JPH09500210A - 疎水クロマトグラフィーのための分離剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、疎水相互作用クロマトグラフィーに使用する固定相に関し、この固定相は、表面にポリマーが共有結合している、ヒドロキシル基含有担体物質に基ずいている。この固定相は以下を特徴としている：ａ）担体物質は脂肪族ヒドロキシル基を含有する。ｂ）ポリマーは末端モノマー単位により担体物質に共有結合する。ｃ）ポリマーは式IIのモノマー単位を含み、 式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、Ｒ⁴はＨ，Ｃ₁−Ｃ₅アルキル又はＣ₆−Ｃ₁₂アリールであり、ｎは１〜５の間の全整数であり、一方のＸ基はＯＨであり、かつ、他方のＸ基はＺ−Ｒ⁵であり、ＺはＯ又はＮＨであり、Ｒ⁵はＣ₁−Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₆−Ｃ₂₅アリール、Ｃ₇−Ｃ₂₅アルキルアリール、あるいは１個以上のニトリル基又はＣ₁−Ｃ₅アルコキシ基により置換することができ、この際、１個以上の非隣接ＣＨ₂基はＮＨ又はＯにより置き換えることもできるか、又は１個以上のＣＨ基がＮによって置き換えることができるＣ₇−Ｃ₂₅アリールアルキルであり、あるいはＲ⁵は −［（ＣＨ₂）_m−Ｏ−］。−Ｒ⁶で表わされ、この式中、ｍは２又は３であり、ｏは１〜２００の全整数であり、Ｒ６はＨ又はＣ₁−Ｃ₅アルキルである。ｄ）モノマー単位は線状で互いに連結する。本発明はまた、上記のような固定相の製造方法、及び複数物質の混合物のクロマトグラフィー分離にこれを使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 疎水クロマトグラフィーのための分離剤 本発明は疎水クロマトグラフィー用分離剤に関する。 疎水相互作用に基ずく液体クロマトグラフィー用に、２種類のグループの分離 剤が慣用されている： ａ）高い配位子密度を有する、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−クロマトグラ フィー）用の分離剤は、非水性溶離液中において低分子量物質を分離するのに主 として使われる ｂ）低い配位子密度を有し、かつ、一般的には低疎水性の配位子（例えばＲＰ −クロマトグラフィーにおけるＣ₈−アルキル又はＣ₁₈−アルキルの代りに、Ｃ₄ −アルキル又はＣ₇−アリール）を有する、疎水相互作用クロマトグラフィー（ ＨＩＣ）用の分離剤は、水溶性溶離液を用いて蛋白質を分離するのに主として用 いられる。カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）、例えば２Ｍ 硫酸アンモニウム、が出発溶離液に添加され、この塩濃度は勾配溶離の進行中に 低下される。 疎水相互作用クロマトグラフィー用の分離剤は当業界では知られている。ポリ サッカリド、架橋したポリ サッカリド及び架橋したポリアクリル酸メチルもベースの担体として慣用される 。どの場合でも、このベースの担体はより低級のアルキル又はアリールラジカル 、例えばブチル、フェニル又はベンジルによって置換される。これらの物質を製 造する既知の方法は、三弗化硼素エーテル錯化合物の存在下で、オキシラン基を 含むベースの担体をアルコールと反応させることに基ずいている。 従来技術の既知の分離剤を使用するときは、不充分な分離効果がしじゅうみら れる。これらの分離剤にしばしばみられる別の不利な点は、生物学的活性の減少 及び／又は分析物の非特異的非可逆結合による損失である。 本発明の目的は、特に疎水相互作用クロマトグラフィーのための改善された性 質を有する分離剤を提供することである。 ドイツ特許出願ＤＥ ４３ １０ ９６４は、式Ｉのモノマーがヒドロキシル 基含有のベース担体にグラフトしている、オキシラン含有活性化担体物質を開示 している。 但し上式中、 Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、 Ｒ⁴はＨ、Ｃ₁−Ｃ₅−アルキル又はＣ₆−Ｃ₁₂−アリールであり、 ｎは１〜５の整数である。 これらの活性化担体物質は、それ自体知られている方法で、疎氷相互作用クロ マトグラフィー用分離剤に転換できることがわかった。得られたこの分離剤は改 善された性質をみせる。 本発明はしたがって、表面上にポリマーが共有結合している、ヒドロキシル基 含有のベース担体に基ずく、疎水クロマトグラフィーのための分離剤に関し、そ の特徴は以下のとおりである。 ａ）このベースの担体は脂肪族ヒドロキシル基を含む。 ｂ）共有結合したポリマーは、末端モノマー単位によってベースの担体に結合 している。 ｃ）このポリマーは式IIのモノマー単位を含む。 ｄ）そのモノマー単位は線状に連結する。 但し上式中、 Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であ り、 Ｒ⁴はＨ、Ｃ₁−Ｃ₅−アルキル又はＣ₆−Ｃ₁₂−アリールであり、 ｎは１〜５の整数であり、 １方のＸラジカルはＯＨであって他方のＸラジカルはＺ−Ｒ⁵であり、 ＺはＯ又はＮＨであり、そして Ｒ⁵はＣ₁−Ｃ₂₀−アルキル、Ｃ₆−Ｃ₂₅−アリール、Ｃ₇−Ｃ₂₅−アルキルアリー ル、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はＣ₁−Ｃ₅−アルコキシにより誘導 することもでき、この際１個以上の非隣接ＣＨ₂基はＮＨ又はＯによって置き換 えることもできるか、さもなければ１個以上のＣＨ基はＮによって置き換えるこ とができるＣ₇−Ｃ₂₅−アリールアルキルであるか、又は Ｒ⁵は −［（ＣＨ₂）_m−Ｏ−］。−Ｒ⁶であり、但しこの式中ｍは２又は３であ り、ｏは１〜２００の整数であり、Ｒ⁶はＨ又はＣ₁−Ｃ₅−アルキルである。 本発明はまた、２以上の物質の混合物の分離、特に蛋白質の分離に関連して、 前記新規な分離剤を疎水相互作用クロマトグラフィーに使用することに関する。 本発明はさらに、ドイツ特許出願ＤＥ ４３ １０ ９６４に開示されている 、オキシランを含有する活 性化担体物質を、式III Ｒ⁵−ＯＨ III のアルコール又はフェノールと反応させるか、又は式IV Ｒ⁵−ＮＨ₂ IV ［上記III、IV式中、Ｒ⁵は前記定義と同じ意味を有する。］ のアミンと反応させることを特徴とする、疎水相互作用クロマトグラフィー用分 離剤の製造方法に関する。アルコールとの反応は三弗化硼素エーテル錯化合物の 存在下に行うのが好ましい。 本発明はまた、本発明の新規分離剤を使用する疎水相互作用クロマトグラフィ ー手段により、２以上の物質の混合物の分離、特に蛋白質の分離のための方法に 関する。 図１ａは、新規な分離剤上での蛋白質類、すなわちシトクロムＣ、ミオグロビ ン、リゾチーム及びキモトリプシノーゲンの分離を示す。比較のため、図１ｂは 、従来技術の既知の分離剤での同じ混合物の分離状況を示す。 疎水性のアルキルラジカルか又はアリールラジカルであるＲ⁵は、ヒドロキシ ル基を含有するベースの担体上にグラフトするポリ（メタ）アクリレートの置換 基として存在する。これに関連して、このＲ⁵ラジカ ルは、疎水クロマトグラフィー（すなわちＲＰクロマトグラフィー及び、特に疎 水相互作用クロマトグラフィー）を目的とする、当業者に知られている疎水性置 換基であり、Ｃ₁−Ｃ₂₀−アルキル、Ｃ₆−Ｃ₂₅−アリール、Ｃ₇−Ｃ₂₅−アルキ ルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はＣ₁−Ｃ₅−アルコキシに より誘導することもでき、この際、１個以上の非隣接ＣＨ₂基はＮＨ又はＯによ って置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のＣＨ基はＮによって置 き換えることができるＣ₇−Ｃ₂₅−アリールアルキル、あるいはポリエトキシ誘 導体又はポリプロポキシ誘導体を含む。 疎水相互作用クロマトグラフィーのためには、エチル、プロピル、ｎ−ブチル 又はｎ−ペンチルなどのＣ₂−Ｃ₅−アルキルラジカル、でなければｉ−ブチル、 ｔ−ブチル、ｉ−アミル又はネオ−ペンチルなどの分岐鎖ラジカル、及びフェニ ル、ナフチル、アントラシル又はフェナントリルなどのＣ₆−Ｃ₁₄−アリール、 さもなければベンジルなどのＣ₇−Ｃ₁₀−アルキルアリール又はＣ₇−Ｃ₁₀−アリ ールアルキルが好ましい。 これらのラジカルは、ポリマー類似反応において相当するＲ⁵−ＯＨアルコー ルを三弗化硼素エーテル錯化合物の存在下にオキシランと反応させることにより 導入される。このポリマー類似反応においては、オキシラン成分としてオキシラ ン含有ポリマーが使用され、このものはヒドロキシル基を含有するベース担体上 にグラフトしている。Ｒ⁵−ＯＨフェノール及びＲ⁵−ＮＨ₂アミンは、苛性ソー ダ水溶液の存在下にオキシラン成分と反応させられる。これらの反応体は互いに 交換することもできる： この場合、ヒドロキシル基含有担体は、三弗化硼素エ ーテル錯化合物存在下に２，３−エポキシプロピルフェニルエーテルなどのオキ シラン誘導体と反応する。 疎水性の度合いはＲ⁵置換基の選定及び置換度によって影響を受ける。余剰の オキシラン基は、既知の方法、稀硫酸処理で除くことができる。 殊更説明するまでもなく、当業者は以上の説明を最大限に利用することができ るものと考えられる。この理由により、好ましい実施態様は専ら開示を説明する ものであり、決して限定するものではないものと解釈すべきである。 以上及び以下に記載の出願、特許及び刊行物などの全開示、及び該当ドイツ特 許出願ＤＥ ４３ ２３ ９１３（１９９３年７月１６日出願）の開示を、参考 文献として本出願中に取り入れる。 実施例 実施例１： オキシラン−活性化担体の製造、フラ クトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ，登録商標）−ＴＳＫ ＨＷ ６ ５（Ｓ）からの方法 ２ｇの硝酸セリウムアンモニウム（２５ｍｌの２ＭＨＮＯ₃中に溶解）を、５ ０ｍｌの沈澱フラクトゲル（登録商標）ＴＳＫ ＨＷ ６５（Ｓ）と２５ｍｌの 水からなる懸濁液中に、室温で激しく撹拌しながら混合した。１分後、３０ｍｌ のジオキサン中３ｇの（２，３−エポキシプロピル）メタクリレートを含む溶液 を添加した。この混合物をさらに３時間撹拌した。次いで反応懸濁物を先ず蒸留 氷で洗浄し、さらに０．０５Ｍ ＥＤＴＡ溶液で洗浄した。 実施例２： ｎ−ブチル置換担体物質の合成 実施例１にしたがって製造した乾燥ゲル５０ｇを１，４−ジオキサン２５０ｍ ｌ中に懸濁させ、５０ｍｌの１−ブタノールを加えた。次いで３０ｍｌの三弗化 硼素エチルエーテル錯化合物を加え、その溶液を室温で１時間撹拌した。その後 、反応生成物を吸引瀘過してアセトンと水で洗浄した。 実施例３： ベンジル置換担体物質の合成 １−ブタノールの代りにベンジルアルコールを使用する以外は、実施例２の方 法にしたがってベンジル−置換の担体物質を製造した。 実施例４： フェニル置換担体物質の合成 ０．６Ｍ ＮａＯＨ及び０．５Ｍ フェノールからなる溶液中に、１００ｍｌ のフラクトゲル−エポキシテンタクル（ｅｘｐｏｘｙｔｅｎｔａｃｌｅ）ゲルを 懸濁させた。この溶液を４０℃で１２時間撹拌した。次いでこのものを吸引瀘過 し、０．５Ｍ硫酸溶液中で４０℃にて２時間ゆるやかに撹拌した。その後、中性 になるまで０．２５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で洗浄を行い、さらに水で洗浄 した。 実施例５： フェニル置換担体物質合成の変形法 実施例１に従って製造したオキシラン含有ゲル２５ｍｌを、０．５Ｍ硫酸１０ ０ｍｌで４０℃にて２時間処理し、ジオール誘導体を生成させた。この誘導体を ジオキサンで数回洗浄し、２５ｍｌの乾燥ジオキサン中に懸濁させた。この懸濁 物を乾燥管を含むエルレンマイヤーフラスコに移し、３ｍｌのＢＦ３−エーテル 錯化合物、次いで１０ｍｌの２，３−エポキシプロピルフェニルエーテルをピペ ットで添加して、全体を室温にて４５分間振盪した。生成物をジオキサンで３回 、次いで水で洗浄した。 実施例６：（アミノブチル）−置換担体物質の合成 ０．２Ｍのｎ−ブチルアミンと０．２Ｍの炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ＝１１）か らなる水溶液１００ｍｌを、実施例１に従って製造されたゲル５０ｍｌ中に加え た。この溶液を４０℃で２４時間撹拌した。次いでこ のものを吸引瀘過し、硫酸の０．５Ｍ溶液中で４０℃にて２時間ゆっくり撹拌し た。その後、中性に達するまで０．２５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で洗浄を行 い、次に水で洗浄した。 実施例７： ポリエチレングリコール−置換担体物質の合成 ２０ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）及び０．３Ｍ炭酸ソーダ 緩衝液（ｐＨ＝１３）からなる水溶液１００ｍｌを、実施例１に従って製造した ゲル５０ｍｌに添加した。この懸濁液を４０℃で２４時間撹拌した。次いでこの ものを吸引瀘過し、硫酸の０．５Ｍ溶液中で４０℃にて２時間ゆっくり撹拌した 。その後、０．２５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で中性になるまで洗浄を行い、 次いで水で洗浄した。 応用例Ａ： ｎ−ブチル置換担体物質上での蛋白質の分離 実施例２にしたがって製造された担体物質を、スーパーフォーマンス（Ｓｕｐ ｅｒ Ｆｏｒｍａｎｃｅ：登録商標）ガラスカラム（５０×１０ｍｍ）中に充填 し、負荷緩衝液（２０ｍＭリン酸ソーダ緩衝液中１．８Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，ｐ Ｈ７．０）により平衡安定化させた。シトクロム、ミオグロビン、リゾチーム及 びキモトリプシノーゲンを含む混合物（各ケース４ｍｇ／ｍｌ）をカラムに装入 した（２００μｌ）。次 いで後者を、２０ｍＭリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７．０）中の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ の勾配が１．８ＭからゼロＭ、流速が１ｍｌ／分で溶離させた（時間，３０分） 。溶離曲線を２８０ｎｍで光度測定法により測定した。 これら４つの蛋白質は完全に分離された（図１ａ参照）。 応用例Ｂ： ベンジル置換担体物質での蛋白質の分離 実施例３に従ってつくられた担体物質をスーパーフォーマンス（登録商標）ガ ラスカラム（５０×１０ｍｍ）に充填した。試料とクロマトグラフィー条件は応 用例Ａに記載のものと同じであった。 これら４つの蛋白質は、この物質でも完全に分離された。すなわち、溶離曲線 は応用例Ａで得られたものと同様であった。 比較例Ｃ： 従来技術のｎ−ブチル置換担体物質上での蛋白質の分離 市場で入手可能な担体物質（ｎ−ブチル置換架橋ポリメタクリレート）をスー パーフォーマンス（登録商標）ガラスカラム（５０×１０ｍｍ）中に充填した。 試料とクロマトグラフィー条件は応用例Ａに記載したものと同じであった。 応用例Ａとは異なり、これら４つの蛋白質は全く分 離されなかった（図１ｂを参照）。 応用例Ａと比較例Ｃに使用した分離剤は極めて類似したベースの担体（架橋し たポリメタクリレート）を有しているので、この結果は意外であった。 比較例Ｄ： 従来技術のベンジル置換担体物質による蛋白質の分離 市場入手可能の担体物質（ベンジル置換架橋アガロース）をスーパーフォーマ ンス（登録商標）ガラスカラム（５０×１０ｍｍ）に充填した。試料及びクロマ トグラフィー条件は応用例Ａに記載のものと同じであった。 応用例Ｂとは異なり、これら４つの蛋白質は完全には分離されなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 担体表面にポリマーが共有結合している、ヒドロキシル基を含有するベー スの担体に基ずく、疎水クロマトグラフィーのための分離剤であって、以下： ａ）前記ベース担体が脂肪族ヒドロキシル基を含有し、 ｂ）前記共有結合ポリマーは末端モノマー単位によってベース担体に結合して おり、 ｃ）前記ポリマーは式IIのモノマー単位を含み、 ｄ）前記モノマー単位は線状に連結している、 ［但し、上式中、 Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立にＨ又はＣＨ₃であり、 Ｒ⁴はＨ、Ｃ₁−Ｃ₅−アルキル又はＣ₆−Ｃ₁₂−アリールであり、 ｎは１〜５の間の整数であり、 一方のＸラジカルはＯＨ、かつ、他方のＸラジカルはＺ−Ｒ⁵であり、 ＺはＯ又はＮＨであり、 Ｒ⁵はＣ₁−Ｃ₂₀−アルキル、Ｃ₆−Ｃ₂₅−アリール 、Ｃ₇−Ｃ₂₅−アルキルアリール、あるいは１回又は１回以上、ニトリル又はＣ₁ −Ｃ₅−アルコキシにより誘導することもでき、この際１個以上の非隣接ＣＨ₂基 がＮＨ又はＯによって置き換えることもできるか、さもなければ１個以上のＣＨ 基がＮによって置き換えることができるＣ₇−Ｃ₂₅−アリールアルキルであるか 、又は Ｒ⁵は −［（ＣＨ₂）_m−Ｏ−］_o−Ｒ⁶であり、但し本式中、ｍは２又は３であ り、 ｏは１〜２００の間の整数であり、 Ｒ⁶はＨ又はＣ₁−Ｃ₅−アルキルである。］ を特徴とする前記分離剤。 ２． ２個以上の物質からなる混合物のクロマトグラフィー分離のための請求項 １の特徴を有する分離剤の使用。 ３． 担体上にオキシラン−誘導ポリ（メタ）アクリレートがグラフトしている 、ヒドロキシル基含有ベース担体からなる活性化担体物質を、式III Ｒ⁵−ＯＨ III のアルコール又はフェノールと反応させるか、又は式IV Ｒ⁵−ＮＨ₂ IV ［但し上記２式中、Ｒ⁵は請求項１に定義した意味を有する。］ のアミンと反応させることを特徴とする、疎水相互作用クロマトグラフィーのた めの分離剤の製造方法。 ４． 請求項１に記載の分離剤を使用する、２以上の物質からなる混合物のクロ マトグラフィー分離方法。