JPH09500378A

JPH09500378A - 枝分れされそして複雑に結合された高分子構造体の集中的合成

Info

Publication number: JPH09500378A
Application number: JP7503683A
Authority: JP
Inventors: エム．グリアズノフ，セルゲイ
Original assignee: リンクスセラピューティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 1997-01-14
Also published as: US5571677A; WO1995001365A1; AU7323194A; EP0706531A4; EP0706531A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、分子のプローブとして有用な分枝鎖状ポリマーの集中合成の方法および組成物を提供する。本発明は、また、標的ポリヌクレオチドを検出のために特に有用ないくつかの新規な分枝鎖状ポリマー構造体を包含する。本発明の分枝鎖状ポリマーは少なくとも２つの分枝鎖からなる：少なくとも１つの分枝鎖は問題の標的分子に特異的に結合できる標的結合部分であり、そして１または２以上の分枝鎖は検出可能なシグナルを直接または間接的に発生できるシグナル発生部分である。本発明の方法に従い、分枝鎖状ポリマーをホスホロチオエート基および／またはハロアシル−またはハロアルキルアミノ基を有する成分から組み合わせる。ホスホロチオエート基およびハロアシル−またはハロアルキルアミノ基は、接触させると、急速にかつ効率的に反応して、分枝鎖状ポリマーのアセンブリーを完成するチオホスホリルアシル−またはチオホスホリルアルキルアミノの架橋を形成する。本発明の方法は、最終の組み合わせ前に成分の完全な精製および単離を可能とする。不完全な分枝鎖状ポリマーは、標準の手段により、所望の生成物から容易に分離することができる。本発明の方法は、いくつかの新規な分枝鎖状ポリマーの立体配置の合成をを可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】枝分れされそして複雑に結合された高分子構造体の集中的合成本発明は、一般に、ポリマーの合成に関し、さらに詳しくは、分枝鎖状のおよび多重に結合した高分子構造体、例えば、マクロサイクル(macrocycles)の合成に関する。背景ポリヌクレオチドの検出および分析は、多数の研究、医学的、および工業的分野において重要性が増加するようになってきている、例えば、Caskey、Science 236：1223-1228（1987）；Landegrenら、Science、242：229-237（1988）；およびArnheimら、Ann．Rev．Biochem.、61：131-156(1992)。標的の検出のために相補的標的核酸に対するプローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションを利用する、いくつかの技術が開発されてきている。一般に、このような技術の最も強力なものは、次のものを包含する：標的配列および／またはシグナルの増幅のいくつかの形態、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、Arnheimら（前掲）；結合に基づく増幅、例えば、Barany、PCR Methods and Application１：5-16（1991）；鎖置換増幅、Walkerら、Proc．Natl．Acad．Sci.、89：392-396（1992）；分枝鎖状プローブのシグナルの増幅、Wangら、米国特許第4,925,785号、Urdeaら、米国特許第5,124,246号、Hudsonら、J．Am．Chem．Soc．、115：2119-2124(1993)など。技術の後者のカテゴリーに関すると、現在の方法による分枝鎖プローブ構造体の合成は典型的には困難であり、低い収率を生じ、そして合成の間ように後の収率および生成物の品質を監視する制限された間接的手段のみを提供する。最近、ポリヌクレオチドの検出に対するほとんどの分枝鎖状ポリマーのアプローチは、実際の商業的アッセイの生産にそれら自体適さない。発明の要約本発明は、分枝鎖状ポリマー、および他の分枝鎖状のおよび多重に結合した高分子構造体、例えば、マクロサイクルの製造および使用に関する方法および組成物を提供する。好ましくは、本発明の分枝鎖状のおよび多重に結合した高分子構造体は少なくとも２つの分枝鎖および／またはマクロサイクルからなる：少なくとも１つの分枝鎖またはマクロサイクルは問題の標的分子に特異的に結合できる標的結合部分であり、そして１または２以上の分枝鎖またはマクロサイクルは検出可能なシグナルを直接または間接的に発生できるシグナル発生部分である。好ましくは、本発明の分枝鎖状ポリマーおよびマクロサイクルは、標的結合部分として少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなる。本発明の方法に従うと、分枝鎖状ポリマーおよび他の高分子構造体は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を有する成分およびハロアシル−またはハロアルキルアミノ基を有する成分から組み合わせられる。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基はハロアシル−またはハロアルキルアミノ基と、接触したとき、急速にかつ効率よく反応して、所望の構造体のアセンブリーを完成するチオ−またはジチオホスホリルアシルアミノあるいはチオ−またはジチオホスホリルアルキルアミノの架橋を形成する。本発明の方法は、最終の組み合わせ工程の前に、成分の完全な精製および単離を可能とする。不完全な分枝鎖状ポリマーおよび／または他の不完全な構造体は、標準の手段により所望の生成物から容易に分離される。本発明の重要な面は、チオ− またはジチオホスホリルアシルアミノあるいはチオ−またはジチオホスホリルアシルアミノの架橋が酸化により容易にかつ選択的に切断された、これにより構造体の便利な後合成が可能となることである。本発明の方法は、さらに、いくつかの新規な分枝鎖状ポリマーの立体配置を可能とする。図面の簡単な説明第１ａ図および第１ｂ図は、オリゴヌクレオチドのクランプの態様を線図的に図解する。第２図は、シグナル発生部分を取り付けるための４つの分枝鎖を有する、二重に接続された、あるいはループ型の、分枝鎖状ポリマーの構造を線図的に図解する。第３図は、３つの分枝鎖および３′末端のみを有する、櫛型の分枝鎖状オリゴヌクレオチドポリマーの構造を線図的に図解する。第４図は、３つの分枝鎖および５′末端のみを有する、櫛型の分枝鎖状オリゴヌクレオチドポリマーの構造を線図的に図解する。第５図は、３′および５′末端の両方を有する、櫛型の分枝鎖状オリゴヌクレオチドポリマーの構造を線図的に図解する。第６図は、ポリエチレングリコールのリンカーのアームを介して取り付けられた４つのビオチンの櫛の構造を線図的に図解する。第７図は、実施例13において合成した分枝鎖状DNA分子の構造を線図的に図解する。定義用語「オリゴヌクレオチド」は、ここにおいて使用するとき、モノマー対モノマーの相互作用、例えば、ワトソン−クリック(Watson−Crick)型塩基対合、フーグスティーン(Hoogsteen)型塩基対合などの規則的なパターンで、標的ポリヌクレオチド特異的に結合できる、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー型、ポリアミドの核酸を包含する、天然のまたは修飾されたモノマーまたは連鎖の線状オリゴマーを包含する。通常、モノマーはホスホジエステル結合またはその類似体により連鎖されて、数モノマー単位、例えば、３〜４から、数100モノマー単位までの大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドを文字の配列、例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」により表すときはいつでも、ヌクレオチドは左から右の５′→３′の順序にあることおよび、特記しない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」はチミジン意味を有することが理解されるであろう。ヌクレオシドのモノマーの間のリンの連鎖は、ホスホジエステルの結合およびホスホジエステル結合の類自体、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデートなどを包含する。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオシド」は、２′−デオキシおよび２′ −ヒドロキシル型、例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第２版（ Freeman、サンフランシスコ、1992）に記載されているものを包含する、天然のヌクレオシド、および修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシド、例えば、一般にScheit、Nucleotide Analogs（John Wil ey、ニューヨーク、1980）に記載されているものを包含する、天然のヌクレオシドに対する類似体を包含する。このような類似体は、結合性質、例えば、安定性、特異性などを増強して、分枝点、標識化部分の取り付けなどのための反応的官能性を提供するように設計された合成ヌクレオシドを包含する。共有結合の連鎖および／または結合部分の間の非共有結合の複合体の形成に関する「安定な」は、結合部分の１または２以上の所定の対およびその標的ポリヌクレオチドを組み込んだオリゴヌクレオチドのクランプの溶融温度がクランプ単独のオリゴヌクレオチド部分を越えて少なくとも25％だけ増加することを意味し、ここで溶融温度は標準の技術、例えば、詳しく後述するように、260nm の吸収の１／２最大／温度により測定する。好ましくは、安定は、１また２以上の所定の結合部分の対およびその標的ポリヌクレオチドを組み込むオリゴヌクレオチドのクランプの溶融温度がクランプ単独のオリゴヌクレオチド部分を越えて少なくとも50％だけ増加することを意味する。本発明の標的分子と分枝鎖またはマクロサイクルとの間の複合体の形成に関する「安定な」は、標的分子および分枝鎖またはマクロサイクルの解離速度が検出可能なシグナルん発生を可能とするために十分に低いことを意味する。好ましくは、複合体の解離速度は少なくとも約10^-7Ｍである。より好ましくは、複合体の解離速度は約10^-8〜約10^-11 である。結合部分の反応に関する「連鎖」は、共有結合の連鎖および非共有結合の複合体の両方を包含する。発明の詳細な説明本発明は、分枝鎖状ポリマーおよび分枝鎖状のおよび多重に結合した高分子構造体の便利な合成の方法および組成物に関する。本発明は、また、特に標的ポリヌクレオチドの検出のために有用ないくつかの新規な分枝鎖状ポリマーの構造体を包含する。好ましくは、本発明の分枝鎖状ポリマーおよび分枝鎖状のおよび多重に接続した高分子構造体は、シグナル発生部分および標的結合部分として働く少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分からなる複数のポリマー単位を包含する。１つの面において、いっそう詳しく後述するように、このような標的結合部分はオリゴヌクレオチドのクランプである。一般に、本発明の分枝鎖状ポリマーおよび分枝鎖状のおよび多重に接続した高分子構造体は、組み合わせの前に、別々に合成しそして精製した、複数の成分から組み合わせられる。このような成分それら自体は、分枝鎖状、線状、またはマクロサイクルのポリマー、あるいは３つの組み合わせからなることができ、そして成分の前の組み合わせおよび単離の生成物であることができる。通常、成分は、分枝鎖状ポリマーの分枝鎖を形成できるか、あるいは自己結合してループまたはマクロサイクルを形成できる、線状のポリマー単位から構成される。本発明の分枝鎖状ポリマーは櫛型の分枝鎖状ポリマーを包含し、これらのポリマーは内部のモノマーおよび／または連鎖部分に位置する１または２以上の分枝点をもつ線状ポリマー単位からなる。本発明の分枝鎖状ポリマーは、末端のモノマーおよび／または連鎖部分に位置する１または２以上の分枝点をもつ線状ポリマー単位からなる。本発明の分枝鎖状のおよび多重に接続した高分子構造体は、次のものを包含する：マクロサイクル、例えば、ここで２つの線状ポリマーは二重に接続されて、共有結合で閉じた円形ポリマー構造体を形成する；分枝鎖をもつマクロサイクル、例えば、下の実施例に開示されているもの；多重に接続されたマクロサイクル、例えば、２つの異なる位置でマクロサイクルに接続する末端を有する、単一の分枝鎖をもつマクロサイクル、および同様な構造体。本発明の分枝鎖状ポリマーおよび他の分枝鎖状のおよび多重に接続した高分子構造体は、種々の用途、例えば、分子プローブとしての用途を有する。本発明の化合物は、さらに、一定の電荷／質量の比を有するポリマー化合物、例えば、ポリヌクレオチドの電気泳動の移動度を変化させる部分として有用である、例えば、Noolandi、Electrophoresis 、13：394-395（1992）；Van Alsti ne、米国特許第 5,108,568号；Livakら、Nucleic Acids Research、20 ： 4831- 4837（1992）；など。ポリマー単位好ましくは、本発明の線状ポリマー単位は、式： −（Ｍ−Ｌ）_n − を有し、式中、Ｌはリンカー部分であり、そしてＭは不活性の非立体障害性スペーサー部分として働くことから、次のものとして働くことができる反応官能性を提供するまでの広い範囲の化学構造体から選択することができる：他の成分を取り付けるための分枝点；標識を取り付けするための部位；増幅因子の鎖または構造体に対するハイブリダイゼーションまたは結合のためにオリゴヌクレオチドまた他の結合ポリマーを取り付けるための部位、例えば、Urdea ら、米国特許第 5 ,124,246号またWangら、米国特許第 4,925,785号に記載されているような部位；「フック」を取り付けるための部位、例えば、Whitcleyら、米国特許第 4,883,7 50号に記載されているような部位；または溶解度、二重らせんおよび／または三重らせんの形成の促進に影響を与える他の基、例えば、インターカレーター、アルキル化剤を取り付けるための部位など。次の言及は本発明における使用に適当ないくつかのホスホルアミダイトおよび／または水素ホスホネートモノマーを開示し、そしてそれらの合成およびオリゴヌクレオチドの中へのそれらの含有の手引きを提供する：Newtonら、Nucleic Acids Research、21：1155-1162（1993）；Griffn ら、 J．Am．Chem．Soc．、114：7976-7982（1992）；Jaschkeら、Tetrahedron Lette rs、34：301-304（1992）；Maら、国際出願 PCT／CA92／00423；Zon ら、国際出願PCT／US90／06630；Durandら、Nucleic Acids Research、18：6353-6359（199 0）；Salunkheら、J．Am．Chem．Soc．、114：8768-8772（1992）；Urdeaら、米国特許第 5,093,232号；Ruthら、米国特許第 4,948,882号；Cruickshank、米国特許第 5,091,519号；Haralambidisら、Nucleic Acids Research、15：4857-487 6（1987）；など。さらに詳しくは、Ｍは１〜20個の炭素原子および０〜10個の酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される異種原子を含有する直鎖状、環状または分枝鎖状の有機分子構造体であである。好ましくは、Ｍは１〜16個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニルまたはアリール；３〜８個の炭素原子および１〜３個の酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される異種原子を含有するヘテロサイクル；グリコシル；またはヌクレオシジルである。より好ましくは、Ｍは１〜８個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニルまたはアリール；グリコシル；またはヌクレオシジルである。好ましくは、Ｌはリン（Ｖ）の連鎖基であり、これはホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルまたはエチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびホスホロアミデートなどであることができる。一般に、ホスホルアミダイトまたは水素ホスホネートの前駆体から誘導された連鎖は、本発明の線状ポリマー単位を商用自動 DNA合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Applied Biosystems，Inc.）（カリフォルニア州フォスターシティー）の 394型などで便利に合成できるので、好ましい。ｎはＭおよびＬの特質に依存して有意に変化することができる。通常、ｎは約３から約 100まで変化する。Ｍがヌクレオシドまたはその類似体あるいはヌクレオシドの大きさのモノマーでありそしてＬがリン（Ｖ）連鎖であるとき、ｎは約12〜約 100まで変化する。好ましくは、Ｍがヌクレオシドまたはその類似体あるいはヌクレオシドの大きさのモノマーでありそしてＬがリン（Ｖ）連鎖であるとき、ｎは約12から約40まで変化する。本発明によれば、分枝鎖状ポリマーの少なくとも１つの成分は標的結合部分として働くオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは所望の標的分子に特異的にかつ安定に結合するように選択される。通常、所望の標的分子はタンパク質またはその一部分、またはエピトープあるいはポリヌクレオチドであろう。結合の特異性はポリヌクレオチドの場合において塩基特異的結合により達成することができるか、あるいは異なる機構により、例えば、炭水化物、タンパク質、および他の構造体、ならびにポリヌクレオチドを包含することができる、一般的高分子構造体に結合するアプタマー(aptamer)で達成することができる。後者の場合において、オリゴヌクレオチド部分の配列は、Ellington およびSz ostak 、Nature、346：818-822（1990）；Tooleら、国際出願 PCT／US92／01383 ；などにより教示されるように選択することができる。好ましくは、その標的に対する標的結合部分の親和性は、解離定数により測定して、少なくとも10^-7Ｍであり、そしてより好ましくは、約10^-8〜約10^-11 Ｍである。結合特異性が塩基の対合により達成されるとき、このような対合はワトソン− クリック（Watson−Crick ）対合および／またはフーグスティーン(Hoogsteen) 対合であることができる。好ましくは、ポリヌクレオチドの標的の場合における結合の特異性はワトソン−クリック（Watson−Crick ）対合およびフーグスティーン(Hoogst een)対合の両方により、オリゴヌクレオチドのクランプを使用して達成される。分枝鎖状ポリマーのオリゴヌクレオチド部分は、商業的に入手可能な自動 DNA 合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティー）の 392型または 394型 DNA／RNA 合成装置を使用して普通の手段により合成することができる。好ましくは、ホスホルアミダイトの化学を、例えば、次の参考文献に開示されているように、使用する：Be aucageおよびIycr、Tetrahedron 、48：2223-2311（1992）；Molko ら、米国特許第 4,980,460号；Kosterら、米国特許第 4,725,677号；Caruthers ら、米国特許第 4,415,732号；米国特許第 4,458,066号；および米国特許第 4,973,679号など。いくつかの応用のために、ヌクレアーゼ耐性主鎖は好ましいことがある。ヌクレアーゼ耐性を付与する多数の型の修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミテートなどは入手可能であり、多数の参考文献に記載されている、例えば、ホスホロチオエート：Stecら、米国特許第 5,151,510号；Hirschbein、米国特許第 5,166,387号；Bergot、米国特許第 5,183,885号；ホスホルアミデート：Froehlerら、国際出願PCT／US90／0 3138；および追加の適用可能な化学の概観について、Uhlmann およびPeyman（前掲）。本発明によれば、分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体は、シグナル発生部分からなる複数のポリマー単位からなる。それらの部分は、普通の手段により検出できるシグナル、例えば、蛍光、熱量測定、放射能などを直接または間接的に発生する高分子構造体である。直接のシグナル発生は、シグナルを生成する部分が分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体に、例えば、蛍光色素、酵素などの共有結合の取り付けにより共有結合で連鎖されることを意味する。間接的シグナル発生は、構造体がシグナルを発生する多成分系の１つの成分、例えば、標識化アビジンタンパク質への結合のためのビオチン部分からなるポリマー単位、共有結合的に取り付けられた蛍光色素を有する相補的オリゴヌクレオチド（他の分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体の一部分であることができる）にアニーリングするオリゴヌクレオチド部分などであることを意味する。好ましくは、シグナル発生部分は、約12〜約50ヌクレオチドの長さの第１オリゴヌクレオチドからなる。この好ましい態様の１つの面において、シグナルは、第１オリゴヌクレオチドに対して相補的でありかつ共有結合的に取り付けられた蛍光色素を有する第２オリゴヌクレオチドを準備することによって、間接的に発生される。オリゴヌクレオチドへの蛍光色素の取り付けはこの分野においてよく知られている、例えば、米国特許第 4,997,828号；米国特許第 5,151,507号；米国特許第 4,855,225号；米国特許第 5,188,934号；Eckstein、編者（前掲）；など。分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体に取り付けられたシグナル発生部分の数は、発生するシグナル特質、標的分子を含有する試料の特質などを包含するいくつかの因子に依存する。好ましくは、プローブとして使用する分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体は約２〜約15〜20のシグナル発生部分からなる。より好ましくは、それは２〜約10のシグナル発生部分からなる。集中的アセンブリーポリマー単位はそれらの間の１または２以上の共通結合の架橋により組み合わせられる。好ましくは、１または２以上の成分上のチオール、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートを１または２以上の他の成分上のハロアシル−またはハロアルキルアミノ基と反応させて、１または２以上のチオ−またはジチオホスホリルアシルアミノまたはチオ−またはジチオホスホリルアルキルアミノの架橋を形成することによおって、架橋は形成される。一般に、このような架橋は次の形態の１つを有する： ...−NHRSP(＝Z)(O^-)O−... または ...−NHRS−... 式中ＲはアルキルまたはアシルでありそしてＺは硫黄または酸素である。アセンブリー反応は特定の態様に依存して２〜20の成分を含むことができる；しかし好ましくは、それは２〜８の成分を含む；そしてより好ましくは、それは２〜４つの成分を含む。好ましくは、ハロアシル−またはハロアルキルアミノ基はハロアセチルアミノ基である；そしてより好ましくは、ハロアセチルアミノ基はブロモアアセチルアミノ基である。ハロアシル−またはハロアルキルアミノ基のアシルまたはアルキル部分は１〜12個の炭素原子を含有する；そしてより好ましくは、このような部分は１〜８個の炭素原子を含有する。反応は広い範囲の溶媒の中で起こることができる；しかし、一般に、アセンブリー反応は液状水性条件下にあるいは、例えば、液状水性反応混合物の温度を低下させることによって得られる、氷の中の凍結状態で起こる。あるいは、DMSO／H₂Oの中のチオホスホリルアセチルアミノ架橋の形成は、次の参考文献により報告された：Thuongら、Tetrahed ron Letters 、28：4157-4160（1978）；およびFrancoisら、Proc．Natl．Acad ．Sci.、86：9702-9706（1989）。典型的な水性条件は、25mMのNaClおよび15mM のリン酸塩緩衝液(pH7.0)の中の４Ｍの反応成分を包含する。チオ−またはジチオホスホリルアシルアミノ−あるいはチオ−またはジチオホスホリルアルキルアミノの架橋は、酸化剤、例えば、硝酸銀、ヨウ化カリウムウムなどにより容易にかつ選択的に切断することができるので、好ましい。好ましくは、架橋はヨウ化カリウムウム、KI₃ で約 100モル過剰量の架橋に等しい濃度において切断される。通常、KI₃ は約 0.1Ｍの濃度において使用される。これらの架橋の御しやすい切断は、最終生成物を分析しそして最終生成物が正しいことを確証する便利な方法を提供するので、複雑な高分子構造体の合成において大きい利点である。３′−ハロアシル−またはハロアルキルアミノ（この実施例において、ハロアセチルアミノ）誘導化オリゴヌクレオチド１を、次の反応の概要に従い５′−ホスホロチオエート誘導化オリゴヌクレオチド２と反応させる：式中、Ｘはハロであり、そしてＮ₁ 、Ｎ₂ 、．．．Ｎ_j およびＮ_k は、それぞれ、ｊ−マーおよびｋ−マーのヌクレオチドである。ヌクレオチドは前述のより一般的ポリマー単位、（Ｍ−Ｌ）ｎの単なる典型であることが理解される。化合物１は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF)中のＮ−スクシニミジルハロアセテートをホウ酸ナトリウム緩衝液中の３′−アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体と室温において反応させることによって製造することができる。約35分後、混合物を希釈し（例えば、H₂O で）、脱塩しそして、例えば、逆相HPLCにより精製する。３′−アミノデオキシリボヌクレオチドは、GryaznovおよびLetsinger 、 Nucleic Acids Research、20：3403-3409（1992）に記載されているように製造することができる。簡単に述べると、脱保護後、標準のスクシニル連鎖を介して支持体連鎖したデオキシチミジンの５′ヒドロキシルを、適当な溶媒、例えば、ジクロロメタン／ジイソプロピルエチルアミン中のクロロ−（ジイソプロピルエチルアミノ）−メトキシホスフィンとの反応により、ホスフィチル化する。テトラゾールを使用する活性化後、５′−ホスフィチル化チミジンを５′−トリチル −Ｏ−３′−アミノ−３′−デオキシヌクレオシドと反応させてヌクレオシド− チミジンの二量体を形成し、ここでヌクレオシド部分はホスホルアミデート連鎖により共有結合的に接合される。オリゴヌクレオチドの残部を標準のホスホルアミダイト化学により合成する。スクシニル連鎖を切断した後、酸処理、例えば、 80％の水性酢酸で室温において18〜20時間の間処理してホスホルアミデート連鎖を切断することによって、３′末端アミノ基をもつオリゴヌクレオチドを発生させる。５′モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２は次のようにして形成する：５′モノホスフェートをオリゴヌクレオチドの５′末端に化学的にあるいはキナーゼで酵素的に取り付ける、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Lab oratory Manual 、第２版（Cold Spring Harbor Laboratory 、ニューヨーク、1 989）。好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の最終工程において、モノホスフェートを次の参考文献に記載されているように化学的リン酸化により付加する： ThuongおよびAsselinc、Chapter 12、Eckstein編、Oligonucleotides and Analo gues（IRL Press 、Oxford、1991）またはHorn and Urdea、Tetrahedron Lett．、27：4705(1986)（例えば、商業的に入手可能な試薬、例えば、Clontech Labor atories （カリフォルニア州パロアルト）からの５′ Phosphatc−ON^TMを使用して）。次いで、５′−モノホスフェートを普通の硫黄化を使用して、例えば、ピリジン／CS₂ のＳ₈ の５％溶液（１：１、ｖ／ｖ、室温において45分間）で処理するか、あるいは米国特許第 5,003,097号；米国特許第 5,151,510号；または米国特許第 5,166,387号に記載されている硫黄化剤で処理することによって硫黄化する。モノホスホロジチオエートは、類似の手順、例えば、Frochlerら、欧州特許公開第0 360 609 A2号；Caruthers ら、国際出願 PCT／Ｔ／US89／02293 ；などにより製造される。上と同様に、５′−ハロアセチルアミノ誘導化オリゴヌクレオチド３を次の反応の概要に従い３′−モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド４と反応させる：式中、記号は上と同一に定義されるが、ただしｊ−およびｋ−マーのヌクレオチドモノマーは反対の向きである。この場合において、化合物３は、３′−アミノオリゴヌクレオチドについて前述したように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(D MF)中のＮ−スクシニミジルハロアセテートをホウ酸ナトリウム緩衝液の中の５ ′−アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体と反応させることによって製造される。５′−アミノデオキシリボヌクレオチドは、次の参考文献に記載されているように製造される：Glinski らJ．Chem．Soc．Chem．COmm．、915-916（1970）；Millerら、J．Org．Chm．29：1772（1964）；Ozols ら、Synthesis 、７：557 -559（1980）；およびAzhayev ら、Nucleic Acids Research、6：625-643（1979 ）；これをここに引用によって加える。３′−モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド４は、ThuongおよびAsseli ne（前掲）に記載されているように製造することができる。オリゴヌクレオチド１および４および２および３を反応させて、それぞれ、２つの５′末端または２つの３′末端を有するポリマー単位を形成することができる。分枝鎖の取り付けのための反応官能性は種々の部位に導入することができる。好ましくは、アミノ官能性はポリマー単位またはループの上に選択したモノマーまたは連鎖部分において導入し、次いでこれらを前述したようにハロアセチルアミノ基に変換する。ヌクレオシドモノマーのアミノ誘導化塩基を、次の参考文献に教示されているように、導入することができる：Urdea ら、米国特許第 5,093 ,232号；Ruth、米国特許第 4,948,882号；Haralambidisら、Nucleic Acids Rese arch、15：4857-4876（1987）；など。アミノ官能性は、また、クロンテク・ラボラトリーズ(Clontech Laboratories)（カリフォルニア州パロアルト）からAmi noModifier Il^TMとして商業的に入手可能な保護されたヒドロキシアミノホスホルアミダイトにより導入することができる。好ましくは、アミノ官能性は、例えば、Agrawal ら、Nucleic Acids Research、18：5419-5423(1990)；およびJager ら、Biochemistry、27： 7237-7246（1988）により教示されているように、ホスファイト連鎖をＩ₂ およびアルキルジアミンで酸化することによって、誘導化ホスホルアミデート連鎖を発生させることによって導入される。一般に、上に手順のために、ハロアシル−またはハロアルキルアミノ基誘導化ポリマー単位はホスホロチオエート誘導化ポリマー単位から別々に製造することが好ましい、そうでなければホスホロチオエート部分は保護基を必要とする。マクロサイクル、またはポリマーのループは、いくつかのアプローチにより、例えば、Prakash およびKool、J．Am．Chem．Soc．、114：3523-3527(1992)；Ru nneyおよびKool、Angew．Chem．Int． Ed Engl.、31：1617（1992）；などに記載されているように合成することができる。簡単に述べると、これらの方法に従い、線状ポリマー単位を前述したように合成し、次いで５′末端のヒドロキシルをリン酸化する。次いで、線状ポリマーの３′および５′末端を並列させる相補的鋳型と線状ポリマーと組み合わせ、ここでそれらの末端を水性臭化シアン／イミダゾール／Ni²⁺を使用して結合する。このような結合は、また、商業的に入手可能なリガーゼのために普通の条件下に酵素的に達成することができる。本発明の１つの面において、ポリマーのループを別々に製造した２またはそれ以上の線状ポリマー単位から組み合わせそして、下に示すように、ホスホロチオエート官能性で、あるいはハロアシル−またはハロアルキルアミノ基官能性でもっぱら誘導化する：ここでＸ、Ｎ₁ 、Ｎ₂ などは上に定義した通りである。単位の相対的向きが重要でない場合、ポリマー単位５および６を溶液の中で組み合わせ、次いで凍結させか、あるいはそれらを１または２以上の鋳型と組み合わせて適当な末端を結合のために並列させることによって、ポリマー単位５および６を組み合わせる。明らかなように、後者のアプローチは、前述したように、ポリマーのループが機能するための鋳型のためのオリゴヌクレオチド部分を含有することを必要とする。好ましくは、鋳型の鎖は約12から約20〜40ヌクレオチドまでの間の長さを有する。オリゴヌクレオチドのクランプ好ましくは、分枝鎖状ポリマーの標的結合部分はオリゴヌクレオチドのクランプであり、これは標的ポリヌクレオチドに特異的に結合した後、共有結合的に閉じたマクロサイクルまたは安定な円形複合体を形成できる化合物である。一般に、オリゴヌクレオチドのクランプは、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合できる１または２以上のオリゴヌクレオチド部分およびオリゴヌクレオチド部分に共有結合的に連鎖した１または２以上の結合部分からなる。標的ポリヌクレオチドにオリゴヌクレオチド部分をアニーリングすると、対の結合部分は並列にされるので、安定な共有結合または非共有結合の連鎖または複合体を形成する。１または２以上の対の結合部分の相互作用は、特異的にアニーリングしたオリゴヌクレオチド部分を標的ポリヌクレオチドに効果的にクランプする。１つの好ましい形態において、オリゴヌクレオチドのクランプは、例えば、次の式の特定の態様により表されるように、第１結合部分、第１オリゴヌクレオチド部分、ヒンジ領域、第２オリゴヌクレオチド部分、および第２結合部分からなる：Ｘ−Ｏ₁−Ｇ−Ｏ₂−Ｙ式中、Ｏ₁ およびＯ₂ は第１および第２オリゴヌクレオチド部分であり、Ｇはヒンジ領域であり、Ｘは第１結合部分であり、そしてＹは第２結合部分であり、こうして第１ａ図に線図で図解するように、オリゴヌクレオチド部分を標的ポリヌクレオチドにアニーリングすることによってＸおよびＹが並列されるときはいつでも、それらは安定な共有結合または非共有結合の連鎖または複合体を形成する。好ましくは、この態様において、Ｏ₁ またはＯ₂ の一方は標的ポリヌクレオチドとワトソン−クリック（Watson−Crick ）結合を行うが、Ｏ₁ およびＯ₂ の他方はフーグスティーン(Hoogsteen)結合を行う。他の好ましい形態において、オリゴヌクレオチドのクランプは、例えば、次の式の特定の態様により表されるように、第１結合部分、第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチド部分、第１および第２のヒンジ領域、、および第２結合部分からなる：Ｘ−Ｏ₁−Ｇ₁−Ｏ₂−Ｇ₂−Ｏ₃−Ｙ式中、ＸおよびＹは前述した通りであり、Ｇ₁ およびＧ₂ は第１および第２のヒンジであり、そしてＯ₁ 、Ｏ₂ およびＯ₃ は第１〜第３のオリゴヌクレオチド部分である。好ましくは、Ｏ₁ 、Ｏ₂ 、およびＯ₃ は、Ｏ₁ およびＯ₂ とＯ₃ およびＯ₂ が、第１ｂ図は線図で図解するように、標的ポリヌクレオチドと三重構造体を形成するように、選択される。三重らせんの形成を望む態様において、標的配列の選択について限定が存在する。一般にフーグスティーン(Hoogsteen)型の結合を介する第３の連合は、二本鎖の標的におけるホモピリミジン−ホモプリンのトラックに沿って最も安定である。通常、塩基のトリプレットはＴ−Ａ＊ＴまたはＣ−Ｇ＊Ｃモチーフ（ここで「−」はワトソン−クリック（Watson−Crick ）の対合を示し、そして「＊」はフーグスティーン(Hoogsteen)型の結合を示す）で形成する；しかしながら、他のモチーフも可能である。例えば、フーグスティーン(Hoogsteen)塩基対合は、第３鎖（フーグスティーン(Hoogsteen)鎖）と第３鎖が結合する二重らせんのプリンに富んだ鎖との間で、鎖の状態および組成に依存して、平行および逆平行の向きを可能とする。特定の態様において望むように三重らせんの安定性を最大とするか、あるいはそうでなければ調節するために、適当な配列、向き、状態、ヌクレオシドの型（例えば、リボースまたはデオキシリボースのヌクレオシドを使用するかどうか）、塩基の修飾（例えば、メチル化シトシンなど）を選択するための広範な手引きが文献の中に存在する、例えば、Roberts ら、Proc．Natl．Acad．Sci.、88：9397-9401(1991)；Rober ts ら、Science 、258 ：1463-1466(1992)；Distefano ら、Proc．Natl．Acad． Sci.、90：1179-1183(1993)；Mcrgnyら、Biochemistry、30：9791-9798(1991)； Cheng ら、J．Am．Chem．Soc．、114 ：4465-4474(1992)；BealおよびDervan、N ucleic Acids Research、20：2773-2776(1992)；BealおよびDervan、J．Am．Che m．Soc．、114 ：4976-4982(1992)；Giovannangeli ら、Proc．Natl．Acad．Sci .、89：8631-8635(1992)；Moser およびDervan、Science 、238 ：645-650(1987 )；McShanら、J. Biol．Chem.、267 ：5712-5721(1992)；Yoonら、Proc．Natl． Acad．Sci.、89：3840-3844(1992)：Blume ら、Nucleic Acids Research、20：1 777-1784(1992)；など。一般に、オリゴヌクレオチド部分の１つが標的ポリヌクレオチドにおいてピリミジンに富んだまたはプリンに富んだトラックをもつワトソン−クリック（Watson−Crick ）二重らせんを形成した後、残りのオリゴヌクレオチドの成分は二重らせんの主要なみぞに結合して三重らせん構造体を形成する。三重らせんを形成するための特定のオリゴヌクレオチドの配列の選択は、また実験的に、例えば、アプトマーのスクリーニングなどの方法により実施することができ、ここで候補のオリゴヌクレオチド部分は固定化された二本鎖の標的に対する結合の強さに基づいて選択される、例えば、ElingtonおよびSzostak 、Natu re、346：818-822(1990)；Toole ら、国際出願PCT／US90／01383；など。標的ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖の DNAまたは RNAであることができる；しかしながら、一本鎖の DNAまたは RNAの標的ポリヌクレオチドは好ましい。好ましくは、オリゴヌクレオチドのクランプ／標的ポリヌクレオチドの複合体の安定性は、溶融、または鎖の解離の曲線により決定される。50％の解離の温度を溶融温度、Tm、として取り、次いでこれを安定性の便利な測定を提供する。Tm の測定は、典型的には、生理食塩水の中で中性のpHにおいて約1.0〜2.0 Ｍの標的およびクランプの濃度で実施される。典型的な条件は次の通りである：10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)または10mMのTris−HCl 緩衝液(pH7.0)中の150m M のNaClおよび10mMのMgCl₂ ；などの条件。溶融曲線のためのデータは、オリゴヌクレオチドのクランプ／標的ポリヌクレオチドの複合体の試料を室温から約85 〜90℃に加熱することによって蓄積する。試料の温度が増加するにつれて、260n m の光の吸収を１℃の間隔で、例えば、カリイ（Cary）（オーストラリア）１Ｅ型またはヘウレット−パッカード（Hewlett−Packerd）（カリフォルニア州パロアルト）HP8459型UV／VIS分光光度計およびHP89100A型温度制御装置などの計器を使用して監視する。オリゴヌクレオチド部分の長さを十分に長くして、特異的結合が他の偶発性の部位においてではなく所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ起こることを保証する。長さの上に範囲は、約30〜40ヌクレオチドより大きい長さのオリゴマーを合成しそして精製する不便さおよび経費、短いオリゴヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチドのより大きい耐性などを包含する、いくつかの因子により決定される。好ましくは、オリゴヌクレオチド部分は約６〜40ヌクレオチドの範囲の長さを有する。より好ましくは、オリゴヌクレオチド部分は約12〜25ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ヒンジ領域は、オリゴヌクレオチド部分のモノマーと標的ポリヌクレオチドのそれらの相補的ヌクレオチドとの特異的結合を好ましくは促進する、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのポリマーから成る。一般に、オリゴヌクレオチド部分はヒンジ領域および／または結合部分に５′→３′または３′→５′で接続することができる。例えば、第１結合部分、第１オリゴヌクレオチド部分、ヒンジ領域、第２オリゴヌクレオチド部分、および第２結合部分からなる前述の態様において、オリゴヌクレオチド部分は任意の次の向きを有する： X-(5')N₁N₂N₃-...-N_j(3')-G-(5')N₁N₂N₃-...-N_k(3')-Y または X-(5')N₁N₂N₃-...-N_j(3')-G-(3')N_kN_k-1N_k-2-...-N₁(5')-Y または X-(3')N_jN_j-1N_j-2-...-N₁(5')-G-(5')N₁N₂N₃-...-N_k(3')-Y または X-(3')N_jN_j-1N_j-2-...-N₁(5')-G-(3')N_kN_k-1N_k-2-...-N₁(5')-Y ここでＮ₁ Ｎ₂ Ｎ₃ −．．．−Ｎ_k およびＮ₁ Ｎ₂ Ｎ₃ −．．．−Ｎ_j は示した向きにおけるｋ−マーおよびｊ−マーのオリゴヌクレオチド部分である。好ましくは、ヒンジ領域は、次の例外を除外して、前述の線状ポリマー単位の一般的形態を有する：ｎは10またはそれ以上の炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、および／またはエーテルからなるＭについての１、例えば、Salunkhe ら、J．Am．Chem．Soc．、114：8768-8772(1992)から、２〜３個の炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、および／またはエーテルからなるＭについての10 まで変化する。好ましくは、全体的にアルキル鎖（および連鎖部分）から成るヒンジＭのについて、このようなアルキルは８〜15個の炭素原子、より好ましくは９〜12個の炭素原子を含有する。好ましくは、ヌクレオシドの大きさのモノマーについて、ｎは約３〜約10の間で変化する；そしてより好ましくは、ｎは約４〜８の間で変化する。種々の結合部分は本発明とともに使用するために適当である。一般に、それらは対で使用され、これらはここで便宜上ＸおよびＹと呼ぶ。ＸおよびＹは同一であるか、あるいは異なることができる。ＸおよびＹの相互作用は安定な疎水性複合体の形成に基づくときはいつでも、ＸおよびＹは親油性基であり、アルキル基、脂肪酸、脂肪族アルコール、ステロイド、ワックス、脂肪可溶性ビタミンなどを包含する。他の典型的な親油性結合部分は、グリセリド、グリセリルエーテル、リン脂質、スフィンゴ脂質、テルペンなどを包含する。このような態様において、ＸおよびＹは好ましくは19〜30個の炭素原子、および０〜６個の酸素原子を有する誘導化パーヒドロシクロペンタノフェナントレン核から成るステロイド；６〜16個の炭素原子を有するアルキル；ビタミンＥ；および20〜40個の炭素原子を有するグリセリドの群から選択される。好ましくは、パーヒドロシクロペンタノフェナントレンに基づく部分はヒドロキシル基を通して、エーテルまたはエステルとして、そのＣ３位置において取り付けられている。ＸおよびＹはそれをオリゴヌクレオチド部分に接続する連鎖基を含むことができることが理解される。例えば、グリセリドは、例えば、MacKellar ら、Nucleic Acids Research、20： 3411-3417(1992)などに記載されているように、ホスホグリセリドを包含する。親油性部分、例えば、パーヒドロシクロペンタノフェナントレン誘導体はオリゴヌクレオチド部分の５′炭素および／または３′炭素に、短いが柔軟なリンカーにより連鎖されていることが殊に好ましく、このようなリンカーは親油性部分がオリゴヌクレオチドのクランプ／標的ポリヌクレオチドの複合体または同一または他のオリゴヌクレオチド部分上の親油性部分の塩基と相互作用できるようにする。このようなリンカーは、ホスフェート（すなわち、ホスホジエステル）、ホスホルアミデート、ヒドロキシウレタン、カルボキシアミノアルキルおよびカルボキシアミノアルキルホスフェートのリンカーなどを包含する。好ましくは、このようなリンカーは２〜８個以下の炭素原子を有する。結合部分はある数の利用可能化学によりオリゴヌクレオチド部分に取り付けることができる。一般に、オリゴヌクレオチドは最初にその３′および／または５ ′末端において反応性官能基、例えば、アミノ、ホスフェート、チオホスフェート、またはチオール基で誘導化することが好ましい。誘導化後、親水性または疎水性の部分を反応性官能基を介してオリゴヌクレオチドに結合される。３′または５′反応性官能基をオリゴヌクレオチドに取り付ける典型的な手段は、次の文献に開示されている：Fungら米国特許第 5,212,304号；Connolly、Nucleic Acid s Research、13：4485-4502(1985)；Tino、国際出願PCT／US91／09657 ；Nelson ら、Nucleic Acids Research、17：7187-7194(1989)；Stabinsky 、米国特許第 4,739,044号；Gupha ら、Nucleic Acids Research、19：3019（1991）；Reedら、国際出願 PCT／US91／06143 ；Zuckerman ら、Nucleic Acids Research、15： 5305（1987）；Eckstein、編者、Oligonucleotides and Analogues：A Practica l Approach（IRL Press Oxford、1991）；Clontech 1992 ／1993 Catalog（Clon tech Laboratories 、カリフォルニア州パロアルト）；などの参考文献。好ましくは、ＸおよびＹが共有結合の連鎖を形成するときはいつでも、ＸおよびＹは並列にすると特異的に互いに反応しなくてはならないが、そうでなければそれらは細胞の環境の中に存在する化学的基と実質的に非反応性でなくてはならない。本発明のこの面において、ＸおよびＹの対は好ましくは次の群から選択される：ＸまたはＹの一方がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートであるとき、他方はハロアセチル、ハロアシル、ハロアルキル、またはアルキルアジドである；ＸまたはＹの一方がチオールであるとき、他方はヨウ化アルキル、ハロアシル、またはハロアセチルである；ＸまたＹの一方がフェニルアジドであるとき、他方はフェニルアジドである。より好ましくは、ＸまたはＹの一方がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートであるとき、他方はハロアセチル、ハロアシルまたはハロアルキルであり、ここで前記アルキル、アセチル、またはアシル部分は１〜８個の炭素原子を包含する。いくつかの態様において、ＸおよびＹは活性化剤の存在下に共有結合の連鎖を形成することができる。すなわち、結合部分の一方または両方は、活性化剤または縮合剤、例えば、放射能、還元剤、酸化剤などへの暴露により、活性化されるか、あるいは互いに対して反応性とされる。活性化剤を使用して典型的な結合部分は、次のものを包含する：K₃Fe(CN)₆ またはKI₃ の存在下のチオホスホリル基、例えば、GryaznovおよびLetsinger 、Nucleic Acids Research、21：1403-140 8(1993)；Ｎ−シアノイミダゾールのの存在下のホスホリルおよびヒドロキシル、例えば、Luebkeら、J．Am．Chem．Soc．、113：7447-7448(1991)；臭化シアンの存在下のホスホリルまたはアミノ基およびヒドロキシル、例えば、Sokolva ら、FEBS Letters、232：153-155(1988)；スペルミン−５−（Ｎ−エチルイミダゾール）カルボキシアミドおよびシアノイミダゾールの存在下のホスホリルおよびヒドロキシル基、例えば、Zuber ら、J．Am．Chem．Soc．、115：4939-4940(199 3)；など。ポリヌクレオチドの検出アッセイ本発明の分枝鎖状ポリマーは、広い範囲の試料の中の１または２以上の標的分子、殊に標的ポリヌクレオチドの存在を検出する診断プローブとして使用され、このような試料は環境の試料、例えば、公共の水の供給設備からの試料、食物からの試料、および他の生物学的試料、例えば、血液、唾液、精液、羊水、植物または動物の組織のホモジネート、あるいはヒトの患者の組織のホモジネートなどを包含する。ヒトの診断、法医学、および遺伝子分析における核酸プローブの使用は広範に概観されている。例えば、次の参考文献は本発明を有用に使用できる核酸プローブの多数の診断の応用を記載している：Caskey、Science 236；1223-1228(1987)；Landegren ら、Science 、 242：229-237(1988)；およびArnheim ら、Ann．Rev．Biochem.、61：131-156(19 92)。そのうえ、本発明の実施に適用可能な、ハイブリダイゼーション条件、標識化手段などの選択に関する文献の中に広範な手引きが存在する。例えは、Wall ace ら、Nucleic Acids Research 6：3543-3557（1979）；Crothersら、J．Mol ．Biol．９：1-9(1964)；Gotoh 、Adv．Biophys．16：1-52(1983)；Wetmer 、Cr itical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 26：227-259（1991）；Breshlauer ら、Proc．Natl．Acad．Sci．83：3746-3750（1986）；Wolf ら、 Nucleic Acids Research、15：2911-2926（1987）；McGrawら、Biotechniques 、８：674-678(1990)など。本発明の分枝鎖状ポリマーは本質的に任意の既知の溶液または固相のハイブリダイゼーションのフォーマット、例えば、分析物をオリゴヌクレオチドに結合し、次いでこれを固相に結合させるフォーマットにおいて使用することができる。ヒンジ領域に取り付けられたオリゴヌクレオチド「テイル」を有するオリゴヌクレオチドのクランプは、分枝鎖状ポリマーの増幅のスキーム、例えば、本発明のものおよび Urdeaら、米国特許第 5,124,246号；Wangら、米国特許第 4,925,785 号；などに開示されているものと組み合わせて特に有用である。Urdea およびWa ngらをこのようなハイブリダイゼーションアッセイの記載について引用によって加える。このような態様において、オリゴヌクレオチドのクランプは、問題の標的ポリヌクレオチドの分析物に結合することによって、高度に安定な「捕捉」プローブとして働く。次いで、オリゴヌクレオチドのテイルは直接または間接的に標識化したアンプリファイアーの鎖または複合体とハイブリダイゼーションする。このようなテイルは、アンプリファイアー鎖と安定な二重らせんを形成するために十分に長い。好ましくは、このようなテイルは18〜60ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドのテイルは、ホスホルアミデートの連鎖またはアミノ誘導化モノマー、例えば、クロンテク・ラボラトリーズ(Clontech Laboratories)（カリフォルニア州パロアルト）から入手可能なAminoModifier IIにおいてヒンジ領域にカップリングすることができる。ポリマー単位について前述したように、アミノ基をハロアセチルアミノなどの基に変換し、次いで前述したように５′または３′ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を有するオリゴヌクレオチドと反応させて、チオホスホリルアセチルアミノなどの架橋を形成することができる。一般に、分子プローブとしての本発明の分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体の使用は、（ｉ）１または２以上の化合物を試料を、より詳細に後述する、複合化緩衝液と接触させ、（ii）特異的に結合した化合物を非特異的に結合したまたは過剰の化合物から分離し、そして（iii）特異的に結合した化合物により直接または間接的に発生されたシグナルを検出することからなる。これらの工程はこの分野においてよく知られているが、塩濃度、温度、ブロッキング剤などのようなパラメーターを特定の態様についての日常の最適化を必要とする。好ましくは、標的分子がポリヌクレオチドでありそして特異的結合をワトソン−クリック（Watson−Crick ）および／またはフーグスティーン(Hoogsteen)型の塩基対合により達成するときはいつでも、本発明の分枝鎖状のまたは多重に接続した高分子構造体の濃度は標的ポリヌクレオチドより約10〜 100倍モル過剰である。本発明の分枝鎖状ポリマーを組み込んだキットは、特定の態様、使用するアッセイのフォーマットの型、および使用する標識化のスキームに依存して種々の形態を取ることができる。１つの面において、本発明のキットは所定の標的分子に対して特異的な分枝鎖状ポリマー、複合化緩衝液、および標識化手段からなる。ここにおいて使用するとき、「複合化緩衝液」は、標的結合部分のその標的分子への特異的結合を可能とする、通常水性の、溶媒系を意味する。複合化緩衝液の組成は、標的分子の型およびアッセイを実施する試料の特質、例えば、妨害する分子種が存在できる程度に依存する。タンパク質の標的について、複合化緩衝液は適度の生理食塩水、例えば、中性の緩衝液中の約10〜50mMのNaClまたはその同等の塩、例えば、50mMのTris−HCl(pH７〜８)である。次の参考文献は適当な条件を選択するための手引きを提供する：Kinzler ら、Nucleic Acids Research、 17：3645-3653（1989）；Thiesen ら、Nucleic Acids Research、18：3203-3209 （1990）；Oliphantら、Mol．Cell．Biol.、９：2944-2949(1989)；など。複合化緩衝液は、追加の成分、例えば、洗浄剤、界面活性剤、キレート剤、担体化合物、例えば、ウシ血清アルブミン、ブロッキング剤、後述するように、などを包含することができる。ポリヌクレオチドの標的について、複合化緩衝液はハイブリダイゼーション緩衝液である。すなわち、それは約100mM 〜約１ＭのNaCl、または同等の塩の生理食塩水であり、一般に中性のpH、例えば、pH７〜８に緩衝化されている。複合化緩衝液のように、ハイブリダイゼーション緩衝液は、追加の成分、例えば、洗浄剤、界面活性剤、キレート剤、担体化合物、例えば、ウシ血清アルブミン、ブロッキング剤、後述するように、などを包含することができる。なお他の面において、本発明のキットは、所定の標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドのクランプ、オリゴヌクレオチドのクランプと操作的に連合した分枝鎖状ポリマー；ハイブリダイゼーション緩衝液、および標識化手段からなる。ここにおいて使用するとき、「と操作的に連合した」は分枝鎖状ポリマーに共有結合で取り付けられているか、あるいは、例えば、クランプの１つが分枝鎖状ポリマーの配列に対して特異的である場合、分枝鎖状ポリマーと特異的に複合化することができることを意味する。本発明のキットは、さらに、未結合の標識および／またはオリゴヌクレオチドのクランプ、固相の支持体、例えば、誘導化磁気ビーズなどを除去するための洗浄緩衝液を含むことができる；そしてプレハイブリダイゼーション緩衝液は、オリゴヌクレオチドのクランプまたは他の結合成分、例えば、アンプリファイアー鎖の非特異的結合を最小とするために、ブロッキング剤、例えば、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DN A 、洗浄剤、例えば、１％SDS などを含有する。典型的なハイブリダイゼーション緩衝液は次の成分からなる：100mM のHCl 、10mMのMgCl₂ 、および10mMのTris −HCl(pH7.0)。実施例１HIV のpol および nef遺伝子のための３′および５′コレステロール結合部分を有するオリゴヌクレオチドのクランプの合成５′末端、３′末端、または３′末端および５′末端の両方に取り付けられたコレステロール部分を有する、表Ｉに列挙するオリゴヌクレオチドのクランプの系列を合成した。まずコレステロール誘導化固相支持体を構成し、次いで普通の自動DNA 配列決定装置（アプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)394型）でホスホルアミダイトモノマーを介する日常的オリゴヌクレオチド連鎖伸長により、３′コレステロールを取り付けた。合成の最終のカップリング工程において、コレステロールクロロホルメートを５′アミノ基を有する末端のヌクレオチドと反応させるか、あるいはコレステロールホスホルアミダイトを末端のヒドロキシル基とカップリングさせることによって、５ ′コレステロールを取り付け、前者の方法は通常より高い収率を与えた。このようなクランプは他のポリマー単位に、前述したように、遊離アミン基を、例えば、AminoModifier II（Clontech）を介して、導入し、次いでブロモアセチル化し、そしてホスホロチオエート基を介してカップリングすることによって容易に取り付けられる。（１）末端の５′−アミノ基をもつ、１モルの規模の、ポリマー支持オリゴヌクレオチドを、クロロホルム／ジイソプロピルエチルアミン（９：１、ｖ：ｖ）中のコレステリルホルメートの10％溶液の２mlで室温において20分間処理した。次いで、ポリマーの支持体をクロロホルムおよびアセトニトリルで洗浄し、切断しそして濃アンモニウムで脱保護し（55℃において５時間）、そして逆相HPLCにより精製した。（２）末端のヒドロキシル基をもつ、１モルの規模の、ポリマー支持オリゴヌクレオチドを、クロロホルム中のコレステロールホスホルアミダイトの 0.1Ｍ溶液の 250リットルおよびアセトニトリル中のテトラゾールの0.45Ｍ溶液の250リットルで室温において10〜15分間処理した。次いで、ポリマーの支持体をアセトニトリルで洗浄し、切断しそして濃アンモニウムで脱保護し（55℃において５時間）、そして逆相HPLCにより精製した。次の一本鎖または二本鎖の標的ポリヌクレオチド（HIV のpol およびncf 遺伝子のセグメント；配列番号：１）に特異的に結合するように、表Ｉに列挙するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのクランプを設計した；次の化合物の溶融温度を、前述したように、260nm の吸収の１／２最大／温度の曲線により決定した：DL015 ：39.0℃：DL014：58℃；DL013：68.0℃；DL021 ：67.5℃；DL022 ：67.5℃；および対照（次の配列を有する結合部分をもたない２つの未接続のオリゴヌクレオチド：3'-TTTTCTTTTCCCCCC-5'（配列番号：16）および5'-TTTTC^MeTTTT(C^Me)₆-3'（配列番号：15）：32.0℃。実施例２コレステロール結合部分、ポリエチレングリコールのヒンジ領域、および遊離アミンをもつオリゴヌクレオチドのクランプの合成非ヌクレオシドのヒンジ領域を有する次のオリゴヌクレオチドのクランプを、前述したように、合成した。ヒンジ領域において、Durandら、Nucleic Acids Re search、18：6353-6359(1990)；およびRumneyら（前掲）に開示されている、保護されたポリエチレングリコールホスホルアミダイトを、クロンテク(Clontech) （カリフォルニア州パロアルト）からのAminoModifier IIと一緒に使用した。ここで「ｐ」はホスホジエステル連鎖の存在を示す。第１の「Ｐ」の左に対するＮ−スクシミジルは配列番号：17であり、そして第４の「Ｐ」の右に対するＮ− スクシミジルは配列番号：18である。実施例３ヒンジ領域に関して反対の向きで遊離アミンおよび２つのオリゴヌクレオチド部分を有するオリゴヌクレオチドのクランプの合成前述の手順によりそして後述するように、次のオリゴヌクレオチドのクランプを製造する。ここで、Ｘはである。ポリマー単位ａおよびｂを別々に合成しそして精製し、次いで、前述したように、それらを溶液の中で組み合わせそして凍結して、オリゴヌクレオチドのクランプｃを形成する。３′−ブロモアセチルアミノ−５′−Chol−オリゴヌクレオチドは次のようにして製造する：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルミアミド(DMF)中の 0.4 ＭのＮ−スクシニミジルボロモアセテート（例えば、Calbiochem）の15リットルを、10mlの 0.2Mのホウ酸ナトリウム緩衝液中の 4.9Ａ₂₆₀ 単位の５′−Chol− ３′−アミノ−オリゴヌクレオチド前駆体に添加する。約35分後、混合物を希釈し(0.5mlのH₂O)、NAP−５カラム(Pharmacia)のゲル濾過により脱塩し、逆相HPLC により精製し（後述するように）、そして再び脱塩して４Ａ₂₆₀ 単位の３′−ブロモアセチルアミノ−５′−Chol−オリゴヌクレオチドを得る（溶出時間：逆相 HPLC、17.4分：イオン交換HPLC、17.4分）。イオン交換HPLCは、ダイオネックス・オムニ・パック（Dionex Omni Pak）NA100 4×250mm のカラムで、pH12(0.001 Ｍ NaOH)において、0.01Ｍ NaOH 中の 1.0Ｍ NaCl の２％／分の勾配で実施する。逆相HPLCはハイパーシル（Hypersil）ODS 4.6 ×200mm のカラムで、0.03Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、pH7.0 、中のアセトニトリルの１％／分の勾配で実施する。５′−Chol−３′−アミノ−オリゴヌクレオチドは前述したように製造する。５′−Chol−３′−ホスホロチオエート−オリゴヌクレオチドは前述したように製造する。実施例４ヒンジ領域に取り付けられたオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドのクランプの合成ヒンジ領域の中に遊離の第１アミンを有する、実施例２のオリゴヌクレオチドのクランプを合成する。アミンを前述したようにブロモアセチルで誘導化する。別々に、必要に応じて、３′または５′モノホスホロチオエート基を有するオリゴヌクレオチドを合成する。ブロモアセチル化クランプおよびオリゴヌクレオチドを、前述したように、水溶液の中で組み合わせそして凍結させる。実施例５オリゴヌクレオチドのクランプの二量体の合成遊離アミンをそれらのヒンジ領域の中に有する下に示す２つのオリゴヌクレオチドのクランプを別々に合成し、そして実施例２に記載するようにブロモアセチル化する。第３の合成において、両方のその５′および３′末端にモノホスホロチオエート基を有するオリゴヌクレオチド、または他の線状ポリマー単位を製造する。ここで「ｐｎｐ」はブロモアセチルアミノ官能性を含有する連鎖またはモノマーを表し、そして「ｐ」はホスホジエステル連鎖である。精製後、ｄ、ｃ、およびｆを前述したように溶液中で組み合わせそして凍結させる。次いで、オリゴヌクレオチドのクランプをゲル電気泳動により精製する。実施例６４つの分枝鎖およびオリゴヌクレオチドのクランプの認識配列を有するループポリマーの合成後述するように、次のオリゴヌクレオチドを合成する：ここで「ｐｎｐ」は上に定義した通りである。ｈにおける12−マーのポリ−Ａセグメントはオリゴヌクレオチドのクランプの認識配列である。ブロモアセチルアミノ官能性を前述したようにｇの中に導入する。ｇおよびｈを鋳型（5'-TGTGTGG GAAAAAAAAAAAAGGTGTGT）（配列番号：21）を使用して溶液中で結合し、次いで生ずるループを調製用ゲル電気泳動により精製する。次いで、精製したループを前述したようにｉと混合しそして凍結させそして、第２図に図解する生成物をゲル電気泳動により精製する。実施例７オリゴヌクレオチドのクランプに共有結合的に取り付けられたループ−および− 分枝鎖ポリマーの合成ここで「（ｐｎｐ）」は前述した通りである。ｋおよびｌを溶液中で組み合わせそして前述したように鋳型の助けにより環化する。次いで、精製したｋをｊおよびｉ（これはまたテサー（tether）として働く）を前述したように溶液中で凍結させる。生成物を普通の調製用ゲル電気泳動により精製する。ｋおよびｌの「ＣＡ」反復を他のオリゴヌクレオチドのクランプのために認識配列と容易に置換される。実施例８３′末端を有する櫛型分枝鎖状ポリマーの合成前述の手順に従い、次のオリゴヌクレオチドを合成する：ここで「ｐｎｐ」は前述した通りである。ｍおよびｎを溶液中で鋳型（例えば、 5'-GTGTGT(3')NHC(=O)CH₂SP(=O)(O)(3')GTGTAT-5'）と前述したように組み合わせて、３つの内部のブロモアセチル化アミノ基を含有する３′−３′ポリマー単位を形成する。次いで、３′ −３′ポリマー単位をｏと溶液中で組み合わせし、次いでこの混合物を前述したように凍結させる。生成物は、第３図に図解されており、普通のゲル電気泳動により精製する。実施例９５′末端を有する櫛型分枝鎖状ポリマーの合成前述の手順に従い、次のオリゴヌクレオチドを合成する：ここで「ｐｎｐ」は前述した通りである。ｐおよびｑを溶液中で前述したように鋳型と組み合わせて、３つの内部のブロモアセチル化アミノ基を含有する５′− ５′ポリマー単位を形成する。次いで、５′−５′ポリマー単位をｒと溶液中で組み合わせし、次いでこの混合物を前述したように凍結させる。生成物は、第４図に図解されており、普通のゲル電気泳動により精製する。実施例10鋳型を使用しない櫛型分枝鎖状ポリマーの合成次のオリゴヌクレオチドを前述の手順に従い合成しそして普通の方法により精製した：ｓおよびｔを前述したように溶液中で組み合わせそして凍結させて、シグナル発生手段をアニーリングするための４つの分枝鎖を有する３′−５′櫛型分枝鎖状ポリマーを形成する。生成物は、第５図に図解されており、普通のゲル電気泳動により精製する。実施例11ビオチニル化分枝鎖をもつ櫛型分枝鎖状ポリマーの合成次のオリゴヌクレオチドを前述の手順に従い合成しそして普通の方法により精製する。ビオチンを商業的に入手可能なビオチンホスホルアミダイト（アプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Applied Biosystems，Inc.）、フォスター・シティイ）を使用してｖにカップリングさせる：ｕおよびｖを前述したように溶液中で組み合わせそして凍結させて、シグナル発生手段をアニーリングするための４つの分枝鎖を有する３′−５′櫛型分枝鎖状ポリマーを形成する。生成物は、第６図に図解されており、普通のゲル電気泳動により精製する。実施例12フォーク型分枝鎖状ポリマーの合成次のオリゴヌクレオチドを前述の手順に従い合成しそして普通の方法により精製する。まずAminoModifier IIモノマーを５′シグナルにカップリングさせ、次いで次の合成サイクルにおいてAminoModifier II（CF₃C(=O)CH₂NH(CH2)₆−ホスホルアミダイト）（アプライド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Applied Biosystems，Inc.）、カリフォルニア州フォスターシティー、から入手可能）を成長するポリマーにカップリングさせることによって、ポリマー単位上の末端のアミン基を取り付けた。切断および脱保護後、遊離アミンを前述したようにブロモアセチル化する。生ずる生成物を精製しそして、前述したように、水溶液中でｘと組み合わせて、フォーク型分枝鎖状ポリマーを生成する。実施例13 ３′末端に５アルキルホスフェートアミノ置換基を含有するデカチミジン酸（ Grayaznov およびLesinger、Nucleic Acids Res．20：3403-3409(1992)により製造した5'dTTTTTTTTT-(LNH₂)₅）を、GryaznovおよびLetsinger、J．Am．Chem．So c．115：3808-3809(1993)に従いブロモアセチル誘導体に合成した。生成物を逆相HPLCにより単離し、そしてNAP5カラム(Pharmacia)で脱塩した。反応の概要１のブロモアセチル誘導体IIを、３′−ホスホロチオエート基を含有する反応の概要１の12−マ−III（3.8OD）と1.38mlの水中で混合した。この混合物を凍結乾燥し、次いで0.2 ＭのMES 緩衝液、pH７、12.5μｌおよび50μｌの水中に溶解し、そして−15℃に48時間フリーザーの中に48時間保持した。次いで、反応混合物を NAP５で脱塩し、そして毛管電気泳動（CE）およびイオン交換（IE）HPLCにより分析した。５分枝鎖状ポリマー（IV）の収率は、出発ブロモアセチル誘導体（II）のODに基づいてほぼ75％であった。反応の概要ここで、実施例Ｂにおいて形成された分枝鎖状 DNA構造体を第７図におけるように図解することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリマー単位からなる分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体を合成する方法において、別々に合成したポリマー単位を分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体に組み合わせる型の方法であって、１または２以上のハロアシル、またはハロアルキルアミノ基を含有する１または２以上の第１ポリマー単位を準備し、１または２以上のチオール、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を有する１または２以上の第２ポリマー単位を準備し、そしてハロアシル−またはハロアルキルアミノ基がチオール、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基と反応してチオアルキル−またはチオアシルアミノ、チオ−またはジチオホスホリルアルキルアミノ、あるいはチオ−またはジチオホスホリルアシルアミノの架橋をそれらの間に形成するように、１または２以上の第１ポリマー単位を１または２以上の第２ポリマー単位と組み合わせる、ことからなる方法。２．前記ポリマー単位が、式：（Ｍ−Ｌ）_n 式中、Ｍは１〜20個の炭素原子および０〜10個の酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される異種原子を含有する直鎖状、環状または分枝鎖状の有機分子構造体であり、Ｌはリン（Ｖ）の連鎖基であり、そしてｎは約３〜約100の範囲である、により定義される、請求の範囲第１項記載の方法。３．Ｍが１〜16個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニルまたはアリール；３〜８個の炭素原子および１〜３個の酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される異種原子を含有するヘテロサイクル；グリコシル；またはヌクレオシジルであり；そしてＬはホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、エチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびホスホロアミデートから成る群より選択される、請求の範囲第２項記載の方法。４．前記組み合わせる工程が水性液相の中で組み合わせて反応混合物を形成し、そして反応混合物が固相であるように反応混合物を凍結することを含む、請求の範囲第１項記載の方法。５．１または２以上の前記第１または第２のポリマー単位がオリゴヌクレオチドである、請求の範囲第１項記載の方法。６．前記１または２以上の第１ポリマー単位が末端のホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を有する第１オリゴヌクレオチドを含み、そして前記１または２以上の第２ポリマー単位が末端のハロアシル−またはハロアルキルアミノ基を有する第２オリゴヌクレオチドを含み、そして第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイゼーションして、末端のホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基および末端のハロアシル−またはハロアルキルアミノ基を並列にさせ、こうしてチオ−またはジチオホスホリルアルキルアミノあるいはチオ−またはジチオホスホリルアシルアミノの架橋をそれらの間に形成させるように、オリゴヌクレオチドの鋳型を準備することを、前記組み合わせる工程が含む、請求の範囲第５項記載の方法。７．前記ハロアシル−またはハロアルキルアミノ基がハロアセチルアミノ基である、請求の範囲第６項記載の方法。８．前記ハロアセチルアミノ基がブロモアセチルアミノ基であり、そして前記ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基がホスホロチオエート基である、請求の範囲第７項記載の方法。９．標的分子に特異的に結合できる分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体であって、前記分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体は、複数のポリマー単位、標的分子と安定な複合体を形成できる標的結合部分からなる少なくとも１つのポリマー単位、および標的分子の存在下に検出可能なシグナルを直接または間接的に発生できるシグナル発生部分からなる少なくとも２つのポリマー単位、ここで前記複数のポリマー単位は１または２以上のチオアルキルアミノ、チオアシルアミノ、チオホスホリルアルキルアミノ、チオホスホリルアシルアミノ、ジチオホスホリルアルキルアミノ、またはジチオホスホリルアシルアミノの架橋により互いに結合されている、からなる分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体。 10．前記標的結合部分からなる前記少なくとも１つのポリマー単位がオリゴヌクレオチドである、請求の範囲第９項記載の分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体。 11．前記標的分子がポリヌクレオチドである、請求の範囲第10項記載の分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体。 12．前記標的結合部分からなる前記少なくとも１つのポリマー単位が前記ポリヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドである、請求の範囲第11項記載の分枝鎖状または多重に結合した高分子構造体。 13．前記標的結合部分がオリゴヌクレオチドのクランプである、請求の範囲第 12項記載の分枝鎖状のまたは多重に結合した高分子構造体。 14．前記複数のポリマー単位の１または２以上が１または２以上の末端を有するオリゴヌクレオチドからなり、前記複数のこのような末端はもっぱら３′末端であるか、あるいはもっぱら５′末端である、請求の範囲第12項記載の分枝鎖状または多重に結合した高分子構造体。 15．前記複数のポリマー単位がチオホスホリルアシルアミノ架橋で一緒に結合されている、請求の範囲第14項記載の分枝鎖状の高分子構造体。 16．末端の数が１〜10である、請求の範囲第15項記載の分枝鎖状の高分子構造体。 17．試料の中の標的分子の存在を検出するキットにおいて、標的分子に対して特異的な核酸プローブおよび複合化緩衝液を準備する型のキットであって、複数の共有結合で接続されたポリマー単位、標的分子と安定な複合体を形成できる標的結合部分からなる少なくとも１つのポリマー単位、および標的分子の存在下に検出可能なシグナルを直接または間接的に発生できるシグナル発生部分からなる少なくとも２つのポリマー単位からなる核酸プローブ、ここで前記複数のポリマー単位は１または２以上のチオアルキルアミノ、チオアシルアミノ、チオホスホリルアルキルアミノ、ジチオホスホリルアルキルアミノ、チオホスホリルアシルアミノ、またはジチオホスホリルアシルアミノの架橋により互いに接続されている、からなるキット。 18．前記ポリマー単位の各々が、式：（Ｍ−Ｌ）_n 式中、Ｍは１〜20個の炭素原子および０〜10個の酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される異種原子を含有する直鎖状、環状または分枝鎖状の有機分子構造体であり、Ｌはリン（Ｖ）の連鎖基であり、そしてｎは約３〜約100の範囲である、により定義される、請求の範囲第17項記載のキット。 19．Ｍが１〜16個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニルまたはアリール；３〜８個の炭素原子および１〜３個の酸素、窒素および硫黄から成る群より選択される異種原子を含有するヘテロサイクル；グリコシル；またはヌクレオシジルであり；そしてＬはホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、エチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびホスホロアミデートから成る群より選択される、請求の範囲第18 項記載のキット。 20．前記複数の共有結合で結合されたポリマー単位が１または２以上が１または２以上の末端を有するオリゴヌクレオチドからなり、前記複数のこのような末端はもっぱら３′末端であるか、あるいはもっぱら５′末端である、請求の範囲第19項記載のキット。 21．前記標的分子がポリヌクレオチドでありそして前記複合化緩衝液がハイブリダイゼーション緩衝液である、請求の範囲第20項記載のキット。