JPH0940699A - ポリペプチド及びその用途 - Google Patents
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ペプチドホルモンの 1 種であるグルカゴン
と同様の生理活性作用 を有するポリペプチド及びその
用途を提供する。 【解決手段】 アミノ酸配列が His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Try Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu X Asn Thr Hse (X : Met 以外のアミノ酸残基、Hse : ホモセリン又は
ホモセリン・ラクトン残基)のポリペプチドである。 【効果】 このポリペプチドは、グルカゴンと比較する
場合に、生理活性がin vitro 試験において同等であり
且つ in vivo 試験において優っており、容易に且つ大
量に生産することが可能であり、廉価に提供することが
できる。
と同様の生理活性作用 を有するポリペプチド及びその
用途を提供する。 【解決手段】 アミノ酸配列が His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Try Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu X Asn Thr Hse (X : Met 以外のアミノ酸残基、Hse : ホモセリン又は
ホモセリン・ラクトン残基)のポリペプチドである。 【効果】 このポリペプチドは、グルカゴンと比較する
場合に、生理活性がin vitro 試験において同等であり
且つ in vivo 試験において優っており、容易に且つ大
量に生産することが可能であり、廉価に提供することが
できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なポリペプチド
及びその用途に係る。このポリペプチドはグルカゴンと
同様の生理活性を有しており、従って、医薬品成分とし
て、殊に低血糖の治療、消化管エックス線検査又は消化
管内視鏡検査の前処置として、更には内分泌機能の検査
剤及び診断剤の有効成分として用いることができる。
及びその用途に係る。このポリペプチドはグルカゴンと
同様の生理活性を有しており、従って、医薬品成分とし
て、殊に低血糖の治療、消化管エックス線検査又は消化
管内視鏡検査の前処置として、更には内分泌機能の検査
剤及び診断剤の有効成分として用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】グルカゴン (Glucagon) は、Staub 等に
より 1953 年に市販の無結晶ブタインシュリンから分離
・精製され、結晶化されたペプチドホルモンであり、19
57 年に Bromer 等によってブタグルカゴンのアミノ酸
の一次構造が下記の通りであることが明らかとなり (配
列番号 : 2)、その後ヒト及びウシにおいてもアミノ酸
構造が同一であることが判明した物質である。 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 グルカゴンの生理作用としては、アドレナリン様のグリ
コーゲン分解及び糖新生の促進、グリコーゲン合成の抑
制、遊離脂肪酸とグリセロールへの中性脂肪の分解、電
解質の排泄促進、消化管運動と胃酸分泌の抑制、ガスト
リンの分泌抑制、成長ホルモンの分泌促進、カテコール
アミンの分泌促進等が知られている。
より 1953 年に市販の無結晶ブタインシュリンから分離
・精製され、結晶化されたペプチドホルモンであり、19
57 年に Bromer 等によってブタグルカゴンのアミノ酸
の一次構造が下記の通りであることが明らかとなり (配
列番号 : 2)、その後ヒト及びウシにおいてもアミノ酸
構造が同一であることが判明した物質である。 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 グルカゴンの生理作用としては、アドレナリン様のグリ
コーゲン分解及び糖新生の促進、グリコーゲン合成の抑
制、遊離脂肪酸とグリセロールへの中性脂肪の分解、電
解質の排泄促進、消化管運動と胃酸分泌の抑制、ガスト
リンの分泌抑制、成長ホルモンの分泌促進、カテコール
アミンの分泌促進等が知られている。
【０００３】このように種々多様な生理作用を有するた
めに、グルカゴンはグリコーゲン分解及び糖新生の促進
作用を利用して低血糖の治療に、消化管運動と胃酸分泌
の抑制作用を利用して消化管運動抑制剤として、又内分
泌系に与える種々の作用を利用して内分泌機能検査剤及
び診断剤の有効成分として利用されている。
めに、グルカゴンはグリコーゲン分解及び糖新生の促進
作用を利用して低血糖の治療に、消化管運動と胃酸分泌
の抑制作用を利用して消化管運動抑制剤として、又内分
泌系に与える種々の作用を利用して内分泌機能検査剤及
び診断剤の有効成分として利用されている。
【０００４】グルカゴンのアミノ酸配列における 27 位
はメチオニン (Met) 残基であるが、これをロイシン (L
eu) 又はノルロイシン (Nle) 残基に変換したアミノ酸
構造を有するポリペプチドがグルカゴンと同様な生理活
性を示すことも知られている。
はメチオニン (Met) 残基であるが、これをロイシン (L
eu) 又はノルロイシン (Nle) 残基に変換したアミノ酸
構造を有するポリペプチドがグルカゴンと同様な生理活
性を示すことも知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題及び発明の目的】慣用技
術によれば、グルカゴンを得るには合成法又は生物試料
からの抽出に頼らざるを得ず、従って当該物質を廉価に
且つ大量に調製することは極めて困難であった。
術によれば、グルカゴンを得るには合成法又は生物試料
からの抽出に頼らざるを得ず、従って当該物質を廉価に
且つ大量に調製することは極めて困難であった。
【０００６】本発明は、従来技術における上記の課題を
踏まえてなされたものであり、本発明の主たる目的は、
容易に且つ大量生産が可能であり、従って廉価で提供で
き、しかも天然型グルカゴンと同等又はそれ以上の生理
活性を有するポリペプチドを提供することにある。本発
明の付随的な、但し重要な目的は、上記のグルカゴン様
活性を有するポリペプチドを有効成分とする医薬品、殊
に低血糖治療剤、消化管運動抑制剤、内分泌機能検査剤
及び診断剤を提供することにある。
踏まえてなされたものであり、本発明の主たる目的は、
容易に且つ大量生産が可能であり、従って廉価で提供で
き、しかも天然型グルカゴンと同等又はそれ以上の生理
活性を有するポリペプチドを提供することにある。本発
明の付随的な、但し重要な目的は、上記のグルカゴン様
活性を有するポリペプチドを有効成分とする医薬品、殊
に低血糖治療剤、消化管運動抑制剤、内分泌機能検査剤
及び診断剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意検討を
重ねた結果、グルカゴンと同様のアミノ酸配列を有して
おり、但し 27 位がメチオニン (Met) 以外のアミノ酸
残基であり且つグルカゴンは既述のように 29 個のアミ
ノ酸から構成されているが、30 位にホモセリン又はホ
モセリン・ラクトン残基 (以下、ホモセリン及びホモセ
リン・ラクトン残基の両者を単に「Hse」残基と表示す
る場合がある) を更に有しているポリペプチドが天然型
グルカゴンと同等又はそれ以上の生理活性を有している
ことを見い出し、これによって本発明を基本的には完成
するに至った。
重ねた結果、グルカゴンと同様のアミノ酸配列を有して
おり、但し 27 位がメチオニン (Met) 以外のアミノ酸
残基であり且つグルカゴンは既述のように 29 個のアミ
ノ酸から構成されているが、30 位にホモセリン又はホ
モセリン・ラクトン残基 (以下、ホモセリン及びホモセ
リン・ラクトン残基の両者を単に「Hse」残基と表示す
る場合がある) を更に有しているポリペプチドが天然型
グルカゴンと同等又はそれ以上の生理活性を有している
ことを見い出し、これによって本発明を基本的には完成
するに至った。
【０００８】従って、本発明によるペプチドは、アミノ
酸配列 (配列番号 : 1 に相当) が His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu X Asn Thr Hse 20 25 30 (上記の配列中において X は Met 以外のアミノ酸残基
を意味し、Hse はホモセリン又はホモセリン・ラクトン
残基を意味する)であり且つグルカゴン様活性を有して
いることを特徴としており、このペプチドにより既述の
主目的が達成される。
酸配列 (配列番号 : 1 に相当) が His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu X Asn Thr Hse 20 25 30 (上記の配列中において X は Met 以外のアミノ酸残基
を意味し、Hse はホモセリン又はホモセリン・ラクトン
残基を意味する)であり且つグルカゴン様活性を有して
いることを特徴としており、このペプチドにより既述の
主目的が達成される。
【０００９】本発明による上記のポリペプチドにおい
て、アミノ酸配列の 27 位が Met 以外のアミノ酸残基
と規定されている理由は、醗酵法や化学合成法を用いる
微量生産には 27 位の Met が障害とならないが、下記
の手法による大量生産には不適当だからである (産生し
た融合蛋白乃至封入体をブロムシアンにて処理する場合
に、27 位の Met 部位でも切断が生じ、生理活性を有す
る所望のグルカゴン・アナログが得られない)。本発明
による上記のポリペプチドは、本明細書には具体的に記
載しないが、本出願人会社の研究者が他のペプチドホル
モンであるモチリン・アナログに関して提案し、特公平
7 - 22517 (特開平 3 - 80096) 公報に開示されている
技術と同様に、リーダー・ペプチドに相当する DNA フ
ラグメント (その N 及び C 末端におけるアミノ酸残基
は共に Met 残基) を上記のポリペプチドと同様のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド (但し、C 末端のアミノ
酸残基は Hse ではなく、Met である) の N 末端側に配
し、一方 C 末端側にはスペーサ・ペプチドをコードす
る DNA フラグメントを介して、必要に応じ複数個の上
記のポリペプチドと同様のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド (但し、上記と同様に、その C 末端のアミノ酸
残基は Hse ではなく、Met である) に相当する DNA フ
ラグメントをタンデムに結合し、このようして且つ二本
鎖となした DNA フラグメントをプラスミド等のベクタ
ーに組込み、この遺伝子組換えベクターにて微生物例え
ば大腸菌又は動物細胞例えば CHO 細胞を形質転換さ
せ、この形質転換体を培養することにより融合蛋白乃至
封入体として産生させ、この融合蛋白をブロムシアンに
て処理することによりポリマー・フラグメントをメチオ
ニン (Met) の部位で切断して個々のモノマー・フラグ
メントに分離させる (この際に C 末端の Met 残基が H
se 残基に変化する) 方法により容易に且つ極めて効率
的に生産することが可能であり、従って廉価に提供する
ことができる。本発明による既述の附随的な目的は、上
記のポリペプチドを有効成分とし、これを自体周知の手
法で製剤化することにより達成される。
て、アミノ酸配列の 27 位が Met 以外のアミノ酸残基
と規定されている理由は、醗酵法や化学合成法を用いる
微量生産には 27 位の Met が障害とならないが、下記
の手法による大量生産には不適当だからである (産生し
た融合蛋白乃至封入体をブロムシアンにて処理する場合
に、27 位の Met 部位でも切断が生じ、生理活性を有す
る所望のグルカゴン・アナログが得られない)。本発明
による上記のポリペプチドは、本明細書には具体的に記
載しないが、本出願人会社の研究者が他のペプチドホル
モンであるモチリン・アナログに関して提案し、特公平
7 - 22517 (特開平 3 - 80096) 公報に開示されている
技術と同様に、リーダー・ペプチドに相当する DNA フ
ラグメント (その N 及び C 末端におけるアミノ酸残基
は共に Met 残基) を上記のポリペプチドと同様のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド (但し、C 末端のアミノ
酸残基は Hse ではなく、Met である) の N 末端側に配
し、一方 C 末端側にはスペーサ・ペプチドをコードす
る DNA フラグメントを介して、必要に応じ複数個の上
記のポリペプチドと同様のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド (但し、上記と同様に、その C 末端のアミノ酸
残基は Hse ではなく、Met である) に相当する DNA フ
ラグメントをタンデムに結合し、このようして且つ二本
鎖となした DNA フラグメントをプラスミド等のベクタ
ーに組込み、この遺伝子組換えベクターにて微生物例え
ば大腸菌又は動物細胞例えば CHO 細胞を形質転換さ
せ、この形質転換体を培養することにより融合蛋白乃至
封入体として産生させ、この融合蛋白をブロムシアンに
て処理することによりポリマー・フラグメントをメチオ
ニン (Met) の部位で切断して個々のモノマー・フラグ
メントに分離させる (この際に C 末端の Met 残基が H
se 残基に変化する) 方法により容易に且つ極めて効率
的に生産することが可能であり、従って廉価に提供する
ことができる。本発明による既述の附随的な目的は、上
記のポリペプチドを有効成分とし、これを自体周知の手
法で製剤化することにより達成される。
【００１０】
【発明の実施の形態】次に、製造例及び薬理活性試験例
に関して本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
尚、以下においてはグルカゴンのアミノ酸配列における
27 位のメチオニン(Met) 残基がロイシン (Leu) 残基
に代替されたポリペプチド ([Leu27]-グルカゴン-Hse)
に関して説明するが、醗酵法を用いれば 27 位が Met
又は Leu 以外のアミノ酸残基である他のグルカゴン様
ポリペプチドも同様に製造し得ることに留意されたい。
に関して本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
尚、以下においてはグルカゴンのアミノ酸配列における
27 位のメチオニン(Met) 残基がロイシン (Leu) 残基
に代替されたポリペプチド ([Leu27]-グルカゴン-Hse)
に関して説明するが、醗酵法を用いれば 27 位が Met
又は Leu 以外のアミノ酸残基である他のグルカゴン様
ポリペプチドも同様に製造し得ることに留意されたい。
【００１１】製造例 ([[Leu27]-グルカゴン-Hse) の合
成 パーキン・エルマー社製のペプチド・シンセサイザー
(モデル 431A) を用いて C 末端にホモセリン又はホモ
セリン・ラクトンを有するポリペプチド([[Leu27]-グル
カゴン-Hse) の合成を t-Boc 固相合成法及び Fmoc 固
相合成法により下記のように行なった。 (a) t-Boc 固相合成法 アミノ酸はαアミノ基を t-butyloxycarbonyl (t-Boc)
基で保護し、側鎖活性基を適当な保護基で保護したもの
を用いた。市販の樹脂である aminomethylatedpolystyl
ene・HCl 0.5mmol に、C 末端にホモセリンを与える化学
合成した N-Boc-0-benzyl-L-homoseryl-4-(oxymethyl)p
henylacetic asid 2.0mmol をジシクロヘキシルカルボ
ジイミド (DCC)/ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)
で縮合反応を行うことによりペプチド結合を形成させ
た。塩化メチレンにて洗浄した後に、TFA により t-Boc
保護基を除去し、上記の縮合反応操作を繰り返すこと
によりカルボキシ末端から順次アミノ酸を導入すること
により合成していった。このようにして合成したポリペ
プチドについてトリフルオロメタンスルホン酸low-high
法にて脱保護基及び脱樹脂処理を行なった。即ち、合
成した樹脂付きポリペプチド 500mg にエタンジチオー
ル 100μl、m-クレゾール 400μl、硫化ジメチル 1.5m
l、TFA 2.5ml 及び TFMSA 500μl を添加し、0℃ で 3
時間攪拌し反応させた。エチルエーテルで沈澱させ、フ
ィルター濾過した後、残渣にチオアニソール 1.0ml、エ
タンジチオール 500μl、TFA 5.0ml 及び TFMSA 1.0ml
を添加し、0℃ で 1 時間攪拌し反応させることにより
所望のグルカゴン様生理活性を有するポリペプチド (グ
ルカゴン・アナログ, [[Leu27]-グルカゴン-Hse)を得
た。
成 パーキン・エルマー社製のペプチド・シンセサイザー
(モデル 431A) を用いて C 末端にホモセリン又はホモ
セリン・ラクトンを有するポリペプチド([[Leu27]-グル
カゴン-Hse) の合成を t-Boc 固相合成法及び Fmoc 固
相合成法により下記のように行なった。 (a) t-Boc 固相合成法 アミノ酸はαアミノ基を t-butyloxycarbonyl (t-Boc)
基で保護し、側鎖活性基を適当な保護基で保護したもの
を用いた。市販の樹脂である aminomethylatedpolystyl
ene・HCl 0.5mmol に、C 末端にホモセリンを与える化学
合成した N-Boc-0-benzyl-L-homoseryl-4-(oxymethyl)p
henylacetic asid 2.0mmol をジシクロヘキシルカルボ
ジイミド (DCC)/ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)
で縮合反応を行うことによりペプチド結合を形成させ
た。塩化メチレンにて洗浄した後に、TFA により t-Boc
保護基を除去し、上記の縮合反応操作を繰り返すこと
によりカルボキシ末端から順次アミノ酸を導入すること
により合成していった。このようにして合成したポリペ
プチドについてトリフルオロメタンスルホン酸low-high
法にて脱保護基及び脱樹脂処理を行なった。即ち、合
成した樹脂付きポリペプチド 500mg にエタンジチオー
ル 100μl、m-クレゾール 400μl、硫化ジメチル 1.5m
l、TFA 2.5ml 及び TFMSA 500μl を添加し、0℃ で 3
時間攪拌し反応させた。エチルエーテルで沈澱させ、フ
ィルター濾過した後、残渣にチオアニソール 1.0ml、エ
タンジチオール 500μl、TFA 5.0ml 及び TFMSA 1.0ml
を添加し、0℃ で 1 時間攪拌し反応させることにより
所望のグルカゴン様生理活性を有するポリペプチド (グ
ルカゴン・アナログ, [[Leu27]-グルカゴン-Hse)を得
た。
【００１２】(b) Fmoc 固相合成法 アミノ酸はαアミノ基を 9-fluorenylmethyloxycarbony
l (Fmoc) 基で保護し、側鎖活性基を適当な保護基で保
護したものを用いた。市販の樹脂である 4-hydroxymeth
ylphenoxymethyl-copolystyrene-1% divinylbenzene 樹
脂 0.25mmolに、活性化剤としてジシクロヘキシルカル
ボジイミド(DCC)／ジメチルアミノピリジン(DMAP) を用
いて C 末端にホモセリンを与える化学合成した N-(9-f
luorenylmethoxycarbonyl)-O-trityl-L-homoserine 1.0
mmol を導入した。その後、ピペリジンにて Fmoc 保護
基を除去し、更にアミノ酸 1.0mmolを [2-(1H-benzotri
azol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluoroph
osphate](HBTU) で縮合反応を行うことによりペプチド
結合を形成させた。N-メチルピロリドン(NMP) にて洗浄
後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシ末端か
ら順次アミノ酸を導入することにより合成していった。
このようにして合成したポリペプチドについて、トリフ
ルオロ酢酸 (TFA) 法にて脱保護基、脱樹脂を行った。
即ち、合成した樹脂付きポリペプチド 500mgにフェノー
ル結晶 0.75g、エタンジチオール 250μl、チオアニソ
ール 500μl、脱イオン水 500μl 及び TFA 5.0ml を添
加し、室温で 3 時間攪拌し反応させた。次にエチルエ
ーテルを添加し、3μm フィルターを用いて濾過した
後、残渣を TFA で溶解しエチルエーテル中に沈澱さ
せ、遠心分離により沈澱を回収した。得られた粗製ポリ
ペプチドを下記に示す条件の逆相 HPLC により精製し
た。 カラム : ウォーターズ社製の μ-bondasphere 5μm C1
8 100A (19 x 150mm) 溶出液 : 0.012N 塩酸中 75% から 40% のアセトニトリ
ルの直線勾配、35 分間 流速 : 7.0 ml/min HPLC によるメインピークを回収して凍結乾燥した。そ
の一部をパーキン・エルマー社製のプロテイン・シーク
ェンサー (モデル 476A) にて調べたところ、正しく化
学合成されていることが確認された。更に、日本電子株
式会社製の質量分析機 (JMS-SX102A/DA7000) にて FAB
質量分析を行ったところ、理論分子量が観測され、構造
的に正しいことが確認された。尚、以上の過程で得られ
たポリペプチドの C 末端は、ホモセリン又はホモセリ
ン・ラクトンとなっていた。
l (Fmoc) 基で保護し、側鎖活性基を適当な保護基で保
護したものを用いた。市販の樹脂である 4-hydroxymeth
ylphenoxymethyl-copolystyrene-1% divinylbenzene 樹
脂 0.25mmolに、活性化剤としてジシクロヘキシルカル
ボジイミド(DCC)／ジメチルアミノピリジン(DMAP) を用
いて C 末端にホモセリンを与える化学合成した N-(9-f
luorenylmethoxycarbonyl)-O-trityl-L-homoserine 1.0
mmol を導入した。その後、ピペリジンにて Fmoc 保護
基を除去し、更にアミノ酸 1.0mmolを [2-(1H-benzotri
azol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluoroph
osphate](HBTU) で縮合反応を行うことによりペプチド
結合を形成させた。N-メチルピロリドン(NMP) にて洗浄
後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシ末端か
ら順次アミノ酸を導入することにより合成していった。
このようにして合成したポリペプチドについて、トリフ
ルオロ酢酸 (TFA) 法にて脱保護基、脱樹脂を行った。
即ち、合成した樹脂付きポリペプチド 500mgにフェノー
ル結晶 0.75g、エタンジチオール 250μl、チオアニソ
ール 500μl、脱イオン水 500μl 及び TFA 5.0ml を添
加し、室温で 3 時間攪拌し反応させた。次にエチルエ
ーテルを添加し、3μm フィルターを用いて濾過した
後、残渣を TFA で溶解しエチルエーテル中に沈澱さ
せ、遠心分離により沈澱を回収した。得られた粗製ポリ
ペプチドを下記に示す条件の逆相 HPLC により精製し
た。 カラム : ウォーターズ社製の μ-bondasphere 5μm C1
8 100A (19 x 150mm) 溶出液 : 0.012N 塩酸中 75% から 40% のアセトニトリ
ルの直線勾配、35 分間 流速 : 7.0 ml/min HPLC によるメインピークを回収して凍結乾燥した。そ
の一部をパーキン・エルマー社製のプロテイン・シーク
ェンサー (モデル 476A) にて調べたところ、正しく化
学合成されていることが確認された。更に、日本電子株
式会社製の質量分析機 (JMS-SX102A/DA7000) にて FAB
質量分析を行ったところ、理論分子量が観測され、構造
的に正しいことが確認された。尚、以上の過程で得られ
たポリペプチドの C 末端は、ホモセリン又はホモセリ
ン・ラクトンとなっていた。
【００１３】生物学的活性試験例 1 (in vitro での血
糖上昇活性の測定) 上記の製造例で得られたポリペプチド (グルカゴン・ア
ナログ) 及びPeninsula Laboratories, Inc. から購入
した合成ヒトグルカゴンを被験物質として、ラットの培
養肝細胞より遊離されるグルコース量を測定し、in vit
ro での血糖上昇活性を評価した。即ち、コラーゲナー
ゼ灌流法によりラットの遊離肝細胞を先ず調製し、プラ
スチックプレート内で 37℃ において 24 時間培養して
初代培養肝細胞とした。この初代培養肝細胞の培地を被
験物質を含有する緩衝液と交換して 37℃ において更に
培養し、培地の交換から 10 分後、20 分後及び 30 分
後にそれぞれ反応を停止させて緩衝液中に放出されたグ
ルコースの量をグルコースオキシダーゼ法により測定し
た。図 1 には種々に設定されたグルカゴン・アナログ
及び合成グルカゴンの濃度と、培地交換から 20 分間培
養した際に交換培地 (緩衝液) に放出されたグルコース
の量との関係がプロットされており、この図から明らか
なように、本発明によるグルカゴン・アナログは、10
-10 - 10-7M の範囲において合成グルカゴンと実質的に
同等のグルコース放出作用を有することが判明した。
糖上昇活性の測定) 上記の製造例で得られたポリペプチド (グルカゴン・ア
ナログ) 及びPeninsula Laboratories, Inc. から購入
した合成ヒトグルカゴンを被験物質として、ラットの培
養肝細胞より遊離されるグルコース量を測定し、in vit
ro での血糖上昇活性を評価した。即ち、コラーゲナー
ゼ灌流法によりラットの遊離肝細胞を先ず調製し、プラ
スチックプレート内で 37℃ において 24 時間培養して
初代培養肝細胞とした。この初代培養肝細胞の培地を被
験物質を含有する緩衝液と交換して 37℃ において更に
培養し、培地の交換から 10 分後、20 分後及び 30 分
後にそれぞれ反応を停止させて緩衝液中に放出されたグ
ルコースの量をグルコースオキシダーゼ法により測定し
た。図 1 には種々に設定されたグルカゴン・アナログ
及び合成グルカゴンの濃度と、培地交換から 20 分間培
養した際に交換培地 (緩衝液) に放出されたグルコース
の量との関係がプロットされており、この図から明らか
なように、本発明によるグルカゴン・アナログは、10
-10 - 10-7M の範囲において合成グルカゴンと実質的に
同等のグルコース放出作用を有することが判明した。
【００１４】生物学的活性試験例 2 (in vivo での血糖
上昇活性の測定) 既述の製造例で得られたポリペプチド (グルカゴン・ア
ナログ) 及び (株) ペプチド研究所から購入した合成ヒ
トグルカゴンを被験物質として、麻酔下のラットに筋肉
内投与した後に経時的に採血し、血漿中のグルコース濃
度を測定し、invivo での血糖上昇作用を評価した。即
ち、ペントバルビタールナトリウムで麻酔させたラット
を先ず 30 分間静置させて血糖値の安定を待ち、その後
被験物質を 20μg/ml の濃度に生理食塩水にて溶解し、
5μg/kg の割合で筋肉内に投与した。投与後経時的に頸
静脈より 100μl 宛ヘパリン加採血を行った。採血は被
験物質の投与の 10 分前及び 1 分前並びに投与から
5、10、15、20、30、40、50 及び 60 分後に行った。血
糖値として血漿中のグルコース量を和光純薬工業 (株)
より購入した診断用グルコース測定キットを用いて測定
した。被験物質の投与前に行われた 2 回の測定値の平
均値に対する投与後の血糖値の上昇量で示した結果は、
図 2 に示されている通りであり、本発明によるグルカ
ゴン・アナログは、in vivo において、天然型グルカゴ
ンよりも血糖上昇活性が優れていることが判明した。
上昇活性の測定) 既述の製造例で得られたポリペプチド (グルカゴン・ア
ナログ) 及び (株) ペプチド研究所から購入した合成ヒ
トグルカゴンを被験物質として、麻酔下のラットに筋肉
内投与した後に経時的に採血し、血漿中のグルコース濃
度を測定し、invivo での血糖上昇作用を評価した。即
ち、ペントバルビタールナトリウムで麻酔させたラット
を先ず 30 分間静置させて血糖値の安定を待ち、その後
被験物質を 20μg/ml の濃度に生理食塩水にて溶解し、
5μg/kg の割合で筋肉内に投与した。投与後経時的に頸
静脈より 100μl 宛ヘパリン加採血を行った。採血は被
験物質の投与の 10 分前及び 1 分前並びに投与から
5、10、15、20、30、40、50 及び 60 分後に行った。血
糖値として血漿中のグルコース量を和光純薬工業 (株)
より購入した診断用グルコース測定キットを用いて測定
した。被験物質の投与前に行われた 2 回の測定値の平
均値に対する投与後の血糖値の上昇量で示した結果は、
図 2 に示されている通りであり、本発明によるグルカ
ゴン・アナログは、in vivo において、天然型グルカゴ
ンよりも血糖上昇活性が優れていることが判明した。
【００１５】生物学的活性試験例 3 (in vivo での消化
管運動抑制作用の測定) 既述の製造例で得られたポリペプチド (グルカゴン・ア
ナログ) 及び山之内製薬株式会社から購入した「注射用
グルカゴン・ノボ」より抽出した動物膵由来のグルカゴ
ンを被験物質として、麻酔下におけるラットの胃前庭部
の収縮運動をストレイン・ゲージ・フォース・トランス
デューサーを用いて測定し、その収縮に対する抑制作用
を評価した。即ち、エチルエーテル吸入により麻酔させ
たラットを正中線に沿って開腹して、先ず胃を露出させ
た。ストレイン・ゲージ・フォース・トランスデューサ
ー(スターメディカル株式会社製のモデル F-061S) を、
前庭部の輪状筋の収縮運動が測定できるように漿膜面に
手術用絹糸を用いて縫着した。閉腹後、ボールマンケー
ジにラットを俯ぶせ状態で固定し、尾静脈に被験物質投
与用の留置針を留置した。トランスデューサーを臓器運
動解析システム (スターメディカル株式会社製) に接続
してラットの胃運動を測定した。閉腹後にラットの胃運
動が顕著に観察されるようになった時点で生理食塩水 5
ml/kg を静脈内投与し、被験物質無投与の対照とした。
その後 1 時間毎に生理食塩水に溶解した被験物質を 2
0、100又は 500μg/kg の割合でラットに静脈内投与し
た。胃運動は収縮波形で記録されるために、この波形を
積分した数値を運動量とし、投与前 30 分間の運動量を
5 分間当りに換算した値を 100% と設定した場合の投
与後 5 分毎の運動量を投与後 30 分まで算出した。結
果は図 3 に示されている通りであり、この図から明ら
かなように、本発明によるグルカゴン・アナログは消化
管運動抑制作用の強度と持続時間とにおいて、天然型グ
ルカゴンよりも優れていることが判明した。
管運動抑制作用の測定) 既述の製造例で得られたポリペプチド (グルカゴン・ア
ナログ) 及び山之内製薬株式会社から購入した「注射用
グルカゴン・ノボ」より抽出した動物膵由来のグルカゴ
ンを被験物質として、麻酔下におけるラットの胃前庭部
の収縮運動をストレイン・ゲージ・フォース・トランス
デューサーを用いて測定し、その収縮に対する抑制作用
を評価した。即ち、エチルエーテル吸入により麻酔させ
たラットを正中線に沿って開腹して、先ず胃を露出させ
た。ストレイン・ゲージ・フォース・トランスデューサ
ー(スターメディカル株式会社製のモデル F-061S) を、
前庭部の輪状筋の収縮運動が測定できるように漿膜面に
手術用絹糸を用いて縫着した。閉腹後、ボールマンケー
ジにラットを俯ぶせ状態で固定し、尾静脈に被験物質投
与用の留置針を留置した。トランスデューサーを臓器運
動解析システム (スターメディカル株式会社製) に接続
してラットの胃運動を測定した。閉腹後にラットの胃運
動が顕著に観察されるようになった時点で生理食塩水 5
ml/kg を静脈内投与し、被験物質無投与の対照とした。
その後 1 時間毎に生理食塩水に溶解した被験物質を 2
0、100又は 500μg/kg の割合でラットに静脈内投与し
た。胃運動は収縮波形で記録されるために、この波形を
積分した数値を運動量とし、投与前 30 分間の運動量を
5 分間当りに換算した値を 100% と設定した場合の投
与後 5 分毎の運動量を投与後 30 分まで算出した。結
果は図 3 に示されている通りであり、この図から明ら
かなように、本発明によるグルカゴン・アナログは消化
管運動抑制作用の強度と持続時間とにおいて、天然型グ
ルカゴンよりも優れていることが判明した。
【００１６】製剤例 本発明によるグルカゴン・アナログを 1mg 宛含有する
ようにバイアルに無菌的に分配し、凍結乾燥により水分
を除去した後に密封する。この凍結乾燥粉末は、用時に
は注射用蒸留水に溶解される。尚、一般的なペプチド製
剤と同様に、本発明によるグルカゴン・アナログにも安
定化剤としてヒト血清アルブミン等を用いることができ
る。
ようにバイアルに無菌的に分配し、凍結乾燥により水分
を除去した後に密封する。この凍結乾燥粉末は、用時に
は注射用蒸留水に溶解される。尚、一般的なペプチド製
剤と同様に、本発明によるグルカゴン・アナログにも安
定化剤としてヒト血清アルブミン等を用いることができ
る。
【００１７】
【発明の効果】本発明によるポリペプチドは、in vitro
試験でグルカゴンと同等の生理活性を示し、in vivo
試験では、これに優る生理活性を示す。然かも、このポ
リペプチドは、本出願人会社の研究者が開発した方法
[特開平 3 - 80096 (特公平 7 -22517) 公報] を利用す
れば容易に且つ極めて効率的に調製することができ、従
って本発明は医薬品の主成分として有用なグルカゴン・
アナログを廉価に提供するものである。
試験でグルカゴンと同等の生理活性を示し、in vivo
試験では、これに優る生理活性を示す。然かも、このポ
リペプチドは、本出願人会社の研究者が開発した方法
[特開平 3 - 80096 (特公平 7 -22517) 公報] を利用す
れば容易に且つ極めて効率的に調製することができ、従
って本発明は医薬品の主成分として有用なグルカゴン・
アナログを廉価に提供するものである。
配列番号 : 1 配列の長さ : 30 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド 他の情報 : Xaa1 : Met (メチオニン) 以外のアミノ酸残基、 Xaa2 : Hse (ホモセリン又はホモセリン・ラクトン残
基) 配列 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa1 Asn Thr Xaa2 20 25 30 配列番号 : 2 配列の長さ : 29 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド 配列 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25
基) 配列 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa1 Asn Thr Xaa2 20 25 30 配列番号 : 2 配列の長さ : 29 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド 配列 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25
【図１】本発明によるポリペプチドであるグルカゴン・
アナログ及び合成グルカゴンを被験物質として、これら
の物質が示すラット初代培養肝細胞からのグルコース遊
離促進作用をグルコースオキシダーゼ法によって測定し
た結果を示すグラフである。
アナログ及び合成グルカゴンを被験物質として、これら
の物質が示すラット初代培養肝細胞からのグルコース遊
離促進作用をグルコースオキシダーゼ法によって測定し
た結果を示すグラフである。
【図２】本発明によるポリペプチドであるグルカゴン・
アナログ及び合成グルカゴンを被験物質として、これら
の物質を麻酔下のラットに筋肉内投与したときの血糖上
昇作用をグルコースオキシダーゼ法によって測定した結
果を示すグラフである。
アナログ及び合成グルカゴンを被験物質として、これら
の物質を麻酔下のラットに筋肉内投与したときの血糖上
昇作用をグルコースオキシダーゼ法によって測定した結
果を示すグラフである。
【図３】本発明によるポリペプチドであるグルカゴン・
アナログ及び合成グルカゴンを被験物質として、これら
の物質を麻酔下のラットに静脈内投与した場合における
胃前庭部収縮運動の抑制作用を調べた結果を示すグラフ
である。
アナログ及び合成グルカゴンを被験物質として、これら
の物質を麻酔下のラットに静脈内投与した場合における
胃前庭部収縮運動の抑制作用を調べた結果を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 多儀 良彦 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 峰田 浩二 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 前田 達志 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 星野 正治 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 アミノ酸配列 (配列番号 : 1 に相当)
が His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 5 10 15 Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu X Asn Thr Hse 20 25 30 (上記の配列中において X は Met 以外のアミノ酸残基
を意味し、Hse はホモセリン又はホモセリン・ラクトン
残基を意味する)であり且つグルカゴン様活性を有して
いることを特徴とする、ポリペプチド。 - 【請求項２】 請求項 1 に記載のポリペプチドを有効
成分としていることを特徴とする血糖上昇剤、消化管運
動抑制剤、内分泌機能検査剤又は内分泌機能診断剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7192900A JPH0940699A (ja) | 1995-07-28 | 1995-07-28 | ポリペプチド及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7192900A JPH0940699A (ja) | 1995-07-28 | 1995-07-28 | ポリペプチド及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0940699A true JPH0940699A (ja) | 1997-02-10 |
Family
ID=16298853
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7192900A Pending JPH0940699A (ja) | 1995-07-28 | 1995-07-28 | ポリペプチド及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0940699A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005514060A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2011524420A (ja) * | 2008-06-17 | 2011-09-01 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション | 代謝疾患および肥満の治療のためのｇｉｐに基づいた混合アゴニスト |
| JP2022526716A (ja) * | 2019-03-15 | 2022-05-26 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | 耐酸化性を有する修飾グルカゴン分子および製剤、ならびにそれらを使用する方法およびキット |
-
1995
- 1995-07-28 JP JP7192900A patent/JPH0940699A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005514060A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2009213477A (ja) * | 2001-12-21 | 2009-09-24 | Human Genome Sciences Inc | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2013172734A (ja) * | 2001-12-21 | 2013-09-05 | Human Genome Sciences Inc | アルブミン融合タンパク質 |
| JP2011524420A (ja) * | 2008-06-17 | 2011-09-01 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション | 代謝疾患および肥満の治療のためのｇｉｐに基づいた混合アゴニスト |
| JP2022526716A (ja) * | 2019-03-15 | 2022-05-26 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | 耐酸化性を有する修飾グルカゴン分子および製剤、ならびにそれらを使用する方法およびキット |
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