JP2938128B2 - 虚血性心疾患の予防・治療剤 - Google Patents
虚血性心疾患の予防・治療剤Info
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- JP2938128B2 JP2938128B2 JP10043990A JP10043990A JP2938128B2 JP 2938128 B2 JP2938128 B2 JP 2938128B2 JP 10043990 A JP10043990 A JP 10043990A JP 10043990 A JP10043990 A JP 10043990A JP 2938128 B2 JP2938128 B2 JP 2938128B2
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- ser
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は虚血性心疾患の予防・治療剤、更に詳しくは
虚血が原因で引き起こされる、例えば狭心症および心筋
梗塞の予防・治療剤に関する。
虚血が原因で引き起こされる、例えば狭心症および心筋
梗塞の予防・治療剤に関する。
従来の技術 成人病のひとつとして近年著しく増加のみられる心臓
病の中でも虚血性心疾患、とくに狭心症、心筋梗塞はそ
の症状の激しさ、死亡率の高さ、また軽症であっても患
者にとっての心理的不安の大きさなどから、その予防お
よび治療は重要な課題である。狭心症および心筋梗塞は
心臓への血液供給が減少あるいは遮断されることにより
生じる。特に血液遮断の時間が長くなれば心筋細胞の障
害あるいは壊死値（心筋梗塞巣）は進展し、心臓はポン
プ機能失調に陥いり全身循環不全により死に至る。心臓
の血液供給は冠動脈を介して行われており、この冠動脈
が収縮あるいは攣縮を生じることがこれら疾患の主な原
因とされている。
病の中でも虚血性心疾患、とくに狭心症、心筋梗塞はそ
の症状の激しさ、死亡率の高さ、また軽症であっても患
者にとっての心理的不安の大きさなどから、その予防お
よび治療は重要な課題である。狭心症および心筋梗塞は
心臓への血液供給が減少あるいは遮断されることにより
生じる。特に血液遮断の時間が長くなれば心筋細胞の障
害あるいは壊死値（心筋梗塞巣）は進展し、心臓はポン
プ機能失調に陥いり全身循環不全により死に至る。心臓
の血液供給は冠動脈を介して行われており、この冠動脈
が収縮あるいは攣縮を生じることがこれら疾患の主な原
因とされている。
このため、これまで狭心症あるいは心筋梗塞の予防な
いし治療には、心臓への血液供給を増加させる冠血管拡
張薬、また心臓の負担を軽減する利尿薬、さらに積極的
に心筋の収縮力を増加させる強心薬が用いられている
が、未だ満足すべき効果は得られていない。
いし治療には、心臓への血液供給を増加させる冠血管拡
張薬、また心臓の負担を軽減する利尿薬、さらに積極的
に心筋の収縮力を増加させる強心薬が用いられている
が、未だ満足すべき効果は得られていない。
一方、最近の研究では内皮細胞より生成される21個の
アミノ酸よりなるエンドセリンが冠動脈においても、こ
れまでに見出された生体内物質あるいは合成物質の中で
も最も強力かつ持続的な収縮作用を有することが示さ
れ、狭心症あるいは心筋梗塞の主要原因とされる冠動脈
収縮に関与している可能性が示唆されるに至った。
アミノ酸よりなるエンドセリンが冠動脈においても、こ
れまでに見出された生体内物質あるいは合成物質の中で
も最も強力かつ持続的な収縮作用を有することが示さ
れ、狭心症あるいは心筋梗塞の主要原因とされる冠動脈
収縮に関与している可能性が示唆されるに至った。
エンドセリンに関しては、内皮細胞培養上清中より見
出されたエンドセリン−１（アミノ酸配列：（Cys Ser
Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cy
s His Leu Asp Ile Ile Trp）、およびその遺伝子ファ
ミリーとして染色体DNAよりその配列が決定されたエン
ドセリン−２（アミノ酸配列:Cys Ser Cys Ser Ser Trp
Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His Leu Asp I
le Ile Trp） およびエンドセリン−３（アミノ酸配列:Cys Thr Cys P
he Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His
Leu Asp Ile Ile Trp）が知られている。またエンドセ
リン−１の前駆体としてアミノ酸38個からなるヒトビッ
グ−エンドセリン−１（アミノ酸配列:Cys Ser Cys Ser
Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His L
eu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu His Val Val
Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser）およびアミノ
酸39個からなるブタビッグ−エンドセリン−１（アミノ
酸配列:Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys
Val Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn T
hr Pro Glu His Ile Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro
Ser Arg Ser）も得られている。
出されたエンドセリン−１（アミノ酸配列：（Cys Ser
Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cy
s His Leu Asp Ile Ile Trp）、およびその遺伝子ファ
ミリーとして染色体DNAよりその配列が決定されたエン
ドセリン−２（アミノ酸配列:Cys Ser Cys Ser Ser Trp
Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His Leu Asp I
le Ile Trp） およびエンドセリン−３（アミノ酸配列:Cys Thr Cys P
he Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His
Leu Asp Ile Ile Trp）が知られている。またエンドセ
リン−１の前駆体としてアミノ酸38個からなるヒトビッ
グ−エンドセリン−１（アミノ酸配列:Cys Ser Cys Ser
Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His L
eu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu His Val Val
Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser）およびアミノ
酸39個からなるブタビッグ−エンドセリン−１（アミノ
酸配列:Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys
Val Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn T
hr Pro Glu His Ile Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro
Ser Arg Ser）も得られている。
本明細書においては、これらのエンドセリン関連ペプ
チドをあわせてエンドセリンと総称する。
チドをあわせてエンドセリンと総称する。
発明が解決すべき課題 以上述べたように虚血が原因で引き起こされる、心疾
患の予防・治療剤を提供することが急務であった。
患の予防・治療剤を提供することが急務であった。
課題を解決するための手段 本発明者等はエンドセリンの作用を特異的に抑制する
抗体を作製し、本抗体特有の薬理作用を見出した。
抗体を作製し、本抗体特有の薬理作用を見出した。
すなわち、本抗体が種々の動物の冠動脈においてエン
ドセリンによる収縮を抑制し、あるいはエンドセリンに
よる細胞障害活性を抑制し、さらには虚血／再灌流モデ
ルにおける心筋梗塞巣の縮小作用を有することを見出
し、これらの知見に基づいてさらに検討の結果、本発明
を完成した。
ドセリンによる収縮を抑制し、あるいはエンドセリンに
よる細胞障害活性を抑制し、さらには虚血／再灌流モデ
ルにおける心筋梗塞巣の縮小作用を有することを見出
し、これらの知見に基づいてさらに検討の結果、本発明
を完成した。
すなわち本発明はエンドセリンの作用を特異的に抑制
する抗体を含有する虚血性心疾患予防および治療剤であ
る。該エンドセリンの作用としては哺乳動物大動脈血管
平滑筋収縮活性、あるいは細胞障害活性等が挙げられ
る。該抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体が含まれる。
する抗体を含有する虚血性心疾患予防および治療剤であ
る。該エンドセリンの作用としては哺乳動物大動脈血管
平滑筋収縮活性、あるいは細胞障害活性等が挙げられ
る。該抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体が含まれる。
本発明のポリクローナル抗体の調製は一般に免疫抗原
のエンドセリンとキャリアー蚤白との複合体をつくり、
このものを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から
抗エンドセリン抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行
うことによる。
のエンドセリンとキャリアー蚤白との複合体をつくり、
このものを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から
抗エンドセリン抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行
うことによる。
本発明のモノクローナル抗体の調製に当っては、上記
免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５
日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それらに含まれる
抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定的に力価の
高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、モノクロ
ーナルなハイブリドーマを得ることによる。
免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５
日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それらに含まれる
抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定的に力価の
高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、モノクロ
ーナルなハイブリドーマを得ることによる。
免疫抗原のエンドセリンとしては、例えば、前記文献
等に記述された天然精製標品あるいは合成標品等いずれ
も使用でき、先に述べたエンドセリン−１、エンドセリ
ン−２、エンドセリン−３、ヒトビッグ−エンドセリン
−１、ブタビッグ−エンドセリン−１およびそれらの一
部分がこの中に含まれる。
等に記述された天然精製標品あるいは合成標品等いずれ
も使用でき、先に述べたエンドセリン−１、エンドセリ
ン−２、エンドセリン−３、ヒトビッグ−エンドセリン
−１、ブタビッグ−エンドセリン−１およびそれらの一
部分がこの中に含まれる。
本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成
の公知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成
法のいずれによってもよい。
の公知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成
法のいずれによってもよい。
固相法によりエンドセリンを合成する場合、メリーフ
ィールドの固相ペプチド合成方法〔ジャーナル オブ
ジ アメリカン ケミカル ソサィエティ（J.Am.Chem.
Soc.）,85,2149（1963）〕を用いるのが好ましい。不溶
性樹脂として当該技術分野で知られたもののいずれであ
ってもよく、例えばクロロメチル化されたスチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体、フェナシルアセティックメチ
ル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体のよう
なポリスチレン型樹脂、ポリジメチルアクリルアミド樹
脂のようなポリアミド型樹脂が挙げられる。Ｃ末端のＮ
−保護アミノ酸を不溶性樹脂に結合させた後、エンドセ
リンのＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次結
合し、次いでフッ化水素で処理した後、ジスルフィド結
合を形成させ目的とするエンドセリンを合成することが
できる。Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基はす
べてBoc基で保護し、セリン水酸基はBzl基で、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸はOBzl基、リジ
ンのε−アミノ基はCl−Ｚ基、システインのチオール基
はAcm基、MeBzl基、チロシンの水酸基はBr−Ｚ基、ヒス
チジンのイミダゾール基はTos基、トリプトファンのイ
ンドール基はCHO基で保護するのが好ましい。
ィールドの固相ペプチド合成方法〔ジャーナル オブ
ジ アメリカン ケミカル ソサィエティ（J.Am.Chem.
Soc.）,85,2149（1963）〕を用いるのが好ましい。不溶
性樹脂として当該技術分野で知られたもののいずれであ
ってもよく、例えばクロロメチル化されたスチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体、フェナシルアセティックメチ
ル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体のよう
なポリスチレン型樹脂、ポリジメチルアクリルアミド樹
脂のようなポリアミド型樹脂が挙げられる。Ｃ末端のＮ
−保護アミノ酸を不溶性樹脂に結合させた後、エンドセ
リンのＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次結
合し、次いでフッ化水素で処理した後、ジスルフィド結
合を形成させ目的とするエンドセリンを合成することが
できる。Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基はす
べてBoc基で保護し、セリン水酸基はBzl基で、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸はOBzl基、リジ
ンのε−アミノ基はCl−Ｚ基、システインのチオール基
はAcm基、MeBzl基、チロシンの水酸基はBr−Ｚ基、ヒス
チジンのイミダゾール基はTos基、トリプトファンのイ
ンドール基はCHO基で保護するのが好ましい。
液相法による合成の手段としては、たとえば「ザ ペ
プチズ（The Peptides）」、第１巻（1966年）、Schrod
er and Lubke著、Academic Press,New York,U.S.A.ある
いは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（1975
年）に記載された方法、たとえばアジド法、クロライド
法、酸無水物法、混合無水物法、DCC法、活性エステル
法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダ
ゾール法、酸化還元法、DCC/アディテイブ（例、HONB,H
OBt,HOSu）法などがあげられる。
プチズ（The Peptides）」、第１巻（1966年）、Schrod
er and Lubke著、Academic Press,New York,U.S.A.ある
いは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（1975
年）に記載された方法、たとえばアジド法、クロライド
法、酸無水物法、混合無水物法、DCC法、活性エステル
法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダ
ゾール法、酸化還元法、DCC/アディテイブ（例、HONB,H
OBt,HOSu）法などがあげられる。
哺乳動物を免疫するために用いられるエンドセリンと
キャリアー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリアー蛋白
の種類およびキャリアーとハプテン（この場合ペプチ
ド）との混合比は、キャリアーにカプリングさせて免疫
したハプテンに対して抗体が効率よく出来れば、どの様
なものをどの様な比率でカプリングさせてもよいが、例
えば、牛血清アルブミンや牛サイログロブリン、ヘモシ
アニン等を重量比でハプテン１対し0.1〜20、好ましく
は１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
キャリアー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリアー蛋白
の種類およびキャリアーとハプテン（この場合ペプチ
ド）との混合比は、キャリアーにカプリングさせて免疫
したハプテンに対して抗体が効率よく出来れば、どの様
なものをどの様な比率でカプリングさせてもよいが、例
えば、牛血清アルブミンや牛サイログロブリン、ヘモシ
アニン等を重量比でハプテン１対し0.1〜20、好ましく
は１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々
の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデビト
やカルボジイミド、マレイミド活性エステル等が好都合
に用いられる。
の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデビト
やカルボジイミド、マレイミド活性エステル等が好都合
に用いられる。
縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与されるが、なかでも皮下注射が好ましい。投与に際し
て抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバン
トや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。
投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計３〜６回程度行わ
れる。
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与されるが、なかでも皮下注射が好ましい。投与に際し
て抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバン
トや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。
投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計３〜６回程度行わ
れる。
用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサ
ギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギ、ニワトリがあげられる。
ギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギ、ニワトリがあげられる。
抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水
（好ましくは血液）などから採取される。抗血清中の抗
エンドセリン抗体価の測定は、例えば後記の標識化エン
ドセリンと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した
標識剤の活性を測定することによりなされる。抗体の分
離精製は免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、ア
ルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交
換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合物あるいはプロテイン−Ａ等の活性吸着剤
により特異抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を
得る特異的精製法〕に従ってなわれる。
（好ましくは血液）などから採取される。抗血清中の抗
エンドセリン抗体価の測定は、例えば後記の標識化エン
ドセリンと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した
標識剤の活性を測定することによりなされる。抗体の分
離精製は免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、ア
ルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交
換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合物あるいはプロテイン−Ａ等の活性吸着剤
により特異抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を
得る特異的精製法〕に従ってなわれる。
このようにして作製された抗体は、IgGを主たる成分
とし、IgM,IgA等、他の免疫グロブリンも含む。また、
このものはエンドセリンと特異的に結合し、アンジオテ
ンシン−IIには結合しない。
とし、IgM,IgA等、他の免疫グロブリンも含む。また、
このものはエンドセリンと特異的に結合し、アンジオテ
ンシン−IIには結合しない。
一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免
疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合させることにより、抗エンドセリン抗体産
生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は
既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法
〔ネーチャー（Nature）、256、495（1975）〕に従い実
施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール
（PEG）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ま
しくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばN
S−１、P3U1、SP2/0などがあげられるが、特にP3U1が好
ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度
であり、PEG（好ましくはPEG1000〜PEG6000）が10〜80
％程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37
℃で３〜10分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。
疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合させることにより、抗エンドセリン抗体産
生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は
既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法
〔ネーチャー（Nature）、256、495（1975）〕に従い実
施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール
（PEG）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ま
しくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばN
S−１、P3U1、SP2/0などがあげられるが、特にP3U1が好
ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度
であり、PEG（好ましくはPEG1000〜PEG6000）が10〜80
％程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37
℃で３〜10分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。
抗エンドセリンモノクローナル抗体の分離精製は上記
のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリ
ンの分離精製法に従って行われる。
のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリ
ンの分離精製法に従って行われる。
このようにして作製・精製された抗エンドセリン抗体
の中から、エンドセリンの作用を特異的に抑制する抗体
をスクリーニングする方法としては、エンドセリンの薬
理作用を検出するいかなる方法を用いることも可能であ
り、例えば、エンドセリンのブタ、ラット、ウサギ、モ
ルモット、イヌ、ヒト等、各種血管平滑筋収縮活性を指
標とする生体外の測定系、あるいはエンドセリンの上記
動物の血圧上昇活性を指標とする生体の測定系が挙げら
れる。
の中から、エンドセリンの作用を特異的に抑制する抗体
をスクリーニングする方法としては、エンドセリンの薬
理作用を検出するいかなる方法を用いることも可能であ
り、例えば、エンドセリンのブタ、ラット、ウサギ、モ
ルモット、イヌ、ヒト等、各種血管平滑筋収縮活性を指
標とする生体外の測定系、あるいはエンドセリンの上記
動物の血圧上昇活性を指標とする生体の測定系が挙げら
れる。
得られたエンドセリンの作用を特異的に抑制し得る抗
体はIgG,IgA,IgMいかなるクラスのものでもよく、また
それらからFcあるいはFc領域を除去したFab′あるいはF
ab画分あるいはその重合体でもよい。また、エンドセリ
ンの作用を特異的に抑制し得るモノクローナル抗体の可
変遺伝子部と、ヒトイムノグロブリン定常遺伝子部とを
融合させ、組み換え体として発現させたキメラ抗体を用
いることもできる。
体はIgG,IgA,IgMいかなるクラスのものでもよく、また
それらからFcあるいはFc領域を除去したFab′あるいはF
ab画分あるいはその重合体でもよい。また、エンドセリ
ンの作用を特異的に抑制し得るモノクローナル抗体の可
変遺伝子部と、ヒトイムノグロブリン定常遺伝子部とを
融合させ、組み換え体として発現させたキメラ抗体を用
いることもできる。
また得られた抗体がエンドセリン−１のＮ端領域を認
識する抗体であるならば、この抗体は同時にヒトビッグ
−エンドセリン−１およびブタビッグ−エンドセリン−
１の薬理活性を中和することが期待され、また、エンド
セリン−１のＣ端領域を認識する抗体であるならば、こ
の抗体は同時にエンドセリン−２およびエンドセリン−
３の薬理活性を中和することが期待される。
識する抗体であるならば、この抗体は同時にヒトビッグ
−エンドセリン−１およびブタビッグ−エンドセリン−
１の薬理活性を中和することが期待され、また、エンド
セリン−１のＣ端領域を認識する抗体であるならば、こ
の抗体は同時にエンドセリン−２およびエンドセリン−
３の薬理活性を中和することが期待される。
本発明の虚血性心疾患の予防・治療剤は、そのまま液
剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、哺乳
動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウ
ス）に対して経口的または非経口的に投与することがで
きる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルート
などによっても異なるが、たとえば成人の狭心症、心筋
梗塞、心不全の予防・治療のために使用する場合には、
エンドセリンの活性を抑制する抗体を１回量として通常
0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重
程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、１日
１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射
により投与するのが好都合である。他の非経口投与およ
び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することがで
きる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量し
てもよい。
剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、哺乳
動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウ
ス）に対して経口的または非経口的に投与することがで
きる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルート
などによっても異なるが、たとえば成人の狭心症、心筋
梗塞、心不全の予防・治療のために使用する場合には、
エンドセリンの活性を抑制する抗体を１回量として通常
0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重
程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、１日
１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射
により投与するのが好都合である。他の非経口投与およ
び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することがで
きる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量し
てもよい。
本発明のエンドセリンの活性を抑制する抗体はそれ自
体または適当な医薬組成物として投与される。上記投与
に用いられる医薬組成物は、上記エンドセリンの活性を
抑制する抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担
体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる
組成物は経口または非経口投与に適する剤形として提供
される。
体または適当な医薬組成物として投与される。上記投与
に用いられる医薬組成物は、上記エンドセリンの活性を
抑制する抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担
体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる
組成物は経口または非経口投与に適する剤形として提供
される。
すなわち、たとえば経口投与のための組成物として
は、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、
フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散
剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ
剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自
体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常
用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するもの
である。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳
糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどが
あげられる。
は、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、
フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散
剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ
剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自
体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常
用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するもの
である。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳
糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどが
あげられる。
非経口投与のための組成物としては、たとえば注射
剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注
射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型
を包含する。かかる注射剤は自体公知の方法、すなわち
エンドセリン活性抑制物質またはその塩を通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁また
は乳化することによって調製される。注射用の水性液と
しては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等
張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアル
コール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオ
ン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50（polyo
xyethylene（50mol）adduct of hydrogenated catsor o
il）〕などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、
大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製
された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸
投与に用いられる坐剤は、エンドセリンの活性を抑制す
る抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合すること
によって調製される。
剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注
射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型
を包含する。かかる注射剤は自体公知の方法、すなわち
エンドセリン活性抑制物質またはその塩を通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁また
は乳化することによって調製される。注射用の水性液と
しては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等
張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアル
コール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオ
ン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50（polyo
xyethylene（50mol）adduct of hydrogenated catsor o
il）〕などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、
大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製
された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸
投与に用いられる坐剤は、エンドセリンの活性を抑制す
る抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合すること
によって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分
の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製される
ことが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、
錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤な
どが例示され、それぞれの投薬単位剤形当り通常５〜50
0mg、とりわけ注射剤では５〜100mg、その他の剤形では
10〜250mgのエンドセリンの活性を抑制する抗体が含有
されていることが好ましい。
の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製される
ことが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、
錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤な
どが例示され、それぞれの投薬単位剤形当り通常５〜50
0mg、とりわけ注射剤では５〜100mg、その他の剤形では
10〜250mgのエンドセリンの活性を抑制する抗体が含有
されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、エンドセリンの活性を抑制
する抗体との配合により好ましくない相互作用を生じな
い限り他の活性成分を含有してもよい。
する抗体との配合により好ましくない相互作用を生じな
い限り他の活性成分を含有してもよい。
実施例 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるべきものではない。
が、本発明はこれに限定されるべきものではない。
後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル
抗体AwETN40aを産生するハイブリドーマ細胞AwETN40は
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 50168として
昭和63年７月14日から寄託されている。また該ハイブリ
ドーマは通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）に受託番号FERM BP−1950としてブダペスト条約
に基き昭和63年７月12日から寄託され、FRIに保管され
ている。
抗体AwETN40aを産生するハイブリドーマ細胞AwETN40は
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 50168として
昭和63年７月14日から寄託されている。また該ハイブリ
ドーマは通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）に受託番号FERM BP−1950としてブダペスト条約
に基き昭和63年７月12日から寄託され、FRIに保管され
ている。
AwETN40が産生するマウスモノクローナル抗体AwETN40
aはエンドセリン−１のＮ端領域を認識し、エンドセリ
ン−２、ヒトビッグ−エンドセリン−１およびブタビッ
グ−エンドセリン−１とは100％かそれ以上の交差反応
性を示し、エンドセリン−３とは0.1％以下の交差反応
性しか示さない。
aはエンドセリン−１のＮ端領域を認識し、エンドセリ
ン−２、ヒトビッグ−エンドセリン−１およびブタビッ
グ−エンドセリン−１とは100％かそれ以上の交差反応
性を示し、エンドセリン−３とは0.1％以下の交差反応
性しか示さない。
実施例１ ブタ冠動脈におけるエンドセリン−１収縮抑制作用につ
いての実験 （ｉ）実験方法 20mlの液槽中にブタ左冠状動脈前下行枝（LAD）を懸
垂し用いた。エンドセリン−１を累積的に加え、その収
縮張力を測定し、60mM KCl収縮に対する％で表わした。
マウスモノクローナル抗体AwETN40a（mAb）10-9Ｍを液
槽中に加えた後、エンドセリン−１を同様に累積的に投
与した。
いての実験 （ｉ）実験方法 20mlの液槽中にブタ左冠状動脈前下行枝（LAD）を懸
垂し用いた。エンドセリン−１を累積的に加え、その収
縮張力を測定し、60mM KCl収縮に対する％で表わした。
マウスモノクローナル抗体AwETN40a（mAb）10-9Ｍを液
槽中に加えた後、エンドセリン−１を同様に累積的に投
与した。
（ii）実験結果 実験結果の一部を次表に示した。
mAb 10-9Ｍはエンドセリン−1 10-10〜10-8Ｍの収縮
反応を50％以上抑制すると共に、濃度−反応曲線（10
-11〜10-7Ｍ）を右方に平行移動する競合型拮抗作用を
示し、そのPA2は7.92であった。
反応を50％以上抑制すると共に、濃度−反応曲線（10
-11〜10-7Ｍ）を右方に平行移動する競合型拮抗作用を
示し、そのPA2は7.92であった。
実施例２ ラット大動脈におけるエンドセリン−１収縮抑制作用に
ついての実験 （ｉ）実験方法 20mlの液槽中にラット大動脈を懸垂し用いた。60mM K
Clの収縮張力を判定した後、mAb（10-9，10-8および10
-7Ｍ）を液槽中に加え、エンドセリン−1 10-8Ｍを添加
し、その収縮張力を測定した。
ついての実験 （ｉ）実験方法 20mlの液槽中にラット大動脈を懸垂し用いた。60mM K
Clの収縮張力を判定した後、mAb（10-9，10-8および10
-7Ｍ）を液槽中に加え、エンドセリン−1 10-8Ｍを添加
し、その収縮張力を測定した。
（ii）実験結果 実験結果は60mM KCl収縮張力に対する％で表わした。
mAbはエンドセリン−1 10-8Ｍによる収縮を濃度依存
性に抑制し、10-7Ｍではほぼ完全に抑制した。
性に抑制し、10-7Ｍではほぼ完全に抑制した。
実施例３ エンドセリン−１のラット血圧反応に対する拮抗作用 （ｉ）実験方法 雄性Wistarラット（体重250〜300g）をペントバルビ
タール麻酔下に用いた。右頚動脈に挿入したカニューレ
より血圧を測定した。エンドセリン−1 0.3nmol/kgを静
注投与し血圧に対する作用を調べた。１時間後にmAb l0
nmol/kgを静注投与して１分後にエンドセリン−１を同
用量静注授与し血圧に対する作用を調べた。
タール麻酔下に用いた。右頚動脈に挿入したカニューレ
より血圧を測定した。エンドセリン−1 0.3nmol/kgを静
注投与し血圧に対する作用を調べた。１時間後にmAb l0
nmol/kgを静注投与して１分後にエンドセリン−１を同
用量静注授与し血圧に対する作用を調べた。
（ii）実験結果 mAbはエンドセリン−１の降圧および昇圧反応をそれ
ぞれ87.0および70.4％抑制し、桔抗作用を有することが
明らかとなった。
ぞれ87.0および70.4％抑制し、桔抗作用を有することが
明らかとなった。
実施例４ ラット冠動脈の結紮−再灌流時における心筋梗塞縮小
作用 （ｉ）実験方法 雄性Wistarラット（体重260〜315g）を用いた。ペン
トバルビタール麻酔後、人工呼吸下に開胸し、左冠状動
脈前下行枝（LAD）を１時間結紮した後、血流を再開し
た。覚醒下に保ち、再灌流24時間後に心臓を摘出し、ト
リフェニル テトラゾリウム クロライド染色し、梗塞
巣を秤量した。mAbは冠動脈結紮および再灌流の５分
前、再灌流後１時間毎に５回、計７回を10および30nmol
/kgの用量で静脈内投与した。対照群には生理食塩水お
よびIgGl,κを投与した。
作用 （ｉ）実験方法 雄性Wistarラット（体重260〜315g）を用いた。ペン
トバルビタール麻酔後、人工呼吸下に開胸し、左冠状動
脈前下行枝（LAD）を１時間結紮した後、血流を再開し
た。覚醒下に保ち、再灌流24時間後に心臓を摘出し、ト
リフェニル テトラゾリウム クロライド染色し、梗塞
巣を秤量した。mAbは冠動脈結紮および再灌流の５分
前、再灌流後１時間毎に５回、計７回を10および30nmol
/kgの用量で静脈内投与した。対照群には生理食塩水お
よびIgGl,κを投与した。
（ii）実験結果 次表にまとめて示す。
mAbは用量依存性に虚血−再灌流時の心筋梗塞巣の大
きさを縮小した。虚血−再灌流時の心筋梗塞巣の進展に
エンドセリン−１が関与していることが示唆される。
きさを縮小した。虚血−再灌流時の心筋梗塞巣の進展に
エンドセリン−１が関与していることが示唆される。
実験例１ ラット冠動脈の結紮−再灌流24時間後における血中お
よび心筋組織中のエンドセリン−１の濃度 （ｉ）実験方法 雄性Wisterラット（体重250〜330g）を用いた。ペン
トバルビタール麻酔後、人工呼吸下に開胸し、左冠状動
脈前下行枝を１時間結紮した後、血流を再開した。覚醒
下に保ち、再灌流24時間後に、再び動物を麻酔した後、
腹部大動脈より血液をまた心臓を摘出し、それぞれエン
ドセリン−１含量を測定した。無処理群およびLAD結紮
を行なわせなかったSham群についてもエンドセリン−１
の含量を判定した。
よび心筋組織中のエンドセリン−１の濃度 （ｉ）実験方法 雄性Wisterラット（体重250〜330g）を用いた。ペン
トバルビタール麻酔後、人工呼吸下に開胸し、左冠状動
脈前下行枝を１時間結紮した後、血流を再開した。覚醒
下に保ち、再灌流24時間後に、再び動物を麻酔した後、
腹部大動脈より血液をまた心臓を摘出し、それぞれエン
ドセリン−１含量を測定した。無処理群およびLAD結紮
を行なわせなかったSham群についてもエンドセリン−１
の含量を判定した。
（ii）実験結果 結果を次表に示す。
エンドセリンは正常ラットの血中に1.08pg/ml、また
心筋組織中に4.8pg/gの濃度で存在することが明らかと
なった。手術侵襲によっては組織あるいは全血中のエン
ドセリン−１含量には変化がなく、冠動脈の結紮−再灌
流により梗塞部を含む心筋組織中でのみエンドセリン−
１の濃度の増加がみとめられたことは、心筋梗塞の進展
にエンドセリン−１が深く関与していることを示すもの
である。
心筋組織中に4.8pg/gの濃度で存在することが明らかと
なった。手術侵襲によっては組織あるいは全血中のエン
ドセリン−１含量には変化がなく、冠動脈の結紮−再灌
流により梗塞部を含む心筋組織中でのみエンドセリン−
１の濃度の増加がみとめられたことは、心筋梗塞の進展
にエンドセリン−１が深く関与していることを示すもの
である。
発明の効果 本発明の抗体は種々の動物の冠動脈標本においてエン
ドセリンによる収縮あるいは細胞障害を抑制し、さらに
ラット心臓における虚血／再灌流モデルにおいて心筋梗
塞巣の縮小作用あるいは心機能障害を改善する作用が認
められた。
ドセリンによる収縮あるいは細胞障害を抑制し、さらに
ラット心臓における虚血／再灌流モデルにおいて心筋梗
塞巣の縮小作用あるいは心機能障害を改善する作用が認
められた。
したがって、本発明の予防・治療剤はヒトなどの哺乳
動物における虚血性心疾患（例えば狭心症、心筋梗塞な
どの諸疾患）などの予防・治療剤として有用である。
動物における虚血性心疾患（例えば狭心症、心筋梗塞な
どの諸疾患）などの予防・治療剤として有用である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌ．，Ｖｏｌ．13（ｓｕｐｐ ｌ．５）Ｍａｙ，1989：Ｓ132−137 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/395 Ｍｅｄｌｉｎｅ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】エンドセリンの活性を抑制する抗体を含有
することを特徴とする虚血性心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項２】エンドセリンが Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Ty
r Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trpのアミノ酸配列を
有するエンドセリン−１である、請求項１記載の虚血性
心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項３】エンドセリンが Cys Ser Cys Ser Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Ty
r Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trpのアミノ酸配列を
有するエンドセリン−２である、請求項１記載の虚血性
心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項４】エンドセリンが Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Ty
r Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trpのアミノ酸配列を
有するエンドセリン−３である、請求項１記載の虚血性
心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項５】エンドセリンが Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Ty
r Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro
Glu His Val Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Se
r のアミノ酸配列を有するヒト ビッグエンドセリン−１
である、請求項１記載の虚血性心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項６】抗体がエンドセリン（エンドセリン−３を
除く）のＮ端部位 Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Ty
r Phe Cysあるいは Cys Ser Cys Ser Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Ty
r Phe Cys を認識する抗体であることを特徴とする請求項１記載の
虚血性心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項７】抗体がエンドセリン−１、エンドセリン−
２、およびエンドセリン−３のＣ端部位 Cys His Leu Asp Ile Ile Trp を認識する抗体であることを特徴とする請求項１記載の
虚血栓心疾患の予防・治療剤。 - 【請求項８】抗体がマウスモノクローナル抗体AwETN40a
かあるいは、その抗原結合部位を含む一部分であること
を特徴とする請求項１記載の虚血性心疾患の予防・治療
剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-112246 | 1989-05-02 | ||
| JP11224689 | 1989-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03128329A JPH03128329A (ja) | 1991-05-31 |
| JP2938128B2 true JP2938128B2 (ja) | 1999-08-23 |
Family
ID=14581900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10043990A Expired - Fee Related JP2938128B2 (ja) | 1989-05-02 | 1990-04-18 | 虚血性心疾患の予防・治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2938128B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010058517A1 (ja) * | 2008-11-20 | 2010-05-27 | 明治乳業株式会社 | ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む神経細胞刺激剤 |
-
1990
- 1990-04-18 JP JP10043990A patent/JP2938128B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）Ｍａｙ，１９８９：Ｓ１３２−１３７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03128329A (ja) | 1991-05-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |