JPH09501186A

JPH09501186A - コレステリルエステル運搬蛋白質阻害ペプチドおよびこれを含む動脈硬化症のための予防および治療剤

Info

Publication number: JPH09501186A
Application number: JP8515938A
Authority: JP
Inventors: パク、ヨンボク; チョ、キュンヒュン
Original assignee: 株式会社エルジ化学
Priority date: 1994-11-12
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1997-02-04
Also published as: KR100204738B1; WO1996015141A1; KR960016905A; EP0733061A1; US5880095A

Abstract

(57)【要約】コレステリルエステル運搬蛋白質(ＣＥＴＰ)阻害活性を有する下記の配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド、その類似体または断片、またはそれらの混合物。

Description

【発明の詳細な説明】コレステリルエステル運搬蛋白質阻害ペプチドおよびこれを含む動脈硬化症のための予防および治療剤発明の分野本発明は、新規なコレステリルエステル運搬蛋白質(Cholesteryl Ester Trans fer Protein；以下ＣＥＴＰと略称)阻害ペプチドおよびこれを含む動脈硬化症のための予防および治療に関する。発明の背景動脈硬化症は、食生活の変化にしばしば起因する疾病であり、成人の患者数が増加しているのみでなく、青少年および子供までもがこの疾病にかかっている。動脈硬化症の発病および進行の原因として多くの遺伝的または環境的な危険因子(risk factor)が報告されてきたが、最近の研究は血中コレステロールの濃度の上昇が主な危険因子として選定されている。従って、血中のリポタンパク質(l ipoproteins)または脂質(lipids)の濃度と冠状動脈疾患の発病との相関関係の確立に多くの関心が集まっている。よく知られているように、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)と低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)は二つとも、ヒトの血中のコレステロールを主にコレステリルエステル（ＣＥ）の形態で運搬する。特にＨＤＬは、末端組織に残留するコレステロールを肝へ逆輸送してコレステロールが肝で分解、排出されるように作用する。従って、コレステロールはＨＤＬによって輸送される場合に除かれやすいので、コレステロールがＨＤＬから他のリポタンパク質に運搬されるのを阻害することによって血中のコレステロールの濃度を効果的に減少させることができる。これと関連して、ＣＥＴＰはＣＥをＨＤＬからＬＤＬに、或いは超低密度リポタンパク質(ＶＬＤＬ)に運搬する作用をするので、その機能に関する広範囲な研究が行われてきた。例えば、ドレーナらは、ヒトＣＥＴＰのｃＤＮＡ配列を決定し、これを成功裏にクローニングし(Drayna et al.,Nature,327,6123(1987))、ウァンらは、ヒトＣＥＴＰのｃＤＮＡを含むベクターを用いるヒトＣＥＴＰの生産を報告した(Wang et al.,DNA,8,753-758(1989))。クシワハらは、ＣＥＴＰが欠乏した幾つかの動物種は、高濃度のＨＤＬ−コレステロールと低濃度のＬＤＬ−コレステロールを有し、かつ、動脈硬化症の発病率が低いと報告した(Kushwaha et al.,J.of Lipid Research,34,1285-1297(1993 ))。かかる事実は、ＣＥＴＰとコレステロールの濃度と動脈硬化症の発病との間に重大な相関関係があることを暗示する。なお、日本では、ＣＥＴＰ欠乏家系の構成員は、大きいＨＤＬの粒子を有し、心臓疾患を患わずに長寿であるという事実が報告された(Koizumi et al.,Arteri osclerosis,58,175-186(1986))。最近、マロチらは、ＣＥＴＰ欠乏マウス(mouse )を異種のＣＥＴＰ遺伝子で形質転換した場合、対照マウス群に比べて形質転換したマウスは深刻な動脈硬化症を起こしたと報告した(Marotti et al.,Nature,3 64、73-75(1986))。前記の観察は、ＣＥＴＰが欠乏するか、またはその活性が阻害されると、ＨＤＬによるコレステロールの運搬または排出が促進され、これによって高濃度のコレステロールに起因する疾病、例えば、動脈硬化症を予防または治療することができるという仮説を支持する。図１は、コレステロールの逆輸送経路におけるＣＥＴＰの役割、およびＣＥＴＰとその阻害剤との相関関係を図式的に示す。図１に示したように、コレステロールはＨＤＬによってＣＥの形態で運搬され、ＣＥＴＰによってＬＤＬへ運搬される。ＬＤＬ中のＣＥは末端領域へ運搬されて細胞内に蓄積され、反面、ＨＤＬ中のＣＥは肝へ輸送されて分解、排出される。ＣＥの量がＨＤＬの輸送容量を超過する場合は、ＣＥが動脈壁のような特定の臨界領域の細胞内に蓄積される。かかる蓄積は結局、細胞の機能損傷を起こし、さらに細胞の壊死を惹起し、次いで、細胞破壊物が血管壁に蓄積されてアテローム性動脈硬化症を誘発する。しかし、この場合、ＣＥＴＰの作用が阻害または遮断されると、ＨＤＬ中のＣＥがＬＤＬへ運搬されず肝へ移送されるので、例えば血管壁でのＣＥの蓄積および動脈硬化症の発生を防止または最少化することができる。これに関連して、血漿中のコレステロールの濃度を低めるために、ＣＥＴＰ活性を阻害または減少させようとする多くの試みがあった。米国特許第５,２７９,５４０号は動脈硬化症を治療するために、動脈硬化症患者の血液を抗−ＣＥＴＰカラムに通して患者の血中ＣＥＴＰの濃度を減少させる方法を開示している。ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／１１７８２号では、ヒヒ(baboon)の血漿から分離したＣＥＴＰ阻害活性を有するペプチド；そのアミノ酸配列；および天然ペプチドと同一のＣＥＴＰ阻害活性を有し、前記配列に基づいて製造された合成ペプチドが開示されている。しかし、優れたＣＥＴＰ阻害活性を有するＣＥＴＰ阻害ペプチドを追求する必要性は依然として存在する。発明の概要従って、本発明の目的は、優秀な阻害活性を有する新規なＣＥＴＰ阻害ペプチドを提供することである。本発明の他の目的は、前記ペプチドの製造方法を提供することである。本発明のまた他の目的は、前記ペプチドを含む動脈硬化症の予防および治療剤を提供することである。本発明の一つの実施態様によって、下記のアミノ酸の配列を有する新規なＣＥＴＰ阻害ペプチド、ペプチドＰ₂₈が提供される。図面の簡単な説明前述した、そしてその他の本発明の目的および特徴は、本願に添付された図面を参照とした下記の説明から明らかになる。図１は、コレステロールの逆輸送経路でのＣＥＴＰの役割、およびコレステロールとその阻害剤との相関関係を図式的に示し；図２は、ヒト血漿とブタ血漿のＨＤＬ分画を用いた電気泳動の結果を示し；図３は、ブタ血漿から完全に分離した本発明の３ｋＤａのペプチドを用いた電気泳動の結果を示し；図４は、本発明の３ｋＤａペプチドのＣＥＴＰ阻害活性を示し；図５は、ペプチドＰ₂₈のＣＥＴＰ阻害活性の基質による変化；図６は、ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀がウサギにおけるＣＥＴＰ活性に及ぼす影響を示し；図７は、ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀がウサギにおける血中の総コレステロール濃度に及ぼす影響を示し；図８は、ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀がウサギにおける血中のＨＤＬコレステロール濃度に及ぼす影響を示し；図９は、ペプチドＰ₂₈またはＰ₁₀に対して特異性を有する抗体の生産を例示し；図１０は、ペプチドＰ₁₀とこれに対しての特異性を有する抗体との結合がペプチドＰ₁₀の変形体によって阻害されることを示す。発明の詳細な説明本発明のＣＥＴＰ阻害ペプチド、即ち、ペプチドＰ₂₈は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した結果、約３ｋＤａの分子量を有し、試験管内試験において高いＣＥＴＰ阻害活性、即ち、純粋なＣＥＴＰに対しては約９０ないし１００％およびヒト血漿に対しては約４０ないし５０％の阻害活性を示す。ペプチドＰ₂₈のアミノ酸配列をアミノ酸データバンク(即ち、大韓民国ＫＩＳＴのＫＲＩＢＢ)に寄託された他のペプチドのアミノ酸配列と比べた結果、ペプチドＰ₂₈のアミノ酸配列は、ブタのアポ−ＣIII蛋白質のＮ−末端断片、即ち、ペプチドＰ₂₈'と相当類似しており、下記の２８個のアミノ酸を含む。ブタのアポ−ＣIIIは、７３個のアミノ酸からなり、主として肝で合成されるが、小腸でも一部合成される。ブタのアポ−ＣIIIは、その機能に関する報告はないが、ＶＬＤＬおよびＨＤＬを構成する微量の蛋白質の一つとして知られている。前記で示したように、ペプチドＰ₂₈およびＰ₂₈'のアミノ酸配列は、Ｎ−末端から５番目および６番目のアミノ酸が相互異なることを除いては同一である。ペプチドＰ₂₈'も純粋なＣＥＴＰに対して約９０ないし１００％、またヒト血漿に対して約４０ないし５０％のＣＥＴＰ阻害活性を示す。ペプチドＰ28およびＰ28'は、多様なカラムクロマトグラフィー法を用いてブタの血漿から分離すること、または、公知の化学的方法に従って同一なアミノ酸配列を有するペプチドを合成することによって製造できる。化学的に合成されたペプチドも天然ペプチドと本質的に同等なＣＥＴＰ阻害活性を示す。なお、ヒトのアポ−ＣIIIは、７９個のアミノ酸と７４番目のアミノ酸に結合している炭水化物の残基からなる糖蛋白質である。該蛋白質は、８.７ｋＤａの分子量を有し、リポタンパク質のリパーゼおよび肝のリパーゼの活性を阻害する。ヒトのアポ−ＣIII蛋白質のＮ−末端断片、即ち、下記の１３個のアミノ酸を含むペプチドＰ₁₃もＣＥＴＰ阻害活性を示す：ペプチドＰ₂₈、Ｐ₂₈'およびＰ₁₃の断片もＣＥＴＰの活性を示す。かかる断片の例としては、ペプチドＰ₂₈の１番目ないし１０番目(Ｐ₁₀)、１番目ないし２４番目(Ｐ₂₄)、１番目ないし２０番目(Ｐ₂₀)、１番目ないし１４番目(Ｐ₁₄)、または１番目ないし８番目(Ｐ₈)のアミノ酸が各々下記の配列を有するＮ−末端断片とペプチドＰ₂₈'の１番目ないし１８番目のアミノ酸がＰ₁₈の配列を有するＮ− 末端断片が挙げられる。ＣＥＴＰ阻害活性を維持しながら一つ以上のアミノ酸が公知のアミノ酸変形体によって置換されて形成されるペプチドＰ₂₈、Ｐ₂₈'、Ｐ₁₃、Ｐ₁₀、Ｐ₂₄、Ｐ₂₀ 、Ｐ₁₄、Ｐ₈、またはＰ₁₈の変形体およびＣＥＴＰ阻害活性を有する該変形体の断片も本発明の範囲に含まれる。アミノ酸置換体は下記からなる群から選ぶことができる：Ｇｌｕに対する２−アミノアジピン酸、ＡｓｐまたはＣa−メチルＧｌｕ；Ａｓｐに対するＧｌｕ、Ｃa−メチルＡｓｐまたはβ−カルボキシＡｓｐ；Ｔｈｒに対するＳｅｒまたはＣa−メチルＴｈｒ；Ｓｅｒに対するＴｈｒまたはＣa−メチルＳｅｒ；Ｐｒｏに対する３，４−デヒドロＰｒｏまたはＣa−メチルＰｒｏ；Ｌｙｓに対するオルニチン、シトルリン、ＡｒｇまたはＣa−メチルＬｙｓ；Ｍｅｔに対するＣa−メチルＭｅｔ；Ｇｌｎに対するＡｓｎ、シトルリンまたはＣa−メチルＧｌｎ；Ｖａｌに対するイソＶａｌ、ノルＶａｌ、Ｃa−メチルＶａｌまたはＬｅｕ；Ａｌａに対するＧｌｙ、β−Ａｌａ、Ｃa−メチルＡｌａまたは２−アミノ酪酸；Ａｒｇに対するＬｙｓ、ホモＡｒｇ、Ｃa−メチルＡｒｇまたはシトルリン；およびＬｅｕに対するノルＬｅｕ、イソＬｅｕまたはＣa−メチルＬｅｕ。また、ペプチドＰ₂₈、Ｐ₂₈'およびＰ₁₃、これらの断片または類似体におけるペプチド結合はチオエーテル結合(−ＣＨ₂−Ｓ−)、アルキル結合(−ＣＨ₂−ＣＨ₂−)およびアミノ結合(−ＣＨ₂−ＮＨ₂−)などのような他の結合で置換され得る。ペプチドＰ₂₈、Ｐ₂₈'またはＰ₁₃、またはこれらの断片を含むポリペプチドまたは蛋白質もＣＥＴＰ阻害活性を示すことができ、これらも本発明の範囲に含まれる。なお、本発明は、ペプチドＰ₂₈、Ｐ₂₈'またはＰ₁₃、これらの断片、または前記ペプチドを含むポリペプチドまたは蛋白質に対する特異性を有する抗体を提供する。本発明の抗体は動脈硬化症の予防および診断試薬の製造に有用である。本発明のペプチドは、ＣＥのＨＤＬからＬＤＬおよびＶＬＤＬへの運搬を遮断するのでＣＥがＨＤＬによって肝へ輸送されて末端細胞内のコレステロールを除く作用を有するＣＥＴＰ阻害剤である。従って、本発明のＣＥＴＰ阻害ペプチドは動脈硬化症の予防および治療に使用できる。従って、本発明は、薬剤学的に許容され得る賦形剤、担体または希釈剤とともに、血中コレステロール濃度の低下または動脈硬化症の予防または治療に効果的な量のペプチドＰ₂₈、Ｐ₂₈'またはＰ₁₃、これらの断片または類似体を活性成分として含む抗動脈硬化症組成物を提供する。前記組成物は任意の通常の方法によって製造できる。組成物の製造において、活性成分は担体に混合または希釈されるか、または担体内に封入されるのが好ましい。従って、前記組成物は錠剤、丸剤、粉剤、香粉 (Sachet)、エリキシル(elixir)、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射剤、滅菌包装粉末製剤などの形態であり得るが、滅菌注射剤の形態が好ましい。前記組成物を注射剤として調剤する場合は、これを凍結乾燥した形態で保管または投与することができる。適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、スターチ、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、微細結晶性セルロース、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カオリン、コロイド状の二酸化硅素、ヒドロキシプロピルスターチ、プロピレングリコール、カゼイン、炭酸水素ナトリウム、乳酸カリウム、ラノリン、ゼラチン、グリセリン、ベントナイト、ステアリン酸カルシウム、ポリビニルアルコール、クエン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビトール、ラノリンエステルなどがある。前記組成物は、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、安定化剤、結合剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の組成物は、当分野で広く知られた任意の方法を用いて患者に投与された後活性成分が迅速に、かつ持続的に、または遅延放出(delayed release)されるように調剤することができる。前記医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内および筋肉内投与をはじめ種々の経路で毎日または規則的に投与され得る。活性成分の１日投与量は、通常、約１ないし３０００ｍｇ、好ましくは２０ないし３００ｍｇの範囲であり、一度に、または数回にわけて投与できる。しかし、実際に投与される活性成分の量は、治療すべき症状、選定される投与経路、患者の体重および年齢、および患者の症状の重さを含む多様な関連因子を考慮して決定されなければならない。従って、前述の投与量が本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。下記の参照試験例および実施例は本発明をさらに例示するためのものであり、本発明の範囲を制限することはなく、特に断らない限り、実施例で用いられた実験方法は下記参照試験例によって行われた。また、以下固体中固体混合物、液体中液体混合物および液体中固体混合物に対しての百分率は、特に断らない限り、各々重量／重量、体積／体積および重量／体積の基準である。参照試験例１：ＣＥＴＰ阻害活性度の決定モートンらの方法(Morton et al.,J．Biol．Chem.,256、11992-11995(1981))によって、ＬＤＬおよび［³Ｈ］−コレステリルオレイン酸で標識されたＨＤＬを合成した後、超遠心分離器(Beckman XL 70)を用いてこれらを分離した。製造されたＬＤＬおよび［³Ｈ］−ＨＤＬを各ＣＥ−受容体およびＣＥ−供与体として用いた。ヘスラーらの方法(Hesler et al.,J.Biol.Chem.,262,2275-2282(1987))によってヒトの血漿から純粋なＣＥＴＰを分離してＣＥＴＰ源として用いた。前記で製造したＬＤＬ０.３ｍｌ、［³Ｈ］−ＨＤＬ０.０５ｍｌおよびＣＥＴＰ源０.０５ｍｌと、ＣＥＴＰ阻害剤０.０５ｍｌとを１.５ｍｌ容量の管に入れて３７℃で３時間反応させた。反応が終わった後、モートンらの方法(Morton et al.,Biochim.Biophys.Acta. ,663,350-355(1981))に従ってＬＤＬを沈殿させた。上澄液の一部を取って液体シンチレーション計数器(Packard Tricarb 1600 TR)を用いてＬＤＬへ運搬された同位元素の量を測定し、これからＣＥＴＰの活性度を算出した。この際、ＣＥＴＰ阻害剤の阻害活性度は、ＣＥＴＰ阻害剤の添加されていない試料を対照群とし、ＣＥＴＰ阻害剤の添加された試料を試験群として、下記のように算出した：参照試験例２：血中総コレステロール濃度の定量アラインらの方法(Allain et al.,Clinical Chemistry,20,470-475(1974))に従って、ウサギの血中総コレステロール濃度の定量を行った。具体的には、ウサギの血漿０.００１ｍｌおよびコレステロール測定用の酵素試薬(Sigma 352-50) ０.５ｍｌを１.５ｍｌ容量の管に入れ、３７℃で５分間撹拌しながら反応させた。反応物を２ｍｌ取って分光計を用いて５００ｎｍでの光学密度(Ｏ.Ｄ.)を測定した。標準曲線と比べて総コレステロールの濃度を算出した。参照試験例３：血中ＨＤＬコレステロール濃度の定量デキストラン硫酸ＭｎＣｌ₂沈殿法(Warnick et al.,Clinical Chemistry,28,1 385-1397(1982))によって、ウサギの血中ＨＤＬコレステロール濃度を定量した。具体的には、ウサギの血漿０.０５ｍｌとＨＤＬコレステロール試薬(Sigma 35 2-3)０.０１ｍｌとを混合し、反応させ、５分間静置した後、３,０００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄液０.００５ｍｌをコレステロール測定用酵素試薬(Sigm a 352-50)０.５ｍｌと混合し、３７℃で５分間撹拌しながら反応を行った。反応液０.２ｍｌを採取後、分光計を用いて５００ｎｍでの光学密度を測定した。標準曲線と比べてＨＤＬコレステロールの濃度を算出した。実施例１：ブタ血漿からＣＥＴＰ阻害ペプチドの同定ヒトおよびブタの血漿をＣＥＴＰ阻害剤として用いて参照試験例１の手順によってヒトおよびブタ血漿のＣＥＴＰ阻害活性度を測定した。その結果、ブタの血漿はヒトの血漿に比べ約１０％のＣＥＴＰ阻害活性度を示した。一方、前記モートンらの方法によって、ヒトおよびブタの血漿を超遠心分離してＨＤＬ分画を得、次いで、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動した。図２は、ヒトおよびブタの血漿のＨＤＬ分画を電気泳動した結果を示し、第１列および第２列は分子量標準物質(ゲルの上部から６７−１４ｋＤａおよび２０ −３ｋＤａ)であり、第３列および第４列は各々ヒトおよびブタの血漿のＨＤＬ分画である。図２に示したように、約３ｋＤａの蛋白質バンドはブタ血漿にのみ観察された。実施例２：ブタ血漿からＣＥＴＰ阻害ペプチドの分離ブタの新鮮な血液から２００ｇの血漿を取って、ここに硫酸アンモニウム１０ .５ｇを添加した。混合物を４,０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を、フェニル−セファロース(Separose)ＣＬ−４Ｂカラム(Pharmacia社製品、スウェーデン)の上で分離し、参照試験例１の方法に従って全ての蛋白質の分画のＣＥＴＰ阻害活性度を決定した。高いＣＥＴＰ阻害活性を有する分画を収集した後、ＤＥＡＥ−セファデクス(S ephadex)カラム(Pharmacia社製品、スウェーデン)に通して高い阻害活性を有する分画を収集した。次いで、前記分画をヒドロキシルアパタイトカラム(Bio−Ra d社製品、米国)に通して３ｋＤａのペプチドを含有する分画を得た後、参照試験例１の方法に従ってそのＣＥＴＰ阻害活性度を決定した。実施例３：３ｋＤａペプチドのＣＥＴＰ阻害活性度の測定実施例１のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の結果分離された３ｋＤａの蛋白質バンドを手術用メスで切断して別の電気泳動装置のＨ−型管に入れ、次いで、電気溶出(参照：Hunkapiller et al.,Meth．Enzymol.,91,227-236(1986)) して純粋な３ｋＤａペプチドを得た。図３は、ブタの血漿から完全分離した本発明の３ｋＤａペプチドを電気泳動によって分析した結果を示し、ここでＡおよびＢ列は分子量標準物質(ゲルの上部から９７−１４ｋＤａおよび２０−３ｋＤａ)であり、第１列は二硫化物結合を切断するβ−メルカプトエタノールを０.２％添加して電気泳動した３ｋＤａペプチドであり、第２列はβ−メルカプトエタノールを添加しないで電気泳動した３ｋＤａペプチドである。図３に示したように、ブタの血漿から分離した純粋な３ｋＤａバンドは第１列および第２列で同一の位置で確認されるが、これは前記ペプチドが単一のペプチドであることを意味する。前記で分離された純粋な３ｋＤａペプチドまたはヒトのアルブミン(対照実験) のＣＥＴＰ阻害活性度を前記参照試験例の方法によって決定した。また、ヒトの血漿をそのままにＣＥＴＰ源として用いることを除けば参照試験例と同一の手順を経て、純粋な３ｋＤａペプチドのＣＥＴＰ阻害活性度を決定した。図４は、本発明の３ｋＤａペプチドのＣＥＴＰ阻害活性度を示すものであり、ここで曲線ＡおよびＢは、ＣＥＴＰ阻害剤としてヒトの血漿から分離された純粋なＣＥＴＰとヒトの血漿そのものをそれぞれ用いた場合の３ｋＤａペプチドのＣＥＴＰ阻害活性度を示し；曲線Ｃはヒトの血漿から分離された純粋なＣＥＴＰがＣＥＴＰ阻害剤として用いられた場合、ヒトのアルブミンのＣＥＴＰ阻害活性度を示す。図４に示したように、ヒトの血漿から分離された純粋なＣＥＴＰおよびヒト血漿そのものがそれぞれＣＥＴＰ阻害剤として用いられた場合、１ｎＭの３ｋＤａペプチドが約１００％(Ａ)および約５０％(Ｂ)のＣＥＴＰ阻害活性度を示す反面、ヒトのアルブミンはＣＥＴＰ阻害活性をほとんど示していなかった。実施例４：ＣＥＴＰ阻害ペプチドのアミノ酸配列ラムリらの方法(Laemmli et al.,Nature,227,680-685(1970))に従って、実施例２で得た３ｋＤａペプチドを緩衝液(４％ＳＤＳ，０.２５Ｍトリス(Ｔｒｉｓ，１０％グリセロール)に溶解させ、３７℃で１２時間反応させた後、１５ｍＡで１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの上で電気泳動を実施した。マツダイラの方法(Matsudaira，J．Biol．Chem.,262,10035-10038(1987))によって、ゲル上で分離した３ｋＤａのペプチドを二フッ化ポリビニル(ＰＶＤＦ)の膜へ送り、膜を７０％エタノールで洗浄した。自動アミノ酸分析器(Protein Seq uenator 470A,Applied Biosystem社製品)を用いて、３ｋＤａのペプチドのＮ− 末端から２８個のアミノ酸を確認した結果、アミノ酸配列は次のようであった。実施例５：ＣＥＴＰ阻害ペプチドの合成実施例４で分析されたアミノ酸配列に基づいて、固相結合法を用いる自動アミノ酸合成器を使用して２８個のアミノ酸を有する３ｋＤａペプチド (Ｐ₂₈)を大量合成した。具体的には、ｔ−Ｂｏｃ基によって保護されたＣ−末端アミノ酸をポリスチレン樹脂に結合し、ｔ−Ｂｏｃ基を除いた後、ｔ−Ｂｏｃ基で保護された次のアミノ酸を最初のアミノ酸の脱保護アミノ基にペプチド結合させた。成長するペプチド鎖に２８番目のアミノ酸が結合されるまで前記手順を繰り返してペプチドＰ₂₈を合成した。ポリスチレン樹脂からＰ₂₈を分離した後、ＨＰＬＣ(GME 712、Gilson社製品)を用いて精製した。前記と同一の手順を繰り返して、各々Ｐ₂₈'、Ｐ₁₃、Ｐ₁₀、Ｐ₁₈、Ｐ₂₄、Ｐ₂₀ 、Ｐ₁₄、およびＰ₈と命名されたペプチドを合成したが、それらのアミノ酸配列は下記のように確認された。実施例６：合成されたペプチドのＣＥＴＰ阻害活性度純粋ＣＥＴＰまたはヒトの血漿をＣＥＴＰ源として使用して参照試験例１の方法に従って、Ｐ₂₈、Ｐ₁₀、Ｐ₁₈、Ｐ₂₄、Ｐ₂₀、およびＰ₁₄のＣＥＴＰ阻害活性度を測定した。非特異的な阻害の可能性を排除するために、対照群として任意のアミノ酸配列を有する２ｋＤａの水溶性ペプチドを合成した後、類似の方法でそのＣＥＴＰ阻害活性度を決定した。前記試験の結果を表Ｉに示した。ペプチドの阻害活性度は、分散分析による平均値±標準偏差として表Ｉに示し、大きい誤差を示す結果はダンカンの多重範囲試験(Duncan,D.B.,“Multiple Ra nge and Multiple F Test,”Biometrics,11,1-12(1955))を行って検討した。表Ｉで分かるように、ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀'、およびこれらの断片、即ち、ペプチドＰ₁₀、Ｐ₁₈、Ｐ₂₄およびＰ₂₀は純粋なＣＥＴＰに対しては約９０ないし１００％、ヒトの血漿に対しては約４０ないし５０％の高いＣＥＴＰ阻害活性度を示す。対照群として使用した２ｋＤａペプチドは、ＨＤＬからＬＤＬへのＣＥの運搬にほとんど影響を及ぼさなかった。実施例７：合成されたペプチドのＣＥＴＰ阻害活性度通常の遺伝工学技法を用いて、ペプチドＰ₂₄、Ｐ₂₀およびＰ₁₄を大腸菌(E.col i)で発現させ、ヒトの血漿をＣＥＴＰ源として用いる参照試験例の方法に従って、これらのＣＥＴＰ阻害活性度を測定した。その結果を表IIに示すが、ペプチドＰ₂₄、Ｐ₂₀およびＰ₁₄が全てＣＥＴＰ阻害活性を示した。実施例８：ＣＥＴＰ阻害活性に影響を及ぼすアミノ酸の確認実施例６でＣＥＴＰ阻害活性が確認されたペプチドＰ₁₀において、そのＣＥＴＰ阻害活性に直接的な影響を及ぼすアミノ酸を調べるために、Ｐ₁₀の各々のアミノ酸残基をアラニン残基で次々と置換して１０個の変形体を得た。参照試験例の方法に従って、前記変形体のＣＥＴＰ阻害活性度を測定し、その結果を表IIIに示す。表IIIに示したように、Ｐ₁₀のＮ−末端から１ないし５番目のアミノ酸がＣＥＴＰ阻害活性に決定的な役割を有し、９番目および１０番目のアミノ酸はＰ₁₀の活性にほとんど影響を及ぼさないことが明らかにされた。実施例９：基質によるペプチドＰ₂₈のＣＥＴＰ阻害活性度ペプチドＰ₂₈の血中の阻害機構を知るために、参照試験例１の方法に従ってＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬまたは再合成されたＬＤＬ(ＬＤＬＲ)をＣＥ受容体として用いてペプチドＰ₂₈のＣＥＴＰ阻害活性度を測定した。ＬＤＬＲは、モートンらの方法(J．Biol．Chem.，256,11992-11995(1981)参照)によって参照試験例１で得たＬＤＬから合成した。ＬＤＬをクロロホルムで脱脂質し、ゲルクロマトグラフィーを行ってＡｐｏＢ１００蛋白質を得た。ホスファチジルコリンおよびオレイン酸コレステリルをよく混合し、窒素ガスを用いて乾燥した後、ここに前記で得たＡｐｏＢ１００蛋白質を加えた。混合物を撹拌しながら反応し、トリス緩衝液で透析し、ゲルクロマトグラフィーを行ってＬＤＬＲを得た。その結果を図５に示したが、ここで、ペプチドＰ₂₈は最終濃度２μＭでＣＥのＨＤＬからＶＬＤＬへの運搬を約１０％、ＨＤＬからＬＤＬへの運搬を約５０％、ＨＤＬからＬＤＬＲへの運搬を約５５％の割合で各々阻害することが分かる。ペプチドＰ₂₈によるＨＤＬからＨＤＬへのＣＥ運搬の阻害は観察されなかった。実施例１０：毒性試験ヒトの繊維芽細胞株(Ａ４３１、ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５)を、１０％(ｗt ／ｖｏｌ)のペプチドＰ₂₈、Ｐ₁₈、Ｐ₁₀、Ｐ₂₄、Ｐ₂₀、またはＰ₁₄を添加して１０％牛胎血清(ＦＢＳ)含有ＤＭＥＭ培地で７２時間培養した。培養された細胞はペプチドを添加しないで培養した対照群と比べ、成長状態および形態における変化を示さなかった。実施例１１：ペプチドの効果に対する生体内試験高脂血症が誘発された４グループのニュージランドホワイト(New Zealand Whi te)種のウサギにペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀を注射することによって、動物生体内でのリポタンパク質の代謝に及ぶ前記ペプチドの効果を調べた。実験条件は表IV に示した。注射前の３週の間、グループＢ、ＣおよびＤのウサギに０.３％のコレステロール食餌を与えて高脂血症を誘発した。グループＡまたはＢのウサギには生理食塩水１ｍｌずつを耳静脈を通じて注射し、グループＣおよびＤのウサギには各々ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀２０ｍｇを同一な方法で注射した。注射後、１、３または６時間ごとに７２時間の間、ウサギの耳静脈を通じて２ｍｌずつ採血した。参照実施例２の方法に従って血液から血漿を分離して使用するまで零下２０℃の冷凍庫に保管した。全ての採血が完了した後、ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀の効果を次のような三つの項目に対して調べ、その結果を下記に示した。１.ＣＥＴＰ活性に及ぶペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀の影響静脈注射直前および注射後７２時間の間、１時間ごとにウサギから血液試料を採血し、参照試験例１の方法に従ってそれらのＣＥＴＰの活性度を決定した。その結果、グループＡおよびＢの場合、注射後７２時間の間、ＣＥＴＰの活性度はほとんど変わらなかった。グループＣの場合は、対照群のグループＢに比べて注射後３０時間まで７０％以上の阻害活性を示した。グループＤの場合、対照群のグループＢに比べて注射後２０時間まで６０％以上のＣＥＴＰ阻害活性を示した。その結果を図６に示す。２.血中の総コレステロールの濃度に及ぶペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀の影響静脈注射直前および注射後７２時間の間、１時間ごとにウサギから血液試料を採血し、参照試験例２の方法に従って血中の総コレステロールの濃度の変化を観察した。その結果、グループＡのウサギでの血中の総コレステロール濃度は、初期段階では少し減少し、注射後２０時間からは徐々に増加し、グループＢでは、注射直後５％減少したが、注射後７時間からは変化がなかった。しかし、グループＣおよびＤの場合は、注射直後濃度が減少し、グループＣの場合は、注射して９時間後には初期濃度の８０％になり、グループＤの場合は、注射して１２時間後に初期濃度の７０％になった。その結果を図７に示す。３.血中のＨＤＬコレステロールの濃度に及ぶペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀の影響静脈注射直前および注射後７２時間の間、規則的にウサギから血液試料を採血し、参照試験例３の方法に従って血中のＨＤＬコレステロールの濃度の変化を観察した。その結果、グループＡの場合、血中のＨＤＬコレステロールの濃度は注射直後少し減少し、グループＢの場合には一定の濃度を維持し、グループＣの場合には、注射して３０時間後から徐々に増加しはじめて３６時間後には最初の濃度の１１３％まで増加し、グループＤの場合には、静脈注射直後から徐々に増加しはじめて５７時間後には最初の濃度の１３５％まで増加した。その結果を図８に示す。実施例１２：ペプチドＰ₂₈またはＰ₁₀に対して特異的な抗体の生産ペプチドＰ₁₂またはＰ₁₀に対して特異的な抗体は次のように生産した。ペプチドの免疫源性を増加させるために、ペプチドを、コンジュゲーションキット(con jugation kit; Pierce 77101，フランス)を用いてキーホールリンペット(key- hole limpet)ヘモシアニン(ＫＬＨ)とコンジュゲートさせた。コンジュゲートされたペプチドを、同一容積のフロイント完全アジュバント(Freund′s complete adjuvant;FCA、Sigma F5881、米国)とよく混合し、これをウサギに皮下注射した。フロイント不完全アジュバント(Freund′s incomplete adjuvant;FIA、Sigma F 5506、米国)と前記コンジュゲートされたペプチドとの混合物を用いて２週間隔で４回の追加注射を行った。最終注射後、ウサギの耳静脈から血液試料を取り、ペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀に対する抗体の生産を確認するために、ＥＬＩＳＡ試験法によってこれらの抗体の濃度を調査した。その結果を図９に示す。抗体の生産が確認されたウサギから血液試料３０ｍｌを採血してペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀に対する抗血清を得、前記抗血清を蛋白質Ａカラム(Pierce 22811、フランス)に通してペプチドＰ₂₈およびＰ₁₀に対して特異的な免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)を得た。実施例１３：ペプチドＰ₁₀の類似体ペプチドＰ₁₀を炭酸塩緩衝溶液(ｐＨ９.５)に１μｇ／ｍｌの最終濃度で溶かした。生成された溶液をＥＬＩＳＡ平板（Ｎｕｎｃ社、米国）の各ウェルにウェル当たり１００μｌずつの量で加えた後、４℃で１８時間反応させて、ペプチドを平板に吸着させた。前記平板をリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７.２）で３回洗浄し、０.２％ゼラチン溶液を各ウェルにウェル当たり２００μｌずつ添加し、室温で２時間反応させて残りの蛋白質吸着部位を遮断した。１００,０００倍の容積のリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ，ｐＨ７.２)で希釈したペプチドＰ₁₀に対する抗体含有溶液１００μｌ、または、ペプチドＰ₁₀の変形体、即ち、実施例８で得た変形体Ｅ(Ａ５)およびＪ(Ａ１０)、および１０番目のアミノ酸のＤ−型である変形体Ｄ１０を各々１μｇずつを更に含有する抗体溶液１００μｌを、平板の各ウェルに添加した。前記平板を３７℃で２時間反応させ、リン酸塩緩衝溶液(ｐＨ７.２)で３回洗浄した。セイヨウワサビ過酸化酵素(horseradish peroxidase;HRP)で標識された抗−マウスＩｇＧ抗体を含んだ溶液を１０,０００倍の容積のＰＢＳ(ｐＨ７.２)で希釈して各ウェルにウェル当たり１００μｌずつ添加した。生成物を３７℃で２時間培養させた後、リン酸塩緩衝液(ｐＨ７.２)で３回洗浄した。次いで、各ウェルにＯ−フェニレンジアミン(OPD;Sigma社、米国)溶液１００μｌを添加し、暗所で室温下３０分間恒温処理した。生成物に、２Ｎ硫酸を１５０μｌ／ウェルの量で添加して発色を中断させた後、ＥＬＩＳＡリーダー(reader)(Dynatech MR 500 0、米国)を用いて４９２ｎｍでの各ウェルの光学密度を測定した。図１０に示したように、実施例８でＣＥＴＰ阻害活性を有すると記述された３種の変形体、即ち、Ａ５、Ａ１０およびＤ１０は、ペプチドＰ₁₀がその抗体に結合するのを阻害している。実施例１４：ブタおよびヒトのアポ−ＣIII断片のＣＥＴＰ阻害活性度の測定ＣＥＴＰ阻害活性を有するペプチドＰ₁₀と高い相同性を有するアミノ酸配列を有する２種のブタおよびヒトのアポ−ＣIIIの二つのＮ−末端断片、ペプチドＰ₂ ₈ 'およびＰ₁₃を、遺伝工学技法によって大腸菌(E.coli)を用いて生産した。ペプチドＰ₂₈'およびＰ₁₃のアミノ酸配列を下記に示す。ヒトの血漿をＣＥＴＰ源として用いることを除いては参照試験例１と同じ方法に従ってペプチドＰ₂₈'およびＰ₁₃のＣＥＴＰ阻害活性を測定した。その結果を表Ｖに示す。表Ｖに示したように、ブタおよびヒトのアポ−ＣIIIのＮ−末端断片、即ち、ペプチドＰ₂₈'およびＰ₁₃はＣＥＴＰ阻害活性を有する。本発明を上記の具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ることは当然である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＮ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸ 39/395 ＡＤＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．コレステリルエステル運搬蛋白質(ＣＥＴＰ)阻害活性を有する下記の配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド、その類似体または断片、またはこれらの混合物。２．ブタのアポリポタンパク質ＣIIIの断片であり、下記のアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド。３．ヒトのアポリポタンパク質ＣIIIの断片であり、下記のアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド。４．断片が下記の群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド。５．断片が下記のアミノ酸配列を有する請求項２記載のペプチド。６．下記の群から選ばれる修飾アミノ酸で一つ以上のアミノ酸が置換された請求項１記載のペプチド。Ｇｌｕに対して、２−アミノアジピン酸、ＡｓｐまたはＣa−メチルＧｌｕ；Ａｓｐに対して、Ｇｌｕ、Ｃa−メチルＡｓｐまたはβ−カルボキシＡｓｐ；Ｔｈｒに対して、ＳｅｒまたはＣa−メチルＴｈｒ；Ｓｅｒに対して、ＴｈｒまたはＣa−メチルＳｅｒ；Ｐｒｏに対して、３，４−デヒドロＰｒｏまたはＣa-メチルＰｒｏ；Ｌｙｓに対して、オルニチン、シトルリン、ＡｒｇまたはＣa−メチルＬｙｓＭｅｔに対して、Ｃa−メチルＭｅｔ；Ｇｌｎに対して、Ａｓｎ、シトルリンまたはＣa−メチルＧｌｎ；Ｖａｌに対して、イソＶａｌ、ノルＶａｌ、Ｃa−メチルＶａｌまたはＬｅｕ；Ａｌａに対して、Ｇｌｙ、β−Ａｌａ、Ｃa−メチルＡｌａまたは２−アミノ酪酸；Ａｒｇに対して、Ｌｙｓ、ホモＡｒｇ、Ｃa−メチルＡｒｇまたはシトルリン；およびＬｅｕに対して、ノルＬｅｕ、イソＬｅｕまたはＣa−メチルＬｅｕ７．一つ以上のペプチド結合が、チオエーテル結合（−ＣＨ₂−Ｓ−）、アルキル結合(−ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、またはアミノ結合(−ＣＨ₂−ＮＨ₂−)で置換されているか；またはアミノ末端がアセチル化されているか；またはカルボキシ末端がアミド化されている請求項１記載のペプチド。８．請求項１に記載のペプチドに対して特異的である抗体。９．有効量の請求項１に記載のペプチド、および薬剤学的に許容され得る担体を含む動脈硬化症の予防または治療用組成物。 10．ブタの血漿からペプチドを分離する段階を含む請求項１に記載のペプチドの製造方法。 11．請求項１に記載のペプチドが請求項８に記載の抗体に結合することを阻害し得るＣＥＴＰ阻害ペプチド。 12．下記の群から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項１１記載のペプチド。