JPH09500022A - 多重病害抵抗性遺伝子含有トランスジェニック植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によれば，複数個の植物防御関連タンパク質からなるトランスジェニック植物であって，それらのタンパク質が，同種の非トランスジェニック植物に比較して植物病原体に対するその植物の抵抗性が増大されるのに十分な量で産生するように発現される植物を提供する．このトランスジェニック植物は発生パターンの研究，食料源としての作物中に増殖した場合の植物病原体に対する抵抗性の増強等に有用である．本発明のトランスジェニック植物を製造する方法に有用な核酸構築体も提供される．

Description

【発明の詳細な説明】 多重病害抵抗性遺伝子含有トランスジェニック植物 本発明は，少なくとも２種の植物防御関連トランスジーンを含有するトランス ジェニック植物に関する． 発明の背景 植物と様々な土壌生命との間の相互作用は極めて複雑であって，それはある場 合には植物に有益であり，他の場合には植物に有害である．植物に有害なカビ類 （植物病原カビ）としては，フザリウム（Fusarium），ピチウム (Pythium)，フ ィトフトラ(Phytophthora)，バーティシリウム（Verticillium），リゾクトニア (Rhizoctonia)，マクロフォーミナ（Macrophomina），シーラビオプシス (Thie laviopsis)，スクレロチニア (Sclerotinia)およびその他の多くを含む広範囲の 属からの菌種を挙げることができる．カビによって引き起こされる植物病には， 出芽前および後種子立ち枯れ，胚軸腐敗病，根腐病，冠腐敗病，導管萎ちょうお よび各種の他の症状が包含される．植物に有害な線虫（植物病原線虫）には，ネ コブセンチュウ (Meloidogyne)，シストセンチュウ（Heterodera），クキセンチ ュウ (Ditylenchus)およびネグサレセンチュウ（Pratylenchus）属からの線虫種 が包含される．線虫によって引き起こされる植物病には根こぶ病，根腐病，病斑 ，「太く短い」根，矮化，ならびに病原カビによる感染の増大に関連する他の様 々な腐敗および萎ちょうがある．一部の線虫［たとえば，ユミハリセンチュウ ( Trichodorus)，ナガハリセンチュウ（Lonoidorus），オオハリセンチュウ (Xiph enema)］は，モモ，ブドウ，タバコおよびトマトを含む多数の植物でウイルスの ベクターとして働くことができる． 多くの植物病原体はわずか１種または限られた数の宿主種に病毒性の表現型を 発現するのみであるように，植物病は規則的というより例外的である．非宿主種 に接種された病原体は増殖能もその植物への感染能も示さず，あるいは侵入後常 に効果的な抵抗機構に遭遇することになる．宿主種との相互作用には，病原体の 機構に依存するある範囲の特異性が認められる．ある種類の病原体は，ネクロト ロフィックで，トキシンおよび／または酵素の産生を介して宿主に傷害を与える 非特異的な「殺滅者」である．この病原体は宿主防御を処理するための不活性化 または回避機構で装備されていることが多い．これに対して，「搾取者」病原体 は，少なくとも初期段階には，バイオトロフィックに増殖し，宿主に重大な傷害 を与えることは避ける．殺滅者とは異なり，搾取病原体は宿主防御を非特異的に 活性化することはない． 回避機構をもたない特定の病原体に対しては，宿主防御はそれが誘導されれば 通常効果的である．病原体によって企てられた感染後の特異的相互作用において は，分子シグナルによりその相互作用が不適合性か適合性かが決定されることに なる．不適合性相互作用（宿主抵抗性，病原無毒性）の場合は，初期の分子認識 に続いて迅速な防御応答の発現が起こる．適合性相互作用（宿主感受性，病原毒 性）の場合は，病原体が植物の監視機構を回避し一般的には疾患が発症する． 有害なカビ類および線虫類を制御するためには様々なアプローチが利用されて きた．一つの方法には，カビ類または線虫類を阻害または妨害する天然に存在す るある種の細菌の応用がある．カビ類と線虫類およびそれらの植物との相互作用 の記述，ならびにカビ類および線虫類の生物学的制御の記述に関しては，たとえ ば K.F.Baker & R.J.Cook，Biological Control of Plant Pathogens，Freeman & Co.(1974) を参照されたい．他の方法としては，植物の全体的抵抗性に量的に はわずかしか寄与しない非主要抵抗性遺伝子の操作に主として焦点をあてた，抵 抗性のための育種がある． 単一遺伝子トランスジェニック植物の形成のために溶菌性酵素が個々に形質導 入されてきた．たとえば，タバコ塩基性液胞キチナーゼ遺伝子をＣＡＭＶ３５Ｓ プロモーターの制御下に極めて類縁の N.sylvestris （タバコ属ナス科）に移入 したところ，トランスジェニック植物では高レベルのキチナーゼ活性が構成的に 現れているのに，C.nicotianae（白絹病病原菌）に対する有効な保護は達成され なかった（Neuhaus ら，Plant Mol.Biol.,16: 141-151，1991 ）．また，米国特 許第 4,940,840号（Suslowら）を参照されたい． 組換えインゲンマメキチナーゼがトランスジェニックタバコ実生に発現された （Broglie ら，Science，254: 1194-1197，1991 ）．キチナーゼ含有トランスジ ェニック植物の実生では，単一種のカビに対する抵抗性は増強されたが，抵抗性 は完全ではなかった．したがって，カビ病原体に対して現存の植物より高レベル の抵抗性を示す植物の獲得が望まれている． 発明の要約 本発明によれば，トランスジェニック植物が提供される．本発明の植物は同種 の非トランスジェニック植物に比べて植物病原体に対する植物抵抗性のレベルが 増大するのに十分な量で発現する複数個の植物防御関連タンパク質からなる． 本発明の植物または植物細胞は，発生の研究に，食物源としての作物内に増殖 した場合の植物病原体に対する抵抗性増大の付与等に有用である．本発明のトラ ンスジェニック植物の製造に有用な核酸構築体が提供される． 図面の簡単な説明 図１は，本発明のトランスジェニックタバコ植物のＦ４世代について例に記載 の Cercospora nicotinae カビ感染アッセイの結果を示す．○＝野生型タバコ植 ジェニックタバコ植物，●＝キチナーゼ／グルカナーゼトランスジェニックタバ コ植物 図２は，本発明のトランスジェニックタバコ植物の異型接合Ｆ３世代について 例に記載の Cercospora nicotinae カビ感染アッセイの結果を示す．○＝野生型 タバコ植物，○＝キチナーゼトランスジェニックタバコ植物，●＝グルカナーゼ トランスジェニックタバコ植物，■＝キチナーゼ／グルカナーゼトランスジェニ ックタバコ植物 図３Ａ（日４データ）および３Ｂ（日５データ）は例に記載の Thanatephorus cucumerisカビ感染アッセイの結果を示す．符号は，上から下に，棒グラフの左 から右へ，各群のバーに相当する．ＷＴ＝野生型タバコ植物，ＧＬＣ／３および ＧＬＣ／１１＝グルカナーゼトランスジェニックタバコ植物，Ｃｈｔ／１７＝キ チナーゼトランスジェニックタバコ植物，Ｘ／７およびＸ／３＝キチナーゼ／グ ルカナーゼトランスジェニックタバコ植物 図４Ａ，４Ｂ，および４Ｃは例に記載の Thanatephorus cucumerisカビ感染ア ッセイの一つの結果を示す．符号は，上から下に，棒グラフの左から右へ各群の バーに相当する．ＷＴ＝野生型タバコ植物，Ｂ２＝グルカナーゼトランスジェニ ックタバコ植物，Ｃ２＝キチナーゼトランスジェニックタバコ植物，Ｃ２Ｂ２＝ キチナーゼ／グルカナーゼトランスジェニックタバコ植物 発明の詳細な説明 本発明によれば，それぞれ植物防御関連タンパク質をコードする複数個のトラ ンスジーンからなるトランスジェニック植物が提供される． 他の実施態様においては，第一の過剰発現植物防御関連タンパク質をコードす る第一のトランスジーン，および第二の過剰発現植物防御関連タンパク質をコー ドする第二のトランスジーンからなり，第二の過剰発現植物防御関連タンパク質 は第一の過剰発現植物防御関連タンパク質とは異なるトランスジェニック植物が 提供される． 「植物」の語は，全植物体，植物器官（たとえば，葉，茎，根等），種子，植 物細胞等を意味する．本発明における使用が意図される植物には，単子葉植物お よび双子葉植物の両者が包含される．本発明の実施においてその使用が意図され る単子葉植物の例には，米，小麦，トウモロコシ，モロコシ，大麦，オート麦， 飼料穀物，ならびに他の穀粒が包含される．双子葉植物の例には，トマト，タバ コ，馬鈴薯，インゲンマメ，大豆等が包含される． 「同種の植物」の語は，本明細書に開示される方法によって導入される遺伝性 核酸トランスジーンに関して以外は実質的に完全に同一な遺伝形質を有する植物 を意味する． 「トランスジェニック植物」は組換えトランスジーンを含む遺伝性発現カセッ トを含有する植物または植物材料を意味する．本発明のトランスジェニック植物 は少なくとも計２種の植物防御関連タンパク質を含有する１種または２種以上の 遺伝性組換え核酸発現カセットを含有する植物または植物材料を意味する．本発 明のトランスジェニック植物は，好ましくは少なくとも３種の植物防御関連タン パク質，さらに好ましくは少なくとも５種の植物防御関連タンパク質を含有し， 少なくとも10種の植物防御関連タンパク質を含有することが最も好ましい． 植物防御関連タンパク質はレシピエント植物に対して異種（レシピエントが属 する種に関して，すなわち，異種／外来性），特定の各レシピエントに対しての み異種（すなわち，外来性），またはレシピエントによってすでに所有される遺 伝情報（すなわち，内因性）である遺伝子によってコードされる． 発現カセットが天然に存在する植物防御関連タンパク質をコードする内因性遺 伝子を含有する場合は，その遺伝子が非発明トランスジェニック植物で天然に起 こる発現レベルに比較して過剰発現可能なように，すなわちその植物が天然の場 合よりも高レベルにそのコードされたタンパク質を産生できるように，このよう な内因性遺伝子のｃＤＮＡはそのネイティブなプロモーターとは異なるプロモー ターに操作性に連結される． この場合に使用される「過剰発現される」植物防御関連タンパク質は，内因性 に産生されるよりも大量に産生されるタンパク質を意味する．過剰発現はたとえ ば，トランスジーンが絶えず発現されるようにトランスジーンを適当な構成プロ モーターに連結することによって達成できる．別法として，トランスジーンは過 剰発現がその要求に応じて起こるように強力な誘導性プロモーターに連結させる こともできる． 過剰発現の適当なレベルには，内因性トランスジーンの天然に起こる発現レベ ルの約1.5倍から約100倍またはそれ以上のトランスジーンの発現が包含される． 過剰発現の好ましいレベルは内因性トランスジーンの天然に起こる発現レベルの 少なくとも約５倍であり，少なくとも約10倍であることがとくに好ましい． 本発明の好ましい実施態様においては，トランスジェニック植物は第一の異種 植物防御関連タンパク質をコードする第一の外来性トランスジーンと第二の異種 植物防御関連タンパク質をコードする第二の外来性トランスジーンからなる． 「異種タンパク質」は，異種タンパク質が形質導入される種とは異なる種（す なわち，本発明のトランスジェニック植物とは異なる種）から得られるトランス ジーンによりコードされる植物防御関連タンパク質を意味する．タンパク質（ま たはポリペプチド）はこの場合，ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ 酸残基の線状配列を意味して使用される語である．異種タンパク質は内因性に産 生される抗微生物防御タンパク質の性質に比較して異なる性質を有する．異種タ ンパク質は好ましくは構成的に発現されるが，そのタンパク質をコードする内因 性遺伝子の天然の発現はストレスに応答して誘導されてもよい． 本発明のトランスジェニック植物における使用が意図される適当な「植物防御 関連タンパク質」は，特定の植物防御機構経路に関わるタンパク質群たとえば溶 菌酵素，タウマチン（thaumatine）様タンパク質，α−チオニン（α-thionin; たとえばBohlmann ら，EMBO J．7: 1559-1565，1988），ジーマチン(zeamatin; たとえば Vigers ら，Mol.Plant Micro.Interactions，4:315-323，1991)，病因 関連（RP）タンパク質 (たとえば Bolら，Ann.Rev.Phytopathol．28: 113-138,1 990)，リボソーム不活性化タンパク質（RIP）（たとえば，Leachら，J.Biol.Che m．266: 1564-1573，1990），レクチン(たとえば Moreno ら，PNAS USA，86;788 5-7889)，セクロピン（cecropin），非植物性リゾチーム，バシラスチュリンジ エンシス (Bacillus thuringensis)毒素，フィトアレキシンの生合成に関与する 酵素，プロティナーゼインヒビター(たとえば Garcia-Olmedoz ら，Surv.Plant Mol.Cell Biol．4: 275-334，1987)，植物病の抵抗性機構のインデューサー等で ある． ここで用いられる「溶菌酵素」とは，既知の病原の生存に必須である分子の結 合（単数または複数）を酵素的に切断できるタンパク質を意味する．溶菌酵素の 例にはキチナーゼ，グルカナーゼ，セルラーゼ，トレハラーゼ等が包含される． また，Boller,T.(1987) "Hydrolytic enzymes in plant disease resistance." in T.Kosuge & E.W.Nester編，Plant-Microbe Interactions．２巻，Macmillan, New York，385-413 頁を参照されたい．この記載はそのすべてを引用により本明 細書に導入する． この場合に用いられる「キチナーゼ」とは，キチンを分解できる酵素を意味す る．一実施態様においては，キチナーゼタンパク質を構成的に発現するキチナー ゼ構築体が使用される．この場合使用されるキチナーゼ遺伝子としては，コメ塩 基性キチナーゼが好ましい．コメキチナーゼをコードする配列の例を配列番号： １として掲げる． この場合に使用できる他の適当なキチナーゼ遺伝子は，たとえば，米国特許第 4,940,840号（Suslow）に記載されている．この記載はそのすべてを引用により 本明細書に導入する．Collingeら，Plant Journal 3: 31-40(1993)の表１におけ る，発表されたキチナーゼヌクレオチド配列の一覧表も参照されたい．この記載 は引用により本明細書に導入する．さらに，適当なキチナーゼ遺伝子は，本技術 分野においてよく知られた方法を用いて得ることができる．たとえば配列番号： １の核酸分子は，キチナーゼタンパク質を産生することが知られている生物体， たとえば Trichoderma harzianum 株Ｐ１(ATCCNo.74058;米国特許第5,173,419 号も参照）のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからキチナーゼ活性に関連する 遺伝子を単離するプローブとして用いることができる．Sambrookら，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)参照． 他の実施態様においては，エンド-1,4- β- グルカナーゼタンパク質を構成的 に発現するグルカナーゼ構築体が使用される．「グルカナーゼ」の語はカロース を分解できる酵素を意味する．この場合に使用される遺伝子としては，クラスII アルファルファ酸性β- グルカナーゼが好ましい．クラスIIアルファルファβ- グルカナーゼをコードする配列の例を配列番号：３に掲げる． この場合の使用に適当なその他のグルカナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）は，トマト （ATCC No.68312; 米国特許第 5,168,064号も参照．この記載は引用により本明 細書に導入する），アボカド（Christoffersenら，Plant Molec.Biol．3: 385， 1984）およびインゲンマメ（Tuckerら，Plant Physiol．88: 1257，1988 ）から 誘導される．さらに Payneら，Plant Mol.Biol．15: 797-808 (1990); Wardら， Plant Physiol．96: 360-397（1991）に記載のタバコグルカナーゼの配列，およ び Linthorstら，PNAS，USA 87: 8756-8760 (1990)に記載のグルカナーゼの配列 も参照されたい．適当なグルカナーゼ遺伝子は，本技術分野においてよく知られ た方法を用いて得ることもできる．たとえば，配列番号： 3の核酸分子は，グル カナーゼ活性に関連する遺伝子を単離するプローブとして用いることができる（ Sambrookら，前出参照）． 本発明の現時点で好ましい実施態様においては，トランスジェニック植物に用 いられる第一および第二のタンパク質はそれぞれ，キチナーゼおよびグルカナー ゼである． 本明細書に記載の植物防御関連タンパク質は組換えトランスジーン分子によっ てコードされる．この場合に用いられる「トランスジーン」の語は，ＤＮＡまた はＲＮＡ分子を意味する．この場合に使用されるトランスジーンは生物学的に活 性なアミノ酸配列（すなわち，タンパク質）をコードする．「複数個のトランス ジーン」の語は，植物防御関連タンパク質をコードする計２種または２種以上の トランスジーンを意味する．本発明のトランスジェニック植物は，好ましくは， 植物防御関連タンパク質をコードする少なくとも３種の異なる植物防御関連タン パク質をコードするトランスジーン，さらに好ましくは少なくとも５種のトラン スジーンを含有し，少なくとも10種のトランスジーンを含有することがとくに好 ましい．この場合に用いられるトランスジーンが生物学的に活性なタンパク質の 発現に要する必要なシグナル，たとえば適当なリーダーペプチド配列等をコード することは，本技術分野の熟練者には明白であろう．生物学的に活性なタンパク 質は天然に起こる生理学的条件下に少なくとも１種の生理学的性質を表すタンパ ク質である． 植物防御関連タンパク質をコードするトランスジーンは通常，発現カセット中 に含まれている．「発現カセット」の語は，所望のタンパク質が合成されるよう に構造遺伝子（すなわち，ｃＤＮＡ）の転写および翻訳を指示できるＤＮＡ分子 を意味する．発現カセットは，所望のタンパク質をコードする少なくとも１種の トランスジーンに操作性に連結した少なくとも１種のプロモーター，および転写 終結配列から構成される．すなわち，タンパク質をコードするセグメントは，プ ロモーター領域の調節下に，翻訳されると所望のタンパク質を与えることができ る転写体に転写される．発現カセットの各種セグメントの適当なリーディングフ レーム配置および方向づけは，本技術分野の通常の熟練者の知識の範囲内である が，さらに詳細は実施例に示す． プロモーター領域とは，それと操作性に連結したＤＮＡの転写を制御する遺伝 子部分を意味する．プロモーター領域には，ＲＮＡポリメラーゼの認識，結合お よび転写開始に十分なＤＮＡの特異的配列が包含される．選択される特定のプロ モーターは，微生物感染に対する植物の抵抗性に有効な量の植物防御関連タンパ ク質の産生を生じるのに十分な発現を起こすことができなければならない．抵抗 性の誘導に必要なタンパク質の量は植物の種類によって変動する．好ましい実施 態様においては，トランスジーンの発現に用いられるプロモーターは，構成プロ モーターである．このプロモーターが本発明のすべての実施態様に対して至適な プロモーターであるとは限らないことを理解すべきである． 「構成」プロモーターは，すべての環境条件およびすべての発生または細胞分 化段階において活性なプロモーターである．本発明の実施に際しての使用に適当 な構成プロモーターは，広範囲に入手が可能であって，本技術分野においてよく 知られている．構成プロモーターの例には，カリフラワーモザイクウイルス35Ｓ （ＣａＭＶ35Ｓ）プロモーター（米国特許第 5,097,925号参照，この記載は引用 により本明細書に導入する），ＣａＭＶ19Ｓプロモーター，ノパリンシンターゼ （ＮＯＳ），オクチピンシンターゼ（ＯＣＳ），コメのアクチン遺伝子プロモー ター等がある．さらに，米国特許第 5,139,954号に記載の小麦からのＤＮＡプロ モーターフラグメントおよび米国特許第 5,097,025号に記載の植物プロモーター も本発明における使用に適している．本発明の実施における使用が現時点で好ま しいプロモーターはＣａＭＶ35Ｓである． 本発明のＤＮＡ構築体に用いられるプロモーターには，所望により，それらの 制御特性に影響する修飾を行うことが可能である．この記述の意図は「ＣａＭＶ 35Ｓ」プロモーターの語には，したがって，ＣａＭＶ35Ｓプロモーターの変型， たとえばオペレーター領域とのライゲーション，ランダムなもしくは制御された 突然変異誘発，ならびに35Ｓエンハンサー要素の単一，縦列もしくは多重コピー によって誘導されたプロモーター等が包含されるとの趣旨によるものである． 本発明の他の実施態様においては，上述の発現カセットからなる核酸構築体が 提供される．ここで用いられる「核酸構築体」またはその省略型「構築体」の語 は，本明細書および請求の範囲を通して，発現カセット，ＤＮＡ複製の起源，各 種起源からの原核および真核遺伝子（たとえば，選択可能なマーカー遺伝子）， レプレッサー遺伝子，ならびに他の任意のヌクレオチド配列を包含できる組換え 核酸分子を意味する．構築体は線状でもまたプラスミドベクターの環状型であっ てもよい． 本発明の核酸構築体は，発現カセットのセグメントも含めて，上述のトランス ジーンが本技術分野の熟練者にはよく知られた適当な条件下に翻訳的に発現され てコードタンパク質を産生できるように互いに「操作性に結合」される． 本明細書において用いられる「プラスミド」または「ベクター」の語は，環状 の二本鎖ＤＮＡループを意味し，これらは染色体に結合しない．本技術分野の熟 練者には明らかなように，プラスミドとベクターの語は交換可能に使用できる． プラスミドはそれに含まれるＤＮＡの発現を誘導できるＤＮＡを含有し，この場 合，このような配列はそれらの発現を行わせることができる他の配列，たとえば プロモーター等と操作性に結合している．用いられるベクターの種類および数に は，２種または２種以上のトランスジーンが，遺伝的にたとえば植物の各世代に よって発現可能である限り，とくに制限はない．本明細書に記載の植物防御関連 トランスジーンの発現における使用に適当なベクターとしては，ｐＡＭＶＢＴＳ （ATCC No．53637; Bartonら，Plant Physiol．85: 1103-1109，1987），ｐＢＩ 101 （Jefferson ら，EMBO J．6: 3902-3907，1987），ならびに，ｐＧＥＭおよ びｐＳＰベクター（Promega，Madison，WI）がある．本発明のトランスジェニッ ク植物の産生に現時点で好ましいベクターは，以下の実施例の項に記載するプラ スミドｐＢＺ56，ｐＭ42Ｘ，およびｐＢＺ100がある． 本発明のさらに他の態様においては，上述のＤＮＡ構築体でトランスフォーム された植物細胞が提供される． 本発明のトランスジェニック植物と他の植物の間の抵抗性の比較に関連して用 いられる場合の「抵抗性」の語は，本発明のトランスジェニック植物が，非トラ ンスジェニック植物または単一遺伝子トランスジェニック植物との比較で，攻撃 に直面して所望の表現型を維持する能力を意味する．抵抗性のレベルは，微生物 感染に暴露されたまたはされていない本発明の植物の生理学的特性を，非トラン スジェニック植物の場合と比較することによって決定される．観察される生理学 的特性の例には植物高，微生物の攻撃に対して生残する能力をもつ植物集団（す なわち適合生病原体と接触する植物）の増加，傷害発症の遅延，病変サイズの減 少等が包含される． この場合に用いられる「病原体に対する増強された抵抗性」とは，病原体に対 して本発明のトランスジェニック細胞が有する特定の標準レベル以上の抵抗性の レベルを意味する．病原体に対する抵抗性の特定の標準レベルとは，同種の非ト ランスジェニックまたは非発明トランスジェニック植物が示す抵抗性のレベルで ある．したがって，増強された抵抗性は同種の以前から存在する植物と比較して 測定される．本発明の一実施態様においては，抵抗性は実質的に特定の標準レベ ル以上に，たとえば20％もしくはそれ以上，好ましくは50％もしくはそれ以上， さらに好ましくは75％もしくはそれ以上に増強される．100％まで増強されるこ とがとくに好ましい． 「同種の非トランスジェニック植物」の語は異種のトランスジーンを含まない 同種の植物を意味する．病原体抵抗性のそれぞれのレベルは，以下の実施例の項 に記載するカビ感染アッセイを含めよく知られた方法を用いて測定できる． 「１つの外来性トランスジーンのみを発現する同種トランスジェニック植物」 の語は１種のトランスジーンを含有するのみの同種のトランスジェニック植物を 意味する．これらの単一遺伝子トランスジェニック植物は，本発明のトランスジ ェニック植物に用いられる複数個の植物防御関連トランスジーンの任意の１つの トランスジーンを含むことができる．単一の異種トランスジーンを含有するトラ ンスジェニック植物の例には，米国特許第 5,188,642号に記載のグリホゼート抵 抗性植物ならびに Broglieら，Science 254: 1194-1197（1991）および Carmora ら，Plant J．3: 457-462(1992)に記載の植物が包含される． 本発明の一実施態様においては，本発明の構築体によって付与される抵抗性の レベルは「相乗的」である．相乗的抵抗性とは，単一トランスジェニック植物に おける少なくとも２つの植物防御関連タンパク質によって与えられる抵抗性のレ ベルが，少なくとも２つの単一遺伝子トランスジェニック植物に別個に含有され た各タンパク質で観察される抵抗性の和よりも大であることを意味する． 本発明において用いられる構築体を適当な宿主細胞に導入する方法，ならびに 異種タンパク質をコードする遺伝子を含有する上記細胞の培養に適用可能な方法 は，本技術分野においてはよく知られている．本発明においては，ベクターは， 任意の適当な方法たとえば，プラスミド，ウイルスまたは細菌ファージベクター を用いるトランスフォーメーション，トランスフェクション，エレクトロポレー ション，リポフエクション等によって宿主細胞中に導入される．異種ＤＮＡには 所望により，発現カセットの染色体外維持を可能にする配列を包含させることも できるし，また上記発現カセットを宿主のゲノム中にインテグレートさせること （宿主内における安定な維持を保証する別法として）も可能である．たとえば， 米国特許第 5,169,770号に記載の発芽植物種子のアグロバクテリウム誘導トラン スフォーメーション，米国特許第 5,163,601号に記載の植物のポチウイルス発現 ベクター，米国特許第 5,168,064号を参照されたい．これらはそれぞれ，引用に より本明細書にとくに導入される． さらに，カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）が植物細胞に核酸構築体 を導入するためのベクターとして使用できる［Hohnら，"Molecular Biology of Plant Tumors，"Academic Press，New York，549-560頁 (1982); Howell,米国特 許第 4,407,956号］．記載された方法によれば，全ＣａＭＶウイルスＤＮＡゲノ ムを母体細菌プラスミドに挿入して，細菌内で増殖できる組換えＤＮＡ分子が創 成される．冷却後，組換えプラスミドは，そのプラスミドのウイルス部分におけ る唯一の制限部位に所望の配列を導入することによってさらに修飾される．組換 えプラスミドの修飾されたウイルス部分をついで母体細菌プラスミドから切り出 し，植物細胞または植物の接種に使用する． ＤＮＡを植物細胞中に導入する他の適当な方法では，予めその遺伝子でトラン スフォームされた Agrobakuterium tumefaciens または A.rhizogenes で植物細 胞を感染させる．本技術分野で既知の適当な条件下において，トランスフォーム された植物細胞は成育して苗条または根を形成し，さらに植物に成長する．アグ ロバクテリウムはグラム陰性菌リゾビウム科（Rhizobiaceae）の代表的な属であ る．その種は，根頭癌腫病 (A.tumefaciens)および毛根病（A.rhizogenes）の病 原菌である．根頭癌腫病および毛根病の植物細胞ではオパインとして知られるア ミノ酸誘導体の産生が誘導され，これは細菌によってのみ異化される．オパイン の発現に関与する細菌の遺伝子は，キメラ発現カセットのための制御エレメント の便利な起源である．しかも，オパインの存在のアッセイはトランスフォームさ れた組織の確認に使用できる． 異種遺伝子配列は適当な植物細胞中にたとえば，A.tumefaciens の Ti プラス ミドまたは A.rhizogenes の Ri プラスミドを用いて導入することができる．Ti または Ri プラスミドはアグロバクテリウムによる感染によって植物細胞に伝達 され，植物ゲノム中に安定にインテグレートされる［J.Schell，Science，237: 1176-1183 (1987)］． Tiおよび Ri プラスミドはトランスフォームされた細胞の産生に必須な２つの 領域を含有する．転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれるこれらの一つは植物の核 に運搬されて腫瘍または根の形成を誘導する．ビルレンス（vir ）領域と呼ばれ る他方はＴ−ＤＮＡの転移に必須ではあるが，それ自体は転移されない．Ｔ−Ｄ ＮＡは，vir 領域が別のプラスミド上にあった場合でも，植物細胞中に転移され る［Hoekema ら，Nature，303: 179-189（1983）］．転移ＤＮＡ領域は，その転 移される能力に影響することなく，異種ＤＮＡの導入によってそのサイズを増大 させることができる．病原遺伝子が除去されている修飾 Ti または Ri プラスミ ドは本発明の遺伝子構築体を適当な植物細胞に運搬するためのベクターとして使 用することができる． Tiおよび Ri プラスミドの構築は，一般には，もっと普遍的なベクター，たと えばｐＢＲ322 を用いて行われるのが通常である．さらに，場合によりネイティ ブなプラスミド中に存在するまた場合により異種配列から構築される補助遺伝子 エレメントが使用される．これらには，それらに限定されるものではないが，「 シャトルベクター」［Ruvkan & Ausubel，Nature，298: 85-98（1981）］，プロ モーター［Lawtonら，Plant Mol.Biol.，9: 315-324 (1987)］および選択因子と しての抗生物質抵抗性のための構造遺伝子［Fraleyら，Proc.Nat.Acad.Sci.，80 : 4803-4807 (1983)］を包含させることができる． 植物細胞をアグロバクテリウムでトランスフォームするには２つの通常の方法 がある．すなわち， （１）アグロバクテリウムの，培養単離プロトプラストとの共培養（これには プロトプラストの培養とそれに続く培養プロトプラストからの植物の再生を可能 にする確立された培養系が要求される），または （２）無傷の細胞または組織のアグロバクテリウムによるトランスフォーメー ション（これには無傷の細胞または組織たとえば子葉がアグロバクテリウムによ ってトランスフォームできることおよびトランスフォームされた細胞または組織 の全植物への再生を誘導できることが要求される）である． 大部分の双子葉植物はアグロバクテリウムによってトランスフォームできる． アグロバクテリウムの天然の植物宿主である種はすべてインビトロでのトランス フォーメーションが可能である．単子葉植物とくに穀類はアグロバクテリウムに 対して天然の植物宿主ではない．これらをアグロバクテリウムによってトランス フォームする試みは最近まで成功していなかった［Hooykas-Van Slogteren ら， Nature，311: 763-764（1984）］．現在，ある種の穀類がアグロバクテリウムに よってトランスフォームできる証拠が集積されつつある．実際，たとえばライ麦 ［de laPena ら，Nature，325: 274-275（1987）］，トウモロコシ［Rhodesら， Science，240: 204-207 (1988)］,コメ ［Shimamoto ら，Nature，338: 274-276 （1989）］が現在ではトランスフォームされている． 本発明の一実施態様においては，キチナーゼおよびグルカナーゼをコードする トランスジーンを含有する２つの発現カセットが上述のようにして調製される． 発現カセットを単一の発現ベクター中に結合させて，植物防御関連タンパク質を コードする２つの個々の遺伝子からなるＤＮＡ構築体を形成させる．ベクターを ついで，非武装 Ti プラスミドを含有する培養 A.tumefaciens中に挿入する．本 発明の他の実施態様においては，それぞれ１つの発現カセットを含有する２つの ベクターが使用される．２つのベクターは単一の植物中または別個の植物中にト ランスフォームされる． それぞれ少なくとも１種のトランスジーンを有する発現カセットを含む２種の 別個のトランスジェニック植物は，よく知られた方法を用いて有性交雑させて， 本発明のトランスジェニック植物を産生させることができる．交雑する２つの種 に応じて，多くの標準的育種技術の任意の方法が使用できる． アグロバクテリウムの Ti または毛根病誘発（Ri）プラスミドから誘導される 植物トランスフォーメーションベクターに加えて，本発明のＤＮＡ構築体の植物 細胞への挿入には別の方法を使用することができる．このような方法には，たと えばリポソーム，エレクトロポレーション，遊離ＤＮＡの取り込みを増大させる 化学物質の使用ならびにウイルスを用いるトランスフォーメーションが包含され る．たとえば，上述の構築体は，組換えＤＮＡを機械的に移入するためのマイク ロピペットを使用し，植物細胞中に直接微量注入することができる［Crossway， Mol.Gen.Genetics，202: 179-185（1985）］．遺伝子材料はまたポリエチレング リコールを用いて植物細胞中に移送することもできる［Krens ら，Nature，296: 72-74（1982）］． トランスジーンセグメントの他の導入方法には，小ビーズもしくは粒子の内部 またはその表面に核酸を含む微小粒子による高速弾丸透過法がある［Klein ら， Nature，327: 70-73（1987）参照］．さらに他の導入方法としては，プロトプラ ストの，他の実体たとえばミニセル，細胞，リソソームもしくは他の融合可能な 脂質表面処理体との融合がある［たとえば，Fraleyら，Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 79: 1859-1863(1982)参照］． ＤＮＡはまた，エレクトロポレーションによっても植物細胞中に導入すること ができる［Fromm ら，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82: 5824 (1985)］．この方法で は，植物プロトプラストは発現カセット含有プラスミドの存在下にエレクトロポ レートされる．高電界強度の電気インパルスにより，生体膜は可逆的に透過性に 変化し，プラスミドの導入が可能になる．エレクトロポレーションに付した植物 プロトプラストは，細胞壁が修復され，分割され，再生される． トランスフォーメーション後，本発明の核酸構築体からなるトランスフォーム された植物細胞または植物は，既知のよく知られた方法を用いて同定することが できる．たとえば，上述したような選択マーカーが通常使用される．トランスフ ォームされた植物細胞は，その細胞を適当な抗生物質を含む成育培地上で成育さ せることによって選択できる．植物がアグロバクテリウムでトランスフォームさ れた場合には，オパインの存在を利用することもできる． トランスフォームされた細胞を選択したのち，所望の異種遺伝子の発現を確認 することができる．挿入ＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡの単純な検出は， 本技術分野においてよく知られた方法，たとえばノーザンブロットハイブリダイ ゼーションによって実施できる．挿入された配列はサザンブロットハイブリダイ ゼーションによっても同様に同定できる． 所望のトランスジーンの存在が確認されたならば，全植物の再生が望まれる． プロトプラストが単離され，培養によって全植物の再生が可能なすべての植物が 本発明によってトランスフォームできる．適当な植物の一部には，たとえば，以 下の属，フラガリア(Fragaria)，ロタス(Lotus),メジカゴ(Medicago)，オノブリ キス(Onobrychis)，トリフォリウム(Trifolium),トリゴネラ(Trigonella)，ビー ナ(Vigna),シトルス(Citrus)，リーナム(Linum),ゼラニウム(Gerenium)，ラファ ヌス(Raphanus)，シナピス(Sinapis),アトローパ(Atropa)，カプシカム(Capsicu m),ペチュニア(Petunia)，ジギタリス(Digitalis),マジョラナ(Majorana)，シコ リウム(Cichorium),ヘリアンタス(Helianthus)，ラクツカ(Lactuca),ブロームス (Bromus)，アスパラガス(Asparagus),アンチリナム(Antirrhinum),ヘレロカリス (Hererocallis)，ネメシア(Nemesia),ペラルゴニウム (Pelargonium)，ペニカム (Penicum),ペニセタム(Pennisetum)，ラヌヌクルス(Ranunculus)，セネシオ(Sen ecio),サルピグロシス(Salpiglossis)，キューカミス(Cucumis),ブロワアリア(B rowaalia),グリシン(Glycine),ロリウム(Lolium)，ゼア(Zea),トリチカム(Triti chum),ソルガム(Sorghum),マルス(Malus),アピウム(Apium),ダツラ(Datura)等か らの種を挙げることができる． 培養プロトプラストからの植物の再生は，Evans ら，Handbook of Plant Cell Cultures,第１巻（MacMillan Publishing Co．New York，1983 ）およびVasil, I.R.ら（編），Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Academic Press，Orlando，第Ｉ巻，1984および第III巻，1986に記載されている． それらに限定されるものではないが，すべてのサトウキビ，サトウ大根，綿， 果樹，および野菜を含む実際上すべての植物が，培養細胞または組織から再生可 能である． 再生の方法は種によって変動するが，一般的には，トランスフォームされたプ ロトプラストの懸濁液またはトランスフォームされた外植体を含有するペトリプ レートをまず準備する．カルス組織を形成させ，カルスから苗条，ついで根が誘 導できる．別法として，よく知られた植物ホルモンを用いて，カルス組織中に胚 形成を誘導することもできる．これらの胚は自然の胚として発芽し，植物を形成 する．培養培地には一般に様々なアミノ酸およびホルモンたとえばオートキシン およびサイトカイニンを含有させる．また，培地にグルタミン酸およびプロリン を添加することは，とくにトウモロコシやアルファルファのような種の場合に有 利である．効率的な再生は，培地，ゲノタイプおよび培養歴に依存する．これら の３つの変動因子が制御されれば，再生は通常，再現性および反復性を示す． 本発明の方法によれば少なくとも，複数個の植物防御関連タンパク質，酵母， 昆虫または哺乳動物からの複製の起源，ならびに上述の植物防御関連タンパク質 の発現に対する選択マーカー遺伝子を含有するトランスジェニック植物が生成さ れる． 次に本発明を，以下の非限定的実施例を参照して，さらに詳細に説明する． 実施例 以下に使用する命名法および以下に記述する組換えＤＮＡ技術における実験操 作は本技術分野においてよく知られていて共通に使用されるものである．クロー ニング，ＤＮＡおよびＲＮＡの単離，増幅ならびに精製には標準的技術を使用し た．ＤＮＡリガーゼ，ＤＮＡポリメラーゼ，制限エンドヌクレアーゼ等の関与す る酵素反応は製造業者の説明書に従って実施する．これらの技術および他の様々 な技術は一般的に，Sambrookら，Molecular Cloning -- A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor，N.Y.(1989) に従って行う．この手引書は”Sambrook”と して以下に引用する．他の一般的な引用は本明細書を通じて提供される．そこに 示された操作は本技術分野でよく知られたものであるが，読者に便利なように記 述する．それらに示された情報はすべて引用により本明細書に導入される． ベクターの製造 プラスミドｐＢＺ56の構築 プラスミドｐＲＨ10（Zhu ら，Plant J．3: 203-212，1993 に記載）から，コ メキチナーゼＲＣＨ10遺伝子（配列番号：１）の SphI フラグメントをｐＳＰ72 （Promega，Madison，WI）にサブクローニンク化てｐＢＺ５Ｂを得た．ＲＨ10の Sac2/Kpnl フラグメントをｐＳＰ72にサブクローニングして，ｐＢＺ52を得た． ｐＢＺ52の Ncol/EcoRV フラグメントを，ｐＢＺ５Ｂの Ncol/PvuII 部位に挿入 してｐＢＺ54を得た．ｐＢＺ54の EcoRV/BgIIIフラグメントを，ｐＧＥＭ721 の BamHI/EcoRV部位に挿入してｐＢＺ55を得た［ｐＧＥＭ721 はＣａＭＶ35Ｓプロ モーター含有のｐＧＥＭ７（Promega，Madison，WI）プラスミドである］．ｐＢ Ｚ55の Hpal/SaclフラグメントをｐＢＩ101.1 （Jefferson ら，EMBO J．6: 390 2-3907，1987）に挿入してｐＢＺ56を得た． ｐＭ42Ｘの構築 アルファルファ懸濁細胞からカビ細胞壁プレパレーションによる誘導２，３お よび４時間後に単離したポリ（Ａ）ＲＮＡから調製した（Dalkinら，Physiol.Mo l.Plant.Path．37: 293-307，1990 ）λＺＡＰII (Stratagene，La Jolla，CA) のｃＤＮＡライブラリーを，プローブとしてインゲンマメグルカナーゼｃＤＮＡ を用いてスクリーニングした（Edingtonら，Plant Mol.Biol．16:81-94，1991） ．ついでプラスミドを，pBluescript sk- 中に，ヘルパーファージＲ408 （Stra ta gene ）を用いてレスキューし，挿入体サイズおよび変化を制限地図の作成に よって決定した．インゲンマメグルカナーゼプローブにハイブリダイズした最大 の挿入体をｐＧＥＭ32ｆ（ ＋）（Promega）にサブクローニングすると，酸性ア ルファルファβ-1,3- グルカナーゼ（配列番号：３）のアイソフォームの全コー ド領域を含有するプラスミド「ｐＡｇｌｕ１」が得られた． アルファルファβ- グルカナーゼ遺伝子を含有するｐＡｇｌｕｌのBamHI/XhoI フラグメントをｐＭＯＮ530 （Monsanto，St.Louis，MO）の BgIII/XhoI 部位に 挿入しｐＭ４を得た．ｐＭ４フラグメントの PvuII/SacI フラグメントをｐＢＩ 121(Jefferson ら，EMBO J．6: 3902-3907，1987）の Smal/Sacl部位に挿入して ｐＭ42Ｘを得た． ｐＢＺ100 の構築 上述のプラスミドｐＢＺ55を EcoRV/Sall で消化し，ＤＮＡポリメラーゼクレ ノウフラグメントで充填し，再びライゲートしてｐＢＺ55Ｍを得た．ｐＢＺ55Ｍ の Hpal/XhoIフラグメントをｐＧＥＭ７（Promega ）に挿入してｐＢＺ55Ｍ-7を 得た．ｐＢＺ55Ｍ-7の SacI フラグメントをｐＭ42Ｘに挿入してｐＢＺ100 を得 た． タバコのトランスフォーメーション プラスミドｐＢＺ56およびｐＭ42Ｘで，Agrobacterium tumefaciens LBA4404 を直接トランスフォームし，コメキチナーゼまたはアルファルファグルカナーゼ トランスジーンのいずれかを含む独立のトランスジェニックタバコ植物を，リー フディスク法（たとえば，Rogersら，Meth．in Enzymol．118: 627-640，1986参 照）によって発生させた．トランスフォームされた植物を， 200μg/mlのカナマ イシンならびに 500μg/mlのカルベニシリンを含有する Murashige-Skoog培地 (Murashige & Skoog，Physiol.Plant，15: 673，1962)上で選択して，25℃で， 16時間明（116 mE）／8 時間暗サイクル下に数週間成育させた．トランスジェニ ック植物からの実生をついで土壌に移した． 約24のｐＢＺ56および20のｐＭ42Ｘトランスジェニック植物がサザンブロット ハイブリダイゼーションによってトランスフォーマントとして確認された．コメ キチナーゼまたはアルファルファグルカナーゼトランスジーンの発現は，慣用の ノーザンブロットおよびウエスタンブロット分析によって調べた．上記トランス ジーンのいずれか一方を高レベルで発現する数個のＦ２世代のトランスジェニッ ク系を，本発明のトランスジェニック植物の製造のための交雑用に選択した． 多重植物防御関連遺伝子を含有するトランスジェニックタバコ植物の製造 ｐＢＺ56およびｐＭ42ＸトランスフォーマントのＦ２高レベル発現同型トラン スジェニック系を，ルーチンの方法を用いて互いに交配させた．同型のＦ３世代 （すなわち交配された植物）が両トランスジーンを含むことの確認には，ポリメ ラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）分析を使用した．確認後，Ｆ３の種子を収穫し， Ｆ４世代の植物を産生させた．キチナーゼおよびグルカナーゼ両トランスジーン について同型のＦ４世代植物を選択して，それらのゲノタイプを戻し交配および ＰＣＲ分析によって確認した．Ｆ４植物をカビ感染アッセイに使用した． 多重植物防御関連遺伝子を含有するトランスジェニックコメ植物の製造 プラスミドｐＢＺ100 およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有するプラス ミドを，市販の小弾丸マイクロプロジェクタイル装置を使用してコメ胚に導入し た．プラスミドを打ち込まれた胚をハイグロマイシンを含むＮ６培地上で成育さ せた（Chu ら，Scientia Sinica 18: 659-668，1975）．再生されたハイグロマ イシン抵抗性植物について，遺伝性ｐＢＺ100 ＤＮＡの存在を，ＰＣＲおよびサ ザンブロット分析によって分析した．結果は，コメトランスフォーマントのゲノ ムＤＮＡが両トランスジーンの遺伝可能なコピーを含むことを指示している． タバコトランスジェニック植物の Cercospora nicotinae カビ感染に対する抵 抗性のアッセイ 上述のＦ３およびＦ４世代の本発明のトランスジェニックタバコ植物を以下の カビ感染アッセイに付した．結果はそれぞれ図３および４に示す． Cercospora nicotinae（American Type Culture Collectionから ATCC 18366 号および 18367号として入手可能）を滅菌 ddH₂O中に菌糸フラグメントを懸濁し て培養した．タバコ葉懸濁液は 200 ml のＶ８液，3.0 ｇ のＣａＣＯ₃，800 ml の水，ｐＨ 6.15，18 gのアガール，１ ｇの乾燥タバコ葉（大きな葉数枚をマイ クロ波中で約10分間乾燥または「解凍」し，乳鉢と乳棒で粉砕する）を含むよう に調製し，20〜25分間オートクレーブ処理した．タバコ葉懸濁液約 0.5〜1.0 ml をペトリプレート上に広げた．プレートの内容物を25℃で，連続明期として４〜 ６週間，白色を帯びた菌糸でプレートが一様に覆われるまでインキュベートした ． 本発明のタバコトランスジェニック植物のＦ３およびＦ４世代（それぞれ，約 100 ）ならびに適当な対照を約５〜６週齢まで成育させた．菌糸を滅菌したメス で均等に小正方形（約2mm²）に切断した．菌糸のアガール板を，3/4 〃防水外科 用テープ（Blenderm，3M）を用いてタバコの葉（最も新しい葉ではなく，頂部か ら２番目または３番目の葉）の下側，葉脈の間に接着させた．植物は20℃で，明 期16時間として４〜10日間インキュベートした． カビの感染による症状はほぼ24〜96時間後に目に見えるようになる．最初に小 さな針で刺したような孔だけが見えるようになり，接種された部分の葉の組織に は，多分，褐色への変色を伴っている．これは灰色の乾燥病変に進行し，直径も 増大する．カビ感染の相対的レベルを以下の評点システムを用いて評価した． ０−症状なし，わずかな褐色への変色を伴うことあり． １−「針孔」，連続的な，測定可能な病変はない． ＞１−（病変部の測定による．一つの測定値として最も幅の広い部分の幅と他 の測定値としてそれと垂直な幅を測定し，これらを乗じておおよその病変面積を mm²で求める）． 図１にはＦ４世代の本発明のトランスジェニックタバコ植物についてのカビ感 染アッセイの結果を示す．結果は，本発明のトランスジェニック植物の病変のサ イズはいずれの時点においても，対照，たとえば野生型タバコ植物ならびにキチ ナーゼまたはβ- グルカナーゼ遺伝子のいずれか一方のみを含有する単一遺伝子 トランスジェニックタバコ植物で認められる病変サイズより小さかったことを示 している．すなわち，本発明のトランスジェニック植物は，カビ病原体によって 引き起こされる病変に対して，いずれの対照タバコ植物よりも，高レベルの抵抗 性を有する． 図２には，同型Ｆ３世代の本発明トランスジェニックタバコ植物についてのカ ビ感染アッセイの結果を示す．結果は，本発明のトランスジェニックタバコ植物 の感染頻度が，対照，たとえば野生型タバコ植物ならびにキチナーゼまたはβ- グルカナーゼ遺伝子のいずれか一方のみを含有する単一遺伝子トランスジェニッ クタバコ植物で認められる感染頻度より本質的に低かったことを示している．す なわち，本発明のトランスジェニック植物は，カビ病原体によって引き起こされ るカビ感染に対して，各対照タバコ植物よりも高レベルの抵抗性を有する． タバコトランスジェニック植物の Thanatephorus cucumerise カビ感染に対す る抵抗性のアッセイ 不完全期においては，吻合グループ３からの T.cucumerise （たとえば ATCC No．62149 株）は病原体 Rhizoctonia solani に類似した茎の病変「腰折病」を 引き起こす．しかしながら，完全期には菌の担胞子が形成される．発芽した担胞 子は付着器を形成してタバコの葉に直接侵入し，病変（「輪紋病」）の形成を招 く．完全期の発生に好ましい因子は16〜28℃の範囲の温度と葉の湿りである． T.cucumeriseは，オートクレーブ処理したコメ培地（250 mlのフラスコ中，50 ｇのアンクルベンの変換ライス，25 ml の２回蒸留水；ホイルで覆って25分間オ ートクレーブ処理；Shew & Main，Plant Disease，74: 1009-1013，1990 参照） を，ＰＤＡ（馬鈴薯デキストロースアガール）プレートからの菌糸の板を接種す ることにより培養した．プレートは，連続明期として22〜25℃で２〜４週間イン キュベートした（ライスはミイラ状に見える．白色，粉末に覆われる）． 本発明のタバコトランスジェニック植物，および適当な対照に接種するために は，接種材料は，極めてわずかにコメの粒子が残るまでブレンダー中で粉砕した （約３×45秒，周囲を中央に掻き落として）．接種材料は，レベル０から開始し て乾燥鉢植えミックス中に，土壌１liter あたりライス混合物 0，1，2および５ g/ｌの割合で混合して，9-ウエルの鉢型に分配した．４〜５週齢のタバコ実生18 本を，高接種レベルから低接種レベルへの持ち込みを避けて注意深く（孔を掘っ て茎の周囲の土壌を押さえるために，各レベル毎に別個の使い捨て綿こての木製 端を用いるのが好ましい）ウエルに移植した．ついで鉢のセットをプラスチック 製の覆い付きの平坦なカバー内に置き，20℃で，明期16時間として４〜７日間イ ンキュベートした．覆いを外し，必要に応じて水を散布して湿潤状態に維持した ． カビの感染による症状は最高接種の場合約３〜４日後に明らかになる．土壌に 接触した葉は灰色になってしおれ，上方の葉はしおれ，茎は土壌線で褐色に変化 して収斂する．図３ＡおよびＢに示す結果は，カビ感染の相対的レベルを以下の 評点システムを用いて評価した． ０−症状なし． １−葉の病変またはしおれが認められるが，植物は生存． ２−茎の重篤な収斂は植物の死が近いことを示し，植物は倒れ，しおれる． 日４および５におけるアッセイの結果をそれぞれ図３Ａおよび３Ｂに示す．図 ３Ａ（日４）は，X/3 と命名された本発明のトランスジェニック植物は，上述の カビとライスの混合物５ｇ/lを含む鉢植え用土壌中で成育させた場合，野生型タ バコ植物ならびにキチナーゼまたはβ- グルカナーゼ遺伝子のいずれか一方のみ を含有する単一遺伝子トランスジェニックタバコ植物を含む対照タバコ植物より も病原体に対して高レベルの抵抗性を有することを示している． 図３Ｂ（日５）は，X/７およびX/３の両本発明のトランスジェニックタバコ植 物が，ライス混合物 2ｇおよび 5ｇ/lを含む鉢植え用土壌中で成育させた場合， 野生型タバコ植物ならびにキチナーゼまたはβ- グルカナーゼ遺伝子のいずれか 一方のみを含有する単一遺伝子トランスジェニックタバコ植物を含む対照タバコ 植物よりも病原体に対して高レベルの抵抗性を有することを示している． キチナーゼおよびβ- グルカナーゼ遺伝子の両者について同型であったＦ５ト ランスジェニックタバコ植物を用いて，同様のアッセイを実施した．このアッセ イでは，ライス混合物４ｇ，15ｇおよび45ｇ/lを使用し，植物は健康または病気 のいずれかとして評価した．結果は，図４Ａ（４ｇ），４Ｂ（15ｇ）および４Ｃ （45ｇ）に示す．結果は，２種の植物防御関連タンパク質を含有する本発明のト ランスジェニック植物では，非トランスジェニック植物および上記植物防御関連 タンパク質の一方のみを発現する同種のトランスジェニック植物に比較して，カ ビ病原体に対する抵抗性が明らかに増大していることを指示している． 以上，本発明をその好ましい実施態様を参照しながら詳細に説明したが，その 修飾および改変は，記述され請求される本発明の精神および範囲内に包含される ものであることを理解すべきである．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ズ，クン アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州サン ディエゴ，ナンバー 21，デコロ ストリート 4158 (72)発明者 マハー，エイリーン エイ. アメリカ合衆国 53704 ウィスコンシン 州マディソン，ミラー アベニュー 502 (72)発明者 ディクソン，リチャード エイ. アメリカ合衆国 73401 オクラホマ州ア ードモアー，サウス ロックフォード ロ ード 920

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．各トランスジーンは植物防御関連タンパク質をコードする複数個のトラン スジーンを含有するトランスジェニック植物． ２．植物防御関連タンパク質は生物学的に活性なタンパク質として発現される 「請求項１」に記載の植物． ３．各トランスジーンは植物防御関連タンパク質が構成的に発現されるように プロモーター配列と操作性に連結されている「請求項１」に記載の植物． ４．少なくとも１種のトランスジーンはその植物に対して外来性である「請求 項１」に記載の植物． ５．少なくとも１種の植物防御関連タンパク質は溶菌酵素である「請求項１」 に記載の植物． ６．植物防御関連タンパク質の両者が溶菌酵素である「請求項１」に記載の植 物． ７．溶菌酵素はキチナーゼである「請求項５」に記載の植物． ８．キチナーゼはコメキチナーゼである「請求項７」に記載の植物． ９．溶菌酵素の一つはグルカナーゼである「請求項６」に記載の植物． 10．グルカナーゼはアルファルファグルカナーゼである「請求項９」に記載の 植物． 11．同種の非トランスジェニック植物に比較してカビ病原体に対する抵抗性が 増大している「請求項１」に記載の植物． 12．１種のトランスジーンのみを発現する同種のトランスジェニック植物に比 較してカビ病原体に対する抵抗性が増大している「請求項１」に記載の植物． 13．抵抗性の増大は相乗性である「請求項12」に記載の植物． 14．植物は単子葉植物である「請求項１」に記載の植物． 15．植物は大麦，小麦，トウモロコシ，オート麦，コメ，モロコシから選択さ れる「請求項14」に記載の単子葉植物． 16．植物はコメ植物である「請求項15」に記載の単子葉植物． 17．植物は双子葉植物である「請求項１」に記載の植物． 18．植物はトマト，タバコ，馬鈴薯，インゲンマメ，および大豆から選択され る「請求項17」に記載の双子葉植物． 19．植物はタバコ植物である「請求項18」に記載の双子葉植物． 20．トランスジェニック植物において，過剰発現する生物学的に活性なコメキ チナーゼタンパク質をコードする第一の外来性トランスジーン，および過剰発現 する生物学的に活性なアルファルファグルカナーゼタンパク質をコードする第二 の外来性トランスジーンを含み，上記トランスジーンは構成的に発現され，上記 植物は上記トランスジーンの両者を構成的に発現しない植物と比較してカビ病原 体に対する抵抗性が増大しているトランスジェニック植物． 21．植物はタバコ植物である「請求項20」に記載の植物． 22．第一の植物防御関連タンパク質をコードする第一のトランスジーン，およ び第二の植物防御関連タンパク質をコードする第二のトランスジーンを含み，上 記トランスジーンはそれぞれプロモーターと操作性に連結している核酸構築体． 23．プロモーターは構成プロモーターである「請求項22」に記載の構築体． 24．第一の植物防御関連タンパクはキチナーゼタンパク質である「請求項22」 に記載の構築体． 25．キチナーゼタンパク質はコメキチナーゼである「請求項24」に記載の構築 体． 26．第二の植物防御関連タンパク質はグルカナーゼタンパク質である「請求項 22」に記載の構築体． 27．グルカナーゼタンパク質は，アルファルファグルカナーゼである「請求項 26」に記載の構築体． 28．構築体はそれを含有するトランスジェニック植物に，上記構築体を含まな い同種の非トランスジェニック植物に比較してカビ病原体に対する高い抵抗性を 付与する「請求項22」に記載の構築体． 29．「請求項22」に記載の構築体からなるベクター． 30．「請求項29」に記載のベクターを含有する植物細胞． 31．植物の疾病抵抗性を増大させる方法において，「請求項22」に記載の核酸 構築体を上記植物のゲノムに導入することからなる方法． 32．第一の異種植物防御関連トランスジーンを含有するトランスジェニック植 物の疾病抵抗性を増大させる方法において，第二の植物防御関連タンパク質をコ ードする第二のトランスジーンを上記植物のゲノム中に導入し，この場合第二の トランスジーンは上記第一の異種植物防御関連トランスジーンとは異なる方法．