濃縮後乾燥することにより粉末トレハロースを得る
ことができた。
【００４０】参考例１ バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。 （培養）ＳＫ−１株を、酵母エキス０．５w/v ％、ポリ
ペプトン２w/v ％、マルトース１w/v ％（ｐＨ７．０）
からなる、１２１℃、２０分間オートクレープ殺菌した
液体培地に１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気振盪
培養後、遠心分離によって菌体と培養液とを分離した。
Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの製造及び精製は以下のようにして行った。 （培養）ＳＫ−１株を、酵母エキス０．５w/v ％、ポリ
ペプトン２w/v ％、マルトース１w/v ％（ｐＨ７．０）
からなる、１２１℃、２０分間オートクレープ殺菌した
液体培地に１白金耳植菌し、５５℃で７２時間通気振盪
培養後、遠心分離によって菌体と培養液とを分離した。
【００４１】（粗酵素の調製）分離した培養液に硫安を
４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質
の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン酸カ
リウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ
緩衝液に対して透析を行い、粗酵素液とした。 （イオン交換クロマトグラフィー）１０ｍＭリン酸カリ
ウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化し
た、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東
ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、５
カラム容量の０〜０．４Ｍ ＮａＣｌの上昇濃度勾配に
よって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合
わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮、脱塩後、さらに、一連
の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
４０〜６０％飽和になるよう溶解し、生じたタンパク質
の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン酸カ
リウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同じ
緩衝液に対して透析を行い、粗酵素液とした。 （イオン交換クロマトグラフィー）１０ｍＭリン酸カリ
ウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化し
た、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６５０Ｍ（東
ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を添加し、５
カラム容量の０〜０．４Ｍ ＮａＣｌの上昇濃度勾配に
よって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合
わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮、脱塩後、さらに、一連
の同じクロマトグラフィー操作を行い精製度を上げた。
【００４２】（疎水クロマトグラフィー）４０％飽和と
なるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸
カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡
化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５
０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、上記部分精製
酵素液を添加し、８カラム容量の４０〜０％飽和硫酸ア
ンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、溶出液
を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用
いて濃縮、脱塩を行った。 （吸着クロマトグラフィー）０．３ｍＭとなるようにＣ
ａＣｌ2 を溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＰＥＮＴＡ
Ｘ ＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部分精製酵素液を
添加し、１０カラム容量の１０〜３００ｍＭリン酸カリ
ウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇濃度勾配に
よって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合
わせ、限外ろ過膜を用いて濃度、脱塩を行った。
なるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸
カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡
化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５
０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、上記部分精製
酵素液を添加し、８カラム容量の４０〜０％飽和硫酸ア
ンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、溶出液
を分取した。活性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用
いて濃縮、脱塩を行った。 （吸着クロマトグラフィー）０．３ｍＭとなるようにＣ
ａＣｌ2 を溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化した、ＰＥＮＴＡ
Ｘ ＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部分精製酵素液を
添加し、１０カラム容量の１０〜３００ｍＭリン酸カリ
ウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の上昇濃度勾配に
よって溶出し、溶出液を分取した。活性のある画分を合
わせ、限外ろ過膜を用いて濃度、脱塩を行った。
【００４３】（ゲル濾過クロマトグラフィー）０．２Ｍ
となるようにＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウ
ム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化し
た、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイ
オテク（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液
を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活
性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩
を行った。 （ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動）上記精
製酵素溶液をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバンドを調べ
たところ一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質
であることが確認できた。
となるようにＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウ
ム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化し
た、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア バイ
オテク（株））を詰めたカラムに、上記部分精製酵素液
を添加し、同じ緩衝液で溶出し、溶出液を分取した。活
性のある画分を合わせ、限外ろ過膜を用いて濃縮・脱塩
を行った。 （ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動）上記精
製酵素溶液をネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバンドを調べ
たところ一本のバンドしか検出されず、単一タンパク質
であることが確認できた。
【００４４】
【発明の効果】本発明によって提供されるマルトースホ
スホリラーゼは耐熱性を有し、マルトースおよびリン酸
からβ−グルコース−１−リン酸を生成する。この酵
素、またはこの酵素およびトレハロースホスホリラーゼ
を用いて、マルトースおよびリン酸から、それぞれβ−
グルコース−１−リン酸またはトレハロースを、雑菌汚
染の低減、反応時間の短縮化を図りつつ、工業的に有利
に製造することができる。
スホリラーゼは耐熱性を有し、マルトースおよびリン酸
からβ−グルコース−１−リン酸を生成する。この酵
素、またはこの酵素およびトレハロースホスホリラーゼ
を用いて、マルトースおよびリン酸から、それぞれβ−
グルコース−１−リン酸またはトレハロースを、雑菌汚
染の低減、反応時間の短縮化を図りつつ、工業的に有利
に製造することができる。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
【図１】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの至適温度を示す。
ーゼの至適温度を示す。
【図２】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの熱安定性を示す。
ーゼの熱安定性を示す。
【図３】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼの至適ｐＨを示す。
ーゼの至適ｐＨを示す。
【図４】本発明で得られた耐熱性マルトースホスホリラ
ーゼのｐＨ安定性を示す。
ーゼのｐＨ安定性を示す。
【図５】本発明の耐熱性マルトースホスホリラーゼ、お
よび耐熱性トレハロースホスホリラーゼをマルトース高
含有糖液に作用させて得られたトレハロース含有糖液を
高速液体クロマトグラフィーにより分析したチャートを
示す（実施例５）。
よび耐熱性トレハロースホスホリラーゼをマルトース高
含有糖液に作用させて得られたトレハロース含有糖液を
高速液体クロマトグラフィーにより分析したチャートを
示す（実施例５）。
【図６】マルトースとリン酸もしくはリン酸塩との反応
によるトレハロースの製造に使用し得る、バチルス・ス
テアロサーモフィラスＳＫ−１から得られた、耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼの至適温度を示す。
によるトレハロースの製造に使用し得る、バチルス・ス
テアロサーモフィラスＳＫ−１から得られた、耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼの至適温度を示す。
【図７】バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１か
ら得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの熱安
定性を示す。
ら得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの熱安
定性を示す。
【図８】バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１か
ら得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適
ｐＨを示す。
ら得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼの至適
ｐＨを示す。
【図９】バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１か
ら得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼのｐＨ
安定性を示す。
ら得られた、耐熱性トレハロースホスホリラーゼのｐＨ
安定性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (8)
- 【請求項１】 ｐＨ６．０の緩衝液中で、５０〜６０℃
のいずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上
の活性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼ。 - 【請求項２】 下記の酵素学的性質を有する耐熱性マル
トースホスホリラーゼ： （１）作用 マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リ
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等
モルのマルトースとリン酸を生成する。 （２）基質特異性 マルトースに特異的に作用する。 （３）至適温度 マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜７０
℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％
以上を示す。 （４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６０℃、１５
分間処理後に無処理の約８０％の活性を有する。 （５）至適ｐＨ ６．０〜７．０。 （６）ｐＨ安定性 ｐＨ５．５〜８．０で安定。 （７）分子量 ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１５万
〜１９万。 - 【請求項３】 下記の酵素学的性質を有する耐熱性マル
トースホスホリラーゼ： （１）作用 マルトースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、リ
ン酸存在下でマルトースに作用させると、等モルのグル
コースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グルコ
ースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると、等
モルのトレハロースとリン酸を生成する。 （２）基質特異性 マルトースに特異的に作用する。 （３）至適温度 マルトース加リン酸分解反応の至適温度は５５℃〜７０
℃付近で、５０℃〜７０℃の範囲で最高活性の約５０％
以上を示す。 （４）熱安定性 １０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、６０℃、１５
分間処理後に無処理の約８０％の活性を有する。 （５）至適ｐＨ ６．０〜７．０。 （６）ｐＨ安定性 ｐＨ５．５〜８．０で安定。 （７）分子量 ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１５万
〜１９万。 （８）失活 １００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。 （９）等電点 ４．７〜５．１。 （10）阻害剤 ＨｇＣｌ2 で著しく活性が阻害される。 - 【請求項４】 マルトースホスホリラーゼ産生能を有す
るバチルス属細菌を栄養培地に培養し、培養物から生成
したマルトースホスホリラーゼを採取することを特徴と
するマルトースホスホリラーゼの製造方法。 - 【請求項５】 バチルスｓｐ・ＲＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５０４４）もしくはマルトースホスホリラーゼ産生
能を有するその突然変異体。 - 【請求項６】 バチルスｓｐ・ＭＫ−１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５０４５）もしくはマルトースホスホリラーゼ産生
能を有するその突然変異体。 - 【請求項７】 ｐＨ６．０の緩衝液中で、５０〜６０℃
のいずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上
の活性を有する耐熱性マルトースホスホリラーゼの存在
下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水性
媒体中で、５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０で反応さ
せることを特徴とするβ−グルコース−１−リン酸の製
造方法。 - 【請求項８】 ｐＨ６．０の緩衝液中で、５０〜６０℃
のいずれかの温度で１５分処理後に無処理の８０％以上
の活性を有する耐熱性マルトースホスホリラ−ゼ、およ
び耐熱性トレハロースホスホリラーゼの存在下に、マル
トースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、
５５〜７０℃、ｐＨ４．５〜８．０で反応させることを
特徴とするトレハロースの製造方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21300595A JP3691875B2 (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 |
| CA002182059A CA2182059A1 (en) | 1995-07-31 | 1996-07-25 | Heat resistant maltose phosphorylase, process for preparation thereof, bacteria used for preparation thereof, and methods for using the enzyme |
| US08/686,647 US5827715A (en) | 1995-07-31 | 1996-07-26 | Heat resistant maltose phosphorylase, process for preparation thereof, bacteria used for preparation thereof, and methods for using the enzyme |
| EP96112114A EP0757098B1 (en) | 1995-07-31 | 1996-07-26 | Heat resistant maltose phosphorylase, process for preparation thereof, bacteria used for preparation thereof, and methods for using the enzyme |
| DE69624993T DE69624993T2 (de) | 1995-07-31 | 1996-07-26 | Hitzebeständige Maltosephosphorylase, Prozess für ihre Herstellung, Bakterien,die für ihre Herstellung verwendet werden,und Methoden zur Verwendung des Enzyms |
| DK96112114T DK0757098T3 (da) | 1995-07-31 | 1996-07-26 | Varmebestandig maltosephophorylase, fremgangsmåde til dens fremstilling, bakterier anvendt til dens fremstilling og fremgangsmåder til anvendelse af enzymet |
| US09/131,732 US5939308A (en) | 1995-07-31 | 1998-08-10 | Heat resistant maltose phosphorylase, process for preparation thereof, bacteria used for preparation thereof, and methods for using the enzyme |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21300595A JP3691875B2 (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0937780A true JPH0937780A (ja) | 1997-02-10 |
| JP3691875B2 JP3691875B2 (ja) | 2005-09-07 |
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ID=16631918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21300595A Expired - Fee Related JP3691875B2 (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5827715A (ja) |
| EP (1) | EP0757098B1 (ja) |
| JP (1) | JP3691875B2 (ja) |
| CA (1) | CA2182059A1 (ja) |
| DE (1) | DE69624993T2 (ja) |
| DK (1) | DK0757098T3 (ja) |
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| WO1998044116A1 (en) * | 1997-03-31 | 1998-10-08 | Kureha Chemical Industry Co., Ltd. | Gene encoding recombinant trehalose phosphorylase, vector containing the gene, transformant transformed by the gene, and method for producing recombinant trehalose phosphorylase with the use of the transformant |
| JPH10327887A (ja) * | 1997-03-31 | 1998-12-15 | Showa Sangyo Co Ltd | 組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体とその産生物 |
| WO2005003343A1 (ja) * | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | 新規微生物、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにその製造方法 |
| JP2016505273A (ja) * | 2013-01-25 | 2016-02-25 | ビオメリューＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ | 目的の核酸の特異的な単離方法 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2002010708A2 (en) * | 2000-08-01 | 2002-02-07 | Charm Sciences, Inc. | Hygiene monitoring |
| EP3740583A1 (en) | 2018-02-23 | 2020-11-25 | Danisco US Inc. | Synthesis of glucan comprising alpha-1,3 glycosidic linkages with phosphorylase enzymes |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0759584A (ja) * | 1993-06-14 | 1995-03-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 二糖類の製造法および新規二糖類 |
| US3944470A (en) * | 1973-06-29 | 1976-03-16 | The Procter & Gamble Company | Stabilization and enhancement of enzymatic activity |
| DE2748036C2 (de) * | 1977-10-26 | 1986-08-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und β-Phosphoglucose-mutase und Verwendung derselben |
| JPS6054036A (ja) * | 1983-09-02 | 1985-03-28 | Brother Ind Ltd | 入力装置 |
| JPH0779694B2 (ja) * | 1985-07-09 | 1995-08-30 | カドラント バイオリソ−シズ リミテツド | 蛋白質および同類品の保護 |
| JPS6360998A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-17 | Fujitsu Ltd | 生体高分子結晶の製造方法 |
| JPH0191778A (ja) * | 1987-09-30 | 1989-04-11 | Unitika Ltd | マルトースホスホリラーゼ |
| JPH05211882A (ja) * | 1991-12-11 | 1993-08-24 | Ajinomoto Co Inc | トレハロースの製造法 |
| JPH05292986A (ja) * | 1992-02-21 | 1993-11-09 | Takeda Chem Ind Ltd | トレハロースの製造法 |
| JP3026322B2 (ja) * | 1992-12-04 | 2000-03-27 | 呉羽化学工業株式会社 | トレハロースの製造法 |
| JP3071356B2 (ja) * | 1993-08-13 | 2000-07-31 | 呉羽化学工業株式会社 | トレハロースの製造方法 |
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| JPH07284389A (ja) * | 1994-02-22 | 1995-10-31 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法 |
| JP3563104B2 (ja) * | 1994-03-23 | 2004-09-08 | 呉羽化学工業株式会社 | トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法 |
| JPH07327691A (ja) * | 1994-04-15 | 1995-12-19 | Kureha Chem Ind Co Ltd | トレハロースの製造方法 |
| JP3014950B2 (ja) * | 1994-09-16 | 2000-02-28 | 日本食品化工株式会社 | トレハロースの製造方法 |
| JP3802590B2 (ja) * | 1994-09-16 | 2006-07-26 | 日本食品化工株式会社 | マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにこれら酵素の生産能を有するプレシオモナス属新菌株 |
| DE69532106T2 (de) * | 1994-09-16 | 2004-07-22 | Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. | Maltose Phospharylase, Trehalose Phophorylase, Plesiomonasstamm, und Herstellung von Trehalose |
| JPH0889273A (ja) * | 1994-09-28 | 1996-04-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | α，α−トレハロースの製造方法 |
| JP3634883B2 (ja) * | 1994-11-04 | 2005-03-30 | 昭和産業株式会社 | 耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、及び該酵素を用いるトレハロースの製造方法 |
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1998
- 1998-08-10 US US09/131,732 patent/US5939308A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
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