JPH09502098A

JPH09502098A - 植物細胞及び植物中で修飾された澱粉を形成することができるｄｎａ配列の組合せ、これらの植物の製造方法並びにそれから得られる修飾された澱粉

Info

Publication number: JPH09502098A
Application number: JP7508470A
Authority: JP
Inventors: コスマン，イェンス; フィルギン，イファー
Original assignee: インスティテュートフュアゲンビオローギシュフォルシュンクベルリンゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 1997-03-04
Also published as: DE4330960C2; EP0719338B1; HUT74667A; IL110916A0; HU9600605D0; AU7657394A; AU694448B2; DE4330960A1; US6066782A; CA2171313A1; EP0719338A1; ATE242329T1

Abstract

(57)【要約】トランスジェニック植物細胞又は植物において特に分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉の形成をもたらすDNA 配列の組合せか記載される。人工的に導入されたDNA 配列発現に基き、合成された澱粉の物理的及び化学的性質が変更された、遺伝的に修飾された植物の作出のための方法、この方法により得られる植物、及びこれらの植物により得られる澱粉も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】植物細胞及び植物中で修飾された澱粉を形成することができるDNA配列の組合せ、これらの植物の製造方法並びにそれから得られる修飾された澱粉本発明は、トランスジェニック植物細胞及び植物中で該細胞中で形成された澱粉の修飾をもたらすDNA 配列の組合せに関する。本発明はさらに、人工的に導入されたDNA 配列の発現のために、天然に形成された澱粉と比較して形成された澱粉の物理的及び化学的性質の観点で修飾された、遺伝的に修飾された植物の製造方法、この方法により得られる植物細胞及び植物、並びにこれらの植物から得られる修飾された澱粉に関する。油、脂肪及び蛋白質と共に、澱粉のごとき炭水化物は植物からの必須の再生可能な材料である。再生可能な原材料の工業的原材料としての使用に対する決定的な障害は、その形状、構造又は他の物理化学的パラメーターが化学工業の要請に正確に適合する材料が欠けることである。工業的用途のために適当な原材料の２つの特定の要件は、それが高純度で得られること、及びそれが均一な化学構造を有することである。後者は、工程のあいだ反応が均一に進行することを確実にするために重要である。澱粉は化学的に均一な基本構造単位、すなわちグルコース分子から形成されたポリマーであるが、重合度及びグルコース鎖中の分岐の頻度を異にする非常に多様な分子の複雑な混合物である。分岐度は特に問題の澱粉の物理化学的性質及びそれ故に非常に多様な用途のための適切さを決定する。特に、α−１，４−結合したグルコース分子から構成される本質的に分岐していないポリマーであるアミロース澱粉と、種々に分岐したグルコース鎖の複雑な混合物であるアミロペクチン澱粉との間に区別が存在する。分岐は追加のα−１，６結合の存在から生ずる。澱粉製造のための典型的な植物、例えばメイズ又はポテトにおいては、約25部のアミロースと75部のアミロペクチンの比率で２つの形の澱粉が存在する。澱粉原料を異る工業用途に適合させるため、すなわちその物理化学的性質を変更するため、澱粉の分岐度に影響を与えることができることが特に必要である。従って、工業的部門での使用のための澱粉のごとき基礎材料の適切さに関して、天然の澱粉と比較して修飾された澱粉を合成する澱粉生産性植物の製造方法を提供することが好ましいようである。変化した分岐度、例えば低下又は増加した分岐度を有するように澱粉を修飾し、これによってより高い又はより低いアミロース含量を有するより均一な澱粉を形成することが特に好ましい。澱粉の工業的利用のための他の注目すべき性質の例はリン酸基の含量である。リン酸含有澱粉は非常に広範な分野、例えば製紙、繊維製造、例えば接着剤、食品の分野及び医薬の分野において広い用途を有する。さらに、澱粉リン酸誘導体は乳化剤としての用途のために適当である。例えば根又はポテトの地下茎のごとき地下器官中に生成される澱粉の特定の例外はあるが、ほとんどの澱粉生産性植物に自然に存在する澱粉は非常に小さい比率のリン酸基のみを含有するので、リン酸基は従来通常は化学的工程により導入されていた。澱粉にリン酸基を導入するためのこのような工程に伴うコスト及び時間の追加の経費を回避するため、リン酸基の含量が増加するように修飾された澱粉を生産するように植物を変えることができる方法を提供することが望ましいであろう。澱粉の分岐度に関して、幾つかの植物種、例えばメイズについて、植物の個々の遺伝子を不活性化するような変量誘発により、アミロペクチンのみを含有する品種を製造することができる。同様に、ポテトについては、アミロースを生成しない遺伝子型が一倍体系の化学的変異誘発により作られている (Hovenkamp-Herm elink ら、1987，Theor，Appl．Genet．75，217-221)。しかしながら、一倍体系、又はそこから発展したホモ接合型二倍体もしくは四倍体は農業において使用できない。遺伝子型の４個の異るコピーの存在の故に遺伝子のすべてのコピーの不活性化は技術的に不可能であるので、農業的に注目されるヘテロ接合型四倍体系に変異誘発技法を適用することはできない。アミロース澱粉を生産することができるメイズ及びエンドウの品種も知られているが、しかしこれらの植物の澱粉中のアミロース濃度はわずか60〜80％である。さらに、これらの品種の作出か基礎を置く変異誘発法は他の植物、例えばポテトに適用することはできない。 Visserら（1991，Mol．Gen．Genet．225，289）はさらに、実質的に純粋なアミロペクチン澱粉を生成するポテトの品種が、遺伝子光学的方法により、特に澱粉粒に結合した澱粉合成酵素の遺伝子のアンチセンス阻害により、作出し得ることを開示している。 WO 92/14827 はポテトの枝つくり酵素（branching enzyme）を開示している。この酵素は、ソラヌム・スベロスム (Saranum tuberosum)のＱ酵素（枝つくり酵素）として命名されている。さらに、WO92/14827 に記載されているポテトの枝つくり酵素の情報を含有するDNA 配列により、澱粉のアミロース／アミロペクチン比が変更されたトランスジェニック植物を作出することができる。但し、WO 9 2/14827 に記載されている植物は高アミロース含量を有する澱粉を生成しない。澱粉の合成、分解及び修飾には多数の酵素が関与し、それらの相互作用は今まで部分的に説明されているに過ぎない。ポテトにおいては、ポリグルカンの非還元末端にグルコース残基を移送するための基質として本質的にADP−グルコースを用いる澱粉合成酵素の作用により澱粉が合成される。ポテトにおける分岐した澱粉の合成に関与する他の酵素がなにであるかは、現時点ではほとんど知られていない。やはり、澱粉の修飾及び分解に幾つかの酵素が関与している。すなわち：助基質 (cosubstrate)として無機リン酸を用いる澱粉ホスホリラーゼはα−１，６分岐の前のα−１，４結合を４ユニットまで分解しそして非還元末端から働く。エキソアミラーゼとして、β−アミラーゼはα−１，４結合に対して高い特異性を有する。最も少なく重合された基質はマルトテトラオースである。分岐点は鎖分解を終らせ、分岐点の前の最後のα−１，４結合は分解されないで残る ( Whelan，1961，Nuture 190，954-957)。残ったポリグルカンは、加水分解酵素活性と合成酵素活性の両者を有するトランスグルコシダーゼにより処理され得る。Ｑ酵素（枝つくり酵素）及びＴ酵素は澱粉の修飾に対してトランスグリコシダーゼとして働く。Ｔ酵素により触媒される反応のために適当な最小の基質はα− １，４−マルトースであり、これはα−１，６−結合を形成してトリサッカライドであるパノースとグルコースに転換される (Whelan，1961；Abdullah & Whela n，1960，J.Biochem．75，12P)。Ｑ酵素は、少なくとも40ユニットの鎖長を有するグルカンに対して排他的に、同じトランスグリコシレーションを触媒する。メイズ（Singh 及びPreiss，1985，Plant Physiol．79，34-40）のごとき他の種について幾つかのＱ酵素の存在が知られているが、WO 92/14827 に記載されている枝つくり酵素のみがソラヌム・ツベロスム (Solanum tuberosum) の場合に検出されている。他のトランスグリコシダーゼであるＤ酵素は1953年に最初に記載された (Natu re 172，158)。Peatら（1956，J．Chem．Soc．Part XX，44-55）はこれを、２個以上のユニットを有するマルトデキストリン基質を移送し、これによりα−１，４結合のみを生成するトランスグリコシダーゼとして記載している。基質は少なくとも３ユニットから形成されていなければならず、そして受容体に関して低い特異性が存在する。Takahaら (1993，J．Biol．Chem．268，1391-1396)はポテトのＤ酵素（EC ２．４．１．25）の精製及びcDNAのクローニングを記載している。精製された酵素は移送されるべき鎖の受容体としてグルコースを許容するが、しかし供与体は少なくとも３個のグルコースユニットから構成されていなければならない。著者はトランスグリコシレーションにおいていかなるタイプの結合が形成されるか記載しておらず、そしてＤ酵素又は不均化（disproportionation）酵素はおそらく澱粉の分解におけると同様に修飾にも大きく関与していないと仮定している。澱粉の修飾に他の酵素が関与するか否か知られていない。さらに、Ｔ又はＤ酵素の活性の修飾が細胞中に生成した澱粉の構造にいかなる影響を与えるかについても、また該影響についても今日まで研究されていない。今まで、Ｄ酵素が澱粉の分解に関与すると予想されていたので、Ｄ酵素をコードする遺伝子の不活性化又は過剰発現は生成される澱粉の基本構造にいかなる影響を与えるとも予想されなかった。澱粉へのリン酸基の導入に関与する酵素反応について現在知られていない。リン酸基の導入を司る酵素は同定されておらず、リン酸基供与体としていかなる基質が作用するかについても明確な説明が存在しない。従って、澱粉が植物中に天然に生ずる澱粉に比べて工業的工程のためにより一層適当であるような態様で、その物理化学的性質、例えばアミロース含量又は分岐度について修飾されている澱粉を生産することができるように遺伝子操作法によって、澱粉生産性植物を特に変えることに、だれも成功していない。さらに、それらの植物中に生成する澱粉がより高含量のリン酸基を有するように遺伝子工業的手段によりいかにして澱粉生産性植物を変え得るかについて知られていない。従って本発明の目的は、植物中に天然に生成する澱粉に比べて、工業的工程に関して種々の利点を有する修飾された澱粉を生産するように、澱粉生産性植物を変え得るDNA 配列の組合せを提供することである。上記の利点には、例えば、アミロース含量の増加、分岐度の変更、リン酸基含量の増加等が含まれる。本発明の更なる目的は、この様に修飾された澱粉を合成するトランスジェニック植物又は植物細胞を提供すること、及びこれらの植物の製造方法を提供することである。驚くべきことには、ポテトのディスプロポーショネーション酵素又は枝つくり酵素をコードする既知のDNA 配列の組合せを植物細胞に導入することにより、特に分岐度及びリン酸含量の観点で天然に生成した澱粉に比べて異る修飾された澱粉を合成する植物を製造することが可能である。従って、本発明は、ａ）枝つくり酵素又はその部分のコード領域、及びｂ）不均化酵素又はその部分のコード領域、から成るDNA 配列の組合せを提供し、これらの配列はアンチセンス方向にプロモーターに融合されており、トランスジェニック植物中の植物ゲノムに導入された後に、その転写がエンチセンス効果によって細胞中の枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転換物を生産し、特に分岐度及びリン酸含量の観察から、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉の細胞内での合成をもたらす。特に、修飾された澱粉の分岐の程度は、減少又は増加した分岐が生じてより高い又は低い比率のアミロースを有する澱粉が合成されるように変更され得る。あるいは、枝つくり酵素及び不均化酵素の２つのコード領域はそれぞれアンチセンス方向にそれら自身のプロモーターに連結することができ、そしてそれ故に相互に独立に転写されることができ、あるいはそれらは共通のプロモーターに融合され得る。その物理化学的性質において、特に分岐度及びリン酸含量に関して修飾された澱粉を遺伝的に修飾された植物において生成せしめるために、植物又は植物のために不均化酵素をコードするDNA 配列と枝つくり酵素をコードするDNA 配列との組合せを記載した者はいない。植物ゲノムへのDNA 配列の新規な組合せの導入が澱粉の物理化学的性質特に分岐度及びリン酸基含量に与える効果は驚くべきものである。なぜなら、今まで、Ｄ酵素が澱粉の合成及び分岐の導入、又は形成された鎖へのリン酸基の導入に関与することを示すものはなにもないからである。確かに、Peatら（1956）の知見によれば、Ｄ酵素はα−１，６結合を形成することができない。 DNA 配列の組合せは、好ましくは、ソラヌム・ツベロスム (Solanum tuberosu m)の枝つくり酵素及びディスプロポーショネーション酵素のコード領域から成り、枝つくり酵素のコード領域は組換プラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)又はプラスミドp35S-anti-BE（DS M 6144）上に位置する配列であり、そして不均化酵素のコード領域は組換えプラスミドp35SH-anti-D（DSM 4879）又はプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)上に位置する。これらの配列の全コード領域又は部分を使用することができるが、これらの部分は細胞中でアンチセンス効果を有するのに十分な長さである必要がある。15bpの最小長さまで、好ましくは 100〜500bp の長さ、又は効果的なアンチセンス阻害のためには特に500bp を越える長さの配列を使用することができる。原則として、5000bpより短いDNA 分子が使用され、好ましくは2500bpより短い配列が使用される。トランスジェニック植物の植物ゲノムに同時に又は次々に導入される場合、組換えDNA 配列は組換えDNA 配列は澱粉代謝の酵素の生成を変更する転写物の形成をもたらし、細胞内で修飾された澱粉が合成され、これらは細胞内で天然に生成する澱粉と比較して特に増加したリン酸含量及び変化した程度の枝つくり酵素、特に低下しているがしかし増加した程度の分岐形成を有し、形成された澱粉は高い又は低い比率のアミロースを含有する。従って、例えば、トランスジェニック植物中の植物ゲノムに同時に又は次々に導入される場合、プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）上の枝つくり酵素のコード領域を有するDNA 配列とプラスミドp35SH-anti-D（DSM 8479）上の不均化酵素のコード領域を有するDNA配列との組合せ、又はプラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)上の枝つくり酵素のコード領域を有するDNA 配列とプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)上の不均化酵素のコード領域を有するDNA 配列との組合せは、細胞中での枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転写物の合成をもたらし、これにより細胞中で特に分岐度及びそのリン酸含量に関し、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉が合成される。さらに、トランスジェニック植物の植物ゲノムに導入される場合、枝つくり酵素のコード領域を有するDNA 配列と不均化酵素のコード領域を有するDNA 配列の１つのプラスミド、すなわちプラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367)上での組合せは、細胞での枝つくり酵素及び不均化酵素の生合成を阻害する転写物の合成をもたらし、特にその分岐度及びそのリン酸含量において細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉が前記細胞中で合成される。本発明はまた、特にその分岐度及びリン酸含量に関し、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を合成することができるトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物細胞の製造方法を提供する。このようなトランスジェニック植物は、本発明によるDNA 組合せの１つを植物細胞のゲノムに安定に組込み、そしてこれらの形質転換された植物細胞を全体植物に再生することにより製造することができ、その製造は、Ａ）次の段階：ａ）下記部分配列からのDNA 配列の組合せの調製、ｉ）各場合において、植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞中でのRNA の生成を保証する１個のプロモーター、 ii）各場合において、枝つくり酵素又はその部分、及び不均化酵素又はその部分の１つのコード領域であって、非−コード鎖の転写物を形成するように、ｉ）に記載のプロモーターに融合したもの（アンチセンス融合）、及び iii）各場合において、植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ii）に記載の非−コード鎖の３’末端に３’−非翻訳配列が連結するようにii）において述べた配列に融合したもの、ｂ）トランスジェニック植物細胞の生産のための植物ゲノムへのDNA 配列の組合せの移行及び導入、並びにｃ）形質転換された植物細胞からの無傷の全体植物の再生、を含んで成る一段階法；あるいはＢ）次の段階：ａ）下記部分配列からのDNA 配列の組合せの調製：ｉ）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞でのRNA の形成を保証するプロモーター、 ii）枝つくり酵素又はその部分のコード領域及び不均化酵素又はその部分のコード領域の融合体であって、両コード領域が同じ方向（センス又はアンチセンス）に読まれるように一緒に融合しており、そして前記融合体の非コード鎖の転写物を形成するようにｉ）に記載のプロモーターに融合している（アンチセンス融合）もの、 iii）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ii）に記載の非コード鎖の３’末端に３ ’−非翻訳配列が結合するようにii）に記載の配列に融合しているもの、ｂ）トランスジェニック植物細胞の製造のための植物ゲノムへのDNA 配列の組合せの移送及び導入、並びにｃ）前記形成転換された植物細胞への無傷の全体植物の再生、を含んで成る一段階法；あるいはＣ）まず、下記部分配列： iv）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞中でのRN A の生成を保証するプロモーター、ｖ）枝つくり酵素のコード領域であって、非コード鎖の転写物を形成するようにiv）に記載のプロモーターに融合したもの（アンチセンス融合）、及び vi）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ｖ）に記載した非コード鎖の３’末端に３ ’−非翻訳配列が連結するようにｖ）に記載の配列に融合したもの、から成る配列を、植物細胞のゲノムに移送しそして導入し、こうして遺伝的に修飾された植物細胞から全体植物を再生せしめ、そして次に、この遺伝的に修飾された植物の細胞での形質転換の反復により、次の部分配列： vii）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞でのRNA の生成を保証するプロモーター、 viii）不均化酵素又はその部分のコード領域であって、非コード鎖の転写物を生成するようにvii）に記載のプロモーターに融合したもの、及び ix）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、viii）に記載した非コード鎖の３’末端に３’−非翻訳配列が連結するようにviii）に記載の配列に融合したもの、から成る他のDNA 配列を植物細胞のゲノムに移送しそして導入し、そして最後に、前記両方のコード領域又はその部分を含有する前記のようにして形質転換された植物細胞を再度全体植物に再生せしめることを含んで成る二段階法；あるいはＤ）前記Ｃ）において記載した二段階法であって、ｖ）に記載のコード領域が枝つくり酵素をコードしないで不均化酵素をコードしており、そしてviii）に記載のコード領域が不均化酵素をコードしないで枝つくり酵素をコードしていることを特徴とする方法である。組合せにおいて使用されそして方法の段階ｉ），iv）及びvii）に記載したプロモーターは、基本的には植物において活性ないかなるプロモーターでもよい。例えば、原理的には形質転換されたすべての組織において下記DNA 配列の構成的発現を惹起するカリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターを使用することができる。形質転換されるべき植物の澱粉貯留器官中で活性なプロモーターを使用するのか好ましい。メイブ及びポテトについては、これらの器官はそれぞれ殻粒及び塊茎である。ポテトの形質転換のため、絶対的ではないか特に、ソラヌム・ツベロスム (Salanum tuberosum)の塊茎的異的Ｂ33 プロモーター又はクラスＩパタチン遺伝子の他のプロモーターを使用することが可能である。枝つくり酵素及び不均化酵素のコード領域は、該コード領域の３’ −末端がプロモーターの３’−末端に連結されるように融合される。この配置をアンチセンス配向と称する。アンチセンス配向の効果は、トランスジーンの発現において、転写物の合成のための非−コード鎖が読まれることである。非コード転写物は遺伝的に修飾された植物において内因性コード転写物を中和することができ、ポリペプチドへの翻訳が起らない。従って、枝つくり酵素及び不均化酵素の酵素活性は、遺伝的に修飾された細胞中では無関係である。翻訳の阻害の成功は特に細胞中で活性なアンチセンス転写物の量に依存する。導入されたDNA 配残の組合せにより形成される転写物を安定化させるため、従って、停止及びポリアデニル化シグナルは通常枝つくり酵素及び不均化酵素のコード領域に取付けられる。これは例えば、アグロバクテリウム・ツメフアシエンス (Agrobacterium tu mefaciens)からのノパリン合成酵素の停止シグナルであることができる。プロモーター、枝つくり酵素及び不均化酵素のコード領域並びに停止シグナルの融合により形成された構成物は好ましくは適当なプラスミドにより植物細胞に導入される。組換えプラスミドは、前記コードDNA 配列の両者、又はアンチセンス効果を発揮するのに十分な長さのそれらの配列の部分の融合体として組合せを含有することができ、あるいはそれらはそれぞれ組合せの１要素を含有することができる。組換えプラスミドが前記のDNA 配列の両者を含有する場合、後者が共通のプロモーターにより移写され得るか（変法Ａ）、あるいは、それらがそれぞれ、それら自身のプロモーターにより移写され得る（変法Ｂ）。組換えプラスミドが組合せの両要素を含有する場合、本発明に従うDNA 配列の組合せを含有するトランスジェニック植物は一段階法により作ることができる。本発明に従って一段階法（変法Ｂ）において使用されるプラスミドは、好ましくはプラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM 936 7)である。組換えプラスミドのそれぞれが組合せの１要素を含有する場合、それらは形質転換のために次々に使用することができ、従って本発明に従うDNA 配列の組合せを含有するトランスジェニック植物は２段階法で作られ得る。本発明に従って２段階法（変法Ｃ）及びＤ））における組合せとして使用される組換えプラスミドは好ましくはプラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）とp35SH- anti-D（DSM 8479）、又はプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)とp35SH-anti-BE (DSM 9366)、あるいはこれらの誘導体である。プラスミドは本発明のさらなる対象である。本発明はさらに、本発明の方法に従って得られる植物細胞及び植物を提供し、これらは本発明に従うDNA の組合せの１又は複数をゲノムに組み込んでおり、そして特に分岐度及びホスフェート含量の点で天然に生成した澱粉とは異る修飾された澱粉を合成することができる。原理的には、本発明の方法はすべての植物に適用することができる。特に興味ある植物は貯蔵物質として澱粉を生成する植物、特に生産植物である。本発明の方法は、好ましくは、澱粉の修飾に枝つくり酵素及び不均化酵素が関与している植物に適用される。これは好ましくは生産植物であるポテトである。サロヌム・ツベロスムの不均化酵素及び枝つくり酵素をコードするDNA 配列の新規な組合せからの部分配列は、細菌中のプラスミドベクターへのクローニングにより複製することができる。ベクターの例はpBR322，pUC シリーズ、m13mp シリーズ等である。DNA 配列には、他のプラスミドへの簡単な再クローニンを可能にするリンカーを付与することができる。植物への導入のため（例６を参照のこと）絶対的にではないが好ましくは、例えば大腸菌用及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス用の複製シグナルを含有するバイナリープラスミドを用いることができる。このバイナリープラスミドがＴ DNA要素を含有する場合、DNA 配列の組合せを双子葉植物のゲノムに移送することが特に容易である。しかしながら、他の方法、例えば単子葉植物の形質転換に使用するための弾導法 (ballisticp rocess)を用いる形質転換 (Potrykus，1991，Ann．Rev．Plant Mol．Blol．Plan t Physiol．42，205-225)も利用可能である。それぞれがプロモーター、枝つくり酵素及び不均化酵素のコード領域又は前記プロモーターに対してアンチセンス配向での２つのコード領域の融合体、並びにターミネーション／ポリアデニレーションシグナルを含有するDNA 配列の新規な組合せの移送は、トランスジェニック植物でのRNA 分子の生成をもたらし、この RNA 分子は枝つくり酵素及び不均化酵素の内因性mRNAとの相互作用により、それらの合成を抑制する。これは、分岐度及びリン酸含量に関して修飾された澱粉へのアクセスをもたらす。トランスジェニック植物中で生成された修飾された澱粉は、植物又は植物細胞から、本発明の方法により得ることができ、そして精製の後、食品や工業製品の製造のために処理することができる。寄託プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）及びプラスミドp35SH-anti-D（DSM 8477 ）は、それぞれ1990年８月20日及び1993年８月26日に、ブダペスト条約に基き、ドイツ連邦共和国ブルンスビックのドイチェ・ザンムルング・クオン・ミクロオルガミスメン（Dcutsche Sanmlung von MiKroorganismm；DSM）に寄託された。下記のさらなるプラスミドも同様に1994年８月10日に、ブタペスト条約のもとにドイチェ・ザンムルング・オオン・ミクロオルガニスメン (DSM)に寄託されている。プラスミドp35S-anti-D（DSM 9365）プラスミドp35SH-anti-BE（DSM 9366）プラスミドp35S-anti-D-anti-BE（DSM 9367）図面の説明図１は、13.6kbのプラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）を示す。このプラスミドは下記の断片を含有する：Ａ＝断片Ａ (529bp)は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、すなわちCaMVのヌクレオチド6909〜7437を含んで成る。Ｂ＝断片Ｂ（2909bp）は、ソラヌム・スベロスムの枝つくり酵素のコード領域を有するDNA 断片を含んで成る。Ｃ＝断片Ｃ (192bp)は、TiプラスミドpTiACH５のＴ DNAの３遺伝子のポリアデニレーションシグナル、すなわちヌクレオチド 11749〜11939 を含んで成る。図２は、12.165kbのプラスミドp35SH-anti-D（DSM 8479）を示す。このプラスミドは下記の断片を含有する：Ａ＝断片Ａ (529bp)は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、すなわちCaMVのヌクレオチド6909〜7437を含んで成る。Ｂ＝断片Ｂ（1474bp）は、ソラヌム・ツベロスムの不均化酵素のコード領域を有するDNA 断片を含んで成る。Ｃ＝断片Ｃ (192bp)は、TiプラスミドpTiACH５のＴ DNAの３遺伝子のポリアデニレーションシグナル、すなわちヌクレオチド 11749〜11939 を含んで成る。図３は、プラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)を示す。このプラスミドは13.7 5kb の長さを有し、そして下記のDNA 断片を含有する：Ａ＝断片Ａ (529bp)は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、すなわちCaMVのヌクレオチド6909〜7437を含んで成る。Ｂ＝断片Ｂ（3068）は、ソラヌム・ツベロスムの枝つくり酵素のコード領域を有するDNA 断片を含んで成る。Ｃ＝断片Ｃ (192bp)は、TiプラスミドpTiACH５のＴDNAの３遺伝子のポリアデニレーションシグナル、すなわちヌクレオチド 11749〜11939 を含んで成る。図４は、プラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)を示す。このプラスミドは12.2kb の長さを有し、そして下記のDNA 断片を含有する：Ａ＝断片Ａ (529bp)は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、すなわちCaMVのヌクレオチド6909〜7437を含んで成る。Ｂ＝断片Ｂ（1474bp）は、ソラヌム・ツベロスムの不均化酵素のコード領域を有するDNA 断片を含んで成る。Ｃ＝断片Ｃ (192bp)は、TiプラスミドpTiACH５のＴ DNAの３遺伝子のポリアデニレーションシグナル、すなわちヌクレオチド 11749 〜11939 を含んで成る。図５は、プラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367)を示す。このプラスミドは15.23kb の長さを有し、そして下記のDNA 断片を含有する：Ａ＝断片Ａ (529bp)は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Ｓプロモーター、すなわちCaMVのヌクレオチド6909〜7437を含んで成る。Ｂ＝断片Ｂ（1474bp）は、ソラヌム・ツベロスムの不均化酵素のコード領域を有するDNA 断片を含んで成る。Ｃ＝断片Ｃ (192bp)は、プラスミドpTiACH５のＴ DNAの３遺伝子のポリアデニレーションシグナル、すなわちヌクレオチド 11749〜11939 を含んで成る。Ｄ＝断片Ｄ（3068bp）は、ソラヌム・ツベロスムの枝つくり酵素のコード領域を有するDNA 断片を含んで成る。図６は、まず植物細胞をプラスミドp35S-anti-BE（DSM 9366）により形質転換し、そして選択及び形質転換体の再生の後に、これらの形質転換体の植物細胞をプラスミドp35SH-anti-D（DSM 9365）により形質転換するという２段階法により作出したポテト植物からの全RNA のノーサンブロット分析を示す。全RNA を、枝つくり酵素又は不均化酵素をコードする転写物の存在について試験した。これらの酵素をコードするcDNA分子をこのためのハイブリダイゼーシヨンプローブとして使用した。バンド１及び５：野性型ポテト植物（ソラヌム・ツベロスム（Sa バンド２，３及び４：前記の方法により作出された３個の異る形質転換されたクローンであり、それぞれが本発明のDNA の組合せを含有する。２個のハイブリダイゼーションシグナルの上の方は枝つくり酵素をコードする転写物に対応し、そして下方のハイブリダイゼーションシグナルは不均化酵素をコードする転写物に対応する。図７は、まず植物細胞をプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)により形質転換し、そして選択及び形質転換体の再生の後、これらの形質転換体の植物細胞をプラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)により形質転換するという２段階法により作出されたポテト植物からの全DNA のノーサンブロット分析を示す。全RNA を、枝つくり酵素又は不均化酵素をコードする転写物の存在について試験した。これらの酵素をコードするcDNA分子をこのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。バンド１及び10：野性型ポテト植物（サロヌム・ツベロスムｃ．ｖバンド２〜９：前記の方法により作出された８個の異る形質転換されたクローンであり、それぞれが本発明のDNA の組合せを含有する。２個のハイブリダイゼーションシグナルの上の方は枝つくり酵素をコードする転写物に対応し、そして下方のハイブリダイゼーションシグナルは不均化酵素をコードする転写物に対応する。図８は、植物細胞をプラスミドp35S-anti-D-anti-BE（DSM 9367）により形質転換し、そして形質転換された細胞から無傷の全体植物を再生するという１段階法により作出したポテト植物からの全RNAのノーサンブロット分析を示す。全RNA を枝つくり酵素及び不均化酵素をコードする転写物の存在について試験した。これらの酵素をコードするcDNA分子をこのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。バンド１及び８：野性型ポテト植物（ソラヌム・ツベロスムｃ．ｖバンド２〜７：前記の方法により作出された６個の異る形質転換されたクローンであり、それぞれは本発明のDNA の組合せを含有する。２個のハイブリダイゼーションシグナルの上の方は枝つくり酵素をコードする転写物に対応し、そして下方のハイブリダイゼーションシグナルは不均化酵素をコードする転写物に対応する。本発明が基礎を置く実施例のよりよい理解のため、最も重要な方法をまず説明する。１．クローニング方法ベクターpUC18 (Yanisch-Perron ら、（1985）Gene，33，103-119)をクローニングのために使用した。植物の形質転換のため、遺伝子構成物をバイナリーベクターBIN19 (Bevan (19 84)，Nucl．Acids Res．12，8711-8720)にクローニングした。２．細菌株大腸菌BMH 71-18 株 (Messing ら (1977)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 24， 6342-6346)又はTBI をpUC ベクターのために使用した。TBI はJM101 株（Yunisc h-Perronら（1985）Gene 33，103-119）の組換えネガティブ・テトラサイクリン耐性誘導体である。TBI 株の遺伝子型は次の通りである（Bart Burrel、私信）：F，tra D36，proAB，lacl，lac ZdM15，d (lac，pro)，SupE，thiS，recA，Sr １ :: Tn 10 (Tcr)。植物の形質転換はアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404 株 (Bevan （1984）Nucl．Acids Res．12，8711-8721)，BIN19 誘導体を用いて行った。３．アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換 BIN19 誘導体の場合、アグロバクテリウムへのDNA の導入はHolstersら (1978 ，Mol．Gen．Genet．163，181-187)の方法を用いる直接形質転換により行われる。形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドDNA をBirnboimら (1979，Nu cl．Acids Res．7，1513-1523)の方法により単離し、そして適当な制限酵素開裂の後、電気泳動により分離した。４．植物の形質転換外科用メスで傷をつけた無菌ポテト培養物の10片の小葉を、２％のシュークロースを含み、選択条件下で増殖したアグロバクテリウム・ツメファシエンスの一夜培養物30〜50μｌを含有するMS培地10mlに入れた。３〜５分間穏和に振とうした後、ペトリ皿を25℃にて暗所でインキュベートした。２日後、1.6％のグルコース、２mg／Ｌのゼアチン（Zeatin）−リボース、0.02mg／Ｌのナフチル酢酸、 0.02mg／Ｌのジベレリン酸、500mg／Ｌのクラホラン (Claforan)，50mg／Ｌのカナマイシン及び 0.8％のバクト−アガーを含有するMS培地上に置いた。25℃及び 3000lux での１週間のインキュベーションの後、培地中のクラホランの濃度が半分に低下した。Rocha-Sosaら（1989，EMBO Journol 8，29）に記載されているようにして、さらなる培養を行った。５．トランスジェニック植物からのゲノムDNA の分析ゲノム植物DNA はRogersら（1985，Plant Mol．Biol．5，69-76）の方法により単離した。10〜20μｇのDNA を適当な制限酵素開裂にかけ、そして次に検討されるべきDNA 配列の組込みについてサザンブロットにより分析した。６．トランスジェニック植物からの全RNA の分析全植物RNA はLogemannら（1987，Analytical Biochem．163，16-20）の方法により単離した。分析のため、各場合において50μｇの全RNA を所望の転写物の存在についてノーサンブロットにより試験した。７．トランスジェニックポテト植物から単離された澱粉のリン酸含量の測定トランスジェニック植物で合成された澱粉のリン酸含量の測定のため、ポテトの塊茎から澱粉を単離し、そしてこの澱粉250mg を１mlの 0.7Ｎ HClに懸濁した。この懸濁液を 100℃にて４時間インキュベートした。800mlの緩衝液 (100mM M OPS-KOH，pH7.5；10mM MgCl₂；２mM EDTA)を 100mlのアリコートに加え、そしてこの混合物をキュベットに入れ、100mlの 0.7Ｎ KOHの添加により中和した。下記のものを逐次加えた：NAD(最終濃度：0.4mM)及びロイコノストック（Leuconos toc）(Sigma)からのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（試験バッチの最終体積：１ml）。吸収の変化を340nm の波長にて測定した。次の実施例は限定することなく本発明の対象を例示する。これらはまず、バイナリープラスミドの作製を示し、そして次にDNA 配列の組合せを含有するトランスジェニックポテト植物の作出を示す。同様の方法を、枝つくり酵素及び不均化酵素が澱粉の修飾に関与する他の生産性植物の形質転換のために使用することができる。実施例１．バイナリープラスミドp35S-anti-BEの作製プラスミドp35S-anti-BE（DSM 4144）をWO 92/14827 に与えられた指示に従って調製した。特に次の段階を行った。発現ベクターλgtllに挿入されたソラヌム・ツベロスム・バラエからのcDNAライブラリーにおいて、枝つくり酵素に対する抗血清により認識される種々のクローンが同定された（イムノアッセイ法については、実施例３のウエスタンブロット法を参照のこと）。これらのクローンを利用して、プラスミドpUC19 のHindIII開裂部位に挿入された、ソラヌム・ツベロスムの生長しつつある塊茎からのcDNAライブラリーから全長クローンを単離した。2909bpの挿入を有するクローンをさらなるクローニングのために用いた。プラスミドp35S-anti-BEを調製するため、cDNA挿入部にカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Ｓ RNAのプロモーター及びTiプラスミドTi ACHH5のオクトピンシンサーゼのポリアデニレーションシグナルを与え、非−コード鎖がプロモーターから始まって読まれるようにcDNAの配向を選択した（アンチセンス配向）。プラスミドp35S-anti-BEは 3.6kbのサイズを有し、そしてプラスミドpBIN19（ Bevan，Nucl．Acids．Res．12，8711-8721）のポリリンカーに挿入された３個の断片Ａ，Ｂ及びＣから成る（図１を参照のこと）。断片Ａ (529bp)はCaMVの35Ｓプロモーターを含み、そしてヌクレオチド6909-7 437 を含んで成る（Frank ら、Cell 21，285-294）。これはプラスミドpDH1 (Pi etrzakら、Nucl．Acids．Res．14，5857-5868)からEcoRＩ/KpnＩとして単離され、そしてpBIN19のポリリンカーのEcoRＩ/KpnＩ開裂部位間に連結され、pBIN19− Ａが得られた。断片Ｃ (192bp)はTiプラスミドpTiACH5（Gielen ら、EMBO J．3，835-846）のＴ DNAの３遺伝子のポリアデニレーションシグナル、すなわちヌクレオチド 117 49〜11939 を含み、これはプラスミドpAGV40 (Herrern-Estrellnら、Nature 303 ，209-213)からPvoII／HindIII断片として単離され、そしてPvoII開裂部位へのS phＩリンカーの付加の後、pBIN19−Ａの SphＩ開裂部位とHindIII開裂部位との間に連結され、pBIN19−ACが得られた。断片Ｂはソラヌム・ツベロスムの枝つくり酵素の2909bpのcDNAを含有し、そして前記のpUC19 誘導体からHindIII/SmaＩ断片として単離された。DNA ポリメラーゼによるHindIII開裂部位のフィルインの後、断片を、上記の誘導体pBIN19−ACの SmaＩ開裂部位に連結した（図１を参照のこと）。実施例２．プラスミドp35SH-anti-Dの作製次の配列：及びの２つの合成的に調製されたDNA オリゴヌクレオチドを、ソラヌム・ツベロスムの塊茎組織からのcDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして使用して、不均化酵素のコード領域のコピーを調製した。これには、オリゴヌクレオチドの特定の配列のためコード鎖の３’末端にKpnＩ開裂部位が与えられ、そしてその５’末端に SmaＩ開裂部位が与えられた。これら２つの開裂部位は、バイナリープラスミドpBIN19-HYGの KpnＩ及び SmaＩ開裂部位間に、アンチセンス配向で不均化酵素のコード領域をクローニングすることを可能にする。プラスミドpBIN19-HYGはＴ DNA中にハイグロマイシン耐性のためのhphＩ遺伝子を担持する。pBIN19誘導体によりすでに形質転換されたプラスミドは、新たな形質転換及び選択を行うことを可能にするために、プラスミドの使用を必要とする。本明細書に記載する方法により実施例１に記載の断片Ａ及びＣが与えられたpBIN19-HYG の誘導体を用いてプラスミドp35SH-anti-Dを調製した。これはプラスミドpBIN19 -HYG-AC を産生した。不均化酵素のコード領域をコピーするためのポリメラーゼ連鎖反応の生成物を KpnＩ及び SmaＩにより開裂せしめ、pBIN19-HYG-ACの KpnＩ及び SmaＩ開裂部位間に連結することによりプラスミドp35SH-anti-Dを得た（図２を参照のこと）。このものは、実施例１に記載されたプラスミドp35S-anti-BEと同様、pBIN19-HYG-AC のポリリンカーに挿入された３個の断片Ａ，Ｂ及びＣから成る。断片Ａ及びＣは実施例１における対応する断片と同一であり、そして断片Ｂはソラヌム・ツベロスムの不均化酵素のヌクレオチド1777-303を含んで成る（Takahaら、1993）。実施例３．バイナリープラスミドp35SH-anti-BE の作製枝つくり酵素をコードする3047bpの挿入部を有する他のクローンBE７を、実施例１に記載したようにして、発現ベクターλZAP II (Kossmannら、Mol．Gen．Ge net．230，39-44)中に挿入されたポテト塊茎組織からのcDNAから単離した。実施例１及び２に記載したように、このcDNAをＢ断片としてベクターpBIN19-H YG-AC に、35Ｓプロモーターに対してアンチセンス配向に挿入した。枝つくり酵素をコードするcDNAをBE７クローンから、3068bpの SmaＩ／HindIII断片として単離した。大腸菌からのDNA ポリメラーゼのKlenow断片により、HindIIIオーバーラップ末端のフィルインの後、この断片を、実施例２に記載の誘導体pBIN19-H YG-AC の SmaＩ開裂部位に連結した。生じたプラスミドp35SH-anti-BEを図３に示す。実施例４．バイナリープラスミドp35S-anti-D の作製実施例２と同様にして、不均化酵素をコードする前記のPCR 断片を断片Ｂとして、実施例１に記載のベクターpBIN19−ACに、35Ｓプロモーターに関してアンチセンス配向で挿入した。生ずるプラスミドp35S-anti-D を図４に示す。実施例５．バイナリープラスミドp35S-anti-D-anti-BE の作製枝つくり酵素をコードする実施例３記載の挿入部を3031bpの NotＩ断片（断片Ｄ）として、実施例４に記載のプラスミドp35S-anti-D に、35Ｓプロモーターに関してアンチセンス配向に挿入した。DN A ポリメラーゼＩのKlenow断片による NotＩ開裂末端のフィルインの後、断片を、SmaＩにより開裂せしめたプラスミドp35S-anti-Dに挿入した。得られるp35S-a nti-BEを図５に示す。実施例６．バイナリープラスミドによるアグロバクターツメファシエンス、及び形質転換されたアグロバクテリアによる植物の遺伝的修飾アグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換するため、実 1988，Nucl，Acids．Res．16，9877）の方法を用いて直接形質転換により細胞に導入した。形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドDNA をBirmboimら ( 1979，Nucl，Acids．Res．７，1513-1523)の方法により単離し、そして適当な制限酵素開裂の後、ゲル電気泳動により分析した。形質転換後に実施例１〜５に記載のバイナリープラスミドの一体性 (integrity)が制限酵素分解分析により同定されたアグロバクテリウムを用いてポテト植物の遺伝的修飾を行った。例えばポテト植物を形質転換するため、例えば、外科用メスで傷をつけた無菌培養物の10片の小葉を２％のシュークロースを含み、選択条件下で増殖したアグロバクテリウム・ツメファシエンスの一夜培養物30〜50μｌを含有するMS培地10 mlに入れる。３〜５分間穏和に振とうした後、ペトリ皿を25℃にて暗中でインキュベートする。２日後、前記の葉を、1.6％のグルコース、２mg／Ｌのゼアチン（Zentin）リボース、0.02mg／Ｌのナフチル酢酸、0.02mg／Ｌのジベレリン酸、 500mg／Ｌのクラホラン (claforan),50mg／Ｌのカナマイシン及び 0.8％のバクト−アガーを含有するMS培地に置く。25℃及び3000Lux にて１週間のインキュベーションの後、培地中のクラホランの濃度が半分に低下した。Rocha-Sosaら (19 89，EMBO J. 8，29)に記載されているようにして、さらなる培養を行った。本発明のDNA 配列の組合せを植物に導入するために次の３つの異る方法が選択される。ａ）１つのケースにおいては、ポテト植物を実施例１に記載のプラスミドにより形質転換した。枝つくり酵素の形成のアンチセンス阻害の成功が実施例１に記載の抗血清により容易に同定され得るからである。枝つくり酵素がもはや検出されないトランスジェニック植物をプラスミドp35SH-anti-Dによる超感染のために使用する。選択のために、次にカナマイシンの代りに３mg／Ｌの濃度のハイグロマイシンを使用する。ｂ）上記ａ）に記載した方法と同様に、逆に、ポテト植物をまず実施例３に記載のプラスミドにより形質転換し、そして不均化酵素に対する抗血清を用いて、不均化酵素の発現か大きく低下した植物を同定しそして選択する。次に、これらの植物を実施例４に記載のプラスミドにより超感染せしめた。ｃ）あるいは、ポテト植物を実施例５に記載のプラスミドp35S-anti-D-anti-B E により形質転換し、そして両蛋白質の含量が大きく低下した再生物を選択した。植物の遺伝的修飾の成功は、Ｑ及びＤ酵素の不存在について全RNA を分析することにより試験することができる。全植物RNA はLogemannら (1987，Anal．Bioc hem．163，16-20)の方法により単離される。分析のため、各場合において、50μ ｇの全RNA を、Ｑ及びＤ酵素転写物の不存在についてノーサンブロットにより試験する。このようなノーサンブロット分析の結果を図６，７及び８に示す。本発明のDNA の組合せを用いて種々の方法により形質転換された圧倒的な数のポテト植物が枝つくり酵素及び不均化酵素をコードする転写物の実質的な減少を惹起することが明らかである。トランスジェニック植物中のＱ酵素の存在を試験するために、植物組織から全蛋白質を抽出し、そして次に適当な抗血清によりウエスタンブロット分析を行った。この目的のため、SDS-PAGEにより分子量に従って蛋白質抽出物を分離する。 SDS-PAGEの後、蛋白質ゲルを黒鉛電極用移送緩衝液（48ｇ／ＬのTris，39ｇ／Ｌのグリシン、0.0375％のSDS、20％のメタノール）中で15〜30分間平衡化し、そして次に４℃にてニトロセルロースフィルター上に 1.3mA／cm² で１〜２時間移行せしめる。フィルターをTBS 緩衝液 (20mM Tris/HCl，pH7.5；500mM NaCl)中３％ゼラチンにより30分間飽和せしめる。次に、フィルターを適当な希釈（TBS 緩衝液中１：1000〜10,000）の抗血清と共に室温にて２時間インキュベートし、その後フィルターをそれぞれTBS 緩衝液、TTBS緩衝液(0.1％のソルビタンモノラウレート20EOを含有するTBS緩衝液) 及びTBS 緩衝液で15分間づつ洗浄する。洗浄後、フィルターを室温にて１時間、アルカリホスファターゼと結合したヤギ抗 −ラビット (GAR)抗体（TBS 中１：7500）と共にインキュベートする。次に、フィルターを上記のようにして洗浄し、AP緩衝液（100mM Tris/HCl，pH9.5，100mM NaCl,５mM MgCl₂）中で平衡化する。50mlの緩衝液中35μｌの５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリルホスフェート（BCIP）（ジメチルホルムアミド中50mg／ mlのBCIP）及び70μｌの４−ニトロテトラゾリウム (NBT)溶液 (70％ジメチルホルムアミド中50mg／mlのNBT)の基質添加によりアルカリホスファターゼ反応を開始する。原則として最初のシグナルは５分後に観察される。異る分岐度を有する澱粉を生産するトランスジェニックポテト植物の澱粉のアミロース／アミロペクチン含量を決定するため、直径10mmの葉片を、連続光条件下で６％シュークロース溶液上に14時間浮かべる。この光インキュベーションが該葉片中での非常に増加した澱粉生成を誘導する。インキュベーションの後、アミロース及びアミロペクチンの濃度をHovenkamp-Hermelink ら (1988，Potato Rereareh 31，241-246)の方法により決定する。分岐度（α−１，６結合の含量）、鎖長及び澱粉粒子のサイズはMorrisonら ( 1990，Methads in Plant Biochemistry，Academic Press Lmtd.,２，323-352)の方法により決定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月２１日【補正内容】請求の範囲１．DNA 配列の組合せであって、ａ）枝つくり酵素をコードする性質を有する、枝つくり酵素又はその部分のコード領域、及びｂ）不均化酵素をコードする性質を有する、不均化酵素又はその部分のコード領域、から成り、これらがそれぞれ１つのプラスミド上に位置するプロモーターにアンチセンス配向に融合しており、このプラスミドはトランスジェニック植物の植物ゲノムに導入された時、細胞中での枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転写物の合成をもたらし、分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成された澱粉とは異る修飾された澱粉の細胞内での合成をもたらすことを特徴とするDNA 配列の組合せ。２．DNA 配列の組合せであって、ａ）枝つくり酵素をコードする性質を有する、枝つくり酵素又はその部分のコード領域、及びｂ）不均化酵素をコードする性質を有する、不均化酵素又はその部分のコード領域、から成り、これらがそれぞれ別々のプラスミド上に位置するプロモーターにアンチセンス配向に融合しており、これらのプラスミドは、トランスジェニック植物の植物ゲノムに同時に又は逐次に導入された時、細胞中での枝つくり酵素及ひ不均化酵素の合成を阻害する転写物の合成をもたらし、分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成された澱粉とは異る修飾された澱粉の細胞内での合成をもたらすことを特徴とするDNA 配列の組合せ。３．枝つくり酵素及び不均化酵素のコード領域がソラヌム・ツベロサムに由来することを特徴とする、請求項１又は２に記載のDNA 配列の組合せ。４．枝つくり酵素のコード領域及び不均化酵素のコード領域かプラスミドp35S -anti-D-anti-BE (DSM 9367)上に位置することを特徴とする、請求項１又は３に記載のDNA 配列の組合せ。５．枝つくり酵素のコード領域かプラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）上に位置し、そして不均化酵素のコード領域かプラスミドp35SH-anti-D（DSM 8479）上に位置することを特徴とする、請求項２又は３に記載のDNA 配列の組合せ。６．枝つくり酵素のコード領域かプラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)上に位置し、そして不均化酵素のコード配列がプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)上に位置することを特徴とする、請求項２又は３に記載のDNA 配列の組合せ。７．まず請求項１〜６のいずれか１項に記載のDNAの組合せを植物細胞のゲノムに組み込み、そして次にこれらの形質転換された植物細胞から全体植物を再生することにより、修飾された澱粉を合成することができるトランスジェニック植物を作出する方法であって、Ａ）次の段階：ａ）下記部分配列からのDNA 配列の組合せの調製、ｉ）各場合において、植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞中でのRNA の生成を保証する１個のプロモーター、 ii）各場合において、枝つくり酵素をコードする性質を有する、枝つくり酵素又はその部分、及ひ不均化酵素をコードする性質を有する、不均化酵素又はその部分の１つのコード領域であって、非−コード鎖の転写物を形成するように、ｉ）に記載のプロモーターに融合したもの（アンチセンス融合）、及び iii）各場合において、植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ii）に記載の非−コード鎖の３’末端に３’−非翻訳配列が連結するようにii）において述べた配列に融合したもの、ｂ）トランスジェニック植物細胞の作出のための植物ゲノムへのDNA 配列の組合せの移行及び導入、並びにｃ）形質転換された植物細胞からの無傷の全体植物の再生、を含んで成る一段階法；あるいはＢ）次の段階：ａ）下記部分配列からのDNA 配列の組合せの調製：ｉ）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞でのRNA の形成を保証するプロモーター、 ii）枝つくり酵素をコードする性質を有する、枝つくり酵素又はその部分のコード領域及び不均化酵素をコードする性質を有する、不均化酵素又はその部分のコード領域の融合体であって、両コード領域が同じ方向（センス又はアンチセンス）に読まれるように一緒に融合しており、そして前記融合体の非コード鎖の転写物を形成するようにｉ）に記載のプロモーターに融合している（アンチセンス融合）もの、 iii）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ii）に記載の非コード鎖の３’末端に３ ’−非翻訳配列が結合するようにii）に記載の配列に融合しているもの、ｂ）トランスジェニック植物細胞の作出のための植物ゲノムへのDNA 配列の組合せの移送及び導入、並びにｃ）前記形成転換された植物細胞への無傷の全体植物の再生、を含んで成る一段階法；あるいはＣ）まず、下記部分配列： iv）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞中でのRN A の生成を保証するプロモーター、ｖ）枝つくり酵素をコードする性質を有する、枝つくり酵素のコード領域であって、非コード鎖の転写物を形成するようにiv）に記載のプロモーターに融合したもの（アンチセンス融合）、及び vi）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ｖ）に記載した非コード鎖の３’末端に３ ’−非翻訳配列が連結するようにｖ）に記載の配列に融合したもの、から成る配列を、植物細胞のゲノムに移送しそして導入し、こうして遺伝的に修飾された植物細胞から全体植物を再生せしめ、そして次に、この遺伝的に修飾された植物の細胞での形質転換の反復により、次の部分配列： vii）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞でのRNA の生成を保証するプロモーター、 viii）不均化酵素をコードする性質を有する、不均化酵素又はその部分のコード領域であって、非コード鎖の転写物を生成するようにvii）に記載のプロモーターに融合したもの、及び ix）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、viii）に記載した非コード鎖の３’末端に３’−非翻訳配列が連結するようにviii）に記載の配列に融合したもの、から成る他のDNA 配列を植物細胞のゲノムに移送しそして導入し、そして最後に、前記両方のコード領域又はその部分を含有する前記のようにして形質転換された植物細胞を再度全体植物に再生せしめることを含んで成る二段階法；あるいはＤ）前記Ｃ）において記載した二段階法であって、ｖ）に記載のコード領域が枝つくり酵素をコードしないで不均化酵素をコードしており、そしてviii）に記載のコード領域が不均化酵素をコードしないで枝つくり酵素をコードしていることを特徴とする方法。８．前記ｉ），iv）又はvii）に記載のプロモーターがカリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。９．前記ｉ），iv）又はvii）に記載のプロモーターがソラヌム・ツベロスムのパタチン（panatine）遺伝子のＢ33プロモーターであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 10．変法Ｃ）及びＤ）の場合、プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）とp35SH- anti-D（DSM 8479）、又はp35SH-anti-BE（DSM 9366）とp35S-anti-D (DSM 9365 )、あるいはこれらの誘導体を使用してDNA の組合せを細胞に導入することを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。 11．変法Ｂ）の場合、プラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367)、又はそれらの誘導体を用いてDNA の組合せを細胞に導入することを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。 12．請求項１〜６に記載のDNA 配列の組合せを含有する植物細胞。 13．分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成された澱粉とは異る修飾された澱粉を合成する植物の作出のための、請求項12に記載の植物細胞の使用。 14．分岐度及びリン酸含量の点で細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を合成することを特徴とする、請求項７〜11のいずれか１項に記載の方法により得られることを特徴とする、澱粉生産性トランスジェニック植物。 15．ポテト、生産性植物であることを特徴とする、請求項14に記載の澱粉生産性植物。 16．分岐度及びリン酸含量に関して、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を合成する植物の作出のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のDNA 配列の組合せの使用。 17．分岐度及びリン酸含量に関し細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を細胞内で生産するために植物細胞を形質転換するための、プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）とp35SH-anti-D（DSM 8476）、又はp35S-anti-D (D SM 9365)とp35SH-anti-BE(DSM 9366)の組合せの使用。 18．分岐度及びリン酸含量に関し、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を細胞中で生成させるための植物細胞の形質転換のためのプラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367)の使用。 19．分岐度及びリン酸含量に関して、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る、請求項14又は15に記載の植物から単離されうる修飾された澱粉。 20．分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成される澱粉とは異る、請求項20に記載の植物細胞から単離しうる修飾された澱粉。 21．食品及び工業製品の製造のための、請求項19又は20に記載の澱粉の使用。 22．プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）と組合せたプラスミドp35SH-anti-D （DSM 8479）。 23．プラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)と組合せたプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)。 24．プラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM-9367)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．DNA 配列の組合せであって、ａ）枝つくり酵素又はその部分のコード領域、及びｂ）不均化酵素又はその部分のコード領域、から成り、これらがそれぞれプロモーターにアンチセンス配向に融合しており、トランスジェニック植物の植物ゲノムへの導入の後、それらの転写が細胞中での枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転写物を生産し、特に分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成された澱粉とは異る修飾された澱粉の細胞内での合成をもたらすことを特徴とするDNA 配列の組合せ。２．枝つくり酵素及び不均化酵素のコード領域がソラヌム・ツベロサムに由来することを特徴とする、請求項１に記載のDNA 配列の組合せ。３．枝つくり酵素のコード領域がプラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）上に位置し、そして不均化酵素のコード領域がプラスミドp35SH-anti-D（DSM 8479）上に位置し、これらのプラスミドは、トランスゲニック植物中の植物ゲノムに同時に又は逐次に導入された場合、細胞中での枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転写物の合成をもたらし、特に分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉の細胞中での合成をもたらすことを特徴とする、請求項１及び２に記載のDNA 配列の組合せ。４．枝つくり酵素のコード領域がプラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)上に位置し、そして不均化酵素のコード配列がプラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)上に位置し、これらのプラスミドはトランスジェニック植物中の植物ゲノムに同時に又は逐次に導入された場合、細胞内での枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転写物の合成をもたらし、特に分岐度及びリン酸含量に関し、細胞中で天然に合成された澱粉とは異る修飾された澱粉の細胞中での合成をもたらすことを特徴とする請求項１及び２に記載のDNA 配列の組合せ。５．枝つくり酵素のコード領域及び不均化酵素のコード領域がプラスミドp35S -anti-D-anti-BE (DSM 9367)上に位置し、このプラスミドはトランスジェニック植物中の植物ゲノムに導入された場合、細胞中での枝つくり酵素及び不均化酵素の合成を阻害する転写物の合成をもたらし、特に分岐度及びリン酸含量に関して、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉の合成をもたらすことを特徴とする、請求項１及び２に記載の方法。６．まず請求項１〜５に記載のDNA の組合せを植物細胞のゲノムに組み込み、そして次にこれらの形質転換された植物細胞から全体植物を再生することにより、修飾された澱粉を合成することができるトランスジェニック植物を作出する方法であって、Ａ）次の段階：ａ）下記部分配列からのDNA 配列の組合せの調製、ｉ）各場合において、植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞中でのRNA の生成を保証する１個のプロモーター、 ii）各場合において、枝つくり酵素又はその部分、及び不均化酵素又はその部分の１つのコード領域であって、非−コード鎖の転写物を形成するように、ｉ）に記載のプロモーターに融合したもの（アンチセンス融合）、及び iii）各場合において、植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ii）に記載の非−コード鎖の３’末端に３’−非翻訳配列が連結するようにii ）において述べた配列に融合したもの、ｂ）トランスジェニック植物細胞の生産のための植物ゲノムへのDNA 配列の組合せの移行及び導入、並びにｃ）形質転換された植物細胞からの無傷の全体植物の再生、を含んで成る一段階法；あるいはＢ）次の段階：ａ）下記部分配列からのDNA 配列の組合せの調製：ｉ）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞でのRNA の形成を保証するプロモーター、 ii）枝つくり酵素又はその部分のコード領域及び不均化酵素又はその部分のコード領域の融合体であって、両コード領域が同じ方向（センス又はアンチセンス）に読まれるように一緒に融合しており、そして前記融合体の非コード鎖の転写物を形成するようにｉ）に記載のプロモーターに融合している（アンチセンス融合）もの、 iii）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ii）に記載の非コード鎖の３’末端に３ ’−非翻訳配列が結合するようにii）に記載の配列に融合しているもの、ｂ）トランスジェニック植物細胞の製造のための植物ゲノムへのDNA 配列の組合せの移送及び導入、並びにｃ）前記形成転換された植物細胞への無傷の全体植物の再生、を含んで成る一段階法；あるいはＣ）まず、下記部分配列： iv）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞中でのRN A の生成を保証するプロモーター、ｖ）枝つくり酵素のコード領域であって、非コード鎖の転写物を形成するようにiv）に記載のプロモーターに融合したもの（アンチセンス融合）、及び vi）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、ｖ）に記載した非コード鎖の３’末端に３ ’−非翻訳配列が連結するようにｖ）に記載の配列に融合したもの、から成る配列を、植物細胞のゲノムに移送しそして導入し、こうして遺伝的に修飾された植物細胞から全体植物を再生せしめ、そして次に、この遺伝的に修飾された植物の細胞での形質転換の反復により、次の部分配列： vii）植物中で活性であり、そして意図される標的組織又は標的細胞でのRNA の生成を保証するプロモーター、 viii）不均化酵素又はその部分のコード領域であって、非コード鎖の転写物を生成するようにvii）に記載のプロモーターに融合したもの、及び ix）植物細胞中で転写の終止及びRNA の３’末端へのポリ−Ａ残基の付加をもたらす３’−非翻訳配列であって、viii）に記載した非コード鎖の３’末端に３’−非翻訳配列が連結するようにviii）に記載の配列に融合したもの、から成る他のDNA 配列を植物細胞のゲノムに移送しそして導入し、そして最後に、前記両方のコード領域又はその部分を含有する前記のようにして形質転換された植物細胞を再度全体植物に再生せしめることを含んで成る二段階法；あるいはＤ）前記Ｃ）において記載した二段階法であって、ｖ）に記載のコード領域が枝つくり酵素をコードしないで不均化酵素をコードしており、そしてviii）に記載のコード領域が不均化酵素をコードしないで枝つくり酵素をコードしていることを特徴とする方法。７．前記ｉ），iv）又はvii）に記載のプロモーターがカリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。８．前記ｉ），iv）又はvi）に記載のプロモーターがソラヌム・ツベロスムのパタチン（panatine）遺伝子のＢ33プロモーターであることを特徴とする請求項６に記載の方法。９．変法Ｃ）及びＤ）の場合、プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）とp35SH- anti-D（DSM 8479）、又はp35SH-anti-BE（DSM 9366）とp35S-anti-D (DSM 9365 )、あるいはこれらの誘導体を使用してDNA の組合せを細胞に導入することを特徴とする請求項６及び７に記載の方法。 10．変法Ｂ）の場合、プラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM 9367)、又はそれらの誘導体を用いてDNA の組合せを細胞に導入することを特徴とする、請求項６及び７に記載の方法。 11．請求項１〜５に記載のDNA 配列の組合せを含有する植物細胞。 12．特に分岐度及びリン酸含量の点で細胞中で天然に合成された澱粉とは異る修飾された澱粉を合成する植物の作出のための、請求項11に記載の植物細胞の使用。 13．特に分岐度及びリン酸含量の点で細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を合成する、請求項６〜10に記載の方法により得られるトランスジェニック植物。 14．ポテト、生産性植物である、請求項13に記載の植物。 15．特に分岐度及びリン酸含量に関して、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を合成する植物の作出のための、請求項１〜５に記載のDNA 配列の組合せの使用。 16．特に分岐度及びリン酸含量に関し細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を細胞内で生産するために植物細胞を形質転換するための、プラスミドp35S-anti-BE（DSM 6144）とp35SH-anti-D（DSM 8476）、又はp35S-anti-D (DSM 9365)とp35SH-anti-BE (DSM 9366)との組合せの使用。 17．特に分岐度及びリン酸含量に関し、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る修飾された澱粉を細胞中で生成させるための植物細胞の形質転換のためのプラスミドp35S-anti-D-anti-BE（DSM 9367）の使用。 18．特に分岐度及びリン酸含量に関して、細胞中で天然に合成される澱粉とは異る、請求項13及び14に記載の植物から単離されうる修飾された澱粉。 19．特に分岐度及びリン酸含量に関して細胞中で天然に合成される澱粉とは異る、請求項19に記載の植物細胞から単離しうる修飾された澱粉。 20．食品及び工業製品の製造のための、請求項18及び19に記載の澱粉の使用。 21．プラスミドp35SH-anti-D（DSM 8479）。 22．プラスミドp35S-anti-D (DSM 9365)。 23．プラスミドp35SH-anti-BE (DSM 9366)。 24．プラスミドp35S-anti-D-anti-BE (DSM-9367)。