JPH09500110A

JPH09500110A - ＧｎＲＨの拮抗ペプチドの調製に有用な、グアニジノ又は修飾されたグアニジノ基を有するフェニルアラニン誘導体又は同族体の調製法

Info

Publication number: JPH09500110A
Application number: JP7502914A
Authority: JP
Inventors: カールエイホエガー; ジーンイーエフリヴィア; ジョンエスポーター
Original assignee: ザソルクインスティテュートフォアバイオロジカルスタディース
Priority date: 1993-06-17
Filing date: 1994-06-13
Publication date: 1997-01-07
Also published as: NZ267921A; KR100308361B1; IL110032A; US5565574A; WO1995000474A1; ZA944345B; AU682702B2; IL110032A0; US5710249A; DE69416676D1; EP0703900A1; EP0703900B1; KR960703110A; AU7061194A; CA2165469A1; US5352796A; DE69416676T2; PH31215A; ATE176904T1

Abstract

(57)【要約】下垂体による性腺剌激ホルモンの分泌を阻害又は促進する、もしくは性腺によるステロイド類の分泌を阻害するようなペプチド類に組み込むことができる非天然アミノ酸の合成法であって、本方法は、式(i) を有するα−アミノ酸（式中、ｊは１、２又は３）を、α−アミノ酸１mol につきHNO₃が少なくとも約２mol であるような、該アミノ酸、濃硫酸及び濃硝酸を含有する反応混合物を形成することによって、ニトロ化条件に晒し、かつこの反応混合物を、温度約５℃以下に保ち、主として第４位に前述のニトロ化を生じる工程；前記4NO₂- 置換生成物を、適当な試薬と反応し、アミノ保護基を該α−アミノ酸に付加する工程；前記保護されたアミノ酸を、該置換されたニトロ基に水素添加し、かつこれをアミノ基に転化するように処理する工程；前記水素添加されたアミノ酸を、適当な溶媒の中に溶解し、かつこれをジフェニルシアノカルボンイミデートと反応し、求核性残基と反応性であるシアノグアニジノ中間体を形成し、式(a) 及び式(b) を有する所望の非天然アミノ酸を合成する工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 GnRHの拮抗ペプチドの調製に有用な、グアニジノ又は修飾されたグアニジノ基を有するフェニルアラニン誘導体又は同族体の調製法本発明は、NH₂Pheのようなジアミノ酸由来であって、生物活性ペプチド類の合成において有用であるような、新規の非天然アミノ酸の調製に関する。更に詳細に述べると、これは、このような非天然アミノ酸を含有するペプチド類の調製に関し、これらのペプチドは、前記保護された非天然アミノ酸の生成、及びその後の標準的鎖延長合成法の一部としてのこのようなペプチドへの組込みによって調製される。これらの非天然アミノ酸は、性腺機能、並びにステロイドホルモン類であるプロゲステロン及びテストステロンの放出を阻害する、GnRHアンタゴニスト、かつ更にこのようなステロイド類の放出を促進するGnRHアゴニストペプチドの形成に有用である。発明の背景下垂体は、視床下部として公知である脳基底部へ、軸索でつながっている。特に、ゴナドトロピン又は性腺刺激ホルモンと呼ばれることもある、ろ胞刺激ホルモン(FSH) 及び黄体形成ホルモン(LH)が、下垂体によって放出される。これらのホルモンは、組み合わされて、性腺の機能を調整し、精巣でテストステロンを、並びに卵巣でプロゲステロン及びエストロゲンを生合成し、更にそれらは配偶子の産生及び成熟も調整する。下垂体前葉によるホルモン放出には、通常視床下部によって産生された別の種類のホルモン類の前放出が必要である。視床下部のホルモンの１種は、性腺刺激ホルモン、特にLHを放出する引き金となる因子として作用し、このホルモンは、 LH-RH 及びLRF とも呼ばれているが、本願明細書中ではGnRHと称す。GnRHは、およそ20年前に、単離され、かつデカペプチドとして特徴づけられ、かつ第６位の Gly の代わりに、D-異性体を有するGnRH類似体、例えば下記式を有する[D-Ala⁶] -GnRH（米国特許第4,072,668号）が： pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ in vitro及びin vivoの両方において、天然のホルモンよりも、レセプターへの結合強度が強く、かつ生物的効力が高いことが発見された。ペプチド類は、一方のアミノ酸のカルボキシル基が、他方のアミノ酸のアミノ基に結合しているような、２個以上のアミノ酸を含有する化合物である。前述の GnRHの式は、アミノ末端が左側で、カルボキシル末端が右側であるような、ペプチドの一般的表現に従っている。アミノ酸残基の位置は、左から右へのアミノ酸残基の数字付けによって識別される。GnRHの場合は、C-末端のグリシンのカルボキシル基のヒドロキシ部が、アミノ基(NH₂) で置換されている、すなわちC-末端がアミド化されている。前述の個々のアミノ酸残基の略号は、一般的なものであり、かつアミノ酸の慣用名を基にしたもので、例えばpGluはピログルタミン酸、 Glu はグルタミン酸、His はヒスチジン、Trp はトリプトファン、Ser はセリン、Tyr はチロシン、Gly はグリシン、Leu はロイシン、Nle はノルロイシン、Or n はオルニチン、Arg はアルギニン、Har はホモアルギニン、Pro はプロリン、 Sar はサルコシン、Phe はフェニルアラニン、Ala はアラニン、Val はバリン、 Nva ノルバリン、Ile はイソロイシン、Thr はトレオニン、Lys はリシン、Asp はアスパラギン酸、Asn はアスパラギン、Gln はグルタミン、及びMet はメチオニンである。グリシン以外の列挙されたアミノ酸類は、特記しない限りは、L-立体配置であると理解される。哺乳類の雌の排卵の停止が必要な理由があり、かつ正常なGnRH機能に対して拮抗作用があるGnRH類似体の投与が、排卵の抑制又は遅延の目的で採用されている。この理由のために、GnRHに対して拮抗的であるGnRH類似体は、それらの避妊薬としての使用の可能性、又は受胎期の調節に関し研究中である。GnRHアンタゴニストは、同じく思春期早発及び子宮内膜症の治療に使用される。このようなアンタゴニストは、哺乳類の雄における性腺刺激ホルモン分泌の調節に有用であることもわかっていて、精子形成の抑制、例えば男性の性犯罪者の治療のため、及び前立腺肥大症の治療のための、男性用避妊薬として、使用することができる。更に詳細に述べると、GnRHアンタゴニストは、ステロイド依存型腫瘍、例えば前立腺及び乳房の腫瘍の治療、並びに体外受精に際し排卵の時期を調節するために使用することができる。女性においては、多毛症、子宮内膜症、月経前症候群(PM S) などの治療にも使用することができる。他方で、GnRHと同じ方法で、LH及びFSH の放出を促進するというGnRHアコニスト機能、並びにより強い生物的効力及び／又はより長い作用の期間を発揮するアゴニスト類は、価値があると考えられる。ペプチド類似体へのそれらの置換の結果、生理活性を増強するような、非天然アミノ酸を合成する方法は、特に興味深い。内因性GnRHに対し強力な拮抗作用をもち、かつLH及びFSH の分泌及び哺乳類の生殖腺によるステロイド類の放出を抑制するか、もしくはGnRHの強力なアゴニストであるかのいずれかであるような、改善されたペプチド類を、鎖延長法によって合成する方法を提供することも、所望である。発明の要約本発明は、非天然アミノ酸を合成する方法、及びこのようなあらかじめ調製された非天然アミノ酸を用いて、ペプチドを調製する方法を提供する。α−アミノ基が保護されたアミノ酸は、以下に述べているような、修飾されたグアニジノ基又はグアニジノ等価体、もしくは修飾されたグアニジノ基の更なる解明(elucida tion) によって得られる誘導体を含み、かつ最も好ましくはトリアゾール又は置換されたトリアゾール基を含むような、側鎖を有するように合成される。これらのアミノ酸は、ヒトを含む哺乳類において、性腺刺激ホルモン類の放出を阻害するペプチド類の調製、並びに同じくGnRHの強力なアゴニストであり、かつ哺乳類の生殖過程を促進するために使用される、改善されたGnRHアナログ類の調製において、有用である。本発明は、下記式U*を有する、保護された非天然アミノ酸：（式中、X¹は、α−アミノ保護基；j は、１、２又は３；R₁は、H，CH₃又はCH₂C H₃；R₂は、アルキル(C₁ からC₆) 、シクロヘキシル、又は-(CH₂) _p-R₃ （式中P は、０〜６の整数、並びにR₃は、メチル、エチル、フェニル、ピリジニル、プリニル、イミダゾイル、インドリル、ナフチル、NHR₄又はOH；並びにR₄は、H 又は CH₃ である。）である。）、もしくはそれらのヘテロ環式転位体を製造する方法を提供する。この方法は、非天然のアミノ酸が生じる、ヘテロ環式転位体のいずれかを含む、下記式の１種を有するという結果をもたらすことが好ましい： (a) （式中、X¹は、α−アミノ保護基；j は、１〜３の整数；R₁は、H，CH₃又はCH₂C H₃；R₂は、アルキル(C₁ からC₅) 、シクロヘキシル、ナフチル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、インドリル、キノリニル又はイミダゾールイルである。）； (b) （式中、X¹は、α−アミノ保護基；j は、１〜３の整数：R₅は、H 、メチル又はエチル；及びR₆は、H 又はアシル(C₁ からC₆)である。）； (c) （式中、X¹は、α−アミノ保護基；j は、１〜３の整数；M₁は、NR₇ 又はNH-(CH₂ ) _p−R₈ （式中P は、０〜３の整数、R₇は、メチル、エチル、プロピル又はフェニル；R₈は、０又はdesR₈ である。）；並びにR₉は、H 又はアルキル（C₁から C₆）である。）；並びに (d) （式中、X¹は、α−アミノ保護基；j は、１〜３の整数；M₁は、NR₇ 又はNH-(CH₂ )_p （式中P は、０〜３の整数、R₇は、メチル、エチル、プロピル又はフェニルである。）である。）。更に好ましくは、この方法は、下記式を有するアミノ酸を合成するために行われる：（式中、X¹及びp は、前に定められたものである。）。このようなアミノ酸は、標準的鎖延長法によって、GnRH類似体及び広範囲の他のペプチド類を合成するためには、L-及びD-異性体の両方が価値がある。最初にアミノ基が修飾されたPhe 又はそれらの同族列の第一級アミノ機能の修飾は、適した試薬で適当に保護されたアミノ酸を処理することによって行われる。これらのアミノ酸類は、概してシアノグアニジンと称され、かつアミノ基のジフェニルシアノカルボンイミデート(I) との反応によって調製され：（式中、“Ｑ”は、式U*の部分として、前述のアミノ酸のような、概して側鎖の第一級アミノ基を有するアミノ酸の主要部分を表わす。）、このアミノ酸は適当に保護されたそのα−アミノ基を有す。次にN-置換-N'-シアノ-O- フェニルイソ尿素残基(II)を有するアミノ酸は、第二求核試薬NXR₂との反応によって、更に官能基化され、下記式(III) を有するシアノグアニジン−含有アミノ酸を生成する：例えば、例えば、HXR=H₂N-CH₂-ピリジンである場合は、その結果：である。この群は、N-g-シアノ-N-g'-3-メチルピリジルグアニジノと称することもできる(IUPAC命名法)。このような化合物は、酸性条件下で加水分解することができ、同じく生物作用のある化合物類の合成に使用されるような、アミノ酸を生じ、例えば：である。環状の残基は、-XR が第二求核性部位を含み、かつX が下記一般式：M₁-(CH₂)_p -M₂（式中、M₁はNR’、及びM₂はNH，０又はNR''であり、ｐは０、１、２又は３である。）である場合に生じる。このような求核試薬の例は、H₂NNH₂、CH₃HNNH₂ 、CH₃HNNHCH₃、H₂NOH、及びH₂N-CH₂-CH₂OH である。この場合、形成されたシアノグアニジン残基は、シアノ基とωアミノ基の反応によって、最初の中間体から形成された、対応するヘテロ環(V) へと転化され、これは：例えば、-XR₂=-HNNH₂ の場合は、更に、-XR=-CH₃NNHCH₃の場合は、その後これらは、前述のように加水分解される。一般にこれらの非天然アミノ酸類は、GnRHのアンタゴニスト又はアゴニストであるような、すなわちヒトを含む哺乳類の下垂体による性腺刺激ホルモンの分泌を強力に阻害するか、もしくはこのような分泌又は放出を強力に促進するかのいずれかであるようなペプチド類の合成に使用される。これらのペプチド類は、第３位、第５位、第６位及び／又は第８位に、式U*の非天然アミノ酸を１個以上含有するGnRH類似体である。U*が第３位及び／又は第６位である場合には、これは常にD-異性体の形状であるのに対し；U*が第５位及び／又は第８位である場合には、これは常にL-異性体の形状である。好ましい実施態様の詳細な説明前述のように、この非天然アミノ酸（L-又はD-異性体であることができる）は、下記式U*で表わされる：（式中、X¹、j 、R₁及びR₂は、前に定義したものである。）。このα−アミノ基は、適当な保護基、例えばBoc によって置換され、C-末端で開始されるペプチド合成のための鎖延長法の一部として直接使用することができるようになる。本発明によって合成されたアミノ酸類を使用して形成された代表例のペプチド類の各々において、少なくとも１種はD-異性体である。更に詳細に述べると、生物的効力があるGnRHアンタゴニスト類は、下記式(F₁) で表わされる： G-AA₁-(A)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-Pro-AA₁₀ （式中、G は、水素又は炭素原子が７個以下のアシル基であり；AA₁ はデヒドロプロリン、D-pGlu、(A)D-Phe、(B)D-Trp、Pro 又はβ-D-NAL；A は、H 、Cl、F 、NO₂ 、CH₃ 、OCH₃ 、C ^aMe/4Cl（ ^aはαを意味する。）、Cl₂ 又はBr；B は、 H 、NO₂ 、NH₂ 、OCH₃、F 、Cl、Br、CH₃ 、N ⁱⁿ For又はN ⁱⁿ Ac ；AA₃ は、U* 、D-PAL、β-D-NAL又は(B)D-Trp ；AA₅ は、U*、Tyr、(C)Arg、Lys(cpd)、Orn(c pd)、Dbu(cpd)、Dpr(cpd)、(A)Phe、(3I)Tyr 又はHis ；AA₆ は、U*、β-D-NAL 、(B)D-Trp、(A')D-Phe 、(D)D-Orn 、(D)D-Lys、(D)D-Dbu、(D)D-Dpr、D-Har 、D-Tyr 、(E)D-His、D-PAL 、(C)D-Arg又は適当な親油性D-異性体；A'は、A 、 NH₂ 、NHCH₃ 又はgua ；C は、H 又は低級アルキル；D は、G 、cpd 又はアリール基；E は、H 、imBzl 又はジニトロフェノール；AA₇ は、Nle 、Leu 、NML 、 (A)Phe、Met 、Nva 、Tyr 、(B)Trp又はPAL ；AA₈ は、U*、(C')Arg 、(C')Har 又はILys；C'は、H 又はジ低級アルキル；AA₁₀は、D-Ala-NH₂ 、Gly-NH₂ 、AzaG ly-NH₂又はNH(R) ；R は、低級アルキル、好ましくはCH₂CH₃ ；並びにU*は、前に定義したものである。）。AA₁ がβ-D-NALであり、かつAA₅ がArg でない場合は、AA₆ は、好ましくはU*、4-NH₂-D-Phe 、D-Lys 、D-Orn 、D-Har 、D-His 、 4-gua-D-Phe 、D-PAL 又はD-Argである。デヒドロプロリンは、3,4-デヒドロプロリン、C₅H₇O₂N の意味である。β-D-N ALは、β−炭素原子がナフチルによって置換された、アラニンのD-異性体の意味であり、すなわち3-D-NALでもある。好ましいβ-D-2NAL は、ナフタレンへの結合が、環構造の第２位であるように用いられる；しかし、β-D-1NAL も、使用することができる。好ましい第１位の残基は、D-Phe で置換された、及び任意にD- Trp で置換された、β-D-NALである。PAL は、β−炭素原子がピリジルで置換されたアラニンを表わし；好ましくは、ピリジン環の第３位に結合している。U*が第５位でない場合は、好ましくはTyr 、Arg 又はLys(cpd)である。NMLは、 N ^a CH₃-L-Leu を意味する。Dbu は、α、γ、ジアミノ酪酸を意味し、並びにDp r は、α、βジアミノプロピオン酸を意味する。Aph は、4-又はパラ- アミノPh e であると想定されるNH₂Pheを意味する。4-gua-D-Phe は、パラ位で置換されたグアニジンを有するD-Phe 残基を意味する。AzaGly-NH₂は、NHNHCONH₂ を意味する。第５又は第６位のArg 残基のグアニジノ基は、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、例えばプロピル(Pr)で置換することができる。D-Lys 、D-Dbu、D -Dpr 又はD-Orn が、第6-位に存在し、かつ一般的でないアミノ酸U*の一部ではないような場合には、その側鎖アミノ基は、脂肪族、ヘテロ環又は芳香族であることができるアシル基、例えばニコチン酸によってアシル化される、もしくは多くとも１個のフェニル環を有するアリール基で置換される。U*が第６位に存在しない場合には、これは好ましくはD-PAL 又はD-Lys(cpd)である。第７位の残基は、Leu 、NML 、Nle 又はPhe であることが好ましい。第８位の残基がU*でない場合には、ILysが好ましい。本発明の生物的効力のあるGnRHアゴニスト類は、下記式(F₂)で表わされる： pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-U*-AA₇-Arg-Pro-AA₁₀ （式中、AA₇ 及びAA₁₀は、前に定義されたものであり；好ましくは、AA₇ はLeu 又はNML であり、AA₁₀はNHCH₂CH₃である。）。合成され、保護されたアミノ酸の好ましい亜属は、下記式を有す：又は（式中、j は１〜３の整数；R₂は、H 、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、OH、NH₂ 、もしくはメチルピリジル、ピリミジニル又はプリニルのようなヘテロ環であり；かつX¹は、α−アミノ保護基である。）。ある好ましい方法は、GnRHアンタゴニスト類及び他のペプチド類の合成に適している、下記式を有する保護されたアミノ酸の亜属の合成のためのものである：（式中、X¹は、前述のものであり、かつj は１又は２である。）。この方法で調製されたアミノ酸の別の亜属は、下記式を有す：（式中、j は１、２又は３；X'はα−アミノ保護基であり、かつR₂は、低級アルキル(C¹-C⁶) 、シクロヘキシル、フェニル、ピリジル、メチルピリジル又はヒスタミニルである。）；もしくは、合成されたアミノ酸の他の好ましい亜属は、下記式を有す： (a) 又は(b) （式中、R₂は、低級アルキル、ピリジル又はメチルピリジル、並びにX¹はα−アミノ保護基、好ましくはBoc である。）。本発明の方法で合成された前述の保護されたアミノ酸は、古典的液相鎖延長合成法によって、もしくは固相技術によって、ペプチド類を合成するために使用することができる。クロロメチル化された樹脂又はヒドロキシメチル化された樹脂を使用することができる；しかし、C-末端アミド又は開裂で置換されたアミドを直接提供するような、メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂、ベンズヒドリルアミン(BHA) 樹脂、又は当該技術分野において公知である他の適当な樹脂が、このようなC-末端が所望である場合には、使用されることが好ましい。例えば、C- 末端に置換されたアミドを有するペプチド類は、1986年２月11日に公布された米国特許第4,569,967 号に開示された、N-アルキルアミノメチル樹脂を用いて合成されることが好ましい。固相合成法は、詳細は米国特許第4,211,693 号に開示された方法で、鎖中にアミノ酸を段階的に添加する方法で行われる。当該技術分野において周知であるように、側鎖保護基は、特に反応性側鎖を有する、及びTrp などの、任意に該樹脂上で形成される鎖に連結されるアミノ酸であるような、いずれかのアミノ酸の一部に含まれることが好ましい。このような合成法は、完全に保護された中間体ペプチド樹脂を提供する。液相又は固相合成によって合成される、第５位及び第６位の非天然アミノ酸を有する、GnRHアンタゴニストの化学的中間体は、下記式で表わされる： X¹-AA-AA₂(X⁵)-AA₃(X²)-Ser(X³)-U*-U*-AA₇(X²又はX⁷)-AA₈(X⁵又はX⁶)-Pro-X⁸（式中、U*は前に定義されたものである。）。 X¹は、ポリペプチドの段階的合成に関する当該技術分野において有用であることが公知であるような種類のα−アミノ保護基であり、並びに所望のペプチド組成物中のG は、保護基として使用することができる特定のアシル基である。X¹に相当するα−アミノ保護基の種類は、(1) アシル型保護基、例えばホルミル(For ) 、トリフルオロアセチル、フタリル、p-トルエンスルホニル(Tos) 、ベンゾイル(Bz)、ベンゼンスルホニル、ジチアノスクシノイル(Dts) 、o-ニトロフェニルスルフェニル(Nps) 、トリチルスルフェニル、o-ニトロフェノキシアセチル、アクリルイル(Acr) 、クロロアセチル、アセチル(Ac)及びγ−クロロブチリル；(2 ) 芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル(Z) 、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、並びにp-クロロベンジルオキシカルボニル(C IZ) 、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル及びp-メトキシベンジルオキシカルボニルのような置換されたベンジルオキシカルボニル；(3) 脂肪族ウレタン型保護基、例えばt-ブチルオキシカルボニル(Boc ) 、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル及びアリルオキシカルボニル；(4) シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル及びシクロヘキシルオキシカルボニル；(5) チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニル；(6) アルキル型保護基、例えばアリル(Aly) 、トリフェニルメチル（トリチル）及びベンジル(Bzl) ；(7) トリアルキルシラン基、例えばトリメチルシランである。好ましいα−アミノ保護基は、Boc である。 X²は、水素、又はTrp のインドール窒素の保護基、例えばBz、Ac又はFor である。多くの合成法においては、Trp を保護する必要はなく、かつこのような保護は、アシル化されたD-Trp が該ペプチドのいずれかに存在する場合には、使用されない。 X³は、Ser 又はThr のヒドロキシル側鎖の保護基、例えばAc、Bz、トリチル、 DCB 又はベンジルエーテル(Bzl) であり、かつBzl が好ましい。 X⁴は、水素、又はTry のフェノール性ヒドロキシル基の保護基であり、テトラヒドロピラニル、t-ブチル、トリチル、ベンジル、Z 、2-ブロモベンジルオキシカルボニル(2BrZ)及び2,6-ジクロロベンジル(DCB) から成る群から選択される。 2BrZが好ましい。 X⁵は、例えばArg 又はHar 中のような側鎖グアニジノ基の、もしくはHis のイミダゾール基の保護基であり、例えばニトロ、Tos 、トリチル、アダマンチルオキシカルボニル、Z 及び2,4-ジニトロフェノール(Dnp) などであるか、もしくは X⁵は、水素であってもよく、これは側鎖基の原子が保護されていないことを意味する。一般にTos が好ましい。 X⁶は、アミノ側鎖基、第一級又は第二級アミノ基の保護基であり、例えばZ 又は2ClZである。 X⁷は、水素、又はMet の保護基であり、例えば酸素である；Met は一般に保護されずに残る。 X⁸は、Gly-NH-[樹脂担体] 、D-Ala-NH-[樹脂担体] 又はN(A)-[樹脂担体] であり；X⁸は、同じくアミド又はエステル保護基、もしくは（液相合成が行われる場合には）Gly 又はD-Ala 又はPro 、又はNHNHCONH₂ に直接付着した置換されたアミドのいずれかの保護基である。 X²−X⁷の側鎖保護基の選択基準は、この合成の各工程での、α−アミノ保護基（好ましくはBoc ）の除去のために選択された反応条件下において、その保護基が、該試薬に対し安定でなければならないことである。一般に保護基は、カップリング条件下では開裂しないが、このペプチド鎖を変更しないような反応条件下では、所望のアミノ酸配列の合成の完了時に、除去可能でなければならない。 X⁸基が、Gly-NH-[樹脂担体] 又はD-Ala-NH-[樹脂担体] である場合は、アミド結合は、BHA 樹脂又はMBHA樹脂に、Gly 又はD-Ala を結合する。X⁸基が、N(A)- ［樹脂担体］である場合は、置換されたアミド結合は、N-アルキルアミノメチル (NAAM)樹脂にPro を結合する。X⁸がAzaGly-NH₂である場合は、該ペプチドは、米国特許第4,234,571 号に開示された、古典的な液相合成法で生成されることが好ましい。例えば最後の式において、G がアセチルである場合には、反応が、（側鎖基は保護され続ける一方で、α−アミノ基は脱保護された後に）、例えばジイソプロピル又はジシクロヘキシルカルボジイミド（DIC 又はDCC ）存在下、酢酸との、もしくは好ましくは無水酢酸との反応によって、前記樹脂上のペプチドで行われることが好ましい。当該技術分野において公知である他の適当な反応も、使用することができる。このペプチドの精製は、当該技術分野で公知であり、かつ特にJ.Rivierらの論文(J.Chromatography，28 8:303-382(1984))で述べられているような、CMC カラム上での、イオン交換クロマトグラフィー、それに続く溶出システムを用いる分配クロマトグラフィー：セファデックスG-25を充填したカラム上で、n-ブタノール；0.1N酢酸（体積比1:1 ）によって、もしくはHPLCを用いることによって、行われる。このGnRHアンタゴニスト類は、雌のラットの排卵を停止するために、発情前期日のほぼ真昼に皮下投与される場合には、体重1kg につき100 μg 未満の濃度で効果がある。排卵の持続性の抑制のためには、約0.1 〜約2.5mg/体重kgの範囲の用量が必要である。これらの類似体類は、特に生理的pHで可溶性であり、その結果、投与のために比較的濃い溶液を調製することができる。同じくこれらのアンタゴニストは、性腺刺激ホルモン及び前述の別の目的のための性ステロイド類の産生を調節するために使用することができる。下記式において、U*残基は、側鎖アミノ基に加え、付随する括弧に記載されている当該の修飾を有する元来のアミノ酸残基として定義されている。元来の残基は、アミノ置換が、その環の4-又はパラ−位に存在するようなアミノフェニルアラニン(D- 又はL-Aph)、もしくはアミノホモPhe（Hph）又はアミノホモホモPhe のいずれかである。これは、通常の鎖延長法の一部として、適当に保護された非天然アミノ酸U*を添加することによって、伸長するペプチド鎖に組み込まれる。この修飾された側鎖アミノ基に関して、実施態様において下記の略号が使用される： act=3-アセチルアミノ-1,2,4- トリアゾール atz=3-アミノ-1,2,4- トリアゾール bcg=アミノブチルシアノグアニジノ bzcg= アミノベンジルシアノグアニジノ chcg= アミノシクロヘキシルシアノグアニジノ ecg=アミノエチルシアノグアニジノ icg=アミノイソプロピルシアノグアニジノ hcg=アミノヘキシルシアノグアニジノ hicg= ヒスタミニルシアノグアニジノ（エチルイミダゾール） mcg=アミノメチルシアノグアニジノ ncg=アミノエチル(1又は2)ナフチルシアノグアニジノ mncg= アミノメチル(1又は2)ナフチルシアノグアニジノ pcg=アミノプロピルシアノグアニジノ trcg= インドールエチルアミノシアノグアニジノ（トリプタミノシアノグアニジノ） mpcg= アミノメチルピリジルシアノグアニジノ（数字は、ピリジル環上のアミノメチル基の位置を表わす。）実施例１ D-及びL-フェニルアラニンからのD-及びL-N ^a -Boc-4-(5'-(3'−アミノ-1H-1',2',4'- トリアゾリル))アミノフェニルアラニンの調製アミノ酸3-(4- ニトロフェニル）アラニンの調製は、しばしばフェニルアラニンの芳香環のニトロ化の様々な方法を用いている。最も頻繁に使用される前述のニトロ化は、硫酸に溶解された硝酸溶液を使用し、かつこれは通常“混酸”と称される。高い収量が報告されることが多いのと対照的に、実際のニトロ化は、該アミノ酸の芳香環の全ての可能な位置（オルト、メタ及びパラ）で生じ、かつその反応条件の修飾は、この異性体比のわずかな変化をもたらすのみであることが最近わかった。沸騰水による反復晶出で、所望でないo-及びm-異性体類を取り除くことができるが、その収量は理論値の約25％にすぎない。実質的に硝酸及び無水酢酸、又は様々な酸の硝酸塩から成る他のニトロ化組成物も、同様に使用されているが、収量は少なく、かつ異性体の分布は報告されていないので、ニトロ化のこれらの変法には利点が無いことが明らかになった。該文献に記載された様々な方法の、ある反応の因子は、すなわち反応物として使用されたPhe 量に対するニトロ化試薬の比は、一定である。この値は、一般に過剰なニトロ化を避けるために、適当な硝酸塩の1.1 〜1.3 当量である。過剰な硫酸が、一般にこの反応に添加され、ニトロ化は、硫酸が90％以上の系において最も迅速であると考えられることから、ニトロ化剤(NO ⁺²) の形成を助ける。より多量の硫酸の使用は、単離時に、黄色アミノ酸をもたらすことが現在はわかっているが；しかしアミノ酸１モルにつきHNO₃を、少なくとも約２モル (当量 )、好ましくは約２〜約3.5 当量で、供給するために、硝酸の量を非常に多くすることによって、より透明な生成物が生成される。好ましくは、硝酸１当量につき、硫酸が約２〜約３当量の量で供給される。更に共役状態での作用時間は、より収量を高める。水による再結晶後、3-(4- ニトロフェニル) アラニンは、CZE を用いて、所望でないメタ−又はオルト−置換異性体の可能性のある混入を検出し、かつ他の異性体類を溶出することがわかっている条件下で、パラ−置換異性体のみを認めた。その後、このα−アミノ基を、脂肪族ウレタン型保護基、好ましくはBoc で保護した。次に、D-及びL-Boc-4-Aph(atz)アミノ酸の両方が、対応するBoc-4-Aph アミノ酸から、ジフェニルシアノカルボンイミデートと、パラ−アミノ官能基の反応、それに続くヒドラジン水和物処理によって、容易に調製されることが示されている。この２工程反応は、実質的に１容器操作であり、かつこれらの２工程間で、濃度／溶媒交換(concentration/solvent exchange)が行われるにもかかわらず、この反応がアルコール溶媒、例えばイソプロパノール中で行われる場合には、そのような必要はない。ジクロロメタンを溶媒とした際のBoc-4-Aph（atz）の溶解限度は、補助溶剤としてN-メチルピロリジン(NMP) を使用することによって、克服された。以下に記載した実験条件は、これらのアミノ酸の調製を詳細に説明するものである。4-ニトロフェニル-D- アラニン：撹袢子を装備し、かつ氷浴中に保持した600ml のビーカー中の、冷、濃(16mol) 硝酸150ml （約2.4mol）に、冷、濃(18mol) 硫酸(200ml) を、徐々に加えた。３℃に冷却後、D-フェニルアラニン (180g，1.09 mol)を、５〜10g ずつ、１時間かけて添加し、温度が約５℃に保たれていることを確認した。この反応物を、氷浴中、温度（２〜５℃）で４時間撹袢した。その後この反応を、氷3kg 上に注ぐことによって停止し、その後濃水酸化アンモニウムで、この反応物を注意深く中和した。pH5-6 で、この溶液は濁りはじめ、かつ 4-ニトロフェニル-D- アラニンが沈殿した。この沈殿を、ろ過によって収集し、かつ氷水(1リットル) で洗浄した。このアミノ酸は、その後、温水700ml で２回再結晶した。この再結晶した生成物を収集し、かつ高真空下で乾燥し、4-ニトロフェニル-D- アラニン157g(0.75mol;68 ％) を得た。［α］_D=-6.9°（1N HClで c=0.86） ;m.p.=238-244℃。4-ニトロフェニル-L- アラニン：4-ニトロフェニル-D- アラニンに関する前述の反応を、Ｌ異性体のために繰り返した。L-Phe 約125g を、前述の方法でニトロ化して、4-ニトロフェニル-L- アラニン 124g （収量約77％）を得た。［α］_D= +6.8°(1N HCl でc=1.0)。N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-D- アラニン：4-ニトロフェニル-D- アラニン(157 g，0.75mol) を、40％のt-ブチルアルコール水溶液500ml に溶解し、かつそのpH を、2N NaOHを用いて9.9 に調節した。ジ-t- ブチルジカルボネート(198g，0.9m ol)を35分以上かけて、撹袢されている反応物に添加し、かつ次にこの混合物を室温で２時間撹袢した。このpHは、この反応過程を通じて約9.8 以上に保った。その後この反応生成物を、まず石油エーテル(2×800ml)、及びジエチルエーテル (1×500ml)で抽出し、その後この水相を、NaHSO₄を用いて、pH2 まで注意深く酸性化した。この水相を、酢酸エチルで抽出し；その後これを、MgSO₄ で乾燥し、かつ真空下で濃縮し、石油エーテルで粉砕されるよう凝固された粘性の油分を得た。このBoc-アミノ酸を、ろ過によって収集し、石油エーテルで洗浄し、かつ乾燥して、N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-D- アラニン210g(0.68mol;90％) を得た。［α］_D=-7.0°(MeOH でc=0.9)；m.p.=100-104℃。N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-L- アラニン：N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-L- アラニンに関する前述の反応を、L-異性体で繰り返した。4-ニトロフェニル-L- アラニン、約123gを前述のように反応し、N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-L- アラニン約155g（収量約86％）を得た。［α］_D =+7.1°(MeOH でc=1.0)。N ^a -Boc-4- アミノフェニル-D- アラニン：N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-D- アラニン(209g，0.68mol) を、エチルアルコール500ml に溶解し、かつ酢酸(10ml) で酸性化した。これに、10％のPd/ 炭素を0.65g を添加し、かつこの混合物を、ほぼ室温で、約40psi のH₂を用い、水素の取込みが終了するまで（６時間）、水素添加した。この結晶を、ろ過によって除去し、かつ反応生成物を、真空下で濃縮し、石油エーテルで粉砕されるよう凝固された粘性の油分を得た。このアミノ酸をろ過によって収集し、石油エーテルで洗浄し、かつ乾燥して、N ^a -Boc-4- アミノフェニル-D-アラニン184g(0.659mol，97％) を得た。[α] _D =-40.2°(Et OAcでc=1.0)及び-23.4°(MeOH でc=1.0);m.p.=128-133℃。N ^a -Boc-4-アミノフェニル-L-アラニン：N ^a -Boc-4- アミノフェニル-D- アラニンに関する前述の反応を、L-異性体について繰り返した。N ^a -Boc-4- ニトロフェニル-L-アラニン約153gを前述のように反応し、N ^a -Boc-4- アミノフェニル-L-アラニン134g（収量約96％）を得た。[α] _D =+23.6°(MeOH でc=1.0)。N ^a -Boc-4-(5'-(3'- アミノ-1H-1',2',4'- トリアゾリル))- アミノフェニル-L - アラニン[Boc-L-4Aph(atz) ] ：機械撹袢子を装備した250ml の丸底フラスコ中で、Boc-L-4-アミノフェニルアラニン 9g(32mmol) に、ジクロロメタン100ml 、及び固形物が完全に溶解するまで十分量のN-メチルピロリドン(10ml)を添加した。この時、ジフェニルシアノカルボンイミデート 8.7g(36.6mmol) を添加し、かつこの反応混合物を室温で約17時間撹袢した。その後この反応混合物を、真空下で濃縮し、かつ得られた、シアノグアニジノ中間体を含有する油分を、メタノール125ml に溶解した。ヒドラジン水和物15mlを添加し、かつこの反応混合物を、室温で24時間撹袢した。その後この反応混合物を、真空下で約50mlにまで凝縮し、得られた油分を、冷水350ml で希釈した。pHが約７になるまで、希硫酸を添加し、かつこの水相を、エーテル(1×150ml)で抽出し、該反応中に生成されたフェノールを除去した。次にこの水相のpHを、2-3 に調節し、この時沈殿が形成された。その後この反応生成物を、温酢酸エチル(3×250ml)で抽出し、かつその有機相をMgSO₄ 上で乾燥した。次にこの有機相を濃縮し、油分を得、エーテルで洗浄し、凝固した。得られた粉末を篩いにかけ、石油エーテルで洗浄し、その後乾燥して、Boc-Aph(3-アミノ- 1,2,4 トリアゾール）とも称される、 Boc-L-Aph(atz ) の褐色粉末9.2g(25.3mmol,収量79％) を生成した。[α] _D =-16.4°(MeOHでc= 1.0)。N ^a -Boc-4-(5'-(3'- アミノ-1H-1',2',4'- トリアゾリル))- アミノフェニル-D - アラニン[Boc-D-4Aph(atz) ] ：前述のBoc-L-Aph(atz)に関する反応を、D-異性体について繰り返した。Boc-D-Aph 、10.1g を、ジフェニルシアノカルボンイミデート10.8g で処理した後に、ヒドラジン水和物20mlを加え；実質的に、 Boc-D -Aph(atz) 7.8g（収量61％）を得た。[α] _D =-15.6°(MeOH でc=1.0)。実施例２デカペプチド[Ac-β-D-2NAL¹、(4Cl)D-Phe² 、D-3PAL³ 、Aph(atz)⁵ 、D-Aph( atz)⁶、ILys⁸ 、D-Ala¹⁰]-GnRH を、固相合成法によって合成した。このペプチドは、下記式を有する： Ac- β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(3-アミノ,1,2,4トリアゾール)-D-Ap h(3-アミノ,1,2,4トリアゾール)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂。 MBHA樹脂(0.76mM/g)を使用し、かつBoc-で保護されたD-Ala を、CH₂Cl₂中で、該樹脂に、約２倍の過剰量のBoc-誘導体及び活性化剤としてDCC を用い、２時間連結した。このD-Ala 残基は、アミド結合によって、MBHA残基に連結した。樹脂約0.9gで開始し、自動化された装置を使用して、各アミノ酸残基をカップリングし、洗浄し、脱保護し、かつ次のアミノ酸残基とカップリングするという操作を、下記のスケジュールに沿って行った。前述のスケジュールは、第一のアミノ酸が連結した後の、本発明のペプチドのアミノ酸類の各々のカップリングのために使用される。N ^a Boc 保護は、本合成を通じ、残りのアミノ酸の各々のために使用される。N ^a Boc-β-D-2NAL は、当該技術分野において公知の方法、例えば1980年11月18日に公布された、米国特許第4,234,571 号に詳細が開示されている方法によって調製され；これはシンステック(SyntheTech)社 (オレゴン、米国) から市販もされている。Bzl （ベンジルエーテル）は、Ser のヒドロキシル基の、側鎖保護基として使用される。Boc-Ly s (Ipr,Z) は、第８位のために使用される。第５位の4Aph(atz) 及び第６位のD- 4Aph(at z)の側鎖基は、保護の必要はない。トリフルオロ酢酸(TFA) によるN-末端のα−アミノ基の脱保護後に、ジクロロメタンを溶媒とする過剰量の無水酢酸を用いて、アセチル化を達成した。該ペプチドの合成及びN-末端のアセチル化の完了後に、下記式の中間体が約1. 67g 存在した：Ac- β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Aph(atz)-D-Aph (a t z)-Leu-Lys(Ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。このペプチド樹脂を乾燥し、かつ次にこの樹脂から該ペプチドを切断し、かつ Ser 及びLys 側鎖の脱保護を、HFを用い０℃で行った。HF処理以前に、捕捉剤としてアニソールを添加した。真空下でHF除去後、この樹脂を100ml のエチルエーテルで２回洗浄した。切断されたペプチドを、CH₃CN 及びH₂O の等量部(equal p arts）を用い、該樹脂から抽出し、この工程を、各回150ml を用いて繰り返した。この抽出物を収集及び凍結乾燥し、粗ペプチド粉末約650mg を得た。その後このペプチドの精製は、当該技術分野で公知であり、かつ特にJ.Rivier らの論文(J.Chromatography,288 :303-328(1984)) に述べられている、分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって行った。最初の分取RP-HPLC による分離には、TEAP（トリエチルリン酸アンモニウム）バッファー系を使用した。この分離を、わずかに異なる勾配の、同じバッファー系を用いて繰り返し、最終分離は、0.1 ％TFA （トリフルオロ酢酸）勾配を用いて行ったが、いずれも前記J.Chro matographyの記事に詳細に記載されている。該デカペプチド約80.7mgを得、これをペプチドNo.1と称した。このペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー及び水性トリエチルリン酸アンモニウムバッファーにアセトニトリルを加えたものを用い、更に毛管ゾーン電気泳動(CZE) を用い、均質であるかどうかを判定した。この純度は、約97％と推定された。結果のアミノ酸解析から、精製されたペプチドは、予定された構造の式と一致し、該鎖中の各アミノ酸の整数値(integer-values)を実質的に示し；更に質量分析も、一致した。旋光度は、光電偏光計を用い、下記式のように測定した： [α] ²⁰ _D＝-2.8±0.5 (C=1，50％酢酸) ペプチドNo.1を、in vivo でアッセイし、かつin vitroで試験した。in vitro 試験は、本アッセイ前に４日間培地に保存し、分離したラットの下垂体細胞を用いて行った。ペプチド類の適用に応じて調製されたLHの濃度は、ラットLHの特異的ラジオイムノアッセイで、アッセイした。細胞の対照皿は、GnRH 3nmolの処置のみを行い：実験皿は、GnRH 3nmol の処置に加え、比較を目的とする本標準アンタゴニスト、すなわち[Ac-デヒドロプロリン¹,(4F)D-Phe²,D-Trp^3.6 ]-GnRH、もしくは試験ペプチドのいずれかを、濃度0.01〜10nmolの範囲の処置を行った。 GnRHのみで処理された試料にいて分泌されたLHの量を、該ペプチド及びGnRHで処理された試料によって分泌されたそれと比較した。試験ペプチドの、GnRH 3nmol によって放出されたLH量を減少する能力を、本標準ペプチドのそれと比較した。 in vivo 試験で、雌のラットの排卵を抑制する効果を測定した。本試験においては、所定の数、例えば５〜10匹の、体重が各々225 〜250gの、雌の成熟したスプラーグ−ダウレー(Sprague-Dawley)系ラットに、指定された用量(mg)のペプチドを、生理食塩水、静菌水、ポリエチレングリコール、とうもろこし油、又はこれらとエタノールの混合物のいずれかを溶媒として、発情前期日の正午頃に注射した。発情前期は、排卵日の午後である。別の雌ラット群を、該ペプチドを投与しない対照群として使用した。対照雌ラットは、それぞれ、発情前期の午後に排卵し；処置したラットの排卵した数を記録した。該ペプチドは全て、約500 μg の用量で、雌ラットの排卵停止に全体として効果的であると考えられた。ペプチドNo.1と称されたペプチドは、低濃度で、in vitroにおけるGnRHに誘発されたLH分泌の阻害に有効であった。このペプチドは、低用量で、哺乳類の雌の排卵停止に効果があると考えられる。下記表Ａは、本GnRHアンタゴニストの、所定のマイクログラム用量でのin vivo 試験の結果を示す：いずれも少なくとも１種のD-異性体の非天然アミノ酸残基を含むような追加のペプチドについては、以下に述べる。実施例３下記式を有する表Ｂに示されたペプチド類： Ac- β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AA₈-Pro-D-Ala-NH₂ は、実施例２に記載された固相法によって調製した。これらの非天然アミノ酸は、実施例１の方法の、ヒドラジンを適当な試薬で置き換えた方法を用いて合成した。例えば、ペプチドNo.11 は、シアノグアニジノ中間体を、DMF を溶媒としたイソプロピルアミンで、室温で24時間処理することによって調製された、保護されたアミノ酸を用いて合成した。表Ｂに記載されたペプチドはいずれも、いくつかの適正濃度で、in vitroにおいて、GnRHが誘発したLH分泌を阻害することに効果があると考えられる。これらのペプチドは全て、低用量で、哺乳類の雌の排卵停止に有効であると考えられる。実施例４下記式を有する表Ｃに示されたペプチド類： Ac- β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-AA₇-ILys-Pro-AA₁₀ は、前述の固相法によって調製した。表Ｃに記載されたペプチド類は、適正濃度で、in vitroでのGnRHが誘発したLH 分泌を阻害することに効果があると考えられる。これらのペプチドは全て低用量で、哺乳類の雌の排卵停止に有効であると考えられる。実施例５下記式を有する表Ｄに示されたペプチド類： pGIu-His-Trp-Ser-Arg-AA₆-AA₇-Arg-Pro-AA₁₀ は、前述の固相法によって調製した。表Ｄに記載されたペプチド類は、雌のラットにおいて、LH及びFSH の放出を引き起こすことに効果があると考えられる。これらは全て、天然のGnRHよりも実質的により有効であると考えられる。本発明のペプチド類は、当該技術分野において周知であるように、医薬として許容できる形状の無毒性塩類、例えば酸付加塩で、もしくは金属錯体で投与されることが多い。例えば、該ペプチドの水溶液を、1Nの酢酸で反復処理し、かつその後凍結乾燥して、それらの酢酸塩を得ることができる。医薬組成物は、一般に通常の医薬として許容できる担体と共に、本ペプチドを含有している。通常、用量は、経静脈的、筋肉内、又は皮下に投与する場合、宿主の体重1kg 当たり、本ペプチドを約10μg 〜0.5mg である。概して、これらのペプチドによる対象の治療は、該ペプチドが溶解する適当な担体を用いて、他の GnRHのアンタゴニスト又はアゴニストを用いる臨床治療と同じ方法で一般に行った。本発明はその好ましい実施態様に関して記載されているが、当業者にとって明らかであるような変更及び修正は、添付された請求の範囲に述べられた、本発明の範囲を逸脱しないように行うことができることは理解されるであろう。アミノ酸に関して、アミノ基置換Phe の修飾をおこなう代わりに、適当なアミノ置換基を有する、ホモPhe 又はホモホモPhe のいずれかを、D-又はL-異性体のいずれかの類似特性を有する非天然アミノ酸の合成に使用することができる。本発明の具体的特徴を、次の請求の範囲において強調して説明する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リヴィアジーンイーエフアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラジョラブラックゴールドロード 9674 (72)発明者ポータージョンエスアメリカ合衆国カリフォルニア州 92024 ルーカディアサクソニーストリート 1002

Claims

【特許請求の範囲】１．鎖延長法によるペプチド合成に有用な非天然アミノ酸を合成する方法で、下記の工程を含む方法：下記式を有するα−アミノ酸：（式中、ｊは１、２又は３）を、α−アミノ酸１mol につきHNO₃が少なくとも約２mol であるような、該アミノ酸、濃硫酸及び濃硝酸を含有する反応混合物を形成することによって、ニトロ化条件に晒し、かつこの反応混合物を、温度約５ ℃以下に保ち、主として第４位に前述のニトロ化を生じる工程；前記4NO₂- 置換生成物を、適当な試薬と反応し、アミノ保護基を該α−アミノ酸に付加する工程；前記保護されたアミノ酸を、該置換されたニトロ基に水素添加し、かつこれをアミノ基に転化するように処理する工程；前記水素添加されたアミノ酸を、適当な溶媒の中に溶解し、かつこれをジフェニルシアノカルボンイミデートと反応し、求核性残基と反応性であるシアノグアニジノ中間体を形成し、所望の非天然アミノ酸を合成する工程である。２．前記ニトロ化工程において、濃硝酸が、α−アミノ酸１mol につきHNO₃が約２〜約3.5 mol の量で使用される、請求の範囲第１項記載の方法。３．前記濃硫酸が、HNO₃１当量につき約２〜約３当量の量で使用される、請求の範囲第２項記載の方法。４．前記4NO₂- 置換生成物が、脂肪族ウレタン型保護基によって、該α−アミノ基の保護を生じるような試薬と反応される、請求の範囲第１項記載の方法。５．前記保護基が、t-ブチルオキシカルボニル(Boc) である、請求の範囲第４項記載の方法。６．前記試薬が、ジ-t-ブチルジカルボネートである、請求の範囲第５項記載の方法。７．前記保護されたα−アミノ酸が、アルコールに溶解し、かつパラジウム／炭素触媒を用いて水素添加される、請求の範囲第１項記載の方法。８．前記水素添加された化合物が、前述の反応のために、ジクロロメタン及びN- メチルピロリジンの混合物に溶解され、前記シアノグアニジノ中間体を形成する、請求の範囲第１項記載の方法。９．前記中間体が溶解している溶液に、ヒドラジン水和物の形でヒドラジンが添加される、請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記j が、１である、請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記中間体が、ヒドラジンと反応し、該アミノ酸側鎖のフェニル環の第４位に結合した3-アミノ1,2,4 トリアゾール残基を生成する、請求の範囲第１〜10項のいずれか１項に記載の方法。 12．C-末端からの鎖延長法による、ペプチドの合成法であって、ペプチド中間体のα−アミノ基の脱保護、並びに請求の範囲第１項記載の方法によって合成されたα−アミノ酸と、アミド結合を形成するような反応を含む方法。 13．請求の範囲第１項記載の方法によって生成されたアミノ酸であって、下記式を有するアミノ酸：又は（式中、X₁は、α−アミノ保護基、j は、１、２又は３、並びにR₂はアルキル、修飾されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はメチルピリジルである。）。