JPH09502873A

JPH09502873A - 薬物結合タンパク質

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Publication number: JPH09502873A
Application number: JP7509390A
Authority: JP
Inventors: リー，ジョン・シー; アダムス，ジェリー・エル; ギャラガー，ティモシー・エフ; グリーン，デイビッド・ダブリュー; ヘイズ，ジョン・リチャード; マクドネル，ピーター・シー; マクナルティ，ディーン・イー; ストリクラー，ジェームズ・イー; ヤング，ピーター・アール
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 1997-03-25
Anticipated expiration: 2018-02-17
Also published as: US5955366A; US5871934A; JP3377529B2; WO1995007922A1; CA2171982A1; GR3032635T3; HK1012399A1; DK0724588T3; DE69421624T2; EP0724588A4; ES2140561T3; CN1134704A; PT724588E; CN1048731C; EP0724588A1; CA2171982C; AU686669B2; NZ274063A; US5777097A; AU7798594A

Abstract

(57)【要約】本発明は、薬物結合タンパク質、それをコードする遺伝子および薬物をスクリーニングするための検定および方法に関する。より詳細には、本発明は、サイトカイン抑制抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）結合タンパク質、それをコードする遺伝子およびこの薬物群の薬物の評価および特徴づけに有用な検定およびスクリーニングに関する。

Description

【発明の詳細な説明】薬物結合タンパク質発明の分野本発明は、薬物結合タンパク質、それをコードする遺伝子、および薬物をスクリーニングするための検定法および方法に関する。より詳細には、本発明は、サイトカイン抑制抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）結合タンパク質、それをコードする遺伝子、およびこの薬物群の薬物の評価および同定に有用な検定法およびスクリーニングに関する。発明の背景サイトカインは、炎症および他の免疫機能における細胞応答の制御において重要な役割を果たしている。なかでも特に興味深いのは、炎症反応カスケードの初期段階に関与する細胞内タンパク質でありサイトカインであるインターロイキン −１（ＩＬ−１、αおよびβ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、αおよびβ）である（アライ（Ａrai）、Ann．Rev．Biochem．59: 783-836(1990)）。そこで、最近、炎症性刺激に応答するＩＬ−１およびＴＮＦの生産の阻害に相当な量の研究がなされてきている。１つの治療的アプローチとしては、転写および／または翻訳および／または分泌のレベルでのＩＬ−１およびＴＮＦの生産の抑制などが挙げられる。ある種のピリジニルイミダゾールに関連する活性は、「ＣＳＡＩＤ」（すなわち、サイトカイン抑制抗炎症薬（Cytokine Suppressing Anti-Inflammatory Drugs）、図１）と称される一群の化合物に結び付いた。これらの化合物は、主に転写レベルでＩＬ−１およびＴＮＦの発現を抑えるようである（ただし、転写に対するより弱い影響も観察されているが他の段階に対する影響は除外され得ない）。ピリジニルイミダゾールである５−(４−ピリジル)−６(４−フルオロフェニル)−２,３−ジヒドロイミダゾ(２,１−ｂ)チアゾール（ＳＫ＆Ｆ８６００２）が標準的なＣＳＡＩＤとして同定されている。その活性の基礎は既に確立され特徴づけられている（リー（Lee）ら、Int'l．J．Immunopharm．10(7): 835-843(1 9 88)）；Agents and Actions 27(3/4): 277-279（1989）およびInt'l．J．Immuno ther．6(1): 1-12(1990)）。ＳＡＲの研究（本明細書中で議論されるもの）は、ピリジニルイミダゾールのサイトカイン抑制作用が、そのエイコサノイドおよびロイコトリエン生産に対する阻害作用から独立した独特の活性を示すことを示唆する。しかしながら、初期の一連の化合物には、サイトカイン抑制活性に選択的であるものも特に著効なものもなかった。ＣＳＡＩＤは実際に新規抗炎症治療剤となり得るため、その作用機構を分子レベルで特徴づけること、および選択性および効力の増大した化合物を得ることは特に興味深い。特に、ＣＳＡＩＤ分子標的の同定および特徴づけは、炎症に関与する生化学的過程の理解を増し、より強力な抗炎症薬を設計およびスクリーニングする助けとなるであろう。本発明は、とりわけ、かかるＣＳＡＩＤ結合タンパク質（ＣＳＢＰ）の精製および特徴づけを開示する。例えば本明細書中に開示する特定の配列の本発明のＤＮＡは、それらが、新規ＣＳＢＰの発現に必要な遺伝情報をコードする点において有用である。また、該配列は、ＣＳＢＰ群に追加されるいずれかの化合物を単離および同定するために、あるいは、ＣＳＢＰ遺伝子の変則的発現により特徴づけられる病態のアンチセンス療法の基礎を築くためにプローブとして使用してもよい。該新規タンパク質自体は、治療剤または診断剤、およびＣＳＡＩＤ結合活性のアンタゴニストまたはアゴニストである化合物のスクリーニング系の成分として直接有用である。また、該タンパク質は、上記診断、治療およびスクリーニングへの適用に有用な抗体の異種における生産を誘導するのに有用である。これらの用途および本明細書中に記載の試薬のための追加的用途は、本明細書を読めば当業者に明らかとなるであろう。発明の簡単な記載本発明は、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ並びにそのアンチセンスアナログおよび生物学的に活性で診断的または治療的に有用なその断片を含む、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。また、本発明は、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質またはペプチドの組換え生産における試薬として有用なクローニングおよび発現プラスミドのような組換えベクター、および、核酸配列をコードするＣＳＢＰよりなる組換え原核および／または真核宿主細胞を提供する。また、本発明は、公知リガンドに対する同定されるべきリガンドの結合を測定することによる、ＣＳＢＰに結合する能力を有するリガンドの同定法を提供する。また、本発明は、ＣＳＢＰと相互作用し結合する化合物を同定するための薬物のスクリーニング法を提供する。該結合タンパク質は、溶液中の単離形態であってもよいし、固定化形態であってもよい。あるいは、ファージ表示系におけるような、または融合タンパク質のような組換え宿主細胞の表面上で発現するように遺伝的に改変されていてもよい。あるいは、スクリーニングプロトコルにおいて、該ＣＳＢＰよりなる全細胞または細胞質ゾル画分を使用してもよい。結合タンパク質の形態にかかわらず、複数の化合物を、化合物／結合タンパク質複合体を形成するのに十分な条件下で該結合タンパク質と接触させ、上記複合体を形成、増強または阻害する能力を有する化合物を検出する。また、本発明は、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質様配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子よりなる核酸プローブを提供する。また、本発明は、ＣＳＢＰをコードするmＲＮＡと結合して該mＲＮＡの翻訳を阻害する能力を有する配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ＣＳＢＰをコードする核酸分子よりなる、あるいはこれを欠くトランスジェニック非人間動物を提供する。また、区別の目安となる結合タンパク質発現、変異およびＳＡＲ評価のための並びにリガンドおよび薬物スクリーニングにおけるモデルとしての上記トランスジェニック動物の使用方法を提供する。また、本発明は、ＣＳＡＩＤ結合ドメインおよび分析的に検出可能な信号を与える能力を有する結合タンパク質／リガンド結合指示ドメインよりなる融合タンパク質を提供する。また、検出可能な信号を形成、増強または阻害することによる薬物のスクリーニング法を提供する。また、本発明は、化合物のＣＳＡＩＤ結合タンパク質に対する結合に反応して検出可能な信号を与える能力を有する第２成分と結合したＣＳＡＩＤ結合タンパク質を表面上に発現する組換え宿主細胞を提供し、化合物の該結合タンパク質に対する結合を許容するのに十分な条件下で複数の候補化合物を上記宿主細胞と接触させ、上記第２成分により発生した信号を検出することにより、結合能を有するそれらの化合物を同定することを特徴とする、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質に結合する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。図面の簡単な記載図１は、ＴＨＰ.１細胞およびヒト単球におけるＩＬ−１βの生合成についてのピリジニルイミダゾールＣＳＡＩＤのＩＣ₅₀の相関関係を示す。ＩＬ−１またはＴＮＦの阻害についてのＩＣ₅₀に関する５０以下の化合物のLog-Logスキャタープロットを得た。退縮分析を行った。相関係数は０.８８１である。図２は、完全ＴＨＰ.１細胞における³Ｈ−化合物Ｉの時間依存的および可逆的取り込みを示す。二百万のＴＨＰ.１細胞を単独で（適当な溶媒制御）または過剰な非放射能標識されたリガンド（５０nＭ）化合物Ｉ（四角）および化合物Ｖ１１１（三角）の存在あるいは非存在（０−０）下の放射能標識化合物Ｉ（５０ nＭ）と共にインキュベートした。種々の間隔をおいて、８％ショ糖クッション上で細胞を遠心分離し、シンチレーション計数することにより、放射能について該細胞ペレットを評価した。１５分で飽和可能な結合が得られた。図３は、結合活性の細胞下局在性を示す。５０nＭ放射能標識化合物Ｉと共に一億個のＴＨＰ.１細胞を２２℃で３０分間インキュベートした。ドウンス（dou nce）ホモジナイゼーションにより該細胞を破裂させた。分画遠心法により細胞ライゼートを核、粒子および可溶性画分に分画した。放射能活性の大部分は、細胞質ゾル画分に関連していた。前もって分画した試料を用いる結合検定においても同じ結果を得た。図４は、ＴＨＰ.１細胞質ゾルによる化合物Ｉ結合の結合等温線およびスキャチャードプロット分析を示す。粗製ＴＨＰ.１細胞質ゾルを用いる結合検定において、一定の過剰の冷リガンド（５０μＭ）の存在下で放射能標識化合物（０〜１μＭ）の滴定を行った。該特異的結合は飽和し得る。スキャチャードプロット分析は、３.６nＭのＫd、５pmol／mgタンパク質のＢmaxおよび単一部位結合を示した。図５は、ＣＳＡＩＤ結合活性の特異性を示す。放射能標識化合物Ｉを使用する競合的結合検定において、サイトカイン合成阻害についての公知のＩＣ₅₀を有する３個の異なる構造群に及ぶ多数のピリジニルイミダゾール化合物を試験した。２つの活性の間に高度の相関があった（Ｒ＝０.８８９）が、これは結合事象がサイトカイン生産の阻害に必要な段階であることを示唆する。図６は、ＣＳＡＩＤの位置選択性を示す。バイオアッセイおよび競合的結合検定において、ＣＳＡＩＤの４対の位置異性体を試験した。各対の１個の異性体のみが活性であり、両検定において同じＩＣ₅₀を有していた。図７は、放射能標識ＳＢ２０２１９０の結合が飽和し得、特異的で可逆的であることを示す。ＴＨＰ.１細胞質ゾルを５０nＭ放射能標識ＳＢ化合物Ｉと共に１５分間インキュベートして、飽和し得る結合を平衡化し、この時点で３０μＭの該冷リガンドを加え、種々の間隔をおいて特異的結合を測定した。該結合は化合物ＶＩＩにより、およびより低度であるが化合物ＸＩにより可逆的であり、化合物ＶＩＩＩでは全く可逆的ではなかった。バイオアッセイにおけるこれらの化合物のＩＣ₅₀は、それぞれ２０nＭ、５０nＭおよび＞５μＭであった。図８は、ＣＳＡＩＤ結合活性がプロテアーゼであり、熱感受性であることを示す。ＴＨＰ.１細胞質ゾルをトリプシン(１００μg／ml)(パネルＡ)および熱(５６℃)(パネルＢ)処理に付した。結合活性の最大消失はトリプシンによる処理後２分以内に得られた。５６℃でインキュベーション後に該結合活性を消失させ、３７℃で少しずつの喪失を示し、２２℃および４℃で比較的安定だった。図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによるＣＳＢＰの光親和性標識の分析を示す。約４０μgのタンパク質を、¹²⁵Ｉ化合物ＩＶ（２.５n Ｍ）による光親和性標識の前に１０μＭで該ゲルの上に載せた阻害剤と共に前インキュベートした。本明細書中に記載のとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより該反応を分析した。図１０は、プレパラティブ等電点電気泳動からの画分のその分析を示す。¹²⁵ Ｉ化合物ＩＶで標識したタンパク質を、本明細書に記載の通り、ライニン(Rainin) ＲＦ３に適用し分析した。図１１は、（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色、および（Ｂ）放射能による、プレパラティブＳＤＳ−ＰＡＧＥ画分の分析を示す。本明細書に下記するとおり、画分を分析した。図１２は、ＭＡＰキナーゼに対するＣＳＢＰの分析の間に見いだされたユニークアミノ酸配列の相同性を示す。該ペプチド配列を、１５残基のＭＡＰキナーゼの直線表示の下に示す（９同一（６０％）、１３同一または相同（８７％））。図１３は、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質の１部分の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。図１４は、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質の第２部分の核酸配列を示す。図１５は、本明細書に記載の種々のＣＳＢＰ cＤＮＡを図示する。図１６は、本明細書に記載のＣＳＢＰの１つのcＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１７は、ＣＳＢＰ−１とＣＳＢＰ−２との間のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の相違を示す。図１８は、種々のプロテインキナーゼの系統樹を示す。図１９は、ＣＳＢＰ−１およびＣＳＢＰ−２のアミノ酸配列を、該プロテインキナーゼファミリーの選択物と共に並べたものを示す。図２０は、イー・コリ（Ｅ．coli）におけるＣＳＢＰの発現の結果を示す。図２１は、ＣＳＢＰ−１ cＤＮＡの全長核酸配列を示す。図２２は、ＣＳＢＰ−２ cＤＮＡの全長核酸配列を示す。発明の詳細な記載本発明をさらに詳細に説明するにあたって以下の追加的語句を用いるが、これらは以下のとおりに定義される。「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して体液性および／または細胞性抗原特異的応答を起こす１以上のエピトープを含有する分子を意味する。また、この語は、本明細書中、「免疫原」と互換的に使用する。「エピトープ」なる語は、特異的抗体分子が結合する抗原またはハプテン上の部位を意味する。また、この語は、本明細書中、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に使用する。「融合タンパク質」は、少なくとも２個の作動的に結合した異種コーディング配列の発現から生じたタンパク質である。ＣＳＡＩＤ結合タンパク質またはその断片および第２非関連ペプチド配列よりなるタンパク質は、融合タンパク質の一例である。ＲＮＡポリメラーゼが２個のコーディング配列を単一のmＲＮＡに転写し、ついで該ＲＮＡが両コーディング配列由来のアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される場合、コーディング配列はもう１つのコーディング配列に「作動的に結合している」。発現される配列が結局加工されて所望のタンパク質を生成する限り、該コーディング配列は互いに隣接している必要はない。「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により生産された、すなわち、所望のポリペプチドをコードする外性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生産されたポリペプチドを意味する。「合成」ポリペプチドは、化学合成により製造されたものを意味する。「レプリコン」は、インビボのＤＮＡ複製の自律性単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製する能力を有する、いずれかの遺伝要素（例、プラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、もう１つのＤＮＡ断片が結合して該結合断片の複製を起こすプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。「２本鎖ＤＮＡ分子」は、リラックスおよびスーパーコイル両方の２本鎖らせん中のデオキシリボヌクレオチド（塩基アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態を意味する。この語は、該分子の１次および２次構造のみを指し、いずれかの個々の３次形態に限定するものではない。したがって、この語は、とりわけ直線ＤＮＡ分子（例、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中に見いだされる２本鎖ＤＮＡを包含する。本明細書における個々の２本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論においては、ＤＮＡの非転写鎖に沿った５'から３'方向の配列（すなわち、mＲＮＡと相同な配列を有する鎖）のみを与える通常の取り決めに従い、配列が記載されているかもしれない。個々のタンパク質の「配列をコードする」ＤＮＡまたは個々のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、転写され、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３' 方向）のコーディング配列の転写を開始する能力を有するＤＮＡ調節領域である。本発明の定義において、該プロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開始コドン（例、ＡＴＧ）により３'末端で結合し、上流（５'方向）へ伸長して、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。該プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより便宜に定義される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を起こすタンパク質結合ドメイン（共通配列）が見いだされる。真核プロモーターは、しばしば（しかし常にではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有するであろう。原核プロモーターは、１０および３５個の共通配列に加え、シャイン・ダルガルノ配列を含有する。ＤＮＡ「制御配列」は、一括して宿主細胞中のコーディング配列の発現（すなわち、転写および翻訳）に備える、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを総称する。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、該コーディング配列をmＲＮＡ（該mＲＮＡは、ついで、コーディング配列にコードされたポリペプチドに翻訳される）に転写する場合に、宿主中でコーディング配列の「発現を指令する」。「宿主細胞」は、外性ＤＮＡ配列により形質転換またはトランスフェクションされている、あるいは形質転換またはトランスフェクションされ得る細胞である。外性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞は該外性ＤＮＡにより「形質転換」されている。外性ＤＮＡは、細胞のゲノムを形成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合される）ていてもよいし、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物および酵母においては、外性ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム因子上に維持されていてもよい。真核細胞に関しては、安定して形質転換またはトランスフェクションされる細胞は、外性ＤＮＡが染色体に組み込まれて、染色体の複製を通じて娘細胞により受け継がれるようになったものである。この安定性は、外性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団よりなる細胞系またはクローンを樹立する真核細胞の能力により示される。「クローン」は、単一の細胞または共通の祖先から有糸分裂により誘導された細胞の集団である。「細胞系」は、インビトロで多世代にわたって安定に増殖する能力を有する１次細胞のクローンである。ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも８５％（好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）が該分子の一定の長さにわたり対合する場合、２個のＤＮＡまたはポリペプチド配列は「実質的に相同」または「実質的に同一」である。本明細書で使用するとおり、実質的相同は、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列との同一性を示す配列をも意味する。実質的に相同なＤＮＡ配列は、その特定の系について定義される通りの例えば緊縮条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適当なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該分野における技術の範囲内である。例えば、「カーレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Pro tocols in Mol．Biol.)」(Vol．I＆II，Wiley Interscience．Ausbel，et al.(ed .)(1992))を参照されたし。実質的に同一なタンパク質配列は、タンパク質加水分解消化、ゲル電気泳動およびミクロシークエンシングにより同定され得る。ＣＳＢＰに関しての「機能的に等価」なる語は、対象タンパク質のアミノ酸配列が、本明細書に開示するＣＳＡＩＤ結合活性を示すものである意である。ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然で一方の分子と結合していることが見いだされていない他方のＤＮＡ分子内の、あるいはそれに結合したＤＮＡの同定可能なセグメントである。したがって、異種領域が受容体遺伝子をコードする場合、該遺伝子は、通常、起源動物のゲノム中の該遺伝子と隣接していないＤＮＡと隣接している。異種コーディング配列のもう１つの例は、コーディング配列自体が天然には見いだされない構築物（例、天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異、代替的スプライシングまたは天然に存在する変異事象は、本明細書中に記載のとおり、ＤＮＡの異種領域を生じさせない。分子試薬の開発放射能リガンド合成本発明のＣＳＢＰを単離および精製するためには、まず、幾つかの標識分子試薬を得ることが必要だった。代替的な放射能リガンドとして、フェノール性トリアリールイミダゾールである化合物Ｉを選択した。それがナノモルの効力であり、また、放射能標識化合物の合成がトリチウムガスの存在下で対応するアリールブロミドの接触還元により比較的容易だからである。以下の反応プロトコルに従い、化合物Ｉを製造した。４−(フルオロフェニル)−２−(４−ヒドロキシフェニル−３,５−ｔ₂)−５−( ４−ピリジル)イミダゾール（化合物Ｉ）の製造２(３,５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル)−４−(４−フルオロフェニル )−５−(４−ピリジル)イミダゾール、化合物Ｉ(p)、の２.９mg(０.００５９mmo l)を、小磁気撹拌棒のついた２.４ml丸底フラスコ中の０.９５mlの乾燥ＤＭＦおよび０.０５mlのトリエチルアミンに溶解した。５％Ｐd／Ｃ（エンゲルハードロット（Engelhard lot）２８８４５）の１.７mgを加え、該フラスコをステンレス鋼トリチウムマニホルドに結合させた。凍結−ポンプ−解凍の４サイクルにより該混合物を脱気し、ついでトリチウムガス（５.３Ｃi、０.０９１mmol）を導入した。該反応混合物を室温まで加温し、２０時間激しく撹拌した。該混合物を液体窒素中で凍結させ、残ったトリチウムガス（２.４Ｃi）を除き、フラスコをマニホルドから外した。洗浄液として３×１mlのメタノールを用いて、該反応混合物を１０ml丸底フラスコに移し、静的真空移動により該溶媒を除いた。メタノールの１.５mlを残渣に加え、ついで静的真空移動により除去した。後者の工程を繰り返した。最後に、１.５mlのエタノールに残渣を懸濁し、３×約１mlエタノール洗浄液と共にシリンジ−チップミリポアフィルター（０.４５ミクロン）により濾過した。全濾液容量は３.９ml、全放射能は９４.２mＣiと測定された。溶液は３.９ml、全放射能は９４.２mＣiと測定された。濾液のＨＰＬＣ分析（パーチジル(Partisil)５ＯＤＳ−３、内径４.６mm×２５cm、１ml／minの７０：３０：０１水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、０.７５mlセルを通すエコシント(Ecoscint)-H反応混液３ml／minでのラジオマチック・フローワン・ベータ・ラジオ・デテクター(Radiomatic Flo-One Beta radio detector)）は、化合物Ｉ（Ｒt＝６０min、全放射能の約３７％）、および化合物Ｉaのモノブロモ誘導体と思われる別個の中間体（Ｒt＝１１.min、約９％）の存在を示した。該濾液を窒素蒸気でほとんど蒸発乾固させ、１.２mlのＨＰＬＣ移動相に残渣を溶解した。下記のとおりＨＰＬＣにより該溶液を分離し、化合物ＩおよびＩa およびＳＢに対応するピークを別々に集めた。ＨＰＬＣ法カラムアルテックス・ウルトラスフィアー(Altex Ultrasphere) 内径１０mm×２５cm 移動相７０：３０：０.１水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸流速５ml／分ＵＶ検出２１０nm 注入容量０.０５〜０.４m 保持時間７.８分化合物Ｉ２４分化合物Ｉa プールした化合物Ｉ画分は合計３２mlであり、放射能濃度は１.５２mＣi／ml （合計４８.６mＣi）であった。プールしたＳＢ化合物Ｉa[³Ｈ]画分（合計１０. １mＣi）を蒸発乾固し、さらに分析するために３.８mlの無水エタノールを用いて残渣を定量的にガラスバイアルに移した。化合物Ｉの８ml（１２.２mＣi）を３５℃未満にて真空中で蒸発乾固し、ついで０.５mlの移動相に再溶解した。全容量を上記ＨＰＬＣ系に注入し、適当なピークを集めた。集めた溶出液を３５℃未満にて真空中で蒸発させ、黄色残渣を無水エタノールでバイアルに移して、化合物Ｉの溶液（３.８ml、２.４４mＣi／ml ）を得た。ＮＭＲ分析に使用するためのこの溶液の一部を、窒素蒸気を用いてまず蒸発乾固し、ついでＣＤ₃ＯＤ中に取った。４−(４−フルオロフェニル)−２−(４−ヒドロキシフェニル−３,５−ｔ₂)− ５−(４−ピリジル)イミダゾール、化合物Ｉ、の分析ＨＰＬＣによる放射化学純度方法カラムウルトラスフィアーオクチル(Ultrasphere Octyl)、５μm、４.６mm、内径×２５cm、ベックマン(Beckman) 移動相３５０：１５０：０.５（v/v/v）水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸流速１.０ml／min 質量検出２１０nmのＵＶ放射能検出ラモナー（Ramona）Ｄ放射能フロー検出器シンチレーターツル−カウント(Tru-Count)(ツル−ラブ・サプライ (Tru-Lab Supply Co.)社) 流速５.０ml／分セル容量０.７５ml 保持時間７.７分結果９８.７シンチレーション計数による放射能濃度方法シンチレーターレディー・セイフ(Ready safe)(ベックマン・インスツルメント・インコーポレーティッド (Beckman Instruments,Inc.)) 機器ＴＭ分析モデル６８８１効率クエンチ曲線からの自動ＤＰＭ計算結果２.４４mＣi／ml質量分析による比活性方法ＣＩ−ＭＳ、ＮＨ₃試薬ガス結果２０.０Ｃi／mmol ³Ｈ分布：非標識４４％一重標識４３％二重標識１３％ ³ＨＮＭＲ⁹ 方法機器ブランカー(Brunker)ＡＭ４００実験プロトンでデカップリングする³ＨＮＭＲプロトンで非デカップリングする³ＨＮＭＲプロトンで非デカップリングする³ＨＮＭＲピーク対照メタノールの溶媒ピーク ∂ ３.３溶媒メタノール−d₄ 結果トリチウムは専ら、芳香族水酸基に対してオルトの炭素原子上に取り込まれている分析要約検定結果ＨＰＬＣで測定した放射化学純度９８.７％シンチレーション計数で測定した放射能濃度２.４４mＣi／ml 質量分析により測定した比活性２０.０Ｃi／mmol³ ＨＮＭＲ推定構造と合致光親和性放射能標識リガンドさらに、光親和性放射能標識を合成した。理想的には、該放射性光親和性試薬はサブミクロモルの結合親和性、放射能標識（好ましくはガンマエミッター）の結合に便宜な部位を有すべきであり、結合部位に近い光反応性基（例、アジド）の位置づけを考慮すべきである。該光親和性試薬の候補としての化合物ＩＶの提案につながるＳＡＲ（構造活性相関）を以下の表Ｉに示す。また、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαレベルを測定するために、特異的ＥＬＩＳＡ検定を有用に用いることもできる（ＰＣＴ出願ＵＳ９３／００６７４およびＵＳ９３／００６７５を参照されたし）。放射性ヨウ化光親和性標識、化合物ＩＶ、の合成は、以下のプロトコルに従い、ヨウ化アリールのパラジウム仲介スタニル化、ついで求電子放射性ヨウ化により行った。［3ー[2-(4-アジドフェニル)-5-(4-ピリジニル)-1H-(4-ピリジニル)イミダゾール -4-イル]フェニル]フェニル]トリブチルスタンナン 4-[2-(4-アジドフェニル)-5-(3-¹²⁵ヨード-フェニル)-1H-イミダゾール-4-イル] ピリジン化合物IV ３.６０mＣi工程の記載４−[２−(４−アジドフェニル)−５−(３−¹²⁵ヨード−フェニル)−１Ｈ−イミダゾール−４−イル]ピリジンの合成および精製 [３−[２−(４−アジドフェニル)−５−(４−ピリジニル)−１Ｈイミダゾール −４−イル]フェニル]トリブチルスタンナン、化合物ＩＶ(p)(２５０μg、０.３９８μmol)、を１００μlの３％酢酸（エーテル中）に溶解した。この溶液に、１１.４μlの水中の２.８５μgのクロラミン−Ｔ水和物(０.０１３μmol)および４５μlの０.１Ｎ水酸化ナトリウム中の５.１９mＣiの[¹²⁵Ｉ]ヨウ化ナトリウムを加えた。さらに５０μlの３％酢酸（エタノール中）を加えて、該反応混合物を均一にした。該反応を室温（暗所中）で６０分撹拌した。ついで該反応に乾燥窒素蒸気を乾固するまで吹き付け、クロロホルム（１ml）と飽和水性炭酸水素ナトリウム（１ml）との間に該残渣を分配した。水層をクロロホルム（２×１ml）で抽出し、有機層を合わせ、顆粒硫酸ナトリウムを充填したピペットに通すことにより乾燥した。乾燥窒素蒸気下で溶媒を除去した。残渣は、４.３６mＣiのヨウ素−１２５を含有していることが判明した（キャピンテック(Capintec)用量測定器上で検定）。該水層は、３１０μＣiのヨウ素−１２５を含有していることが判明した。有機層からの残渣を８０μlのＨＰＬＣ移動層中に取り、９０：１０：１（v/v/v）ヘキサン／イソプロパノール／トリエチルアミンで１.５ml／分で溶出するベイカー（Baker）ＳiＯ₂カラム（５μm、内径４.６mm×２５０mm）上で精製し、２６０nmでＵＶ監視した。該生成物画分を合わせ、乾燥窒素蒸気を吹き付けて乾固させた。該生成物を３.０mlの無水エタノール中に取った。この方法により、放射化学純度９９.０％、放射能濃度１.２０mＣi／分および比活性１７３６Ｃi／mmolで３.６０mＣiの化合物ＩＶを得た。４−[２−アジドフェニル)−５−(３−ヨード−¹²⁵Ｉ−フェニル)−１Ｈ−イミダゾール−４−イル]ピリジン、化合物ＩＶ、の分析ＨＰＬＣによる放射化学純度方法カラムベイカー(Baker)、シリカ(Silica)、５μm、１２０Ａ内径４.６mm×２５cm 移動相９０：１０：１（v/v/v）ヘキサン／イソプロパノール／トリエチルアミン流速１.３ml／分質量検出２６０nmのＵＶ放射能検出検出器 β−ＲＡＭ放射能フロー検出器シンチレーターツル−カウント(Tru-Count)(ツル−ラブサプライ社 (Tru-Lab Supply Co.)) 流速５.０ml／分セルの大きさ０.８ml 保持時間１７.０分結果９９.０％ＨＰＬＣによる物質濃度ベイカー、シリカ、５μm、１２０Ａ方法カラム内径４.６×２５cm 移動相９０：１０：１（v/v/v）ヘキサン／イソプロパノール／トリエチルアミン流速１.５ml／分物質検出２６０nmのＵＶ保持時間１１.２分結果９９.０％シンチレーション計数（外部標準法）による放射能濃度方法溶媒レディー・セイフ(Ready Safe)(ベックマン(Beckman)) 機器ＴＭ分析モデル６８８１効率クエンチ曲線からの自動ＤＰＭ計算結果１.２mＣi／ml物質および放射能濃度から誘導された比活性方法質量および放射能濃度から誘導結果１７３６Ｃi／mmol分析要約検定結果ＨＰＬＣによる放射化学純度９９.０％ＨＰＬＣによる物質濃度０.３２μg／ml 放射能濃度１.２mＣi／ml 物質および放射能濃度から誘導された比活性１７３６Ｃi／mmol 光親和性標識は、競合結合検定において０.５〜０.８μＭのＩＣ₅₀およびＣＳＡＩＤバイアッセイにおいて３μＭのＩＣ₅₀を有する。ＣＳＡＩＤバイオアッセイＣＳＡＩＤ活性を評価するために使用した生物学的検定は、ＩＬ−１依存性ＥＬ−４／ＩＬ２誘導検定（サイモン，ピー・エル（Simon，P.L.）ら、J．Immuno . Meth．84: 85-94(1985)）であった。簡単にいえば、ヒト単球を、ミリリットル当たりウェル当たり１０⁶の濃度で１％ヒトＡＢ血清を含有する無ＬＰＳＲＰＭＩ１６４０培地中の２４ウェル平板中で平板培養し、３７℃で１時間付着させた。穏やかに洗浄することにより非付着性細胞を除いた。１０ng／mlで細菌リポ多糖（イー・コリ００１：Ｂ４；ディフコ(Difco)、デトロイト）を添加する０または１時間前に該細胞に試験化合物または培地を加えた。ついで、湿った５％ＣＯ₂雰囲気中３７℃で示されるとおり種々の間隔をおいて該培養をインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、培養上清を集めた。０.１５Ｍオクチル−グルコピラノシド、２５mＭヘペスおよび０.５mＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（食塩水中）を含有する緩衝液中で、残った付着単球を溶解した。上清および細胞ライゼートの双方を遠心分離により清澄化し、ＩＬ−１活性について検定した。ＩＬ−１活性は、それがＡ２３１８７イオノホアの存在下ＥＬ−４（ＡＴＣＣＴＩＢ１８１）細胞によりＩＬ−２の分泌を刺激する能力により測定した。２ ×１０^-7ＭカルシウムイオノホアＡ２３１８７の存在下、１０⁵ＥＬ−４細胞と共に試料の連続希釈物をインキュベートした。一夜インキュベートした後、各培養からの０.１mlの無細胞上清を取り、１０⁴ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２０（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ２１４）細胞と共にインキュベートした。さらに２０時間のインキュベートの後、該培養を１μＣiのトリチル化チミジンで４時間パルスした。ついで、ガラスファイバーフィルター上に収穫し、液体シンチレーション計数により放射能を測定した。ＩＬ−１活性のすべての測定は、標準と比較して行った。ＣＳＡＩＤ結合検定ＣＳＢＰの単離および生成の次の段階では、細胞に基づくＣＳＡＩＤ結合検定の開発および正当化を要した。上記のとおり、初期のＣＳＡＩＤ研究は、ヒト単球にて行った。より便宜な細胞源であるヒト単球白血病細胞系、ＴＨＰ.１（ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）を選んだ。これは、それが有する、ＩＬ−１およびＴＮＦを生成するための刺激に対する応答性およびヒト単球に匹敵するＣＳＡＩＤに対する感受性のため、機構研究のための適切な代用細胞源であることが示された（図１）。放射能標識化合物Ｉは、もとのままのＴＨＰ.１細胞により時間依存的に取り込まれた（図２）。該放射能標識の取り込みは迅速であり、３７℃にて３〜５分で最大値に達した。さらに、放射能標識の取り込みは、飽和し得るものであり、特異的であった。放射能標識リガンドをロードしたＴＨＰ．１細胞の細胞下分画においては、放射能の蓄積の優勢な細胞下部位は細胞質ゾルであることが判明した（図３）。ＴＨＰ.１からの可溶性細胞質ゾル画分および放射能標識化合物Ｉを用いて、特異的で再現可能なＣＳＡＩＤ結合検定を開発した。簡単にいえば、ＴＨＰ.１細胞質ゾルを、窒素空洞法、ついで１０Ｋ×g低速および１００Ｋ高速遠心分離により得られた細胞ライゼートから常法により調製し、その上清を細胞質ゾル画分として消化した。適当に希釈された放射能リガンドと共に、該結合が平衡になるのを許容する一定時間、室温にて、ＴＨＰ.１細胞質ゾルをインキュベートした。Ｇ−１０カラムに該試料を加え、２０mmのＴＲＮ、５０μＭ β−メルカプトエタノール、ＮaＮ₃で溶出した。空洞体積を包囲する画分を集め、液体シンチレーション計数により放射能を評価した。インキュベーション混合物中に過剰の冷リガンドが存在することにより、あるいは細胞質ゾル画分が全く存在しない場合には該放射能シグナルが終結したため、結合放射能リガンドを反映させるためにこれを測定した。より詳細には、ＣＳＡＩＤ結合検定は以下のとおりに行った。材料インキュベーション緩衝液：２０mＭトリス、１mＭＭgＣl₂、２０μＭヘペス、０.０２％ＮaＮ₃、４℃で貯蔵。溶出緩衝液：２０mＭトリス、５０μＭ２− メルカプトエタノール、ＮaＮ₃、４℃で貯蔵。Ｇ−１０セファデックス：４００ml ddＨ₂Ｏへ１００gセファデックスＧ−１０（ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン、アップザラ(Uppsala)）を加え、室温で２時間膨張させる。微粉をデカントし、３回洗浄する。ＮaＮ₃およびＱＳをddＨ₂Ｏと共に加えて５００mlにし、４℃で貯蔵する。組み立てカラム：ストローカラム、フィルターフリットおよびチップ（コノーツ（Konotes）、ＳＰ４２０１６０−０００、４２０１６２−００２）。結合反応に使用するローソーブ・チューブ（ヌンク(Nunc)）。清澄化のために１５０００rpmで５分間回転させるＴＨＰ.１細胞質ゾル。細胞の催眠薬処理および窒素中の減圧による溶解により調製されたＴＨＰ.１細胞質ゾル。分画遠心法（１０,０００gで１時間、１００,０００gで１時間）により除去された核および膜断片。化合物：非放射能化合物Ｉおよび対応するＥtＯＨ対照(インキュベーション緩衝液中で希釈)、および³Ｈ−化合物Ｉ(インキュベーション緩衝液中で希釈)方法：Ａ．カラム調製１．反応混合物の先溶出の３０分前に開始する。２．床体積１.５mlのカラムにＧ−１０スラリー３mlを加える。３．７mlの溶出緩衝液（カラムの上端に満たす）で洗浄する。４．カラムを小さくする。Ｂ．試料インキュベーション１．４℃で１５分インキュベーション。２．結合反応混合物；１００μl細胞質ゾル、１０μl冷化合物ＩまたはＥtＯＨ対照、１０μl ³Ｈ−化合物Ｉ（モル濃度は研究の性質に依る）。３．「無」対照＝細胞質ゾル調製物の代わりの１００μＬインキュベーション緩衝液。Ｃ．試料溶出１．４℃で溶出。２．全反応容量をＧ−１０カラムに加える。３．４００μl溶出緩衝液をカラムに加え、溶出液を捨てる。４．５００μlの溶出緩衝液をカラムに加え、溶出容量を２０mlシンチレーションバイアル中に集める。５．１５mlのレディー・セイフ(Ready Safe)シンチレーション流体を加える。６．ボルテックスし、液体シンチレーションカウンター中で５分間計数する。「全入力計数対照」を含む（標識リガンドの１０μl）。Ｄ．データ分析１．ＤＰＭＳを出力としてグラフ用紙にプロットし、それぞれＩＣ５０およびＫd／Ｋiの決定のための回帰分析および「ランドン（Lundon）リガンド結合」ソフトウェアにより分析する。２．ＣＳＡＩＤバイオアッセイにおける試験化合物のＩＣ５０の順位づけをし、ＣＳＡＩＤ結合検定により得られものと比較し、相関曲線を作る。さらに、該結合検定を以下の基準により正当化する。・ＴＨＰ.１細胞質ゾルは、放射能標識化合物Ｉの飽和し得る、特異的な結合を示した（図４）。・放射能標識競合結合検定においては、相当数のピリジニルイミダゾールＣＳＡＩＤを試験した。化合物の効力順序およびＩＣ₅₀は、ヒト単球バイオアッセイにより決定されたものと高い相関関係にあった（図５）。さらに、競合結合活性は、位置選択的であった（図６）。これらの結果は、これらの化合物のサイトカイン抑制作用に対する、結合検定の個々の有用性を明らかに示すものであり、ＳＡＲ開発および分子標的の解明を助ける手段の提供に特に有利だと考えられる。・結合は、ピリジニルイミダゾールＣＳＡＩＤに非常に特異的である。種々の薬理活性を有する一連の非構造的関連化合物を、該競合結合検定において試験した。それらは、特異的シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、二重ＣＯ／ＬＯ阻害剤、ＰＤＥＩＶ阻害剤、免疫抑制マクロライド、ステロイドなどを含む（表II）。１００μＭで試験した化合物で、競合結合を示すものは無かった。該競合ＣＳＡＩＤ結合検定で試験した非ピリジニルイミダゾールＣＳＡＩＤ、関連抗炎症または免疫抑制化合物の一覧を表IIに示す。特に示さない限り、１００μＭ以下では競合結合は観察されなかった。細胞源および結合活性を確認した後、ＣＳＢＰをさらに特徴づけすることにより、ＣＳＡＩＤ結合が飽和し得、特異的であり、可逆的であり（図７）、迅速なオンオフ速度に従い、結合活性はプロテアーゼおよび熱処理に対して感受性であり（図８）、タンパク質濃度依存性である（データは示していない）ことが確認された。ヒト単球におけるＣＳＡＩＤ結合活性は、上記の結合活性のための基準によっては、ＴＨＰ.１について決定したものと区別できない。結合は、最適pＨ範囲５〜８を有するpＨ依存性であり、二価の陽イオンから独立しており、可逆的な高塩濃度に敏感である。ＣＳＢＰの精製ＴＨＰ.１細胞からのＣＳＢＰの精製は、以下のとおりに行った。材料共に１９９３年１月１３日付けで出願されたＰＣＴ出願ＵＳ９３／００６７４およびＵＳ９３／００６７５に略述されている方法により、以下の化合物を合成した。放射能標識化合物ＩＩおよびＩＶは、上記のとおりに製造した。アクチン(それぞれウサギ(cat#６５−０９６)およびマウス(cat.#６９−１００))に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、ＩＣＮバイオメディカルズ（Biomed icals）から購入した。標準的な固相ＦＭＯＣ化学（例えば、フィールズ，ジー・ビー（Fields，G．B.）ら、Int'l．Peptide Protein Res．35: 161-214(1990) 参照）により、ペプチドNH₂-Ile-Thr-Ala-Ala-Gln-Ala-Leu-Ala-His-Ala-Tyr-Ph e-Ala-Gln-Tyr-Cys-COOH（配列番号１）を合成し、精製し、常法によりマレイミド活性キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)(ＫＬＨ )（ピアス・ケミカル社（Pierce Chemical Co.）、Cat#７７１０５Ａ）にカップリングさせ、ウサギに接種するのに使用した。他のすべての化学品は試薬等級であり、特に明示しない限り、特定の販売元から購入したものではない。ＴＨＰ.１細胞の増殖ＴＨＰ.１細胞を以下のとおり増殖させ、加工した。ＴＨＰ.１細胞を、２５mＭヘペス、１０％ＦＢＳ（反応器中８％）、１０mＭグルタミンおよび０.０５％プルロニックＦ−６８を有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。該細胞を平均細胞数２×１０⁶（播種密度２×１０⁵〜３× １０⁵）にて３／４日の周期で継代した。振とうフラスコ中の高密度細胞リサイクルにより細胞を大反応器にスケールアップした。この方法では、振とうフラスコの全容量を回転させ、同じ容量の新鮮な培地で再懸濁させた。したがって、播種密度は、各継代とともに増加し、より高い細胞密度／容量を与えた。該密度は６×１０⁶〜１２×１０⁶の範囲であった。該振とうフラスコから、２個のスケールアップ法を用いて、必要な容量を得た。最初は、２個の８０Ｌのアルチザン（artisan）反応器（６０Ｌの作動容量）を使用した。５日毎に、両反応器から５０Ｌを取り出し、収穫した。ついで、全必要容量に達するまで、該細胞にさらに５０Ｌを供給した。また別法として、３０Ｌのアルチザン中で細胞を増殖させ、２５０Ｌのアベック（Abec）反応器（合計作動容量は１５０Ｌであった）に播種した。５日毎に１２０Ｌを収穫し、残りの３０Ｌを再供給した。播種密度は３×１０⁵〜５×１０⁵であった。両型の反応器のpＨを７.０〜７.２に制御した。制御用の酸としてＣＯ₂を、緩衝液として炭酸水素ナトリウムを使用した。Ｄ.Ｏ.をアルチザンズ反応器のために３０％に、アベック反応器のために２０％に調整した。ＴＨＰ.１細胞質ゾルの調製２０mＭトリスＨＣl（pＨ７.４）、１mＭＭgＣl₂、１mＭＰＭＳＦ、１μＭペプスタチンＡおよび１μＭロイペプチン中で窒素キャビテーションにより細胞を溶解した。不溶物を１０,０００×gで１０分間ペレット化し、さらに４℃で１時間、１００,０００×gの遠心分離により上清を清澄化した。最終遠心分離からの上清を集めた。以下、これをＴＨＰ.１細胞質ゾルと称する。ＣＳＡＩＤ結合活性の測定同じもの（典型的には２００μgタンパク質）を、室温で６０分間、適当に希釈された³Ｈ−化合物Ｉ（５０nＭ）と共にインキュベートして、該結合を平衡にした。２０mＭトリスＨＣl（pＨ７.４）１.５mlセファデックスＧ−１０カラム上、結合リガンドから遊離リガンドを分離した。空隙容量を包囲する画分を集め、液体シンチレーション計数により放射能を評価した。ビシンコニン酸検定（ピアース（Pierce））によりタンパク質濃度を測定した。スーパーローズ１２クロマトグラフィー１０mＭＮaＰＯ₄（pＨ７.０）および１５０mＭＮaＣl中４℃で平衡化した５Ｌスーパーローズ（Superose）１２カラム（ファルマシア（Pharmacia）；１１. ５×５０cm）に、約１００〜２５０mlのＴＨＰ.１細胞質ゾルを１４.５cmh^-1で適用した。画分を集め（５０ml）、ＣＳＡＩＤ結合活性について検定した。Ｍr ５０,０００以下のタンパク質の溶出容量に対応する活性の単一のピークをプールした（２００〜５００ml）。ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー１０mＭＮaＰＯ₄（pＨ７.０）中室温で平衡化した１６０mlヒドロキシルアパタイトＨＡカラム（キャル・バイオケム（Cal．Biochem）;５.０×８.０cm）に、スーパーローズ１２カラムからの物質を３０cmh^-1で適用した。１０〜２００m ＭＮaＰＯ₄勾配にて２.５カラム体積で該カラムを溶出した。画分（３０ml）を集め、ＣＳＡＩＤ結合活性について検定した。該カラムに適用された約６０％のＣＳＡＩＤ結合活性を含有するタンパク質ピークをプールした（５０〜２５０ml）。ＣＳＢＰの放射能光親和性標識約３０mlの試料について以下のプロトコールを用いたが、これはより大きいまたはより小さい容量についても適用できる。アミコン撹拌セル(Amicon stir cel l)(ＹＭ３０膜、７０psiＮ₂)を用いて、該ヒドロキシルアパタイトのプールを約３０mlまで濃縮した。濃縮物中の不溶性物質を遠心分離（ＳＳ３４ローター中４ ℃、１０,０００×gで３０分間）により除去した。６ウェルのマイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc））中で行った標識反応において、上清（４５０mgタンパク質）を使用した。以下の試薬およびプロトコールを用いて６個の反応を行った。０.２５mlの緩衝液(１０mＭＮaＰＯ₄(pＨ７.０)、１５０mＭＮaＣl)および０.２５mlの５０nＭ放射性（すなわち「ホット（hot）な」）¹²⁵Ｉ化合物ＩＶ（２．５nＭ、２５０μＣiの最終濃度）に薄光中で約６０mgのタンパク質（４ml ）を加え、氷上で１０〜１５分間放置した。該マイクロタイター・プレートを５〜１０cmの距離にて氷上で２分間、３００nmを超える光にさらした。化合物ＩＶ（化合物IVの「コールド（cold）」（すなわち非放射性）形態である化合物ＶＩ）により、以下のとおり、反応を追跡した。１０mＭＮaＰＯ₄（pＨ７.０）および１５０mＭＮaＣl中の２.７mlの５０％エタノールに０.３ml １０mＭ化合物ＶＩを加えることにより、化合物ＶＩの１mＭの保存物を調製した。薄光中で各標識反応に化合物ＶＩ（０.５ml １mＭ）を加え、氷上で１０〜１５分間放置した。放射能標識に関し該反応を光にさらした。分離用等電点電気泳動または電気泳動工程により未反応化合物ＩＶおよびＶＩを標識タンパク質から除去した。あるいは、より小さい容量の試料について、２０mＭＮaＰＯ₄（pＨ７.４）および１５０mＭＮaＣl中、セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（１.６×１２cm）上、ゲル濾過クロマトグラフィーにより除去した。分析電気泳動、オートラジオグラフィーおよび免疫ブロッティング実質的にはスミス，ビー・ジェイ（Smith，B．J.）（Meth．in Mol．Biol.,Vo l I，pp．44-57(1984)）により記載されているとおり、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ヘファー（Hoefer）ＳＥ６００またはマイティー・スモール(Mighty Smal l)電気泳動系を用いて、厚さ０.７５mmでそれぞれ１６cm（４％スタッキング（s tacking、濃縮用）、１０または１２％分離）または１０cm（１２％プレ−キャスト、ジュール（Jule））のスタブゲル上で試料を走らせた。クーマシー・ブルーＲ３５０（ファルマシア）または銀（シルバー・ステイン・プラス（Silver S tain Plus）、バイオラッド（BioRad））のいずれかによりタンパク質を染色した。分子量標準タンパク質をアマシャム（Amersham）またはバイオラッド（BioR ad）から購入した。ブロッティングのために、ゲニー電気泳動ブロッター(Genie electrophoretic blotter)(アイディア・サイエンティフィック(Idea Scientif ic))を１５Ｖで使用して、１９２mＭグリシン／２５mＭ Tri，pＨ８.３および２０％（v/v）メタノール中のポリビニリデンジフルオリド膜（ミリポア（Millipo re））にタンパク質を移した。¹²⁵Ｉで標識されたタンパク質を、−７０℃で一夜露光した後、ハイパーフィルム（Hyperfilm）−ＭＰ（アマシャム（Amersham ））を使用してオートラジオグラフィーにより可視化した。緩衝液中で１,０００〜５,０００倍に希釈された適当な抗血清とインキュベーションする前に、２０mＭトリスＨＣl（pＨ７.５）および５００mＭＮaＣl中、５％ゼラチンで該膜をブロックした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、ハイパーフィルム−ＥＣＬ（アマシャム（Amersham））上でルミノールリン光により可視化された抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリンＧ（アマシャム（Amersham））で該抗体複合体を検出した。分取等電点電気泳動ライニン（Rainin）ＲＦ３リサイクリング・フリー・フロー・フォーカシングタンパク質分画器を用いて、４℃で一夜、分取等電点電気泳動を行い、アミコン（Amicon）撹拌セル（ＹＭ３０膜、７０psi Ｎ₂）で約３mlまで濃縮し、１０％グリセロールおよび１％両性電解質（ファルマシア・アンホリン（Pharmacia Am pholine）またはファルマライト(Pharmalyte)、pＨ４〜６）に移して約１０mlの最終容量にした。試料をＲＦ₃に適用する前に、１％両性電解質／１０％グリセロール溶液を１〜１.５時間（電圧、電流、電力および温度が基準線となるまで）前電気泳動した。針およびシリンジを用いて該試料を泡入口１４に注入した。該前電気泳動に関しては、３ml画分を集める前に、該系を平衡化した。放射能を監視することにより標識ＣＳＢＰを同定し、適当な画分をプールした。分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥバイオラッドモデル（BioRad Model）４９１分取セルを用いて分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。該分取等電点電気泳動からプールした画分をアミコン（Amicon ）撹拌セル（ＹＭ３０膜、７０psi Ｎ₂）で２〜３mlに濃縮した。１００℃で３〜５分間インキュベートする前に、約２〜２.５mlの濃縮物を、１００mＭトリス（pＨ６.８）、２％ＳＤＳ、１００mＭ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロールおよび０.０１％ブロモフェニルブルー中、約３mlにした。該試料をゲル（２cm ４％濃縮用ゲル、６cm １１％分離ゲル）に適用し、１９２mＭグリシン／２５mＭトリス、pＨ８.３および０.１％ＳＤＳ中、室温にて４０mＡで走らせた。画分（２.５ml）を集め、放射能について検定して、標識ＣＳＢＰがゲルから溶出する位置を確認した。結果ＣＳＢＰの部分精製ＴＨＰ.１細胞質ゾルからのＣＳＢＰの典型的な部分精製を表IIIに要約する。表IIIに示されるとおり、活性の回収は２０％であり、精製のレベルは３倍である。これは、いくつかのクロマトグラフィー樹脂（アニオンおよびカチオン交換、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、ブルーセファロース、ヘパリンセファロースなどによる疎水性相互作用）の評価において、ＣＳＢＰ回収および精製に特徴的である；表III に示す精製スキームは最大回収および最も再現性のよい結果を与えた。ＣＳＡＩＤ結合活性を追跡しながらＣＳＢＰをさらに精製する試みでは活性の回収が少なかったため、これは、この精製に関する限り、光親和性標識の前に行った。ＣＳＢＰの光親和性標識ＣＳＢＰを¹²⁵Ｉ、アリールアジドＣＳＡＩＤ誘導体化合物ＩＶで共有結合的に標識した。該反応は、図９に示されるとおり非常に特異的であった。図９は、Ｍr４３,０００の単一のタンパク質が標識されたことを示す(「無し」と標識されたレーン)。上記の部分精製の間、ＣＳＡＩＤ結合活性は、Ｍr４５,０００〜５０,０００のタンパク質に相当する分子量を有する、スーパーローズ(Superrose) １２ゲル濾過クロマトグラフィーからの単一のピークとして溶出した。ひとまとめると、これら２つの分析は、ＣＳＢＰがＭr４３,０００の単一鎖または「単量体」のタンパク質であることを示す。また図９は、標識の特異性を示す。ゲルの中央のレーンにおいて、¹²⁵Ｉ化合物ＩＶ（２.５nＭ）による光親和性標識の前に、タンパク質を非放射性ＣＳＡＩＤ（１０μＭ）と共に前インキュベートした。各ＣＳＡＩＤが光親和性標識と競合する程度は、細胞検定におけるその効力とよく相関した。すなわち、該化合物がヒト単球におけるそのＩＬ−１生産抑制能において強力になればなるほど、それはＣＳＢＰの光親和性標識をより効果的に阻止する。このように、ＣＳＢＰは化合物ＩＶで標識されたタンパク質である。標識ＣＳＢＰの精製ＣＳＢＰをそのアミノ酸配列により同定するために、光親和性標識に使用した部分精製ＣＳＢＰから、標識タンパク質をさらに精製した。これを行う戦略は、分取等電点電気泳動、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣであった。分取等電点電気泳動の結果を図１０に示す。標識タンパク質の等電点はpＨ約４.５に相当する。ウエスタン分析は、この方法によりいくつかの（しかし全てではない）アクチンが除去されることを示した。さらに、適用されたほぼ７０％のタンパク質は、標識タンパク質（放射能の５０％回収）と共に溶出した。また、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色分析により証明された（データは示していない）。このように、この適用に関しては、分取等電点電気泳動によっては所望のタンパク質は十分には精製できなかった。標識ＣＳＢＰの最も十分な精製は、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成された。バイオラッドモデル（BioRad Model）４９１プレパラティブセル（Preparative Cell）を使用して、分取等電点電気泳動からプールされた物質をゲルに適用した。図１１に示されるとおり、約４３kＤa（画分５６）のタンパク質に相当する放射性画分は、この方法で除去された非放射能タンパク質の少なくとも９０％を有する。さらに、未導入標識も除去される。ＣＳＢＰの特徴づけ分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、放射能と共に溶出するタンパク質ピークを集める逆相ＨＰＬＣに標識ＣＳＢＰを適用した。タンパク質濃度（アミノ酸分析により決定）を試料の比放射活性と比較することにより、このタンパク質のわずか１０％が標識されたことが示された（タンパク質分子量が４３,０００であると仮定した場合）。Ｎ末端配列分析により、予想されるアミノ末端から下流の３０〜４０アミノ酸に相当するアクチン配列が同定された。トリプシンまたはＣＮＢrによる断片化後の内部配列分析により、約９０％のアクチン配列が得られたが、該ペプチドの約１０％はユニーク配列を与えた。トリプシン消化からの配列の１つは、マイトジェン活性（ＭＡＰ）キナーゼとして知られているSer／Thrタンパク質キナーゼのファミリーで見いだされているＣ末端配列と強い（８５％）相同性を有していたが、同一ではなかった（図１２；また、レイ，エル・ビー（Ray，L .B.）およびスタージル、ティー・ダブリュー（Sturgill，T.W.），Proc．Nat'l Acad．Sci.(USA)，85: 3753-3757(1988)を参照されたし）。ＭＡＰキナーゼに対する相同性を有する配列に基づくペプチドを合成し、抗血清生産用のウサギに接種するのに使用した。標識ＴＨＰ.１細胞質ゾル２−Ｄゲルのウエスタン分析およびオートラジオグラフィーは、１）アクチンまたはＭＡＰキナーゼに対する抗体はブロット上のタンパク質を認識するが、放射能標識タンパク質を認識しない；２）トリプシンペプチドから調製された抗体は放射能標識タンパク質を認識することを示した。したがって、ＣＳＢＰは、ＭＡＰキナーゼに対する相同性を有するが、これと異なるようである。翻訳の調節におけるキナーゼの役割（ペレチ（Pelech）およびサングヘラ（Sanghera），Science 257: 1355-66(1992)）およびＣＳＡＩＤのＩＬ−１およびＴＮＦ翻訳に対する効果を考えると、キナーゼはＣＳＡＩＤに対する分子標的として矛盾することはない。ＣＳＢＰ遺伝子の単離および特徴づけ本発明は、ヒトＣＳＢＰをコードする単離された核酸分子を提供する。放射性光親和性プローブと共に移動するタンパク質画分から２個のアミノ末端ペプチド配列を得た。これらのうちの１つは、放射性タンパク質画分のトリプシン消化物に由来するが、それ自体は放射性ではなく、以下の配列を有していた。 ILE THR ALA ALA GLN ALA LEU ALA HIS ALA TYR PHE ALA GLN TYR（配列番号１）第２のものは、放射能と結合した８ＫＤa臭化シアン断片から得られ、以下の配列を有していた。 XXX（GLN）LEU LEU ASN ASN ILE（VAL/PHE）LYS（PHE）GLN LYS LEU THR（配列番号２） [式中、( )は不確実な割当てを、／は２個のアミノ酸の間の不確実さを表す。X XXは未知のアミノ酸である]。ゲンバンク（Genbank）の調査によると、配列番号１のペプチドはタンパク質キナーゼのＭＡＰキナーゼファミリーと相同であるが、ペプチド配列番号２はユニークであることが示された。これらの２個の配列に基づき、タンパク質配列を逆翻訳する遺伝暗号および哺乳動物細胞コドン優先の表（グランサム，アール（Grantham，R.）ら、Nucl．Acid Res．9:(1981)）を用いて、２個の縮重したオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを合成した。 1．GCYCAYGCTAYTTYGCYCARTA（配列番号３）および 2．AAYAAYATYKTBAARTTYCAAA（配列番号４） [式中、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｇ、ＣまたはＴ] したがって、この２個の混合オリゴヌクレオチドは、それぞれ１２８個および３８４個のユニーク配列よりなる。γ−３２ＰＡＴＰで標識された２個の合成オリゴヌクレオチド混合物の５０：５０の組み合わせに対してハイブリダイゼーションにより低緊縮でスクリーニングした市販のベクターλＺＡＰ（ストラタジーン（Stratagene））中、ＧＭ−ＣＳＦ（リビ（Livi）ら、Mol．Cell Biol．10 ：2678-86(1990)）で処理されたヒト単球から作られたcＤＮＡライブラリー。オリゴヌクレオチドの標識は、典型的には、３μgの混合オリゴヌクレオチドを２５０μＣiγ−³²ＰＡＴＰで標識し、このすべてを２５０μlのハイブリダイゼーション容量中で使用する公開されている方法（Current Protocols in Molecul ar Biology）に従った。ＢＢ４宿主株を用いて、ファージを平板培養し移すための製造業者が勧める条件に従った（ストラタジーン（Stratagene）λＺＡＰプロトコール、カリフォルニア州ラ・ジョラ、ストラタジーン(Stratagene,La Jolla ，Ca)参照）。１個の追加工程は、細菌の残がいを除くために前ハイブリダイゼーションの前に、２×ＳＳＰＥ／０.１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間、フィルターリフトを２度前洗浄することであった。ついで、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０.１％ＳＤＳおよび１００μg ／mlフェノール／クロロホルム抽出酵母tＲＮＡ中、３７℃で２４〜７２時間、標識オリゴヌクレオチドプローブによる前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った。（２０×ＳＳＰＥは３ＭＮaＣl、０.２ＭＮaＨ₂ ＰＯ₄、０.０２ＭＥＤＴＡ pＨ７.４。５０×デンハート溶液は１０gポリビニルピロリドン（ＭＷ４０，０００）、１０g牛血清アルブミンおよび１０gフィコール４００（Ｈ₂Ｏ１リットル当たり））。ハイブリダイゼーション後、以下のそれぞれの条件下、該フィルターを２回洗浄した。１．６×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、室温、１０〜１５分２．６×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、３７℃、１０〜１５分３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム溶液（５００g Ｍe₄ＮＣl、１.３８リットルＨ₂Ｏ、７３ml １ＭトリスpＨ８.０、５.８ml ０.５ＭＥＤＴＡ、７.３ml ；０.４５μＭフィルターで濾過された２０％ＳＤＳ）、３７℃、３０分（この技術の記載に関してProc．Nat'l．Acad．Sci．USA 82: 1585-1588(1985)参照)。補力スクリーンの存在下、フィルターを３〜５日間、コダック（Kodak）フィルムにさらし、２重フィルター中の重複した陽性を拾い、純粋なプラークが得られるまで同じ方法を反復した。製造業者の方法（ストラタジーン（Stratagene））に従い、recＡ^-イー・コリ（E．coli）宿主ＸＬ−１ブルー中でＭ１３ヘルパーファージＲ４０８でファージを切り出した。オリゴヌクレオチド混合物＃１のみを用いて陽性ハイブリダイゼーションプラークの再平板培養およびハイブリダイゼーションを続けて２回りさせた後、サザンブロットにおいてオリゴヌクレオチド＃１（配列番号３）とはハイブリダイズするがオリゴヌクレオチド＃２（配列番号４）とはハイブリダイズしない単一の均一ファージを得た。このファージのＤＮＡ挿入物の配列決定は、上記Ｎo.２ユニークペプチド配列番号２の一部をコードする一方の末端のオープンリーディングフレームを示した。このようにコードされるアミノ酸配列は、 Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr（配列番号５）であった。オープンリーディングフレーム（図（１３）配列番号６および７）の残りは、 cdc２およびＭＡＰキナーゼファミリーを含むいくつかのタンパク質キナーゼと相同であった。この相同性に基づけば、それは、得られたcＤＮＡクローンのアミノ末端領域によるライブラリースクリーニングの２周目で得られるアミノ末端から約１３０個のアミノ酸を欠いていると予想される。該cＤＮＡの他方の末端は、それが得られるもととなるmＲＮＡの３'末端に相当するポリＡ配列を含有する（図１４、配列番号８）。したがって、最初のcＤＮＡ（図１３）に基づき、センス鎖の５'末端からオリゴヌクレオチド（5'-CCTCGGAGAATTTGGTAGATAAGG-3'(配列番号９)および5'-AACAT TGTGAAATGTCAGAAGCTTACAGATGACCAT-3'(配列番号１０)）を設計し、ＣＳＢＰのアミノ末端をコードするcＤＮＡについてスクリーニングするために使用した。該オリゴヌクレオチドをその５'末端でポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−³²Ｐ −ＡＴＰで標識した。λＺＡＰ中で構築されたＧＭ−ＣＳＦ刺激ヒト単球ライブラリーからの１０⁶個のプラークを、ハイブリダイゼーションの前に２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ中で５０℃で前洗浄した二重のニトロセルロースフィルター上でスクリーニングした。５０％ホルムアミド、６×ＳＳＰＥ、５×デンハートおよび１００μg／mlの剪断され変性したサケ精子ＤＮＡで４８時間ブロッキングした後、同じ緩衝液中４２℃で２４時間、上記標識オリゴヌクレオチドでフィルターをハイブリダイズした。ついで、室温にて２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳで該フィルターを２回洗浄し、ついで４２℃にて１×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、４２℃にて０.５×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、ついでハイブリダイズしたプラークをオートラジオグラフィーにより検出した。二重フィルター上に現れた陽性プラークを拾い、再度平板培養し、製造業者のプロトコール（ストラタジーン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems）、カリフォルニア州ラジョラ（LaJolla））に従い、ユニークプラークが単離されファージミドＤＮＡが遊離されるまで該方法を２回繰り返した。普遍および特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびTaqポリメラーゼサイクルシークエンシングを用いて、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems) 自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７３Ａ）上でcＤＮＡを配列決定し、該配列を混合し、マッキントシュIIci上レーザージーン（Lasergene）ソフトウェアを用いて調査した。各cＤＮＡクローン中で少なくとも１回、両鎖を完全に配列決定した。cＤＮＡの記載単離されたcＤＮＡの概要を図１５に図示する。完全に配列決定されており、下記の１つの例外を除いて重複領域において同一である４個の異なるcＤＮＡがある。ＢＰ０１／０２は上記で最初に単離されたcＤＮＡであり、図１３および１４にその部分配列を示す。最長のcＤＮＡは３.８kb長さ（Ｎ５）の配列番号１１であり、５'非翻訳配列の３７０個のヌクレオチド、１.１kbのコーディング配列および２.４kbの３'非翻訳配列を含有する。先端の３'末端はmＲＮＡに特徴的なポリＡ伸長で終結し、ポリアデニル化のための予想されるコンセンサス配列の後にくる。該Ｎ７cＤＮＡは、代替的なポリアデニル化部位を示唆する部位およびポリＡランで終結するわずか１.４kbの３'非翻訳領域を有する。ノーザンブロット上、該コーディング領域由来のプローブは約４.２kbのmＲＮＡとハイブリダイズし、これは単離された最長のcＤＮＡが全長に近いことを示唆する。該コーディングは、¹²⁵Ｉ-標識化合物ＩＶによる光親和性架橋により同定されたタンパク質の大きさに匹敵する４１.５kＤＡの算出分子量を有する３６０個のアミノ酸のタンパク質に翻訳する（図１６）。また、推定等電点（約５.６）は、観察されたもの（約５.０）に近い。該配列を検討すると、それはＴＨＰ.１細胞中のＣＳＡＩＤ結合タンパク質の配列決定により得られたトリプシンペプチド配列ITAAQ....および臭化シアン配列LNNIVK...（囲み部分）の両方を含有することが判明した。これらの配列は、適当な開裂部位（矢印）の後にくる。臭化シアン断片（８kＤa）の予想される大きさは、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質の臭化シアン処理の後、依然として¹²⁵Ｉ−標識放射性光親和性標識（化合物ＩＶ）に結合している断片の大きさに匹敵する。Ｎ１３ cＤＮＡ（図１５）配列番号１２は、Ｎ５ cＤＮＡの１０５４位から始まる７５ヌクレオチド領域の例外を除き、残り３個のcＤＮＡと同一である。この相違の結果、アミノ酸２３０〜２５５が変化した同じ大きさのタンパク質となる（図１７）。２個の異なる配列はヌクレオチドレベルで４３％、アミノ酸レベルで４４％同一であった。いずれの個々の理論にも拘束されることを望まなければ、対立遺伝子変異は除外できないが、この２個の変異型は代替的な内部エキソンスプライシングから生じるようである。記載を容易にするために、本明細書中、２個のタンパク質をＣＳＢＰ１（Ｎ５ cＤＮＡに対応）およびＣＳＢＰ２（Ｎ１３ cＤＮＡに対応）と称する。ＣＳＢＰ配列をゲンバンク（GenBank）／ＥＭＢＬまたはスイスプロット（Swi ssprot）データベース中のタンパク質と比較することにより、ＭＡＰ（マイトジェン活性タンパク質）またはerk（細胞外調節）キナーゼとして公知のタンパク質のファミリーとの近い相同性が示された（ボールトン（Boulton）ら、「Erks; インシュリンおよびＮＧＦに応答して活性化されチロシンリン酸化されるタンパク質セリン−トレオニンキナーゼのファミリー」、Cell，65: 663-675(1993) ）。タンパク質キナーゼのこのファミリーは、図１８の系統樹に示されるとおり、酵母からヒトまで保存されており、最も近い公開されている相同染色体は酵母ＨＯＧ１遺伝子である（ブルースター（Brewster）ら、Science 259: 1760-63(1 993)）。ＣＳＢＰをこのファミリーの選ばれたメンバーと並べる（図１９）と、すべてのタンパク質キナーゼ（太字）において同一である残基を含む、全１１個のタンパク質キナーゼモチーフ（Ｉ〜ＸＩ）の保存が示される（ハンクス（Hank s）ら、Science，241: 42-52(1988)）。領域ＶＩおよびＶＩＩＩの２個の囲まれたモチーフは、該キナーゼはセリンおよびトレオニンをリン酸化することを示す（ハンクス（Hanks）ら、1988）。したがって、ＣＳＢＰはタンパク質キナーゼである。ドメインＶＩＩＩに近いTxY配列（星印）におけるトレオニンおよびチロシンは、Erk1およびErk2についての調節リン酸化部位として公知である（ペイン（Pa yne）ら、EMBO.J.，10: 885-892，1991）。これらの２個の残基は、種々の細胞外シグナルに応答してMEK(MAPKまたはERKキナーゼ(Kinase))によりリン酸化され、その結果、MAPキナーゼのセリン／トレオニンキナーゼ活性が活性化される（コサコ（Kosako）ら、EMBO．J.，12: 787-794(1993)）。ＣＳＢＰにおけるこれらのアミノ酸の保存は、それらもまた、例えばＬＰＳのような細胞外刺激に応答してＭＥＫにより調節されることを示唆する。これらの知見は、ＣＳＢＰが、細胞内で細胞表面刺激を例えば翻訳調節のような事象に伝達するタンパク質リン酸化事象のカスケード内にあることを示唆する。適当に刺激された細胞におけるＣＳＢＰの挙動の多くは、該ＭＡＰキナーゼの公知の性質および挙動の類推に基づいて予想することができる(マーシャル(Marshall)ら、Curr．Opin．Genetics & Develop.，4: 82-89(1994))。コーディング領域cＤＮＡプローブによる多重組織ノーザンブロットは、ほとんどの組織におけるＣＳＢＰmＲＮＡの発現を示唆する。高緊縮（０.１％ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ）におけるサザンブロットは単一の遺伝子を示唆するが、より低い緊縮洗浄は密接に関連したキナーゼを示すかもしれない。商業的に入手可能なヒト／マウスハイブリッド細胞系のパネルを用いる遺伝子マッピング実験は、ＣＳＢＰについての遺伝子がヒト染色体６上にあることを示した。イー・コリ（E．coli）中での発現単離されたcＤＮＡによりコードされるタンパク質がＣＳＡＩＤに結合し得ることを確認するために、該cＤＮＡをイー・コリおよび酵母中で発現させた。イー・コリ中では、該ＣＳＢＰは、β−ガラクトシダーゼおよび／またはエンテロキナーゼで開裂可能なＦＬＡＧエピトープ標識との融合タンパク質として発現した（図２０）（ＦＬＧＡは市販のエピトープであり、それに対する試薬はＩＢＩ −コダック（Kodak）から入手可能である）。後者の場合、これは、開始部位、抗体認識配列、およびエンテロキナーゼ開裂部位との合成オリゴヌクレオチドリンカーの設計により行われる。pLac（例えばカリフォルニア州ラジョラ(LaJolla )、ストラタジーン（Stratagene）からのブルースクリプト（Bluescript）ＫＳベクター）またはλpＬ（シャットマン（Shatman）ら、N.Y．Acad．Sci.，478: 233-248(1986)）のいずれかのプロモーターの制御下でタンパク質を発現させた。該放射性光親和性プローブ（化合物ＩＶ）は、細胞ライゼート中で予想された大きさのタンパク質を特異的に架橋することが示された。また、ライゼートは化合物ＩＡに特異的な結合活性を含有している。ＣＳＢＰ１およびＣＳＢＰ２は共に細胞内のＣＳＡＩＤの分子標的であると結論づけることができる。イー・コリ（E．coli）中で発現されるタンパク質は、製造業者の指示に従い、ＦＬＡＧエピトープに対するモノクローナル抗体を含有する親和性マトリックスに通すことにより精製した。酵母中での発現ＣＳＢＰの発現のための代替系は、精製のためだけでなく機能を評価するためのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。酵母ＨＯＧ１(高容量オスモル濃度グリセロール応答(High Osmolarity Glycerol response) )遺伝子（前掲のブルースター(Brewster)ら）は、ＣＳＢＰの近い同族体であるＭＡＰキナーゼをコードする。突然変異体hog１Ｄ株は、高容量オスモル濃度培地上での増殖が減少していることを示し、この表現型のＣＳＢＰによる機能相補性を試験した。以下のとおり、酵母発現のためにＣＳＢＰ２を処理した。オリゴヌクレオチドプライマー：5'-cgccctcgagatgtctcaggagaggcccacg-3'(配列番号１３)および3'- ctaagacctaaaacctgaccg-5'(配列番号１４)を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ムリス（Mullis）およびファルーナ（Faloona）、Method in Enzymd.，155:335-50 (1987)）により、ＣＳＢＰ２の開始コドンの位置にXhoI部位を導入した。XhoIおよびBglIIでこの５２５bpのＰＣＲ断片を消化し、ＴＲＰ１選択マーカーがＵＲＡ３で置換されているp１３８ＮＢ(マックヘイル(McHale)ら、Mol．Pharm.39: 1 09-113(1991)）の修飾体であるp１３８ＮＢＵ中の同じ部位にサブクローニングした。ついで、得られたプラスミドをBglIIおよびSalIで消化し、ＣＳＢＰ２の３'末端を含有するBglII XholI断片で連結した。該最終構築物は、高コピー数を維持するための部分２ミクロン配列を含有し、ＣＳＢＰ２ mＲＮＡ発現は銅誘導ＣＵＰ１プロモーターで起動され、酵母ＣＹＣ１転写ターミネーターにより終結する。プラスミドp１３８ＮＢＵ−ＣＳＢＰＮ１３Ｂは、野生型ＣＳＢＰ２タンパク質をコードすることが判明した。親（ＹＰＨ４９９ＭＡＴa ura3-52lys2-80 1 ^amade2-101 trp1-D63 his3D200 leu2-D1）およびhog1D(JBY10[YPH499+hog1::TR P 1])株(ブルースター(Brewsterら、J．Bacteriol．153: 163-168(1983) Ura⁺プロトトロフの形質転換体を単離し、ウラシルを欠く合成完全培地（ヒックス(Hic ks)ら、Genetics 83: 245(1976)）中、１.０の^A５４０まで増殖させた。ＣＳＢＰ２発現は、１５０mＭＣuＳＯ₄を添加することにより誘導した。５時間で細胞を収穫し、２０mＭトリス−ＨＣl pＨ７、１mＭＭgＣl₂、１mＭフェニルメチルスルホニルフルオリド中に再懸濁し、０.４５mmのガラスビーズの存在下でボルテックスすることにより破壊した。抽出物を１,５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。放射性光親和性プローブ（化合物ＩＶ）は、制御プラスミド(p１３８ＮＢＵ) を含有する野生型またはhog1D株には存在せず同様の条件下で増殖する、p１３８ＮＢＵ−ＣＳＢＰＮ１３Ａおよびp１３８ＮＢＵ−ＣＳＢＰＮ１３Ｂの両方のライゼート中の予想された大きさのタンパク質を特異的に架橋することが示された。また、ライゼートは³Ｈ化合物Ｉaに特異的な結合活性を含有していた。したがって、ＣＳＢ１およびＣＳＢ２は共にＣＳＡＩＤＳに結合する。本発明のタンパク質は、好ましくは、組換え遺伝子工学技術により製造される。その単離された核酸、特にcＤＮＡは、遺伝子発現に必要な発現制御領域（例、調節領域）に該ＤＮＡを作動的に結合させることにより発現ベクターに導入することができる。該ベクターは、当該分野でよく知られた方法（前掲のオースベル(Ausubel)ら）により、原核（例、細菌）または真核（例、酵母または哺乳動物）細胞のような適当な宿主細胞に導入することができる。既に調製され単離されている所望のタンパク質についてのコーディング配列は、いずれかの適当なベクターまたはレプリコン中にクローニングすることができる。非常に多くのクロニングベクターが当業者に公知であり、適当なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそれが形質転換し得る宿主細胞としては、例えばバクテリオファージλ(イー・コリ(E．c oli))、pＢＲ３２２（イー・コリ）、pＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、pＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、pＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、pＭＥ２９０（非イー・コリグラム陰性細菌）、pＨＶ１４（イー・コリおよびバチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)）、pＢＤ９（バチルス）、pＩＪ６１（ストレプトミセス(Streptomyces)）、pＵＣ６（ストレプトミセス）、ＹＩp５（サッカロミセス(Saccharomyces)）、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣp１９（サッカロミセス）などが挙げられる（一般的には「ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)」：第ＩおよびII巻、グローバー（Glover）ら編集、ＩＲＬプレスオックスフォード（１９８５）（１９８７）およびティー・マニアティス（ T．Maniatis）ら、「モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)」、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２）を参照されたし）。該遺伝子をプロモーター、リボゾーム結合部位（細菌発現用のもの）および所望によりオペレーター（本明細書中、「制御」因子と総称する）の制御下に置いて、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、この発現構築を含有するベクターで形質転換された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにすることができる。該コーディング配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含有していてもしていなくてもよい。本発明のサブユニット抗原は、例えばイー・コリtacプロモーターまたはタンパク質Ａ遺伝子（spa）プロモーターおよびシグナル配列を用いて発現させることができる。リーダー配列は、翻訳後プロセッシングにおいて細菌宿主により除去され得る。例えば米国特許第４,４３１,７３９、４,４２５,４３７、４,３３８,３９７号を参照されたし。制御配列に加え、宿主細胞の増殖に関して該タンパク質配列の発現の調節を許容する調節配列を加えるのが望ましいかもしれない。調節配列は、当業者に公知であり、例えば、調節化合物の存在を包含する化学的または物理的刺激に反応してスイッチが開閉される遺伝子を発現させるものが挙げられる。また、他の型の調節因子もベクター、例えばエンハンサー配列中に存在する。個々のコーディング配列が、適当な調節配列を有するベクター中に位置し、制御配列に関してのコーディング配列の配置および配向が制御配列の「制御」下でコーディング配列が転写される（すなわち、制御配列の位置でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが該コーディング配列を転写する）ように、発現ベクターを構築する。この目的を達成するためには、関心のある個々のタンパク質をコードする配列を修飾することが望ましいかもしれない。例えば、場合によっては該配列を修飾して、それが、適当な配向を有する制御配列に結合し得るようにすること、すなわちリーディングフレームを維持することが必要かもしれない。上記クローニングベクターのようなベクターへの挿入の前に、該制御配列および他の調節配列をコーディング配列に連結してもよい。あるいは、該コーディング配列を、制御配列および適当な制限部位を既に含有する発現ベクター中に直接クローニングすることができる。場合によっては、宿主生物からのポリペプチドの分泌を起こし、続いて分泌シグナルを開裂する配列を加えることが望ましいかもしれない。あるいは、遺伝子融合体を作り、それにより、関心のある結合タンパク質をコードする遺伝子を、他の望ましい性質を有する生成物をコードする遺伝子と融合させてもよい。例えば、融合相手は、該結合タンパク質を選択する代替手段として使用できる公知の検定可能な活性（例、酵素的）を与え得る。結合タンパク質（通常は細胞質成分）が融合タンパク質の形態で細胞表面上に現れるように、該融合相手は例えば細胞表現成分のような構造成分であってもよい。また、関心あるタンパク質の突然変異体またはアナログを生産することも望ましいかもしれない。突然変異体またはアナログは、該タンパク質をコードする配列の部分の欠失により、配列の挿入により、および／または該配列内の１以上のヌクレオチドの置換により調製してもよい。例えば部位特異的変異処理および融合タンパク質形成のようなヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当業者によく知られている。例えば、前掲ティー・マニアティス(T．Maniatis)ら；前掲「ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)」、第ＩおよびII；前掲ヌクリーク・アシッド・ハイブリダイゼーション（Nuclei c Acid Hybridization）を参照されたし。いくつかの原核発現ベクターは当該分野において公知である。例えば、米国特許第４,５７８,３５５、４,４４０,８５９、４,４３１,７４０、４,４３１,７３９、４,４２８,９４１、４,４２５,４３７、４,４１８,１４９、４,４１１,９９４、４,３６６,２４６、４,３４２,８３２号；英国特許出願第ＧＢ２,１２１,０５４；ＧＢ２,００８,１２３；ＧＢ２,００７,６７５号；および欧州特許出願第１０３,３９５号を参照されたし。また、酵母発現ベクターも当該分野において公知である。例えば、米国特許第４,４４６,２３５、４,４４３,５３９、４,４３０,４２８；欧州特許出願第１０３,４０９、１００,５６１、９６,４９１号を参照されたし。pＳＶ２neo（J．Mol．Appli．Genet．1:327-341）は、ＳＶ４０後期プロモーターを用いて哺乳動物細胞中で発現を起動させるものであり、また、pＣＤＮＡ１neoは、ＣＭＶプロモーターを用いて発現を起動させるpＣＤＮＡ１（Mol．Cell Biol．7: 4125-29）由来である。後者２個のベクターは共に、哺乳動物細胞における遷移または安定（例、Ｇ４１８またはヒグロマイシン耐性を用いる）発現のために使用することができる。また、昆虫細胞発現系、例えばドロソフィラ（Drosophila）（例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ８９／０５１５５およびＵＳ９１／０６８３８およびＥＰ出願８８／３０４０９３.３）およびバキュロウイルス発現系も有用である。選択した発現系および宿主に応じて、関心あるタンパク質が発現される条件下で上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより、本発明のタンパク質を生産する。ついで、該タンパク質を宿主細胞から単離し、精製する。発現系が増殖培地中にタンパク質を分泌すれば、該タンパク質は培地から直接精製することができる。該タンパク質が分泌されなければ、それを細胞ライゼートから単離し、細胞膜画分から回収する。適当な増殖条件および回収方法の選択は、当該分野の技術範囲内である。本発明のタンパク質を同定する代替的な方法は、遺伝子ライブラリーを構築し、得られたクローンを用いてイー・コリを形質転換させ、所望の結合タンパク質に対するポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて個々のコロニーをプールし、スクリーニングすることによる。また、本発明のタンパク質は、公知のアミノ酸配列または関心ある遺伝子のＤＮＡ配列から導かれたアミノ酸配列を用いて、例えば固相ペプチド合成のような化学合成により生産してもよい。かかる方法は、当業者に公知である。ペプチドの化学合成が特に好ましいという訳ではない。本発明の結合タンパク質または少なくとも１個のエピトープよりなるその断片を使用して、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を生産することができる。ポリクローナル抗体を望むなら、選択した哺乳動物（例、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を本発明の結合タンパク質またはその断片または変異結合タンパク質で免疫感作する。該免疫感作動物からの血清を集め、公知方法により処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清を使用する場合、免疫親和性クロマトグラフィーまたは他の公知法により該ポリクローナル抗体を精製することができる。また、本発明のタンパク質またはその断片に対するモノクローナル抗体も、当業者により容易に製造することができる。ハイブリドーマ技術を用いるモノクローナル抗体を作る一般的方法はよく知られている。不死抗体生産細胞系は、細胞融合、および例えば腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バールウイルスによるトランスフェクションのような他の技術により作ることができる。例えば、エム・シュライアー（M．Schreier）ら、「ハイブリドーマ技術（Hybridoma Techniques）」（１９８０）；ハンマーリング（Ha mmerling）ら、「モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridoma）」（１９８１）；ケネット（Kennett）ら、「モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies）」（１９８０）；米国特許第４,３４１,７６１、４,３９９,１２１、４,４２７,７８３、４,４４４,８８７、４,４５２,５７０、４,４６６,９１７、４,４７２,５００、４,４９１,６３２および４,４９３,８９０号を参照されたし。関心あるタンパク質またはその断片に対して生産されたモノクロナール抗体のパネルを、種々の性質、すなわちイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。あるいは、当該分野で公知のＰＣＲ技術により、関心のあるモノクローナルをコードする遺伝子をハイブリドーマから単離し、適当なベクター中でクローニングし、発現させてもよい。モノクローナル抗体は、それが向けられている個々のタンパク質の、免疫親和性技術を用いる精製において有用である。本発明の抗体は、ポリクローナルであろうとモノクローナルであろうと、免疫検定、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどにおける試薬として使用してもよい点で付加的な有用性を有する。また、それは、ＣＳＢＰをヒト細胞から単離し、異なる刺激および化合物が内在性ＣＳＢＰのリン酸化状態およびタンパク質キナーゼ活性に及ぼす影響を決定するために使用することができる。該抗体は、ＣＳＢＰのリン酸化またはキナーゼ活性を阻止する新規化合物の知見または修飾のための組織培養に基づく検定を確立するために使用することができる。かかる検定の一例としては、ＬＰＳによる処理の前に、一定時間、ヒト単球または単球細胞系を化合物または化合物混合物と共にインキュベートし、ついでＣＳＢＰを抗体と共に免疫沈降させ、免疫ブロットまたはクロマトグラフィーによりそのリン酸化状態を評価またはそのキナーゼ活性を適当なタンパク質またはペプチド基質で測定することが挙げられる。本発明は、ＣＳＢＰに結合することが以前知られていなかったリガンドがかかるタンパク質に結合し得るか否かを決定する方法を提供する。本方法は、同定しようとするリガンドを、ＴＨＰ.１細胞からの細胞質ゾル画分と接触させ、上記のとおり、ＣＳＡＩＤ結合検定において、それが公知の放射性ＣＳＡＩＤと競合する能力を測定することよりなる。代替的な方法は、同定しようとするリガンドを、かかる受容体に結合すると既に同定されているリガンドの結合に十分な条件下でＣＳＢＰのコーディング配列を発現する全細胞と接触させることを含む。他の具体例においては、ＣＳＢＰ融合または単離された遊離または固体支持体に固定されたＣＳＢＰよりなる細胞膜画分を用いて、試験しようとするリガンドの結合を測定してもよい。ＣＳＢＰを発現させるために組換え細胞を使用する場合には、結合がもしあれば、それが、発現された関心あるタンパク質の存在によるものとなるよう、内在性ＣＳＢＰ活性を全くまたはほとんど有さない細胞を使用するのが好ましい。上記したとおり、受容体結合の特異的に設計された指示体を構築することができる。例えば、本発明のＣＳＢＰを、ＣＳＢＰ／リガンド結合に敏感なタンパク質ドメインと融合することにより、融合タンパク質を作ることができる。本明細書中で指示ドメインと称するかかるドメインは、それ自体で、あるいは補助分子と共に、受容体リガンド結合を示す分析的に検出可能なシグナルを生成する能力を有する。このアプローチの変法は、ＴＨＰ.１または他の哺乳動物細胞中で、ＣＳＢＰを融合タンパク質（例、ＦＬＡＧペプチドと融合）として発現させ、適当な刺激およびＴＨＰ.１細胞の前処理の後、組換えＣＳＢＰを単離する手段として該融合ペプチドを使用することである。かかる発現は、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶ、ＲＳＶおよびポリアデニル化配列など、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモンおよび安定なトランスフェクション体を選択するための例えばＧ４１８またはヒグロマイシンのような選択マーカーを利用する非常に多くの哺乳動物発現ベクターにより達成することができる。かかる融合体を発現するトランスフェクションまたは形質転換された細胞からの細胞質ゾル調製物を使用してもよい。リガンドの同定に有用な上記技術はすべて、薬物スクーニングおよび薬物開発プロトコールにおいても有用である。あるいは、化合物Ｉaとの競合結合検定において、精製された組換えタンパク質を用いて粗製ＴＨＰ.１細胞ライゼートに代用させてもよい。この検定は、ＣＳＢＰに結合する新規化合物をスクリーニングするのに、あるいは、結合することが知られている化合物への改変を評価する方法として有用である。精製タンパク質の入手可能性は、粗製物質について既に記載されているものからの、検定の代替的な構成を許容する。例えば、該タンパク質が標識、比色検定における配置についてのかかるタンパク質結合部位、例えば複合抗体に、あるいは酵素活性の直接検出のための酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼに共有結合していれば、固体マトリクス上に示される新規化合物への結合を検出し得る。かかる化合物は、低分子量有機分子、ペプチド、ペプトイドおよびタンパク質を包含する。後者の場合、そのシグナルカスケードにおける他のタンパク質、例えば、活性化単球におけるサイトカイン翻訳の活性化のための経路中のものを単離する方法として、該タンパク質を使用することができる。また、該タンパク質を使用して、ＣＳＡＩＤ結合機構により作用する哺乳動物細胞内に自然に生じる調節分子を単離してもよい。最後に、該タンパク質は、ファージの表面に現れる標的ペプチドを同定するために使用することができる。ＣＳＢＰがタンパク質キナーゼをコードするという知見は、タンパク質キナーゼ活性を確認するために組換え形態を使用することができることを示唆する。典型的には、これは、γ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下、タンパク質またはペプチド基質と共にＣＳＢＰを直接インキュベーションし、ついで、分離および計数することにより、基質に取り込まれた放射能を測定することを含む。分離方法には、免疫沈降法、遠心分離による分離およびシンチレーション近接検定による取り込みの測定を許容するビーズへの基質のコンジュゲーション、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ついでオートラジオグラフィーまたはバイオセンサー分析が含まれる。該特異的基質は未知であるが、候補物には、ＣＳＢＰ自体（自己リン酸化）および公知のＭＡＰキナーゼ基質と関連したペプチドが含まれる。他の基質は、固体支持体にコンジュゲートしたランダムペプチドとＣＳＢＰをインキュベートすることにより知見される、あるいはファージ（上記参照）によりまたは哺乳動物細胞ライゼート（例、ＴＨＰ.１細胞ライゼート）およびγ−³²Ｐ−ＡＴＰと共にＣＳＢＰをインキュベーションし、ついで標識標的タンパク質を分離および配列決定することにより現れるかもしれない。また、抗ホスホチロシン抗体を使用することによりキナーゼ活性を検出してもよい。ＣＳＢＰのタンパク質キナーゼ活性は、特異的なＭＥＫとインキュベーションすることを要するかもしれない。これは、刺激された真核細胞（例、ＬＰＳ処理ＴＨＰ.１細胞）ライゼートおよびＡＴＰと共にＣＳＢＰを前インキュベートすることにより行ってもよい。あるいは、ヒトＣＳＢＰを発現する酵母のＨＯＧ１欠失株からＣＳＢＰのより活性な形態を単離し、高容量オスモル濃度条件で増殖させることが可能かもしれない。これらの検定により、ＣＳＢＰキナーゼ活性をインビトロで阻害する化合物の知見および修飾が可能となる。かかる化合物は、本明細書中に記載の化合物に匹敵する態様でサイトカイン合成を阻止することが予想される。また、それらは、それ自体がサイトカイン生成を阻止する新規化合物の知見のための生存し得る標的であり得る新規基質の知見につながり得る。ＣＳＢＰは、他のＭＡＰキナーゼと同様、ＭＥＫにより活性化され、したがって、該組換えタンパク質により、ＣＳＢＰが推定ＭＥＫによりリン酸化される能力を測定する第２の検定の確立が可能となると予想される。この場合、γ−³²Ｐ −ＡＴＰの存在下、刺激された細胞ライゼート（例、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ .１細胞）からの画分をＣＳＢＰとインキュベートし、³²Ｐ−標識のＣＳＢＰ中への取り込みを、分離および計数により測定する。分離は、いくつかの方法で行うことができる。１つの方法は、ペプチドまたはタンパク質に融合したＣＳＢＰを使用し、ペプチドまたはタンパク質指向抗体アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降により分離することである。あるいは、ＣＳＢＰをビーズに直接コンジュゲートさせ、融合ペプチドまたはタンパク質（例、ＦＬＡＧ（ペプチド）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を介して結合させ、細胞ライゼートとのインキュベーションの後、遠心分離により分離することができる。また、ＣＳＢＰのチロシンリン酸化は、商業的に入手可能な抗ホスホチロシン抗体による免疫沈降または免疫ブロットにより検出できるであろう。これらの検定は、ＣＳＢＰタンパク質キナーゼ活性の活性化を阻止する化合物を見いだすために、およびすでに見いだされている化合物の効力を向上させるために使用することができる。これらの化合物は、それらのサイトカイン合成の阻止により有用性を有すると予想されるであろう。また、該検定は、それ自体、サイトカイン合成を阻止する新規化合物の標的となり得る新規ＭＥＫを見いだすのに有用である。ヒトＣＳＢＰが高い容量オスモル濃度の条件での増殖に際してＨＯＧ１欠失株を救う能力のために、ＣＳＢＰ活性をインビボで阻止する化合物の直接スクリーニングが可能となる。例えば、高い容量オスモル濃度中でＣＳＢＰ＋／ＨＯＧ１ −酵母株の増殖を阻止するが、標準的な容量オスモル濃度中での同じ株の増殖または高い容量オスモル濃度でのＣＳＢＰ−／ＨＯＧ１＋には影響を及ぼさない能力について化合物をスクリーンニングできるであろう。この酵母に基づく検定の感受性は、細胞膜および浸透性に影響を及ぼす宿主突然変異を導入することにより増大させることができる（ゲイバー（Gaber）ら、Mol．Cell．Biol．9: 3447- 3456(1989)）。本発明の化合物スクリーニングの具体例においては、単離され、固定化されまたは細胞に結合した形態のＣＳＢＰを大多数の候補分子と接触させ、該タンパク質に結合しこれと相互作用する候補物を選択する。該結合または相互作用は、放射能で標識した関心のある候補物を使用することにより直接に、あるいは、該候補化合物の相互作用または結合から生じる効果を測定することにより間接的に測定することができる。あるいは、公知のリガンド、好ましくは分析的に検出可能な試薬で、最も優れているのは放射能で標識されたものを試験化合物と共に導入し、化合物が標識リガンドの結合を阻害または増大させる能力を測定する競合スクリーニング検定に、該候補化合物を付すことができる。ＣＳＢＰに対する増大した親和性および選択性について化合物をスクリーニングする。本発明のこの態様を例示するために、天然化合物のスクリーニングを行った。ミニカラムを用いる排除クロマトグラフィーにより結合リガンドを遊離体から分離する標準的な検定を用いて、スクリーニング努力を開始した。ＴＨＰ．１細胞質ゾルに対する³Ｈ−化合物Ｉ結合の阻害について、約６２５個の海産抽出物、２０２個の微生物抽出物および２３３個の植物物質の抽出物を試験した。それぞれ約２００および８０μg／mlのＩＣ₅₀を有するこの結合のアンタゴニストとして２個の抽出物を確認した。選ばれた一群の「迷惑抽出物」のいずれによる阻害も観察されないことと共にこの低いヒット率（０．２％）は、該検定がスクリーニング努力を支持するのに十分に選択的かつ強力であることを示す。これらの２個のヒットの効力はやや弱いが、それでもやはりそれらは有効成分の単離のリード役とみなされて、一次検定が生物活性化合物の同定と同様に評価されるようになるであろう。ついで、この２個の抽出物を分画し、特徴づけした。スクリーニングの間じゅう高度に促進するための結合検定のさらなる精製は、スピンカラムを用いることにより結合リガンドを遊離リガンドから分離する小さな修飾により行うことができる。また、本発明は、上記方法により同定された場合の化合物および医薬上許容される担体よりなる医薬組成物をも意図する。本発明のタンパク質性薬の医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内投与に特に有用である。非経口投与用組成物は、通常、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解された本発明の化合物の溶液またはその反応混液よりなる。種々の水性担体、例えば水、緩衝水、０.４％食塩水、０.３％グリシンなどを使用してもよい。これらは溶液は無菌であり、一般に微粒子物質を含まない。これらの溶液は、通常のよく知られた滅菌技術により滅菌されていてもよい。該組成物は、pＨ調整剤、緩衝剤などのような生理学的条件に要求される医薬上許容される補助物質を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明の化合物の濃度は、約０.５重量％未満、通常少なくとも１重量％から１５または２０重量％まで広く変化し得、選択した個々の投与方法に従い、主として流体容量、粘性などに基づき選択する。したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１mlの無菌緩衝水および５０mlの本発明化合物を含有するよう調製できるであろう。同様に、静注用の本発明の医薬組成物は、２５０mlの無菌リンゲル溶液および１５０mgの本発明化合物を含有してなるものであってもよい。非経口的に投与し得る組成物の実際の調製方法は良く知られているか、当業者に明らかであり、例えばレミントンズ・ファーマシュティカル・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）、１５版、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、ペンシルバニア州イーストン中により詳細に記載されている。本明細書中に記載の化合物は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体中で再構成することができる。この技術は、通常のタンパク質で有効なことが示されており、当該分野で公知の凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。同定された薬が非タンパク質性である場合、それは単独または医薬上許容される担体と組み合わせて投与してもよい。その比率は、該化合物の溶解度および化学的性質、選んだ投与経路および標準的な医薬プラクティスにより決定される。例えば、それらは、デンプン、乳糖、ある種の粘土などの賦形剤を含有する錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与してもよい。それらは、有効成分が糖およびコーンシロップ、香味剤および染料と混合され、ついで固体形態への圧縮に適するよう十分に脱水されたトローチ剤またはロゼンジの形態で舌下投与してもよい。それらは、非経口的、すなわち筋肉内、静脈内または皮下に注射してもよい溶液の形態で経口投与されてもよい。非経口投与には、それらは、他の溶質、例えば溶液を等張にするのに十分な食塩またはグルコースを含有する無菌溶液の形態で使用してもよい。最も適切な本発明の治療剤の投与量は医師が決定するであろう。それは、選択した投与形態および個々の化合物により変化するであろう。また、それは治療中の個々の患者により変化するであろう。医師は、一般に、少ない投与量、実際には該化合物の最適用量未満で治療を開始し、その状況下で最大効果に到達するまで少しずつ投与量を増やすことを望むであろう。該組成物を経口投与する場合、非経口投与されたより少量の場合と同じ効果を得るためには、より多量の有効成分が必要であることが一般に見いだされるであろう。該化合物は、他のセロトニン剤と同様に有用であり、投与量レベルはこれらの他の治療剤に一般に投与されているのとほぼ同じ大きさである。該治療投与量は、一般に、１日当たり１〜１０ミリグラムおよびそれ以上であい、いくつかの異なる投与単位でそれを投与してもよい。０.５〜１０mgの有効成分を含有する錠剤が特に有用である。患者の状態に応じて、予防および／または治療的治療のために本発明の医薬組成物を投与することができる。治療的適用においては、疾患に既に罹患している患者に、該疾患およびその合併症を治すまたは少なくとも抑えるのに十分な量の組成物を投与する。予防的適用においては、本発明化合物またはその反応混液を含有する組成物を未だ病態にない患者に投与して、患者の抵抗性を増強する。治療する医師が用量レベルおよびパターンを選んで、医薬組成物の単一または複数投与を行うことができる。いずれにせよ、本発明の医薬組成物は、患者を有効に治療するに十分な量の本発明化合物を提供するべきである。本発明の核酸の具体例は、ヒトＣＳＢＰ配列との特異的ハイブリダイゼーション能を有するプローブを提供するのに特に有用である。プロービング技術は、当該分野でよく知られており、プローブの大きさは大きく変化し得ると理解されるが、プローブは少なくとも１５ヌクレオチド長が好ましい。また、かかるプローブは、プローブの同定を容易にするための分析的に検出し得る試薬で標識され得る、または好ましくは標識されると理解される。有用な試薬としては、放射能、蛍光染料または検出可能な生成物の形成を触媒する酵素などが挙げられるがこれに限定されるわけではない。本発明は、例えば、異常な（すなわち増加または減少した）レベルの受容体遺伝子発現により特徴づけられた病態の診断的評価におけるプローブをコードする受容体の使用を意図する。あるいは、該プローブは、使用して、該受容体をコードする遺伝子に染色体のまたは分子の突然変異を担持する個体を同定することができる。当業者により用いられる条件に応じて、該プローブを使用して、他の細胞型および個体からのこの受容体（そのゲノムまたは cＤＮＡ型）の追加例を同定および回収することができる。一般に、ハイブリダイゼーション条件がより緊縮になればなるほど、回収された遺伝子はより密接に関連するようになる。ＣＳＢＰについて本明細書中に開示されている配列上で予想されるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。合成オリゴヌクレオチドまたは関連アンチセンス化学構造アナログは、該受容体遺伝子をコードする標的核酸を認識しこれに特異的に結合し、遺伝子発現、すなわち標的核酸がmＲＮＡの場合は遺伝子の翻訳を抑制するように設計する。アンチセンス薬の作用機構についての個々の理論に縛られることを望むわけではないが、かかる薬は以下の１以上の機構により作用し得ると考えられている：mＲＮＡに結合し、リボヌクレアーゼＩのような内在性ヌクレアーゼによる分解を誘導することによる、または生産タンパク質合成に要する調節因子またはリボゾーム成分へのmＲＮＡの結合を阻害することによりmＲＮＡの翻訳を阻害することによる。また、該アンチセンス配列は、該配列がリボザイム配列または反応性化学基と組合わさっている複合巨大分子配列の成分として使用することができ、また、関心のあるmＲＮＡを特異的に標的化し、上記mＲＮＡを分解または化学的に修飾するのに使用される。アンチセンス技術の一般的分野は、背景技術の目的で出典明示により本明細書の一部とする以下の開示に例示されている（コーエン，ジェイ・エス（Cohen，J .S.），Trends in Pharm．Sci．10: 435(1989)およびウェイントローブ，エイチ・エム(Weintraub，H．M.)、Scientific American、１月号（１９９０）、第４０頁）。また、本発明は、本明細書中に開示するＤＮＡ配列の遺伝子治療における使用をも意図する。ＣＳＢＰはタンパク質キナーゼであるため、キナーゼとして不活性であるが同じ細胞中で同時発現された場合に内在性ＣＳＢＰの活性化を阻止する部位特異的突然変異体、すなわち優性陰性突然変異体を作ることが可能である（コルフ（Kolch）ら、Nature 349: 426-428(1991)）。この突然変異タンパク質をコードするＤＮＡを遺伝子治療で使用して慢性炎症を減弱することができるであろう。例えばアデノウイルス、レトロウイルスなど、インビボでＤＮＡを標的細胞に導くのに使用できる多数のベクターおよび送達系がある。また、本発明は、ＣＳＢＰからの本明細書中に開示するアミノ酸配列に対応するエピトープに向けられたモノクローナルまたはポリクローナルの抗体をも意図する。免疫学的な目的のための受容体で特に重要な領域は、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合した領域である。該領域に向けられた抗体は、それがタンパク質−リガンド相互作用に及ぼす影響のため、診断的および治療的適用において特に有用である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造法は、よく知られている。例えば、オースベル（Ausubel）ら（前掲）、第１１章を参照されたし。また、本発明は、タンパク質活性化に関連した病態を治療または改善するために、自然に生じるリガンドのそのタンパク質に対する結合を阻止するためにＣＳＢＰに対して向けられた抗体またはその断片の有効量よりなる医薬組成物を提供する。本明細書中に開示されているＣＳＤＰをコードする核酸を宿主の適当な受精卵または胚にトランスフェクトすることにより、トランスジェニックの、ヒト以外の動物を得てもよい。例えば、米国特許第４,７３６,８６６、５,１７５,３８５、５,１７５,３８４および５,１７５,３８６号を参照されたし。得られたトランスジェニック動物を、ＣＳＢＰ／リガンド相互作用の研究のためのモデルとして使用してもよい。特に、有用なトランスジェニック動物は、該タンパク質の発現に関連した検出可能な表現型を現すものである。ついで、関連表現型を逆転または悪化させる薬物の能力について薬物をスクーニングしてもよい。また、本発明は、種々の温度または代謝条件に特異的に反応し、それにより、それらの条件に応じて表現型発現を効果的にスイッチ開閉する調節因子に、ＣＳＢＰをコードする遺伝子を作動的に結合させることをも意図する。ヒトＣＳＢＰ遺伝子の同族体変形を所望の実験動物種からクローニングするために（例えばマウス変形）、本明細書に開示されている核酸プローブを使用することができる。通常の遺伝子ノックオウト（knock-out）技術により上記遺伝子が除去されているマウスの系統を発生させることができる。ついで、該遺伝子を本発明のヒトＣＳＢＰＤＮＡにより置換して、インビボで候補薬をスクリーニングするためのマウスを得ることができる。また、同様の遺伝子ノックアウトおよびヒトタンパク質阻害研究を酵母で行うことができる。また、本発明の精製タンパク質は、ＣＳＢＰに影響を及ぼす新規薬の合理的な設計のための手段として、結合薬候補物による又はそれなしの構造研究の試薬に有用である。例えば、該組換えタンパク質は、Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたは関連タンパク質キナーゼ、例えばＣＳＫの公開されている構造からのモデル化により、単独のまたは化合物Ｉaおよび関連化合物と複合体化したタンパク質の構造を導くのに使用することができる。構造は、阻害化合物がいかに結合するかについての理解を促進し、ＣＳＢＰ活性を阻止し従ってサイトカイン合成の阻害剤となり得るさらに別の化合物の設計または知見につながり得る。現在、他のタンパク質標的、例えばＨＩＶプロテアーゼについての、かかる構造に基づく設計のいくつかの例がある。ＣＳＢＰのいくつかの他のキナーゼ（例、ＭＡＰおよびＣＤＣキナーゼ）に対する類似性を考えると、かかる構造の情報は、他の群のキナーゼファミリーを阻害する新規化合物を設計するのに有用であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/715 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/24 16/24 7804−4ＢＣ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 7804−4Ｂ 1/21 1/21 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ 21/08 21/08 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/00 ＺＣ１２Ｑ 1/00 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＧＧ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/566 33/566 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＮ 9051−4Ｃ 37/02 ＡＢＥ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者アダムス，ジェリー・エルアメリカ合衆国ペンシルベニア州19087、ウェイン、フォレスト・ロード611番 (72)発明者ギャラガー，ティモシー・エフアメリカ合衆国ペンシルベニア州19438、ハーリーズビル、マナー・ロード255番 (72)発明者グリーン，デイビッド・ダブリューアメリカ合衆国ペンシルベニア州19010、ブリン・モール、オールド・ランカスター・ロード835番 (72)発明者ヘイズ，ジョン・リチャードアメリカ合衆国ペンシルベニア州19355、マルバーン、フリントシャー・ロード９番 (72)発明者マクドネル，ピーター・シーアメリカ合衆国ペンシルベニア州19034、フォート・ワシントン、ビー・マディソン・アベニュー223番 (72)発明者マクナルティ，ディーン・イーアメリカ合衆国ペンシルベニア州19147、フィラデルフィア、シー・フルトン・ストリート229番 (72)発明者ストリクラー，ジェームズ・イーアメリカ合衆国マサチューセッツ州02188、ウェイマウス、オーデュボン・ロード141 番、アパートメント307 (72)発明者ヤング，ピーター・アールアメリカ合衆国ニュージャージー州08648、ローレンスビル、ヘンドリクソン・ロード 32番

Claims

【特許請求の範囲】１．サイトカイン抑制抗炎症薬結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。２．該核酸がＤＮＡである請求項１記載の分子。３．図２１および２２で特徴づけられる配列を有する請求項２記載の分子。４．ヒトＣＳＢＰである単離されたタンパク質。５．アミノ酸配列図１６により特徴づけられる請求項４記載のタンパク質。６．さらに、ヒト単球から単離し得、約４３,０００の分子量を有し、約４.５のpＩを有することで特徴づけられる請求項４記載のタンパク質。７．請求項１記載の核酸よりなるベクター。８．プラスミドである請求項７記載のベクター。９．クローニングプラスミドである請求項８記載のプラスミド。１０．発現プラスミドである請求項８記載のプラスミド。１１．請求項７記載のベクターよりなる組換え宿主細胞。１２．原核細胞である請求項１１記載の宿主細胞。１３．真核細胞である請求項１１記載の宿主細胞。１４．培地中および発現に十分な条件下でＣＳＢＰを発現する能力を有する組換え宿主細胞を培養し、該宿主細胞からＣＳＢＰを回収することよりなるＣＳＢＰの製造法。１５．（ａ）分析的に検出可能な試薬で標識された公知のＣＳＡＩＤを、ＣＳＡＩＤ／ＣＳＢＰ複合体を形成させるのに十分な条件下でＣＳＢＰと接触させ、（ｂ）上記複合体を、同定されるべき化合物よりなる試料と接触させ、（ｃ）上記化合物が上記複合体中の標識ＣＳＡＩＤの量を変化させる能力を検出することにより該化合物をＣＳＡＩＤとして同定することを特徴とする、化合物をＣＳＡＩＤとして同定する方法。１６．該ＣＳＢＰが、全細胞、細胞質ゾル細胞画分、膜細胞画分、および精製または部分精製された形態よりなる群より選ばれた形態である請求項１５記載の方法。１７．ａ．ＣＳＢＰを発現する細胞から可溶性細胞質ゾル画分を形成させ、ｂ．試薬ＣＳＡＩＤ／ＣＳＢＰ複合体を形成させるのに十分な条件下、上記画分を分析的に検出可能な試薬で標識されたＣＳＡＩＤと接触させ、ｃ．上記複合体を、ＣＳＡＩＤを含有する試料と接触させ、ｄ．該標識ＣＳＡＩＤ／ＣＳＢＰ複合体中の試薬量の減少を測定することによりＣＳＡＩＤを検出することを特徴とする、化合物をＣＳＡＩＤとして同定する方法。１８．上記細胞がヒト単球である請求項１７記載の方法。１９．上記細胞が組換え宿主細胞である請求項１７記載の方法。２０．上記試薬が放射能標識である請求項１７記載の方法。２１．ＣＳＢＰを発現する組換え宿主細胞を、結合を許容する条件下、同定すべきリガンドと接触させ、いずれかのリガンド結合タンパク質の存在を検出することを特徴とする、ＣＳＢＰに結合する能力を有するリガンドの同定方法。２２．該組換え宿主細胞がその細胞表面で上記ＣＳＢＰを発現する請求項２１記載の方法。２３．該タンパク質または該タンパク質を含有する膜画分が、同定すべきリガンドと接触させる前に上記細胞から単離されている請求項２１記載の方法。２４．請求項１５記載の方法により同定されるアンタゴニストまたはアゴニスト化合物。２５．請求項１５記載の方法により同定された化合物および医薬上許容される担体よりなる医薬組成物。２６．図１６のアミノ酸配列を含有するヒトＣＳＢＰをコードするmＲＮＡ分子のいずれかの配列と特異的に結合してその翻訳を阻止する能力を有する配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。２７．請求項５記載のヒトＣＳＢＰに向けられた抗体。２８．モノクローナル抗体である請求項２６記載の抗体。２９．ヒトを除くトランスジェニック哺乳動物であって、そのいずれかの細胞中で請求項３記載のＤＮＡを発現する能力を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。３０．ＣＳＢＰドメインおよび結合タンパク質／リガンド結合指示ドメインよりなる融合タンパク質を、該ＣＳＢＰドメインへの結合を許容する条件下、複数の化合物と接触させ、該タンパク質／リガンド結合指示ドメインの活性を増強または抑制する能力を有する候補薬物を同定することを特徴とする、ヒトＣＳＢＰに結合する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法。