JPH09502081A

JPH09502081A - 一細胞型の肝臓細胞との共培養プロセス

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Publication number: JPH09502081A
Application number: JP6502947A
Authority: JP
Inventors: バーダー，アウグスティヌス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-07-08
Filing date: 1993-07-07
Publication date: 1997-03-04
Also published as: DK0651788T3; DE59309981D1; ATE190649T1; EP0651788B1; KR950702238A; AU4565193A; WO1994001535A1; AU685056B2; DE4222345A1; EP0651788A1; PT651788E; ES2145051T3; CA2139782A1

Abstract

(57)【要約】ある細胞型を共培養するためのプロセスが開示されている。肝臓細胞（３）がサンドイッチ法により支持体（１）上で培養され、分析の対象である第二の細胞（５）をその上、あるいはその間に配置する。

Description

【発明の詳細な説明】一細胞型の肝臓細胞との共培養プロセス本発明は、肝細胞性生成物のインビトロ（試験管内）における製造プロセス、およびこれらの生成物を安定な細胞性検査システムにおいて第２の細胞に作用させるための手法に関する。従来、インビトロ（試験管内）で安定であり、かつ医薬品や化学薬品、同時にそれらの代謝物の特定の細胞型に対する影響が全体的に調べられるような真核細胞用の機能検査システムはなかった。しかし、例えばインビボ（生体内）の条件下で用いることができる検査システムは、以下のようなものにおいて特に重要である。１．薬剤前駆体の開発。ここでは、代謝的に、すなわち肝臓内で酵素的に転換されてより容易に分泌可能な物質、腫瘍に有毒な形態へと転換される細胞増殖抑制物質前駆体（プロサイスタティック）を一例として挙げる。このタイプの前駆体は、患者に投与しても器官に副作用をほとんど示さない。言い換えれば、このような物質は抗がん剤として理想的な種類である。２．突然変異あるいは発がん性物質を生じる物質の同定。周知のように、我々のまわりで生じるある種の物質は、元来発がん性を有せず、ヒト生体に取り入れられ代謝された時に活性化され発がん性を示すようになる。３．毒性研究。周知のように、新規に開発された医薬品や化学物質は潜在的に有する毒性を検査しなければならない。しかし、主に代謝能や多様な種依存性解毒能により、多くの薬剤が毒性を有する。４．相互作用の研究。これは、型の異なる細胞間で相互作用が起こることを意味する。上記１〜３で述べたケースには、特に、代謝終了までに『活性な形態』に転換されない物質が含まれる。これらの物質の検査に関して、動物に投与できること、あるいは代謝後酵素混合物中の特定の細胞型に適用できること、あるいは肝臓細胞とそれ以外の細胞型との従来の単層共培養系において試験できることが知られている。しかしながら、これら公知の方法には、とりわけ、異なる動物種間だけでなく、特に動物とヒトの間において代謝生成のパターンが極端に異なるという欠点がある。すなわち、ヒトの代謝により代謝された後でのみ活性形態あるいは毒性形態になる全ての物質は、動物実験では有効に決定できない。このような理由から、すでに、肝臓細胞との共培養法を用いた様々な細胞型の研究が試みられている。しかし、これら公知の共培養法は全て、肝細胞、すなわち肝臓細胞の機能が培養調整直後に低下し始まる、という固有の問題を有している。これは、基本的な肝細胞に特異的な要件および細胞生物学的要件が、用いられる方法において考慮されなかった、あるいは考慮できなかったことによるものと考えられる。したがって、このようなシステムを用いる長期間の研究は無意味である。しかし、発がん物質の特性が長期間経て初めて発現されることは十分公知であり、こうした研究は非常に重要であろう。公知の共培養法において、細胞は２次元の層内で混合される。したがって、それらの細胞を選択的に分離するのは容易ではない。言い換えれば、この検査システムは再利用できないのである。特に、公知の検査システムを用いて実験する不安定な機能、およびそれらの反応がインビボの条件を反映していないという事実から、そのような効果を研究するために、物質を酵素混合物中の各細胞型に加え、続いて代謝させることが提案されている。しかし、このような検査システムの欠点は、インビボで生じる特定比率の代謝物が再度検出されてしまうことである。なぜならば、完全な代謝は何の手も加えられていない完全な細胞系にのみ起こるからである。つまり、治療上効果的な、あるいは有毒な物質は形成される道理がないので、検出されない。しかしながら、最大の欠点は、潜在的な発がん物質または細胞増殖抑制物質がこの方法では検出できないことである。共培養における異種細胞型間、特に肝細胞とそれ以外の細胞型との相互作用の研究（上記ケース４と同様）は、肝細胞が培養中に安定な機能を保持できる限りにおいて有意義であろう。しかし、公知の方法においてこのような例はない。したがって、本発明は、ある細胞型の共培養方法において、長期間にわたって少なくともインビボの条件に近付けることを達成して、この細胞型を調べるための方法を確立する、という課題に基づくものである。本発明において、この課題は、肝臓細胞をサンドイッチ技術を用いて支持体上で培養し、その間あるいはその上に検査の対象である第２の細胞型をおくことにより解決される。本発明では、上記のような問題点は、肝細胞のサンドイッチ培養技術を用いることに加え、第２の被験細胞型を３次元的な培養系におけるこの構造中、好ましくはこの構造上で培養することにより解決される。本発明で具体的に記載されているこの共培養法の有利点の一つは、肝細胞の分極化された足場がこのように保持されることである。この種の細胞重層（スタッキング）や細胞密度は、通常は非常かつ速やかに下層にある肝臓細胞の酸素欠乏を引き起こす。したがって、酸素を膜酸素添加の形態で該支持体を経由させて該肝臓細胞に供給することが、非常に有利かつ非自明である本発明のさらなる開発内容である。この方法において、支持体は、いわゆる膜酸素添加を達成するように構成されており、肝臓細胞に十分な酸素供給を行なう。実際には、３つの技術を組み合わせることにより、肝細胞性生成物を製造するためのサンドイッチ式肝細胞培養技術の機能的有利点、および選択されたあらゆる共培養細胞型に対するそれら生成物の即時的作用および、逆に該生成物に対する該細胞型の即時的作用を利用できるようになる。したがって、本発明で用いられる方法は、多少は公知である３種類の技術からなる。すなわち、支持体を経由する膜酸素供給、肝臓細胞を培養するためのサンドイッチ技術、およびこの形態では新規である共培養方法からなる。この方法により、酸素供給の問題が解決され、安定な肝臓細胞培養が提供され、かつ、例えば肝細胞やその代謝能力により発現される効果を調べることができるようなある種の細胞型を該肝臓細胞と同時に共培養することが可能になる。本発明は、従来公知の検査系、特に公知の共培養方法とは違って、数週間にわたって代謝物が生成され、かつそれら代謝物の効果が研究できるような、機能的に安定である検査系およびそれらの効果を提供する。さらに、本発明は細胞の相互作用についても適用できる。このように、長期毒性研究のための手段が初めて可能になったのである。肝臓細胞および検査の対象である第２の細胞型を互いに重ねて配置した場合、例えば間充質層によりそれらを隔てることができるので、両細胞とも必要に応じて再度選択的に分離できる。これは、例えば一番上に配置された培養細胞型に酵素を添加することで可能になる。トリプシンは細胞分離に好適に用いられる酵素である。肝臓細胞の長期機能安定性、および肝臓細胞をサンドイッチシステム中に固定したままで分離されるある細胞型の能力も、この検査システムを再利用可能なものにする。例えば、肝臓細胞以外の被験細胞型は、系を洗浄した後で再培養できる。このことは、ヒト肝細胞などのヒト細胞は無限に得られるものではないので、特に重要である。本発明の方法のもう一つの非常に重要な有利点は、ヒト肝細胞を使用できるので、ヒトについて非常に適切な結果が得られることである。これは、あらゆるヒトの薬学的および毒物学的研究の最終的な目的である。また、本発明の方法は、酵素混合物を用いる方法と比較してもさらに高レベルに適切な方法である。なぜならば、本方法は何も損なわれていない完全な細胞系を提供するのであり、したがって、全ての代謝物がそのまま検査できるからである。この点において、公知の共培養方法は、手段および長期研究において非常に限定された適切性しか示さない。なぜならば、そのような公知のシステムにおける肝細胞は代謝酵素を非常に急速に失うからである。本発明の方法の原理をさらに詳細に説明するために、二つの実施例を以下に示す。第１図は、互いに重ねて配置した二つの細胞型を用いて、ある細胞型を共培養するための方法を示す。第２図は、互いの間に、あるいは隣接して配置した二つの細胞型を用いて、ある細胞型共培養するための方法を示す。共培養では、少なくとも気体透過性である膜１をまず間充質２で被覆して支持体として用いる。このような気体透過性膜１として、用いられる支持体は適度に大きな孔を有する、あるいは穴があけてありそこから酸素が通過または拡散するような物質から作られる。例えば、焼結金属盤がこの目的において好適であり、そこにおいて、酸素源からの酸素が該盤内部のチャンネルまたはあけらた穴へと通過し、そこから酸素が適当にあけられた穴（孔）を経由して膜１の表面へと運ばれる。多孔性プラスチックやセルロースも膜１として好適である。間充質２としては、コラーゲンなどのタンパクを含有する層が用いられる。必要に応じて、グリコサミノグリカンやグリコプロテイン（糖タンパク）などの成分をさらに混合してもよい。このような成分は肝細胞に対して誘導機能を示す。肝細胞、すなわち肝臓細胞３は分極化されており、間充質２の中または上にのせる。肝細胞との共培養に用いられる細胞型としては、Ｖ−７９細胞またはリンパ球が挙げられる。これらの細胞は突然変異誘発の検査において特に有用である。間充質２は、肝細胞３の接着性を向上させるのにも有用である。膜１が肝臓細胞３の接着性を促進する場合には、必要に応じて、肝臓細胞３を、介在的に配置される間充質２を設けずに直接この膜１にのせてもよい。このような膜の例としては、ポリウレタン箔、ポリプロピレン、あるいはヒトまたは動物結合組織のような生体膜が挙げられる。肝臓細胞３は、標準的な方法、すなわち肝臓の結合組織構造をコラゲナーゼで消化し洗浄する、という方法により単離できる。肝臓細胞３を第１の間充質層２にのせた約３０分〜１時間後に、コラーゲンを基本接着構造として用いて第２の間充質層４を該肝臓細胞３の上にのせる。この第２の間充質層４は肝臓細胞３を上部細胞膜に沿ってこの構造に固定するのに役立つ。第１の間充質層２の場合と同様に、必要に応じて、さらに物質を第２の間充質層４に混合できる。第２の上部間充質層４を接着させた後、第２の細胞型（あるいは数種類でもよい）５をこの上にのせる。最後に、培養または栄養培地６を上側の被験細胞層５の上にある層に入れる。両側に固定しなければならない特定の細胞型５においては、さらに第３の間充質層を被験細胞層５の上に設けることが可能である。これは第１図において点線７で示してある。この場合も、培養または栄養培地６の層は第３間充質層７上の上限を表わす。一般に、第３の間充質層７は、例えば上部の被験細胞５も肝細胞である場合に設けられる。図示した方法を用いれば、長期間にわたって安定な肝細胞性の表現型を保持したまま、肝臓細胞３を第２の細胞型５と共培養することが可能になる。肝臓細胞３の酸素供給は膜酸素添加により確実に行なわれる。したがって、その他のどのような細胞型でも、第２の上部コラーゲン層４の基板（下地）の上で通常の方法で培養できる。被験細胞型５は、上から培養または栄養培地６を経て供給される。潜在的に毒性を有する標的器官由来の細胞はヒト代謝系と直接結合するので、第１図に示す方法は、例えば薬剤の毒性試験に用いることができる。したがって、本方注は、スクリーニング法、すなわちいくつかの物質の検査系列として用いうる。この方法を用いれば、最も広い多様性を有するその他の細胞系だけでなく、動物実験では検出できないヒト特異性代謝生成物も研究できる。さらに、この方法により、細胞系により毒性効果を正確に極在させることが可能になる。第１図に示した方法は、必要に応じて、動的培養培地サイクルに組み込むことができる。第２の細胞型５、すなわち、代謝の影響により試験される細胞型は、肝臓細胞３の上の培養培地の方向を示している間充質層４の側面にのせる代わりに、分離支持体（図示せず）にのせてもよい。その後で、この支持体を、その上に配置されている細胞と共に、代謝物が豊富な肝細胞系由来の培地ですすぐ。その後、培養培地との隙間が二つの系の間に位置するように第２の支持体を第２の細胞型５に接近させてもよい。第２図は、サンドイッチシステムの中で神経細胞などの細胞型５を肝臓細胞３に直接添加する方法を示す。第１図の方法と同様に、第２の間充質層４を結合細胞層の上に配置し、その一番上に培養または栄養培地６を配置する。酸素は下から同様の方法で膜１を経由させて供給する。しかしながら、系の再生産性に欠けることがこの方法の欠点である。依然として、その他の細胞型５を、通常インビボでは接触しない肝臓細胞３に加えることを行なわなければならない。気体透過性膜１の代わりに、単純な気体非透過性の板を支持体として用いることもできる。しかし、適切な酸素供給を行なうためには、肝臓細胞に酸素が適切に供給されるように、その上に位置する細胞濃度にしたがって部分的酸素圧を上昇させることができる特別なインキュベーター内で該細胞を分析することが必要となる。しかし、実際には、簡単かつ容易に行なうために、通常は気体透過性膜が用いられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年６月２３日【補正内容】明細書一細胞型の肝臓細胞との共培養プロセス本発明は、肝細胞性生成物のインビトロ（試験管内）における製造プロセス、およびこれらの生成物を安定な細胞性検査システムにおいて第２の細胞に作用させるための手法に関する。従来、インビトロ（試験管内）で安定であり、かつ医薬品や化学薬品、同時にそれらの代謝物の特定の細胞型に対する影響が全体的に調べられるような真核細胞用の機能検査システムはなかった。しかし、例えばインビボ（生体内）の条件下で用いることができる検査システムは、以下のようなものにおいて特に重要である。１．薬剤前駆体の開発。ここでは、代謝的に、すなわち肝臓内で酵素的に転換されてより容易に分泌可能な物質、腫瘍に有毒な形態へと転換される細胞増殖抑制物質前駆体（プロサイスタティック）を一例として挙げる。このタイプの前駆体は、患者に投与しても器官に副作用をほとんど示さない。言い換えれば、このような物質は抗がん剤として理想的な種類である。２．突然変異あるいは発がん性物質を生じる物質の同定。周知のように、我々のまわりで生じるある種の物質は、元来発がん性を有せす、ヒト生体に取入れられ代謝された時に活性化されて発がん性を示すようになる。３．毒性研究。周知のように、新規に開発された医薬品や化学物質は潜在的に有する毒性を検査しなければならない。しかし、主に代謝能や多様な種依存性解毒能により、多くの薬剤が毒性を有する。４．相互作用の研究。これは、型の異なる細胞間で相互作用が起こることを意味する。上記１〜３で述べたケースには、特に、代謝終了までに『活性な形態』に転換されない物質が含まれる。これらの物質の検査に関して、動物に投与できること、あるいは代謝後酵素混合物中の特定の細胞型に適用できること、あるいは肝臓細胞とそれ以外の細胞型との従来の単層共培養系において試験できることが知られている。しかしながら、これら公知の方法には、とりわけ、異なる動物種間だけでなく、特に動物とヒトの間において代謝生成のパターンが極端に異なるという欠点がある。すなわち、ヒトの代謝により代謝された後でのみ活性形態あるいは毒性形態になる全ての物質は、動物実験では有効に決定できない。このような理由から、すでに、肝臓細胞との共培養法を用いた様々な細胞型の研究が試みられている（ＷＯ８４／０４３２５やニューヨーク科学協会年報１９８０年３４９号２６４頁から２７２頁を参照）。しかし、これら公知の共培養法は全て、肝細胞、すなわち肝臓細胞の機能が培養調整直後に低下し始まる、という固有の問題を有している。これは、基本的な肝細胞に特異的な要件および細胞生物学的要件が、用いられる方法において考慮されなかった、あるいは考慮できなかったことによるものと考えられる。したがって、このようなシステムによる長期間の研究は無意味である。しかし、発がん物質の特性が長期間経て初めて発現されることは十分公知であるので、こうした研究は非常に重要であろう。公知の共培養法において、細胞は２次元の層内で混合される。したがって、それらの細胞を選択的に分離するのは容易ではない。言い換えれば、この検査システムは再利用できないのである。特に、公知の検査システムを用いて実験する不安定な機能、およびそれらの反応がインビボの条件を反映していないという事実から、そのような効果を研究するために、物質を酵素混合物中の各細胞型に加え、続いて代謝させることが提案されている。しかし、このような検査システムの欠点は、インビボで生じる特定比率の代謝物が再度検出されてしまうことである。なぜならば、完全な代謝は何の手も加えられていない完全な細胞系にのみ起こるからである。つまり、治療上効果的な、あるいは有毒な物質は形成される道理がないので、検出されない。しかしながら、最大の欠点は、潜在的な発がん物質または細胞増殖抑制物質がこの方法では検出できないことである。共培養における異種細胞型間、特に肝細胞とそれ以外の細胞型との相互作用の研究（上記ケース４と同様）は、肝細胞が培養中に安定な機能を保持できる限りにおいて有意義であろう。しかし、公知の方法においてこのような例はない。したがって、本発明は、ある細胞型の共培養方法において、長期間にわたって少なくともインビボの条件に近付けることを達成して、この細胞型を調べるための方法を確立する、という課題に基づくものである。本発明において、この課題は、肝臓細胞を支持体上で培養し、その上に間充質層を配置し、そしてその上に検査の対象である第２の細胞型を配置することにより解決される。本発明では、上記のような問題点は、肝臓細胞に対し、検査の対象である第２の細胞型を３次元的な培養系におけるこの構造上で培養することによる一種のサンドイッチ培養技術を用いることによって解決される。本発明で具体的に記載されているこの共培養法の有利点の一つは、肝細胞の分極化された足場がこのように保持されることである。この種の細胞重層（スタッキング）や細胞密度は、通常は非常かつ速やかに下層にある肝臓細胞の酸素欠乏を引き起こす。したがって、酸素を膜酸素添加の形態で該支持体を経由させて該肝臓細胞に供給することが、非常に有利かつ非自明である本発明のさらなる開発内容である。この方法において、支持体は、いわゆる膜酸素添加を達成するように構成されており、肝臓細胞に十分な酸素供給を行なう。実際には、３つの技術を組み合わせることにより、肝細胞性生成物を製造するためのサンドイッチ式肝細胞培養技術の機能的有利点、および選択されたあらゆる共培養細胞型に対するそれら生成物の即時的作用および、逆に該生成物に対する該細胞型の即時的作用を利用できるようになる。したがって、本発明で用いられる方法は、多少は公知である３種類の技術からなる。すなわち、支持体を経由する膜酸素供給、肝臓細胞を培養するためのサンドイッチ技術、およびこの形態では新規である共培養方法からなる。この方法により、酸素供給の問題が解決され、安定な肝臓細胞培養が提供され、かつ、例えば肝細胞やその代謝能力により発現される効果を調べることができるようなある種の細胞型を該肝臓細胞と同時に共培養することが可能になる。本発明は、従来公知の検査系、特に公知の共培養方法とは違って、数週間にわたって代謝物が生成され、かつそれら代謝物の効果が研究できるような、機能的に安定である検査系およびそれらの効果を提供する。さらに、本発明は細胞の相互作用についても適用できる。このように、長期毒性研究のための手段が初めて可能になったのである。肝臓細胞および検査の対象である第２の細胞型を互いに重ねて配置した場合、例えば間充質層によりそれらを隔てることができるので、両細胞とも必要に応じて再度選択的に分離できる。これは、例えば一番上に配置された培養細胞型に酵素を添加することで可能になる。トリプシンは細胞分離に好適に用いられる酵素である。肝臓細胞の長期機能安定性、および肝臓細胞をサンドイッチシステム中に固定したままで分離されるある細胞型の能力も、この検査システムを再利用可能なものにする。例えば、肝臓細胞以外の被験細胞型は、系を洗浄した後で再培養できる。このことは、ヒト肝細胞などのヒト細胞は無限に得られるものではないので、特に重要である。本発明の方法のもう一つの非常に重要な有利点は、ヒト肝細胞を使用できるので、ヒトについて非常に適切な結果が得られることである。これは、あらゆるヒトの薬学的および毒物学的研究の最終的な目的である。また、本発明の方法は、酵素混合物を用いる方法と比較してもさらに高レベルに適切な方法である。なぜならば、本方法は何も損なわれていない完全な細胞系を提供するのであり、したがって、全ての代謝物がそのまま検査できるからである。この点において、公知の共培養方法は、手段および長期研究において非常に限定された適切性しか示さない。なぜならば、そのような公知のシステムにおける肝細胞は代謝酵素を非常に急速に失うからである。本発明の方法の原理をさらに詳細に説明するために、一つの実施例を以下に示す。図は互いに重ねて配置した二つの細胞型を用いて、ある細胞型を共培養するための方法を示す。共培養では、少なくとも気体透過性である膜１をまず間充質２で被覆して支持体として用いる。このような気体透過性膜１として、用いられる支持体は適度に大きな孔を有する、あるいは穴があけてありそこから酸素が通過または拡散するような物質から作られる。例えば、撓結金属盤がこの目的において好適であり、そこにおいて、酸素源からの酸素が該盤内部のチャンネルまたはあけらた穴へと通過し、そこから酸素が適当にあけられた穴（孔）を経由して膜１の表面へと運ばれる。多孔性プラスチックやセルロースも膜１として好適である。間充質２としては、コラーゲンなどのタンパクを含有する層が用いられる。必要に応じて、グリコサミノグリカンやグリコプロテイン（糖タンパク）などの成分をさらに混合してもよい。このような成分は肝細胞に対して誘導機能を示す。肝細胞、すなわち肝臓細胞３は分極化されており、間充質２の中または上にのせる。肝細胞との共培養に用いられる細胞型としては、Ｖ−７９細胞またはリンパ球が挙げられる。これらの細胞は突然変異誘発の検査において特に有用である。間充質２は、肝細胞３の接着性を向上させるのにも有用である。膜１が肝臓細胞３の接着性を促進する場合には、必要に応じて、肝臓細胞３を、介在的に配置される間充質２を設けずに直接この膜１にのせてもよい。このような膜の例としては、ポリウレタン箔、ポリプロピレン、あるいはヒトまたは動物結合組織のような生体膜が挙げられる。肝臓細胞３は、標準的な方法、すなわち肝臓の結合組織構造をコラゲナーゼで消化し洗浄する、という方法により単離できる。肝臓細胞３を第１の間充質層２にのせた約３０分〜１時間後に、コラーゲンを基本接着構造として用いて第２の間充質層４を該肝臓細胞３の上にのせる。この第２の間充質層４は肝臓細胞３を上部細胞膜に沿ってこの構造に固定するのに役立つ。第１の間充質層２の場合と同様に、必要に応じて、さらに物質を第２の間充質層４に混合できる。第２の上部間充質層４を接着させた後、第２の細胞型（あるいは数種類でもよい）５をこの上にのせる。最後に、培養または栄養培地６を上側の被験細胞層５の上にある層に入れる。両側に固定しなければならない特定の細胞型５においては、さらに第３の間充質層を被験細胞層５の上に設けることが可能である。これは図において点線７で示してある。この場合も、培養または栄養培地６の層は第３間充質層７上の上限を表わす。一般に、第３の間充質層７は、例えば上部の被験細胞５も肝細胞である場合に設けられる。図示した方法を用いれば、長期間にわたって安定な肝細胞性の表現型を保持したまま、肝臓細胞３を第２の細胞型５と共培養することが可能になる。肝臓細胞３の酸素供給は膜酸素添加により確実に行なわれる。したがって、その他のどのような細胞型でも、第２の上部コラーゲン層４の基板（下地）の上で通常の方法で培養できる。被験細胞型５は、上から培養または栄養培地６を経て供給される。潜在的に毒性を有する標的器官由来の細胞はヒト代謝系と直接結合するので、その実施例に示す方法は、例えば薬剤の毒性試験に用いることができる。したがって、本方法は、スクリーニング法、すなわちいくつかの物質の検査系列として用いうる。この方法を用いれば、最も広い多様性を有するその他の細胞系だけでなく、動物実験では検出できないヒト特異性代謝生成物も研究できる。さらに、この方法により、細胞系により毒性効果を正確に極在させることが可能になる。その方法は、必要に応じて、動的培養培地サイクルに組込むことができる。第２の細胞型５、すなわち、代謝の影響により試験される細胞型は、肝臓細胞３の上の培養培地の方向を示している間充質層４の側面にのせる代わりに、分離支持体（図示せず）にのせてもよい。その後で、この支持体を、その上に配置されている細胞と共に、代謝物が豊富な肝細胞系由来の培地ですすぐ。その後、培養培地との隙間が二つの系の間に位置するように第２の支持体を第２の細胞型５に接近させてもよい。気体透過性膜１の代わりに、単純な気体非透過性の板を支持体として用いることもできる。しかし、適切な酸素供給を行なうためには、肝臓細胞に酸素が適切に供給されるように、その上に位置する細胞濃度にしたがって部分的酸素圧を上昇させることができる特別なインキュベーター内で該細胞を分析することが必要となる。しかし、実際には、簡単かつ容易に行なうために、通常は気体透過性膜が用いられる。特許請求の範囲１．肝臓細胞（３）をサンドイッチ技術を用いてを支持体（１）上で培養し、その上に間充質層（４）を配置し、そしてその上に検査の対象である第２の細胞型（５）を配置することを特徴とする、ある細胞型の肝臓細胞との共培養方法。２．酸素を膜酸素添加の形態で支持体（１）を経由させて肝臓細胞（３）に供給することを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．第１の間充質層（２）を肝臓細胞（３）と支持体（１）の間に配置して該肝臓細胞（３）を固定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。４．培養または栄養培地（６）を、肝臓細胞（３）の上に配置された第２の細胞（５）の上に配置することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．第３の間充質層（７）を第２の細胞型（５）のために配置し、その上に培養または栄養培地（６）をおくことを特徴とする、請求項４に記載の方法。６．第２の細胞型（５）をそれ自身の第２の支持体上に配置し、培養または栄養培地（６）との隙間が２つの細胞型（３，５）の間にくるように調整することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．インキュベーター内で部分的に酸素圧を上昇させながら行なわれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。８．請求項１〜７による方法を用いて被験物質の毒性検査を行なう方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．肝臓細胞（３）をサンドイッチ技術を用いてを支持体（１）上で培養し、その上またはその間に試験の対象である第２の細胞型（５）を配置することを特徴とする、ある細胞型の肝臓細胞との共培養方法。２．酸素を膜酸素添加の形態で支持体（１）を経由させて肝臓細胞（３）に供給することを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．第１の間充質層（２）を肝臓細胞（３）と支持体（１）の間に配置して該肝臓細胞（３）を固定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。４．第２の間充質層（４）を肝臓細胞（３）の上に配置することを特徴とする、請求項３に記載の方法。５．培養または栄養培地（６）を、肝臓細胞（３）の上に配置された第２の細胞（５）の上に配置することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．第３の間充質層（７）を第２の細胞型（５）のために配置し、その上に培養または栄養培地（６）をおくことを特徴とする、請求項５に記載の方法。７．第２の細胞型（５）をそれ自身の第２の支持体上に配置し、培養または栄養培地（６）との隙間が２つの細胞型（３，５）の間にくるように調整することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．インキュベーター内で部分的に酸素圧を上昇させながら行なわれることを特徴とする、請求項１に記載の方法。９．請求項１〜８による方法を用いて被験物質の毒性検査を行なう方法。