JPH0940581A - アポトーシス関連疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】細胞死の一種であるアポトーシスに関連する疾
患、特に糸球体腎炎の治療剤の提供。 【解決手段】繊維芽細胞増殖因子等の細胞増殖因子、並
びにヘパラン硫酸及び／又はヘパリン等の当該細胞増殖
因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分として含ん
でなることを特徴とする糸球体腎炎等のアポトーシス関
連疾患治療剤を提供すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、細胞死の一種であ
るアポトーシスに関連する疾患、特に糸球体腎炎の治療
剤に関する技術分野に属する。

【０００２】

【従来の技術】細胞死には、大きく分けて壊死（necros
is）とプログラムされた細胞死（programmed cell deat
h）の２種類がある。アポトーシスは、後者のプログラ
ムされた細胞死の一種であり、通常の壊死は細胞の膨張
やミトコンドリアの変化を伴うが、アポトーシスは細胞
核の変化が顕著である。そして、特にアポトーシスを起
こした細胞では、ヌクレオソーム単位でＤＮＡが断片化
し、このＤＮＡに電気泳動を行うと、約１８０〜２００
bpを単位としたＤＮＡの断片（いわゆるラダー）が観察
されることが知られている。

【０００３】壊死が種々の原因から起こる受動的な細胞
死であるのに対し、アポトーシスは、一般的に発生過程
や組織細胞の交替期に見られる、細胞の負の選択に関わ
る能動的な現象である。そして、近年、このアポトーシ
スが正常な生命活動のみならず、種々の疾患に関連して
いることが次第に明らかになってきている。

【０００４】例えば、糸球体腎炎にアポトーシスが関連
していることが既に判明しており（Szabolcs M.J.et a
l.,JASN 5(3)844,1994 ）、アポトーシスの誘導がＨＩ
Ｖ感染患者において亢進しているという報告もある（Mo
ntagnier,L. et al.,Sixieme Colloque des Cent Garde
s,9-17(1991)) 。また、薬剤耐性ウイルス性肝炎の肝障
害においては、薬剤又はウイルスの感染によるアポトー
シス亢進が、それらの肝障害に関与していると考えられ
ており（Bursh,W. et al.,TiPS,13,245-251(1992))、循
環器疾患や消化器疾患にもアポトーシスが関連している
ものが存在することが報告されている。

【０００５】また、その他にも形態異常、組織形成不
全、組織の萎縮、腎芽細胞腫（腎臓のウイルムス腫
瘍）、中毒や虚血による尿細管障害、脳虚血に伴う神経
細胞の障害、筋萎縮性側索硬化症，アルツハイマー病，
ハンチントン舞踏病やパーキンソン病等の神経細胞の変
性性疾患、神経細胞発達性疾患（精神病）、免疫抑制剤
や抗ガン剤の投与による胸腺細胞の障害、末梢Ｔ細胞の
減少、免疫不全症、扁平苔癬、扁平疣贅、臓器移植や組
織移植に伴う拒絶反応、細菌毒素，植物毒素や動物毒素
による障害、萎縮性脱毛症等がアポトーシスが過剰に起
きることによる疾患や障害として示唆されている。この
ように、様々な疾患とアポトーシスとの関係が、現在種
々の立場から検討されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記アポトーシスを有
効に抑制する手段を見出すことができれば、アポトーシ
スが関連する疾患を治療し、又は予防することが可能に
なると考えられる。そこで、本発明が解決しようとする
課題は、上記アポトーシスを抑制することで、アポトー
シスが関連する疾患の治療手段を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討を行った。その結果、細胞増殖因子及び
この細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖との複合
体が、生体内におけるアポトーシスを抑制することを知
見し、かかる複合体成分を配合したアポトーシスが関連
する疾患の治療剤を提供するに至った。すなわち、本発
明者は、本願において、以下の請求項記載の発明を提供
する。

【０００８】請求項１において、細胞増殖因子及びこの
細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分と
して含んでなることを特徴とするアポトーシス関連疾患
治療剤を提供する。

【０００９】請求項２において、アポトーシス関連疾患
が糸球体腎炎であることを特徴とする前記請求項１記載
のアポトーシス関連疾患治療剤を提供する。

【００１０】請求項３において、細胞増殖因子がヘパリ
ン及び／又はヘパラン硫酸結合性細胞増殖因子であるこ
とを特徴とする前記請求項１又は請求項２記載のアポト
ーシス関連疾患治療剤を提供する。

【００１１】請求項４において、ヘパリン及び／又はヘ
パラン硫酸結合性細胞増殖因子が繊維芽細胞増殖因子で
あることを特徴とする前記請求項３記載のアポトーシス
関連疾患治療剤を提供する。

【００１２】請求項５において、繊維芽細胞増殖因子が
塩基性繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とする前記
請求項４記載のアポトーシス関連疾患治療剤を提供す
る。

【００１３】請求項６において、細胞増殖因子と結合す
ることが可能な糖鎖がヘパラン硫酸及び／又はヘパリン
であることを特徴とする前記請求項３乃至請求項５のい
ずれかの請求項記載のアポトーシス関連疾患治療剤を提
供する。

【００１４】請求項７において、ヘパラン硫酸及び／又
はヘパリンが、繊維芽細胞増殖因子１重量に対して、ウ
ロン酸量で１×１０³ 重量以上配合されてなることを特
徴とする前記請求項６記載のアポトーシス関連疾患治療
剤を提供する。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明は、細胞増殖因子及びこの細胞増殖
因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分として含ん
でなることを特徴とするアポトーシス関連疾患治療剤を
提供する。

【００１６】本発明において用い得る細胞増殖因子は、
いずれかの糖鎖と結合してこの細胞増殖因子とこの糖鎖
との複合体を形成することが可能である限りにおいて特
に限定されない。そして、これらの細胞増殖因子の中で
もヘパリン及び／又はヘパラン硫酸結合性細胞増殖因子
が本発明への適用に関して好ましい。なお、ヘパリン及
び／又はヘパラン硫酸結合性細胞増殖因子とは、ヘパリ
ン及び／又はヘパラン硫酸に結合する性質を有する細胞
増殖因子を意味し、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸に
結合する性質を有する限りにおいて特に限定されるもの
ではない。

【００１７】具体的には、塩基性繊維芽細胞増殖因子
（bＦＧＦ若しくはＦＧＦ−２），酸性繊維芽細胞増殖
因子（aＦＧＦ若しくはＦＧＦ−１），ｉｎｔ−２（Ｆ
ＧＦ−３），カポジ肉腫ＦＧＦ（ＦＧＦ−４），ＦＧＦ
−５，ＦＧＦ−６，ケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ若し
くはＦＧＦ−７）等の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン
３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、シ
ュワノーマ由来細胞増殖因子、血管内皮増殖因子等を上
記細胞増殖因子として挙げることができる。

【００１８】そして、さらにこれらの中でも、bＦＧＦ
が下記に挙げるヘパリン及び／又はヘパラン硫酸等の特
定のオリゴ糖構造を有する多糖との結合性に富み、上記
細胞増殖因子として選択するのが特に好ましい。また、
上記のような天然型の細胞増殖因子の他に、安定化、薬
理活性の強化、副作用の低減、吸収促進、細胞への親和
性を向上させる等の目的で、化学的又は蛋白質工学的に
修飾された細胞増殖因子を用いることも可能である。

【００１９】なお、ここに挙げた細胞増殖因子はあくま
で例示であり、特にこれらに本発明に適用可能な細胞増
殖因子が限定されるものではない。また、これらの細胞
増殖因子は、各々の細胞増殖因子に固有の通常公知の調
製法により調製して用いることも可能であり、市販され
ているものについては、その市販品を用いることも可能
である。

【００２０】なお、これらの細胞増殖因子は、全てが本
来生体内に存在する物質であり、これらの増殖因子の本
発明アポトーシス関連疾患治療剤における投与量での安
全性が推定される。

【００２１】上記細胞増殖因子と結合することが可能な
糖鎖は、選択した細胞増殖因子の種類に応じて選択する
ことが可能である。言い換えれば、選択可能な糖鎖又は
選択することが好ましい糖鎖は、細胞増殖因子によって
個別的である。例えば、細胞増殖因子として、塩基性繊
維芽細胞増殖因子（bＦＧＦ），酸性繊維芽細胞増殖因
子（aＦＧＦ）等の上記繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）
を用いる場合には、Ｎ−スルホ−Ｄ−グルコサミン（以
下、GlcNS と略記するこもある。）残基とＬ−イズロン
酸２硫酸（以下、IdoA(2S)と略記することもある。) 残
基を多く含むオリゴ糖構造を有する糖鎖を選択するのが
好ましい。

【００２２】このような糖鎖として、特開平５−１４８
３０５号公報に記載されているオリゴ糖を用いてもよ
い。この公報には、主な２糖単位がＬ−イズロン酸２硫
酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンであり、かつ８−
１８糖で構成される繊維芽細胞増殖因子に結合するオリ
ゴ糖及びその製造方法が記載されている。

【００２３】なお、上記公報において主たる２糖単位と
は、この２糖単位がオリゴ糖鎖の大半を占めるという意
味ではなく、必須かつ比較的多く含むとの意味で上記公
報において定義されており、このようなオリゴ糖鎖をも
本発明における「細胞増殖因子と結合することが可能な
糖鎖」として用いることができる。このようなオリゴ糖
鎖としてより具体的には、ｂＦＧＦを担体に結合させた
アフィニティーカラムにヘパラン硫酸を添加し、このカ
ラムに結合させたヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩで処
理し、このカラムをＮａＣｌ等の塩で処理することによ
り溶出されるオリゴ糖鎖を例示することができる。

【００２４】このオリゴ糖鎖は、通常８〜１８糖（分子
量約１８００〜４０００）で、かつ構成２糖単位とし
て、GlcA-GlcNAc を２５〜２８％程度、GlcA-GlcNAc(6
S) を１〜８％程度、GlcA-GlcNSを１２〜１５％程度、G
lcA-GlcNS(6S)を３〜５％程度、IdoA(2S)-GlcNSを３５
〜４０％程度、IdoA(2S)-GlcNS(6S)を１１〜１４％程度
含有するオリゴ糖を例示することができるが、これに限
定されるものではない（GlcAはＤ−グルクロン酸を、Gl
cNAcはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、GlcNS(6S)
はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６−硫酸をそれぞれ表
す。）。

【００２５】また、Trends in Glycoscience and Glyco
technology, 5(25),343-354, 1993（筆者：Ishihara,
M.）には、

【化１】 （式中、Ｒ¹ は、−ＳＯ₃ ^- 又は−Ｈを表す。）

【００２６】で表される６糖体構造が塩基性繊維芽細胞
増殖因子（ｂＦＧＦ）及び酸性繊維芽細胞増殖因子（ａ
ＦＧＦ）に対して高い親和性を有することが記載されて
おり、本発明ではこの６糖体構造を含有する糖鎖をも用
いることができる。

【００２７】また、同文献中には、完全にＮ−硫酸化さ
れており、１０mer 以上のサイズとIdoA(2-O-S)-GlcNS
(6-O-S)配列〔IdoA(2-O-S) は、Ｌ−イズロン酸・２−
Ｏ−硫酸を、GlcNS(6-O-S)は、Ｄ−グルコサミン−ＮＨ
−硫酸・６−Ｏ−硫酸を表す〕に富む構造についても、
上記繊維芽細胞増殖因子に高い親和性を有することが記
載されており、本発明ではこのような構造を含む糖鎖を
も用いることができる。

【００２８】上記のオリゴ糖構造部分と上記繊維芽細胞
増殖因子とが結合して、生体外又は生体内で繊維芽細胞
増殖因子と糖鎖との複合体が容易に形成される。また、
これらの糖鎖は、各々の糖鎖に固有の通常公知の調製法
により調製して用いることも可能であり、市販されてい
るものについては、その市販品を用いることも可能であ
る。

【００２９】上記オリゴ糖構造を有する糖鎖として、具
体的には、

【化２】 〔式中、Ｒ² 及びＲ⁴ は、−ＳＯ₃ ^- 又は−Ｈを表し、
Ｒ³ は、−ＳＯ₃ ^- 又はＣＨ₃ ＣＯ−を表す。Ｘ¹ 及び
Ｘ² は、−ＣＯＯ^- 又は−Ｈを表す（Ｘ¹ ，Ｘ² は常に
異なる。）。ｎは１以上の整数である。〕。

【００３０】でその基本構造が表されるヘパラン硫酸又
は

【化３】 （式中、Ｒ⁵ ，Ｒ⁷ 及びＲ⁸ は、−ＳＯ₃ ^- 又は−Ｈを
表し、Ｒ⁶ は、−ＳＯ₃ ^- 又はＣＨ₃ ＣＯ−を表す。Ｘ
¹ 及びＸ² 並びにｎは、前記式（II）と同様である。）
でその基本構造が表されるヘパリンを用いることが可能
であり、かつ好ましい。

【００３１】このヘパラン硫酸又はヘパリンは、本発明
アポトーシス関連疾患治療剤中に単独で配合することも
可能であるが、これらを共に配合することも可能であ
る。なお、本発明で用いる糖鎖は、全てその糖鎖の性質
又は製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を
用いることができる。例えば、上記ヘパリンやヘパラン
硫酸のような硫酸化多糖の場合には、アルカリ金属塩
（例えば、ナトリウム塩，カリウム塩等）、アルカリ土
類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩又はジエ
タノールアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシ
ルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬
学上許容できる塩を本発明において用いることができ
る。

【００３２】また、ヘパリンのマウス（♂，♀）におけ
る急性毒性試験によるＬＤ₅₀は、経口投与で５０００
（mg／kg）以上、皮下又は腹腔内投与２５００（mg／k
g）以上、静注で１０００（mg／kg）程度ということが
知られている。また、ヘパラン硫酸は、その構造から、
上記ヘパリンと同等又はそれ以上の安全性が推定され
る。

【００３３】上記のように、本発明アポトーシス関連疾
患治療剤中に配合された細胞増殖因子及びこの細胞増殖
因子と結合することが可能な糖鎖は、少なくともアポト
ーシスが関与する疾患部位において、上記細胞増殖因子
及び上記糖鎖の複合体を形成し、かかる複合体が疾患に
関連しているアポトーシスの進行を制御し得る。すなわ
ち、この複合体はエンドサイトーシスにより細胞質内に
取り込まれ、最終的には細胞核に移行すると考えられて
おり、細胞核に移行したこの複合体が、細胞核ＤＮＡに
何らかの作用をして、ＤＮＡにプログラムされた細胞死
（アポトーシス）を抑制するというメカニズムが考えら
れるが、詳細には不明な点も多い。

【００３４】なお、例えばＦＧＦに、ヘパラン硫酸やヘ
パリン等のＦＧＦ結合性糖鎖が結合することにより、こ
のＦＧＦが安定化され（プロテアーゼによる分解を受け
にくくなる）、またＦＧＦの拡散性が増すことも知られ
ている。本発明アポトーシス関連疾患治療剤は、細胞増
殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な糖
鎖を有効成分として含有する。そして、アポトーシスが
関与する疾患部位において上記細胞増殖因子及び上記糖
鎖が複合体を形成する限り、これらの細胞増殖因子と糖
鎖とが、本発明アポトーシス関連疾患治療剤中で既に複
合体を形成しているか否かは特に問題とはならない。し
かしながら、細胞増殖因子の製剤中での一般的な安定性
を考慮すると、上記細胞増殖因子及び上記糖鎖の複合体
を本発明アポトーシス関連疾患治療剤に配合することが
好ましい。

【００３５】なお、本発明アポトーシス関連疾患治療剤
は、細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合すること
が可能な糖鎖を有効成分として含むが、これらの細胞増
殖因子と糖鎖とを個別に投与しても、上記の本発明アポ
トーシス関連疾患治療剤において所望される効果と同様
の効果を奏することが期待される。このことから、細胞
増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合することが可能な
糖鎖とを同一製剤中に配合することなく、個別にこれら
の細胞増殖因子又は糖鎖を製剤化したものを備えるアポ
トーシス関連疾患治療用のキットも本発明の所期の目的
は達成され得る。

【００３６】また、疾患部位において細胞増殖因子が既
に存在する場合は、この細胞増殖因子と結合することが
可能な糖鎖を投与することによっても、上記の本発明ア
ポトーシス関連疾患治療剤において所望される効果と同
様の効果を奏することが期待される。さらに、これとは
逆に疾患部位において細胞増殖因子と結合することが可
能な糖鎖が既に存在する場合には、この糖鎖と結合可能
な細胞増殖因子を投与することによっても、上記の本発
明アポトーシス関連疾患治療剤において所望される効果
と同様の効果を奏することが期待される。このことか
ら、疾患の状況によっては、細胞増殖因子又はこの細胞
増殖因子と結合することが可能な糖鎖を有効成分として
含む製剤によっても、上記の本発明アポトーシス関連疾
患治療剤において所望される効果と同様の効果を奏する
ことが期待される。

【００３７】本発明アポトーシス関連疾患治療剤の適用
となる疾患は、文字通りアポトーシスに関連する疾患で
あれば、特に限定されるものではない。例えば、急性糸
球体腎炎，慢性糸球体腎炎，糖尿病性腎炎，糸球体硬化
症，狼瘡等に分類される糸球体腎炎；腎芽細胞腫；中毒
や虚血による尿細管障害；エイズ（ＡＩＤＳ），免疫抑
制剤や抗ガン剤の投与による胸腺細胞の障害，末梢Ｔ細
胞の減少，免疫不全症等の免疫関連疾患；血管狭窄，虚
血等の循環器疾患；薬剤やウイルス感染による肝障害等
の肝臓疾患；消化器疾患；脳虚血による神経細胞の障
害、筋萎縮性側索硬化症，アルツハイマー病，ハンチン
トン舞踏病やパーキンソン病等の神経細胞の変性性疾
患、神経細胞発達性疾患（精神病）等の神経疾患；扁平
苔癬；扁平疣贅；臓器移植や組織移植に伴う拒絶反応；
細菌毒素，植物毒素や動物毒素による障害；萎縮性脱毛
症；形態異常；組織形成不全；組織の萎縮等をその適用
範囲とすることができる。なお、ここに挙げた疾患名は
例示であり、アポトーシスが関連する疾患である限り、
かかる例示疾患に本発明アポトーシス関連疾患治療剤の
適用範囲が限定されるものではない。

【００３８】また、本発明アポトーシス関連疾患治療剤
は、文字通り、アポトーシスに関連する疾患の治療に使
用し得るが、純然とした治療目的のみならず、これらの
疾患の予防目的にも用いることができる。すなわち、本
発明アポトーシス関連疾患治療剤は、これらの疾患の
「予防剤」の概念をも包含する。

【００３９】本発明においては、対象となる疾患の性質
や進行段階に応じて、後述する剤形を本発明アポトーシ
ス関連疾患治療剤の剤形として適宜選択することが好ま
しい。

【００４０】なお、剤形として注射剤を選択し、これを
静注等する場合には、ヘパリンの血液凝固抑制作用に留
意する必要があり、穿刺部の止血を確認する必要があ
る。このため、注射用製剤にする場合には、血液凝固抑
制作用のないヘパラン硫酸を用いることが好ましい傾向
がある。

【００４１】本発明アポトーシス関連疾患治療剤は、前
述の細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合すること
が可能な糖鎖と共に、適当な医薬製剤担体を配合して製
剤組成物の形態に調製される。かかる製剤担体として
は、使用形態に応じた製剤を調製するのに通常使用され
る充填剤，増量剤，結合剤，付湿剤，崩壊剤，界面活性
剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用することがで
きる。

【００４２】製剤組成物の形態は、これが上記した有効
成分を効果的に含有し得る状態であれば特に限定される
ものではなく、例えば錠剤，粉末剤，顆粒剤，丸剤等の
固剤；液剤，懸濁剤，乳剤等の注射剤形態とすることも
可能である。また、使用前に適当な担体を添加すること
によって液状となし得る乾燥品とすることも可能であ
る。

【００４３】このように得られる医薬製剤は、その形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は静脈内投与，筋肉内投与，皮下投与，皮内投与，腹腔
内投与等；固剤形態の医薬製剤は、経口投与又は経腸投
与等により投与され得る。なお、アポトーシス関連疾患
のうち、慢性疾患に対しては経口投与が特に好ましく、
急性疾患に対しては静脈投与が好ましい。

【００４４】本発明アポトーシス関連疾患治療剤中の上
述した有効成分の量及びこの製剤の投与量は、この製剤
の投与方法，投与形態，使用目的，患者の具体的症状等
によって個別的であり特に限定されない。また、本発明
アポトーシス関連疾患治療剤中の有効成分量は、１日成
人１人当り糖鎖量として５０μg 〜５００mg程度、細胞
増殖因子量として５５ng〜０．５mg程度となる範囲で投
与するのが好ましい。また、上記製剤の投与間隔は１日
１回程度でも可能であり、２〜４回に分けて投与するこ
とも可能である。

【００４５】なお、本発明アポトーシス関連疾患治療剤
の有効成分である細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と
結合することが可能な糖鎖同士の配合比は、増殖因子に
対する糖鎖の配合比率が十分に大きくないと所望するア
ポトーシス関連疾患の治療効果を発揮することが困難で
ある。

【００４６】例えば、細胞増殖因子に結合可能な糖鎖が
ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンであり、細胞増殖因子
が繊維芽細胞増殖因子である場合には、ヘパラン硫酸及
び／又はヘパリン１重量に対して、繊維芽細胞増殖因子
をウロン酸量で１×１０³ 重量以上配合することが好ま
しい。

【００４７】

【実施例】以下、実施例等により本発明をより具体的に
記載するが、かかる実施例等により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。

【００４８】〔試験例１〕アポトーシスの誘導試験 正常のウイスター・ラット（Wister rat：オス，体重２
００g ）より、腎糸球体を滅菌操作下、２０％仔牛胎児
血清（ＦＣＳ）加ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最
小基本培地（ＤＭＥＭ）培地中でシービング（Sieving
）法（StewarkK.N. et al.,J.Pathol,163,265-272,199
1 ）によって単離した。すなわち、上記ラットの腎臓を
１７３μm ，１２５μm ，５３μm のステンレス製メッ
シュで順にラットの腎臓をすりおろし、上記５３μm の
メッシュ上に残った腎糸球体を単離した。次いで、２０
％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中で単離したラットの腎糸球体を３
７℃で初代培養した。

【００４９】この初代培養したラットの腎糸球体にハブ
毒（Snake venom from Trimeresurus,和光純薬株式会社
製）を添加して（２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ培地中５μg
／ml）アポトーシスを誘導した（なお、ハブ毒によりア
ポトーシスが誘導されることについては既に報告されて
いる）。

【００５０】アポトーシスの誘導の有無は、実験群ごと
のＤＮＡを抽出して（ＤＮＡを抽出する１群当りの細胞
数は約１．０×１０⁷ 個）、これを１．７％アガロース
電気泳動にかけることにより判定した。すなわち、前述
のように、アポトーシスを起こした群は、ヌクレオソー
ム単位でＤＮＡが断片化する結果、約１８０〜２００b.
p を単位としたＤＮＡの断片化（いわゆるラダー）が観
察されるので、これらの断片の電気泳動写真上での有無
を判定した。

【００５１】このＤＮＡ電気泳動実験の結果を図１の電
気泳動写真で示す。この電気泳動写真において、向かっ
て左端のレーン（レーンａという）は、単離したラット
の腎糸球体のＤＮＡをそのまま抽出して電気泳動にかけ
たレーンである。また向かって真ん中左のレーン（レー
ンｂという）は、単離後、３７℃で２０％ＦＣＳ加ＤＭ
ＥＭ中で１時間初代培養を行ったラットの腎糸球体のＤ
ＮＡを抽出して電気泳動にかけたレーンである。また、
向かって真ん中右のレーン（レーンｃという）は、３７
℃で２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中で４時間初代培養を行っ
たラットの腎糸球体のＤＮＡをそのまま抽出して電気泳
動にかけたレーンである。そして、向かって右端のレー
ン（レーンｄという）は、単離したラットの腎糸球体を
２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭ中に移し、即培地基準で５μg
／mlの前記ハブ毒を添加し、４時間初代培養を行った場
合のラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気泳動にか
けたレーンである。

【００５２】この電気泳動写真において、ハブ毒を添加
しないレーンａ，ｂ，ｃは、たとえ初代培養を４時間行
ってもＤＮＡの断片化は起こらないが、ハブ毒を添加し
たレーンｄは、初代培養後４時間でＤＮＡの断片化が起
こり、アポトーシスが誘導されたことが判明した。

【００５３】なお、ここでハブ毒の代わりに抗Ｔｈｙ−
１．１モノクローナル抗体（このモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマは、オックスフォード大学のA.
F.Williams博士より恵与された。）を単離したラットの
腎糸球体に添加した場合も、上記とほぼ同様にアポトー
シスを誘発することができた。

【００５４】また、前記ウイスター・ラットにハブ毒又
は抗Ｔｈｙ−１．１モノクローナル抗体を静脈内投与す
ることによっても、腎糸球体にアポトーシスを誘発する
ことができた。

【００５５】単離糸球体のかわりに、“Haneda M. et a
l., Kidney Int., 44, 518-526(1993)”に記載された方
法によって、ラットの単離糸球体から得たメサンギウム
細胞を１０％（v/v）ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０中で培
養し、トリプシンを用いる通常の方法で継代培養した培
養メサンギウム細胞に、終濃度２００μg /ml の抗Ｔｈ
ｙ−１．１抗体又は終濃度５μg/mlのハブ毒を添加し、
添加後１２時間目にＤＮＡを抽出して１．７％アガロー
スゲル電気泳動を行った結果、いずれの場合もＤＮＡの
ラダーが検出された。このことから培養メサンギウム細
胞も、抗Ｔｈｙ−１．１抗体やハブ毒によりアポトーシ
スを誘発することができることが明らかになった。

【００５６】なお、アガロースゲル電気泳動によりＤＮ
Ａのラダーを検出してアポトーシスの誘発を確認する方
法の他に、組織切片を、Gavrieli等の方法（terminal d
eoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated nick end
labeling method；J. CellBiol., 119, 493-501 (199
2)）を応用したApopTag In Situ Apoptosis Detection
Kit (Oncor, Gaithersburg, MD, USA 販売)を用いて染
色することによってもアポトーシスの誘発を確認するこ
とができる。

【００５７】すなわち、抗Ｔｈｙ−１．１モノクローナ
ル抗体を静脈内投与したラットの腎臓切片を、２０μl
／ml プロテイナーゼ Ｋ(proteinase K)中で１５分間、
室温でインキュベートして、その後で内在性のペルオキ
シダーゼを抑制するために切片を１．５％ 過酸化水素
を含む無水メタノール中でインキュベートした。そし
て、この切片を、TaTとジゴキシゲニン(digoxigenin)−
ｄＵＴＰを含む反応緩衝液中でインキュベートして、ジ
ゴキシゲニンをペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン
抗体（peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antib
ody(ベーリンガー・マンハイム製)）と、基質として
３，３−ジアミノベンジジン 四塩酸（3,3-diaminobenz
idine tetrahydrochloride(DAB；シグマ社製)）を用い
てアポトーシスによって断片化されたＤＮＡの末端が存
在する部分を染色してアポトーシスの誘発を確認するこ
とができた。なお、対照染色(counterstaining)はメチ
ルグリーン(Methylgreen) で行い、光学顕微鏡で観察し
た。

【００５８】その結果、メサンギウム細胞の部分に茶色
の発色が見られた。このことは、メサンギウム細胞のＤ
ＮＡが断片化し、その結果、露出したＤＮＡの末端が多
量に発生したことを示すものであり、茶色に染色された
メサンギウム細胞がアポトーシスを起こしていることが
示された。

【００５９】〔試験例２〕アポトーシスの抑制試験 （１）上記試験例１と同様に単離したラットの腎糸球体
を、５μg ／mlの濃度で試験例１で用いたハブ毒を添加
した２０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭを基本的な培地として初代
培養を行った。そして、初代培養後のラットの腎糸球体
（細胞数は、約１．０×１０⁷ 個）のＤＮＡを抽出して
電気泳動にかけて、ハブ毒によって誘導されるアポトー
シスの抑制の有無を検討した。

【００６０】このＤＮＡ電気泳動実験の結果を図２の電
気泳動写真で示す。この電気泳動写真において、向かっ
て左端のレーン（レーンｅという）は、単離したラット
の腎糸球体を、３７℃で２０％仔牛胎児血清（ＦＣＳ）
加ＤＭＥＭ中で４時間初代培養を行ったラットの腎糸球
体のＤＮＡをそのまま抽出して電気泳動にかけたレーン
である。向かって左から２番目のレーン（レーンｆとい
う）は、上記のハブ毒添加培地中で初代培養を３７℃で
４時間行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気
泳動にかけたレーンである。真中のレーン（レーンｇと
いう）は、上記のハブ毒添加培地中に、塩基性繊維芽細
胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（生化学工業株式会社販売）を
０．５ng／ml及びヘパリン（株式会社ミドリ十字販売）
をウロン酸量で４ng／mlの割合で添加した培地で初代培
養を３７℃で４時間行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを
抽出して電気泳動にかけたレーンである。向かって右か
ら２番目のレーン（レーンｈという）は、前記レーンｇ
に関する条件中、ヘパリンの添加濃度をウロン酸量で４
００ng／mlに変更して電気泳動にかけたレーンである。
向かって右端のレーン（レーンｉという）は、前記レー
ンｈに関する条件中、ヘパリンの添加濃度をウロン酸量
で４００００ng／mlに変更して電気泳動にかけたレーン
である。

【００６１】この電気泳動写真において、培地にハブ毒
を添加しない系（レーンｅ）は、上記試験例１のレーン
ｃと同様にＤＮＡの断片化は起こらなかったことが示さ
れた。また、これに対して、培地にハブ毒を添加した系
（レーンｆ）では、ラットの腎糸球体のアポトーシスの
誘導によるＤＮＡの断片化が起こったことが示された。
また、ハブ毒を添加した培地にさらにｂＦＧＦとヘパリ
ンとを添加した系（レーンｇ，ｈ，ｉ）においては、ヘ
パリンの添加濃度が低い系（レーンｇ及びレーンｈ）で
はＤＮＡの断片化が見られた。ただし、ここではいずれ
もほぼ等量のＤＮＡ（細胞数は約１．０×１０⁷ 個）
を、電気泳動にかけているが、レーンｇとレーンｈで
は、レーンｈの方が断片化するＤＮＡの量が少ない傾向
にあった。すなわち、レーンｈにおいてはアポトーシス
の抑制がわずかではあるが認められた。また、ヘパリン
をウロン酸量で４００００ng／ml培地中に添加した系
（レーンｉ）においてはＤＮＡの断片化が著しく抑制さ
れていることが示された。

【００６２】よって、ヘパリンの添加量に対して用量依
存的にアポトーシスが抑制され、特に、レーンｉの系に
おける条件においてｂＦＧＦ及びヘパリンを作用させる
ことによって、すなわち、ｂＦＧＦ１重量に対して、ヘ
パリンをウロン酸量で８×１０⁴ 重量以上添加すること
によって、腎糸球体におけるアポトーシスの惹起を抑制
し得ることが明らかになった。

【００６３】（２）次に、添加する糖鎖の種類を変更し
て添加した場合のアポトーシスの抑制の有無を検討し
た。各系とも、上記（１）記載のハブ毒添加培地を基本
培地として初代培養を行った。すなわち、このハブ毒添
加培地にｂＦＧＦを０．５ng／ml添加し、さらに種々の
糖鎖をそれぞれウロン酸量で４μg ／ml添加して、これ
らの場合のアポトーシスの抑制効果について検討を行っ
た。

【００６４】このＤＮＡ電気泳動実験の結果を図３の電
気泳動写真で示す。図３において、向かって左側のブロ
ックの左側のレーン（レーンｊという）は、コンドロイ
チン−４−硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ）（生化学工業
株式会社製）を添加した上記培地で初代培養を３７℃で
４時間行ったラットの腎糸球体のＤＮＡを抽出して電気
泳動にかけたレーンである。同ブロックの右側のレーン
（レーンｋという）及び向かって右側のブロックの右側
のレーン（レーンｎという）は、同じくヘパラン硫酸
（生化学工業株式会社製）を添加した系について電気泳
動にかけたレーンである。また、向かって右側のブロッ
クの左側のレーン（レーンｌという）は、同じくケラタ
ン硫酸（ＫＳ−Ｉ；生化学工業株式会社製）を添加した
系について電気泳動にかけたレーンである。同ブロック
の真中のレーン（レーンｍという）は、同じくヘパリン
（株式会社ミドリ十字販売）を添加した系について電気
泳動にかけたレーンである。

【００６５】この電気泳動写真において、ヘパラン硫酸
を培地中に添加した系（レーンｋ，ｎ）及びヘパリンを
培地中に添加した系（レーンｍ）では、ＤＮＡがほとん
ど断片化されておらず、アポトーシスの惹起が抑制され
たことが示されたが、その他の系（レーンｊ，ｌ）で
は、ＤＮＡが断片化されており、アポトーシスが惹起さ
れていることが明らかになった。

【００６６】上記とは別に、ラット培養メサンギウム細
胞を無血清培地中で７２時間培養し、終濃度５μg／ml
となるように試験例１で用いたハブ毒を培地に添加し、
同時に終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度
５μg／mlのヒアルロン酸；終濃度５ng／mlのｂＦＧＦ
とウロン酸量で終濃度５μg／mlのデルマタン硫酸；終
濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg／m
lのヘパリン又は終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸
量で終濃度５μg／mlのヘパラン硫酸を培地に添加し、
更に１５時間培養した。培養後ＤＮＡを抽出して電気泳
動にかけた結果、ヒアルロン酸又はデルマタン硫酸を添
加した系についてはＤＮＡの断片化が見られたことか
ら、アポトーシスが惹起されていることが明らかとなっ
た。また、ヘパリン又はヘパラン硫酸を添加した系につ
いてはＤＮＡの断片化は観察されなかったことからｂＦ
ＧＦと、ヘパリン又はヘパラン硫酸の添加によってアポ
トーシスの惹起が抑制されることが明らかになった。

【００６７】すなわち、この試験例２（２）において、
種々の糖鎖（ここではグリコサミノグリカン）の中で
も、ヘパリン又はヘパラン硫酸の添加によって特異的に
アポトーシスの惹起を抑制し得ることが明らかになっ
た。また、ｂＦＧＦ１重量に対してヘパリン又はヘパラ
ン硫酸をウロン酸量で１×１０³ 重量以上を添加するこ
とにより、アポトーシスの惹起を抑制し得ることも確認
された。

【００６８】なお、ヘパリン及びヘパラン硫酸は、繊維
芽細胞増殖因子との結合ドメインである前述したオリゴ
糖構造を有するという点において共通しており、この点
より考えるとかかる結合ドメインと繊維芽細胞増殖因子
とが結合して複合体を形成することが、アポトーシスの
惹起の抑制という本発明アポトーシス関連疾患治療剤の
根本的な機能と密接に関わっていることが示唆された。

【００６９】（３）さらに、ｂＦＧＦに結合性を有する
オリゴ糖とｂＦＧＦに結合性を有さないオリゴ糖とを用
いて、これらについてアポトーシス惹起の抑制効果の有
無を検討した。すなわち、ＥＨＳ(Engelbreth-Holm-Swa
rm)腫瘍由来のヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩにより
消化させて得られる、ｂＦＧＦに結合性を有するオリゴ
糖（以下、ｂＦＧＦ結合性オリゴ糖ともいう）とｂＦＧ
Ｆに結合性を有さないオリゴ糖（以下、ｂＦＧＦ非結合
性オリゴ糖ともいう）を特開平５−１４８３０５号公報
に記載の方法で調製して、これらを用いた系についてア
ポトーシス惹起の抑制効果を検討した。

【００７０】上記と同様に、ラット培養メサンギウム細
胞を、無血清培地中で７２時間培養し、終濃度５μg／m
lとなるように試験例１で用いたハブ毒を培地に添加
し、同時に終濃度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終
濃度５μg／mlのｂＦＧＦ結合性オリゴ糖、または終濃
度５ng／mlのｂＦＧＦとウロン酸量で終濃度５μg ／ml
のｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖を培地に添加し、更に１５
時間培養した。培養後ＤＮＡを抽出して電気泳動にかけ
た結果、ｂＦＧＦとｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖とを添加
したものではＤＮＡの断片化が見られたが、ｂＦＧＦと
ｂＦＧＦ結合性オリゴ糖とを添加したものではＤＮＡの
断片化は見られなかった。このことからｂＦＧＦとｂＦ
ＧＦ結合性オリゴ糖を添加することによりアポトーシス
の惹起が抑制されることが明らかとなった。ｂＦＧＦと
ｂＦＧＦ非結合性オリゴ糖とを添加したものではアポト
ーシスの惹起が抑制されなかったことから、アポトーシ
スの惹起の抑制のためにはｂＦＧＦのような細胞増殖因
子と、ｂＦＧＦ結合性オリゴ糖のような、細胞増殖因子
に結合性を有する糖鎖が必須であることが確認された。

【００７１】〔実施例〕本発明アポトーシス関連疾患治
療剤の調製 （１）カプセル剤の調製 ｂＦＧＦ ０．０５mg ヘパラン硫酸ナトリウム塩 ５００mg バレイショデンプン １５０mg 軽質無水ケイ酸 ５０mg ステアリン酸マグネシウム １０mg 乳糖 ２９０mg 上記成分を均一に混合し、硬カプセルに２００mgずつ充
填した。

【００７２】（２）錠剤の調製 ｂＦＧＦ ０．０５mg ヘパリンナトリウム ５００mg バレイショデンプン １５０mg 結晶セルロース ６０mg 軽質無水ケイ酸 ５０mg ヒドロキシプロピルセルロース ３０mg ステアリン酸マグネシウム １５mg 乳糖 １９５mg ｂＦＧＦ，ヘパリンナトリウム，乳糖，バレイショデン
プン，結晶セルロース及び軽質無水ケイ酸を混合し、ヒ
ドロキシプロピルセルロースの１０％メタノール溶液を
加えて練合造粒し、径０．８mmのスクリーンで押し出し
て顆粒を調製し、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウ
ムを加えて圧縮成型し、２００mgの錠剤とした。

【００７３】（３）注射剤の調製 ｂＦＧＦ ０．０１mg ヘパラン硫酸ナトリウム塩 １００mg これらを、ヘパラン硫酸ナトリウム塩濃度としてウロン
酸量で終濃度５mg／mlとなるように、５％マンニトール
水溶液で溶解し、これを無菌濾過した後、２mlずつアン
プルに分注し密封して注射剤を調製した。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、細胞死の一種であるアポ
トーシスに関連する疾患、特に糸球体腎炎の治療剤が提
供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例１に対応する電気泳動写真。

【図２】試験例２（１）に対応する電気泳動写真。

【図３】試験例２（２）に対応する電気泳動写真。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞増殖因子及びこの細胞増殖因子と結合
   することが可能な糖鎖を有効成分として含んでなること
   を特徴とするアポトーシス関連疾患治療剤。
2. 【請求項２】アポトーシス関連疾患が糸球体腎炎である
   ことを特徴とする請求項１記載のアポトーシス関連疾患
   治療剤。
3. 【請求項３】細胞増殖因子がヘパリン及び／又はヘパラ
   ン硫酸結合性細胞増殖因子であることを特徴とする請求
   項１又は請求項２記載のアポトーシス関連疾患治療剤。
4. 【請求項４】ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸結合性細
   胞増殖因子が繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とす
   る請求項３記載のアポトーシス関連疾患治療剤。
5. 【請求項５】繊維芽細胞増殖因子が塩基性繊維芽細胞増
   殖因子であることを特徴とする請求項４記載のアポトー
   シス関連疾患治療剤。
6. 【請求項６】細胞増殖因子と結合することが可能な糖鎖
   がヘパラン硫酸及び／又はヘパリンであることを特徴と
   する請求項３乃至請求項５のいずれかの請求項記載のア
   ポトーシス関連疾患治療剤。
7. 【請求項７】ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンが、繊維
   芽細胞増殖因子１重量に対して、ウロン酸量で１×１０
   ³ 重量以上配合されてなることを特徴とする請求項６記
   載のアポトーシス関連疾患治療剤。