JPH09501822A - 精製哺乳動物ｆｌｔ３リガンド並びにそのアゴニストおよびアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドおよびそのフラグメント、それらをコードしている核酸、該核酸を含む組換えベクターおよび宿主細胞、該リガンドまたはそのフラグメントに対して特異的に結合する抗体またはその結合フラグメント、並びにＦｌｔ３リガンド受容体を有する細胞の生物学的活性を変更するためのキットおよび薬剤組成物を提供する。前述の材料を製造するおよび使用する方法もまた、本発明によって提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 精製哺乳動物ＦＬＴ３リガンド並びにそのアゴニストおよびアンタゴニスト 本発明は、哺乳動物細胞、例えば、哺乳動物免疫系の細胞の発生および分化を 制御する場合に機能する組成物に関する。特に、本発明は、造血系細胞を含む各 種細胞の発生、分化および機能を調節するタンパク質および模擬体を提供する。 発明の背景 タンパク質チロシンキナーゼは、しばしば、細胞増殖をもたらすシグナル伝達 において重要な役割を果たす。広範な群のタンパク質チロシンキナーゼとしては 、多数の成長因子受容体がある。例えば、ポーソン（Ｐａｗｓｏｎ）ら（１９９ ０）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３５０〜３５６を参照された い。成長因子受容体は、細胞生理学および発生の制御および調節において重要で ある。これらの受容体は各種細胞系列で見出されたが、異なる細胞系列の発生の 調節におけるそれらの特異的役割は概して十分に理解されていない。造血におけ るタンパク質チロシンキナーゼの役割の示唆は、主として、赤血球およびマスト 細胞系列に影響を与えるＷ遺伝子座突然変異としてのｃ−ｋｉｔ受容体チロシン キナーゼの識別に基づいていた。例えば、チャボット（Ｃｈａｂｏｔ）ら（１９ ８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３５：８８〜８９；およびガイスラー（Ｇｅｉｓｓｌｅ ｒ）ら（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５：１８５〜１９２を参照されたい。 Ｗ遺伝子座の遺伝子産物の他にも、別のタンパク質チロシンキナーゼが単離さ れ且つ特性決定された。マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら（１９９１）Ｃｅｌ ｌ ６５：１１４３〜１１５２；およびロスネット（Ｒｏｓｎｅｔ）ら（１９９ １）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１６４１〜１６５０を参照されたい。このタンパク 質は、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）またはＦｌｋ２と称された。そ れは胎盤、性腺、神経および造血系などの特定の細胞種に局在していたが、細胞 分化および生理学に対するその生物学的作用は十分に記載されていなかった。 更に、受容体は天然のリガンドに応答して細胞シグナル伝達を媒介すべきであ る。リガンドの性質はなお定義される必要があり、しかもその生理学的作用およ び細胞系列特異性はほとんど知られていないままである。しかしながら、受容体 の分布は、細胞生理学および細胞系列の多様性の発生を調節する場合にリガンド がある役割を果たしていることを示唆している。 したがって、Ｆｌｔ３チロシンキナーゼ受容体に対して自然に結合する調節因 子の構造的、生物学的および生理学的性質について知ることが要求される。 発明の概要 本発明は、一部分はＦｌｔ３チロシンキナーゼ受容体の天然リガンドの発見に 基づいており、前述の要求を満たす。本発明は、該天然リガンドのアゴニストお よびアンタゴニスト、例えば、天然の配列の突然変異（突然変異タンパク質）、 融合タンパク質、化学的模擬体、抗体および他の構造的または機能的類似体を提 供する。更に、本発明は、本発明のタンパク質をコードしている単離された核酸 を提供する。これらの異なるタンパク質または核酸組成物の様々な使用も提供す る。 本発明は、実質的に純粋なＦｌｔ３リガンド若しくはそれらのペプチド、また はＦｌｔ３リガンド配列を含む融合タンパク質；Ｆｌｔ３リガンドに対して特異 的に結合する抗体；およびＦｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントをコードし ている核酸を提供する。 Ｆｌｔ３リガンドまたはそのペプチドは、鳥またはマウスを含む哺乳動物など の温血動物に由来することができ、表１に示された少なくとも１種類のポリペプ チド配列を含む。更に、それらは、表２で開示された特徴の少なくとも一つを含 む天然Ｆｌｔ３リガンドとは異なる翻訳後修飾パターンを示すことができるかま たはそれらはＦｌｔ３受容体を自己リン酸化させることができる。もう一つの実 施態様は、このようなリガンドおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物であ る。 抗体実施態様において、抗原はマウスを含む哺乳動物のタンパク質でありうる し；抗体は表１のペプチド配列に対して引き起こされ；抗体は単クローン性抗体 であり；または抗体は標識されている。 核酸実施態様において、核酸は表３の配列を含むことができる。 本発明は、更に、例えば正の対照としての実質的に純粋なＦｌｔ３リガンド若 しくはフラグメント；Ｆｌｔ３リガンドを特異的に結合する抗体若しくは受容体 ；またはＦｌｔ３リガンド若しくはペプチドをコードしている核酸を含むキット を包含する。 これらの試薬の有効性は、更に、細胞の生理学または発生を調節する方法であ って、該細胞をＦｌｔ３リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストと接触させ ることを含む上記方法を提供する。例えば、アンタゴニストは哺乳動物Ｆｌｔ３ リガンドに対する抗体であるかもしれないし、或いは該細胞は、リンパ系細胞を 含む造血系細胞；胎盤細胞；性腺細胞；またはニューロン若しくは非ニューロン 細胞を含む神経細胞でありうる。 発明の説明 本明細書中に引用された参考文献はいずれも本明細書にそのまま援用される。概論 本発明は、チロシンキナーゼ受容体タンパク質に対して結合する性質を示す種 々の哺乳動物タンパク質をコードしているアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供 する。これらのタンパク質は、チロシンキナーゼ型受容体の構造的特徴を示すタ ンパク質であるＦｌｔ３タンパク質に対して結合するタンパク質として最初に特 性決定されたので、Ｆｌｔ３リガンドと称される。 天然リガンドは、標的細胞において生物学的または生理学的反応をもたらすべ きである各種生化学的反応を媒介することができる。最初の研究は、該タンパク 質を造血系幹細胞および原始的な未分化の前駆細胞に限定していた。最もよく特 性決定された実施態様はマウスにおいて最初に記載されたが、本明細書中ではヒ ト変異型を更に記載する。ヒトなどの他の哺乳動物種のタンパク質の更に別の配 列もまた入手可能なはずである。以下の説明は、例示目的のためにマウスＦｌｔ ３リガンドに関するが、他の種からの関連実施態様に同様に当てはまる。 単離されたマウスＦｌｔ３タンパク質は、最近になって、受容体チロシンキナ ーゼの構造的特徴を示すタンパク質として記載された。該タンパク質は、特に、 胎盤、性腺、造血系および神経組織に局在している。マシューズら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：１１４３〜１１５２；およびロスネットら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１６４１〜１６５０を参照されたい。Ｆｌｔ３受容体は 、シグナル伝達および細胞性反応をもたらすこれまでに識別されていないリガン ドの結合に対する生化学的反応を媒介する。 特に、該リガンドは、二量体化された受容体分子の交差リン酸化を反映すると 考えられる自己リン酸化検定を追跡することによって単離された。該リガンドは 、、約３０ｋＤのタンパク質移動性によってポリアクリルアミドゲル電気泳動で 泳動するタンパク質として単離され且つ特性決定されたが、他の物理的性質は表 ２に記載する。 Ｆｌｔ３のリガンドは、前述の組織種類に存在するはずであり、そしてリガン ドと受容体との相互作用は、細胞生理学または発生の各種態様を媒介するのに重 要であるはずである。異なる組織におけるＦｌｔ３受容体タンパク質の分布は、 それおよびそのリガンドが、例えば、他の細胞種類における発生の調節において 免疫系以外の機能的役割を有することを示唆している。例えば、ギルバート（Ｇ ｉｌｂｅｒｔ）（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第 ３版），シナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ） ，サンダーランド，ＭＡ；ブラウダー（Ｂｒｏｗｄｅｒ）ら（１９９１）Ｄｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （第３版），サウンダーズ（Ｓａｕｎｄ ｅｒｓ），フィラデルフィア，ＰＡ．；ルッソー（Ｒｕｓｓｏ）ら（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｐ ｐｒｏａｃｈ ，スプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ），ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．；およびウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）（１９９ ３）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ （第２版）ウィリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）ニューヨーク，Ｎ ．Ｙ．を参照されたい。 高度に精製された天然マウスＦｌｔ３リガンドをＩＬ−３と一緒にマウスＴｈ ｙ^loＳｃａ−１⁺ｌｉｎ^-幹細胞に対して加えた場合、コロニー数は有意に増加し た。これらの条件は多系列コロニーを生じたが、それらはｃ−ｋｉｔリガンドお よびＩＬ−３と一緒に特徴的に見出される豊富な赤血球を含んでいなかった。適 度な同時刺激活性は、Ｆｌｔ３リガンドおよびＩＬ−６の存在下において明ら かであった。しかしながら、Ｆｌｔ３リガンド単独では、ｃ−ｋｉｔリガンドと 組合わせて用いた場合でさえも、これらの細胞に対して刺激活性を示さなかった 。 選別されたヒト胎児肝前駆細胞を用いた場合、Ｆｌｔ３リガンドはＧＭ−ＣＳ ＦまたはＩＬ−３との組み合わせで同様の相乗作用を示した。この場合、Ｆｌｔ ３リガンドの同時刺激作用は、低増殖能コロニー形成細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ）並 びに更に原始的な高増殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）両方で観察され た。しかしながら、ｃ−ｋｉｔリガンドとは対照的に、Ｆｌｔ３リガンドはヒト 胎児肝赤芽球コロニー群形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の増殖をあまり増加させること ができなかった。したがって、Ｆｌｔ３リガンドは、ｃ−ｋｉｔリガンドとは明 らかに異なる方法であるが、成長因子に対する幹および原始的前駆細胞の反応を 促進する。 骨髄系前駆細胞に関して、Ｆｌｔ３リガンドは増殖に対して単独ではほとんど 作用しないが、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３のような因子との組合わせでは、リ ガンドは、原始的なおよび更に成熟した骨髄系前駆細胞両方の増殖を相乗的に促 進することができる。 ＩＬ−７またはＩＬ−１２との組合わせのＦｌｔ３リガンドは、特異的胸腺細 胞サブセットを活性化して増殖させる。ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺およびＣＤ４^lo胸腺細 胞は、サイトカイン組み合わせに対して反応する若干のサブセットである。 Ｆｌｔ３リガンドを、更に、Ｔ細胞前駆体に富む１４日目の胎児胸腺細胞で検 査した。ＩＬ−７またはＩＬ−１２との組合わせのＦｌｔ３リガンドは、有意の 増殖を引き起こした。ＩＬ−１２は、更に、ｃ−ｋｉｔリガンドとの組合わせで 胎児胸腺細胞を増殖させる。これらの結果は、Ｔ細胞発生におけるＦｌｔ３リガ ンドの役割を更に支持する。 初期Ｂ系列細胞、例えば、プロＢ細胞系またはプロＢおよびプレＢ細胞に富む 骨髄細胞の増殖は、Ｆｌｔ３リガンドの存在下において、特にＩＬ−７との組合 わせにおいて有意に増加する。更に、預託されたＢ系列細胞を生じる初期発生段 階細胞集団は、特に他のストロマ細胞因子との組合わせでのＦｌｔ３リガンドに 反応して増殖する。 Ｆｌｔ３のリガンドの識別は、これらの知見によって生じた疑問のいくつかに 取り組む手段を提供する。精製Ｆｌｔ３リガンド マウスおよびヒトＦｌｔ３リガンドアミノ酸配列を表１に示す。アミノ〜カル ボキシ末端までを示したこれらのアミノ酸配列は、タンパク質を他のタンパク質 から区別するのを可能にするリガンドの配列情報を提供する場合に重要である。 更に、ペプチド配列は、このようなセグメントを認識する抗体を生じるためのペ プチドの製造を可能にし且つオリゴヌクレオチドプローブの製造を可能にし、こ れらは両方ともこのような配列をコードしている遺伝子の単離、例えばクローニ ングのための方策である。 特に、ＭＢ８単離物は、リガンドのらせんサイトカインドメインを膜結合から 開裂させるタンパク質分解プロセッシング部位を含む２９アミノ酸のインサート を含む。他のサイトカインとの類似性が観察された。例えば、ボーセンバーグ（ Ｂｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：１１５７〜１１６５；ワ ン（Ｈｕａｎｇ）ら（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ３：３４９〜３６２；およびパンディエラ（Ｐａｎｄｉｅｌ ｌａ）ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４０２８〜２４０３ ３を参照されたい。これは、細胞結合タンパク質を用いて作業するすなわちそれ を管理するいくつかの問題点を回避し、そして細胞特異性の可能な機序を洞察さ せる。 表１に示された配列は、更に、ペプチド１〜１８の配列がそれぞれ配列番号： １〜１８で定義されている配列表において定義される。配列中のいくつかのアミ ノ酸残基を、配列決定が若干不正確であった場合にＸａａと表示する。 表１で示された他の配列を配列表において以下のように定義する。ペプチド 配列番号： ＨｕＳ８６／Ｓ１０９（Ｓ８６ Ｃ末端まで） １９ ＨｕＳＩ０９（Ｃ末端部分） ２０ ＭｏＴ１１８／Ｔ１１０（Ｔ１１０ Ｃ末端まで） ２１ ＭＯＴ１１８（Ｃ末端部分） ２２ ＭＢ８単離物 ２３ ＭｏＴ１１８のＣ末端部分のヌクレオチド配列を配列番号：２４で定義する。 本明細書中で用いられる「マウスＦｌｔ３リガンド」という用語は、タンパク 質文脈中で用いられる場合、表１で示されたマウスアミノ酸配列を有するタンパ ク質またはこのようなタンパク質の有意のフラグメントを包含する。更に、それ は、同様の生物学的機能を示すまたはＦｌｔ３リガンド特異的結合成分と相互作 用するマウス由来ポリペプチドを意味する。これらの結合成分、例えば、抗体は 、典型的に、Ｆｌｔ３リガンドに対して高親和性で、例えば、少なくとも約１０ ０ｎＭ、通常約３０ｎＭより大、好ましくは約１０ｎＭより大、そして更に好ま しくは約３ｎＭより大で結合する。相同タンパク質は、マウス以外の哺乳動物種 、例えばラットにおいて見出されると考えられる。非哺乳動物種もまた、構造的 にまたは機能的に関連した遺伝子およびタンパク質を有するはずである。 本明細書中で用いられる「ポリペプチド」という用語は、有意のフラグメント またはセグメントを含み、そして少なくとも約８個のアミノ酸、一般的には少な くとも１０個のアミノ酸、更に一般的には少なくとも１２個のアミノ酸、しばし ば少なくとも１４個のアミノ酸更にしばしば少なくとも１６個のアミノ酸、典型 的に少なくとも１８個のアミノ酸、更に典型的に少なくとも２０個のアミノ酸、 通常少なくとも２２個のアミノ酸、更に通常は少なくとも２４個のアミノ酸、好 ましくは少なくとも２６個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも２８個のアミ ノ酸、そして特に好ましい実施態様において少なくとも約３０個またはそれ以上 のアミノ酸を有するアミノ酸残基の伸長を包含する。 「結合組成物」という用語は、特異性によってＦｌｔ３リガンドに対して、例 えば、リガンド−受容体型様式、抗体−抗原相互作用で、またはＦｌｔ３リガン ドと特異的に結合するタンパク質などの化合物に対して、共有若しくは非共有の 天然の生理学的に適切なタンパク質−タンパク質相互作用などで結合する分子を 意味する。分子はポリマーまたは化学試薬でありうる。Ｆｌｔ３リガンドがリガ ンド−受容体相互作用のリガンドであるかまたは受容体であるかということにつ いては、該相互作用が特異的親和性などの同様の特異性を示す以外に意味はない 。 機能性類似体は、構造的修飾を伴うリガンドであってよいし、または適当なリ ガンド結合決定基と相互作用する分子形状を有するような全く無関係の分子であ ってよい。リガンドは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして役立つ ことができ、例えば、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら（監修）（１９９０）Ｔ ｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕ ｔｉｃｓ （第８版），ペルガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓs）を 参照されたい。 実質的に純粋なとは、典型的に、タンパク質が他の混入タンパク質、核酸、お よび元の起原生物に由来する他の生物学的物質を含まないことを意味する。純度 は標準法によって検定することができ、通常、少なくとも約４０％純粋、更に通 常は少なくとも約５０％純粋、一般的には少なくとも約６０％純粋、更に一般的 には少なくとも約７０％純粋、しばしば少なくとも約７５％純粋、更にしばしば 少なくとも約８０％純粋、典型的には少なくとも約８５％純粋、更に典型的には 少なくとも約９０％純粋、好ましくは少なくとも約９５％純粋、更に好ましくは 少なくとも約９８％純粋、そして最も好ましい実施態様において少なくとも９９ ％純粋である。 ポリペプチドまたはフラグメントの溶解性は環境および該ポリペプチドに依る 。多数のパラメーターがポリペプチド溶解性に影響を与え、温度、電解質環境、 ポリペプチドの寸法および分子特性並びに溶媒の性質がある。典型的に、ポリペ プチドが用いられる温度は約４℃〜約６５℃である。通常、使用中の温度は約１ ８℃より大であり、更に通常は約２２℃より大である。診断目的のための温度は 、通常ほぼ室温またはそれより暖かいが、検定中の成分の変性温度未満である。 治療目的のための温度は、通常体温、典型的にはヒトの場合約３７℃であるが、 ある種の状況下においては温度を現場でまたはインビトロで上昇させるかまたは 低下させてよい。 電解質は、通常、ほぼ現場の生理学的条件であるが、好都合なところで更に高 いかまたは更に低いイオン強度まで修正してよい。実際のイオンは、例えば、生 理学的または分析学的状況において用いられる標準緩衝液に一致するように修正 することができる。 ポリペプチドの寸法および構造は、概して、実質的に安定な状態にあるべきで あり、通常、変性状態にない。ポリペプチドは、例えば、溶解性を与えるように 四次構造において他のポリペプチドと結合していてよいし、または天然脂質二層 相互作用に近い様式で脂質若しくは界面活性剤と結合していてよい。 溶媒は、通常、生物学的活性の保存に用いられる種類の生物学的に適合した緩 衝液であり、通常、生理学的溶媒に近い。通常、溶媒のｐＨは中性であり、典型 的には約５〜１０、好ましくは約７．５である。若干の場合、界面活性剤を加え るが、典型的に、ＣＨＳ若しくはＣＨＡＰＳなどの温和な未変性のもの、または リガンドの構造的または生理学的性質を有意に破壊しないように十分に低濃度で ある。 溶解性は特定の条件下の分子の沈降速度の尺度であるスベドベリ単位で測定さ れた沈降によって反映される。沈降速度の決定は、分析用超遠心機で古典的に行 なわれたが、現在は典型的に、標準的超遠心機で行なわれる。フライフェルダー （Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ）（１９８２）Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ （第２版），Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）；並びにカンター（ Ｃａｎｔｏｒ）およびシンメル（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ）（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙ ｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，１〜３部，Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カ ンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．），サンフランシスコを参照されたい。 大まかな決定として、可溶性と考えられるポリペプチドを含む試料を、標準的な 十分な寸法の超遠心機において約５０Ｋ ｒｐｍで約１０分間回転させ、そして 可溶性分子は上澄み中に残る。可溶性粒子またはポリペプチドは、典型的に約３ ０Ｓ未満、更に典型的には約１５Ｓ未満、通常は約１０Ｓ未満、更に通常は約６ Ｓ未満、そして具体的な実施態様において好ましくは約４Ｓ未満、更に好ましく は約３Ｓ未満である。 Ｆｌｔ３リガンドの２種類の特異的な生物学的活性を以下に記載する。第一は 、受容体に形質転換されたまたは適当な試験細胞に与えられたリガンド依存性活 性である。第二は、受容体のリガンド依存性自己リン酸化である。これら２種類 の生物学的活性を用いて適当なリガンドを単離した。物理的変異型 本発明は、更に、Ｆｌｔ３リガンドのアミノ酸配列との実質的なアミノ酸配列 相同性を有するタンパク質またはペプチドを包含する。変異型としては種または 対立遺伝子変異型がある。 アミノ酸配列相同性すなわち配列同一性は、残基対合を最適にすることによっ て、必要ならば要求に応じたギャップを導入することによって決定される。これ は、同類置換を対合と考えた場合は異なる。同類置換としては、典型的に、以下 の基、すなわちグリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパ ラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リ シン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの範囲内の置換がある。 相同のアミノ酸配列は、典型的に、それぞれのタンパク質配列中に天然の対立遺 伝子および種間変異型を含むように予定されている。典型的な相同タンパク質ま たはペプチドは、Ｆｌｔ３リガンドのアミノ酸配列と２５〜１００％相同（ギャ ップを導入しうる場合）から５０〜１００％相同（同類置換を含む場合）である 。相同性の尺度は、少なくとも約３５％、一般的には少なくとも４０％、更に一 般的には少なくとも４５％、しばしば少なくとも５０％、更にしばしば少なくと も５５％、典型的に少なくとも６０％、更に典型的には少なくとも６５％、通常 は少なくとも７０％、更に通常は少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０ ％、更に好ましくは少なくとも８０％、そして特に好ましい実施態様において少 なくとも８５％またはそれ以上である。 ニードルハム（Ｎｅｅｄｌｅｈａｍ）ら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８ ：４４３〜４５３；サンコフ（Ｓａｎｋｏｆｆ）ら（１９８３）Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ，Ｓｐｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｓ，ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃ ｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ アディソン・ウェスリー（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓ ｌｅｙ），レディング，ＭＡの第１章；並びにインテリジェネティクス（Ｉｎｔ ｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ），マウンテン・ヴュー，ＣＡ；およびウィスコンシ ン大学遺伝学コンピューターグループ（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、マ ディソン，ＷＩからのソフトウェアパッケージを更に参照されたい。 単離されたＦｌｔ３リガンドＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失 、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド伸長の逆位によって容易に修飾すること が できる。これらの修飾は、これらの抗原、それらの誘導体、または同様の生理学 的活性、免疫学的活性若しくは抗原活性を有するタンパク質をコードする新規の ＤＮＡ配列を生じる。これらの修飾された配列を用いて、突然変異体抗原を生じ るかまたは発現を促進することができる。促進された発現は、遺伝子増幅、増加 した転写、増加した翻訳および他の機序に関与することがある。このような突然 変異体Ｆｌｔ３リガンド誘導体としては、それぞれのタンパク質またはそのフラ グメントの予め決定されたまたは部位特異的突然変異がある。「突然変異体Ｆｌ ｔ３リガンド」は、他の場合には前記のようなマウスＦｌｔ３リガンドの相同性 規定の範囲内にあるが、欠失、置換または挿入によろうとよるまいといずれにせ よ天然に見出されるＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列とは異なる配列を有するポ リペプチドを包含する。 特に、「部位特異的突然変異体Ｆｌｔ１３リカンド」としては、概して、表１ の配列を有するリガンドと有意の相同性を有するタンパク質があり、各種生物学 的活性、例えば、抗原活性または免疫学的活性をこれらの配列と共有するように および好ましい実施態様において開示された配列の大部分を含む。同様の概念は 、別のＦｌｔ３リガンドタンパク質、特に、哺乳動物および鳥類などの各種温血 動物で見出されたものに当てはまる。前述のように、説明は概して全てのＦｌｔ ３リガンドタンパク質を包含するものであり、具体的に論及されたマウス実施態 様に制限されないことを強調する。 部位特異的突然変異部分は予め決定されるが、突然変異体が部位特異的である 必要はない。Ｆｌｔ３リガンド突然変異誘発は、アミノ酸を挿入または欠失させ ることによって行なうことができる。置換、欠失、挿入または任意の組合わせは 、最終構築物に到達するように生じさせることができる。挿入としては、アミノ −またはカルボキシ末端融合がある。ランダム突然変異誘発は標的コドンで行な うことができ、次に、所望の活性についてスクリーニングすることができる。既 知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定された部位で置換突然変異させる方法は、 当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発また はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ）ら（１９８９）およびオースベル（Ａｕｓｂｅｌ）ら（１９８７年および補 遺） を更に参照されたい。 ＤＮＡの突然変異は、通常、読み枠からのコーディング配列を配置すべきでは なく、好ましくは、ループまたはヘアピンなどの二次ｍＲＮＡ構造を生じるよう にハイブリッド形成可能な相補的部分を作らない。 本発明は、更に、組換えタンパク質、例えば、これらのタンパク質からのセグ メントを用いる異型融合タンパク質を提供する。異型融合タンパク質は、本来、 同様の方法では通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合である。し たがって、免疫グロブリンとＦｌｔ３リガンドポリペプチドとの融合生成物は、 典型的なペプチド連鎖で融合された、典型的には単一翻訳生成物として製造され た配列を有し且つそれぞれの源ペプチドに由来する性質を示す連続タンパク質分 子である。同様の概念は異型核酸配列に当てはまる。 更に、新規の構築物は、他のタンパク質からの同様の機能性ドメインを組合わ せることから製造することができる。例えば、リガンド結合性または他のセグメ ントは、異なる新規の融合ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換」するこ とができる。例えば、カニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら（１９８９）Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０〜１３３６；およびオーダウド（Ｏ′Ｄｏｗｄ ）ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５〜１５９９２を 参照されたい。したがって、新規の組合わせの特異性を示す新規のキメラポリペ プチドは、リガンド結合特異性および他の機能性ドメインの機能連鎖の結果とし て生じる。 ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルサーズ（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ） （１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２によって記載 されたホスホルアミダイト法は、適当な合成ＤＮＡフラグメントを生じる。２本 鎖フラグメントは、しばしば、相補鎖を合成し且つ適当な条件下で該鎖を一緒に アニーリングすることによってかまたは適当なプライマー配列と一緒にＤＮＡポ リメラーゼを用いて、例えば、ＰＣＲ技術を用いて相補鎖を加えることによって 得られる。機能性変異型 Ｆｌｔ３リガンドに対する生理学的反応の阻止は、おそらく競合阻害によって 、 Ｆｌｔ３受容体に対するリガンドの結合の阻害の結果として生じることがある。 したがって、本発明のインビトロ検定は、しばしば、単離されたタンパク質、組 換え体膜に結合したＦｌｔ３リガンドを発現する細胞からの膜、これらのリガン ドの受容体結合セグメントを含む可溶性フラグメント、または固相支持体に結合 したフラグメントを用いる。これらの検定は、更に、結合セグメント突然変異お よび修飾かまたはリガンド類似体などのリガンド突然変異および修飾の作用の診 断決定を可能にする。 本発明は、更に、例えば、抗原または受容体フラグメントに対する中和抗体が タンパク質に対する結合に関して試験化合物と競合する場合、競合的薬剤スクリ ーニング検定の使用を考える。この方法において、抗体は、リガンドの１個また はそれ以上の抗原結合部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出するのに 用いることができるし、更に、他の場合に受容体と相互作用するかもしれないタ ンパク質上の結合部位を占有するのに用いることができる。 更に、Ｆｌｔ３リガンドおよび高親和性受容体結合部位を有する該リガンドの 可溶性フラグメントに対する中和抗体は、組織、例えば異常な生理機能を経験し た組織中のリガンド機能を阻害するのに用いることができる。 Ｆｌｔ３リガンド抗原の「誘導体」としては、アミノ酸配列突然変異体、グリ コシル化変異型および他の化学残基との共有または凝集結合体がある。共有結合 誘導体は、当該技術分野において周知の手段によってＦｌｔ３リガンドアミノ酸 側鎖にまたはＮ−若しくはＣ末端に見出される基に対する官能基の結合によって 製造することができる。これらの誘導体としては、制限されないが、カルボキシ ル末端のまたはカルボキシル側鎖含有残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒド ロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミ ノ基含有残基、例えば、リシンまたはアルギニンのＮ−アシル誘導体を挙げるこ とができる。アシル基は、Ｃ３〜Ｃ１８直鎖アルキルを含むことによってアルカ ノイルアロイル種を生成するアルキル残基の群から選択される。担体タンパク質 に対する共有結合は、免疫原性部分がハプテンである場合に重要でありうる。 特に、グリコシル化変化があり、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パター ンをその合成およびプロセッシング中にまたは更にプロセッシングする段階で修 飾することによって作られる。これを達成するための特に好ましい手段は、通常 このようなプロセッシングを提供する細胞に由来するグリコシル化酵素、例えば 、哺乳動物グリコシル化酵素に対してポリペプチドを暴露することによる。脱グ リコシル化酵素も考えられる。更に、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホス ホトレオニンなどのリン酸化アミノ酸残基を含む、他の僅かな修飾を有する同様 の一次アミノ酸配列の変型がある。 誘導体の主な群は、Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントと他のタンパク 質またはポリペプチドとの共有結合複合体である。これらの誘導体は、Ｎ−若し くはＣ末端融合などの組換え体培養においてまたは反応性側基を介してタンパク 質を架橋する場合の有用性が当該技術分野において知られている原因物質の使用 によって合成することができる。架橋剤による好ましいリガンド誘導部位は、遊 離アミノ基、炭水化物残基およびシステイン残基である。 Ｆｌｔ３リガンドおよび他の相同または異型タンパク質間の融合ポリペプチド を更に提供する。多数の成長因子およびサイトカインはホモ二量体物質であり、 そして反復構築物は、タンパク質分解開裂に対する低減した感受性を含む種々の 利点を有することができる。更に、多数の受容体はシグナルを導入するように二 量体化する必要があり、そして各種二量体リガンドまたはドメイン反復体が望ま れることがある。相同ポリペプチドは、例えば、受容体結合特異性を示すハイブ リッドタンパク質を生じた異なる表面マーカー間の融合でありうる。同様に、誘 導体タンパク質の性質または活性の組合わせを示すと考えられる異型融合を構築 することができる。 典型的な例は、ルシフェラーゼなどの受容体ポリペプチドと、受容体結合セグ メントなどのリガンドのセグメントまたはドメインとの融合であるので、融合リ ガンドの存在または位置は容易に決定することができる。例えば、ダル（Ｄｕｌ ｌ）ら、米国特許第４，８５９，６０９号明細書を参照されたい。他の遺伝子融 合パートナーとしては、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、 β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母α −接合因子がある。例えば、ゴドウスキー（Ｇｏｄｏｗｓｋｉ）ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８１２〜８１６を参照されたい。 ボーケージおよびカルサーズ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１ ８５９〜１８６２によって記載されたホスホルアミダイト法は、適当な合成ＤＮ Ａフラグメントを生じる。２本鎖フラグメントは、しばしば、相補鎖を合成し且 つ適当な条件下で該鎖を一緒にアニーリングすることによってかまたは適当なプ ライマー配列と一緒にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を加えることによって 得られる。 このようなポリペプチドは、更に、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、ま たは他の残基、特にリン酸基と同様の分子形状を有するものの付加若しくは除去 によって化学的に修飾されたアミノ酸残基を有することができる。若干の実施態 様において、修飾は有用な標識試薬であるし、または親和性リガンドなどの精製 目標として役立つ。 融合タンパク質は、典型的に、組換え核酸法かまたは合成ポリペプチド法によ って製造される。概して、核酸操作および発現の技術は、例えば、サムブルック ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版），１〜３巻，コールド・スプリング・ハーバー・ラ ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） に記載されている。ポリペプチドの合成技術は、例えば、メリーフィールド（Ｍ ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２ １４９〜２１５６；メリーフィールド（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３ ４１〜３４７；およびアサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）ら（１９８９）Ｓｏｌｉ ｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ，ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ），オックスフォードに記載 されている。 本発明は、更に、アミノ酸配列の変化またはグリコシル化以外のＦｌｔ３リガ ンドの誘導体の使用を考える。このような誘導体は、化学残基との共有または凝 集結合を伴うことがある。これらの誘導体は、概して、３クラス、すなわち、（ １）塩類、（２）側鎖および末端残基共有結合修飾、並びに（３）例えば、細胞 膜との吸着複合体に分けられる。このような共有結合または凝集誘導体は、免疫 原として、免疫検定における試薬として、またはリガンド若しくは他の結合リ ガントのアフィニティー精製用などの精製法において有用である。例えば、Ｆｌ ｔ３リガンド抗原は、当該技術分野において周知の方法により、臭化シアンで活 よって固定化することができるし、または抗Ｆｌｔ３リガンド抗体若しくはその 受容体の検定若しくは精製において用いるためのポリオレフィン表面上に、グル タルアルデヒド架橋を伴うか若しくは伴うことなく吸着させることができる。 Ｆｌｔ３リガンドは、更に、検出可能な基によって標識することができ、例え ば、クロラミンＴ法によって放射性ヨウ素化することができるし、希土類キレー トに対して共有結合させることができるし、または診断検定において用いるため の別の蛍光残基に対して結合させることができる。Ｆｌｔ３リガンドの精製は、 固定された抗体または受容体によって行なうことができる。 本発明の可溶化されたＦｌｔ３リガンドまたはフラグメントは、該リガンドま たはその任意のフラグメントに特異的な抗血清または抗体の産生のために免疫原 として用いることができる。精製リガンドは、タンパク質を含む様々な形の不純 な標品を用いる免疫感作によって製造された単クローン性抗体またはリガンド結 合フラグメントをスクリーニングするのに用いることができる。特に、「抗体」 という用語は、天然抗体の抗原結合フラグメントをも包含する。精製Ｆｌｔ３リ ガンドは、更に、両者とも異常な若しくは独特の生理学的または疾病の症状の診 断薬である高濃度のリガンドまたはリガンド含有細胞フラグメントの存在に反応 して生じた抗体を検出するための試薬として用いることができる。 更に、リガンドフラグメントは、以下にすぐ記載されるように、本発明の抗体 を生じるための免疫原としても役立ちうる。例えば、本発明は、表１に示された ヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列またはそれらを含むタンパ ク質のフラグメントに対して生じた抗体を考える。特に、本発明は、脂質二層の 外側にあると予想される特異的フラグメントに対して結合親和性を有するかまた はそれに対して生じる抗体を考える。 本発明は、更に別の近縁種変異型の単離を考える。サザンおよびノーザンブロ ット分析は、他の哺乳動物に類似の遺伝物質が存在することを確証するはずであ る。Ｆｌｔ３リガンドは、齧歯類、ウサギ目、食肉目、偶蹄目、霊長類などの種 変異型の広範囲に及んでいると考えられる。 本発明は、更に、構造、発現および機能の相違および類似性の両方を表わす関 連抗原の群を単離する手段を提供する。リガンドの多数の生理学的作用の解明は 、リガンドの異なる種変異型の単離および特性決定によって大いに加速される。 特に、本発明は、異なる種における更に別の相同遺伝物質を識別するのに有用な プローブを提供する。 単離された遺伝子は、対応するＦｌｔ３リガンドを発現することができない細 胞、例えば、対応するリガンドを欠き且つ負のバックグラウンド活性を示す種の 種類かまたは細胞の形質転換を可能にする。形質転換された遺伝子の発現は、限 定されたまたは単一種変異型を有する抗原に関して純粋な細胞系の単離を可能に する。このアプローチは、任意のＦｌｔ３受容体タンパク質の生理学的作用の一 層敏感な検出および識別を可能にする。細胞下フラグメント、例えば、サイトプ ラストまたは膜フラグメントを単離し且つ用いることができる。 リガンドによって与えられた種々の分化機能を働かせる臨界的構造因子の詳細 な分析は、特に、関連クラスのメンバーを比較する場合に最新の分子生物学の標 準法を用いて可能である。例えば、カニングハムら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３９〜１３３６に記載された相同性走査型突然変異誘発技術；並 びにオーダウドら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５〜 １５９９２；およびレチライター（Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒ）ら（１９９０）ＥＭ ＢＯ Ｊ．９ ：４３８１〜４３９０で用いられたアプローチを参照されたい。 特に、受容体結合セグメントは、受容体結合親和性および特異性の両方、更に はシグナル伝達において構造的特徴が重要であることを決定するように種変異型 間で置換することができる。一連の異なるリガンド変異型は、異なる受容体種変 異型との相互作用の組合わせの性質を示すリガンドをスリーニングするのに用い られる。 おそらく、細胞内機能は、細胞質ゾルに通常近付きやすい受容体のセグメント に関係していると考えられる。しかしながら、リガンドインターナリゼーション がある種の状況下で起こることがあり、細胞内成分と「細胞外」セグメントとの 相互作用が起こりうる。Ｆｌｔ３リガンドと他の細胞内成分との相互作用の独特 のセグメントは、突然変異誘発または直接的な生化学的手段、例えば、架橋若し くはアフィニティー法によって識別することができる。結晶学的または他の物理 的方法による構造分析もまた応用可能である。シグナル伝達の機序についての研 究としては、更に、アフィニティー法または遺伝学的手段、例えば、突然変異体 の相補性分析によって単離可能でありうる関連成分の研究がある。 Ｆｌｔ３リガンドの発現および制御の研究を更に続ける。リガンドに関係した 制御因子は、分化的な発生上の、組織特異的なまたは他の発現パターンを示すこ とができる。上流または下流の遺伝子部分、例えば、制御因子は興味深い。特に 、発生上のまたは生理学的変異型の、例えば、多数の他にプロセッシングされた 形のリガンドが見出された。例えば、表３を参照されたい。例えば、メッセージ の分化的スプライシングは、リガンドの膜結合型、可溶性型および修飾変異型を もたらすことができる。 リガンドの構造研究は、新規のリガンド、特に、受容体上でアゴニストおよび アンタゴニストの性質を示す類似体の設計をもたらす。これを前に記載されたス クリーニング法と組合わせて、望ましいスペクトルの活性を示すリガンドを単離 することができる。 他の細胞種における発現は、しばしば、特定のリガンドで異なるグリコシル化 を引き起こす。様々な種変異型は、アミノ酸配列以外の構造上の相違に基づく異 なる機能を示すことがある。分化的修飾は分化的機能の原因でありうるし、現在 、作用の解明が可能になっている。 したがって、本発明は、生理学的リガンド−受容体相互作用に関連した重要な 試薬を提供する。前述の説明は主としてマウスＦｌｔ３リガンドに的をしぼって きたが、当業者は、本発明が他のリガンド、例えば、ラットおよび他の哺乳動物 種または対立遺伝子変異型、更にはそれらの変異型を包含することを速やかに理 解する。抗体 抗体は、天然に存在する形および組換え体の形の両方の種または対立遺伝子変 異型およびそれらのフラグメントを含む種々のＦｌｔ３リガンドに対して生じる ことができる。更に、抗体は、活性型かまたは不活性型のＦｌｔ３リガンドに対 しても生じることができる。抗イディオタイプ抗体も考えられる。 リガンドの予め決定されたフラグメントに対する、結合フラグメントおよび一 本鎖変型を含む抗体は、該フラグメントと免疫原性タンパク質との複合体を用い る動物の免疫感作によって生じることができる。単クローン性抗体は、所望の抗 体を分泌する細胞から製造される。これらの抗体は、正常若しくは欠陥Ｆｌｔ３ リガンドに対する結合についてスクリーニングされることができるし、または受 容体によって媒介されるようなアゴニスト若しくはアンタゴニスト活性について スクリーニングされることができる。これらの単クローン性抗体は、通常、少な くともＫ_Ｄが約１ｍＭ、更に通常は少なくとも約３００μＭ、典型的には少なく とも約１０μＭ、更に典型的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも 約１０μＭ、そして更に好ましくは少なくとも約３μＭまたはそれ以上で結合す る。 抗原結合フラグメントを含む本発明の抗体は、有意の診断上のまたは治療上の 価値を有する。それらは、受容体に対して結合し且つリガンド結合を阻害するま たは生体反応を引き出すリガンドの能力を阻害する強力なアンタゴニストであり うる。更に、抗体は非中和抗体としても有用でありうるし、しかも該抗体がリガ ンドに対して結合する場合に、例えばその表面上でそれを発現する細胞を死滅さ せるように、毒素または放射性核種に対して結合することができる。更に、これ らの抗体は、薬剤または他の治療薬に対して直接的にかまたはリンカーによって 間接的に結合することができるし、しかも薬剤を標的に集中させることができる 。 本発明の抗体は、更に、診断用途において有用でありうる。捕捉または非中和 抗体として、それらが受容体結合を阻害することなくリガンドに対して結合する 能力についてスクリーニングすることができる。中和抗体としては、競合結合検 定において有用でありうる。更に、それらは、Ｆｌｔ３リガンドまたはその受容 体を検出するまたは定量する場合に有用である。 リガンドフラグメントは、他の物質、特にポリペプチドに対して、免疫原とし て用いられる融合または共有結合したポリペプチドのように結合することができ る。リガンドおよびそのフラグメントは、種々の免疫原、例えば、スカシガイの ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド等に対して融合または共 有結合することができる。多クローン性抗血清を製造する方法の説明について、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ，ホーバー・メディカル・ディビジョン（Ｈｏｅｂｅ ｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ），ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）およびロ ー（Ｒｏｗ），１９６９年；ランドスタイナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ）（１ ９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔ ｉｏｎｓ ，ドーバー・パブリケーションズ（Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ），ニューヨーク、およびウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら（１９６７ ）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ ，１巻，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） ，ニューヨークを参照されたい。典型的な方法は、抗原による動物の超免疫感作 を必要とする。次に、反復免疫感作直後に被験動物の血液を採取し、そしてγ− グロブリンを単離する。 若干の場合、種々の哺乳動物宿主、例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒト等 から単クローン性抗体を製造することが望まれる。このような単クローン性抗体 を製造するための技術の説明は、例えば、スティッツ（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（監修 ）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）， ランゲ・メディカル・パブリケーションズ（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕ ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），ロス・アルトス，ＣＡ、およびそこにおいて引用され た参考文献；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレイン（Ｌａｎｅ）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，ＣＳＨプレ ス；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （第２版） アカデミック・プレス，ニューヨーク；そして特に、単クローン性抗体を生じる 一つの方法を論及しているＮａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７のコーラー（ Ｋｏｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）において見 出すことができる。 簡単に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注射することを必要とする。 次に、被験動物を屠殺し、そしてその脾臓から細胞を採取した後、それを骨髄腫 細胞と融合させる。結果は、インビトロで再現することができるハイブリッド細 胞すなわち「ハイブリドーマ」である。次に、ハイブリドーマ集団をスクリーニ ングして、免疫原に対する単一抗体種をそれぞれ分泌する個々のクローンを単離 する。この方法において、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質上で認識され た特定の部位に反応して生じた免疫動物からの不死化され且つクローン化された 単Ｂ細胞の産物である。 他の適当な技術は、抗原性ポリペプチドに対する、または代わりにファージ若 しくは同様のベクター中の抗体のライブリーの選択に対するリンパ球のインビト ロ暴露を伴う。ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）「λファージにおける免疫 グロブリンレパートリーの多数の組合わせライブラリーの継代（Ｇｅｎｅｒａｔ ｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８ １；およびワード（Ｗａｒｄ）ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜 ５４６を参照されたい。本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾を伴ってまたは 伴うことなく用いることができ、キメラまたはヒト化抗体を含む。しばしば、該 ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを与える物質を共有結合によっ てかまたは非共有結合によって結合することにより標識される。 広範囲の標識および結合技術が知られており、科学および特許文献の両方で広 く報告されている。適当な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補助因子、 阻害剤、蛍光残基、化学発光残基、磁性粒子等がある。このような標識の使用を 教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書；同第３，８５ ０，７５２号明細書；同第３，９３９，３５０号明細書；同第３，９９６，３４ ５号明細書；同第４，２７７，４３７号明細書；同第４，２７５，１４９号明細 書；および同第４，３６６，２４１号明細書がある。更に、組換え免疫グロブリ ンを製造することができ、カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）、米国特許第４，８１６ ，５６７号明細書を参照されたい。 本発明の抗体は、更に、タンパク質を単離する場合のアフィニティークロマト グラフィーに用いることができる。抗体が固体支持体、例えば、アガロース、Ｓ ことができ、そこにおいて細胞溶解産物をカラムを介して通過させることができ 、カラムを洗浄した後、温和な変性剤の濃度を増加させ、それによって精製Ｆｌ ｔ３リガンドタンパク質を遊離させる。 更に、抗体は、特定の発現産物の発現ライブラリーをスクリーニングするのに 用いることができる。通常、この種の方法で用いられる抗体は、抗体結合によっ て抗原の存在を容易に検出させる残基で標識される。 それぞれのＦｌｔ３リガンドに対して生じた抗体は、抗イディオタイプ抗体を 生じさせるのにも有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関係した種々 の免疫学的症状を検出するまたは診断する場合に有用である。核酸 記載されたペプチド配列および関連試薬は、例えば、天然起原のＦｌｔ３リガ ンドをコードしているＤＮＡクローンを単離する場合に有用である。典型的に、 それはマウスから遺伝子を単離する場合に有用であり、同様の手順を適用して他 の種、例えば、鳥類および哺乳動物などの温血動物から遺伝子を単離する。表３ を参照されたい。クロスハイブリッド形成は、他の種からのリガンドの単離を可 能にする。適当な核酸クローンをうまく単離するのに多数の異なるアプローチが 利用できるはずである。 精製タンパク質または定義されたペプチドは、前記のように標準法によって抗 体を生じさせるのに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質を免疫系に 与えて、単クローン性または多クローン性抗体を生じることができる。例えば、 コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ウィリー／グリーン（Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎ ｅ）；およびハーローおよびレイン（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，コールド・スプリング・ハーバー・プレス を参照されたい。或いは、Ｆｌｔ３受容体は特異的結合試薬として用いることが できるし、しかもその結合特異性を利用することができ、抗体と同様に大いに用 いられるであろう。 例えば、特異的結合性組成物は、Ｆｌｔ３リガンドを発現する細胞系から製造 された発現ライブラリーのスクリーニングに用いることができた。スクリーニン グは、表面で発現されたリガンドの標準的な染色でありうるし、またはパニング による。細胞内発現のスクリーニングは、種々の染色または免疫蛍光法手順によ っても達成しうる。該結合性組成物を用いて、リガンドを発現する細胞をアフィ ニティー精製するかまたは選別することができた。 ペプチドセグメントは、更に、ライブラリーをスクリーニングするのに適当な オリゴヌクレオチドを予想するのに用いることができる。遺伝コードを用いて、 スクリーニング用のプローブとして有用な適当なオリゴヌクレオチドを選択する ことができる。例えば、表３を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 技術との組合わせにおいて、合成オリゴヌクレオチドはライブラリーから正しい クローンを選択する場合に有用である。相補的配列もまた、プローブまたはプラ イマーとして用いられる。適当なアミノ末端の識別に基づいて、第三のペプチド は特に有用であるべきであり、例えば、アンカーベクター若しくはポリ−Ａ相補 的ＰＣＲ技術とまたは他のペプチドの相補的ＤＮＡと組み合わされるべきである 。 当然ながら、相補的配列もまた有用である。 表３に示された配列を、以下のように配列表で更に定義する。ペプチド 配列番号： １．（ａ） ２５ （ｂ） ２６ （ｃ） ２７ （ｄ） ２８ （ｅ） ２９ ２． ３０ ３． ３１ ４．（ａ） ３２ （ｂ） ３３ ５． ３４ ヌクレオチド配列 ３５ ＭｏＴ１１０／Ｔ１１８ ２１ ＭＢ８ ２３ペプチド 配列番号： Ｔ１１８ ヌクレオチド配列 ２４ アミノ酸配列 ２２ ＨｕＳ８６／Ｓ１０９ １９ Ｓ１０９ ２０ アミノ末端セグメントをコードしている単離された核酸を単離し且つ配列決定 して、そして以下の配列が得られる。 ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＴＣ ＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧＴＴ Ｔ ＡＧＡ ＧＡＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＴＴＡＡＡ ＧＡＴ これをプローブとして用いて、更に長いまたは完全長さクローンを単離すること ができ、他の種若しくは対立遺伝子変異型または他の近縁遺伝子の単離をもたら す。表３および以下の表５を参照されたい。 本発明は、生物学的に活性な対応するＦｌｔ３リガンドポリペプチドをコード する単離されたＤＮＡまたはフラグメントの使用を考える。更に、本発明は、適 当な条件下において本明細書中に記載のＤＮＡ配列とハイブリッド形成すること ができる生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードする単離され たまたは組換えＤＮＡに関する。前記生物学的に活性なタンパク質またはポリペ プチドは、そのままのリガンドまたはフラグメントでありうるし、そして表１に 開示されたようなアミノ酸配列を有する。更に、本発明は、Ｆｌｔ３リガンドと 相同であるかまたはＦｌｔ３リガンドをコードしているｃＤＮＡをプローブとし て用いて単離されたタンパク質をコードする単離された若しくは組換えＤＮＡま たはそのフラグメントの使用に関する。単離されたＤＮＡは、５′および３′側 にそれぞれの調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ−Ａ付加シ グナル他を有することがある。 「単離された」核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマーなどの核酸であり 、天然の配列、例えば、由来の種からのリボソーム、ポリメラーゼおよびフラン キングゲノム配列を当然伴う他の成分から実質的に分離される。該用語は、その 天然に存在する環境から取出された核酸配列を包含し、組換えまたはクローン化 ＤＮＡ単離物および化学的に合成された類似体または異種系によって生物学的に 合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子としては、単離された形の分子が ある。 単離された核酸は、概して、分子の均一組成物であるが、若干の実施態様にお いては少量の不均一を含む。この不均一は、典型的に、望ましい生物学的機能ま たは活性に臨界的でないポリマー末端または部分で見出される。 「組換え」核酸は、その製造法かまたはその構造によって規定される。例えば 、ある方法によって製造された生成物の製造法に関して、該方法は組換え核酸技 術の使用であり、例えば、ヌクレオチド配列中にヒトの介入、典型的には選択ま たは製造を伴う。或いは、それは、本来は互いに隣接しない二つのフラグメント の融合を含む配列を生じることによって製造された核酸でありうるが、天然に存 在する突然変異体などの自然の生産物を除外する意味である。したがって、例え ば、何等かの天然に存在しないベクターによる細胞の形質転換によって製造され た生成物は、何等かの合成オリゴヌクレオチド法を用いて誘導された配列を含む 核酸と同様に包含される。このようなことは、コドンを同様のまたは同類のアミ ノ酸をコードしている重複コドンで置き換えるのにしばしば行なわれるが、典型 的には、配列認識部位を導入するかまたは除去する。 或いは、一般的に入手可能な天然の形では見出されない望ましい機能組み合わ せを含む単一遺伝物質を生じさせる望ましい機能の核酸セグメントを一緒に結合 することを行なう。制限酵素認識部位は、しばしば、このような人工的操作の標 的であるが、他の部位特異的標的、例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調 節配列、制御配列または他の有用な特徴を設計によって組み込むことができる。 同様の概念を、融合などの組換えポリペプチドに当てはめる。具体的に挙げられ るのは、これらの抗原のフラグメントと同様のポリペプチドを遺伝コード重複性 によってコードする合成核酸、および種々の異なる種変異型からの配列の融合物 がある。 核酸文脈中の有意の「フラグメント」は、少なくとも約１７ヌクレオチド、一 般的には少なくとも２０ヌクレオチド、更に一般的には少なくとも２３ヌクレオ チド、普通は少なくとも２６ヌクレオチド、更に普通は少なくとも２９ヌクレオ チド、しばしば少なくとも３２ヌクレオチド、更にしばしば少なくとも３５ヌク レオチド、典型的には少なくとも３８ヌクレオチド、更に典型的には少なくとも ４１ヌクレオチド、通常は少なくとも４４ヌクレオチド、更に通常は少なくとも ４７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、更に好ましくは少 なくとも５３ヌクレオチドの隣接したセグメントであり、そして特に好ましい実 施態様においては少なくとも５６ヌクレオチドまたはそれ以上である。 Ｆｌｔ３リガンドタンパク質をコードするＤＮＡは、特に、遺伝子、ｍＲＮＡ 、および関連のまたは相同のリガンドをコードするｃＤＮＡ種、更には別の種か らの相同タンパク質をコードするＤＮＡを同定するのに有用である。霊長類を含 む他の種に相同体が存在すると考えられる。種々のＦｌｔ３リガンドタンパク質 が相同であるべきであり、本明細書中に包含される。しかしながら、該リガンド に対して進化の関係が一層遠いタンパク質でさえも、それらが十分に相同である ならば、適当な条件下においてこれらの配列を用いて容易に単離することができ る。霊長類Ｆｌｔ３リガンドタンパク質は特に興味深い。 本発明は、更に、本明細書中に記載の単離されたＤＮＡと同一のまたは極めて 相同のＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子およびフラグメントに関する。特に 、該配列は、しばしば、転写、翻訳およびＤＮＡ複製を制御するＤＮＡセグメン トに対して機能的に結合している。或いは、イントロンを含むようなゲノム配列 に由来する組換え体クローンは、例えば、形質転換細胞および生物を含む形質転 換実験に、並びに遺伝子治療に有用である。例えば、ロイット（Ｒｏｉｔｔ）（ 監修）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ アカデミック ・プレス，サン・ディエゴ，１５０２〜１５０４頁のグッドナウ（Ｇｏｏｄｎｏ ｗ）（１９９２）「形質転換動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ）」 ；トラヴィス（Ｔｒａｖｉｓ）（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１３９２ 〜１３９４；クーン（Ｋｕｈｎ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７０ ７〜７１０；カペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ ４ ： １２８８；ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）（１９８７）（監修）Ｔｅｒａ ｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬプレス，オックスフォ ード；およびローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ ｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：１８０〜１９９を参照されたい。 相同核酸配列は、比較した場合、有意の類似性を示す。核酸の相同性の基準は 、当該技術分野において一般的に用いられる配列比較による相同性の尺度である かまたはハイブリッド形成条件に基づく。ハイブリッド形成条件は以下に詳細に 記載されている。 核酸配列比較文脈中の実質的相同性とは、セグメントかまたはそれらの相補鎖 が、比較した場合、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に配列され た場合に、ヌクレオチドの少なくとも約５０％、一般的には少なくとも５６％、 更に一般的には少なくとも５９％、普通は少なくとも６２％、更に普通は少なく とも６５％、しばしば少なくとも６８％、更にしばしば少なくとも７１％、典型 的には少なくとも７４％、更に典型的には少なくとも７７％、通常は少なくとも ８０％、更に通常少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、更に好 ましくは少なくとも約９５〜９８％またはそれ以上で、そして特別な実施態様に おいては約９９％またはそれ以上の高さのヌクレオチドで同一であることを意味 する。 或いは、セグメントが選択的ハイブリッド形成条件下において、典型的には表 ２に由来する配列を用いてある鎖またはその相補鎖に対してハイブリッド形成す る場合、実質的な相同性が存在する。典型的には、少なくとも約３０ヌクレオチ ドの伸長にわたって少なくとも約５５％の相同性、好ましくは少なくとも約２５ ヌクレオチドの伸長にわたって少なくとも約６５％、更に好ましくは少なくとも 約７５％、そして最も好ましくは約２０ヌクレオチドにわたって少なくとも約９ ０％の相同性が存在する場合に選択的ハイブリッド形成が起こる。カネヒサ（Ｋ ａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３〜２ １３を参照されたい。 記載のような相同性比較長さは、更に長い伸長部分にわたっていてよく、若干 の実施態様においては少なくとも約１７ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ ヌクレオチド、更に通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくと も約２８ヌクレオチド、更に典型的には少なくとも約４０ヌクレオチド、好まし くは少なくとも約５０ヌクレオチド、そして更に好ましくは少なくとも約７５〜 １００ヌクレオチドまたはそれ以上の伸長部分にわたる。 ハイブリッド形成文脈中の相同性に関する緊縮条件は、塩、温度、有機溶媒お よび他のパラメーター、典型的にはハイブリッド形成反応において制御されたも のの緊縮組み合わせ条件である。緊縮温度条件としては、通常、約３０℃を越え る、更に通常は約３７℃を越える、典型的には約４５℃を越える、更に典型的に は約５５℃を越える、好ましくは約６５℃を越える、そして更に好ましくは約７ ０℃を越える温度がある。緊縮塩条件は、普通は約１０００ｍＭ未満、通常は約 ５００ｍＭ未満、更に通常は約４００ｍＭ未満、典型的には約３００ｍＭ未満、 好ましくは約２００ｍＭ未満、そして更に好ましくは約１５０ｍＭ未満である。 しかしながら、いずれか一つのパラメーターの尺度よりもパラメーターの組み合 わせがはるかに重要である。例えば、ウェットマー（Ｗｅｔｍｕｒ）およびデー ビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３ ４９〜３７０を参照されたい。 他の哺乳動物種からのＦｌｔ３リガンドは、近縁種の交雑種ハイブリッド形成 によってクローン化し且つ単離することができる。例えば、以下を参照されたい 。均一性は遠縁種間では比較的低いことがあり、したがって、比較的近縁の種の ハイブリッド形成が賢明である。或いは、種特異性をほとんど示さない抗体標品 の製造は、発現クローニングアプローチにおいて有用でありうる。Ｆｌｔ３リガンドの製造：模擬 Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡは、化学的合成 、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または広範囲の細胞系若しくは組織 試料から製造されたゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得る ことができる。 このＤＮＡは、例えば、多クローン性または単クローン性抗体を生じさせるの に順次に用いることができる完全長さリガンドまたはフラグメントの合成のため に；結合実験のために；修飾分子の構築および発現のために；そして構造／機能 研究のために広範囲の細胞宿主において発現させることができる。それぞれの抗 原またはそのフラグメントは、適当な発現ベクターによって形質転換またはトラ ンスフェクトされた宿主細胞において発現することができる。これらの分子は、 組換え体宿主に由来するもの以外のタンパク質または細胞混入物を含まないよう に実質的に精製することができ、したがって、薬学的に許容しうる担体および／ または希釈剤と組合わされた場合の薬剤組成物において特に有用である。抗原ま たはその部分は、他のタンパク質との融合物として発現することができる。 発現ベクターは、典型的に、適当な宿主細胞において認識される適当な遺伝制 御因子に対して通常機能的に結合した所望の抗原遺伝子またはそのフラグメント を含む自己複製性ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。これらの制御因子は、適当 な宿主中で発現することができる。発現させるのに必要な制御因子の具体的な種 類は、用いられる最終宿主細胞に依る。概して、遺伝制御因子としては、原核生 物プロモーターシステムまたは真核生物プロモーター発現制御システムを挙げる ことができ、典型的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意のオペ レーター、ｍＲＮＡ発現レベルを高める転写エンハンサー、適当なリボソーム結 合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳を終結させる配列がある。更に 、発現ベクターは、通常、宿主細胞とは無関係にベクターを複製させる複製起点 を含む。 本発明のベクターは、典型的には生物学的に活性なポリペプチドをコードして いるＦｌｔ３リガンドをコードするＤＮＡまたはそのフラグメントを含む。該Ｄ ＮＡは、ウイルスプロモーターの制御下にありうるし且つ選択マーカーをコード することができる。本発明は、更に、原核生物または真核生物宿主中でＦｌｔ３ リガンドをコードする真核性ｃＤＮＡを発現することができるこのような発現ベ クターの使用を考えるが、ここにおいて、該ベクターは宿主と適合しうるし、そ して該リガンドをコードする真核性ｃＤＮＡは、該ベクターを含む宿主の増殖が 当該ｃＤＮＡを発現するようにベクター中に挿入される。通常、発現ベクターは 、、望ましい遺伝子の細胞当りの全コピー数を大きく増加させるように、それら の宿主細胞における安定な複製のためにまたは増幅のために設計される。発現ベ ク ターが宿主細胞中で複製することは必ずしも必要ではなく、例えば、宿主細胞に よって認識される複製起点を含まないベクターを用いて様々な宿主においてリガ ンドまたはそのフラグメントを一時的に発現させることが可能である。更に、組 換えによって宿主ＤＮＡ中へのＦｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントの組込 みを引き起こすベクターを用いること、または内因性遺伝子の発現を制御するプ ロモーターを組込むことも可能である。 本明細書中で用いられるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファ ージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノム中へのＤＮＡフラ グメントの組込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、機能的に 結合した遺伝子の発現をもたらす遺伝制御因子を含む特殊なベクターである。プ ラスミドは、最も一般的に用いられる形のベクターであるが、均等な機能を与え 且つ当該技術分野において知られているまたは知られることになる他の形のベク ターはいずれも本明細書中で用いるのに適している。例えば、ポーウェルズ（Ｐ ｏｕｗｅｌｓ）ら（１９８５年および補遺）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）， ニューヨークおよびロドリクツ（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ）ら（１９８８）（監修）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ ，バタースワース（Ｂｕｔ ｔｅｒｓｗｏｒｔｈ），ボストン，ＭＡを参照されたい。 形質転換細胞としては、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベ クターを含むＦｌｔ３リガンド遺伝子によって形質転換またはトランスフェクト された哺乳動物細胞がある。形質転換された宿主細胞は、通常、リガンドまたは そのフラグメントを発現するが、クローニング、増幅およびそのＤＮＡの操作の 目的にはタンパク質を発現させる必要はない。本発明は、更に、栄養培地中で形 質転換細胞を培養し、それによって培養物中にタンパク質を蓄積させることを考 える。該タンパク質は、培養物からかまたは培地から回収することができる。 本発明の目的のために、ＤＮＡ配列が互いに機能的に関係している場合、それ らを機能的に結合させる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがプレ タンパク質として発現されるかまたはポリペプチドを細胞膜に対して向けること 若しくはポリペプチドの分泌に関与している場合、それを該ポリペプチドに対し て機能的に結合させる。プロモーターがポリペプチドの転写を制御する場合、そ れをコーディング配列に対して結合させ；リボソーム結合部位が翻訳を可能にす るように配置されている場合、それをコーディング配列に対して結合させる。通 常、機能的に結合したとは、隣接しているおよび読み枠中にあるという意味であ るが、しかしながら、リプレッサー遺伝子などの若干の遺伝因子は、隣接して結 合されていないが、順次に発現を制御するオペレーター配列に対してはなお結合 している。 適当な宿主細胞としては、原核生物、下等真核生物および高等真核生物がある 。原核生物としては、グラム陰性およびグラム陽性両方の微生物、例えば、大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がある。下等真核生 物としては、酵母、例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピ キア（Ｐｉｃｈｉａ）、並びにディクティオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌ ｌｉｕｍ）属の種がある。高等真核生物としては、昆虫細胞および鳥類などの非 哺乳動物起原、並びにヒト、霊長類および齧歯類などの哺乳動物起原の両方の動 物細胞から樹立された組織培養細胞系がある。 原核生物宿主−ベクター系としては、多数の異なる種の広範囲のベクターがあ る。本明細書中で用いたように、大腸菌およびそのベクターは、他の原核生物に おいて用いられた均等なベクターを含むように一般的に用いられる。ＤＮＡを増 幅させるための典型的なベクターは、ｐＢＲ３２２または多数のその誘導体であ る。Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントを発現させるのに用いることがで きるベクターとしては、制限されないが、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣ−系列） ；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮ −系列）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃ（ｐ ＤＲ５４０）などのハイブリッドプロモーターを含むものなどのベクターがある 。ロドリゲツ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）およびデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）（ 監修）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ ，バタースワ ース，ボストン，１０章，２０５〜２３６頁のブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）ら （１９８８）「λ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−およびＩｐｐ誘導プロモーターを用い る発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐ ｒｏｍｏｔｅｒｓ）」を参照されたい。 酵母およびディクティオステリウムなどの下等真核生物は、ベクターを含むＦ ｌｔ３リガンド配列によって形質転換することができる。本発明の目的のための 最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母であるサッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。それは、下等 真核生物を一般的に表わすのに用いられるが、多数の他の菌株および種もまた利 用可能である。酵母ベクターは、典型的に、複製起点（組込み型を除いて）、選 択遺伝子、プロモーター、所望のタンパク質またはそのフラグメントをコードし ているＤＮＡ、並びに翻訳終結、ポリアデニル化および転写終結のための配列か ら成る。 酵母の適当な発現ベクターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼおよび 種々の他の解糖酵素遺伝子プロモーターのような構成性プロモーターまたはアル コールデヒドロゲナーゼ２プロモーター若しくはメタロチオニンプロモーターの ような誘導プロモーターがある。適当なベクターとしては、以下の種類の誘導体 がある。自己複製性低コピー数（ＹＲｐ−系列など）、自己複製性高コピー数（ ＹＥｐ−系列など）；組込み型（ＹＩｐ−系列など）またはミニ染色体（ＹＣｐ −系列など）。 高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なＦｌｔ３リガンドタンパク質の 発現に好ましい宿主細胞である。原則として、昆虫バキュロウイルス発現系など の高等真核生物組織培養細胞系は、無脊椎動物起原であろうと脊椎動物起原であ ろうといずれも使用可能である。しかしながら、共翻訳によっても翻訳後によっ ても、プロセッシングの点においては哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞 の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は常套手段となっている。 有用な細胞系の例としては、ヒーラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）細胞系、乳児ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞系、昆虫細胞系、トリ細胞系および サル（ＣＯＳ）細胞系がある。このような細胞系の発現ベクターは、通常、複製 起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡを用 いる場合）、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。これらのベクター は、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子も含む。 適当な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス 、ワクシニアウイルスまたはサイトメガロウイルスからのような起原に由来する プロモーターを有するプラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスでありうる。 適当な発現ベクターの典型的な例としては、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ、オカヤマ（ Ｏｋａｙａｍａ）ら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６〜 １１４２を参照されたい；ｐＭＣ１ｎｅｏポリＡ、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら （１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３〜５１２；およびバキュロウイルスベクタ ー、例えば、ｐＡＣ ３７３またはｐＡＣ ６１０がある。 しばしば、独特のまたは一定のグリコシル化パターンを与える系においてＦｌ ｔ３リガンドポリペプチドを発現させることが望まれる。この場合、通常のパタ ーンは、発現系によって自然に与えられるものである。しかしながら、該パータ ンは、異種発現系に導入された適当なグリコシル化タンパク質に対して、グリコ シル化されていない形などのポリペプチドを暴露することによって修飾可能であ る。例えば、Ｆｌｔ３リガンド遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素 をコードしている１種類またはそれ以上の遺伝子によって共形質転換することが できる。このアプローチを用いると、若干の哺乳動物グリコシル化パターンは原 核生物または他の細胞中で達成できるまたは近似する。 Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントは、細胞膜に対してホスファチジル イノシトール（ＰＩ）結合されるように工学処理されうるが、ホスファチジルイ ノシトール開裂酵素、例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣに よる処理によって膜から除去することができる。これは、生物学的に活性な形で 抗原を放出し、そしてタンパク質化学の標準法による精製を可能にする。例えば 、ロ−（Ｌｏｗ）ら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９８８ ：４２７〜４５４；ツェ（Ｔｓｅ）ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３ ０ ：１００３〜１００８；およびブルンナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ）ら（１９９１）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１４ ：１２７５〜１２８３を参照されたい。 Ｆｌｔ３リガンドが特性決定された現在、そのフラグメントまたは誘導体は、 ペプチドを合成する慣用法によって製造することができる。これらには、ステュ ワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，ピアス・ケミカル・カン パニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．），ロックフオード，ＩＬ； ボダンツキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）およびボダンツキー（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，スプリンガー ・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），ニューヨーク；およびボ ダンツキー（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，スプリンガー・フェアラーク，ニューヨークに記載され ているような方法がある。 例えば、アジド法、酸塩化物法、酸無水物法、混合無水物法、活性エステル法 （例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ルまたはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾール法、酸化的還元的法、 またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）／添加剤法を用いることが できる。固相および液相合成は両方とも前述の方法に応用できる。 Ｆｌｔ３リガンド、フラグメントまたは誘導体は、ペプチド合成において典型 的に用いられる上記方法により、概して、配列中においてアミノ酸を末端アミノ 酸に対して一つ一つ縮合させることを含むいわゆる段階法によってかまたは末端 アミノ酸に対してペプチドフラグメントをカップリングさせることによって適当 に製造される。カップリング反応で用いられないアミノ基は、典型的に、間違っ た位置でカップリングすることがないように保護される。 固相合成を用いる場合、Ｃ末端アミノ酸を不溶性担体または支持体に対してそ のカルボキシル基によって結合させる。不溶性担体は、それが反応性カルボキシ ル基に対する結合能力を有する限りにおいて特に制限されない。このような不溶 性担体の例としては、ハロメチル樹脂、例えば、クロロメチル樹脂またはブロモ メチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、ｔ−アルキルオキシカル ボニル−ヒドラジド化樹脂等がある。 アミノ基が保護されたアミノ酸を、その活性カルボキシル基および前に生成さ れたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基の縮合によって配列中で結合して、ペプ チドを一つ一つ合成する。完全な配列を合成した後、ペプチドを不溶性担体から 分離してペプチドを生じる。この固相法は、概して、メリーフィールドら（１９ ６３）によってＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５６に記載 されている。 製造されたリガンドおよびそのフラグメントは、ペプチド分離によって、例え ば、抽出、沈殿、電気泳動および様々な形のクロマトグラフィー等によって反応 混合物から単離し且つ精製することができる。本発明のＦｌｔ３リガンドは、そ の望ましい使用に応じた様々な精製度で得ることができる。精製は、本明細書中 に開示されたタンパク質精製技術の使用によってまたは免疫吸着アフィニティー クロマトグラフィーにおいて本明細書中に記載された抗体の使用によって達成す ることができる。 この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーは、最初に抗体を固体支持体 に対して結合させた後、結合した抗体を、適当な起原細胞の可溶化溶解産物、リ ガンドを発現する他の細胞の溶解産物、またはＦｌｔ３リガンドをＤＮＡ技術の 結果として生産する細胞の溶解産物または上澄みと接触させることによって行な われ、以下を参照されたい。用途 本発明は、本明細書中の他のところ、例えば、発生上の異常についての概説に おいてまたは以下の診断用キットの説明において記載の診断用途において用いら れる試薬を提供する。 本発明は、更に、有意の治療効果を有する試薬を提供する。Ｆｌｔ３リガンド （天然に存在するまたは組換え体）、そのフラグメントおよびそれに対する抗体 は、Ｆｌｔ３リガンドに対する結合親和性を有すると定義された化合物と一緒に 、癌状態などの異常増殖または変性状態を含む異常な生理学または発生に関係し た症状の治療において有用であるべきである。特に、リンパ系細胞の発生の調節 が考えられるが、性腺および神経細胞などの非リンパ系組織上のより広範な組織 分布は、このような組織の発生が同様に反応することを示唆している。 異常増殖、再生、変性および委縮は、本明細書中で提供された組成物を用いる 適当な治療処置によって調節することができる。例えば、Ｆｌｔ３リガンドによ る異常発現または異常シグナリングに関係した疾患または障害は、該リガンドの アゴニストまたはアンタゴニストの適当な標的であるべきである。該リガンドは 、自己免疫疾患などの免疫学的応答に影響を与えるリンパ系細胞などの造血系細 胞の調節または発生においてある役割を果たしていると考えられる。 他の異常な発生上の状態は、ノーザンブロット分析によってＦｌｔ３受容体ｍ ＲＮＡを有することが分かった細胞種のそれぞれにおいて知られている。バーコ ウ（Ｂｅｒｋｏｗ）（監修）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａ ｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ，メルク・アンド・カンパニー（Ｍｅｒ ｃｋ ＆ Ｃｏ．），ローウェー，Ｎ．Ｊ．；およびトルン（Ｔｈｏｒｎ）ら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ′ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅ ｄｉｃｉｎｅ ，マクグロー・ヒル，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。例えば、神経およ び脳の異常は、例えば、脳血管性疾患、ＣＮＳ新生物、脱髄疾患および筋ジスト ロフィーに存在する。肝臓障害、腎臓障害、心肺障害および他の難点が、しばし ば医学的症状を引き起こす。これらの難点は、本明細書中で与えられた組成物を 用いる予防または治療を受けやすいかもしれない。 組換えＦｌｔ３リガンドまたはＦｌｔ３リガンド抗体は、精製した後、患者に 投与することができる。これらの試薬は、例えば、免疫原性アジュバントなどの 慣用的な薬学的に許容しうる担体または希釈剤中の追加の活性または不活性成分 と一緒に治療使用するために、生理学的に無害な安定化剤および賦形剤と一緒に 組合わせることができる。これらの組合わせは、滅菌濾過し、そして用量バイア ル中での凍結乾燥または安定な水性製剤中での貯蔵によるように剤形にすること ができる。本発明は、更に、抗体または補体結合ではない形を含むその結合フラ グメントの使用を考える。 Ｆｌｔ３受容体またはそのフラグメントを用いる薬剤スクリーニングは、Ｆｌ ｔ３リガンドに対して結合親和性を有する化合物を識別するように行なうことが でき、関連成分の単離を含む。次に、引続きの生物学的検定を用いて、該化合物 が固有の剌激活性を有するかどうか、したがって、それがリガンドの活性を阻止 するという点でブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうかを確認すること ができる。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は受容体を活性化することが でき、したがって、それがＦｌｔ３リガンドの活性を刺激するという点でアゴニ ストである。本発明は、更に、Ｆｌｔ３リカンドに対する抗体のアンタゴニスト としての治療使用を考える。このアプローチは、他のＦｌｔ３リガンド種変異型 と一緒に特に有用であるべきである。 有効な治療に必要な試薬の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態お よび投与される他の薬剤を含む多数の異なる因子による。したがって、処置用量 は、安全性および効力を最適にするように滴定されるべきである。典型的に、イ ンビトロで用いられる用量は、これらの試薬の生体位投与に有用な量での有用な 指標を与えることができる。特定の疾患の治療の有効量についての動物実験は、 ヒト用量の指標を更に予測させる。 様々な考察は、例えば、ギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）ら（監修）（１９９０）Ｔ ｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕ ｔｉｃｓ ，第８版，ペルガモン・プレス；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，第１７版，（１９９０），マク ・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）， イーストン，ペンシルベニアに記載されている。投与法は、それらの中におよび 以下に、例えば、経口、静脈内、腹腔内または筋肉内投与、経皮拡散、その他に ついて論及されている。 薬学的に許容しうる担体としては、水、食塩水、緩衝液、およびＭｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ ，メルク・アンド・カンパニー，ローウェー，ニュージャージーなど に記載された他の化合物がある。用量範囲は、適当な担体と一緒に、普通は１ｍ Ｍ濃度より少ない、典型的には約１０μＭ濃度未満、通常は約１００ｎＭ未満、 好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェ ムトモル）未満量であると予想される。徐放性製剤または徐放性装置は、しばし ば連続投与用に用いられる。 Ｆｌｔ３リガンド、そのフラグメント並びにそれに対する抗体またはそのフラ グメント、アンタゴニストおよびアゴニストは、治療される宿主に対して直接的 に投与することができるし、或いは、化合物の寸法に応じて、それらを投与する 前に卵アルブミンまたは血清アルブミンなどの担体タンパク質にそれらを結合さ せるのが望ましいことがある。治療用製剤は、いずれの慣用的な製剤でも投与す ることができる。 活性成分を単独で投与することは可能であるが、製剤として与えることが好ま しい。典型的に、製剤は、前記に定義の少なくとも１種類の活性成分を、その１ 種類またはそれ以上の許容しうる担体と一緒に含む。それぞれの担体は、他の成 分と相溶性であり且つ患者にとって無害であるという点で薬学的にも生理学的に も許容されうるべきである。製剤としては、経口、肛門、鼻または非経口（皮下 、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適したものがある。 製剤は、便宜上、単位剤形で与えられることができ、当該薬学技術分野におい て周知のいずれの方法によっても製造することができる。例えば、ギルマンら（ 監修）（１９９０）Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏ ｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，上記；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，上記；エイビス（Ａｖｉｓ）ら（ 監修）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ） ，ニューヨーク；リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）ら（監修）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ ， デッカー，ニューヨーク；およびリーバーマンら（監修）（１９９０）Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓ ｔｅｍｓ ，デッカー，ニューヨークを参照されたい。 本発明の治療は、他の化学療法薬または化学的予防薬と組合わせるかまたは一緒 に用いることができる。 本発明のＦｌｔ３リガンドは天然に存在するものも組換え体も、化合物のタン パク質に対する結合活性についてスクリーニングすることができるキットおよび 検定法において特に有用である。近年、自動検定のいくつかの方法が、いく万も の化合物を短時間でスクリーニングすることを可能にするように開発されてきた 。例えば、固体支持体上で合成された多数の定義されたポリマーによる結合親和 性 の検査手段を記載しているフォドア（Ｆｏｄｏｒ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２５１：７６７〜７７３を参照されたい。適当な検定の開発は、本発明によ って提供される多量の精製可溶性Ｆｌｔ３リガンドの利用可能性によって大きく 促進されうる。 例えば、アンタゴニストは、通常、リガンドがいったん構造的に定義されると 見つけることができる。潜在的なリガンド類似体の試験は、精製Ｆｌｔ３受容体 を用いる高度に自動化された検定法の開発によって現在可能である。特に、新規 のアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニング技術 を用いることによって発見される。特に重要であるのは、多数のＦｌｔ３受容体 に対して組合わせの結合親和性を有することが分かった化合物、例えば、Ｆｔｌ ３リガンドの種変異型のアンタゴニストとして役立ちうる化合物である。 本発明は、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかにおいて組換え受容体を 用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。特定のリ ガンドのスクリーニングにおいて組換えタンパク質を用いる利点としては、（ａ ）特定の起原に由来するＦｌｔ３受容体の改良された更新可能な起原；（ｂ）検 定においてより良いシグナル対ノイズ比を与える潜在的により大きい細胞当りの リガンド数；および（ｃ）種変異型特異性（理論上、より大きい生物学的および 疾患特異性を与える）がある。 薬剤スクリーニングの一つの方法は、Ｆｌｔ３受容体を発現する組換えＤＮＡ 分子によって安定して形質転換される真核生物または原核生物宿主細胞を用いる 。他のいずれからの単離においても受容体を発現する細胞を単離することができ る。このような細胞は、生存しうる状態でも固定された状態でも、標準的なリガ ンド／受容体結合検定に用いることができる。細胞反応を検出する鋭敏な方法を 記載しているパース（Ｐａｒｃｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２ ４３〜２４７；およびオウィキ（Ｏｗｉｃｋｉ）ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４００７〜４０１１も参照されたい 。 競合検定は、リガンドに対して既知の結合親和性を有する標識受容体または抗 体、例えば、¹²⁵Ｉ−抗体、および結合組成物に対する結合親和性が測定され る試験試料と細胞（Ｆｌｔ３リガンド源）を接触させ且つ一緒にインキュベート する場合に特に有用である。次に、結合したおよび遊離の標識結合組成物を分離 して、リガンド結合度を評価する。 結合した試験化合物の量は、既知の源に結合した標識受容体の量に反比例する 。多数の技術の内のいずれか一つを用いて遊離リガンドから結合型を分離して、 リガンド結合度を評価することができる。この分離工程は、典型的に、フィルタ ーに付着させた後洗浄、プラスチックに付着させた後洗浄、または細胞膜の遠心 分離などの手順を必要とすることがあった。更に、生存しうる細胞を用いて、Ｆ ｌｔ３リガンドに媒介された機能に対する薬剤の効果、例えば、二次メッセンジ ャー濃度、すなわち、Ｃａ⁺⁺；細胞増殖；イノシトールリン酸プール変化；その 他についてスクリーニングすることができた。いくつかの検出法、例えば、近接 好感度検出系は分離工程の省略を可能にする。カルシウム感受性染料は、蛍光光 度計または蛍光細胞選別装置によってＣａ⁺⁺濃度を検出するのに有用である。 もう一つの方法は、Ｆｌｔ３リガンド源として形質転換された真核生物または 原核生物宿主細胞からの膜を利用する。これらの細胞は、工学処理された膜に結 合した形などのＦｌｔ３リガンドの発現を支配するＤＮＡベクターによって安定 して形質転換される。本質的に、膜は細胞から調製され且つ何等かの受容体／リ ガンド結合検定、例えば、上記の競合検定において用いられると考えられる。 更にもう一つのアプローチは、形質転換された真核生物または原核生物宿主細 胞からの可溶化された未精製のまたは可溶化された精製Ｆｌｔ３リガンドを用い ることである。これは、増加した特異性、自動化する能力および高薬剤試験効率 の利点を伴って「分子」結合検定を可能にする。 もう一つの薬剤スクリーニング技術は、Ｆｌｔ３受容体に対する適当な結合親 和性を有する化合物の高効率スクリーニングを提供する、および１９８４年９月 １３日公開のガイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）、欧州特許出願第８４／０３５６４号明 細書に記載されているアプローチを行なう。最初に、多数の異なる小ペプチド試 験化合物を固体支持体、例えば、プラスチックピンまたは何か他の適当な表面上 で合成する。次に、ピン全部を可溶化された未精製のまたは可溶化された精製Ｆ ｌｔ３受容体と反応させ且つ洗浄する。次の工程は、結合したＦｌｔ３受容体の 検出を行なう。 論理的薬剤設計は、更に、Ｆｌｔ３リガンドおよび他のエフェクターまたは類 似体の分子形状の構造研究に基づくことができる。エフェクターは、リガンド結 合に反応して他の機能を媒介する他のタンパク質、または受容体と通常相互作用 する他のタンパク質でありうる。特定の他のタンパク質と相互作用する部位を決 定するための一つの手段は、物理的構造決定技術、例えば、Ｘ線結晶学または２ 次元ＮＭＲ技術である。これらは、アミノ酸残基が分子接触部分を形成すること に関して指標を与える。タンパク質構造決定の詳細な説明については、例えば、 ブルンデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）（１９７ ６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，アカデミック・プレス ，ニューヨークを参照されたい。 精製Ｆｌｔ３リガンドは、前述の薬剤スクリーニング技術において用いるため にプレート上に直接塗布することができる。しかしながら、これらのリガンドに 対する非中和抗体を捕捉抗体として用いて、それぞれのリガンドを固相上に固定 することができる。キット 本発明は、更に、Ｆｌｔ３リガンドまたはＦｌｔ３受容体の存在を検出するた めの種々の診断用キットおよび方法におけるＦｌｔ３リガンドタンパク質、その フラグメント、ペプチドおよびそれらの融合生成物の使用を考える。典型的に、 該キットは、ある一定のＦｌｔ３リガンドペプチド若しくは遺伝子セグメントか または、受容体フラグメント若しくは抗体などの一方若しくは他を認識する試薬 が入っている区画を有する。 Ｆｌｔ３リガンドに対する試験化合物の結合親和性を決定するためのキットは 、典型的に、試験化合物；標識化合物、例えば、リガンドに対する既知の結合親 和性を有する受容体または抗体；Ｆｌｔ３リガンド源（天然に存在するまたは組 換え体）；および遊離標識化合物から結合型を分離するための手段、例えば、リ ガンドを固定するための固相を含む。いったん化合物がスクリーニングされると 、リガンドに対する適当な結合親和性を有するものは、当該技術分野において周 知のように適当な生物学的検定で評価されて、それらが受容体に対してアゴニス ト として作用するかまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを決定すること ができる。組換えＦｌｔ３リガンドポリマーの利用可能性は、更に、このような 検定を較正するための十分に定義された基準を与える。 試料中のＦｌｔ３リガンドなどの濃度を決定するのに好ましいキットは、典型 的に、該リガンドに対する既知の結合親和性を有する受容体または抗体などの標 識化合物、リガンド源（天然に存在するまたは組換え体）および遊離標識化合物 から結合型を分離するための手段、例えば、Ｆｌｔ３リガンドを固定するための 固相を含む。通常、試薬が入っている区画および取扱説明書が与えられる。 Ｆｌｔ３リガンドまたはリガンドフラグメントに特異的な、抗原結合性フラグ メントを含む抗体は、高濃度のＦｌｔ３リガンドおよび／またはそのフラグメン トの存在を検出する診断用途において有用である。このような診断検定は、溶解 産物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光法、細胞培養物、体液を用いることかできる し、そして更に、血清中のリガンドに関係した抗原または類似のものの検出を行 なうことができる。診断検定は、均一（遊離試薬と抗原−リガンド複合体との分 離工程を伴わない）または不均一（分離工程を伴う）でありうる。種々の商業的 検定法、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント 検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、酵素多形免疫検定技術（Ｅ ＭＩＴ）、基質標識蛍光免疫検定法（ＳＬＦＩＡ）等がある。例えば、未標識抗 体は、標識されている且つＦｌｔ３リガンドまたはその特定のフラグメントに対 する抗体を認識する二次抗体を用いることによって用いることができる。同様の 検定は、文献中で広範囲に論及されており、例えば、ハーローおよびレイン（１ ９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ ＳＨを参照されたい。 抗イディオタイプ抗体は、Ｆｌｔ３リガンドに対する抗体の存在を診断するの に同様に用いることができ、それ自体が様々な異常状態の診断薬でありうる。例 えば、Ｆｌｔ３リガンドの過剰生産は、特に、癌または異常分化などの増殖細胞 状態における異常な生理学的状態の診断薬でありうる種々の免疫学的反応を生じ させることがある。 しばしば、診断検定のための試薬は、検定の感度を最適にするようにキットで 与えられる。本発明のためには、検定の性質に応じて、プロトコルおよび標識、 標識されたか若しくは未標識の抗体若しくは受容体、または標識Ｆｌｔ３リガン ドが与えられる。これは、通常、他の添加剤、例えば、緩衝剤、安定化剤、シグ ナル生産に必要な物質、例えば、酵素の基質等と一緒になっている。好ましくは 、キットは、適切な使用および使用後の内容物の廃棄のための取扱説明書も含ん でいる。典型的に、キットはそれぞれの有用な試薬のための区画を有する。望ま しくは、試薬は乾燥した凍結乾燥粉末として与えられ、そこにおいて試薬は、検 定を実施するのに適当な濃度の試薬を与える水性媒質中で還元されることができ る。 薬剤スクリーニングおよび診断検定の前述のいずれの成分も、修飾することな く用いることができるしまたは種々の方法で修飾してよい。例えば、標識付けは 、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に与える残基を共有または非共有 結合することによって達成することができる。これらの検定のいずれにおいても 、リガンド、試験化合物、Ｆｌｔ３リガンドまたはそれに対する抗体を直接的に かまたは間接的に標識することができる。直接標識の可能性としては、標識基、 すなわち、放射性標識、例えば、¹²⁵Ｉ、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホ スファターゼなどの酵素（米国特許第３，６４５，０９０号明細書）、並びに蛍 光強度、波長シフトまたは蛍光偏光の変化を監視することができる蛍光標識（米 国特許第３，９４０，４７５号明細書）がある。間接標識の可能性としては、一 つの成分をビオチニル化した後、上記標識基の一つに共役したアビジンに対して 結合させることがある。 更に、遊離リガンドから結合型を分離する、或いは、遊離試験化合物から結合 型を分離する多数の方法がある。Ｆｌｔ３リガンドは、種々のマトリックス上に 固定した後、洗浄することができる。適当なマトリックスとしては、ＥＬＩＳＡ プレートなどのプラスチック、フィルターおよびビーズがある。Ｆｌｔ３リガン ドをマトリックスに対して固定する方法としては、制限されないが、プラスチッ クに対する直接付着、捕捉抗体の使用、化学的カップリングおよびビオチン−ア ビジンがある。このアプローチでの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコ ールなどの有機溶媒または硫酸アンモニウムなどの塩を用いるものを含むいくつ かの方法のいずれかによるリガンド／受容体またはリガンド／抗体複合体の沈降 を行なう。他の適当な分離技術としては、制限されないが、ラトル（Ｒａｔｔｌ ｅ）ら（１９８４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０：１４５７〜１４６１に記載され た蛍光抗体磁化粒子法および米国特許第４，６５９，６７８号明細書に記載の二 重抗体磁性粒子分離がある。 各種標識に対してタンパク質またはそれらのフラグメントを結合する方法は、 文献中で広範囲に報告されており、ここで詳細に論及する必要はない。多数の技 法は、ペプチド結合を生成するためのカルボジイミドの使用によるか若しくは活 性エステルによる活性カルボキシル基の使用、クロロアセチルなどの活性ハロゲ ン若しくはマレイミドなどの活性オレフィンとメルカプト基の反応によるチオエ ステルの生成または類似のものを必要とする。融合タンパク質もまたこれらの用 途で用いられる。 本発明のもう一つの診断上の態様は、Ｆｌｔ３リガンドの配列から得られたオ リゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を必要とする。これらの配 列は、癌または発生上の問題などの異常症状を有すると疑われる患者からの試料 中においてリガンドメッセージのレベルを検出するためのプローブとして用いる ことができる。ＲＮＡおよびＤＮＡ両方のヌクレオチド配列の製造、配列の標識 付け並びに配列の好ましい寸法は、文献中で十分に説明され且つ論及された。普 通は、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４ヌクレオチド、通常は 少なくとも約１８ヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプ ローブは、最大数キロベースまでであってよい。各種標識を用いることができ、 最も一般的には放射性核種、特に³²Ｐである。 しかしながら、ポリヌクレオチド中へ導入するためのビオチン修飾ヌクレオチ ドを用いるような他の技法もまた用いることができる。次に、ビオチンは、アビ ジンまたは抗体に対する結合のための部位として役立ち、広範囲の標識、例えば 、放射性核種、蛍光体、酵素または類似のものによって標識されうる。或いは、 ＤＮＡ二重らせん、ＲＮＡ二重らせん、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重らせん またはＤＮＡ−タンパク質二重らせんを含む特定の二重らせんを認識することが できる抗体を用いることができる。抗体は順次に標識することができ、そして二 重らせんが表面に結合しているところで検定が行なわれるので、表面上の二重ら せ んの生成によって、二重らせんに結合した抗体の存在を検出することができる。 新規のアンチセンスＲＮＡに対するプローブの使用は、何等かの慣用的な技法、 例えば、核酸ハイブリッド形成、プラス・マイナススクリーニング、組換えプロ ービング、ハイブリッド放出翻訳法（ＨＲＴ）およびハイブリッド阻害翻訳法（ ＨＡＲＴ）において行なうことができる。これには、更に、ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）などの増幅技術がある。 更に、他のマーカーの存在を定性的または定量的に更に試験する診断用キット を考える。診断または予後は、マーカーとして用いられる多数の指標の組合わせ に依ることがある。したがって、キットは、マーカーの組合わせを検査すること ができる。例えば、ヴィアレット（Ｖｉａｌｌｅｔ）ら（１９８９）Ｐｒｏｇｒ ｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．１ ：８９〜９７を参照さ れたい。 実施例 広範囲の本発明は、例証するためではないが本発明を特定の実施態様に制限す るためではない以下の実施例を論及することによって最も良く理解される。一般的な方法 いくつかの標準法は、例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８ ２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ ｕａｌ ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コールド・スプリン グ・ハーバー・プレス；サムブルックら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版），１〜３巻， ＣＳＨプレス，ＮＹ；オースベルら、Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン・パブリッシン グ・アソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｓ），ブルックリン，ＮＹ；またはオースベルら（１９８７年および補遺）Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，グリーン／ウィリー，ニューヨーク；イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（監修）（１９ ９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ アカデミック・プレス，ＮＹに記載されて いるかまたは論及されている。 タンパク質の精製法としては、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフ ィー、電気泳動、遠心分離、結晶化その他のような方法がある。例えば、オース ベルら（１９８７年および定期補遺）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ ，１８２巻中のドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）（１９９０）「タンパ ク質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ）」およびこの双書の他の巻；並びにタンパク質精製産物の使用に関する製 造者文献、例えば、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ピスカタウェイ，Ｎ ．Ｊ．またはバイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），リッチモンド，ＣＡを参照され たい。組換え技術との組合わせは、適当なセグメント、例えば、ＦＬＡＧ配列、 またはプロテアーゼで除去可能な配列によって融合することができる均等物に対 する融合を可能にする。例えば、ホチュリ（Ｈｏｃｈｕｌｉ）（１９８９）Ｃｈ ｅｍｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ １２：６９〜７０；セトロー（Ｓｅｔｌ ｏｗ）（監修）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：８７〜９８，プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕ ｍ Ｐｒｅｓｓ），Ｎ．Ｙ．中のホチュリ（１９９０）「金属キレート吸収剤に よる組換えタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂ ｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔｅ Ａｂ ｓｏｒｂｅｎｔ）」；およびクロウェ（Ｃｒｏｗｅ）ら（１９９２）ＱＩＡｅｘ ｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＱＵＩＡＧＥＮインコ ーポレーテッド，チャツワース，ＣＡを参照されたい。 ＦＡＣＳ分析は、メラムド（Ｍｅｌａｍｅｄ）ら（１９９０）Ｆｌｏｗ Ｃｙ ｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ ウィリー・リス・インコーポレーテ ッド（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク，ＮＹ；シャピロ（Ｓ ｈａｐｉｒｏ）（１９８８）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒ ｙ リス，ニューヨーク，ＮＹ；およびロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら（１ ９９３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ウィリー・リス，ニューヨーク，ＮＹを 参照されたい。Ｆｌｔ３リガンドの製造および配列決定 Ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２リガンドの検定 Ｂａｆ３細胞（マウスプレＢ細胞系；パラシオス（Ｐａｌａｃｉｏｓ）ら（１ ９８５）Ｃｅｌｌ ４１：７２７〜７３４；およびパラシオスら（１９８４）Ｎ ａｔｕｒｅ ３０９：１２６〜１３１を参照されたい）は、Ｆｌｔ３受容体のｃ ＤＮＡによって安定してトランスフェクトされた。ロスネット（Ｒｏｓｎｅｔ） ら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１６４１〜１６５０。二つの方法を用い て、リガンドを含む試料に対するこれらの細胞の反応を観察した。主検定はＭＴ Ｔ検定であり、そこにおいてＦｌｔ３でトランスフェクトされた細胞（Ｂａｆｌ ｔ）は、リガンド存在下の２４時間インキュベーションで生存し（リガンド不存 在の場合は生存しない）、続いてＭＴＴ染料を取込み且つ分解することができる 。モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ６５：５５〜６３を参照されたい。形質転換されていないＢａｆ細胞は、リ ガンド存在下でも不存在下でも死滅するので、試料は双方の細胞種で平行して規 定通り検定される。これらの２種類の細胞種（Ｂａｆｌｔ−Ｂａｆ）から得られ たシグナルの差は、試料中に存在するリガンドの量の尺度である。 活性試料が、細胞に対して毒性の物質も含んでいるいくつかの場合、Ｂａｆｌ ｔについてのＭＴＴ検定でリガンドの存在を検出することはできない。これらの 場合にリガンドを検出する第二の方法は、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｋｉｔおよびｆｌｔ −３などの受容体が、それらの適当なリガンドに結合しながらそれ自体速やかに （５分間以内）自己リン酸化するという事実を利用することである。この反応は 、毒性物質に対する感度が２４時間ＭＴＴ検定の場合よりもはるかに小さい。 自己リン酸化した受容体は、応答細胞をＮＰ−４０などの界面活性剤によって 溶解させ、分子の細胞内部分に対して向けられた抗体を用いてＦｌｔ３を免疫沈 降させ、そして免疫沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースにブ ロッティングし、抗ホスホチロシン単クローン性抗体でプローブし、そしてホス ホチロシンを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗免疫グロブリンなどで検出し且 つ化学発光基質で発現させることによって観察される。Ｆｌｔ３リガンド源 多数の細胞系からＦｌｔ３リガンドを発現するものをスクリーニングした。マ ウス胸腺ストロマ細胞系ＴＡ４（ドナ・レニック（Ｄｏｎｎａ Ｒｅｎｎｉｃｋ ）、ＤＮＡＸリサーチ・インスティトゥート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ）によって提供された）を、大規模生産する場合のその取扱の容易さのた めに選択した。細胞をローラーボトルで増殖させ、そして７日間ならし培地上澄 み（血清不含）を採取し、０．２２μｍフィルターを介して通過させ、１００倍 に濃縮し、そして−８０℃で凍結貯蔵した。Ｆｌｔ３リガンドの生化学的特性決定 Ｆｌｔ３リガンド活性は、種々のタンパク質分離技術を用いるその分離パラメ ーターによって規定されている。しかしながら、低い発現レベルのために、活性 の検出は培地の濃度によって極めて容易になった。典型的に粗製上澄み１０Ｌで ある１００ｘ濃度のＴＡ４細胞上澄みのアリコートに、硫酸アンモニウム沈殿、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラ フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー並びに逆相クロマトグラフィーを含む種々 の生化学的精製技術を施した。表２を参照されたい。これらの技術それぞれにお いてＦｌｔ３リガンドを示している生物学的活性の挙動を以下に要約する。 硫酸アンモニウム沈殿（４℃で）：６０〜８５％飽和（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ペレッ トで見出された活性； 疎水性相互作用クロマトグラフィー［フェニル−５ＰＷカラム上の２０ｍＭト リス、ｐＨ７．５中の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄勾配］：９００〜７５０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄で溶離された活性； 陰イオン交換クロマトグラフィー（モノＱカラム上の２０ｍＭトリス、ｐＨ７ ．５中のＮａＣｌ勾配）：１３０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶離された活性； 陽イオン交換クロマトグラフィー（モノＳカラム上の１０ｍＭクエン酸塩、ｐ Ｈ３．０中のＮａＣｌ勾配）：４４０〜５４０ｍＭ ＮａＣｌ間で溶離された活 性の大部分； で流れた活性； 逆相高速液体クロマトグラフィー（ポロスＲ／Ｈカラム上の０．１％ＴＦＡ中 の水対アセトニトリル勾配）：３２〜３５％アセトニトリル間で溶離された活性 。可溶性Ｆｌｔ３の工学処理、製造および精製 Ｆｌｔ３受容体の可溶性フラグメントを、構築物の発現生成物を精製するのに 有用なＦＬＡＧなどの配列に対して融合したＦｌｔ３受容体の膜スパニングおよ び細胞質ドメインを除去することによって構築した。例えば、クロウェら（１９ ９２）ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＱＵ ＩＡＧＥＮインコーポレーテッド，チャツワース，ＣＡ；およびホップ（Ｈｏｐ ｐ）ら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４〜１２１０を 参照されたい。該配列は、可溶性精製物の有効なアフィニティー精製を可能にす る。適当な分泌またはプロセッシング部位もまた標準法によって構築物中に工学 処理することができる。精製は、受容体に対する抗体などのアフィニティー精製 の使用によってまたは標準的なタンパク質精製法によって達成されうる。典型的 に、アフィニティー試薬または精製手順は組換え受容体を用いて達成されうる。 更に具体的には、２種類の標識をＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインのカルボキ シ末端に工学処理した。ｐＭＥＸｎｅｏ−Ｆｌｔ３を源として用いて、細胞外ド メインの最後のアミノ酸であるＳｅｒ５４４の直後のヌクレオチド１６６２にＢ ｇＩＩＩ部位を導入するようにＦｌｔ３ ｃＤＮＡを修飾した。細胞外Ｆｌｔ３ ドメイン全部を含むＸｍａｌ／ＢｇＩＩＩフラグメントを、インビトロジェン・ コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）からのｐＶＬ１３９３ の誘導体であるｐＨＦＢｇＩ中にクローン化した。ｐＨＦＢｇＩは、フレーム中 でポリリンカーのＢｇＩＩＩ部位と融合したＨｉｓ₆−ＦＬＡＧ−停止コドン配 列を有する。表４を参照されたい。得られたプラスミドをｐＨＦ／Ｆｌｔ３と称 した。 表４に示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、更に、配列表においてそ れぞれ配列番号：３６および３７で定義される。 Ｓｆ９昆虫細胞をｐＨＦ／Ｆｌｔによってトランスフェクトし且つウイルス原 液を調製した。組換えウイルスをＳｆ９細胞に感染させた後、培地を集めた。可 溶性の分泌Ｆｌｔ３−Ｈｉｓ₆−ＦＬＡＧ発現生成物を、キアジェン（Ｑｉａｇ ｅｎ）からのニッケル−ＮＴＡ樹脂を用いて培地から精製した。精製Ｆｌｔ３受 容体をＭ２抗ＦＬＡＧ抗体カラムに結合させた。以下を参照されたい。Ｆｌｔ３リガンドの精製 Ｆｌｔ３リガンドを、特異的結合試薬としてのＦｌｔ３受容体と、他のタンパ ク質および混入物からの分離を可能にする初期に定義された物理的性質とを組合 わせて用いるアフィニティークロマトグラフィー組合わせによって単離した。ヒ ト細胞検定およびヒト細胞源を用いる同様の技術を応用して、ヒトリガンドを単 離することができた。 粗製ＴＡ４上澄み１００ＬをＰＢＳ中に緩衝液交換し且つ１０００ｘまで濃縮 した。次に、これを、可溶性Ｆｌｔ３を予め与えられたＭ２（抗ＦＬＡＧ）ビー ズ２ｍｌと一緒に一晩中回転させた。次に、ビーズをカラム容量の数倍のＰＢＳ で洗浄し、そして結合した物質を１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５の３ｍｌで溶 離させた。溶離液は、グリシンを中和するのに十分な２Ｍトリス、ｐＨ７．５が 入っている試験管中に集められた。次に、中和した溶離液を４．６ｘ１００ｍｍ ポロスＲ／Ｈカラムに充填し、そして０．１％ＴＦＡ中の直線状の水／アセトニ トリル勾配を用いるクロマトグラフィーによってタンパク質を分離した。 それぞれの画分の試料をバイオアッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に乾燥させ た。Ｆｌｔ３リガンド活性を示す分子は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で明らかにグ リコシル化されたタンパク質として約３０キロダルトンで流れた。生物学的活性 の大部分を含む画分を完全に乾燥させ、そして１２％ミニゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）上で単線で流すのに十分なレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）ゲル試料緩衝液（ＤＴ Ｔ含有）中に混合した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、脱染色し、そしてＦ ｌｔ３リガンドを示すバンドを注意深く切り取った。この切片は生化学的に純粋 なＦｌｔ３リガンドを含んでいた。ＴＡ４細胞上澄み１００Ｌは、このタンパク 質を５マイクログラム未満含んでいた。精製タンパク質の比活性は、Ｂａｆ検定 において１ｘ１０⁷単位／ミリグラムである。１単位は、１００μｌの検定にお いて最大刺激の半分を与えることである。Ｆｌｔ３リガンドトリプシンペプチドの生成および精製 リガンドを含むプレプゲル切片を水およびアセトニトリルで簡単に洗浄して過 ト（Ｓａｒｖａｎｔ））上で真空乾燥させた後、修飾トリプシン（それ自体を消 化しない化学的に修飾された形）０．５μｇおよび２ｍＭ ＤＴＴ並びに０．０ １％トゥイーン２０を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）０．２ｍｌ中に可溶化さ せた。開裂反応を３７℃で６時間行ない、その時点でトリプシンの第二アリコー ト０．５μｇを加え、そして一晩中消化を続けた。反応配合物を１３Ｋで回転さ し、そして直線状の４〜４４％アセトニトリル勾配（一定の０．１％ＴＦＡを含 む）でペプチドを溶離した。若干の場合、同様のカラム上で１６〜４４％アセト ニトリル勾配（一定の０．１ｍＭヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）を含む）を用 いるクロマトグラフィーによってペプチドを再度分離した。溶離するペプチドを ２１５ｎｍおよび２８０ｎｍ両方で監視し、そして手動で集めた。Ｆｌｔ３リガンドのペプチドのアミノ酸配列の決定 ペプチド配列を、アプライド・バイオシステムズ４７７Ａシークエンサー（Ａ ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用い て決定した。フラグメントは、ペプチド１７がアミノ末端である共通配列中 に再構築された表１のペプチド配列を与えた。 Ｆｌｔ３リガンドをコードしているＤＮＡクローンの単離 精製タンパク質または定義されたペプチドは、上記のように標準法によって抗 体を生じさせるのに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は、単クロ ーン性または多クローン性抗体を生じさせるように免疫系に与えられる。例えば 、コリガン（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ ウィリー／グリーン；並びにハーローおよびレイン（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ コールド・ スプリング・ハーバー・プレスを参照されたい。或いは、Ｆｌｔ３受容体は特異 的結合試薬として用いられ、抗体が用いられたのとほぼ同様にその結合特異性を 利用することができる。どちらの場合にも、結合試薬は前記のように蛍光若しく は他の方法などで標識されるかまたはパニング法の基質に対して固定される。 結合組成物は、Ｆｌｔ３リガンドを発現する細胞系から製造された発現ライブ ラリーのスクリーニングに用いられる。標準的な染色技術を用いて、細胞内若し くは表面に発現されたリガンドを検出若しくは選別し、または表面発現性形質転 換細胞をパニングによってスクリーニングする。細胞内発現のスクリーニングは 、種々の染色または免疫蛍光法によって行なわれる。マクマーン（ＭｃＭａｈａ ｎ）ら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１〜２８３２も参照されたい。 ｍｌのフィブロネクチン１ｍｌ／室を室温で３０分間プレコーティングする。Ｐ ＢＳで１回洗浄する。次に、ＣＯＳ細胞を増殖培地１．５ｍｌ中において細胞２ 〜３ｘ１０⁵個／室で平板培養する。３７℃で一晩中インキュベートする。 １日目に、各試料に対して、ＤＥＡＥ−デキストラン６６μｇ／ｍｌ、６６μ ＭクロロキンおよびＤＮＡ ４μｇの血清不含ＤＭＥ中溶液０．５ｍｌを調製す る。各セットの正の対照を、例えば、ｈｕＩＬ−１０−ＦＬＡＧ ｃＤＮＡから １および１／２００希釈で、並びに負の模擬を調製する。細胞を血清不含ＤＭＥ で洗浄する。ＤＮＡ溶液を加え且つ３７℃で５時間インキュベートする。培地を 除去し且つＤＭＥ中１０％ＤＭＳＯ ０．５ｍｌを２．５分間加える。除去し且 つＤＭＥで１回洗浄する。増殖培地１．５ｍｌを加え且つ一晩中インキュベート する。 ２日目に、培地を交換する。３日目または４日目に、細胞を固定し且つ染色す る。細胞をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、そして４％パラホル ムアルデヒド（ＰＦＡ）／グルコース中で５分間固定する。ＨＢＳＳで３回洗浄 する。液体を全て除去した後、スライドは−８０℃で貯蔵することができる。各 室について０．５ｍｌインキュベーションを以下のように行なう。１Ｍ ＮａＮ₃ ３２μｌ／ｍｌと一緒にＨＢＳＳ／サポニン（０．１％）を２０分間加える 。次に、細胞をＨＢＳＳ／サポニンで１回洗浄する。細胞に対して可溶性Ｆｌｔ ３受容体／抗体複合体、そして３０分間インキュベートする。細胞をＨＢＳＳ／ サポニンで２回洗浄する。二次抗体、例えば、ベクター抗マウス抗体を１／２０ ０希釈で加え且つ３０分間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ溶液、例えば、ベク ター・エリート（Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣ西洋ワサビペルオキシダー ゼ溶液を調製し且つ３０分間プレインキュベートする。例えば、ＨＢＳＳ／サポ ニン２．５ｍｌにつき溶液Ａ（アビジン）を１滴および溶液Ｂ（ビオチン）を１ 滴用いる。細胞をＨＢＳＳ／サポニンで２回洗浄する。ＡＢＣ ＨＲＰ溶液を加 え且つ３０分間インキュベートする。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、２回目の洗 浄は２分間で、これが細胞を閉鎖する。次に、ベクタージアミノ安息香酸（ＤＡ Ｂ）を５〜１０分間加える。ガラス蒸留水５ｍｌにつき緩衝液２滴およびＤＡＢ ４滴およびＨ₂Ｏ₂ ２滴用いる。室を注意深く除去し、そして水中でスライド を洗浄する。数分間自然乾燥させた後、クリスタルマウントを１滴加えてカバー ガラスをする。８５〜９０℃で５分間焼く。 或いは、結合組成物を用いて、リガンドを発現する細胞をアフィニティー精製 するかまたは選別する。例えば、サムブルックらまたはオースベルらを参照され たい。 もう一つの方法において、ペプチドセグメントを用いて、ライブラリーをスク リーニングするのに適当なオリゴヌクレオチドを予想する。遺伝コードを用いて 、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして有用な適当なオリゴ ヌクレオチドを選択する。例えば、表３を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）法との組合わせにおいて、適当な配向の合成オリゴヌクレオチドをプ ライマーとして用いて、ライブラリーから正しいクローンを選択する。上流／下 流センス／アンチセンス組合わせの種々の組合わせを、適当なクローンが増幅さ れ且つ検出されるまで試験する。 例えば、機能的スクリーニングアプローチは、リガンドの生物学的検定に基づ いて応用される。ＢａｆプロＢ細胞系を受容体ｃＤＮＡによってトランスフェク トして安定なトランスフェクタントを生じる。該トランスフェクタントは、ＴＡ ４ストロマ細胞上澄みに対して、該上澄みが１００Ｘに濃縮されている場合に特 に検出可能なマイトジェン反応を示す。親トランスフェクタント細胞は上澄みに 対して非反応性である。生産性ＴＡ４細胞から製造された発現ｃＤＮＡライブラ リーを製造する。ランダムｃＤＮＡクローンのプールをＣＯＳサル細胞中にトラ ンスフェクトし、そして上澄みのリガンド生物学的活性をスクリーニングする。 正のプールを細分して単クローンを単離する。 もう一つのアプローチにおいて、発現スクリーニングは可溶性リガンドの生化 学的検定に基づく。該検定は、マイトジェン活性よりもむしろ自己リン酸化活性 に基づく。暴露された試験細胞の全細胞溶解産物を調製し、そして抗ホスホチロ シン抗血清によって免疫沈降させる。免疫沈降はポリアクリルアミドゲル上で実 施され、そして例えば、フィルターにブロッティングされ、そしてホスホチロシ ンの抗体染色によって発現される。 更にもう一つのアプローチにおいて、膜結合リガンドの機能的スクリーニング は、マイトジェンバイオアッセイかまたは生化学的自己リン酸化検定による。適 当な融合ベクターは、適当な発現構築物を生じることができる。 もう一つの計画は、パニングによって膜結合リガンドをスクリーニングするこ とである。受容体ｃＮＤＡを前記のように構築する。定義されたペプチドフラグ メントに対して生じた可溶性受容体または抗体を固定し且つ用いて、発現性細胞 を固定することができる。固定化は、可溶性受容体構築物のＦＬＡＧ配列などを 認識する適当な抗体の使用によって、または一次抗体に対して生じた抗体の使用 によって達成することができる。選択および増幅の反復サイクルは、適当なクロ ーンを増加させ且つクローンを発現するリガンドを最終的に単離させる。 ファージ発現ライブラリーは、可溶性受容体または抗フラグメント抗体によっ てスクリーニングすることができる。抗ＦＬＡＧ抗体などの適当な標識技術は、 適当なクローンを特別に標識することを可能にする。 ペプチド配列に基づく縮重プローブを用いるハイブリッド形成によるスクリー ニングもまた、適当なクローンの単離を可能にする。或いは、ＰＣＲスクリーニ ングに適当なプライマーの使用は、適当な核酸クローンを増加させる。 同様の方法は、種かまたは対立遺伝子変異型を単離するのに適用しうる。種変 異型は、プローブとして一つの種からの完全長さ単離物またはフラグメントの単 離に基づく交雑種ハイブリッド形成技術を用いて単離される。或いは、同様の検 定を、Ｆｌｔ３リガンド活性の単離のためにヒト細胞などにおいて開発すること ができる。マウス細胞検定は、ヒト胸腺上皮ＳＶ４８細胞などにおいてヒトＦｌ ｔ３リガンド活性を検出する。 ベクターに基づく縮重プライマーおよび下流配列を用いるＰＣＲ増幅は、１回 目のＰＣＲ増幅で生成物を生じた。ベクター配列に基づくプライマーおよびＮＬ ＱＤＥＫペプチド配列からの縮重プライマーを１回目の増幅で用いた。１回目の 増幅生成物に、ＴＰＤＣＹＦおよびＹＰＶＴＶＡＶペプチド配列に基づく縮重プ ライマーを用いる２回目の増幅を施した。この２回目のＰＣＲ増幅の生成物は、 ＮＦＫＶＫＦ配列に基づくプローブを用いてプローブされた１０８ｂｐ生成物を 生じた。その長さは、与えられた配列によって予想されるのと一致する。この１ ０８ｂｐ生成物の配列決定により、予想されたペプチド配列をコードするヌクレ オチド配列 ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＴＣ ＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＡＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＴＴＡ ＡＡ ＧＡＴ が得られた。クローンを更に配列決定することにより、表５の配列が得られた。 表５に示された配列は、配列表においても配列番号：１８で定義され、適切な エンコーディング核酸配列の縮重を排除する。このプローブを用いて、更に長い または完全長さライブラリーをマウスまたは他の哺乳動物種などからスクリーニ ングする。対立遺伝子変異型および他の関連遺伝子もまた、ハイブリッド形成技 術などを用いて単離できる。サムブルックらおよびオースベルらを参照されたい 。ヒトＦｌｔ３リガンドをコードしているＤＮＡクローンの単離 ポリＡ＋ ｍＲＮＡから構築されたｐＭＥ１８Ｓのヒト２９ＳＶ４８ストロマ 細胞ｃＤＮＡライブラリーを、マウスＴ１１８クローンに由来する８００ｂｐの ＤＮＡフラグメントによってスクリーニングした。このフラグメントは、２種類 のマウスクローン、Ｔ１１８およびＴ１１０（表３を参照されたい）の間に保存 されたコーディング領域を包含している。³²Ｐ標識プローブを用いるフィルター のハイブリッド形成は、２０％ホルムアミド、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート 、ｔＲＮＡ １００μｇ／ｍｌおよび０．１％ ＳＤＳの溶液中において４２℃ で一晩中行なわれた。フィルターを２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳによっ て室温において１０〜１５分間で２回洗浄した。次に、フィルターを０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ中において以下の条件の一つ、即ち、５０℃で３ ０分間それぞれ３回；５５℃で３０分間それぞれ３回；５５℃で３０分間１回お よび６０℃で３０分間１回；または６０℃で３０分間１回の条件下で洗浄した。 約２０個の正のコロニーを、これらの条件を用いて選択した。これらを部分的 に配列決定し、そして二つのクローン、Ｓ８６およびＳ１０９はマウスクローン に対して最初の１６３アミノ酸にわたって約７５％相同であることが分かった。 クローンＳ８６は、全体の相同性６６％にはやや少ないが、クローンＴ１１０に 対して停止コドンまでは相同性を示すように続いた。クローンＴ１１８およびＳ １０９は互いにまたはマウス残基１６３（ヒト残基１６０）後の他のクローンに 対して相同性を示さない。ＭＢ８と称する更に別のマウスクローンは、マウスリ ガンドの共通部分と分岐部分との間の結合に２９アミノ酸インサートを有する。 本発明の多数の修正および変更は、当業者に明らかであるように、その精神お よび範囲から逸脱することなく行なうことができる。本明細書中に記載の具体的 な実施態様は例示のためにのみ与えられ、本発明は請求の範囲、並びに該請求の 範囲が与えられる均等物の全範囲によってのみ制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＣＶ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ ＡＤＵ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ 8517−4Ｈ 16/18 16/18 8517−4Ｈ 16/42 16/42 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 9358−4Ｂ 21/08 15/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 21/08 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＤ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／０９２，５４９ (32)優先日 1993年７月16日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／１０６，３４０ (32)優先日 1993年８月13日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／１１２，３９１ (32)優先日 1993年８月24日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／１５５，１１１ (32)優先日 1993年11月19日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／１６２，４１３ (32)優先日 1993年12月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハンナム，チャールズ・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州94087, サニーヴェイル，ウエストチェスター・ド ライヴ 1081 (72)発明者 リー，フランク・ディー アメリカ合衆国カリフォルニア州94301, パロ・アルト，ローウェル・アベニュー 620 (72)発明者 ビルンバウム，ダニエル フランス共和国エフ―13009 マルセイユ, ラ・クロワ―デュ―スュッド，リュ・バル ダッシーニ ９ (72)発明者 カルペッパー，ジャニス・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040, マウンテン・ヴュー，エドナメリー・ウェ イ・ナンバー21755

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 実質的に純粋な哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメント。 ２． 哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントをコードしている単 離核酸。 ３． 請求項２に記載の核酸を含む組換えベクター。 ４． 請求項３に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。 ５． 哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントを製造する方法であ って、核酸が発現される条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含 む上記方法。 ６． 請求項１に記載のＦｌｔ３リガンドまたはフラグメントに対して特異的 に結合する抗体またはその結合フラグメント。 ７． Ｆｌｔ３リガンド受容体を有する細胞の生物学的活性を変更するための 薬剤組成物であって、生理学的に許容しうる担体および哺乳動物Ｆｌｔ３リガン ドまたは該リガンドに対して特異的に結合する抗体若しくはその結合フラグメン トを含む上記薬剤組成物。 ８． Ｆｌｔ３リガンド受容体を有する細胞の生物学的活性を変更するための 薬剤組成物の製造法であって、生理学的に許容しうる担体および哺乳動物Ｆｌｔ ３リガンドまたは該リガンドに対して特異的に結合する抗体若しくはその結合フ ラグメントを混合することを含む上記方法。 ９． 個別の容器中に、 （ａ）実質的に純粋な哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメント； （ｂ）哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントに対して特異的に結 合する抗体またはその結合フラグメント；または （ｃ）哺乳動物Ｆｌｔ３リガンドまたはそのフラグメントをコードしている核 酸 を含むキット。 １０．Ｆｌｔ３リガンドがマウスまたはヒトＦｌｔ３リガンドである請求項１ 〜９のいずれか１項に記載のリガンド若しくはそのフラグメント、核酸、方法、 抗体、薬剤組成物またはキット。 １１．Ｆｌｔ３リガンド、そのフラグメントまたは核酸の配列が配列番号：１ 〜２４のいずれか一つによって定義される請求項１０に記載のリガンド若しくは そのフラグメント、核酸、方法、抗体、薬剤組成物またはキット。