JPH0940556A

JPH0940556A - トコフェロール含有ｈｓｐ４７合成抑制剤

Info

Publication number: JPH0940556A
Application number: JP21093595A
Authority: JP
Inventors: Toshimi Shiragami; 俊美白神; Yoichi Shobu; 洋一清輔; Masayoshi Morino; 眞嘉森野; Chikao Yoshikumi; 親雄吉汲
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 1997-02-10

Abstract

(57)【要約】【課題】分子量４７キロダルトンの熱ショックタンパ
ク質の合成抑制剤を提供する。【解決手段】トコフェロール又はその誘導体を有効成
分として含有する。【効果】コラーゲン合成を抑制するので、細胞外マト
リックス産生の亢進の病態を示す病気を治療することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トコフェロール又
はその誘導体、特にα−トコフェロール（すなわち、ビ
タミンＥ）を有効成分として含有する、分子量４７キロ
ダルトンの熱ショックタンパク質（以下、ＨＳＰ４７と
称する）の合成抑制剤に関する。本発明のＨＳＰ４７合
成抑制剤は、特に、臓器内のコラーゲンの合成を抑制す
ることにより肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、
交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮
症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリッ
クス（細胞外基質）産生亢進の病態を示す病気の患者の
生理学的状態を有効に改善させ、肝硬変、間質性肺疾
患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どの細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気を効
果的に治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、コラーゲンなどの細胞外マトリッ
クスの産生の亢進の病態を示す病気が大きな問題となっ
ている。ここでいう細胞外マトリックス産生の亢進の病
態を示す病気とは、例えば肝硬変、間質性肺疾患、慢性
腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や
熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性
瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどを含
む。

【０００３】例えば、死亡者がわが国だけでも年間約２
万人にものぼるといわれている肝硬変は、肝臓が結合組
織の増殖のため固くなる病気の総称で、種々の慢性肝疾
患の終末像であるといわれ、肝全体にわたるびまん性の
肝線維症である。すなわち、肝炎などの肝傷害が長期に
及ぶ慢性肝炎においては、線維芽細胞や伊東細胞などの
細胞外マトリックス（特にＩ型コラーゲン）産生の著し
い亢進を伴い肝臓は線維化する。肝の線維化が慢性的に
進行すると、ますます正常な肝再生は妨害され、肝細胞
に置き換わり、線維芽細胞とＩ型コラーゲンを主体とす
る細胞外マトリックスが肝組織のかなりの部分を占め、
多くの凝小葉からなる肝硬変に至る。肝硬変の進行に伴
い、線維隔壁が肝全体に進展し、その結果生じる血流の
異常は、肝実質細胞の変性を更に押し進める一因にもな
り、肝硬変における悪循環が続くことになり、更にはア
ルコール、ウイルス、自己免疫等種々の原因によって、
肝臓中に多量の膠質線維が生成され、肝細胞の壊死と機
能消失とが生じ、肝硬変患者は遂には死に至る。Ｉ型コ
ラーゲンは正常肝では全タンパク質量の約２％を占める
が、肝硬変となると１０〜３０％を占めるようになる。

【０００４】また、間質性肺疾患は、肺胞及び肺胞管の
みならず、しばしば呼吸細気管支や終末気管支も巻き込
む下部気道の慢性炎症（肺胞炎 alveolitis)とその結果
である間質の線維化と肺胞内線維化を特徴とする疾患群
である。ここでいう間質性肺疾患とは、例えば、間質性
肺炎、肺線維症などのびまん性間質性肺疾患、特発性肺
線維症、透過性肺水腫、膠原病肺、サルコイドーシスな
どを含む。間質性肺疾患においては、線維化組織では細
胞外マトリックスの過剰な産生と蓄積が認められてい
る。すなわち、間質性肺疾患の肺線維化組織では、肥大
した間質に著明なＩ型及び III型コラーゲンの集積がみ
られており、特に III型コラーゲンは、線維化の早期に
肥厚した肺胞中隔に集積し、病期が進行し、後期にはＩ
型コラーゲンが増加し、主要なコラーゲンとなる。基底
膜は早期に破壊されており、肺胞腔側へのコラーゲン線
維の侵入が観察される。

【０００５】また、慢性腎不全とは慢性腎炎症候群の結
果、腎機能の荒廃により体内の恒常性が維持できなくな
った状態である。慢性腎不全の進行を病理学的にみると
糸球体硬化と間質線維化の進行である。糸球体硬化症
は、メサンギウム領域を中心とした細胞外マトリックス
の増生である。メサンギウム硬化症の成分は正常と比較
し、著明にIV型コラーゲンなどの糸球体基底膜の成分が
増加し、また間質成分であるＩ型コラーゲンも硬化症部
位に一致して増生している。すなわち、慢性に経過する
糸球体硬化に対しては、細胞外マトリックスの産生亢進
が大きな要因である。ここで慢性腎不全に陥いる疾患と
は、例えばＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性
腎炎、糖尿病性腎症、慢性間質性腎炎、慢性糸球体腎炎
などを含む。その他、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、あるい
は強皮症、動脈硬化等の細胞外マトリックス産生亢進の
病態を示す病気は、何らかの原因によりコラーゲン合成
の異常亢進が起こり、線維化が進んで組織の硬化変化を
生ずることが主要な成因と考えられている。

【０００６】また、血管新生においても基底膜及び基底
膜中のコラーゲン合成が、重要な役割をはたすことが指
摘されている（Maragoudakis, E., Sarmonika, M., and
Panoutsacopoulous, M., "J. Pharmacol. Exp. The
r.", 244 : 729, 1988 ; Ingber, D. E., Madri, J.
A., and Folkman, J., "Endocrinology", 119 : 1768,
1986）。血管新生による疾患としては、例えば、糖尿
病性網膜症、後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管
新生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ、幹せん、化膿性肉
芽腫、血管腫、線維性血管腫、肥大性はん痕、肉芽、リ
ューマチ性関節炎、浮腫性硬化症、アテローム性動脈硬
化症、各種腫瘍などが知られている。このようにコラー
ゲンなどの細胞外マトリックスの産生の亢進の病態を示
す病気が大きな問題となっているにもかかわらず、従来
では副作用や薬理効果等の種々の面で満足すべき細胞外
マトリックス合成抑制剤（例えば、コラーゲン合成抑制
剤）は未だ開発されていなかったのである。

【０００７】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞に何らかのストレス、例えば熱、薬剤、放射線等を
加えることにより細胞に発現されるタンパク質である。
ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、分子量の大き
さから９０ファミリー、７０ファミリー、６０ファミリ
ー、低分子ファミリーの４ファミリーに大別することが
できる。ストレスへの応答に加えて、これらのタンパク
質のいくつかは構成的に合成され、正常な環境のもと、
タンパク質のフォールディング、アンフォールディン
グ、タンパク質サブユニットの会合、タンパク質の膜輸
送のような、必須の生理的な役割を演じていることが示
されている。熱ショックタンパク質としてのこれらの機
能は、分子シャペロンと称される。

【０００８】ＨＳＰ４７は、永田等によって１９８６年
に発見されたタンパク質で、分子量４７キロダルトンの
塩基性タンパク質（ｐＩ＝９．０）である。ＨＳＰ４７
の発現が増大するにつれて、コラーゲンの合成も増加す
ることが様々な細胞で示されている（"J. Biol. Che
m.", 261 : 7531, 1986 ; "Eur. J. Biochem.", 206 :
323, 1992 ; "J. Biol. Chem.", 265 : 992, 1990 ;
"J. Clin. Invest.", 94：2481, 1994）。すなわち、Ｈ
ＳＰ４７は、細胞内で小胞体内でのプロコラーゲンのプ
ロセシング、三重鎖ヘリックス形成、あるいは小胞体か
らゴルジ装置へのプロコラーゲン輸送・分泌という局面
で、コラーゲンの特異的分子シャペロンとして機能して
いるとされているので、増大したＨＳＰ４７発現は、細
胞外マトリックスにおけるコラーゲン分子の蓄積を刺激
する。このようにコラーゲン結合熱ショックタンパク質
であるＨＳＰ４７は、発現と同様に機能においても、細
胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンに密接に
関連した熱ショックタンパク質である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢
性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交
通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、
動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス
産生亢進の病態を示す病気の患者の生理学的状態を有効
に改善させ、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は
慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、
交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮
症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞外マトリッ
クス産生亢進の病態を示す病気を効果的に治療すること
のできる、細胞外マトリックス合成抑制剤を提供するた
めに、種々検討を重ねてきた。

【００１０】上記したように、肝硬変、間質性肺疾患、
慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢
痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥
厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの
線維症は臓器内の細胞外マトリックスの著しく増加した
病態が主病変と理解されている。肝硬変、間質性肺疾
患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どの細胞外マトリックス産生亢進の病態を示す病気に伴
う線維化は、コラーゲン生合成増加やコラーゲン分解能
の低下により生ずると考えられている。例えば、肝の線
維化において、Ｉ型、 III型、IV型コラーゲンの合成活
性化が起こるが、特に主要成分であるＩ型コラーゲンの
合成活性化が重要な意味をもつ。

【００１１】こうした状況下で、本発明者らは、意外に
も、トコフェロール又はその誘導体、特にα−トコフェ
ロール（すなわち、ビタミンＥ）が、病態を示す組織の
細胞におけるＨＳＰ４７の合成を特異的に抑制すること
を見出した。すなわち、トコフェロール又はその誘導体
を投与することにより、細胞内でのＨＳＰ４７の合成を
抑制し、臓器内でのコラーゲン合成を抑制し、ひいては
肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に
陥いる疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の
後に生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、
又は関節リウマチなどの細胞外マトリックス産生亢進の
病態を示す病気の治療が可能であることを見出したので
ある。本発明はこうした知見に基づくものであり、肝硬
変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥い
る疾患）、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に
生じるケロイドや肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は
関節リウマチなどの細胞外マトリックス産生の亢進の病
態を示す病気を効果的に治療することのできるＨＳＰ４
７合成抑制剤であって、細胞内でのコラーゲンの成熟及
び輸送過程に重要な役割を果たしているコラーゲン特異
的な分子シャペロンであるＨＳＰ４７の合成抑制剤を提
供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、トコ
フェロール又はその誘導体、特にα−トコフェロール
（すなわち、ビタミンＥ）を有効成分として含有するこ
とを特徴とする、ＨＳＰ４７合成抑制剤に関する。

【００１３】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、有効成分としてトコフ
ェロール又はその誘導体を含有する。本明細書において
トコフェロールとは、α−トコフェロール、β−トコフ
ェロール、γ−トコフェロール、又はδ−トコフェロー
ルなどを意味し、本発明においては、それらのトコフェ
ロール同族体を単独で、又はこれらの混合物を用いるこ
とができる。トコフェロールとしては、特にα−トコフ
ェロール〔３，４−ジヒドロ−２，５，７，８−テトラ
メチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデシル）
−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−オール〕、すなわちビ
タミンＥが最も好適である。トコフェロール誘導体とし
ては、例えば、天然物中に本来含有されているトコフェ
ロール誘導体、抽出又は分画の際の化学的処理によって
変換したトコフェロール誘導体、及び化学的修飾を行な
ったトコフェロール誘導体等を挙げることができる。天
然物中に本来含有されているトコフェロール誘導体とし
ては、例えば、トコトリエノール同族体、すなわちα−
トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコト
リエノール、又はδ−トコトリエノール等を挙げること
ができる。抽出若しくは分画の際の化学的処理によって
変換したトコフェロール誘導体、又は化学的修飾を行な
ったトコフェロール誘導体としては、例えば、トコフェ
ロールエステル誘導体又はトコトリエノールエステル誘
導体等を挙げることができる。トコフェロールエステル
誘導体の具体例としては、例えば、直鎖状若しくは分枝
状のアルキルモノカルボン酸若しくはジカルボン酸（好
ましくは炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分枝状のアル
キルモノカルボン酸若しくはジカルボン酸）、直鎖状若
しくは分枝状のアルケニルモノカルボン酸若しくはジカ
ルボン酸（好ましくは炭素数２〜３０の直鎖状若しくは
分枝状のアルケニルモノカルボン酸若しくはジカルボン
酸）、アリール部分の炭素数が６〜３０のアリールモノ
カルボン酸若しくはジカルボン酸（例えば、安息香
酸）、又は窒素原子１若しくは２個を含む５員若しくは
６員の複素環式モノカルボン酸若しくはジカルボン酸
（例えば、ニコチン酸）と、トコフェロールとのエステ
ル化合物、例えば、酢酸トコフェロール、コハク酸トコ
フェロール、ニコチン酸トコフェロール等が挙げられ
る。なお、前記のトコフェロール又はその誘導体には、
立体異性体が存在し、本発明では、それらの任意の純粋
な立体異性体又はそれらの混合物を用いることができ
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤に
含有されるトコフェロール又はその誘導体は、化学合成
によって、又は天然物から抽出して精製することによっ
て、調製することができる。あるいは、市販品を用いて
もよい。本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、トコフェロ
ール又はその誘導体を、それ単独で、又は好ましくは製
剤学的に許容することのできる通常の担体と共に投与す
ることができる。投与剤型としては、特に限定がなく、
例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸
濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しく
は丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐
剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口
剤を挙げることができる。

【００１５】これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、ア
ルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳
糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロ
ース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコー
ル、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸
アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性
剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、
香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防
止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、軟カプセル剤を製造する場合には、植物油又は
合成油等にビタミンＥを、必要に応じて加温しながら溶
解し、常法に従って製造したゼラチン、グリセリン、及
び／又は防バイ剤等を混合・溶融した皮膜用組成物を用
いて、軟カプセル充填機により軟カプセル剤を製造する
ことができる。また、硬カプセル剤を製造する場合に
は、例えば、ビタミンＥを加温し、軟質無水ケイ酸等の
賦形剤に吸着し、必要であれば更に結晶セルロース及び
／又はコーンスターチ等を加えて、混合・造粒の後に、
篩過したものを、カプセル充填機を使用して、硬カプセ
ルに充填することによって製造することができる。ま
た、内服液剤を製造する場合には、例えば、ポリエチレ
ン硬化ヒマシ油等の合成界面活性剤、又はレシチン等の
天然界面活性剤等を用いて、常法により乳化又は可溶化
することによって製造することができる。

【００１６】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのトコフェロール又は
その誘導体の他に、例えば生理食塩水、リンゲル液等の
水溶性溶剤、植物油、若しくは脂肪酸エステル等の非水
溶性溶剤、ブドウ糖、若しくは塩化ナトリウム等の等張
化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は
乳化剤等を任意に用いることができる。また、本発明の
ＨＳＰ４７合成抑制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた
徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本
発明のＨＳＰ４７合成抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリ
マーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療す
べき組織中に外科的に移植することができる。

【００１７】本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、これに
限定されるものではないが、トコフェロール又はその誘
導体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８
０重量％の量で含有することができる。本発明のＨＳＰ
４７合成抑制剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、
患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法な
どにより異なり、特に制限はないが、α−トコフェロー
ル量として通常成人１人当り１ｍｇ〜１０ｇ程度を、１
日１〜４回程度にわけて、経口的に又は非経口的に投与
する。更に、用途も医薬品に限定されるものではなく、
種々の用途、例えば、機能性食品や健康食品として飲食
物等の形で与えることも可能である。

【００１８】

【作用】上記したように、本発明のＨＳＰ４７合成抑制
剤に含有されるトコフェロール又はその誘導体、特にα
−トコフェロール（すなわちビタミンＥ）は、細胞内の
ＨＳＰ４７合成を特異的に抑制する作用があるので、ト
コフェロール又はその誘導体を投与すると細胞内でのＨ
ＳＰ４７生合成が特異的に減少し、コラーゲンの生合成
が抑制される。その結果、細胞外マトリックス産生も抑
制されることになる。従って、トコフェロール又はその
誘導体は、コラーゲンの増加を伴う細胞外マトリックス
産生亢進の病態を示す病気、例えば肝硬変、間質性肺疾
患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後
の瘢痕や熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイド
や肥厚性瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチな
どの予防及び治療に使用することができる。すなわち、
本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、コラーゲン特異的シ
ャペロンであるＨＳＰ４７の合成を抑制することにより
コラーゲンの合成を抑制する。

【００１９】また、前記のように、血管新生において
も、基底膜及び基底膜中のコラーゲン合成が重要な役割
をはたすことが指摘されているので、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤は、血管新生の異常増殖に基づく多くの疾
患の予防治療薬として極めて有用であり、先に述べたよ
うな各疾患、すなわち糖尿病性網膜症、後水晶体線維増
殖症、角膜移植に伴う血管新生、緑内症、眼腫瘍、トラ
コーマ、乾せん、化膿性肉芽腫、血管腫、線維性血管
腫、肥大性はん痕、肉芽、リューマチ性関節炎、浮腫性
硬化症、アテローム性動脈硬化症及び各種腫瘍などに用
いることができる。更に、Ｉ型コラーゲンとフィブロネ
クチンを基本骨格とする間質（interstitialstroma)が
癌の転移において、離脱した癌細胞が近傍の脈管に侵入
するまでのガイド役を果たすことが、明らかとなってい
るので〔"BIOTHERAPY", 7 (8) : 1181, 1993〕、本発明
のＨＳＰ４７合成抑制剤を投与することにより、癌の転
移を抑制することも可能である。

【００２０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の作製（１）抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の調製ヒトＨＳＰ４７のＮ末端から２〜１６番目のアミノ酸配
列に対応するアミノ酸１５個からなるペプチド〔以下、
ヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１６）と称する；ラット
のＨＳＰ４７の相当する部分と共通アミノ酸配列を示
す〕を自動ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８システム，
島津制作所）を用いて作製し、スクシニミジル４−（ｐ
−マレイミドフェニル）ブチレート〔ＳＭＰＢ：Succin
imidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate〕を架橋剤とし
て用い、常法（"Biochemistry", 18：690, 1979)により
ラクトグロブリンと結合させ、感作抗原を作製した。こ
の感作抗原１５０μｇを含むリン酸緩衝生理食塩水〔組
成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄＝０．２ｇ／
ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄（無水）＝
１．１５ｇ／ｌ：以下ＰＢＳ（−）と称する：コスモバ
イオ，カタログ番号320-01〕０．２ｍｌと、等量のフロ
イント完全アジュバント（ヤトロン，カタログ番号RM60
6-1)とを混和し、得られた混合液０．２ｍｌを、ルーラ
ット（６週齢，雌性：日本クレア）の皮下に投与し、免
疫した。同様の方法で第２次及び第３次免疫を繰り返し
た後、アジュバント（Hunter's TiterMax ; CytRx Corp
oration,米国ジョージア州）を用いて６回免疫感作を行
った。感作動物より採血し、常法により血清を分離して
採取し、以下に示す酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）及びウ
ェスタンブロット法によって血清中の抗体価を測定し
た。

【００２１】（２）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）による
抗ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体特性の評価前項（１）で調製したヒトＨＳＰ４７ペプチド（２−１
６）をＰＢＳ（−）に溶解し、１０μｇ／ｍｌの濃度の
ペプチド溶液を調製し、リジットアセイプレート（ファ
ルコン，カタログ番号3910）の各ウェルに前記ペプチド
溶液を５０μｌずつ滴下した。最も外側のウェルにはＰ
ＢＳ（−）５０μｌのみを入れ、湿潤下で４℃にて一晩
放置した後、前記ペプチド溶液を捨て、ＰＢＳ（−）を
用いて各ウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略称する）を含むＰＢＳ（−）１００
μｌを各ウェルに入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢ
Ｓ（−）で３回洗浄した後、前項（１）で取得したルー
ラット血清５０μｌを各ウェルに入れ、１時間室温にて
放置した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、各ウェルに
２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ５
０μｌを入れ、室温下で１時間放置した。ＰＢＳ（−）
で２回洗浄した後、過酸化水素水４μｌを加えた０．１
Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）１０ｍｌにｏ−フ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）タブレット（シグマ，カタ
ログ番号P8287)１個（１０ｍｇ）を溶解して調製した基
質液１００μｌずつを各ウェルに滴下し、室温にて遮光
下で３０分間放置した後、各ウェルの４９２ｎｍの吸光
度をマイクロプレートリーダー（東ソー，ＭＰＲ−Ａ４
ｉ型）にて測定した。抗体価の上昇が確認された血清を
抗ヒトＨＳＰ４７ポリクローナル抗体として以下の実施
例に用いた。

【００２２】（３）ウェスタンブロット法による抗ＨＳ
Ｐ４７ポリクローナル抗体特性の評価Ｌａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Nat
ure", 283 : pp. 249-256, 1970)を用いて、ＨｅＬａ細
胞のライセートのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を、以下の方法に従って
行った。濃縮ゲルの調製は次のように行った。蒸留水
６．１ｍｌ、０．５Ｍトリス（バイオ・ラッド，カタロ
グ番号161-0716）−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．５ｍｌ、
１０％ＳＤＳ（バイオ・ラッド，カタログ番号161-030
1）１００μｌ、及び３０％アクリルアミド（バイオ・
ラッド，カタログ番号161-0101）／Ｎ，Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミド（バイオ・ラッド，カタログ番号16
1-0201）１．３ｍｌを混合して、１５分間脱気し、１０
％過硫酸アンモニウム（バイオ・ラッド，カタログ番号
161-0700）５０μｌ及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ
チルエチレンジアミン（以下、ＴＥＭＥＤと略称する）
（バイオ・ラッド，カタログ番号161-0800）１０μｌを
加えて、濃縮ゲルを調製した。また、分離ゲルの調製は
次のように行った。蒸留水４．０４５ｍｌ、１．５Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ
１００μｌ、及び３０％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミド３．３ｍｌをゆっくり混合し
て、１５分間アスピレータで脱気し、１０％過硫酸アン
モニウム５０μｌ、及びＴＥＭＥＤ５μｌを加えた。泳
動バッファーとしては、トリス９．０ｇ、グリシン（バ
イオ・ラッド，カタログ番号161-0717）４３．２ｇ、及
びＳＤＳ３．０ｇに蒸留水を加えて６００ｍｌにし、こ
れを蒸留水で５倍希釈したものを用いた。サンプルバッ
ファーは、蒸留水２ｍｌ、２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
６．８）５００μｌ、ＳＤＳ０．３２ｇ、β−メルカプ
トエタノール８００μｌ、及び０．０５％（ｗ／ｖ）ブ
ロモフェノールブルー（バイオ・ラッド，カタログ番号
161-0404）４００μｌを混合したものを用いた。

【００２３】後述する実施例２に示す方法に基づいてＨ
ｅＬａ細胞を培養し、そのライセートを調製した。得ら
れたＨｅＬａ細胞ライセートのＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った後、０．４５μｍニトロセル
ロース膜（Schleicher & Schuell，カタログ番号40119
6）にゲルを密着させ、タンパク質転写装置（Trans-Blo
t Electrophoretic Transfer Cell：バイオ・ラッド）
を用いて、室温にて１００Ｖで、３時間ブロッティング
を行った。ブロッティングバッファーとしては０．０２
５Ｍトリス及び０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．
５に調整されたトリスグリシンバッファー（Tris Gly R
unning and Blotting Buffer；Enprotech,米国マサチュ
ーセッツ州，カタログ番号SA100034）にメチルアルコー
ルを２０％になるように加えて調製したバッファーを用
いた。ブロッティング後、５％スキムミルク（雪印乳
業）を含むＰＢＳ（−）溶液にニトロセルロース膜を室
温にて３０分間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキ
ング後、スクリーナーブロッター（サンプラテック）を
用いて、前項（１）で取得したルーラット血清を１次抗
体として、１次抗体反応を行った。１次抗体反応は、２
％スキムミルク（雪印乳業）を含むＰＢＳ（−）にて１
０倍希釈した前記ルーラット血清２００μｌで、室温に
て１２０分間行った。１次抗体反応終了後、スロー・ロ
ッキング・シェイカーを用いて、ＰＢＳ（−）で５分間
の振盪を２回、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイオ・ラッ
ド，カタログ番号170-6531）を含むＰＢＳ（−）溶液で
１５分間の振盪を４回、更にＰＢＳ（−）で５分間の振
盪を２回行うことにより、ニトロセルロース膜を洗浄し
た。洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩ
ｇＧ抗体（Southern Biotechnology，カタログ番号3030
-05)を、２％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５
０００倍に希釈した溶液５ｍｌを用いて、２次抗体反応
を２時間行った。反応終了後、ＰＢＳ（−）溶液、及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）溶液で、１
次抗体反応後の洗浄と同じ条件下にてニトロセルロース
膜の洗浄を行った。

【００２４】余分なＰＢＳ（−）溶液を除去した後、ウ
ェスタンブロッティング検出試薬（ECL Western blotti
ng detection reagent；アマーシャム，カタログ番号RP
N2106)をニトロセルロース膜上に振りかけ、１分間室温
にて静置した後、余分な検出試薬を除去し、ニトロセル
ロース膜をラップに包み、反応面をＸ線フィルム（コダ
ック X-OMAT, AR カタログ番号165 1454）に密着させて
露光させた。現像後、ＨＳＰ４７に相当する分子量４７
キロダルトン付近のバンドを測定することによって、抗
ＨＳＰ４７ポリクローナル抗体の反応性の検討を行っ
た。抗体価の上昇が確認された血清を、抗ヒトＨＳＰ４
７ポリクローナル抗体として、以下の実施例に用いた。

【００２５】実施例２：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量
の測定（１）ヒト培養癌細胞の培養ヒト培養子宮癌細胞株ＨｅＬａＳ３（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ２．２）を、５％二酸化炭素条件下で、熱ショック
処理時以外は、３７℃で、１０％非働化ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地にて培養した。

【００２６】（２）α−トコフェロール処理及び熱ショ
ック処理播種２日後の培養ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａＳ３の培
地中に、最終濃度２０μＭになるようにＤ−α−トコフ
ェロール（フナコシ、カタログ番号ICN 81-1521-47）を
添加し、２４時間培養した。その後、４５℃にて１５分
間熱ショック処理をしてから、３７℃にて終夜培養し
た。対照試験は、α−トコフェロールを添加しないこと
以外は前記と同様に実施した。

【００２７】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定前項（２）で処理した細胞を、以下に示す方法によりホ
モジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法に
て測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞をＰ
ＢＳ（−）で洗浄した後、ライシスバッファー（ｌｙｓ
ｉｓｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４０、０．１５
Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エチルマレイミ
ド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μ
ｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペプスタチン〕
１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。その後、４℃
で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心を行った。遠
心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０μｌに加え、
更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reagent Concentr
ate : バイオラッド，カタログ番号500-0006）２００μ
ｌを加えた。５分間、室温にて静置した後、５９５ｎｍ
で吸光度を測定してタンパク質定量を行った。タンパク
質定量を行った試料を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉのバッフ
ァー系にて、等量のタンパク質を含むライセートのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動
後、実施例１で述べた方法に従って、ブロッティング及
びそれに続くブロッキングを行った。すなわち、タンパ
ク質転写装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer
Cell：バイオ・ラッド）を用いて、室温にて１００Ｖに
て、０．４５μｍニトロセルロース膜（Schleicher & S
chuell，カタログ番号401196）にゲルを密着させ、３時
間ブロッティングを行った。ブロッティングバッファー
としては、前記実施例１（３）で用いたバッファーと同
じものを用いた。ブロッティング後、ニトロセルロース
膜を１０％スキムミルク（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶
液に室温にて３０分間、インキュベートし非特異的結合
をブロックした。

【００２８】ブロッキング後、スクリーナーブロッター
（サンプラテック）を用いて、ニトロセルロース膜の上
で、実施例１にて製造した抗ヒトＨＳＰ４７ラットポリ
クローナル抗体により、１次抗体反応を行った。その
後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて２回
の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行
い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイ
オ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間ず
つ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、
ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。洗浄
終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体
（Southern Biotechnology，カタログ番号3030-05)を、
２％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍
に希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、
２次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース
膜に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変え
て２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶
液で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロ
ッキング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ
（−）溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰ
ＢＳ（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティン
グ検出試薬（ECL Westernblotting detection reagen
t；Amersham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロー
ス膜上に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分
な検出試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包
み、反応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT,AR,カタ
ログ番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳ
Ｐ４７の有無の検討を行った。その結果によれば、α−
トコフェロールは子宮癌細胞株ＨｅＬａＳ３において
ＨＳＰ４７の発現を抑制した。すなわち、α−トコフェ
ロールは、ＨＳＰ４７の発現を抑制するＨＳＰ４７合成
抑制剤の活性を有するものと結論づけられ、この事実
は、α−トコフェロールが細胞外マトリックス産生の亢
進に抑制的に働くことを示している。

【００２９】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明のＨＳＰ４
７合成抑制剤は、例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性
腎不全（又は慢性腎不全に陥いる疾患）、術後の瘢痕や
熱傷性瘢痕、交通事故等の後に生じるケロイドや肥厚性
瘢痕、強皮症、動脈硬化、又は関節リウマチなどの細胞
外マトリックス産生の亢進の病態を示す病気に罹患した
細胞にみられるコラーゲン合成亢進を改善する作用を有
する。従って、本発明によるＨＳＰ４７合成抑制剤を投
与することにより、臓器、組織の線維化、硬化が阻止さ
れ、その結果、前記病気の患者の生理学的状態を有効に
改善させ、前記病気を効果的に治療することができる。
また、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤は、血管新生の異
常増殖を伴う各種疾患の予防治療にも有用である。更
に、Ｉ型コラーゲンとフィブロネクチンを基本骨格とす
る間質が、癌の転移において離脱した癌細胞が近傍の脈
管に侵入するまでのガイド役を果たすことが、明らかと
なっているので、本発明のＨＳＰ４７合成抑制剤を投与
することにより、癌の転移を抑制することも可能であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 31/355 ＡＣＶＡ６１Ｋ 31/355 ＡＣＶ // Ｃ０７Ｄ 311/72 １０１Ｃ０７Ｄ 311/72 １０１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トコフェロール又はその誘導体を有効成
分として含有することを特徴とする、分子量４７キロダ
ルトンの熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
【請求項２】トコフェロールがα−トコフェロールで
ある、請求項１に記載の分子量４７キロダルトンの熱シ
ョックタンパク質の合成抑制剤。