JPH09501047A

JPH09501047A - アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用

Info

Publication number: JPH09501047A
Application number: JP7502627A
Authority: JP
Inventors: アルバートディ．フリーセン，
Original assignee: ジェネシスファーマインコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-23
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 1997-02-04
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: HU9503751D0; AU697234B2; CA2165821A1; EP0705335A1; US6420551B1; KR960703170A; HUT74597A; WO1995000638A2; US5594122A; US5811537A; AU7237194A; CA2165821C; WO1995000638A3; JP2798305B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)遺伝物質の領域に結合したときに、該オリゴヌクレオチドがHIV遺伝物質の発現を実質的に減少させるに十分、該領域に相補的なヌクレオチド配列である、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用発明の分野本発明は、オリゴヌクレオチド(ODN)をベースとする治療法、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染の処置に関する。発明の背景本発明は、感染した細胞におけるHIVの複製を阻害することによるHIV感染個体の処置において使用することに適したODNに関する。本明細書中で引用されるすべての文献は、その文献全体として本明細書中に参考として援用される。 HIVは、後天性免疫不全症候群(AIDS)として知られてきつつある疾患の原因である。初めて認識されたのは1981年であるが、この避け難い致死的な疾患の治療法はいまだ見いだされていない。HIVは、性的接触、感染した血液または血液産物、および周産期のような、種々の手段で拡がった。HIV感染は複雑であり、そして有効な治療法が不足しているため、感染を検出し、治療し、そして予防する方法を開発するための多大な努力が繰り広げられている。感染した、人、血液、および他の生物学的産物を同定するための診断的手順が開発されている。 HIVゲノムは、詳しく特徴づけられている。このゲノムは、約10kbのコード配列であり、HIV複製の調節セグメント、ならびにgag、polおよびenv遺伝子（これらはそれぞれ、コアタンパク質、逆転写酵素−プロテアーゼ−エンドヌクレアーゼ、ならびに内部および外部エンベロープ糖タンパク質をコードする）を含む。 HIVは高頻度で変異するので、その結果、ウイルスの株の間での遺伝的多様性が高く、そして実際、感染した単一の個人のウイルス粒子間での遺伝的多様性が高い。HIVゲノム中には、変異しない傾向にある「保存」領域がいくつかある。これらの領域のうちのいくつかは、ウイルスの機能に必須のタンパク質の部分をコードすると推定され、従って、これらの領域は非常に少ない変異的事象に抵抗し得る。 HIVのenv遺伝子は糖タンパク質であるgp160をコードし、これは通常、タンパク質分解性切断により、外部ウイルス糖タンパク質であるgp120およびウイルス膜透過性糖タンパク質であるgp41を形成する。gp120は、gp41との非共有的(nonc ovalent)相互作用のため、HIVビリオンと会合したままである。これらの非共有的(noncovalent)相互作用は弱く、従って、gp120の大部分は、可溶性形態で細胞およびビリオンから放出される。大部分のウイルスと同様に、HIVはしばしば、中和抗体の産生を誘発する。しかし、感染によって防護的な免疫性に達する、他の多くのウイルスおよび他の感染因子とは異なり、HIV特異的抗体は、この疾患の進行を停止するには不十分である。従って、HIVの場合、天然の感染の免疫性を誘発するワクチンは、有効ではないことが証明され得る。実際、HIVタンパク質gp160から調製されるワクチンは、中和抗体を誘発するものの、HIV感染に対する免疫性はほとんど提供しないようである。このような有効な抗HIVワクチンの産生の失敗から、有効なワクチンは1990年代の終わりまでには得られないという予想がなされている。現在AIDS の処置に使用されている治療薬は、しばしば、重大な副作用を引き起こし、このことがこれらの治療薬を多くの患者に使用することを妨げている。従って、ワクチン接種および現在使用されている薬剤を伴わない、この疾患の処置および予防のための別法を得ることは有用である。最近、ウイルス感染に関連するタンパク質の産生を、このタンパク質の合成を指揮するmRNA分子を妨げることによって低減する試みがなされている。このタンパク質の産生を妨げることによって、治療効果を最大にし、かつ副作用を最小にする治療結果を達成することが期待されている。このような治療的アプローチの一般的な目的は、所望されないタンパク質の形成に至る遺伝子発現を妨害するか、あるいは他の方法によって遺伝子の発現を低減させることである。特定の遺伝子の発現を阻害するための方法として有望であると考えられている方法のひとつは、「アンチセンス」アプローチである。主としてRNAである一本鎖核酸は、ODNのための標的分子であり、これはアンチセンス機構によって遺伝子発現を阻害するために使用される。アンチセンスの概念および治療的アプローチは、有効であることが示されている。アンチセンスODNは、相補的RNA配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子発現に影響を与えることが要求される。ハイブリッドRNA-ODN二重鎖は、プロセッシング、翻訳、および代謝回転を包含するRNA代謝の１つまたはそれ以上の局面を妨げるようである。化学修飾されたODNは、ヌクレアーゼの安定性、および細胞の透過性を増強させるために使用される。二重鎖DNAは、認識可能なヌクレオモノマー(nucleomonomer)配列に基づくオリゴマーによって特異的に認識され得る。「GT」認識と名付けられたモチーフは、 Bealら(1992)Science、251:1360-1363；Cooneyら(1988)Science、241:456-459；およびHoganら、EP公開第375408号によって記載されている。このG-Tモチーフにおいて、ODNは、標的プリンリッチの配列にアンチパラレルに配向し、そしてA-T 対は、アデニンまたはチミン残基によって認識され、そしてG-C対はグアニン残基によって認識される。一本鎖標的配列および二重鎖標的配列の両方の配列特異的標的化は、診断、分析、および治療における用途を有する。このような結合が行われるいくつかの状況下において、得られる二重鎖または三重鎖を長期間に渡って安定化させることは有利である。オリゴマーを標的に共有架橋(covalent crosslinking)させることは、安定化を延長するためのひとつのアプローチを提供する。共有架橋を伴う一本鎖DNAの配列特異的認識は、いくつかのグループによって報告されている。例えば、Vlas sovら(1986)Nuc．AcidsRes.、14：4065-4076は、一本鎖DNAフラグメントと標的配列に相補的なヌクレオモノマーのアルキル化誘導体との共有結合を記載した。同じグループによる同様の研究の報告は、Knorreら(1985)Biochimie、67:785-78 9に記載されている。一本鎖DNAの配列特異的切断は、切断を活性化し得る改変されたヌクレオモノマーの取り込みによって媒介され得る。IversonおよびDervan (1987)J．Am．Chem．Soc.、109:1241-1243。標的ヌクレオモノマーに対する共有架橋はまた、一本鎖標的ヌクレオモノマー配列に相補的なアルキル化試薬を用いて達成された。Meyerら(1989)J．Am．Chem．Soc.、111:8517-8519。ソラレン(ps oralen)によって媒介される一本鎖ODNへの光活性化架橋が開示されている。Lee ら(1988)Biochem.、27:3197-3203。三重らせん形成性プローブにおける架橋の使用もまた開示されている。Horneら(1990)J．Am．Chem．Soc.、112:2435-2437。一本鎖オリゴマーおよび二本鎖オリゴマーへの架橋のためのアルキル化試薬としてN⁴,N⁴-エタノシトシンを使用することもまた記載されている。WebbおよびMa tteucci(1986)J．Am．Chem．Soc.、108:2764-2765；(1986)Nuc．AcidsRes.、14: 7661-7674；およびShawら(1991)J．Am．Chem．Soc.、113:7765-7766。これらの論文はまた誘導体化シトシンを含むODNの合成を記載している。一本鎖DNAへのOD Nの結合に関係する、N⁶,N⁶-エタノアデニンを含有するオリゴマーの合成、およびこの残基の架橋特性が記載されている。MatteucciおよびWebb(1987)Tetrahedr on Letters 、28:2469-2472。最近の論文において、光活性化可能な架橋剤に連結したオクタチミジン(octat hymidylate)の一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの両方への配列特異的結合が記載されている。Praseuthら(1988)Proc．Natl．Acad．Sci.(USA)、85:1349-1353。さらに、ODNの5'-リン酸を介してアルキル化試薬による二重鎖DNAの標的化が記載されでいる。Vlassovら(1988)Gene 313-322；およびFedorovaら(1988)FEBS Lett. 、228:273-276。三重鎖を得るための結合を行う場合、例えば、標的の１つの鎖上にプリン残基が集中すると、他方の鎖上に逆の極性のオリゴマーが提供され得る。「逆の極性」とは、反対の極性を有するタンデム配列を含むオリゴマーを意味する。すなわち、片方が5'→3'の極性を有し、次いで他方が3'→5'の極性を有する。あるいはその逆である。このことは、これらの配列が、事実上の3'-3'ヌクレオシド間( internucleoside)結合（しかしこの結合は達成される）または事実上の5'-5'ヌクレオシド間結合と考えられ得る結合によって連結していることを暗示している。このようなオリゴマーは、環状ODNを得るための反応の副生成物として示唆されている。Capobioncoら(1990)Nuc．AcidsRes.、18:2661-2669。3'-3'逆位(inve rsion)または5'-5'逆位のいずれかを用いるAT結合によって固定されるヘアピンを形成するように設計された「平行鎖DNA」の組成物が合成されている。van de Sandeら(1988)Science、241:551-557。さらに、3'-3'結合を含むオリゴマーを用いる三重らせん形成が記載されている。HorneおよびDervan(1990)J．Am．Chem． Soc. 、112:2435-2437；およびFroehlerら(1992)Biochem.、31:1603-1609。標的遺伝子発現の発現を阻害する手段としての三重らせん(triple helix or t riplex)複合体の使用が、以前に提示されている(国際出願番号PCT/US89/05769) 。三重らせん構造は、標的遺伝子発現を妨害することが示されており、このアプローチの実現可能性を示す。国際出願番号PCT/US91/09321；およびYoungら(1991 )Proc．Natl．Acad．Sci．USA、88:10023-10026に示されている。 ODNにおいて使用するために適した種々の修飾が見いだされている。5-プロピニル修飾ピリミジンを含むオリゴマーが記載されている。Froehlerら(1992)Tetr ahedron Letters 、33:5307-5310。2'-デオキシ-7-デアザアデノシンおよび2'-デオキシ-7-デアザグアノシンをODNに組み入れ、そして相補的DNA配列への結合について評価された。熱変性分析(Tm)によれば、これらのアナログで2'-デオキシアデノシンおよび2'-デオキシグアノシンを置き換えたとき、これらの置換によって、二重鎖のTmはすこし減少することが示された。SeelaおよびKehne(1987)Bi ochem. 、26:2232-2238；およびSeelaおよびDriller(1987)Nuc．Acids Res.、14: 2319-2332。2'-デオキシ-7-デアザ-アデノシンと-チミジンが交互であるODNは、 2'-デオキシ-アデノシンと-チミジンとを含むODNよりも二重鎖のTmがわずかに上昇し得ることが示されている。SeelaおよびKehne(1985)Biochem.、24:7556-7561 。アミダイトおよびホスホン酸水素化学によるDNA合成が記載されている。米国特許第4,725,677号；同4,415,732号；同4,458,066号；および同4,959,463号。 HIVの処置にアンチセンスODNを使用することは、幾人もの研究者が記載している。MatthewsおよびKricka(1988)Anal．Biochem. 169:1-25；Degolsら(1992)Ant iviral Res. 279-287；およびCantinらの米国特許第5,110,802号。HIVに対するアンチセンス標的化における先行する試みは、感染を成功させるために必須のウイルスタンパク質の合成を、培養中の感染しやすい細胞の新たな(de novo)感染を用いることによって阻害することに焦点をあてている。Agrawalら(1988)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85:7079-7083；Goodchildら(1988)Proc．Natl．Acad． Sci．USA 85：5507-5511；およびZamecnikら(1986)Proc．Natl．Acad．Sci.USA 83 :4143-4146。その本来の性質上、このようなアッセイは、試験化合物が、ウイルスのライフサイクル中の任意の重大なプロセスを潜在的に妨害することを可能にする。従って、新たな感染のアッセイは抗ウイルス活性について化合物を初期スクリーニングするためには有効であるが、抗ウイルス活性が、アンチセンスプロセスから実際に誘導される意図するアンチセンスオリゴマーによって示されるのか、あるいは感染プロセスの初期段階で作動する作用の結果であるのかを含む、作用機構を確立するためには複雑な系である。Ｔリンパ球がHIVに感染すると、細胞変性効果および細胞死が起こり、これは免疫系のヘルパーＴリンパ球の機能の選択的な損失に関連する。Aryaら(1985)Sc ience 29:69-73。感染細胞内でHIV-1抗原が蓄積することにより細胞死に至る急性感染(Pettewayら(1991)TiPS 12:28-34)に加えて、慢性または持続性感染もまた起こる。このようなウイルスリザーバー(reservor)の持続は、HIV感染およびA IDSの進行に関係する。Noeら(1988)Biochim．Biophys．Acta 946:253-260。HIV 複製の後期段階の事象を標的化する合理的な薬剤の発見は、この慢性リザーバーからの感染性ビリオンの産生を阻害することによってウイルスが拡がることをブロックすることが可能な抗ウイルス剤を与える可能性を有する。保存HIVタンパク質、特にp24コア抗原タンパク質の合成のシグナルであるウイルスRNAの保存部位を標的化することによって、ウイルス遺伝子の発現および複製の阻害がより効果的に達成され得ることが、ここで見いだされた。発明の要旨本発明は、ヌクレオチド配列を含むODNに関し、該ヌクレオチド配列は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)遺伝物質の保存領域に結合したときに、該ODNがHIV遺伝物質の発現を効果的に減少させるに十分、該領域に相補的なヌクレオチド配列である。図面の簡単な説明図１は、HIVタンパク質およびそれらの分解生成物のインビボ合成を示すSDS-P AGEのオートラジオラフである。図２、HIV-1ゲノムの第１のスプライスドナー部位に対するアンチセンスODNによってHIVタンパク質の発現が有意に阻害されることを示すSDS-PAGEのオートラジオグラフである。図３は、HIV遺伝子産物合成に対するHIVゲノムの第１ドナー部位に対するアンチセンスODN濃度の違いの影響を示すウェスタンブロット分析である。図４は、B4-14と呼ばれるpGAGPOL-rre-r(HIV遺伝子配列)で安定にトランスフェクトされたCOS-様サル腎細胞株中におけるHIV-1ウイルス遺伝子発現に対する、アンチセンスODN、GPI2Aの濃度依存性阻害を示すSDS-PAGEのオートラジオグラフである。図５は、リポフェクチン(lipofectin)との処方による、細胞に関連する放射標識化ODNの増強を表す。図６は、HIV-1 gagタンパク質前駆体p55の生合成に対する、１μMのGPI2Aの阻害活性を表す。図７は、HIV-1ウイルスコア抗原p24の生合成に対する、１μMのGPI2Aの配列特異的阻害活性を表す。図８は、HIV gagタンパク質p24の生合成に対する、GPI2A濃度依存性阻害活性を示すオートラジオグラフのデンシトメトリー分析を表す。図９は、HIV-1 mRNAに対する１μMのGPI2Aの阻害活性を表す。Ａ：ODNを用いた４時間の予備処理後の総RNA抽出物; Ｂ：24時間の予備処理後。図１０（ウイルス感染P-PHA刺激CBMC細胞におけるGPI2AによるRT活性の濃度依存性阻害）は、GPI2Aによる急性感染細胞におけるHIV-1複製の阻害を表す。図１１は、慢性感染したH9/IIIB細胞におけるHIV-1複製の阻害を表す。図１２は、予備処理された、または未処理のB4.14細胞のコロニー形成能を表す。図１３は、B4.14細胞の成長特性に対するODN予備処理の影響を未処理コントロールと比較して表す。発明の説明 HIV RNA内のいくつかの領域が、アンチセンスODNおよびそれらのアナログによってウイルス遺伝子産物の発現を阻害するための有効な標的であることが、現在、見いだされた。この阻害は、p24の産生によって測定される、ウイルス複製の間の特定の機能をブロックする能力に基づく。p55の開裂産物であるp24の臨床的な重要性は、HIVのp24抗原に対する抗体の血清レベルが、ウイルスに対する免疫応答の有効性の証拠を提供すること、そしてAIDSが進行した段階の患者の血清中の遊離ウイルスのマーカーとして働くことによって証明される。Goedertら(1989 )N．Engl．J．Med.、321:114。本発明によれば、２つの20merのODN配列が設計され、そして抗HIV化学療法剤としてのそれらの有効性について試験された。いかなる特定の理論にも拘束されないが、アンチセンス化学療法の作用機構は、翻訳または転写をそれぞれ妨げるように、mRNAまたはDNAに結合することに専ら起因し得る。この作用機構はまた、RNase Hの活性化、およびそれに続くRNAの分解に起因し得る。この配列は、少なくとも２つの異なるHIV単離物中で保存される(Battleら(199 2)J．Viol. 66:6868)。従って、このアンチセンスODNは、広範なHIV株に対する有効な薬剤である得る。この配列を、ODN合成のホスホルアミダイト化学に基づいて、Applied Biosyst ems モデル380D自動DNA合成機および392 DNA/RNA合成機上で合成した。これらを、ODN精製カートリッジ、PAGEおよび／またはHPLCを用いて精製した。治療的用途において、このODNは、標的遺伝子領域の発現を阻害することによって種々の症状を処置するために適切な方法によって使用される。このような治療において、ODNは単独または組み合わされて、全身投与、局所投与、または局部投与を包含する種々の投与様式として製剤化され得る。技法および製剤化は、一般的に、Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，East on，PA,最新版に見いだされ得る。ODN活性成分は、一般に、投与様式および投薬形態の性質に依存して、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、または滑沢剤を包含し得る希釈剤または賦形剤のような薬学的に受容可能な担体と組み合わされる。典型的な投薬形態は、錠剤、散剤、液体調剤(懸濁剤、乳濁剤、および溶液を包含する)、顆粒剤、カプセル、および座剤を包含し、そしてリポソーム調剤を包含する注射のための液体調剤を包含する。好ましくは、この組成物は、有効濃度の脂質処方物を含む。有効濃度とは、細胞によるODNの取り込みを増強する濃度である。取り込みを増強することにおいて特定の脂質処方物またはその濃度が有効か否かを決定することは、当業者の技術範囲内であり、以下に例を示す。適切な脂質処方物には、脂質混合物、リポソーム、およびカチオン性脂質調製物が包含されるがこれらに限定されない。適切なカチオン性脂質処方物は、リポフェクチンである。全身投与のためには、注射が好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下が包含される。注射のためには、本発明のODNは、溶液中、好ましくはハンクス液、またはリンゲル液のような生理学的に適合性の緩衝液中に製剤化される。さらに、ODNは固体形態として製剤化され得、そして使用直前に再溶解あるいは懸濁し得る。凍結乾燥形態もまた包含される。全身投与に使用され得る投薬量は、好ましくは、１日に１回または２回の投与で約0.01mg/Kgから50mg/Kgの範囲である。しかし、(i)個々のODNがその標的DNAまたはRNAの活性を阻害する能力、(ii) 病理学的疾患状態の重篤度または程度、または(iii)所与のODNの薬物動態学的挙動、に依存して、異なる投薬スケジュールを使用し得る。全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によって行われ得、あるいはこの化合物は経口投与され得る。経粘膜投与または経皮投与のためには、浸透されるべきバリアに適した浸透剤(penetrant)が製剤中で使用される。このような浸透剤は当該分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体である。さらに、透過を促進するために増強剤(enhan cer)を使用し得る。経粘膜投与は、例えば、点鼻スプレーまたは座剤を用いて行われ得る。経口投与のためには、ODNは、カプセル、錠剤、およびトニック剤のような従来の経口投与形態中に製剤化される。局所投与のためには、本発明のODNは、当該分野で一般に知られているような、軟膏(ointment、salve)、ゲル、またはクリーム中に製剤化される。眼科適応のためには、本発明のオリゴマーの製剤は、当該分野で公知の標準組成物に基づく。治療において使用することに加えて、本発明のODNは、ODNが特異的に結合する標的核酸の存在または不存在を検出するための診断薬として使用され得る。本発明のODNの増強された結合親和性は、プライマーおよびプローブとしてのそれらの使用に有効である。診断的試験は、二重らせんまたは三重らせん形成のいずれかによるハイブリダイゼーションを行い、次にこれを通常の手段によって検出することによって行われ得る。例えば、ODNを、放射活性、蛍光、または色素原標識によって標識し得、そして固体支持体に結合した標識の存在を検出する。あるいは、二重らせんまたは三重らせんの存在は、これらの形態を特異的に認識する抗体によって検出され得る。本発明の置換結合を含むODNを三重らせん形成による診断薬として使用することは有利である。なぜなら、三重らせんは穏和な条件下で形成され、このアッセイは、試験検体を過酷な条件下に供さなくても行うことができるからである。RN Aの検出に基づく診断アッセイは、しばしば、試料または実験室で成育された生物からRNAを単離することを必要とする。RNAは遍在するヌクレアーゼに対して非常に感受性が高いので、RNAの単離は労力を要し、かつ時間がかかる。 ODNプローブはまた、ODNを特にヌクレアーゼ安定性にする糖の修飾および／または結合の置換のようなさらなる修飾を導入し得、このようにして、通常ヌクレアーゼ活性を含んでいる細胞または組織抽出物の存在下において行われるアッセイのために有用であり得る。末端修飾を含むODNは、しばしば、特異性を失うことなく、相補的配列に結合するそれらの能力を保持する。Uhlmannら(1990)Chem. Rev. 、90:543-584。上記のように、本発明のプローブはまた、別の(alternate) DNA鎖に特異的に結合し得るリンカーを、このような結合をさせるリンカーを導入することによって含み得る。Froehlerら(1992)Biochem.、31:1603-1609；およびHorneら(1990)J．Am．Chem．Soc.、112:2435-2437。塩基アナログを、共有架橋剤も含んでいるプローブに導入することは、診断アッセイまたは検出アッセイにおける感度を増加させ、そしてバックグラウンドを低下させる可能性を有する。さらに、架橋剤の使用により、新規なアッセイの改変が可能となる。例えば、(1)プローブの識別能を高めるために、架橋を使用する、(2)バックグラウンドを低下させるために変性洗浄工程を導入する、および( 3)標的中の二次構造を減少させ、そしてプローブの特異性を増大させるために、ハイブリッドの融点または融点付近でハイブリダイゼーションおよび架橋を行う、ことのような改変である。ハイブリダイゼーション条件の改変は、以前に記載されている。Gamperら(1986)Nuc．Acids Res.、14:9943。本発明のODNは、米国特許第4,775,619号に記載のような、検出されるべきオリゴマーまたは核酸のいずれかが固体支持体に共有結合するような方法を用いる診断アッセイに使用されることに適している。このODNはまた、例えば欧州特許公開第0 393 744号に記載されているような方法に従って、標的配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく診断アッセイに使用されることに適している。プライマーとして働き得る3'末端を含む本発明のODNは、TaqまたはVent^TM (New England Biolabs)ポリメラーゼのような、PCR法に使用されるポリメラーゼに適合性である。従って、本発明のODNは、PCRプロトコルにおけるプライマーとして使用され得る。このODNは、分離した(discrete)配列であるプライマーとして有用であり、またはランダム配列を有するプライマーとして有用である。ランダム配列プライマーは、通常、約６、７、または８ヌクレオモノマー長さであり得る。このようなプライマーは、種々の核酸増幅プロトコル(PCR、リガーゼ連鎖反応など)またはクローニングプロトコルにおいて使用され得る。本発明の置換結合は、一般に、プライマーとしてのODNの能力を妨害しない。3'-末端残基以外の部位に2'-修飾を有する本発明のODN、およびODNをRNaseを無能力にするか、あるいは他の方法でヌクレアーゼ安定性にするような別の改変は、細胞抽出物またはヌクレアーゼを含む他の溶液中で、RNAまたはDNA配列のためのプローブまたはプライマーとして有利に使用され得る。従って、このODNは、標的核酸を含む試料とこのODNを混合し、次いで、ODNを標的核酸にハイブリダイズし、そしてPCR、LCRまたは他の適切な方法により、この標的核酸を増幅することによって試料中の核酸を増幅するためのプロトコルにおいて使用され得る。 EDTA、DTPA、または1,2-ジアミノシクロヘキサン酢酸のアナログのようなキレート剤へ誘導体化されたODNは、例えば米国特許第4,772,548号、同4,707,440号、および同4,707,352号に記載のような、種々のインビトロ診断アッセイに使用され得る。あるいは、本発明のODNは、5-(3-ヨードアセタミドプロプ-1-イル)-2 '-デオキシウリジンまたは5-(3-(4-ブロモブチルアミド)プロプ-1-イル)-2'-デオキシウリジンのような架橋剤によって誘導体化され得、そして例えば国際公開 Wo90/14353に記載のような種々のアッセイ法またはキットにおいて用いられ得る。上記のような使用に加えて、このオリゴマーが遺伝子発現を阻害する能力は、被験体細胞または組換え系における発現レベルを、任意の適切な方法によって測定することによってインビトロ系において実証し得る。Graessmannら(1991)Nuc. Acids．Res. 、19:53-59。本発明の場合、p24のレベルが、ウイルス複製の指標として測定された。本発明の第１の実施態様は、gag遺伝子の5'長末端反復(LTR)と第１の開始コドン(AUG)との間の領域に相補的なODNである。この領域は、効果的なウイルスRNA パッケージングに必要な高度に保存された配列を含む。The Human Retroviruses 、GalloおよびJay編、Acad．Press.中のKlotmanおよびWong-Staal(1991)。このアンチセンスODNを「アンチ-gag」と呼ぶ。このODNはHIV-1遺伝子発現を阻害するに十分な長さおよび相補性である。この相補的部位は塩基+262から塩基+281までであり、この番号付はRatnerら(1985)Nature、313:277-283に従う。好ましい実施態様においては、アンチ-gag ODNは特定の配列：を有する。本発明の、第２の実施態様は、第２のスプライス受容部位内の領域に相補的な ODNである。(Battlesら、1992)。このアンチセンスODNは、「GPI2A」と呼ばれる。このODNはHIV-1遺伝子発現を阻害するに十分な長さおよび相補性である。この相補的部位は塩基+1189から塩基＋12O8までであり、この番号付はRatnerら(1985) に従う。好ましい実施態様においては、GPI2A ODNは特定の配列：を有する。さらに好ましい実施態様において、ODNは、ホスホジエステル骨格の少なくとも１つの天然に存在する非架橋酸素原子をイオウで置換して、このオリゴマーの対応するホスホロチオエート誘導体を形成することによって化学的に修飾される。イオウ原子の好ましい位置は、以下に示す通りである。アンチ-gag： GPI2A：本発明によれば、p24タンパク質の発現を調節する方法が提供される。標的RNA またはこれを含む細胞を、HIVのp24コア構造タンパク質をコードするRNAの特定の領域に結合するODNアナログで処理する。RNA標的部位は、HIVのp24コア構造タンパク質を発現する機構に関連する領域を含む。以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図しない。１μMのGPI2A存在下におけるウイルスコア抗原の産生を配列特異的に阻害することを示す実施例もまた、観察された。p24形成に対するGPI2Aの濃度依存的阻害効果を示すオートラジオグラフのデンシトメトリー分析（１μMで84％を超える）は、0.5μMのIC₅₀を与えた。GPI2Aで予備処理された細胞から得られたmRN Aレベルの劇的な減少が、ノーザン分析によって示された。両方の効果は予備処理の４時間後でさえ観察されたので、阻害パターンは、このタンパク質レベルにおいて得られたデータに合致する。ODNの細胞障害性効果を、細胞のコロニー形成能および増殖特性によって評価した。ウイルスタンパク質生合成の濃度依存的減少は、GPI2Aの薬理学的価値を示している。より低い転写レベルから得られる阻害効果は、RNase H活性化による、可能な作用機構を示しており、それによって、提唱されたアンチセンスODNのホスホロチオエート誘導体の作用機構を支持している。このアプローチは、おそらく、HIV感染、および機能的に関連した治療的に重要な疾患関連タンパク質の発現を調節することによって戦い得る、大部分の主要な疾患の有効な治療のための薬剤の候補としてのアンチセンスオリゴマーの開発のための、一般的スクリーニングに多大に寄与する。実施例１細胞培養ウイルスの遺伝子発現に対するアンチセンスオリゴマーの効果を決定するために、B4.14細胞（David Rekosh博士（バージニア大学微生物学科）より提供された）を、１ウェルあたり5,000〜12,000細胞の細胞密度で12ウェル/35mmのプラスチック製組織培養プレートに接種し、そして５%CO₂の加湿インキュベーター内で 10%の仔ウシ血清、50μg/mlのゲンタマイシンおよび200μg/mlのハイグロマイシンＢを含むIscove改変Dulbecco培地に37℃で２〜３時間維持した。次いで、インキュベートされた細胞を洗浄し、そして示された濃度のオリゴマーおよび血清ヌクレアーゼ活性を減少させるために加熱不活化した10%血清を含む培地と共に同一条件下でインキュベートした。同じオリゴマー配列（ただし、極性を切り換えられた）をコントロールとして使用した。実施例２ウイルス抗原アッセイ実施例１に記載したように培養した細胞を、29.2mg/100mlのグルタミン、50μ g/mlのゲンタマイシン、200μg/mlのハイグロマイシンＢ、加熱不活化した10%仔ウシ胎児血清および所望の濃度のオリゴマーを含む無メチオニン培地の存在下で、75〜150μCi/mlの[³⁵Ｓ]-メチオニン（70%L-メチオニン/15%L-システイン）で標識した。[³⁵Ｓ]-メチオニン濃度は185MBqであり、そして比活性は1057Ci/mmol であった。次いで、標識された試料をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、そして50mM Tris，pH7.2；150mM NaCl；5mM EDTA；１% Triton-100；0.2% デオキシコール酸を含む200μlの溶解緩衝液に再懸濁した。標識されたウイルスを含む培養培地を、１%の最終濃度まで10% Triton X-100 を用いて処理し、ウイルス粒子を粉砕した。この試料をプロテインＡ−Sepharos eビーズを用いて４℃で30分間予備吸着させた。次いで、[³⁵Ｓ]-メチオニンで標識したウイルスタンパク質を、プロテインＡ−Sepharoseビーズおよび2.5μl/試料のHIV-1 p25/24に特異的なポリクローナルウサギ抗血清を用いて２時間免疫沈降させた。抗体は、Notional Institute of Allergy & Infectious Disease（AI DS Reseach & Reference Reagent Program）およびMicroGeneSys，Inc.から得た。得られたペレットを、溶解緩衝液で４回洗浄し、500mM NaClを含む溶解緩衝液で１回洗浄し、そして最後に10mM Tris，pH7.2；25mM NaCl；１mM EDTAを含むTN E緩衝液で１回洗浄した。次いで、試料を、Laemmli（1970）Nature，227:680-68 5により記載された方法に従って、20〜30μlの２×SDS試料緩衝液に再懸濁し、５〜10分間煮沸し、12.5%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いで電気泳動により分析した。得られた結果を図１および２に示す。阻害パーセントをオートラジオグラフィーのデンシトメトリー分析により測定した。ODNは、ホスホロチオエート誘導体（塩基を交互にイオウ化）であった。 B4.14細胞における抗gagによるウイルスタンパク質合成（CCGCCCCTCGCCTCTTGC CG；相補的部位262-281；機能、スプライスドナー）の阻害は30%であった（図２）。図１は、HIV-1ウイルスタンパクおよびそれらの分解産物のインビボ合成を示すSDS-PAGEのオートラジオグラフである。[³⁵Ｓ]-メチオニンで代謝的に標識した後のCMT3[野生型（左）]細胞分解液およびB4.14[トランスフェクトされた株（右）]細胞溶解液の各200μlを、上述のようにp24ウイルス抗原に対するウサギ血清を用いて免疫沈降させ、SDS-PAGE上で電気泳動し、そしてＸ線フィルムに曝した。ウイルスタンパク（p160；p55およびp24）の位置は、B4.14細胞溶解液でははっきりと肉眼で見えるが、コントロール細胞株であるCMT3の細胞溶解液では見えない。図２は、抗gag ODNによるHIVタンパク質の発現の有意な阻害を示すSDS-PAGEのオートラジオグラフィーである。200μlのB4.14[トランスフェクトされた細胞株 ]細胞溶解液を、アンチセンス[AS]；センス、すなわちアンチセンスODNの逆相補体（inverse complement）[Ｓ]；およびコントロール（B4.14、細胞溶解液単独）で６日間処理し；そして引き続いて³⁵Ｓ-メチオニン標識した後、上述のようにp24ウイルス抗原に特異的なウサギ血清を用いて免疫沈降させた。等量のタンパク質を各レーンに加えた。実施例３異なる濃度のアンチセンスODNの効果 HIV遺伝子発現に対するアンチセンスODNの用量関係が存在するかどうか決定するために、以下の実験を行った。実施例１に記載したように細胞を培養し、そして５μg/mlのリポフェクチンおよび１%加熱不活化FCSの存在下で異なる濃度の抗gag ODNと共に一晩インキュベートした。次いで、培地を、10%加熱不活化血清を含む新鮮な培地に取り替えた。次いで、ODNを加え、そして７日間インキュベートした。ウェスタンブロット分析を、HIV p24/55タンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗体を用いて行った。 SDSポリアクリルアミド電気泳動の後、細胞タンパク質を、以下のようにImmob ilonメンブラン（Schleicher and Schuell）に電気泳動的に移行させた。Immobi lonメンブランをきれいな皿内のメタノール中に置き、脱イオン蒸留水で数回洗浄し、そしてウェスタン移行緩衝液（western transfer buffer）（60.6gのTris -HCl；288gのグリシン；４リットルのメタノール、そして蒸留水で20リットルにした）に浸した。使用した装置は、Bio-Rad Trans-Blot cellであり、これを製造者の指示書に従って使用した。ウェスタンブロット分析を、Vectastain ABCキット（Alkaline Phosphatase Rapid IgG）（Vector Laboratories）を用いて製造者の指示書に従って行った。結果を図３に示す。図３では、0.5および１μMのアンチセンスODNは、HIV-1ウイルスタンパク質合成を妨げるという点で等しく効果的であった。実施例４異なる濃度のODN GPI2Aの効果 HIV感染細胞におけるp24の発現をODN GPI2Aが阻害する能力を測定するために、以下の実験を行った。細胞を、１%加熱不活化仔ウシ胎児血清の存在下で、0.1、0.5および1.0μMのO DNと共に一晩インキュベートした。続いて、血清濃度を10%まで増加させ、そして３日間インキュベートした。約３×10⁷cpm/プローブを、上述のようにp24/25 ウイルスタンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。コントロールとして示されたレーンは、センス鎖、すなわちアンチセンスオリゴマーの逆相補体を有していた。図４のオートラジオグラフは、とりわけ、HI Vウイルスコア抗原の用量依存性阻害が存在したことを示す。実施例５発現プラスミドの構築 pCMVrevは、サルサイトメガロウイルス（CMV）IE94遺伝子由来のプロモーターーエンハンサー領域の制御下のHIV-1 cDNAフラグメント由来のコード配列（−65 0〜＋30）を含む(Jeangら(1987)J.Virol. 61:1559-1570)。このプラスミドを、p CV1由来のBsu961フラグメントをベクターpCMV中に挿入することにより構築した。pCMVにおいて、pBABY内に含まれるSV40配列を、CMVプロモーター領域と交換した(Lewisら(1990)J.Virol. 64:1690-1697)。 pGAGPOLは、pBABYのXhoI部位に挿入されたHIV-1のプロウイルスBH10クローン由来のcDNAフラグメント（HXB2ヌクレオチド679-5785位に対応）を含む。このフラグメントは、gag、polおよびvifのためのオープンリーディングフレームを含む。それを、ベクターpSP64（Promega Biotec、Madison、WI）において完全BH10 プロウイルスクローンをSalIフラグメントとして含むプラスミドから単離した。 HIV-1配列を、pSP64ポリリンカー内のSalI部位とHIV-1 DNA内の5785位のSalI部位との間のSalIフラグメントとして切り出した。pBABY内へ挿入した後、小欠失（Aval-XbaI）を、残りのpSP64ポリリンカーにおいて、制限酵素消化、T4 DNAポリメラーゼ修復およびBam HI部位（ポリリンカー）の欠失を生じる再連結により行った。SV40 DNA配列とpBR322 DNA配列との境界での第２のBamHI部位もまた、制限酵素消化および修復により取り除いた。これらの操作を、pGAGPOL-RRE-rの構築を容易にするために行った。HIV-1 BH10クローン由来のBglII-BamHIフラグメント（HXB2ヌクレオチド7620〜8474に対応）をpGAGPOL内に存在する特有のBam HI部位中に、gag、polおよびvifに関してウイルスゲノムの場合と同一の方向に挿入することにより、pGAGPOL-RRE-rを作成した。実施例６トランスフェクトされた細胞およびそれらの培養 COS様サル腎細胞株CMT3（GerardおよびGlutzman（1985）Mol．Cell Biol. 5:3 231-3240）を、pCMVgagpol-rre-r、gagの効果的発現に必要なpCMVrev(Smithら（ 1990）J.Virol. 64:2743-2750)、および標準のCaPO₄法(Grahamおよびvan der Eb （1973） Virology 52:456)によりハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する選択マーカープラスミドを用いてトランスフェクトして、細胞株B4.14（David Rekos h博士、バージニア大学微生物学科）を得た。この細胞を、10%仔ウシ血清、50μ g/mlゲンタマイシンおよび200μg/mlハイグロマイシンＢを有するIscove改変Dul becco培地中で維持した。膳帯血単核細胞（CBMC）を、Ficoll-Hypaque（Pharmacia、Uppsala、Sweden）勾配遠心分離により単離した。細胞を回収し、洗浄し、そして赤血球凝集素（P- PHA）刺激した。細胞を培養フラスコ中に接種し、そして10%加熱不活化ウシ胎児血清（Flow Laboratories、Toronto、Ontario、Canada）、２mM L-グルタミン、および200U/mlペニシリンを補充した完全RPMI-1640培養培地（Gibco Laboratori es、Toronto、Ontario、Canada）中で３日間維持した（Bourら（1991）J.Virol. 65:6387-6396）。実施例７オリゴデオキシヌクレオチド配列の合成自由エネルギー（ΔＧ）、ハイブリダイゼーション温度ならびに最も近接した ΔＧ値の精度の高い測定に基づくDNAおよびRNAの二次構造を計算するコンピュータモデルプログラム[OLIGO：Primer Analysis Softoware、Version 3.4]を使用して、目的の標的配列に高度に選択的であるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを作成した。このようにして作成されたオリゴデオキシヌクレオチドは、最小の遺伝子的変異性を有すると予想され(Battlesら（1992）J.Virol. 66:6868 -6877)、安定な二重鎖（duplex）および非自己相補性を形成した。GPI2Aは、Rat nerら（1985）Nature 313:277-284の命名法に従って以下の塩基組成より作成されるアンチセンス構築物である：⁵'GGTTCTTTTGGTCCTTGTCT³'、２箇所の点変異（下線）：⁵'GGTTCTTTTGTGCCTTGTCT³'、およびセンス鎖：ヌクレオチド＋1189〜＋ 1208位（多くのレトロウイルスにおいて遺伝的に保存される領域）にわたる⁵'TC TGTTCCTGGTTTTCTTGG³'。（Battlesら（1992）；Garveyら（1990）Virology 175: 391-409；およびGondaら（1987）Nature 330:388-391）。この伸長領域（stretc h）内において、BIVは、EIAVとは10残基のうち８残基を、SIV_macとは10残基のうち６残基を、ビスナウイルスとは10残基のうち３残基を、SIV_agm、HIV-2およびH IV-1とは10残基のうち７残基を共有した(Garveyら(1990))。GPI2Aを、７つの異なる塩基位置で、ホスホジエステル骨格の天然由来の非架橋酸素原子をイオウ原子に置換することにより化学的に修飾して、比較的ヌクレアーゼ耐性であるの対応するホスホロチオエート誘導体を形成した(Cohen（1989）Trends Pharmacolog lcal Sci. 10:435-437；およびZon（1988）Pharmaceut．Res. 5:539-548)。 ODNを、標準ホスホルアミデート（phosphoramidate）化学法を用いて、Applie d Biosystemsのモデル380B自動DNA合成機およびモデル392DNA/RNA合成機で合成した。オリゴマーおよびそれらのホスホロチオエートアナログを、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（Applied Biosystem）、20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、すなわちPAGE（Efcavitch(1990)，D.RickwoodおよびB.D.Hames (編 )，Gel Electrophoresis of Nucleic Acids-A Practical Approach Oxford Univ ersity Press．Oxford）を用いて、または高速液体クロマトグラフィー、すなわちHPLC（ZonおよびThompson（1986）BioChromatog. 1:22-32）により精製した。実施例８ ODN/脂質処方物を用いた細胞の前処理従来の研究により、GPI2Aの適度のアンチセンス活性は、細胞膜透過性が乏しいことに起因することが示された。この効果を最適化するために、カチオン性脂質送達システムを、高費用のODN合成を相殺するために用いた。リポフェクチン試薬は、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）と、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）との膜濾過水中の１：１[W/W]リポソーム製剤（GIBCO BRL、 Research Products LifeSci．Inc.）である。リポフェクチン試薬は、DNAと自発的に反応して、そのDNAを完全に捕らえる脂質-DNA複合体を形成する。この複合体の細胞膜との融合は、カプセル化したDNAのこの細胞の細胞内環境への効率的な取り込みを生じる(JulianoおよびAkhtar（1992）Antisense Res．& Develop. 2:165-176)。適切な量のDNAおよびリポフェクチン試薬を、滅菌蒸留水で別々に希釈し、次いでポリスチレンチューブ中で１つにし、そしてボルテックス撹拌しないで穏やかに混合した。次いで、この混合液を少なくとも15分間室温で静置した。(Felgn erら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)。約50〜70%集密度のプレートを無血清培地で洗浄した。次いで、１mlの培地を細胞に加え、そして複合体をできるだけ一定に滴下して穏やかに加えた。実験条件に依存して、細胞を、加湿した５〜10%二酸化炭素環境中で37℃で0.5分間〜24時間インキュベートした。細胞を免疫沈降または後に置換される培地およびODNのいずれかのために標識し、そして以前に公表された手順（Chanら（1993）Biochem. 47:12835-12840）の改変法による放射能標識および免疫沈降の前に、ODNの存在下で所望の長さの時間インキュベートした。細胞に関連する放射能を測定するために、細胞を³²Ｐ-標識した5'-DNA末端標識化システム（GIBCO、BRL）と共にインキュベートした。リポフェクチン試薬の存在下または非存在下のODNおよび細胞に関連する放射能を、液体シンチレーション培地（Universol,ICN Biomedicals Inc.、Irvine、CA）中に標識した細胞を直接懸濁することによって測定した。細胞を1.5×10⁴の密度で接種し、続いて加湿した５〜10%二酸化炭素環境中、10μg/mlのリポフェクチン試薬を含むかまたは含まない放射能標識した１μMのGPI2Aの存在下で37ので１時間および４時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、そして細胞に関連する放射能（cpm、y 軸）を、液体シンチレーション培地中での溶解および懸濁によりカウントした。得られた結果を図５に示す。図５において、各点は４つの実験の平均値を表す。統計的解析を、Studentのt検定により行った：−Lipo（１時間）対＋Lipo（１時間）についてはp〈0.01；-Lipo（４時間）対＋Lipo（４時間）についてはp〈0.0 05；−Lipo（１時間）対−Lipo（４時間）についてはp〈0.01；＋Lipo（１時間）対＋Lipo（４時間）についてはp〈0.003。実施例９アンチセンスオリゴマーおよびウイルス遺伝子発現ウイルス遺伝子発現に対するアンチセンスオリゴマーの効果を測定するために、B4.14細胞を、所望の細胞密度で６ウェルのプラスチック製組織培養プレートに接種し、そして５%CO₂の加湿インキュベーターにおいて10%の仔ウシ血清、50 μg/mlのゲンタマイシンおよび200μg/mlのハイグロマイシンＢを含むIscove改変Dulbecco培地中で37℃で維持した。続いて、細胞を洗浄し、そして１μMのGPI 2Aおよび加熱不活化した血清を含む培地と共に４時間インキュベートした。コントロールオリゴマー配列は、２箇所の点変異を含んでいたか、またはアンチセンス構築物の逆相補体であった。次いで、前処理した細胞およびコントロールをPBSで洗浄し、そして無メチオニン培地の存在下で、120〜250μCi/mlの³⁵Ｓ-メチオニン（70% L-メチオニン/1 5% L-システイン、[³⁵Ｓ]-メチオニン濃度：185MBq.、比活性：1057Ci/mmol）で 30分間放射能標識した。続いて、標識した試料をPBS緩衝液で洗浄し、そして200 μlの溶解緩衝液（50mMのTris pH7.2、150mMのNaCl、5mMのEDTA、1%のTriton X- 100、0.2%のデオキシコール酸）中に再懸濁した。試料を、プロテインＡ−Spharoseビーズを用いて、少なくとも30分間４℃で予めきれいにした。[³⁵Ｓ]-メチオニン標識したウイルスタンパク質を、プロテインＡ−SpharoseビーズおよびHIV-1 p25/24に特異的なポリクローナルウサギ抗血清（National Institute of Allergy & Infectious Diseases[AIDS Research & Reference Reagent Program]およびMicoGeneSys，Inc.）の2.5μl/試料を用いて４℃で２時間または一晩免疫沈降させた。得られたペレットを溶解緩衝液を用いて４回洗浄し、500mMのNaClを含む溶解緩衝液を用いて１回洗浄し、そして最後にTNE緩衝液（10mMのTris pH7.2；25mMのNaCl；１mMのEDTA）を用いて１回洗浄した。次いで、試料を20〜30μlの２×SDS試料緩衝液中に再懸濁し、５〜10分間煮沸し、そして12.5% SDS-PAGE上で分析し、乾燥し、KODAK X-OMATフィルム（ Eastman Kodak、Rochester、NY）上で曝露した。得られた結果を図６〜８に示す。実施例１０ノーザン解析単離したRNA試料についてのノーザン解析を、以前に公表された手順（Amaraら（1993）Nuc．Acids Res. 21:4803-4809）の改変法により行った。簡潔に言えば、細胞を、実施例８の記載のように10μg/mlのリポフェクチン試薬の存在下で１ μMのODNを用いて前処理した。メッセンジャーRNAを、Gough(1988)(Analytical Biochemistry 173:93-95)により記載された方法に従って、迅速RNA調製法により細胞から抽出した。電気泳動を１%ホルムアルデヒドアガロースゲル上で行った後、ナイロンメンブラン（Schleicher & Schuell、Nytran⁺、0.45μm）上に一晩ブロッティングして、乾燥し、続いて80℃で２時間ベーキングした。フィルターを、ハイブリダイゼーションオーブン（Turbo Speed hybridization oven、Bio/ Can Scientific）中42℃で一晩予備ハイブリダイズした。次いで、フィルターを、BH10クローンの塩基334〜2037に対応する³²Ｐ-標識したプローブ（Oligolabel ing kit、Pharmacia）を用いて42℃で一晩プローブした（Ratnerら(1985)）。メンブランをハイブリダイゼーションした後に洗浄し、続いて露光した（Kodak X- OMAT AR）。得られた結果を図９に示す。図９Ａは、負荷コントロールとしてGAP DHを用いた全RNAの単離前の構築物を用いた４時間の前処理の後でのHIV-1転写物の阻害を示す。図９Ｂは、負荷コントロールとして28Sを用いた全RNAの単離前の前処理24時間後に得られた結果を示す。コントロールは、（i）アンチセンスの逆相補体；および（ii）２箇所の点変異を有するアンチセンス構築物であった。実施例１１抗ウイルス活性アッセイ急性感染した細胞においてアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートの抗ウイルス活性を試験するために、慢性感染したH9細胞から単離したHIV-1のHIV-IIIB研究室株（laboratory strain）を使用して、P-PHAで刺激したCBMCをTCID₅₀＝2000のウイルス力価（ウイルスストック＝５×10³TCID₅₀/ml）で感染させた。37℃で感染の２時間後、細胞を洗浄して、付着しなかったウイルスを洗い落とし、そしてI0Ｕ/mlのIL-2を含む新鮮な培地中に再懸濁した。細胞を４×105細胞/ウェルで接種し、そして適切な濃度のインシュリン（SigmaCo.）またはIGF-１（Gibco Laboratories）および各濃度のGP12Aを加えた。細胞培養上清におけるHIV-1活性の阻害は、培養の４日後に実施例１１において記載される逆転写酵素アッセイにより測定された。得られた結果を図１０に示す。実施例１２逆転写酵素アッセイ HIV逆転写酵素（RT）に対するGP12Aの効果を測定するために、以下の実験を行った。慢性感染させたH9/IIIB細胞を、加熱不活化血清および１μM濃度のODN/脂質処方物を用いて４×10⁵細胞/ウェルで接種した。細胞を、ODN/脂質処方物との24時間の予備インキュベーションの後にPBSで洗浄し、そして10%加熱不活化血清およびODNを含む新鮮な培地を加えた。細胞を５日間培養し続けた。細胞培養上清におけるHIV-1活性の阻害を、培養上清上でのRTアッセイにより測定した。Student のt検定による統計解析は、p〈0.02[対応のない(unpared)]であった。 RTアッセイを以前に公表された手順（Boulericeら（1990）J.Virol. 64:1745- 1744；およびLeeら、J．Clin．Microbiol. 25:1717-1722）の改変法により行った。簡潔に言えば、50μlの清浄な培養上清を、ポリプロピレンチューブ中、50m MのTris HCl pH7.9、５mMの塩化マグネシウム、150mMの塩化カリウム、0.5mMのエチレングリコールービス（β-アミノエチルエーテル）-N,N,N',N-四酢酸、0.5 %のTriton X-100、２%のエチレングリコール、５mMのジチオトレイトール、0.3m Mの還元グルタチオン、20μCiの滴定されたチミジン三リン酸および50μg/mlの鋳型プライマー[ポリ（rA）.オリゴ（dT）]を含む50μlの反応カクテルに加えた。このチューブを激しく撹拌し、次いで３０℃で22時間インキュベートした。この反応を、１mlの冷トリクロロ酢酸（TCA）の添加により停止した。新規に合成したDNAを、氷上で少なくとも２時間沈降させ、次いでWhatman CF/Cガラスフィルター上で集め、10%冷TCAおよび無水エタノールで２回洗浄した。フィルターを20 分間乾燥し、そして取り込まれた放射能をカウントした。得られた結果を図１１に示す。実施例１３ GPI2Aの毒性正常細胞（B4.14）のコロニー形成能力および生育特性に対するGPI2Aの効果を測定するために、以下の実験を行った。B4.14細胞を１μMのオリゴマーで３日間前処理した。続いて、細胞をPBSで洗浄し、回収し、次いで低密度で再接種した。次いで、細胞を、コロニーが形成されるまで（約６〜11日）培養し続けた後に、細胞を染色した。得られた結果を図１２示す。正常細胞の生育に対するGPI2Aの効果を測定するために、以下の実験を行った。B4.14細胞を接種し、続いて１μMのODNの存在下で３日間生育させた。細胞を、100mm組織培養プレート中に再接種し、そしてODNの存在下で図１３のＸ軸上に示した時間生育させた。次いで、細胞を回収し、示された時間でカウントした。得られた結果を図１３に示す。図１２および1３から、GPI2Aは細胞培養において毒性を示さなかったことが認識され得る。

【手続補正書】【提出日】１９９６年７月９日【補正内容】請求の範囲１．ヒト免疫不全ウイルスの核酸配列+1189〜+1208に相補的なヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチド。２．ヌクレオチド配列 5' ＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴ 3' を有する、オリゴヌクレオチド。３．ヌクレオチド配列 5' Ｇ^SＧＴＴＣ^SＴＴＴＴＧ^SＧＴＣＣ^SＴＴＧ^SＴＣ^SＴ 3' を有し、ここでＳがイオウ原子を示す、オリゴヌクレオチド。４．請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。５．請求項２に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。６．請求項３に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。７．リポソーム調製物の治療的に有効な量をさらに含有する、請求項４に記載の組成物。８．前記リポソーム調製物がリポフェクチンを含有する、請求項７に記載の組成物。９．リポソーム調製物の治療的に有効な量をさらに含有する、請求項５に記載の組成物。１０．前記リポソーム調製物がリポフェクチンを含有する、請求項９に記載の組成物。１１．リポソーム調製物をさらに含有する、請求項６に記載の組成物。１２．前記リポソーム調製物がリポフェクチンを含有する、請求項１１に記載の組成物。

Claims

【特許請求の範囲】１．ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)遺伝物質の領域に結合したときに、該オリゴヌクレオチドがHIV遺伝物質の発現を実質的に減少させるに十分、該領域に相補的なヌクレオチド配列である、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。２．前記領域が、5'長末端反復とgag遺伝子である第１の開始コドンとの間；および第２のスプライシング受容部位からなる群から選択される、請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。３．前記ヌクレオチド配列が、+262〜+281；および+1189〜+1208からなる群から選択される核酸配列に相補的である、請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。４．前記ヌクレオチド配列が、からなる群から選択される、請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。５．前記ヌクレオチドが、少なくとも１つの共有結合したイオウ原子を含む、請求項４に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。６．前記ヌクレオチド配列が、からなる群から選択され、ここでＳはイオウ原子を示す、請求項５に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド。７．請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。８．さらに、脂質処方物の治療的に有効な量を含有する、請求項７に記載の組成物。９．前記脂質処方物が、脂質混合物、リポソーム、またはカチオン性脂質調製物を含む、請求項８に記載の組成物。１０．前記カチオン性脂質調製物がリポフェクチンである、請求項９に記載の組成物。１１．請求項２に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。１２．さらに、脂質処方物の治療的に有効な量を含有する、請求項１１に記載の組成物。１３．前記脂質処方物が、脂質混合物、リポソーム、またはカチオン性脂質処方物を含む、請求項１２に記載の組成物。１４．前記カチオン性脂質調製物がリポフェクチンである、請求項１３に記載の組成物。１５．請求項３に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。１６．さらに、脂質処方物の治療的に有効な量を含有する、請求項１５に記載の組成物。１７．前記脂質処方物が、脂質混合物、リポソーム、またはカチオン性脂質調製物を含む、請求項１６に記載の組成物。１８．前記カチオン性脂質調製物がリポフェクチンである、請求項１７に記載の組成物。１９．請求項４に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。２０．さらに、脂質処方物の治療的に有効な量を含有する、請求項１９に記載の組成物。２１．前記脂質処方物が、脂質混合物、リポソーム、またはカチオン性脂質調製物を含む、請求項２０に記載の組成物。２２．前記カチオン性脂質調製物がリポフェクチンである、請求項２１に記載の組成物。２３．請求項５に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。２４．さらに、脂質処方物の治療的に有効な量を含有する、請求項２３に記載の組成物。２５．前記脂質処方物が、脂質混合物、リポソーム、またはカチオン性脂質調製物を含む、請求項２４に記載の組成物。２６．前記カチオン性脂質調製物がリポフェクチンである、請求項２５に記載の組成物。