JPH09501312A - 核酸配列分析の平行プライマー拡張手法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 対象ポリヌクレオチドを分析する方法であって、各組内で一塩基対だけ違う連続オリゴヌクレオチドプライマーの一組以上のアレイを所定位置で固体担体に取り付け、ハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーのアレイにポリヌクレオチドの一ストランドまたは一断片をアニールし、プランマーを、ポリメラーゼおよび相互に区別可能な終止ヌクレオチドとの単一塩基拡張反応に付し、各終止ヌクレオチドの標識と位置を見ることによって、対象ポリヌクレオチドの配列またはその一部のヌクレオチド配列を分析する方法が開示されている。各組内で成長端が一塩基対だけ違う連続オリゴヌクレオチドプライマーの一組以上のアレイを所定位置に取り付けた固体担体を備えた分析装置も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列分析の平行プライマー拡張手法 発明の背景 今日DNA 配列決定には化学分解法(chemical degradation)(Maxam and Gilbert ，Proc．Natl．Acad．Sci．74:560-564[1977])とジデオキシ連鎖終止法(Sanger et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．74:5463-5467[1977])の二つの主な方法がある 。大抵の自動配列決定方法は生成物組成の蛍光検知を利用する連鎖終止法に基づ くものである。これらの方法には、(1) 染料標識プライマーにデオキシヌクレオ チドとジデオキシヌクレオチドを加えたものと(2) プライマーにデオキシヌクレ オチドと蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを加えたものの二つの一般的な変形が ある。さらに、標識デオキシヌクレオチドは非標識ジデオキシヌクレオチドとと もに用いることができる。この方法は酵素が特定のヌクレオチドを鋳型にアニー ル（焼還）されたプライマーの3'ヒドロキシル端に付加できることに基づいてい る。核酸の塩基対合性によってヌクレオチド付加の特異性が決まる。拡張生成物 はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離され、レーザ励起を利用する光 学系によって検出される。 化学分解法とジデオキシ連鎖終止法はともに広く用いられているが、多くの関 連した欠点がある。例えばこれらの方法ではゲル電気泳動分離が必要である。一 般に、単一クローンから400〜800の塩基対しか配列できないので、この系は時間 、労働ともに集約的である。配列処理能力を増そうとしてゲル分離をしない方法 が開発されている。 Crkvenjakov(Drmanac，et al，Genomics 4:114[1989])； Strezoska et al．( Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:10089[1991])；Drmanac，et al.(Science260:1 649[1991])およびBainsとSmith(Bains and Smith，J．Theoretical Biol．135:3 03[1988])によって方法が提案されている。ハイブリッド形成(SBH)法によるこれ らの配列(sequencing) は、多重ハイブリッド形成反応が同時に行われるので、配列処理能力を潜在的に 増すことができる。この種の系では核酸配列を決定するのに短いオリゴヌクレオ チドを用いて３対象ポリヌクレオチドの多重ハイブリッド形成から得られる情報 が用いられる（Drmanac，米国特許No.5,202,231）。配列を再構成するには多重 ハイブリッド形成によって得られたすべてのフラグメントの最適順位を決定する ための広範なコンピュータ探索アルゴリズムが必要である。 これらの方法は種々の点で問題がある。例えば、ハイブリッド形成は、GCに富 んだ領域がATに富んだ領域よりも安定になるように、オリゴヌクレオチドと対象 ポリヌクレオチドの二重型の配列組成に依存しているので、ハイブリッド形成検 出中に疑似陽性と疑似陰性が存在することが多く、配列決定が複雑になる。さら に、ポリヌクレオチドの配列は直接決定されず、既知のプローブの配列から推測 され、これが誤差の可能性を増している。核酸配列決定の能率的で正確な方法を 開発することがなお求められている。 発明の概要 本発明は対象ポリヌクレオチドの分析、特に配列に関する方法と対象ポリヌク レオチドの分析に有用な装置に係るものである。本発明の一実施例においては、 対象ヌクレオチド配列に変異(mutations)または変化(alterations)があるか分析 している。本発明の第２の実施例においては、ヌクレオチド配列が既知でない対 象ポリペプチドのヌクレオチド配列を決定している。この方法は各々別の拡張事 象(extension event)の標識と位置で対象ポリヌクレオチドの塩基(base)が決ま るように、一組の特定オリゴヌクレオチドプライマーの単一塩基拡張事象を検出 するものである。 本発明の一方法では固体担体を設ける。既知の配列で特定の大きさの連続オリ ゴヌクレオチドプライマーの一組または数組のアレイを所定位 置で固体担体に取り付ける。オリゴヌクレオチドプライマーは各組内で一塩基対 だけ違う。オリゴヌクレオチドプライマーは配列が既知の場合、対象ポリヌクレ オチドの一ストランドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相応しているか、 配列が未知の場合、特定の大きさのオリゴヌクレオチドプライマーのすべての可 能なヌクレオチド配列の一組を代表しているか、いずれかである。DNAかRNAであ る対象ポリヌクレオチドまたは対象ポリヌクレオチドの断片(fragment)をハイブ リッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーのアレイにアニールして、「ア ニールプライマー」を発生させる。アニールプライマーは単塩基拡張反応条件に 付し、この条件で、四つの既知の塩基(A，GおよびC)に相当するジデオキシヌク レオチド(ddNTPs)のような核酸ポリメラーゼと終止ヌクレオチドを、アニールプ ライマーに与える。終止ヌクレオチドはジヌクレオチドのような既知のポリヌク レオチドの終止ストリングより成るものであってもよい。単塩基拡張反応の結果 として、アニールプライマーの各々に終止ヌクレオチドが付加された拡張プライ マーが発生する。終止ヌクレオチドは同時か順次のいずれかでアニールプライマ ーに与えることができる。終止ヌクレオチドは相互に区別できる。すなわち、ヌ クレオチドの少なくとも一つに標識して検出を容易にする。終止ヌクレオチドを 付加して後、オリゴヌクレオチドアレイを「読む」、すなわち、固体担体上のア レイ内の各終止ヌクレオチドの標識と位置を見ることによって、対象ヌクレオチ ドの配列を分析する。固体担体上の各終止ヌクレオチドの標識と位置によって、 分析している対象ポリヌクレオチドの配列が直接決まる。 本発明の第２の方法においては、固体担体に取り付けられていないオリゴヌク レオチドプライマーを用いて、対象ポリヌクレオチドに特定の変異がないか分析 する。オリゴヌクレオチドプライマーは、変異点のすぐ前の点で対象ポリヌクレ オチドにアニールするように調整する。二つ以上の変異点を調べる場合には、オ リゴヌクレオチドプライマーを相互 に区別できるように設計する。好適な一実施例においては、オリゴヌクレオチド プライマーはゲル電気泳動中に異なる移動度を持つ。例えば長さの異なったオリ ゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドプライマーを対象ポリヌクレオチ ドにアニールして後、アニールしたプライマーを単塩基拡張反応条件に付すと、 拡張プライマーとなり、アニールされたプライマーの各々に終止ヌクレオチドが 付加される。本発明の第１の方法におけるように、終止ヌクレオチドは相互に区 別できる。終止ヌクレオチドを付加して後、拡張プライマーを溶出し、ゲル電気 泳動を行い、ゲルを「読む」、すなわち、自動DNA 配列決定装置でするように、 標準法でゲル上の各終止ヌクレオチドの標識と位置を観察する。ゲル上の各終止 ヌクレオチドの標識と位置によって、分析している対象ポリヌクレオチドの配列 が直接決まり、変異があるがとうかが示される。 本発明の装置は、各々が各組内で一塩基対だけ違う既知の配列の連接したオリ ゴヌクレオチドプライマーの一組以上を持つアレイを取り付けた固体担体より成 るものである。オリゴヌクレオチドプライマーの組は、配列が既知の場合に対象 ポリヌクレオチドの一ストランドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相応す るか、配列が未知の場合に特定大きさのオリゴヌクレオチドプライマーについて 可能なヌクレオチド配列の全部であるか、いずれかである。 本発明は、対象ポリヌクレオチドについて特定ヌクレオチド付加の検出による 直接情報と、特定塩基付加がなされたアニールプライマーの既知の配列による間 接情報の両方とも与えるものである。核酸配列を決定できることは遺伝子発現と 制御(regulation)を知るのに不可欠な要素である。さらに、分子医学が進歩し続 けると、配列決定は疾病の診断と処置により重要な要素となる。 図面の簡単な説明 図１は成長端において一塩基対だけ違い対象ポリヌクレオチドの関連 部または全体沿いに順次ハイブリッド形成できる連接プライマー(con-secutive primer)より成るオリゴヌクレオチドプライマーの一組の例を示す図である。 図２は固体担体に取り付けられたプライマーに結合された単一ストランド鋳型 を例示する模式図である。 図３は図２に例示したプライマーのすぐ後に続く対象ポリヌクレオチドの一部 に対する連接オリゴヌクレオチドの一組を例示する図である。 図４は図３に例示したすべてのプライマーへの単一塩基対付加物ならびに対象 ポリヌクレオチドの相補ストランドに関係した相応するプライマーに対する相応 する付加物を例示する図である。 図５は対象ポリヌクレオチドにアニールした遊離オリゴヌクレオチドプライマ ーを用いて形成された拡張プライマーの長さをグラフ表示した図である。 図６Ａ，６Ｂ，６Ｃは対象ポリヌクレオチドの変異の検出を実証するエレクト ロフオレトグラム(electrophoretogram)をグラフ表示した図である。 図７Ａ，６Ｂ，６ＣはHPRT遺伝子の第３エキソン内の５塩基領域についてのDN Aチップベースの分析(DNA chip-based analysis)の結果を示す図である。 発明の詳細な説明 本発明は、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の分析法に関するもので ある。この方法は対象ポリヌクレオチドのすべてまたはフラグメントをハイブリ ッド形成し単一塩基拡張反応を行い、単一塩基拡張事象を検出するものである。 この方法はヌクレオチド配列に変異（変化）がないか配列を調べることによって 、すなわち対象ポリペプチドの配列を決定することによって対象ポリペプチドの 配列を分析するに用いることができる。 「対象ポリヌクレオチド」という語は、ここで用いた意味では、配列情報が欲 しい特定のポリヌクレオチドのことである。代表的な対象ポリヌクレオチドには 、オリゴヌクレオチド、DNAあるいはDNAフラグメント、RNAまたはRNAフラグメン ト、ならびに遺伝子または遺伝子の部分がある。対象ポリヌクレオチドは一重ス トランドでも二重ストランドのものでもよい。「対象鋳型ポリヌクレオチド(tem plate polynucleotide of interest)」という語は、ここでは、二重ストランド のポリヌクレオチドの一ストランドだけ分析する場合、分析するストランド、あ るいは二重ストランドのポリヌクレオチドの両ストランドを分析する場合、第１ ストランドと識別されるストランドのことを言う。「相補対象ポリヌクレオチド 」という語は、ここでは、二重ストランドのポリヌクレオチドの一つのストラン ドだけを分析する場合、分析しないストランド、あるいは二重ストランドのポリ ヌクレオチドの両方のストランドを分析する場合、第２のストランド（すなわち 第１［鋳型］ストランドに相補的なストランド）と識別されるストランドのこと を言う。二つのストランドのいずれも分析できる。好適な一実施形態では、相補 （第２）ストランドと比較することによって鋳型（第１）ストランドから得られ た配列情報を確認するために、対象二重ストランドのポリペプチドの両ストラン ドとも分析している。それでも両ストランドを分析するのは常に必要ではない。 例えば、対象ポリヌクレオチドに単一塩基変異がないかを分析しようとしており 、変異領域における完全な塩基配列を分析しようとするのでなければ、対象ポリ ヌクレオチドの単一ストランドを分析すれば十分である。 本発明の方法は対象ポリペプチドのヌクレオチド配列における変異（変化）が あるかないかを確認するのに用いることができる。変異（変化）を確認するには 対象ポリヌクレオチドの配列を未変性の、すなわち正常なポリヌクレオチドの配 列と比較する。ここで用いた対象ポリヌクレオチドの「変化」とは、欠失、挿入 、点変異、フレームシフト、拡張オ リゴヌクレオチド反復、などの変化を含む予期される配列（未変性の正常なポリ ヌクレオチドの配列）からの逸脱のことである。変化部のある対象ポリヌクレオ チドの部分は「変化」領域と言われる。この方法はこれまで未知のヌクレオチド 配列のある対象ポリペプチドの配列を決定するのにも用いることもできる。 本発明の一実施形態においては、対象ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチド プライマーの組より成るアレイにアニールすることによって分析する。アレイの オリゴヌクレオチドプライマーの長さはＮで、このＮは約７ないし約30（両端を 含む）のヌクレオチドで、なるべく、20ないし24（両端を含む）のヌクレオチド であるとよい。各組内の各オリゴヌクレオチドプライマーは一塩基対だけ違う。 オリゴヌクレオチドプライマーは従来法(Sambrook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual[第 2版、1989]を参照)によって調製できる。アレイ上の 各オリゴヌクレオチドプライマーの位置とヌクレオチド内容がわかるように、オ リゴヌクレオチドプライマーの組をアレイに配置する。 アレイのオリゴヌクレオチドプライマーの大きさとヌクレオチド内容は、対象 ポリヌクレオチドと配列情報の望まれる対象ポリヌクレオチドの領域による。対 象ポリヌクレオチドに変化がないか分析するには、成長端で一塩基対だけ違いポ リヌクレオチドの関連部分あるいは全体沿いに順次ハイブリッド形成できる連接 プライマーを用いる。このようなプライマー組の一例を図１に示す。ポリヌクレ オチド配列の一つまたは数個の特定位置だけに変化がないか調べるのであれば、 オリゴヌクレオチドプライマーの必要なアレイは、変異領域だけに渡るものであ って小さい。対象ポリヌクレオチドの全体あるいは大部分を種々の位置に変異が ないか分析するのであれば、必要なアレイはもっと大きくなる。例えば、ヒポキ サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子は30 X 30 アレイに配置した 900のプライマーによって処理でき、全p53遺伝子には 700の プライマーが必要である。二重ストランドの 対象ポリヌクレオチドの両ストランドに変化がないか分析する場合は、アレイは 鋳型対象ポリヌクレオチドと相補対象ポリヌクレオチドの両方の疑われる変異領 域に対する連接オリゴヌクレオチドプライマーより成るものとする。対象ポリヌ クレオチドを以前に配列させていない場合には、アレイはすべての可能なNマー より成るオリゴヌクレオチドプライマーを含むものとする。 オリゴヌクレオチドプライマーの組のアレイを所定位置（すなわち、既知の位 置）で固体担体に固定する。固定したアレイを「DNAチップ」と言うが、これは 本発明の装置(apparatus)である。固体担体は硝子、珪素、あるいは他の材料の 板または削り屑(chip)でもよい。固体担体は金や銀のようなもので被覆してもよ い。被覆するとオリゴヌクレオチドプライマーを固体担体の表面に取り付けやす くなる。オリゴヌクレオチドプライマーはビオチンとアビジン、あるいはビオチ ンとストレプタビジンのような特定結合対によって固体担体に結合できる。例え ば、プライマーにはその調製関連でビオチンハンドルを設けることができ、次い でビオチン標識したプライマーをストレプタビジン被覆担体に取り付けることが できる。別法として、C_10-20鎖のような共有結合炭化水素のようなリンカーアー ムによって結合できる。プライマーはエポキシド／アミン結合化学作用によるな どして固体担体に直接結合することができる(Eggers，M.D. et al.，Advances i n DNA Sequencing Technology，SPIE Conference Proceedings，1993年 1月21日 )。次に詳細に述べるように、固体担体は再使用できる。 本発明のもう一つの実施形態においては、対象ポリヌクレオチドを固体担体に 取り付けられていない一つ以上の特定のオリゴヌクレオチドにアニールすること によって、そのポリヌクレオチドを分析する。このようなオリゴヌクレオチドプ ライマーを、ここでは「遊離オリゴヌクレオチドプライマー」という。遊離オリ ゴヌクレオチドプライマーを用いる場合は、対象ポリヌクレオチドを磁性ビード のような固体担体に取り付 けることができる。遊離オリゴヌクレオチドプライマーの長さは上述のようにＮ で、通常の方法（Sambrook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ［第２版、1989年］を参照）で調製する。遊離オリゴヌクレオチドプライマーの 大きさとヌクレオチド内容は対象ポリヌクレオチドと、配列情報を求めている対 象ポリヌクレオチドの領域とによる。対象ポリヌクレオチドに変化がないかを分 析するには、ポリヌクレオチドの関連部分にすぐ隣接してハイブリッド形成でき るプライマーを用いる。ポリヌクレオチド配列の二つ以上の位置に変化がないか を調べるに場合は、遊離オリゴヌクレオチドプライマーは相互に区別できるもの とする、すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーはゲル電気泳動中に移動度の 異なるものとする。好適な一実施形態においては、長さの異なったオリゴヌクレ オチドを用いている。例えば、長さ10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライ マーを一つの推定変異部にすぐ隣接してハイブリッド形成するようにし、長さ12 ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーを第２の推定変異部にすぐ隣接し てハイブリッドを形成するようにする。オリゴヌクレオチドプライマーは長さが 異なるものであるので、ゲルの異なった位置へ移行する。このようにして、各オ リゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド内容がゲル上のオリゴヌクレオチド の位置によって同定できる。 極めて厳密な条件で、対象ポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドプライマ ーのアレイ、または遊離ヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成し、塩基対 の不同(mismatch)なしに、対象ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプライマ ーを正確に合わせるようにする（Sambrook et al.，Moleular cloning: A Labor atory Manual［第 2版、1989年］参照）。例えば、固体担体に取り付けたオリゴ ヌクレオチドプライマーにアニールした仮想の対象ポリヌクレオチドを、図２に 略図で例示している。図２において、アレイ上のオリゴヌクレオチドに結合され たポリヌクレオチドの部分のすぐ後に続く対象ポリヌクレオチドの配列の一部 をTGCAACTAと示す。六つの相応する連接プライマー、すなわち対合塩基A、AC、A CG、などで終止するプライマーを図３に示す。対象ポリヌクレオチドが二重スト ランドのものであれば、それは対象ポリヌクレオチドのアレイオリゴヌクレオチ ドプライマーへの結合の前か後のいずれかの時に二つの単一ストランドに分離す ることができる。鋳型と相補の対象ポリヌクレオチドはともに単一アレイを用い て分析できる。すなわち、図２には示していないが、相補対象ポリヌクレオチド に相応する適切なプライマーも、既知の位置で固体担体に取り付けることができ る。 対象ポリヌクレオチドをハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマ ーの組のアレイまたは遊離のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成 すると、アニールプライマーができる。ここで用いた用語「アニールプライマー 」とは、対象ポリヌクレオチドをハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドプラ イマー（遊離か又は固体担体に取り付けられたもの）を言う。アニールプライマ ーは単一塩基拡張反応に付する。ここで用いた「単一塩基拡張反応」とは、単一 終止ヌクレオチドがアニールプライマーの各々に付加される条件で、T7ポリメラ ーゼのようなDNA ポリメラーゼと終止ヌクレオチドの反応混合物を、アニールプ ライマーに与える反応のことである。ここで用いた「終止ヌクレオチド」という 語は、単一終止ヌクレオチド又はヌクレオチドの単位（この単位はなるべくジヌ クレオチドであるとよい）のことである。好適な一実施形態では終止ヌクレオチ ドは単一ジデオキシヌクレオチドとしている。終止ヌクレオチドは、標準ヌクレ オチドとヌクレオチド類似物またはそのいずれかを含むものとすることができる 。それで、各アニールプライマーに付加した終止ヌクレオチドは対象ポリヌクレ オチドの鋳型塩基と対合する塩基であり、それぞれのプライマーの成長端にすぐ 隣接して付加される。単一塩基拡張反応によって終止ヌクレオチドを付加したオ リゴヌクレオチドプライマーを「拡張プライマー」と言う。すなわち、仮想対象 ポリヌクレオチドの両ストランドについて、図４に模式的に示 すように、単一ヌクレオチドをアレイの各プライマーに付加する。図２に例示し たストランドに関連するプライマー組は、図４の左側に示し、他の（相補）スト ランドは右に示す。付加したヌクレオチドは太字で示す。 終止ヌクレオチドはなるべくdNTPsを有するもの、ことにジデオキシヌクレオ チド(ddNTPs)を有するものであるとよいが、当業者には自明な他の終止ヌクレオ チドも用いることができる。終止ヌクレオチドが単一ヌクレオチドであれば、四 つの塩基（A、T、G および C）の各々に相応するヌクレオチドを単一塩基拡張反 応に用いる。終止ヌクレオチドは例えばジヌクレオチド単位であれば、16の可能 なジヌクレオチドの各々に相応するヌクレオチドを用いる。 ヌクレオチドは相互に区別できる。例えば、固体担体を金や銀でのように自由 電子金属で被覆すると、表面プラスモン共鳴(SPR)顕微鏡で、各塩基拡張によっ て起こる表面における屈折率の変化により、各ヌクレオチドを同定できる。別法 として、終止ヌクレオチドの少なくとも一つを標準法で標識して検出を容易にす る。適当な標識には蛍光染料、化学発光、および放射性核種がある。標識するヌ クレオチドの数は変えることができる。標識した終止ヌクレオチドを三つ用いれ ば十分で、塩基拡張反応で単一ヌクレオチドを付加する場合、第４の終止ヌクレ オチドはそれの「無標識」によって識別する。例えば、変化した領域における完 全な塩基配列についてでなく、対象ポリヌクレオチドに特定の変化がないかどう かを調べるのであれば、標識した終止ヌクレオチド三つで十分である。適切な状 況では標識は三つより少なくすることもできる。二つを標識し二つを標識しない dNTPsを用いる例を次に挙げる。点変異のような特定の変化を調査するのであれ ば、変異が「無標識」のあることによって示されることになるので、無変化すな わち正常なヌクレオチドだけ標識すればよい。別法として、予期される変異体ヌ クレオチドも標識できる。 単一塩基拡張反応を行った後、各終止ヌクレオチドの標識と位置を見る。遊離 オリゴヌクレオチドプライマーを用いる場合は、ゲル電気泳動法で拡張プライマ ーを溶出して分離してからゲルを分析する。アレイに取り付けたオリゴヌクレオ チドプライマーを用いる場合は、アレイ自体を分析する。ゲルあるいはアレイは オリゴヌクレオチドプライマーに結合された標識した終止ヌクレオチドを検出し て分析する。標識した終止ヌクレオチドは光学系のような通常の方法によって検 出する。例えば、特定の型の終止ヌクレオチドの蛍光発光を分離するために、フ ィルタセットと一緒にレーザ励起源を用いることができる。光電子増倍管、荷電 結合素子(CCD)、または他の適当な蛍光検知法のいずれかを用いて、蛍光終止ヌ クレオチドの発光を検出することができる。 アレイまたはゲル上の相異なるプライマーの位置が既知であり、かつ、各終止 ヌクレオチドがそれに特定の標識によって識別できるので、対象ポリヌクレオチ ドの配列をアレイ上またはゲル上で見られる標識パタンから分析できる。アレイ 内かゲル上のいずれかの各終止ヌクレオチドの標識と位置によって、分析してい る対象ポリヌクレオチドの配列が決まる。対象ポリヌクレオチドの配列の変異（ 変化）は予期される標識のパタンの変化によって示される。例えば、図２に示す ヌクレオチド配列に一つの変異があるとする。左から三番目の塩基Ｃが、対象ポ リヌクレオチドではＧによって置き換えられている。図３の最上プライマーは図 ４に示すように、なおＣによって拡張されるが、次のプライマーもＧでなくＣに よって拡張される。この新しい予期されない塩基Ｃはそれの特定標識によって識 別することができ、またそれぞれのプライマー位置がわかっているので、相応す る塩基変異をＧとして識別する。 下記の簡単な例は、完全な配列情報を得て対象の代表的なポリヌクレオチドに おける変異を識別できることを例示するものである。この例は完全な配列情報を 与える二つの標識した終止ヌクレオチドを用いている。下記の塩基対組成を持つ 正常ポリヌクレオチド ＋ ＡＣＴＧＣＴＴＡＧ − ＴＧＡＣＧＡＡＴＣ および第３塩基対に単一塩基変異のある下記の塩基対組成を持つ相応する変異 体ポリヌクレオチドを想定する。 ＋ ＡＣＣＧＣＴＴＡＧ − ＴＧＧＣＧＡＡＴＣ 例えば終止Ａに赤標識（“Ｒ”）、終止Ｃに緑標識（“Ｇ”）、残りの塩基Ｔ 、Ｇに無標識すなわち、無し（“Ｎ”）とする蛍光標識法を用いると、それぞれ 正常、変異体および異型接合体(heterozygote)の配列に対して配列判定が可能な 下記の「二進」記号が得られる。 ＋ Ｎ−Ｇ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｎ−Ｎ 正常 − Ｒ−Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｇ ＋ Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｎ−Ｎ 変異体（影響を受けた） − Ｒ−Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｇ このような点変異があると次の二三のオリゴヌクレオチドプライマーの対象ポ リヌクレオチドとの塩基対合、それにより得られるプライマー拡張に影響があっ て、変異部の付近の（すなわち、変化領域の）塩基が正確に同定できなくなる。 この変化領域の塩基の同定を最適にするには、なるべく対象二重ストランドポリ ヌクレオチドの両ストランドを分析するとよい。対象の鋳型ポリヌクレオチド上 で同定しにくい二三の塩基ならびに変化塩基は、相補対象ポリヌクレオチドの分 析を反対方向から変異点に近付いて行うようにすると、対象ポリヌクレオチドに ついてプライマーの塩基拡張によって同定される。変化部の両側の最も近い領域 では、これで二つのストランドの一つについてオリゴヌクレオチドプライマーに よって配列決定がなされる。 配列が既知の対象ポリヌクレオチドの配列は、オリゴヌクレオチドプライマー のアレイを用いる変異の同定について上に述べた方法と同様な方法で決定できる 。前述のように、アレイ内の終止ヌクレオチドの位置によって対象ポリヌクレオ チドの各ヌクレオチドの配列位置が決まる。 オリゴヌクレオチド配列を決定するには、一つのアニールしたプライマーを「 開始」アニールプライマーに選ぶ。分析を行うために、対象ポリヌクレオチドの 配列がこのプライマーで「開始する」と想定している。開始アニールプライマー に付加されたヌクレオチドは標準法で検出する。次いで、開始アニールプライマ ーから5'ヌクレオチドを取り、付加ヌクレオチドを付加したものと同じヌクレオ チド配列の第２アニールプライマーを選ぶ。この第２アニールプライマーに付加 された終止ヌクレオチドを検出する。第２アニールプライマーを「開始」アニー ルプライマーとして用いて、対象ポリヌクレオチドの配列が決定されるまで、こ れらのステップを反復する。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが長さ10ヌ クレオチドであれば(N=10)、開始アニールプライマーを配列の最初の十塩基に相 当するように選ぶ。次いで開始アニールプライマーの終止ヌクレオチドを決定す る。次に、塩基 2〜11（すなわち開始アニールプライマーの塩基2〜10プラス終 止ヌクレオチド拡張部）をもう一つのアニールプライマーに合わせる。このプラ イマーが第２アニールプライマーである。次いでこの第２アニールプライマーの 終止ヌクレオチドを決定する。これらのステップを繰り返して完全な配列を決定 する。このようにして単一塩基拡張反応によってアニールプライマーの組が自動 的につなぎ合わされる。 対象ポリペプチドの分析の後、チップを再使用することができるように、対象 ポリヌクレオチドと終止ヌクレオチドをDNA チップから除去する。好適な実施形 態においては、対象ポリヌクレオチドの分析の後、付 加された終止ヌクレオチドは固体担体から除去することができる。ヌクレオチド を除去すると、固定オリゴヌクレオチドプライマーの付いた固体担体は新しい分 析に用いることができる。ヌクレオチドは酵素開裂あるいは化学分解のような標 準法で除去できる。酵素開裂には例えば酵素によって除去できる終止ヌクレオチ ドを用いる。単一塩基拡張反応では、逆トランスクリプターゼか他のポリメラー ゼによってオリゴヌクレオチドプライマーに、RNA ジデオキシTTP またはRNA ジ デオキシCTP が付加されることになる。すると、RNアーゼ AのようなC/T 開裂酵 素を用いてRNA ジデオキシヌクレオチドを「剥離」することができる。別法とし て、単一拡張反応中に含硫黄ジデオキシ Aあるいはジデオキシ Gを用いることが できる。次いで、燐酸塩を開裂させない硫黄専用エステラーゼを用いてジデオキ シヌクレオチドを開裂して除くことができる。化学分解には、化学的に分解でき る終止ヌクレオチドを用いることができる。例えば、アセチル基によって2'-ヒ ドロキシル基と3'-ヒドロキシル基をエステル化した修飾リボヌクレオチドを用 いることができる。アニールプライマーに終止ヌクレオチドを結合させて後、塩 基で処理してアセチル基を除去して2'-ヒドロキシル基と3'-ヒドロキシル基を露 出させる。すると、リボース残基は過ヨウ素酸酸化によって分解でき、塩基とア ルカリ性ホスファターゼで処理して燐酸残基をアニールプライマーから除去でき る。 本発明の方法と装置は変異、欠失、拡張オリゴヌクレオチド反復、その他の遺 伝的異状を検出するのに用いられる。例えば、本発明は挿入あるいは欠失により 起こるフレームシフト変異を識別するのに用いることができる。正常信号と変化 信号ともに検出されるので、本発明を用いてさらに嚢胞性繊維症、β−サラセミ ア、α−１、ゴーシェ病、テイ・サックス病、あるいはレッシュ・ナイハン病の ような遺伝病の担体状態(carrier status)を容易に決定することができる。さら に薬剤抵抗のあるHIV 感染患者に起こるようなDNA 分子の混合物が判定できる。 HIV ウ イルスには、逆トランスクリプターゼ(RT)遺伝子における点変異によって、AZT のような薬剤に対する抵抗ができる。ウイルス固体群に変異ウイルスが出現し始 めると、変異遺伝子と正常（野生型）遺伝子がともに検出できる。変異体の割合 が多いほど、相応する変異体終止ヌクレオチドからの信号も多い。 本発明を下記の実施例によってさらに例証する。 実施例１：遊離オリゴヌクレオチドプライマーを用いる 対象ポリヌクレオチドの配列の分析 ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（ 対象ポリペプチド）の分析を三個体（患者A、B、およびC）について行った。 A．対象ポリヌクレオチドを得ること 対象ポリヌクレオチドを増殖するのに、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Sambr ook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 〔第２版、1989年〕特 に第14章）を用いた。反応中、二つのPCR プライマーの一つをビオチン基で標識 した。増殖の後、単一ストラント鋳型をストレプタビジン被覆磁気ビードで捕集 した。50μｌの PCR反応に、25μｌのDynal M-280 常磁性ビード(Dynal A/S，Os lo，Norway)を用いた。ビードの上澄液を除去し、50μｌの結合・洗浄緩衝液（1 0 mM トリス-HCl［pH 7.5］;1 mM EDTA;2 M NaCl）と取り替えた。ビードに PCR 生成物を加え室温で30分間温置して生成物をビード捕集した。５分間にわたって 、 150μｌの0.15M NaOHを加えて対象の単一ストランドポリヌクレオチドを分離 した。ビードを捕集し、上澄液を除去し、0.15M NaOH 150μｌを５分間再び加え た。変性の後、ビードを0.15M NaOH 150μlで一回、1X T7アニール用緩衝液（40 mM トリスHCl ［pH7.5］;20mM MgCl_z;50mM NaCl）で二回洗浄した。ビードは最 期に水70μｌ中に懸濁させた。このプロセスで単一ストランドの対象ポリヌクレ オチドが分離されるとともに、PCR 後に残留している組み込まれていないdNTPs が除去され る。 B．対象ポリヌクレオチドの配列の分析 単一ストランド分離の後、約２分間65℃に加熱し、約20分間で室温まで冷却し てオリゴヌクレオチドプライマーをポリヌクレオチドにアニールした。10μl 反 応容(reaction volume)は、対象ポリヌクレオチド 7μl （0.5〜１pmol）、5X T 7アニール用緩衝液２μl と拡張プライマー１μl (3 〜9 pmol)より成るもので あった。次いで拡張反応を行った。この反応には DTT 1μl 、T7ポリメラーゼ 2 μl(1:8希釈)およびddNTPs(最終濃度0.5uM)を添加した。反応は37℃で2分間進め てから、洗浄緩衝液（1XSSPE、0.1%SDS、30%エタノール）を加えて停止した。ビ ードは洗浄緩衝液 150μl で二回洗浄した。拡張生成物をホルマミド５μl を加 えて溶出し、70℃で２分加熱した。ビードを磁石で捕集し、拡張生成物を含む上 澄液を収集し、ABI373(Applied Biosystems，Inc.)で分析した。長さ 10〜17と 異なるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。図５に示すように拡張生成物は 効率的に生成された。 1. デオキシヌクレオチド標識‐四つの蛍光体 各 ddNTPは異なった蛍光体によって標識した。 標識ポリメラーゼ用に造られた ABI染料ターミネータを用いた。 ddG は青、ddA は緑、ddT は黄、ddC は赤である。各反応管に四つの蛍光ddNTPs を加えた。拡張生成物を精製し、ゲル分離してABI373で分析した。HPRT遺伝子の エキソン3 の二つの異なった塩基、塩基16534（野生型(wild type)は A) と塩基 16620 （野生型は C）を分析した。 ４蛍光体、１レーンの結果、変異のあることが容易に識別できることが示され た。３人の患者はすべて塩基 16534 が Aの野生型である(データは図示せず)。 図６Ａ，６Ｂおよび６Ｃに示すエレクトロホレトグラムによって、患者 Aは塩基 16620が野生型(C) (図6A)、患者 Bは塩基 16620が変異固体(C-->T) (図6B)、患 者 Cは塩基 16620が保因者(C、Tとも)(図6C)であることが示されている。 2. デオキシヌクレオチド標識‐単一蛍光体 各 ddNTPを同じ蛍光体で標識した。デュポン NENフルオロセイン染料 (NEL 40 0〜404)を用いた。各 ddNTPは ABI 373で青く見える。各反応管に一つの蛍光 dd NTPのみを加える。拡張生成物を精製し、ゲル分離して、 ABI 373で分析した。 各塩基を分析するのにゲル上の４レーンを用いねばならない。HPRT遺伝子のエキ ソン 3の異なった二つの塩基である、塩基 16534（野生型は Aである）と塩基 1 6620（野生型は Cである）を分析した。 １蛍光体、４レーンの結果、上の(1) に述べた４蛍光体、１レーン法で得られ た結果と同じものであることが実証された。この種の検定では、拡張生成物生成 中およびゲル分離中における蛍光体の違いの影響を最小にする。 3. デオキシヌクレオチド標識‐ビオチニル化 ジデオキシヌクレオチド ddNTPsをビオチン基で標識する。四つの別の反応を行うが、四つのddNTPsのう ちの一つしかビオチニル化しない。拡張反応の後、ストレパビジン（またはアビ ジン）結合蛍光基がビオチン化ddNTPsに付く。ビオチン基は小さいので、ddNTPs が均等に組み込まれると予期され、拡張における塩基特定の差異が少なくなる。 さらに、ビオチン基は多重蛍光体に結合されたストレプタビジンの部分を拘束で きるので、蛍光信号を増幅できる。 実施例２：標識したデオキシヌクレオチドを用いる 対象ポリヌクレオチドの配列の分析 ３個体（患者Ａ、Ｂ、Ｃ）について、ヒポキサンチングアニンホスホリボシル トランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子（対象ポリペプチド）の分析を行った。HPRT遺 伝子の第３エキソンを調べた。 Southern(Nucl．Acids Res．20:1679［1992］とGenomics 13:1008[1992])に従 って、乾燥キシレン(Aldrich Chemical)中でジイソプロピ ルエチラミン(Aldrich Chemical)の触媒量とともに、25% 3’グリシドオキシプ ロピルトリエトキシシラン(Aldrich Chemical)を用い、80℃で８時間顕微鏡ガラ ススライドをエポキシシラン化した。 5'-アミノ結合オリゴヌクレオチド(50 μ M 、0.1M NaOH)0.5μl を37℃の湿潤環境に６時間置いて、DNA チップを造った 。チップは50℃の水中で15分間洗い、乾燥して用いた。アニール反応は、単一ス トランド DNA 2.2μl (T7反応緩衝液中で 0.1 M)を各グリッド位置に付加し、湿 潤環境にあるチップを70℃に加熱してから、ゆっくり室温に冷却することからな る。0.1M DTT の液滴１μl 、Sequenase Version 2.0 (USB) 3 ユニット、α−^{3 2} P dNTP (3000 Ci/mmol) (DuPont NEN)５μCi および競合しない無標識のddNTPs (Pharmacia)18.5μM を、３分間に各グリッド位置に付加した。この反応は、75 ℃の水中で洗って停止させ、Phosphorlmager（Molecular Dynamics）で分析した 。 図７Ａ，７Ｂ，７ＣはHPRT遺伝子の第３エキソン内の５塩基領域についてのDN A チップベースの分析結果を示している。行(rows)は検討している特定塩基に相 応し、列(columns)は標識塩基に相応している。図７Ａは野生型配列(TCGAG)を示 し、図７ＢはC-->T変異を示し、図７ＣはC-->T変異を示している。 均等物 当業者はここに説明した特定の実施例の均等物を認識する、すなわち平常の実 験以上をすることなく確認できるであろう。そのような均等物も下記の請求の範 囲に入るものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュメーカー・ジョン アメリカ合衆国，テキサス州 77009 ヒ ューストン，パイザー 719 (72)発明者 メツパル・アンドレス エストニア国，2400 タルツ，カウナゼ・ ストリート ４―33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。 a) 長さＮヌクレオチドの既知の配列の遊離オリゴヌクレオチドプライマーに対 象ポリヌクレオチドをアニールしてアニールプライマーを発生させ、 b) アニールプライマーを単一塩基拡張反応に付して、終止ヌクレオチドを付加 することによりアニールプライマーを拡張し、 c) アニールプライマーに付加した各終止ヌクレオチドを同定する。 ２．下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。 a) ハイブリッド形成条件で長さＮヌクレオチドの既知の配列の遊離オリゴヌク レオチドプライマーに対象ポリヌクレオチドをアニールしてアニールプライマー を発生させ、 b) 四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドをアニールプライマーに与える単 一塩基拡張反応にアニールプライマーを付して、終止ヌクレオチドを付加するこ とによりアニールプライマーを拡張し、 c) アニールプライマーに付加した各終止ヌクレオチドを同定し、その位置を見 る。 ３．下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。 a) 長さＮヌクレオチドの既知の配列のオリゴヌクレオチドプライマーのアレイ を固体担体の所定位置に取り付け、 b) オリゴヌクレオチドプライマーのアレイに対象ポリヌクレオチドをアニール してアニールプライマーを発生させ、 c) アニールプライマーを単一塩基拡張反応に付して、終止ヌクレオチドを付加 することによりアニールプライマーを拡張し、 d) 固体担体上のアレイ内の各終止ヌクレオチドを同定し、その位置を見る。 ４．下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。 a) 長さＮヌクレオチドの既知の配列のオリゴヌクレオチドプライマー のアレイを固体担体の所定位置に取り付け、 b) オリゴヌクレオチドプライマーのアレイに対象ポリヌクレオチドをアニール してアニールプライマーを発生させ、 c) アニールプライマーを単一塩基拡張反応に付して、終止ヌクレオチドを付加 することによりアニールプライマーを拡張し、 d) 開始アニールプライマーを選定し、 e) 開始アニールプライマーに付加した終止ヌクレオチドを同定し、その位置を 見て、順序が次のヌクレオチドを決定し、 f) 開始アニールプライマーのヌクレオチド 2ないしN とステップ(e) で決まる 順序が次のヌクレオチドを加えたものと同じヌクレオチド配列の第２アニールプ ライマー選定し、 g) 各反復について第２アニールプライマーを開始アニールプライマーとして用 いてステップ (e)、(f) を反復し、対象ポリヌクレオチドの配列を決定する。 ５．下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。 a) 長さＮヌクレオチドの既知の配列のオリゴヌクレオチドプライマーのアレイ を固体担体の所定位置に取り付け、 b) ハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーのアレイに対象ポリ ヌクレオチドをアニールしてアニールプライマーを発生させ、 c) 四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドをアニールプライマーに与える単 一塩基拡張反応にアニールプライマーを付して、終止ヌクレオチドを付加するこ とによりアニールプライマーを拡張し、 d) 固体担体上のアレイ内の各終止ヌクレオチドを同定し、その位置を見る。 ６．下記のステップを含む対象ポリヌクレオチドの配列の分析法。 a) 長さＮヌクレオチドの既知の配列のオリゴヌクレオチドプライマーのアレイ を固体担体の所定位置に取り付け、 b) ハイブリッド形成条件でオリゴヌクレオチドプライマーのアレイに 対象ポリヌクレオチドをアニールしてアニールプライマーを発生させ、 c) 四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドをアニールプライマーに与える単 一塩基拡張反応にアニールプライマーを付して、終止ヌクレオチドを付加するこ とによりアニールプライマーを拡張し、 d) 開始アニールプライマーを選定し、 e) 開始アニールプライマーに付加した終止ヌクレオチドを同定し、その位置を 見て順序が次のヌクレオチドを決定し、 f) 開始アニールプライマーのヌクレオチド 2ないしN とステップ(e) で決まる 順序が次のヌクレオチドを加えたものと同じヌクレオチド配列の第２アニールプ ライマーを選定し、 g) 各反復について第２アニールプライマーを開始アニールプライマーとして用 いてステップ (e)、(f) を反復し、対象ポリヌクレオチドの配列を決定する。 ７．単一塩基拡張反応が、ポリメラーゼと四つの塩基の各々に相応するヌクレオ チドとから成る反応混合物にアニールプライマーを反応させるものである請求項 １ないし６のいずれかに記載の分析法。 ８．四つの塩基の各々に相応するヌクレオチドが相互に区別できるものである請 求項５ないし７のいずれかに記載の分析法。 ９．四つのヌクレオチドのうちの三つが標識の異なったものである請求項８に記 載の分析法。 10．三つの異なった標識のヌクレオチドが蛍光標識したものである請求項９に記 載の分析法。 11．さらに、相補対象ポリヌクレオチドの配列を分析することを含む請求項 1な いし10のいずれかに記載の分析法。 12．終止ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドである請求項１ないし11のいず れかに記載の分析法。 13．オリゴヌクレオチドプライマーの長さ Nが 7ないし30（両端を含む）である 請求項 1ないし12のいずれかに記載の分析法。 14．オリゴヌクレオチドプライマーの長さ Nが20ないし24（両端を含む）である 請求項 1ないし13のいずれかに記載の分析法。 15．オリゴヌクレオチドプライマーが異なった長さのオリゴヌクレオチドプライ マーを含む請求項1 、2 、13または14のいずれかに記載の分析法。 16．終止ヌクレオチドを同定し位置を見るのを、荷電結合素子または光電子増倍 管を用いて行う請求項 1ないし13のいずれかに記載の分析法。 17．分析終了後、終止ヌクレオチドをアニールプライマーから除去して固体担体 を再使用できるように用意する請求項 3ないし14、または16のいずれかに記載の 分析法。 18．終止ヌクレオチドがジヌクレオチドである請求項 1ないし17のいずれかに記 載の分析法。 19．既知の配列のオリゴヌクレオチドプライマーのアレイが所定位置に取り付け られた固体担体を有する対象ポリヌクレオチドの配列を分析する分析装置。 20．オリゴヌクレオチドプライマーが特定結合対によって固体担体に取り付けら れている請求項19に記載の分析装置。 21．特定結合対が、ビオチンと、アビジンとストレパビヂンを含む群から選ばれ た分子との対である請求項20に記載の分析装置。