JPS6218401A - 結合組織病理において有効な医薬の製造に使用する多糖およびオリゴ糖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は結合組織の病理に有効な医薬を得るための多糖
又はオリゴ糖の使用に係る。

これら病理において、心血管疾患、骨関節疾患、肺疾患
及びその他の老人病及び突起例えば悪性腫瘍によって不
能が生じ、このような不能の頻度及び状態はしばしば年
令と共に指数的に増加及び悪化する。

これらの疾患の正確なメカニズムは完全には解明されて
いない。しかし乍ら、ある種の細胞メカニズムと分子メ
カニズムとの存在が知られており、このようなメカニズ
ムは特に、弾性組織分解活性をもつプロテアーゼ／抗プ
ロテアーゼの比のアンバランス、より詳細にはエラスタ
ーゼ（特に白血球エラスターゼ）／抗エラスターゼの比
のアンバランスに関与する。

例えば、ある種の肺疾患例えば肺気腫又は血管疾患例え
ば動脈硬化症に対してエラスターゼ／エラスチン系とそ
れらの阻害物質とが関与することは公知である。

また、肺の弾性組織分解が肺気腫の進行の初期の割合の
減少又はその失活又は組織局部での弾性組織分解活性の
増加に起因する。

従ってエラスターゼ／エラスターゼ阻害物質＃；＝ｔ＃
＝＃の比はこの種の病理の進行の主要要因である。

この現象に関与するエラスターゼは多くの場合白血球エ
ラスターゼ及びモノサイト−マクロファージのエラスタ
ーゼに対応する。これらは夫々、セリンプロテアーゼと
金属プロテアーゼとを意味する。

上記のその他の疾患においてもまた、ある種のプロテア
ーゼ、しばしばエラスターゼのタイプのプロテアーゼの
活性が増加することが観察される。

血管平滑筋肉細胞の細胞膜に固定したエラスターゼのタ
イプのプロテアーゼ（セリンプロテアーゼ）の生合成が
指数的に増加すること、及び、インビトロで線維芽細胞
中の金属プロテアーゼのタイプのエラスターゼが培地に
分泌され細胞集団の倍増数即ち熟成に伴って増加するこ
とが最近判明した。

これらエラスターゼとその阻害物質との比のアンバラン
スは、エラスターゼが極めて多量に分泌されるため、エ
ラスターゼ阻害物質の欠陥が存在するため特にα−１プ
ロテアーゼ阻害物質即ちα−１抗トリプシン（以後αＩ
Ｐ＋と指称）が欠如しているために生じる。このアンバ
ランスの理由としてまた、エラスターゼが弾性繊維に迅
速に吸着され阻適用される有効な薬剤が存在しなかった
。

例えば肺気腫を治療するには、一般に天然又は合成の阻
害物質を使用する。天然阻害物質は、主として供与者に
由来のα−ＩＰＩである。この阻害物質は肺気腫受容体
中に潅流される。α−ＩＰ＋の生物期間が極めて短いの
で、反復治療の必要があり従って臨床使用が難しい。

インビトロで有効なエラスターゼの合成阻害物質、例え
ばクロロメチルケトンペプチド又はフッ化スルホニルは
、インビボでは重大な欠点を生じる。これらの選択率は
実際極めて低くまた毒性もとうてい無視できない。更に
、肺気腫を誘発するエラスターゼの気管内注入の以前又
は以後の短時間内に注射しなければ効果がない（その効
力は酵素の活性部位との接触の速さに左右される）。

発明者等はこの分野での研究によって、凝血に対する調
整特性をもつことが既知のある種の多糖又はオリゴ糖を
使用すると弾性組織分解活性をもつプロテアーゼに対し
て有効な薬剤が得られることを知見した。この薬剤は高
い選択性をもち効力が大きく副作用を実質的に生じない
。

従って本発明の目的は、プロテアーゼと抗プロテアーゼ
とのアンバランスが関与する結合組織の病理に有効な新
規な薬剤を提供することである。

本発明の目的はまた、これらの系のアンバランスの原因
となる要因を予防及び治療するために薬剤を種々の投与
形態で使用することである。

本発明によれば、結合組織の病理に対して有効、な薬剤
を得るためにグリコサミノグリカン又はグリコサミノグ
リカンの断片が使用される。これは薬理学的に許容され
る塩の形態でもよい。

グリコサミノグリカンＧＡＧは実質的に、ウロン酸−ア
ミノ糖（又はその逆の）繰返し基本単位から形成される
。この単位は生物学的に活性の天然ＧＡＧ例えばヘパリ
ン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫
酸又はヒアルロン酸の多糖鎖又はオリゴ糖鎖中に検出さ
れる。これらの鎖中、ウロン酸基本単位は特にＤ−グル
クロン酸又はＬ−イズロン酸構造に対応し、アミノ糖基
本単位は（例えばヘバリ、ン又はヘパラン硫酸中の）Ｄ
−グルコサミンの構造又は前記の別の物質中のＤ−ガラ
クトサミン構造に対応する。

本文及び特許請求の範囲において、天然グリコサミノグ
リカン、その低分子量断片又は鎖、薬理学的に許容され
るその塩をＧＡＧと指称する。

ある種の天然物質は抗トロンビンＩ　（ＡＴ−ＩＩＩ　
）又はヘパリンの補因子Ｕ（）ｆｃＩＩ）に高いアフィ
ニティをもつ鎖を含む。

アルコール抽出又は亜硝酸もしくは酵素による解重合に
よって鎖の割合を増加させ、凝血因子Ｘａに対してより
特異的な活性をもっＧＡＧを生成し得る。

これら組成物の特徴は、Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価（抗
トロンビン活性を示す抗Ｘａ活性の尺度）とＵＳＰ価（
総凝血活性の尺度）との比がヘパリンより高いこと即ち
１より大きいことである。

ある種のＧＡＧにおいてはＵＳＰ価は実質的に０になり
０１価は２０００ｕ／鬼の“値を上回る。

意外にもこれらＧＡＧのインビトロ及びインビボテスト
によれば、種々の精製エラスターゼに対して有効である
ことが判明した。

より詳細には、これら物質は、エラスターゼ／抗エラス
ターゼの比のアンバランスに関連した結合組織の病理に
主として関与する酵素たる白血球エラスターゼに対して
強力な阻害効果及び高い選択性を有する。

この阻害は、多形核白血球中に白血球エラスターゼと共
に存在し惣性又は慢性の炎症性組織傷害の処でエラスタ
ーゼ活性に相乗効果を与えるカテブシンＧにも有効であ
るという利点をもつ。

極めて重要な別の特徴によれば、これら物質はエラスタ
ーゼ阻害物質の血清中比率を増加し得る。

本発明の実施態様によれば、本発明の薬剤の製造に使用
されるＧＡＧはヘパリン又はヘパラン硫酸中で検出され
る如きＤ−グルコサミン−ウロン酸（Ｌ−イズロン酸又
はＤ−グルクロン酸）の繰返し基本単位をベースとする
。

本発明の好適具体例によれば、ＧＡＧがヘパリンである
。

別の好適具体例によれば、使用ＧＡＧはヘパラン硫酸か
ら成る。

更に別の好適具体例によれば、出発ＧＡＧはヘパリン又
はヘパラン硫酸より小さい分子量をもつ。

特に、分子量（ＰＭ）は約１０，０００ドルトン未満で
ある。

これら低分子量即ち低ＰＭのＧＡＧとしては特に以下の
物質を挙げることができる。

−特に１９７８年１１月６日のフランス特許第７８３１
３５７号及び第１追、加特許たる１９７９年７月２０日
のフランス特許第７９１８８７３号に記載のヘパリンの
アルコール抽出によって得られたムコ多糖。

主特許の特徴によれば、これら生成物は分子最約２００
０〜８０００ドルトンでＹｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価／Ｕ
ＳＰ価の比が２以上の鎖の混合物から形成される。記載
の生成物のうちでＶＷ／ＵＳＰ比が３から５のオーダで
平均分子ｆｉ３０００〜５５００のものを以後ＣＹ２１
６と指称する。

−前記フランス特許第７８３１３５７号の第２追加特許
たる１９８０年３月２０日のフランス特許第８００６２
８２号及び１９８１年４月ｌＯ日のフランス特許出願第
８１０７２８３号に記載の亜硝酸によるヘパリンの調整
解重合により得られるムコ多糖。これら生成物は一般的
に上記特性に対応し２．５−無水−マンノ構造の基で終
結する。

特に、２．５−無水−マンニトール末端をもつタイプの
ムコ多糖（以後ＣＹ２２２と指称）又は２．５−無水−
マゐ ンｌン酸末端をもつタイプのムコ多糖が挙げられる。よ
り特定的には、多数グリコシド鎖の分子量は２０００か
ら３０００のオーダ特に約２０００〜２６００である。

ＹＷ価／ＵＳＰ価の比は特に１０以上でＹｉｎ４ｅｓｓ
ｌｅｒ価は約２００ｕ／９以上である。

−１９８４年１０月１８日のフランス特許出願第８４１
５９７８号に記載の主として、（１）平均分子量３００
０〜６０００ドルトン特に約４０００〜５０００の鎖で
、（２）ＶＷ／ＵＳＰ比が１０未満特に約６〜３で、（
３）２，５−無水−マンノ構造の基本単位で終結する鎖
から形成されたムコ多糖。

−１９８０年ＩＯ月６日の欧州特許出願第８０４０１４
２５号に記載の如き実質的に２０００ｕ／Ｎの高いＹｉ
ｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価と実質的に０の低いＵＳＰ価とを
もち高いＡＴＩＩｒアフィ−動物器官の処理によって得
られるＧＡＧ組成物に対応する所謂完全ＧＡＧ０ 一ヘパリナーゼ又は亜硝酸によるヘパリンの解重合と、
ＡＴ−ＩＩＩへの固定配列をもつ両分の分離と、これら
画分のゲル濾過とによって得られるような種々の重合度
のＧＡＧ断片。

これらＧＡＧ断片として例えば、重合度（ｄｐ）が１２
より大きいＧＡＧ断片及び重合度１２未満特に１２，１
０，８゜６．４のＧＡＧ断片がある。

これらの種々のＧＡＧは非限定的な例として示されただ
けであり、出願人名義の種々の特許及び特許出願で使用
され記載された出願人が十分に知っている生成物である
ことは理解されよう。

本発明の医薬を製造するために他のいかなるグリコサミ
ノグリカンの使用も可能である。

更に、本発明の別の特徴によれば、使用ＧＡＧが、例え
ばデルマタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫
酸又はヒアルロン酸中で検出されるようなり一ガラクト
サミンーウロン酸の繰返し基本単位をベースとする。

１つの具体例ではデルマタン硫酸が有利である。

別の具体例では使用ＧＡＧがコンドロイチン又はコンド
ロイチン硫酸から形成される。

更に別の具体例ではＧＡＧがヒアルロン酸から構成され
る。

本発明の別の特徴によれば、出発ＧＡＧの重合度が均一
である。これらＧＡＧは例えば、ヘパリン解とこの分離
が容易である。

偶数の重合度の鎖から形成される解重合混合物を使用し
て容易に行なわれる処理の変形例によれば、ＧＡＧ混合
物をゲル濾過処理して重合度の均質なＧＡＧを得る。

本発明の別の特徴によれば、硫酸化（ｓｕｌｆａｔａ−
ｔ　１ｏｎ）プロフィルが修正されたＧＡＧが使用され
る。

これは、−〇Ｈ基の一部又は大部分又は全部が硫酸エス
テル基５０３−によって置換された前記の如き生成物を
意味する。

このタイプの生成物は特に、出願人による同日のフラン
ス特許出願に記載のタイプの生成物であり、該フランス
特許出願に記載の方法を用いて有機溶媒に可溶な塩の形
態の所与のＧＡＧの硫酸化によって生成されるのが有利
である。

硫酸化度は約２〜約４の値で変わる。

これらＧＡＧは、アミノ糖基本単位の２位の−ＮＩＳＯ
，−基の一部又は大部分又は全部が−ＮＨ−アシル基特
に−ＮＨ−アセチル基で置換された生成物を包含する。

インビトロモデル反応及びインビボ動物モデル中の前記
ＧＡＧの作用をテストするとその強力な効力が証明され
た。

この作用に関する研究の結果、白血球エラスターゼとカ
テプシンＧ（エラスターゼの活性に相乗効果を与える）
とに対する強力な阻害効果、高度な選択性及び低濃度（
０，５ｎｙ／ｍ）が証明される。別の重要な知見は、こ
れら生成物か白血球エラスターゼに与える阻害効果とカ
テプシンＧに与える阻害効果との間に十分な相関性が見
られることである。

後述の実施例に記載のごとく、これら生成物はハムスタ
ーに対して行ったインビボテストで、血清のエラスター
ゼ活性を強力に阻害し、またエラスターゼ阻害物質特に
αＩＰ＋の血清中濃度を次第に増加させるという重要な
結果が判明した。

これらＧＡＧの効力の範囲は、アテローム形成症に関与
する細胞付着因子を構成するフィブロネクチンの生合成
の阻害に及ぶ。

これらＧＡＧはまた、コラーゲンの合成阻害、特にＩ＋
Ｉ型のコラーゲンの合成阻害に作用する。

ＧＡＧの別の特性は、動脈プロテオグリカンによる軽量
りボタンバク質（ＬＤＬ）の沈降に関与することである
。アテローム沈着の形成後に不溶性の遊離ＬＤＬ−動脈
プロテオグリカン複合体の形成が生じることは一般に認
められている。これらの現象が総合されて動脈硬化症及
び血管閉塞症の進行に重大な影響を与える。

上記の特性をもつだけでなく更にこれら生成物は無毒で
あることが既知なので結合組織の病理特に肺、血管及び
関節の病理に有効な薬剤の製造に特に重要である。

本発明の製剤の特徴は、有効最の上記ＧＡＧを薬剤賦形
剤と共に含有することである。これら製剤は発熱性物質
を含まない。

好適組成物は経口投与に適した薬剤担体を含む。

対応する有利な剤形はカプセル剤、錠剤又はタブレット
剤、火剤、又はリポソームである。

別の薬剤組成物は、ＧＡＧを直腸投与に適した賦形剤と
共に含む。対応する剤形は坐薬剤である。

別の薬剤組成物においてＧＡＧはエアゾール又は軟膏の
形態である。

本発明は更に静脈内、筋肉内又は皮下注射によって投与
できる無菌又は殺菌可能な注射薬に係る。

これら溶液は、皮下注射で投与されるときは１〜２００
町／ｄ好ましくは２０〜１５０■／ｉのＧＡＧを含むの
が有利である。これら溶液が例えば静脈内注射又はａ流
によって投与されるときは３０〜１００■／ｍｌ特に４
０〜５０”Ｒ／ｄのＧＡＧを含む。

かかる薬剤は既製の使い捨て注射器の形態で供給される
のか有利である。

本発明の薬剤組成物は特に、心血管、骨関節、肺又はそ
の他の結合組織の病変を含む老人病の予防又は治療に有
効である。

これら組成物は特に、エラスターゼの不均換ｉ、特に白
血球エラスターゼ−抗エラスターゼの不均衡の予防及び
治療に適している。

本発明の組成物はまた、フィブロネクチン及びコラーゲ
ンに対する阻害効果がありまたＬＤＬとの相互作用に対
する阻害効果があるのでアテローム形成症にも極めて重
要である。

本発明組成物は更に、例えば動脈硬化症で特に血管壁、
肺線維症で肺、肝硬変で肝臓の組織中で生じるコラーゲ
ン増加を抑制する。

本発明組成物の抗エラスターゼ活性はまた、毛細管の基
底層の侵食が脳及び血管の障害の主因となっている病気
又は骨関節疾患の治療にも適する。

ヒトに使用できる用量の一例を以下に示す。用量は、投
与形態次第で約１ｒｒＩｇ〜約１．５ｇ／２４時間の範
囲で゛あり、静脈内投与では好ましくは５〜５００■７
日例えば２００■７２４時間のオーダ、経口投与では１
００〜５００鬼７日である。

これら投与量は勿論、各患者毎に行った予備血液分析の
結果とかかっている病気の種類と全体の健康状態とに応
じて各患者毎に調整される。

本発明ＧＡＧは更に、別の物質のプロテアーゼ阻害活性
をテストするための比較コントロールとして実験室で使
用される生物試薬の成分として使用される。

本発明の特徴及び利点は以下の実施例によってより十分
に理解されよう。

弾性組織分解活性と＃＝＝；プロテアーゼの阻害能とに
関するインビトロテスト （ａ）血清弾性組織分解活性の定量 以下の基本手順で定量する。アミノ酸とバラニトロアニ
リド化合物とのアミド結合をタンパク質分解によって破
壊しバラニトロアニリド化合物を遊離する。

不安定なバラニトロアニリドは環形成して４１０ｎｍに
最大吸収をもつ安定な化合物バラニトロアニリンを形成
する。

エラスターゼ活性を４１０ｎｍで比色的に算定すると加
水分解した基質のモル量に比例する。

Ｎ−メチル−２−ピロリドン中にスクシノイルートリア
ラニルーパラニトロアニリドを７９”９／ｄの割合で含
む１２５ｍＭの合成基質の溶液を調製する。

漸増量で添加する。

調製物を３７°Ｃで１時間インキュベートし２０ハのＰ
ＭＳＦを添加して反応を停止させる。

光学濃度をエラスターゼ濃度の関数として測定して酵素
活性を測定する（酵素の量はｎｇのオーダである）。

（ｂ）エラスターゼに対する血清阻害能の定量一定量の
基本手順 ハムスターの血清中に漸増量の阻害物質を添加した後に
残留エラスターゼ活性を定量する。

このために、α１−プロテアーゼ阻害物質とα２−マク
ログロブリンとを含有する種々の量の血清を既知量のブ
タ膵臓エラスターゼと共にブレインキュベートする。こ
のブレインキュベーション後に合成基質５ＴＡＮＡに対
して残留酵素活性を定量する。

純酢酸（１００ｄ）を添加して反応を停止させる。

−処理モード （基質と共に１時間インキュベートした光学濃度０．８
に対応する）８０ｎ９の酵素をＯ〜３０ＪＩｌの範囲の
種々の量の基質と共に室温で３Ｄ分間ブレインキュベー
トする。

ハムスターの血清を２０倍に希釈する。これは、エラス
ターゼとのインキュベーションを１時間維持した後にあ
まり多くない定量的な阻害を得るためである。酵素と血
清とを３０分間存在させると酵素−阻害物質複合体が形
成される。次に２０７４の基質と、１ｍ１の最終溶液を
得るために十分な量のバッファとを添加する。

調製物を１時間インキュベートし、ｔｏｏ、ａの純酢酸
を添加してｐＨを低下させることによって反応を停止さ
せる。

残留エラスターゼ活性を４１０ｎｍの光学濃度で測定す
る。観察されたグラフは２つの主要な相をもつＯ −血清添加景の関数として酵素活性の定常減少を示す相 一活性酵素の一部を残存させた余剰虫の血清阻害物質に
対応するプラトー。

即ち、α２マクログロブリンはエラスターゼ活性の一部
しか阻害しない。使用した５ＴＡＮＡの如き小基質に接
近可能な酵素の活性中心は残存する。

コントロール血清のプロテアーゼ阻害能とグリコサミノ
グリカン誘導体で処理した血清の同じ阻　′害能とを比
較すると、種々の血清阻害能を有効且つ定量的に比較で
きるグラフの下降部分が存在する。

種々のエラスターゼに対するヘパリン、ＣＹ２１６、Ｃ
Ｙ２２２及びｄｐ＞１２の両分によって得られた結果を
以下に示す。

（１）ラットの白血球エラスターゼに対するテスト　。

エラスターゼ活性（％）を被検物質の濃度引ｔの関数と
して測定する。結果を第１図に示す。第１図は、ヘパリ
ンによる結果をグラフ−〇−〇、ＣＹ２１６＋、：：よ
る結果をグラフ　−Ｘ−Ｘ５ＣＹ２２２＋、ニーよる結
果をグラフ−０−０−１ｄｐ＞１２の両分による結果を
グラフ−Δ−Δで夫々示す。

これらグラフより、被検物質が０．０５’Ｖ／ｄという
低濃度でエラスターゼ活性の約８０％を阻害することが
判明する。

−ラットのカテプシンＧに対するテスト残留酵素活性を
被検物質の関数として測定する。

第２図は、エラスターゼ及びカテプシンＧに対してヘパ
リン（ａ）、ＣＹ２１６（ｂ）、ＣＹ２２２（ｃ）、ｄ
ｐｉ２の画分（ｄ）、ｄｐ＞１２の画分（ｅ）で得られ
た結果を示す。

これらのグラフより、白血球エラスターゼ及びカテブシ
ンＧの夫々に対するこれら物質の阻害作用の間に十分な
相関性が存在することは明らかである。

ヘパリン、ＣＹ２１６及びＣＹ２２２は白血球エラスタ
ーゼよりもカテプシンＧを゛強力に阻害するが、ａｐ１
２の画分はカテブシンＧよりもエラスターゼを阻害する
。

（２）ブタの膵臓エラスターゼに関するテスト以下のご
とく処理する。

繊維性エラスチンを含むアガロースゲルをペトリ皿に入
れ、阻害物質添加及び不添加の既知量のエラスターゼを
小カップから付着させる。次に溶解領域の発達を観察す
る。

１０’￥／ｍｔ’の高濃度の被検化合物が膵臓エラスタ
ーゼの作用を強力に阻害することが確認された。

（３）エラスターゼのタイプのプロテアーゼ（ブタの大
動脈の平滑筋肉細胞（セリンプロテアーゼ）とブタの大
動脈の外膜の線維芽細胞（金属プロテアーゼ）に対する
テスト １０■／威より高い濃度で被検物質によるエラスターゼ
の阻害効果が得られる。

ｍじとじ、ハムスター血清のエラスターゼおよび阻害活
性に対する作用−血清のエ ラスターゼ活性の阻害と供試化合物 の濃度との関係 合成基質の５ｕｃ（Ａｊ！ａ）３−　ｐＮＡにツいて定
量し、結果は化合物を添加してない血清単独の場合（対
照）の活性を１００％として相対活性（％）で示す。

これらの結果によってＣＹ　２１６とＣＹ　２２２の分
子の存在下での血清の弾性組織分解活性の不活化が立証
される。すなわち、これらの化合物のｍ度は０．２ｎＱ
ｌ−という低濃度でも血清１＃Ｉｌ！中に含まれる弾性
組織分解活性の２０％を不活化することができることが
示される。特に化合物ＣＹ２１６の場合は指数関数的な
用量−効果の関係がある。ヘパリンでは同じ用量で不活
性化は全くみられなかった。

丈ＪＪＬＩ−ハムスターの正常血清または処理血清中の
エラスターゼ／抗−エラスタ ーゼ平衡に対する本発明の医薬の作 用のｉｎ　ｖｉｖｏ研究 次の３群のハムスターに対して行なった実験の結果を以
下に挙げる。

一第１群一対照１０匹 一第２群＝　ＣＹ　２１６分子で６週間処理したハムス
ター１０匹 一第３群＝　ＣＹ　２２２分子で６３ｉ間処理したハム
スター１０匹。

この処理は、１００ｇのハムスターに６３１１１！！毎
日分子２＋１１（Ｊを注射して行なう。この用量は治療
量と考えられる。

ａ）循環血清のエラスターゼ活性の測定上記処理の間毎
週頚部から血液試料を採取して循環面のエラスターゼ活
性の変化を追跡する。

試料は化合物の皮下注射の１時間後、２時間後。

４時間後、７時間後および２４時間後に採取する。

こうすると、化合物の投与に応じた酵素反応の進展の動
静を追跡できる。動物は１群が１０匹であるので、供試
化合物の皮下注射の１時間侵に各群の２匹のハムスター
から６００ｐｉ採血し、その後注射後２時間、４時間、
７時間および２４時間の時点で別の２匹のハムスターか
ら順に６００１１Ｎ採取する。

得られた血清のエラスターゼ活性を第３図のヒストグラ
ムに示す（供試化合物の注射後採血までの時間は横軸に
示した。なお、実験までの全処理時間（１，２，３週）
も示しである。） 結果が示しているように、処理後筒１迎目からエラスタ
ーゼ活性の減少を認めることができ、この減少はＰＭが
ヘパリンより小さい分子の注射の２時間後に最大になる
。次に、２４時間後には（全く処理していないハムスタ
ーの血清の値で示される）正常の値に戻る傾向が認めら
れる。

この効果は６週間の処理の間処理が長引くにつれて匹敵
するようになる。

これらの結果から、処ｙｆ、ＩＪ物の血清の弾性組織分
解活性に対するＣＹ物質の作用は、ＣＹ分子を直接血清
に添加した際にみられるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける血清
の弾性組織分解活性に対する不活化と同じ方向に働くと
結論できる。ざらにｉｎ　ｖｉｖｏで見られたこれらの
結果は、循環血液中のＣＹＩｉ度が減少するにつれて効
果が減少することを示唆しており、このこともｉｎ　Ｖ
ｉｔｒＯで得られた結果を支持している。

ｂ）膵臓エラスターゼに対する血清の阻害能の測定 用いた手順プロトコルは既に記載したものと同じである
。３週間の処理の間血清中エラスターゼ阻害物質の割合
の増加が認められる。この実験は気腫におけるヘパリン
、その両分および断片ならびにその過硫酸化（５ｕｒｓ
ｕｌｆａｔｅｄ）誘導体の治療価を予言する。気腫の特
徴は弾性組織分解活性の増大に帰因する肺の弾性組織の
損失であり、エラスターゼの減少を伴なうことが多い。

阻害能については、３ｕｌｌｅｔｉｎ　［：ｕｒｏｐｅ
ｃｎ　ｄｅ　　Ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌ。

ｇｉｅ　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｉｒｅ　　（１９８０）　
Ｖｏｌ、１８．補遺、特に１９９〜２０６頁、ならびに
同刊行物の別の論文を参照されたい。処理の４週間侵に
膵臓エラスターゼに対する阻害能の増大傾向がみられる
（第４図のヒストグラム参照）。

実」１１Ｌ先≦−コラーゲンの生合成の阻害に対するＧ
ＡＧの作用の研究 ブタ大動脈（第四路）の事情筋細胞を箱当り細胞２．５
Ｘ　１０６個の割合で用いる。トレーサーとしてトリチ
ウム化プロリンを加えて２４時間インキュベートする。

対照（４箱）、ヘパリン、ＣＹ２１６およびＣＹ２２２
　　（各々２０１１ｇと　１００埒の用量）を用いる。

インキュベーション後、細胞層を採取し、培地を傾斜し
、１回洗い、Ｈ２Ｏに対して透析し、次に０．５ＭＹｒ
ｉＱに対して透析し、ペプシン処理（ｐｅｐｓｉｎｉ、
５ａｔｉｏｎ　）　Ｌ／てコラーゲンを可溶化する（１
００／４ｇ／ｄ、　２ｘ２４　４℃）。

可溶性のペプシン画分は放射性ヒドロキシプロリン全体
のうち９５％を含んでいる。（ＮＨ４）２８０４　　（
１７２ｍｏ／ｄ）を用いて沈殿さゼた後Ｒｏｊ１＜ｉｎ
ｄ法に従ってヒドロキシ（３日）プロリンと（３Ｈ）プ
ロリンの放射能を測定する。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、７．５％）上で
電気泳動する。

α１鎖とα２鎖に相当するゾーンを切り出し、８鎖の放
射能を測定する。

得られた結果を下の表に示す。

この結果を検べると、コラーゲンの生合成に対するＧＡ
Ｇの阻害効果が大ぎいことがわかる。

ヘパリンとＣＹ２１６について用量効果があることに注
意されたい。阻害は２０埒よりも１００／１１１９の用
量の時の方が大きい。その代わりにＣＹ　２２２の場合
は２０埒でも強い阻害がみられる。

本発明の医薬の製造に用いたＧＡＧはさらに、コラーゲ
ンエ型＋■型と比較して■型を選択的に阻害するという
定性的作用を示す。

実ＪＬｆＬゴ二一　平滑筋細胞によるフィブロネクチン
の生合成に対するＧＡＧの作用 ブタ大動脈（第四路）の平滑筋細胞を箱当り２．５Ｘ　
１０６個用いる。各実験で３個ずつかまたは４個ずつで
用いた８箱に何も加えない（対照）か、あるいはＣＹ　
２１６か２２２を２０埒／ｍｇで加え、他の箱にはＣＹ
２１６と２２２をｉｏｏ埒／ｄ、すなわち箱当り３００
ｐ９、また同様にヘパリンを加える。

使用したトレーサーは３５Ｓ−メチオニン（１箱に付き
５μＣｉ）であり、使用したインキュｔべ一ションの時
間はフィブロネクチンの生合成が速いために３時間と６
時間の２種にする。

インキュベーションし、培地を傾斜し、洗浄した後、デ
オキシコール酸塩で抽出して膜および細胞内画分を得、
フィブロネクチン中に特異的に取り込まれた放射能両分
を免疫沈降によって測定する。下記表に、３時間後と６
時間後にデオキシコール酸抽出物中に取り込まれた３５
Ｓ−メチオニンとアクリルアミドゲル電気泳動で免疫沈
降させたものから単離したフィブロネクチンのバンド中
にみられる放射能の割合（％）を示す。ヘパリノイドの
存在下でフィブロネクチン中にとり込まれたアイソトー
プの割合の約５０％が阻害されることがわかる。

実施例６：　フィブロネクチンの生合成のＧＡＧによる
阻害ブタ大動脈の平滑部組 胞−２，５Ｘ　１０Ｇ個／箱。ＣＹ２１Ｇ。

ＣＹ　２２２およびヘパリン−２０１１ｇ／　ｄおよび
１００／１１１９　／　ｄ。インキュベーション−３時
間および６時間。

デオキシコール酸抽出物（膜画分）およびフィブロネク
チンの免疫沈降物内のｂｔ１９Ａ能定聞−ポリアクリル
アミドゲル上でのバンドの分離、切り出しおよび　　　
： フィブロネクチン内に取り込まれ、 認められた放射能（％） ３時間　阻害％　６時間　阻害％ 対　　照　　　　　　　７０．６３１．７抽出物中の全
放則能 ｄｐｍ／１０６細胞： ４５．８００Ｘ　３．５　＝ １６０３００、００±５６００８．ｄ。

ＣＹ２１６　２０１１９／ｍｌ！　　３９．２　　４４
　　２５．０　　２１ＣＹ　２１Ｇ　１００〜／ｄ　　
３８．４　　４６　　２４．１　　２４ＣＹ２２２　２
０ｓ／＃＋ｅ　　３６．１　　４９　　２１．０　　３
４ＣＹ　２２２１００１１！Ｉ／ｄ　　３７．３　　４
７　　２０．２　　３６ヘパ’）ン２０Ｒ／ｒｔｄｌ　
　３５．１　　５０　　２０．２　　３６へ′１ゝ１０
０　　３３．７　５２　１４．８　４７これらの結果は
試験した条件のフィブロネクチンの生合成に対するＧＡ
Ｇの阻害作用を明らかに示している。

実ｍじ−ＧＡＧｓ、ｓ、の白血球エラスターゼとカテブ
シンＧに対する活性のｉｎ ｖ　’＋　ｔｒｏテスト（Ｓ、Ｓ、は硫酸化プロフィル
の修正されたＧＡＧをさす〉 白血球エラスターゼはラットの胸膜浸出液から得た多形
核白血球を用いて調製した。基質はＮ−スクシニルトリ
アラニンパラニトロアニリドであり、酵素活性は酵素を
供試化合物と共に室温（２０℃）で１時間インキュベー
トしてから測定する。次に基質を加え、３７℃で２０時
間インキュベートし、４１０ｎｍで読み取る。

ヒト多形核白血球から得たヒト力テプシンＧの場合は基
質としてアゾカゼインを用いて定量する。

上と同様に、酵素を供試化合物と共に室温で１時間イン
キュベートし、次にアゾカゼインを加え、混合物を３７
℃で５時間インキュベー１〜し、最終濃度５％のトリク
ＯＯ酢酸で沈澱させ、３６６ｎｍで読み取る。

供試化合物と、エラスターゼおよびカテプシンＧに対す
る阻害活性とを下記表に示す。

また硫酸化プロフィルの修正されていない化合物も一緒
に挙げる。

Ｂ′の部分に示したテストは濃度０．１８ＭのＮａ　Ｃ
！の存在下で行なったものである。

テストしたいろいろな誘導体について良好な阻害活性が
みられた。

硫酸化を過多にすると阻害は増強される。（エラスター
ゼは過硫酸化ＣＹ　２１６で１００％阻害され、カテブ
シンＧは過硫酸化ヘパリンで５９％、過硫酸化ＣＹ２１
Ｇで６５％阻害される）。分子量が一定であれば阻害は
過硫酸化化合物の方が強い。この現象は、阻害活性をほ
とんど全くもたず、過硫酸化されると強く阻害する最も
低分子量のものの場合に最も著るしい。

供試化合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　％　阻害エラスターゼ　力テブシンＧ ａ、ｂ、Ｃ０ｄ。

Ａ）ヘパリン（ナトリウムｊＷ）　　　　　　　　　７
００　　　１００　　　　４９　　　　５９Ｂ）ＣＹ２
２２のセファローズ 分画で得たオリゴ糖 ｄｐ： Ｂ’）　　　　　ｄｐ： Ｃ）　ＣＹ２１６．　ＣＹ２１６　Ｄおよび誘導体−Ｃ
Ｙ２１６　　（ナトリウム塩＞　　　　　　　　　　９
０　　　　　　　　　５５−ＣＹ２１６　Ｄ　（ｙトラ
フチルアンモニウム塩）７８　　　１００　　　　５２
−ＣＹＤ２１Ｇ　　（Ｑ−アセチル化）　　　　　　　
　９８　　　　　　　　　４９ａとＣは天然生成物の硫
酸化率を有する物質またはその断片での測定、ｂとｄは
硫酸化プロフィルが修正された物質での測定に対応する
。

【図面の簡単な説明】

第１図は供試化合物の濃度に対するエラスターゼ活性を
示すグラフ、第２図はヘパリン（ａ）。 ＣＹ２１６　　（ｂ）、　ＣＹ２２２　　（ｃ）、画分
ｄｐ１２　（ｄ　）および両分ｄｐ＞　１２　（ｅ　）
で得られたエラスターゼおよびカテブシンＧに対する阻
害活性を示すヒストグラム、第３図は本発明の薬剤の血
清１ラスターゼ活性に対する影響を示す図、第４図は本
発明の薬剤の血清のエラスターゼ阻害能に対する影響を
示す図である。 代理人弁理士　中、　　村　　　　至 寥２上グ之へ　　　　血う青梅プロｆ了−ビっ阻害４ｔ
　：　ＣＹａ＋ｂδ♂ジ゛２２２辱）１；Ｊり烙理ｉｋ
１邊ＰＪ’ｌ　、　＋　２Ｊｊｌ没、×３通災７＝４４
侵

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）結合組織の病理に対して有効な薬剤としてのグリ
   コサミノグリカン（ＧＡＧ）及び／又はＧＡＧ断片の必
   要な場合には薬理学的に許容される塩の形態での使用。
2. （２）使用ＧＡＧがヘパリン又はヘパラン硫酸中にみら
   れる繰返し基本単位Ｄ−グルコサミン−ウロン酸（Ｌ−
   イズロン酸又はＤ−グルクロン酸）をベースとすること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の使用。
3. （３）ＣＡＧがヘパリン又はヘパラン硫酸であることを
   特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の使用。
4. （４）ＧＡＧがヘパリン又はヘパラン硫酸より小さい分
   子量特に約１０，０００ドルトン未満の分子量（ＰＭ）
   をもつことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
   使用。
5. （５）ＧＡＧが −ヘパリンのアルコール抽出によって生成され、分子量
   約２０００〜８０００の鎖の混合物から形成され、Ｙｉ
   ｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価／ＵＳＰ価の比が２以上特にＹＷ
   ／ＵＳＰ比が３〜５のオーダであり平均分子量約３００
   ０〜５５００のＣＹ２１６と指称されるムコ多糖、 −亜硝酸によるヘパリンの調整解重合によって生成され
   、前記の一般的特徴を有しており、２，５−無水マンノ
   構造の残基で終結するムコ多糖、特に２，５−無水マン
   ニトール末端をもつＣＹ２２２と指称されるムコ多糖又
   は２，５−無水マンノン酸末端をもつムコ多糖であって
   、大部分が２０００〜３０００のオーダ特に約２０００
   〜２６００のＰＭをもちＹｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価が２
   ００ｕ／ｍｇ以上でＹｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価／ＵＳＰ
   価の比が特に１０以上であるムコ多糖、 −主として、（１）平均分子量３０００〜６０００ドル
   トン特に約４０００〜５０００で、（２）ＹＷ／ＵＳＰ
   価が１０未満特に約６〜３で、（３）２，５−無水マン
   ノ構造の基本単位で終結する鎖から形成されるムコ多糖
   、 −８個以上の糖基本単位から形成され、２０００ｕ／ｍ
   ｇに達し得る高いＹｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ価と実質的に
   ０の低いＵＳＰ価とをもち、ＡＴ−IIIに対する高いア
   フィニティをもつオリゴ糖であり、亜硝酸による調整解
   重合によって生成され、２，５−無水マンノ構造の残基
   で終結し、ヘパリナーゼによるヘパリンの調整解重合に
   よって生成され、不飽和ウロン基本単位に対応する鎖初
   端基本単位を含み、特に次式で示されるＡＢＣＤＥＦＧ
   Ｈ構造の８糖、 ▲数式、化学式、表等があります▼ −前記８糖をヘパリナーゼによる調整作用により処理し
   て得られた６糖の均質組成物特に次式で示される組成物
   、 ▲数式、化学式、表等があります▼ −特にアルコール抽出によって得られる例えばＣＹ２１
   ６、又はヘパリンの亜硝酸解重合によって得られる例え
   ばＣＹ２２２の如き抗トロンビン活性をもつムコ多糖を
   Ｓｅｐｈａｄｅｘの如き材料でろ過して得られた、又は
   イオン強度勾配によるクロマトグラフィーによって得ら
   れた均一重合度のオリゴ糖又は多糖−ヘパリンに過ヨウ
   素酸塩を作用させ次に塩基性媒体中で処理して得られた
   ＧＡＧ、 −動物器官の処理によって得られたＧＡＧ組成物の如き
   所謂完全ＧＡＧ、 −ヘパリナーゼ又は亜硝酸によるヘパリンの解重合とＡ
   ＴIIIへの固定配列をもつ画分の分離とこれら画分のゲ
   ルろ過とにより得られた種々の重合度をもつＧＡＧ断片
   、例えば重合度が１２より大きい断片及び１２未満の断
   片特に１２、１０、８、６、又は４の断片から成るＧＡ
   Ｇ断片、 から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第４項
   に記載の使用。
6. （６）使用ＧＡＧが例えばデルマタン硫酸、コンドロイ
   チン、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸中にみられ
   るＤ−ガラクトサミン−ウロン酸の繰返し基本単位をベ
   ースとし、特に上記の化合物自体で構成されることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の使用。
7. （７）使用ＧＡＧが重合度に関して均質であり特に偶数
   の重合度をもつ鎖から形成されることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の使用。
8. （８）使用ＧＡＧが修正された硫酸化プロフィルを有し
   ており、このＧＡＧが例えば前記に定義した物質のうち
   の基−ＯＨの一部又は大部分また時には全部が硫酸エス
   テル基ＳＯ＿３＾−で置換された物質の１つから成るこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項から第７項のいず
   れかに記載の使用。
9. （９）ＧＡＧの硫酸化度が２〜４の範囲であることを特
   徴とする特許請求の範囲第８項に記載の使用。
10. （１０）ＧＡＧが経口投与、注射、直腸投与に適した形
    態又は軟膏、エアゾール又はリポソームの形態の薬剤組
    成物であることを特徴とする特許請求の範囲第１項から
    第９項のいずれかに記載の使用。
11. （１１）注射液が、皮下注射で投与される溶液のときは
    １〜２００ｍｇ／ｍｌ好ましくは２０〜１５０ｍｇ／ｍ
    ｌのＧＡＧを含んでおり静脈注射又は灌流によって投与
    される溶液は３０〜１００ｍｇ／ｍｌ特に４０〜５０ｍ
    ｇ／ｍｌのＧＡＧを含むことを特徴とする特許請求の範
    囲第１０項に記載の使用。