JPH0353890A - ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、４−−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
の製造法に関する。さらに詳しくは、微生物由来の脱ハ
ロゲン化酵素の作用により、シアン化アルカリの存在下
にエピハロヒドリンから生化学的に４−−ハロ−３−ヒ
ドロキシブチロニトリルヲ製ｍ　−Ｊ−る方法に関する
。

４−−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、２種の
異なる官能基をもつ化合物であることから、種々の医薬
品や生理活性物質の合或原料として有用な物質であり、
特にＬ一カルニチンの合威原料として有用であることが
知られている（特開昭５７−１６５３５２号公報参照）
。

（従来技術と問題点） 従来、４−−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製
造する方法としては、下記に示すような（１）〜（３）
の方法が知られている。

（］）　１　．　３−ジクロロ−２−プロパノールを水
溶液中シアン化アルカリと共に加温反応させる方法（特
公昭３６−２１７１８号公報参照）。

（２）　３−クロロ−１，２−プロパンジオールに塩化
トシルを作用させて１位のアルコールをトシル化したの
ち、シアン化アルカリと反応させる方法（特開昭５７−
１６５３５２号公報参照）。

（３）エピクロルヒドリンと青酸とを触媒量のシアン化
カリウムの存在下に反応させる方法（Ｆ．ビノン（Ｂｉ
ｎｏｎ）　ら．バイルテン・デス・ソシェテス・デス・
シごケス・ヘルジエス（ｌｌｕｌｌ．　Ｓｏｃ．　Ｃｂ
ｉｍ．Ｂｅｌｇｅｓ），　Ｖｏｌ．　７２，　１６６−
］．７７（１９６３）参照）。

しかし、（１）の方法では収率が約４０％と低いこと、
（２）の方法では二つの工程からなり反応が煩雑である
上に、総合収率も約４５％と低いこと、（３）の方法で
は操作、取扱い上危険な青酸を使用すること、副生物の
生威防止のための反応条件のコントロールが困難である
こと、などの問題点を有し、工業的実施に有利な方法と
は云い難い。さらに（１１〜（３）の方法はいずれも化
学的製込法であり、ゾｉコこ１−ラルまたはラセミ体原
料からでは光学活性体を得ることはできない。

（発明の概要） そこで本発明者らは、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロ
ニトリルの有用性、特に光学活性体が種々の医薬晶合威
の中間体として有用なる点に着目し、４−−ハロ−３−
ヒドロキシプチ口ニ１・リルの製ｍ　法について鋭意検
討を重ねた。その結果、微生物の酵素作用を利用する新
規な製逍法を見出した。ずな３ わち、本発明は、エビ八口ヒドリンをシアン化アルカリ
の存在下に微生物由来の脱ハロゲン化酵素の作用により
４−ハロ−３−ヒドロギシブチ口ニトリルに転化させ、
これを採取することを特徴とする４−−ハロ−３−ヒド
ロキシブチロニトリルの製造法、である。

−・般に、ハロゲン埜を水酸火に変換する酵素は脱ハロ
ゲン化酵素として知られているが〔酵素ハンドブンク，
６２７頁（朝倉書店）、Ｔ．横田ら，アグリ力ルチュラ
ル・アンド・ハイオロジカル・ケミストリー（八ｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）Ｖｏｌ．５０＋４５３４６
０（１９８６）参照）、１．３−ジハロ−２−プロパノ
ールを基質として３−ハロ−１，２−プロパンジオール
に変換する反応は従来全く知られておらず、本発明者ら
により初めて見出され、先に特許出願した（特願平１−
１００１７３号明細書参照）。しかしながら、さらに驚
くべきことに本酵素をシアン化アルカリの存在下にエビ
八口ヒドリンに作用させるとエピハロヒドリンが開環シ
アノ化して４−−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
に変換されることを新たに見４ 出し、本発明に至ったのである。本発明の方法によれば
、常温、中性付近のｐｌ＋で極めて効率よく反応が行え
るので、化学的方法に比し有利であり、また、特に光学
活性の４−−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを安
価なエピハロヒドリンから製造することが初めて可能と
なった。

（発明の具体的説明） 本発明でいう脱ハロゲン化酵素とはシアン化アルカリの
存在下にエビ八口ヒドリンを最終的に４ハロ−３−ヒド
ロキシブチロニトリルに転換し得る酵素である。具体的
には、例えば、本発明者らにより新たに分離、見出され
たコリネバクテリウム属に属する微生物、Ｎ−２３５４
株およびミクロバクテリウム属に属する微生物、Ｎ−４
７０１株等の産生ずる酵素を挙げることができる。これ
らの微生物は、工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に、それぞれ微工研菌寄第１０６７３号（コリネバ
クテリウムｓｐ．Ｎ−２３５４　）および微工研菌寄第
１０６７４号（ミクロバクテリウムｓｐ．　Ｎ−４７０
１）として寄託されており、その菌学的性質は以下に示
す通りである。

Ｎ−２３５４ 形　　　　　態 集落の周辺細胞 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 オキシダーゼ カタラーゼ ＯＦ 嫌気下での生育 細胞壁のジアミノ酸 グリコリル試験 デンプン分解 ゼラチン液化 硫化水素産生 ペプトン チオ硫酸ナ ト　　リ　　ウ　ム メチルレッド レバンの産生 桿菌 伸長せず ＋ 認めず ジアミノ酪酸 （アセチル型） ＮａＣｌ存在下での生育 ３％ ５％ 酸の産生 イヌリン マンニト−ル マンノース メレチト−ス Ｎ−４７０１ 形　　　　　態 集落の周辺細胞 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 鞭　　　　　毛 集落の色 オキシダーゼ カタラーゼ ＯＦ 嫌気下での生育 多形性桿菌 伸長セす →− 認めず −ト 極〜側毛 黄橙色 ＋ ＋ Ｏ 全細胞の加水分解物中の ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸の存在 細胞壁のジアごノ酸　　　　　リジン グリコリル試験　　　　　＋（グリコリル型）デンプン
分解　　　　　　　　　　士 ゼラチン液化 硝酸塩還元 アルギニン利用　　　　　　　　　十 硫化水素産生 尿素分解 スキムξルク培地中での 耐熱性　６０゜Ｃ　　３０分間 酸の産生 イヌリン　　　　　　　　　　　＋ グリセロール グルコース　　　　　　　　　　＋ シュ−クロース　　　　　　　　＋ トレ−ハロ−ス　　　　　　　　　　＋ラフィノ−ス　
　　　　　　　　＋ ８ 以上の菌学的性質をハージェーズ・マニュアル・オブ・
システマティック・ハタテリオロジーＶｏｌ．　２　（
１９８６）　　（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　
Ｖｏｌ．２　　（１９８６）　）に従って検索すると、
Ｎ−２３５４株はコリネバクテリウム属およびＮ４７０
ｌ株はミクロバクテリウム属にそれぞれ属する細菌と同
定された。

上記微生物を培養するための培地組威としては通常これ
らの微生物が生育しうるものであれば何でも使用できる
。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シ
ェークロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸等
の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール
類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス
、蛋白質加水分解物、アξノ酸等の一般天然窒素源の他
に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用でき、この
他無機塩、微量金属塩、ビタくン等が必要に応して適宜
使用される。この際高い酵素活性を誘導させるために、
１．３−ジクロロ−２−プロパノール、３−クロロ−１
．２−プロパンジオール等を培地に添加することも有用
である。

上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐ１１４
〜１０、温度２０〜４０゜Ｃの範囲にて好気的に１０〜
９６時間培養する。

本発明で使用するエピハロヒドリンはエビクロヒドリン
、エビプロモヒドリン等である。また、シアン化アルカ
リはシアン化カリウム、シアン化ナトリウム等である。

エピ八ロヒドリンに脱ハロゲン化酵素を作用させて４−
−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを得る方法とし
ては、上記のように培養して得た微生物の培養液あるい
は遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基質およびシ
アン化アルカリ（以下基質等という）を添加する方法、
菌体処理物（例えば菌体破砕物、粗酵素・精製酵素等の
菌体抽出物等）あるいは常法により固定化した菌体また
は菌体処理物等の懸濁液に基質等を添加する方法、微生
物の培養時に）Ｊ．質等を培養液に添加して培養と同時
に反応を行う方法等がある。

反応液中の基質の濃度は特に限定するものではないが、
０．１〜１０　（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、また、シアン
化アルカリの使用量は通常基質の１〜３倍量（モル）で
ある。基質等は反応液に一括して加えるか、あるいは分
割添加することができる。

反応温度は５〜５０℃、反応ρＩＩは４〜１００）範囲
で行うことが好ましい。

反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反
応条件等によって変わるが、通常１〜１２０時間で終了
するように条件を設定するのが好ましい。

かくして反応液中に生成、蓄積した４−ハロ−３ヒドロ
キシブチ口ニトリルは、公知の方法を用いて採取および
精製することができる。例えば、反応液から遠心分離な
どの方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶
媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４
−−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを
得ることができる。また、このシロンプを減圧下に蒸留
することによりさらに精製することもできる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明すＩ １ ではない。

実施例１ グルコース１％、ペプトン０．　５％、肉エキス０．３
％、酵母エキス０．　３％からなる培地をｐＨ７．０に
調整して、５００ｍｆｆｉ三角フラスコに１００ｄずつ
分注し、１２０’Ｃで１５分殺菌後、メンプランフィル
ターにて除菌した２５（Ｗ／Ｖ）％の３−クロロー１．
２−プロパンジオール水溶液を０．　８　ｍｌ添加した
。

上記培地にＮ−４７０１菌株を接種し、３０℃にて４８
時間振とう培養を行った。この培養液から遠心分離して
菌体を集め、５ｍＭメルカプトエタノールを含む２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）に菌体を懸濁して常法
にしたがって菌体を破砕し、透析後、ＤＥＡＥ−セファ
セルのカラムクロマトグラフイーによって部分精製した
酵素液を得た。ＩＭのリン酸塩緩衝液（ｐｌ１　８．０
）　４０−に上記酵素液１０ｍ君を加え、これにエビク
ロロヒドリン０．　５　ｇおよびシアン化カリウム０．
３５ｇを添加して２０゜Ｃで撹拌し反応を行った。

５時間後ガスクロマ１−グラフイーにて精製した４１２ クロ口−３−ヒドロキシブチロニ１・リルを定量したと
ころ、仕込んだエビクロロヒドリンに対するモル収率は
６２．５％であった。

実施例２ 実施例１と同様にして得た培地にＮ−２３５４菌株を接
種し、３０゜Ｃにて４８時間振とう培養を行った。この
培養液１４０　ｍを遠心分離して菌体を集め、１００ｍ
Ｍのトリスー１１ｃＩ緩衝液（ｐｉｆ　８．０）１４０
成で１回洗浄後、３５ｍｌのＩＭＵン酸塩緩衝液（ｐｌ
ｌ　８．０）に菌体を懸濁した。この懸濁液にエピクロ
口ヒドリン０．３５ｇおよびシアン化カリウム０．２５
ｇを添加して、２０゜Ｃで５時間攪拌して反応を行った
。

反応後、ガスクロマトグラフィーにて生威した４−クロ
ロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを定量したところ、
仕込んだエビクロロヒドリンに対するモル収率は５５．
６％であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）エピハロヒドリンをシアン化アルカリの存在下に
   微生物由来の脱ハロゲン化酵素の作用により４−ハロ−
   ３−ヒドロキシブチロニトリルに転化させ、これを採取
   することを特徴とする４−ハロ−３−ヒドロキシブチロ
   ニトリルの製造法。
2. （２）微生物がコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ）属またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃ
   ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である請求項１記載の製造
   法。