JPH09503661A - 繊維芽細胞成長因子の表面ループ構造アナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 繊維芽細胞成長因子の構造アナログは、分子の折り畳みが有意に摂動されないような、因子の第９番目及び第１０番目のβ鎖においてアミノ酸配列置換、又は第９番目及び第１０番目のβ鎖を接続する表面ループに相当する配列を有する。好ましいアナログは、初めの因子の二次及び三次の構造全部を有し、そして高い親和性でヘパリン及び繊維芽細胞成長因子受容体ファミリーの１種以上のメンバーと結合する。或る態様では、置換は、他のアミノ酸配列、例えば他の構造的に関連する繊維芽細胞成長因子又はインターロイキンからのループ配列により置換されている。図は、ＦＧＦ−１ ＦＧＦ−２及びＩＬ―１βからのアミノ酸配列を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 繊維芽細胞成長因子の表面ループ構造アナログ 技術分野 本発明は、第９番目及び第１０番目のβ−鎖を接続する表面ループ中に異なる 一次構造を有する繊維芽細胞成長因子アナログに関する。アナログは、元の因子 に対する二次及び三次蛋白構造全部の類似性を保持するが、異なる生物学的性質 及び受容体結合特異性プロフィルを示す。 背景技術 ポリペプチド成長因子は、細胞の増殖及び分化のホルモン様モジュレータであ る。成長因子は、発生、再生及び傷の修復を含む種々の生理学的プロセスの調節 に関連があり、そして正常なプロセス並びに病態生理学的プロセスと関係がある 。種々の成長因子が、種々の組織及び細胞で同定されてきており、そしてこれら の因子に適用されている名前は、表皮成長因子、血小板由来成長因子、神経成長 因子、造血成長因子及び繊維芽細胞成長因子を含む。 繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、繊維芽細胞及び内皮細胞の分裂を誘発する ウシの脳又は下垂体から由来する活性として先ず記載された。脳からの一次マイ トジェンは、下垂体から単離されたそれとは異なることが、後で知られた。これ らの二つの因子は、それらが、類似の生物学的活性を有したがそれらの当電点が 異なるために、それぞれ酸性及び塩基性のＦＧＦと名付けられた。酸性及び塩基 性のＦＧＦは、約１５４個のアミノ酸を含む蛋白である。それらのアミノ酸配列 は、関連があり、それらの間で約５５％の配列同等性を有する。 酸性及び塩基性の繊維芽細胞成長因子は、多くの細胞のタイプで種々の生物学 的レスポンスを集合的に引き起こす大きなファミリーのヘパリン結合成長因子の メンバーであることが今知られており、これら細胞のタイプは、中胚葉及び神経 外胚葉の起源のもの、例えば内皮細胞、平滑筋細胞、副腎皮質細胞、前立腺及び 網膜の表皮細胞、希突起グリア細胞、星状細胞、クロンドサイト（Ｃｈｒｏｎｄ ｏｃｙｔｅ）、筋原細胞、及び骨芽細胞を含む。元のファミリーのメンバーとし て、酸性及び塩基性のＦＧＦは、それぞれＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２として現在 記述されている。ファミリーの７種の他のメンバーは、細胞の増殖及び分化のそ れらの調節、並びに他のＦＧＦへのそれらの配列同等性に基づいて同定されてい る。 細胞の成長を剌激する分裂誘発レスポンスを引き出すことに加えて、繊維芽細 胞成長因子は、非分裂誘発のやり方で反応する多数の細胞のタイプを剌激するこ とができる。これらの活性は、傷領域への細胞の移行の促進（化学走性）、新し い血管の形成の開始（脈管形成）、神経の再生及び生存の変調（神経向性）、内 分泌機能の変調、並びに特定の細胞蛋白発現、細胞外マトリックス生成及び細胞 生存の刺激或いは抑制を含む（Ｂａｉｒｄ、Ａ．、及びＢｏｅｈｌｅｎ、Ｐ．Ｈ ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９５（１）：３６９−４ １８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９０）。これらの性質は、傷の治癒、神経の修復 、副行の血管形成などを促進する治療上のアプローチに繊維芽細胞成長因子を使 用する基礎を提供する。例えば、繊維芽細胞は、心疾患及び手術における心筋の 損傷を最低にすることが示唆されている（米国特許第４３７８３４７号、Ｆｒａ ｎｃｏ）。 ＦＧＦ−２及び他のＦＧＦに関する最近の研究は、受容体媒介経路の分子的な 詳細に集中し、それにより、それらの色々な生理学的な活性は、これらの因子の 作用に良く似るか又は阻害するかの何れかができる治療上有用な剤のデザインの ための情報を得る方法として、表現される。種々の源から単離されたＦＧＦ−２ の一次構造は周知であり、そしてウシ及びヒトのＦＧＦ−２が、Ｅ．ｃｏｌｉ及 びＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにクローンされ発現されているので、二次及び三次の 構造が注目されている。 ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２の三次元構造は、決定されている（Ｅｒｉｋｓｓｏ ｎ、Ｅ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：３４４１ −３４４５（１９９１）、Ｚｈａｎｇ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：３４４６−３４５０（１９９１）、及びＺｈｕ、Ｈ．ら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：９０−９３（１９９１））。これらの研究において、Ｆ ＧＦ−１及びＦＧＦ−２は、抗原性又は分裂誘発性の剌激に対するレスポンスで マクロファージ及びＴ細胞により生成されるサイトカイン インターロイキン− １α、及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１ａ及びＩＬ−１β）、蛋白因子に ついて観察されるそれに有意に似た折り畳みパターンを示すことが示されたが、 インターロイキン−１ポリペプチドの一次構造は、ＦＧＦに対してアミノ酸配列 は、わずか約１０％しか一致しない。 ＦＧＦ−２の全部の構造は、三角形のピラミッドとして記述でき、その場合、 三つの側面のそれぞれは、２本のβ鎖がともに形成されて、６本の逆平行の鎖の βシートの胴を形作る（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、Ｅ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４４１−３４４５（１９９１））。ピラミッ ドの基礎は、６本の追加のβ鎖から形成されて、１２本の鎖の全部について胴の 一端を閉じるためにピラミッドの三つの側面から延在する。それ故、三つの面を 有する反復は、ポリペプチド鎖の折り畳みで観察され、そして三つの部分を有す るように見える軸は、分子の基礎の中心を通り、さらにピラミッドの頂点を通っ て延在する（同上）。蛋白のＦＧＦファミリー内に保存されたアミノ酸の内、殆 どは、ＦＧＦ−２の芯のβ鎖領域内に存在し、これらの蛋白のそれぞれが、ＦＧ Ｆ−２のそれに似た三次元構造全部を有することを支持する。 ＦＧＦの生物学的なレスポンスは、特定な細胞表面受容体に対する成長因子の ヘパラン硫酸塩依存結合により媒介されるが（Ｇｉｖｏｌ、Ｄ．及びＹａｙｏｎ 、Ａ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３３６２−３３６９（１９９２）及びＪａｙｅ、Ｍ ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３５：１８５−１９９ (１９９２)）、ＦＧＦとのヘパリン及び受容体の分子的相互反応、並びにシグナ ルトランスダクション経路の結果の正確な性質は知られていない。ＦＧＦ配列に 関連する合成ペプチドを使用する研究は、ＦＧＦ−２（３３−７７）及び（１０ ６−１２９）がヘパリンに結合し、そしてＦＧＦ活性の分裂誘発アッセイにおけ る弱い部分的なアゴニスト及び拮抗剤として作用する（Ｂａｉｒｄ、Ａ．ら、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２３２４−２３２８（１９ ８ ８））。同じ研究は、受容体結合に含まれる配列ＦＧＦ−２（１１５−１２４） を同定した。セグメントは、第９番目のβ鎖の中心で始まり、折り畳まれた分子 の表面の上でやや開いたループを作り、そして第１０番目のβ鎖の始まりで終わ る。未変性の蛋白中のこの配列（１１８−１２２）は、推定されているヘパリン 結合部位を形成できる塩基性の表面残基の集まりに近い小さい表面ループを形成 する（Ｚｈａｎｇ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ８：３４４６−３４５０（１９９１））。 この配列は、又ｃＡＭＰ依存蛋白キナーゼにより燐酸化できるＴｈｒ−１２１ を含み（Ｆｅｉｇｅ、Ｊ．Ｊ．及びＢａｉｒｄ、Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７４−３１７８（１９８９））、Ｔｈｒ− １２１は、この論文ではＴｈｒ−１１２として示されている。それは、研究者が 、ポリペプチドのＮ末端トランケート形を使用し、それは、完全な生物学的活性 を示すが通常の１５４個のアミノ酸よりむしろ１４６個のそれを有するからであ る。Ｔｈｒ−１２１の燐酸化は、その受容体への放射線同位元素ラベルＦＧＦ− ２結合と競合する増大した能力を示す一つの形の蛋白の発生をもたらすが、蛋白 の燐酸化及び非燐酸化の形の生物学的性質に相違がないことが観察された（同上 ）。ＦＧＦ−２とは対照的に、ＦＧＦ−１は、キナーゼに関する基質ではない。 データは、配列１１５−１２４は、受容体結合に含まれず、そしてそれらが、分 子の完全な受容体結合ドメインを規定しないか、又はそれらが、Ｔｈｒ−１２１ の燐酸化の生理学的有意性を示さないという仮説と一致する。 へパリン及び受容体結合領域に加えて、ＦＧＦ中の特異的配列が、リガンド誘 発シグナルトランスダクションに影響するという証拠が存在する。例えば、ＦＧ Ｆ−２の残基２７−３２（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）の欠失又 は塩基性残基Ａｒｇ−１１８、Ｌｙｓ−１１９、Ｌｙｓ−１２８及びＡｒｇ−１ ２９の突然変異は、蛋白の分裂誘発活性に影響しないように見えたが、プラスミ ノーゲン括性剤遺伝子の発現を排除した（欧州特許出願公開第３６３６７５号、 Ｂｅｒｇｏｎｚｏｎｉら、及びＰｒｅｓｔａ、Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１８５：１０９８−１１０７（１９９２））。 少なくとも４種の異なる繊維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）は、同定され ており（Ｗｅｒｎｅｒ、Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１２：８２−８８ （１９９２））、そして異なる受容体の形の間の機能的相違は、観察されている 。交互スプライシングによる同じ遺伝子から由来する異なるＦＧＦ受容体の形は 、異なるリガンド結合性を有し、さらに異なるＦＧＦ受容体遺伝子からの類似の スプライス変異型は、ＦＧＦファミリーの異なるメンバーと結合する（Ｊｏｈｎ ｓｏｎ、Ｄ．Ｅ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｌ．Ｔ．、Ａｄｖ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ． ６０：１−４１（１９９３））。従って、繊維芽細胞成長因子受容体は、多数の 構造的変異型を示し、さらに受容体とそれらの種々のリガンドとの間にかなりの 交差反応性を示す（Ｙａｙｏｎ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１８８５−１８ ９０（１９９２））。第三の免疫グロブリン様ドメインのカルボキシ末端領域は 、異なるＦＧＦメンバーの特異性を規定する構造要素であるように思われるが（ 上記のＷｅｒｎｅｒら及びＹａｙｏｎら）、ＦＧＦ−受容体−ヘパリン相互反応 の正確な性質及び関係する蛋白残基は、明らかにされるべきである。 発明の開示 繊維芽細胞成長因子の新しい構造アナログを提供するのが本発明の目的である 。 薬理学的に別のものである結合及び生物学的性質を有する（即ち、野生型因子 と普通は結合する及び／又は野生型因子で観察されるそれとは異なる生物学的性 質を示す、受容体と同じ又はそれとは異なるＦＧＦ受容体へ結合する）繊維芽細 胞成長因子アナログを提供するのが、本発明の他の目的である。 他のアミノ酸配列により置換された表面ループの全て又は一部を有する、繊維 芽細胞成長因子の構造アナログ例えばヒト繊維芽細胞成長因子−２の構造アナロ グを提供するのが、本発明の別のしかもさらに特定の目的である。 これら及び他の目的は、ポリペプチドの二次及び三次の構造全部が、有意に摂 動される（ｐｅｒｔｕｒｂ）ことなく、しかもアナログがヘパリンに結合するよ うに、表面ループ又は表面ループに隣接する配列にアミノ酸の変化を有する繊維 芽細胞構造アナログを提供する本発明に、より達成される。さらに特に、本発明 は、β鎖９及び１０と隣接鎖との相互反応が、有意に摂動することなく、しかも アナ ログがヘパリンに結合するように、第９番目及び第１０番目のβ鎖と接続する表 面ループに相当する配列、又は因子の第９番目及び第１０番目のβ鎖においてア ミノ酸配列置換を有する繊維芽細胞成長因子の構造アナログを提供する。アナロ グは、繊維芽細胞成長因子受容体への結合親和性を示す。アナログの結合特異性 は、好ましくは、対応する受容体に対する未変性の因子の結合親和性とは異なる 。一つの態様では、アナログは、生体内の血管形成を剌激する。 好ましい繊維芽細胞成長因子構造アナログは、第９番目から第１０番目のβ鎖 へ延在する表面ループにおけるアミノ酸配列置換を有する。或る態様では、第９ 番目から第１０番目のβ鎖へ延在する成長因子表面ループにおけるアミノ酸配列 の全て又は一部は、他のアミノ酸配列、例えば関連のある繊維芽細胞成長因子又 はインターロイキンポリペプチドから由来する対応するアミノ酸配列により置換 される。 従って、本発明の繊維芽細胞成長因子アナログは、他の成長因子における対応 するループ配列の代わりに、繊維芽細胞成長因子−１配列Ｌｙｓ１１５−Ｌｙｓ １１６−Ｈｉｓ１Ｉ７−Ａｌａ１１８−Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ１２０−Ａｓｎ１ ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２のアミノ酸１１５−１２１）、繊維芽細胞成長因子 −２配列Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０−Ｔｈｒ１２１−Ｓｅｒ１ ２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸１１８−１２２）、繊維芽細胞成長因子 −３配列Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ− Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ− Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４のアミノ酸１３２−１ ５２）、繊維芽細胞成長因子−４配列Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５のアミノ酸１７２−１７６）、繊維芽細胞成長因子−５ 配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌ ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６のアミノ酸１７６−１８６）、繊維 芽細胞成長因子−６配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ７のアミノ酸１７４−１７８）、繊維芽細胞成長因子−７配列Ａｌａ− Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８のアミノ酸１５４−１６３）、繊維芽細胞成長因子−８配列Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９のアミノ酸１４４− １４８）及び繊維芽細胞成長因子−９配列Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈ ｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０のアミノ酸１５１−１６１）を使用することにより形成されるアナログを含 むが、これらに限定されない。ループのフランキング配列を変化させたアナログ 、及びループ配列を含むペプヂドフラグメントアナログは、本発明により相応じ て提供される。 例えば、残基１１２−１２８においてアミノ酸配列置換を有するヒト繊維芽細 胞成長因子−２構造アナログは、ＦＧＦ−２と同じ二次及び三次の構造全部を維 持するが、異なる生物学的性質を示す因子を生ずる。これらの例示の態様では、 ＦＧＦ−２ループ配列は、任意のサイズ又は組成の挿入断片により置換される。 或る誘導体は、残基１１５−１２４を変えることにより製造され、他のものは、 ループ残基１１８−１２２を変えることにより製造される。一つの態様では、例 えば、ＦＧＦ−２のループは、同じ又は他の種からのＦＧＦ−１から由来する対 応するアミノ酸により置換され、他の態様では、同じ又は他の種からのインター ロイキン−１βが使用され、そして他の態様では、同じ又は他の種からのＦＧＦ −７からのループが使用される。上記で要約されるように、これらのアナログは 、ヘハリン、及び未変性の繊維芽細胞成長因子受容体と結合する。 本発明は、又繊維芽細胞成長因子誘導体をエンコードすＤＮＡ、ＤＮＡを含む 生物学的に機能的な環状プラスミド又はウイルスＤＮＡ、及び宿主細胞をして新 しい因子を発現させるやり方でベクターにより形質転換された又はトランスフエ クションされた原核又は真核宿主細胞例えばＥ．ｃｏｌｉも提供する。 図面の簡単な説明 図１は、ループ領域におけるヒトＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１及びＩＬ−１βの配 列配置を示す（下記の配列リストセクションでＩＤ Ｎｏ １−３とされる）。 アンダーラインされた配列は、第９番目のβ鎖の末端に位置する表面ループに相 当する。かっこ内の残基は、ウシ配列に見いだされる残基を示す。 図２は、¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２とともにインキュベートされた密集乳児ハムスタ ー腎細胞、並びに指示された濃度の競合物ＦＧＦ−２（白丸）、構造アナログＦ ＧＦ−２ＬＩ（以下に詳述、黒い四角）、そして構造アナログＦＧＦ−２ＬＡ（ 以下に記述、黒い三角）の競合的受容体結合をプロットする。 図３は、添加された未ラベルＦＧＦ蛋白の機能としてＮＩＨ ３Ｔ３細胞に存 在するＦＧＦ−受容体タイプ１に対する、放射性ヨード化ＦＧＦ−２（黒い四角 ）、ＦＧＦ−２ＬＡ（白丸）及びＦＧＦ−２ＬＩ（白い三角）の結合をプロット する。 図４は、指示された濃度のＦＧＦ−２（黒丸）、ＦＧＦ−２ＬＩ（白い四角） 及びＦＧＦ−２ＬＡ（白い三角）とともに、８０００細胞／穴で植え付けされさ らに５日間インキュベートされた成熟ウシ大動脈弓内皮細胞の内皮細胞の成長を 示す。 図５は、野生型又は突然変異体のＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）により誘導さ れる細胞関連ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤の生成を示す棒グラフ である。 図６は、タイプＩコラーゲンゲル上で培養されたＡＢＡＥ細胞による管状の構 造の形成を誘導するそれらの能力により測定される、野生型又は突然変異体のＦ ＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）の生体外血管形成活性の効力を示す棒グラフである 。データは、同じ条件の細胞培養が、重複した穴で保持される代表的な実験から のものである。それぞれの穴の三つから四つの領域は、イメージ分析により調べ られ、そして平均値及び標準偏差が示される。 図７は、ＦＧＦ−２におけるアミノ酸残基１１３及び１２８に相当する残基間 のＦＧＦファミリーの９個のメンバーの間のアミノ酸配列の比較を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１；ＦＧＦ−１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２として示され、そして他 のＦＧＦは、次々にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４−１０として示されるが、但しＦＧＦ −１ウシ配列のＨｉｓ１２１は、ヒト配列のＡｓｎにより置換される）。数を数 えるシステムは、ＦＧＦ−２に関連し、そして星印は、同様な保存された残基に 関する。ＦＧＦ−２の位置Ｓｅｒ１１７−Ｔｒｐ１２３間に位置する残基は、他 のＦＧＦが挿入断片及び変化を含む位置を示す。第９番目及び第１０番目のβ鎖 及びループ領域における相同の配列を説明するために、図は、アミノ酸に関する 標準の一文字の命名法を使用する。Ａ、Ａｌａ；Ｃ、Ｃｙｓ；Ｄ、Ａｓｐ；Ｅ、 Ｇｌｕ；Ｆ、Ｐｈｅ；Ｇ、Ｇｌｙ；Ｈ、Ｈｉｓ：Ｉ、Ｉｌｅ；Ｋ、Ｌｙｓ；Ｌ、 Ｌｅｕ；Ｍ、Ｍｅｔ；Ｎ、Ａｓｎ；Ｐ、Ｐｒｏ；Ｑ、Ｇｌｎ；Ｒ、Ａｒｇ；Ｓ、 Ｓｅｒ；Ｔ、Ｔｈｒ；Ｖ、Ｖａｌ；Ｗ、Ｔｒｐ；Ｙ、Ｔｙｒ。 図８は、ＦＧＦ−２（黒い三角）及びＦＧＦ−２ＬＡ（黒丸）によるウサギ耳 チェンバーモデルに誘導された血管新生の程度の比較を示す。ＦＧＦのないコン トロールは、黒い四角で表示される。 図９Ａは、添加される未ラベルＦＧＦ蛋白の関数としての可溶性の組み換えＦ ＧＦ受容体タイプ１に対する添加されたＦＧＦ−１（白丸）、ＦＧＦ−２（白い 四角）、ＦＧＦ−７（黒丸）、ＦＧＦ−２ＬＡ（黒い四角）、及びＦＧＦ−２Ｌ Ｉ（白い三角）の関数としての¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２の結合をプロットする。図９ Ｂは、同様な結合プロフィルをプロットするが、但し可溶性の組み換えＦＧＦ− ２（ＩＩＩｃ）を使用する。 発明を実施するための最良の形態 本発明は、ＦＧＦ分子の二次及び三次の構造の全部を摂動させないやり方によ る繊維芽細胞成長因子の表面ループ残基の変化は、ＦＧＦアゴニスト及び潜在的 な拮抗剤を含む、変化ししかも望ましい生理学的性質を有する一連の構造アナロ グを生ずるという発見に基づく。ループ配列、又はループ配列に隣接する配列に おける変化は、ヘパリンに結合しそして未変性の繊維芽細胞成長因子受容体への 結合親和性を示すアナログを生ずる。 「拮抗剤」により、例えば生物学的レスポンスを顕在化させることなく、細胞 受容体へ結合するような、一体となって他の作用を取り消し勝ちな任意の物質を 意昧する。ＦＧＦでは、拮抗剤は、ＦＧＦ受容体へ結合するが、繊維芽細胞、内 皮細胞及び大グリア細胞の増殖又は移動を剌激しない任意の物質を含むが、これ らに限定されない。対照的に、「アゴニスト」により、分裂誘発活性、血管形成 、化学走性などを含む、未変性の因子により通常剌激される細胞受容体に親和性 を有しそして生理学的活性を刺激する任意の物質を意味する。本明細書で使用さ れ つとき、用語は限定的ではなく、そして単一の因子は、未変性の因子により媒介 される一つの生物学的機能に対してアンタゴニズムを示し、そして他の機能に対 してアゴニズムを示すことができる。これが生ずるとき、未変性の因子の生物学 的活性は、アナログにおいて薬理学的に分離されるといわれる。 蛋白は、本明細書において、もしそれが、ＦＧＦファミリーの他のメンバーと 有意な配列及び三次元の構造的相同性、生体外又は生体内のアッセイにおけるＦ ＧＦ様活性を示し、そしてヘパリン又はヘパリン様物質へ結合するならば、繊維 芽細胞成長因子（ＦＧＦ）として規定される。「ヘパリン」により、抗凝固剤の 性質を有するか又は有しない、「アグリカン」として遊離の形で、又は「プロテ オグリカン」として蛋白の芯に結合した、Ｄ−グルクロン酸及びＤ−グルコサミ ンからなる不均質なサルフェート化陰イオン性多糖類を意味する。「ヘパリン様 」物質は、ヘパリンに関運するオリゴ糖構造を有するが、抗凝固剤括性を有する か又は有しない分子である。任意のタイプの繊維芽細胞成長因子又は突然変異蛋 白質又は誘導体は、本発明により包含され、特に拮抗剤又はアゴニストの性質、 又はその両者を示すループ配列ペプチドとともに、ヒト繊維芽細胞成長因子を包 含する。 広く言えば、本発明の繊維芽細胞因子アナログは、β鎖中に少なくとも１個の アミノ酸の欠失、挿入又は置換を有する繊維芽細胞成長因子の構造アナログ、又 は隣接する鎖が摂動することなくそして分子がその二次及び三次の構造全部を維 持するようにβ鎖を接続するループを含む。二次及び三次の構造は、ヘパリン結 合、ＦＧＦ受容体への結合、分光学（紫外線、肉眼、又は円二色性光を使用する ）、Ｘ線結晶学及び生物学的活性により決定される。 特に好ましいのは、Ｈｙｎｅｓ、Ｔ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：７３− ７６（１９８９）により酵素について開示された、親分子の立体配座を維持しつ つ、ターン（ｔｕｒｎ）の構造カセット又はモジュールの置換に類似した、２本 のβ鎖を結合するループ中のＦＧＦ配列の置換である。或る態様では、因子の第 ９番目又は第１０番目のβ鎖、又は第９番目又は第１０番目のβ鎖を接続する表 面ループに相当する配列は、分子全部の折り畳みが有意に摂動することがないよ うに、任意のサイズ又は組成のアミノ酸配列挿入断片により置換される。或る態 様では、表面ループは、他の因子からの表面ループにより置換される。従って、 本発明は、ランダムループ、長い又は短いループ、及び異なる電荷のループ及び それらのステム及びアンカーを含む、構造的に関連のあるそして閏連のない配列 によるループ及びループステム及びアンカー置換を特に包含する。それは、又結 合の研究及び生物学的アッセイにおいてこれらのループによく似たペプチドフラ グメントも包含する。 以下にさらに十分に示されるように、これらの鎖中のアミノ酸の数え方は、便 宜のために、ＦＧＦ−２に関してなされる。摂動及び鎖の調節性は、本明細書で は、三次元の感覚で規定され、そして上記のように測定される。全部の折り畳み は、アナログ中に保持される。好ましいアナログは、受容体へ親和性を示す対応 するＦＧＦファミリーメンバーの結合より大きいが、１００倍より小さい親和性 で、ＦＧＦ受容体へ結合する。 アナログの多くが代表的に結合する受容体は、未変性の乳児ハムスター腎（Ｂ ＨＫ）細胞繊維芽細胞成長因子受容体、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞受容体又は特別なＦ ＧＦへ特異的な他の受容体を含む。結合は、好ましくは、その受容体に対する対 応する未変性の因子の結合に実質的に似た又はそれより優れた親和性を示す。本 発明の利点は、ループの操作が、それからループが由来する対応する因子に対し て同様な結合プロフィルを示すアナログを生ずることである。それ故、本発明の 或るアナログは、異なる細胞のタイプ上の受容体を含む、未変性の因子が結合し ない受容体を標的とする。例えば、内皮細胞受容体と元来結合する因子は、内皮 細胞受容体と結合するように操作されることができる。例は、以下に示される。 一つの態様は、生体内で血管形成活性を刺激する。 特に好ましい構造アナログは、第９番目から第１０番目のβ鎖へ延在しそして 分子がＥｒｉｋｓｓｏｎら、Ｚｈｕらにより記載されたように折り畳まれるとき 表面から突き出す、表面ループの配列において、因子が、少なくとも一つのアミ ノ酸欠失、付加又は置換を有し、さらに未変性の因子の二次及び三次の構造全部 を有するものである。或る態様では、置換は、他のＦＧＦ種又は関連する分子か らの配列である。他の態様では、置換は、任意のＦＧＦ種に構造的に関連がなく 、そしてより少ない又はより多いアミノ酸、又は異なる電荷を有するアミノ酸を 含 むことができる。従って、任意のアミノ酸配列は、鎖を接続しているループ中の 配列置換として使用できる。 例えば、本発明の構造ＦＧＦアナログは、表面ループ中の少なくとも一つのア ミノ酸欠失、付加又は置換、特にアミノ酸配列置換を有するアナログを含み、該 ループは、繊維芽細胞成長因子−１配列１１２−１２３、特にＬｙｓ１Ｉ５−Ｌ ｙｓ１１６−Ｈｉｓ１１７−Ａｌａ１１８−Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ１２０−Ａｓ ｎ１２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２のアミノ酸１１５−１２１）、繊維芽細胞成長 因子−２配列１１５−１２４、特にＡｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０ −Ｔｈｒ１２１−Ｓｅｒ１２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸１１５−１２ ４）、繊維芽細胞成長因子−３配列Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ− Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ− Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ４のアミノ酸１３２−１５２）、繊維芽細胞成長因子−４配列Ｔｙｒ−Ｌｙｓ −Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５のアミノ酸１７２−１７６） 、繊維芽細胞成長因子−５配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６のアミノ 酸１７６−１８６）、繊維芽細胞成長因子−６配列Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｎ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７のアミノ酸１７４−１７８）、繊維芽細胞 成長因子−７（又ケラチン生成細胞又はＫＧＦとして知られている）配列Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８のアミノ酸１５４−１６３）、繊維芽細胞成長因子−８配列Ａｌ ａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９のアミノ酸１４４ −１４８）及び繊維芽細胞成長因子−９配列Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ− Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ１０のアミノ酸１５１−１６１）を使用することにより形成されるアナログを 含むが、これらに限定されない。ＦＧＦファミリー中の表面ループ配列の比較は 、図７に画かれる。本発明のこれらの態様では、構造アナログは、一つのＦＧＦ の表面ループ配列を、例えば他の因子からの表面ループ配列であるがこれに限定 されないような他のアミノ酸配列により置換することにより製造される。 ループステム及びアンカー点を含む、ループに影響する近くの領域における変 化は、分子の折り畳み全部が摂動しない限り、本発明により包含される。それ故 、本発明のアナログは、繊維芽細胞成長因子−１配列Ｔｙｒ１１２−Ｉｌｅ１１ ３−Ｓｅｒ１１４−Ｌｙｓ１１５−Ｌｙｓ１１６−Ｈｉｓ１１７−Ａｌａ１１８ −Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ１２０−Ａｓｎ１２１−Ｔｒｐ１２２−Ｐｈｅ１２３− Ｌｙｓ１２４−Ａｓｎ１２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２のアミノ酸１１２−１２５ ）、繊維芽細胞成長因子−２配列Ｔｒｙ１１５−Ａｒｇ１１６−Ｓｅｒ１１７− Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０−Ｔｈｒ１２１−Ｓｅｒ１２２−Ｔ ｒｐ１２３−Ｔｙｒ１２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸１１５−１２４） 、繊維芽細胞成長因子−３配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙ ｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌ ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅ ｕ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４のアミノ酸１２９−１５４）、繊維 芽細胞成長因子−４配列Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５のアミノ酸１６９−１７８）、繊 維芽細胞成長因子−５配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ− Ｔｙｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６のアミノ酸１７３−１８８）、繊維芽細胞成長因 子−６配列Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ −Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７のアミノ酸１７１−１８０）、繊維芽 細胞成長因子−７配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈ ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８のアミノ酸１５１−１６４）、繊維芽細胞成長因子−８配列Ａｓｎ−Ａ ｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌ ｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９）及び繊維芽細胞成長因子−９配列Ａｓｎ−Ｔｒｐ −Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ −Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ −Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０）における、突然変異特に配列置換を有する構造を含む。本発明は、又ヘパ リン及びＦＧＦ受容体結合を示すこれらのループに相当するペプチドも包含する 。 ＦＧＦ−２の構造アナログは、或る態様では好ましい。「ＦＧＦ−２」により 、生物学的活性を示す全ての繊維芽細胞成長因子−２を意味し、それは、初めて 単離且つ配列決定された１４６個のアミノ酸ポリペプチド、完全なポリペプチド であると現在考えれている１５４個のアミノ酸の形、活性を示すトランケート形 、胎盤ＦＧＦのような拡張形、文献に記載された高分子量のＮ末端の拡張形、及 びこれらの任意のものの誘導体及び突然変異体を含むアナログを含む。用詰は、 特に、適切なベクターにより哺乳動物又は昆虫の細胞で発現された、又は任意の 種からＥ．ｃｏｌｉ又はＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおいてクローンされたＤＮＡ から発現された組み換えポリペプチド、並びに哺乳動物の組織から抽出された天 然のＦＧＦ−２を含む。 ヒトＦＧＦ−２は、多くの態様において好ましい。本発明により操作できる第 ９番目又は第１０番目のβ鎖を有するヒトＦＧＦ−２は、アミノ酸付加、アミノ 酸置換及びアミノ又はカルボキシル末端の部分の欠失を含むアミノ酸欠失を有す るＦＧＦ−２、並びに他の蛋白のＮ又はＣ末端でＦＧＦを含むキメラ蛋白を含む が、これらに限定されない。本発明により操作できるＦＧＦ−２の例は、セリン のような中性アミノ酸により置換されたシステインを有するか、又はＳｅｎｏら の欧州特許出願公開第２８１８２２号に安定性の増大を有すると示唆されている 他の酸により置換されたアスパラギン酸、アルギニン、グリシン、セリン或いは ハリンを有するもの；さらに安定なアナログを生ずるための異なるアミノ酸残基 により、天然のＦＧＦ−２に見いだされるシステインの少なくとも１個そしてさ らに好ましくは２個を置換することにより形成される突然変異蛋白質（Ａｒａｋ ａｗａ及びＦｏｘの欧州特許出願公開第３２０１４８号）；カルボキシル末端か らアミノ酸を欠きそして任意にＳｅｎｏらの欧州特許出願公開第３２６９０７号 に活性を維持しつつ改良された安定性を有すると示唆されたアミノ酸置換を有す る突然変異蛋白質；Ｓｅｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２３９ −２４５（１９９０）により記載されたもののようなアミノ又はカルボキシル末 端の実質的な部分を欠く突然変異体；Ｆｉｄｄｅｓらの欧州特許出願公開第２９ ８７２３号に示唆されている種々の点突然変異又はＮ末端欠失を有する突然変異 蛋白質；上記のＢｅｒｇｏｎｚｏｎｉの欧州特許出願公開第３６３６７５号に開 示されている失われ且つ置換されたアミノ酸を含むＭ１−ｂＦＧＦ−Ｍ６−ｂＦ ＧＦ突然変異蛋白質；Ｓｅｄｄｏｎ、Ａ．Ｐ．ら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．６３８：９８−１０８（１９９１）に記載されたような、Ｇｌｕ による組み換えＦＧＦのＡｌａ−３及びＳｅｒ−５の置換により製造される容易 に発現されるＦＧＦ及びそのアナログなどを含む。 本発明の実施では、本発明の繊維芽細胞成長因子例えばヒトＦＧＦ−２構造ア ナログは、残基１１２（Ｔｙｒ）と１２８（Ｌｙｓ）との間の配列において、少 なくとも１個のアミノ酸、好ましくは１個より多いアミノ酸を欠失、付加又は置 換することにより製造される。或る態様では、置換は、残基１１５（Ｔｙｒ）と １２４（Ｔｙｒ）との間で生じ、他の態様では、変化は、１１８（Ａｒｇ）と１ ２２（Ｓｅｒ）との間で生ずる。上記で規定したように、他のＦＧＦアナログに 関する数え方のやり方は、ＦＧＦ−２に準ずる。 或る好ましい態様では、繊維芽細胞成長因子構造アナログは、因子の第９番目 又は第１０番目のβ鎖、又は第９番目及び第１０番目のβ鎖を接続する表面ルー プに相当する配列にアミノ酸配列置換を有する。アミノ酸配列は、本明細書では 、少なくとも３個のアミノ酸、代表的には少なくとも５個のアミノ酸の配列とし て規定される。アミノ酸配列の例は、上記に示される。 例えば、繊維芽細胞成長因子構造アナログ、例えばヒトＦＧＦ−２構造アナロ グは、分子の折り畳み仝部が有意に摂動しないかぎり、任意の長さのランダムア ミノ酸配列により第９番目−第１０番目のβ鎖の表面ループのアミノ酸配列の全 て又は一部を置換することにより製造される。従って、構造的に関連のあるポリ ペプチドから由来する配列、例えば他の種からの繊維芽細胞成長因子−２、ヒト 繊維芽細胞成長因子−１又は３−９、他の種からの繊維芽細胞成長因子−１又は ３−９、ヒトインターロイキン−１α又はβ、又は他の種からのインターロイキ ン−１α又はβ、大豆トリプシン阻害剤又はヒスアクトフィリンが、使用できる 。或る態様では、好ましいＦＧＦ−２アナログは、Ｔｈｒ１２１で燐酸化を排除 するアミノ酸置換を含む。 一つの態様では、以下にさらに記述される望ましい生物学的性質を示す本発明 の構造アナログは、以下の実施例でＦＧＦ−２ＬＩと記述される、ヒトインター ロイキン−１βからの対応するアミノ酸配列Ａｌａ１１５−Ｇｌｎ１１６−Ｐｈ ｅ１１７−Ｐｒｏ１１８−Ａｓｎ１１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３のアミノ酸２３ １−２３５）により置換された表面ループアミノ酸Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９ −Ｔｙｒ１２０−Ｔｈｒ１２１−Ｓｅｒ１２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ 酸１１８−１２２）を有する繊維芽細胞成長因子−２誘導体からなる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）。他の態様では、アナログは、以下の実施例でＦＧＦ−２ＬＡ と記述される、ウシＦＧＦ−１から由来する対応するアミノ酸配列Ｌｙｓ１１５ −Ｌｙｓ１１６−Ｈｉｓ１１７−Ａｌａ１１８−Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ１２０− Ｈｉｓ−１２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２のアミノ酸１１５−１２１）により置換 された表面ループアミノ酸Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０−Ｔｈｒ １２１−Ｓｅｒ１２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸１１８−１２２）を有 するヒト繊維芽細胞成長因子−２誘導体からなる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６）。 さらに他の態様では、アナログは、ＦＧＦ−７（又ケラチン生成細胞成長因子と して知られている）からの対応する９残基アミノ酸ループ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８の残基１５４−１６２）、ＦＧＦ−７からのＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔ ｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕにより置換された表面ループア ミノ酸１１８−１２２を有するヒト繊維芽細胞成長因子−２誘導体からなる。 本発明の新規な繊維芽細胞成長因子構造アナログは、当業者に周知の化学的、 生化学的又は物理的な手段を使用して、構成アミノ酸又はペプチドから点突然変 異、配列交代又はポリペプチドアセンブリにより製造される。別に、本発明の新 規な繊維芽細胞成長因子アナログは、表面ループ突然変異蛋白質をエンコードす るＤＮＡの製造、そのＤＮＡのベクターへの挿入、宿主細胞中のベクターの発現 、及びそれにより生成される突然変異ＦＧＦの単離を含む、組み換え蛋白合成に より製造される。 本発明のＦＧＦ構造アナログをエンコードするＤＮＡは、標準の手段を使用し て生成されるヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの付加又は点突然変異により繊 維芽細胞成長因子の遺伝子を変えることにより製造される。説明は、実施例１及 び２に示されている。遺伝子コードの縮重のために、種々のコドン変化の組み合 わせは、本発明のＦＧＦアナログをエンコードするＤＮＡを形成するように選択 でき、そのため、ループ突然変異ＦＧＦをエンコードするＤＮＡをもたらす任意 のヌクレオチド欠失、付加又は点突然変異の１種以上は、本発明に包含される。 或るコドンは、或るタイプの生物においてポリペプチドの発現にさらに能率的で あるので、本発明のＦＧＦ突然変異蛋白質についてコードするＤＮＡ物質を生ず るための繊維芽細胞遺伝子の改変の選択は、好ましくは、組み換えベクターの宿 主として働く生物のタイプの最も有効な発現を生ずるものである。改変されたコ ドンの選択は、又ベクター構築の考察に基づく。 本発明のＦＧＦアナログについてコードするＤＮＡを形成するように改変され た繊維芽細胞成長因子ＤＮＡ出発物質は、天然、組み換え又は合成の何れでもよ い。従って、ＤＮＡ出発物質は、組織又は組織培養から単離されるか、従来の方 法を使用してオリゴヌクレオチドから構築されるか、市場から得られるか、又は 繊維芽細胞からＦＧＦについてコードするＲＮＡを単離し、このＲＮＡを使用し て対応する二本鎖ＤＮＡを合成するテンプレートとして使用される一本鎖ｃＤＮ Ａを合成することにより製造される。 本発明を説明するのは、実施例１及び２において構築されたようなヒトＦＧＦ −２アナログを規定するクローンされた相補性ＤＮＡ配列である。又包含される のは、本明細書に記載された相補性ＤＮＡに相同的又は密接に関運するＤＮＡ配 列、即ちＦＧＦアナログｃＤＮＡ、及びそれに対応するＲＮＡへ、特に、高い頻 度の相補的塩基配列を有する核酸フラグメント間でのみ対（ｐａｉｒｉｎｇ）を もたらす厳重な条件下で、ハイブリッドするＤＮＡ配列である。ＦＧＦエンコー ド配列に加えて、本発明により包含されるＤＮＡは、遺伝子の発現を助ける、ベ クター構築配列に応じて、追加の配列を含むことができる。 本発明のＦＧＦアナログをエンコードするＤＮＡ、又はそれに相当するＲＮＡ は、次に微生物的宿主生物を形質転換するのに使用されるベクター、例えばｐＢ Ｒ、ｐＵＣ、ｐＵＢ又はｐＥＴシリーズプラスミド中へ挿入される。本発明で有 用な宿主生物は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵 母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、哺乳動物（例えば、マウス繊維芽細胞 ）、 又は昆虫細胞である。本発明は、従って、又標準的手段により生ずるＦＧＦアナ ログを記述するＤＮＡ及びＤＮＡ配列を取り込む、新規な生物学的に官能的なウ イルス及び環状ブラスミドＲＮＡ及びＤＮＡベクターも提供する。外因性のベク ターにより生ずるＤＮＡ又はＲＮＡ配列の大量の発現を助ける条性下でこれらベ クターにより安定に形質転換され又はトランスフエクシヨンされた宿主生物の培 養、並びに成長培地、細胞分解物又は細胞膜フラクションからの望ましいポリペ プチトの単離は、所望の生成物を生ずる。Ｅ．ｃｏｌｉのＦＧＦ−２突然変異蛋 白質の発現の例は、実施例３に示される。 本発明は、ＦＧＦ−２ループ突然変異体についてコードずるＤＮＡ配列の全部 及び／又は部分の製造を提供し、そして選択された非哺乳動物宿主による発現に 好ましいコドンの取り込み、エンドヌクレアーゼ酵素による制限により開裂の部 位の提供、並びに容易に発現されたベクターの構築を助ける追加の最初、最後又 は中間のＤＮＡ配列の提供のような有利な特徴を含む。従って、本発明は、ＦＧ Ｆアナログの細菌による発現についてコードするＤＮＡ配列の製造（そしてｃＤ ＮＡ及びゲノムＤＮＡの部位特異性の突然変異誘発による発生）を提供し、その アナログは、１個又はそれ以上のアミノ酸残基のアイデンティティ又は位置で本 明細書に特に記載される形とは異なり（即ち、ヒトＦＧＦ−２について特定され た残基を全てより少なく含む欠失アナログ及び／又は１個又はそれ以上の残基が ポリペプチドの末端又は中位部分へ付加している置換アナログ）、そして本明細 書で記載されたＦＧＦ−２アナログの生物学的性質を共有する。 本発明のＤＮＡ（及びＲＮΛ）配列は、一次構造的配座の少なくとも一部を有 しさらにＦＧＦアナログの１種又はそれ以上の生物学的性質を有するポリペプチ ド生成物の真核又は原核の宿主細胞で発現を生じさせるのに有用な全ての配列に ついてコードし、それらは、（ａ）本明細書に記載されたようなＦＧＦ−２ルー プ突然変異蛋白質をエンコードするＤＮＡ配列、又は相補性鎖；（ｂ）（ａ）に 定義されたＤＮＡ配列又はそのフラグメントにハイブリッドするＤＮＡ配列；及 び（ｃ）遺伝子コードの縮重ではなく、上記の（ａ）及び（ｂ）で定義されたＤ ＮＡ配列へハイブリッドするであろうＤＮＡ配列により包含される。特に包含さ れるのは、そこに含まれるＦＧＦアナログの対立遺伝子の変異型をエンコードす るゲノムＤＮＡ配列、並びにループ突然変異蛋白質ＲＮＡをエンコードする配列 、そのフラグメント、並びにＲＮＡ又はＤＮＡ配列が非脊椎動物宿主のメッセン ジャーＲＮＡの転写又はＲＮＡ複製を助けるコドンを取り込むアナログである。 本発明により提供される微生物的に発現されたポリペプチドの単離及び精製は 、従来の手段によりなされ、例えば、実施例３に説明されるような調製クロマト グラフィ分離、並びにモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体の調製を含 む免疫学的分離を含む。 上記に要約されそして以下の実施例に詳述されているように、本発明の二つの 例のＦＧＦ−２構造アナログは、ＦＧＦ−２ＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６）及 びＦＧＦ−２ＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）であり、ＦＧＦ−２配列は、それ ぞれＥ．ｃｏｌｉに発現されたウシＦＧＦ−１及びヒトインターロイキン−１β からの対応する配列により置換されたループ残基１１８−１２２を有する。これ らの突然変異は、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅから蛋白を溶離するのに必要なＮ ａＣｌの濃度により評価されるヘパリン結合、又は乳児ハムスター腎細胞及びＮ ＩＨ ３Ｔ３細胞（実施例４）に存在するＦＧＦ受容体への結合のためにＩ¹²⁵ −ＦＧＦ−２と競合する蛋白の能力の何れかに対して明らかな効果を有しない。 ループアナログは、ウシ内皮細胞増殖アッセイで分裂誘発的に活性を有する。両 方のアナログは、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性剤を誘発する有意 に低下した性能を示す。生体外の血管形成アッセイでは、ＦＧＦ−２ＬＡは、野 生型ＦＧＦ−２に匹敵する毛細血管状の管形成を示す。同じ生体外のアッセイで 、ＦＧＦ−１ＬＩは、毛細血管状の構造の遥かに少ない誘発を示すが、しかしそ れは、生体内のアッセイで有意に血管形成を剌激する。 他のＦＧＦ−２ループ突然変異体であるＦＧＦ−２ＬＫ（実施例に詳述されて いる）は、ＦＧＦ−７（ケラチン生成細胞成長因子）からの９−アミノ酸配列を 含む。ＦＧＦ−２は、ケラチン生成細胞成長因子上でＦＧＦ−７受容体（ＦＧＦ Ｒ２ ＩＩＩｂ）に結合せず、そしてＦＧＦ−７は、ＦＧＦ受容体タイプ１（Ｆ ＧＦＲ１）に結合しない。ＦＧＦ−７からのそれによるＦＧＦ−１のループ配列 の置換は、ヘパリンに対する蛋白の親和性を明らかに低下させる。受容体結合の 実験では、ＦＧＦ−２ＬＫ蛋白は、ＦＧＦ受容体タイプ１に対するＦＧＦ−２の 結合を置換できず又はそれと競合できないが、しかし受容体タイプ２（ＩＩＩｂ ）に対してＦＧＦ−７と競合し一方ＦＧＦ−２は、結合と競合しない。それ故、 ループ配列は、受容体−リガンドの特異性を与え、そしてＦＧＦ−７と結合する がＦＧＦ−２と結合しない受容体サブタイプ（ＦＧＦＲ ＩＩＩｂ）へのＦＧＦ −２ＬＫ突然変異体の結合を行わせる。逆に、ＦＧＦ−７からのループ配列は、 ＦＧＦ受容体１への蛋白の結合を廃止する。 分子の二次及び三次の構造全部を有意に摂動することなくＦＧＦ表面ループ中 の新しい一次構造要素の導入は、一つのＦＧＦタイプから他のものへ性質を改変 させる一群のＦＧＦ構造アナログを提供し、そして従ってＦＧＦ蛋白の活性を調 整する手段、蛋白の生物学的活性を薬理学的に分離する手段、及び新しい活性を 導入する手段を提供する。以下の実施例に説明されるように、ＦＧＦループアナ ログは、対応する未変性のＦＧＦと同じ受容体、又は異なる受容体、特に未変性 のＦＧＦへのそれよりむしろループに対応する受容体へ結合するように構築でき る。 低下した生物学的活性を示すＦＧＦ拮抗剤は、抗癌剤及び杭増殖剤として有用 である。血管形成阻害剤として作用する拮抗剤は、眼の網膜障害、血管新生緑内 障、皮膚障害、慢性炎症、関節リュウマチなどのような血管新生が病理学におい て主要である疾患の治療に有用である。 ＦＧＦ活性のアゴニストであるＦＧＦループ構造アナログは、血管形成、細胞 成長、及び／又は細胞生存を促進でき、そのため組織の修復、例えば傷、火傷、 骨折、外科剥離、消化器潰瘍などの治癒、並びに虚血及び虚血の血管新生による 心筋梗塞中の紺織の修復の適用を有する。 表面ループアミノ酸配列置換に加えて、本発明は、さらに、置換されたループ に良く似るように構築された成長因子ペプチド拮抗剤、即ちＦＧＦ受容体へ結合 するが、ループを含む対応する因子により剌激される繊維芽細胞及び他の細胞の 増殖又は移動を剌激しない拮抗剤を提供する。 ＦＧＦ受容体タイプの発現は、細胞特異性であり、そして発現された受容体の タイプは、どのＦＧＦに細胞が応ずるかを決定する。上述のように、受容体特異 性における変化、例えばＦＧＦ−２ＬＡについて知られるものは、ＦＧＦ−２が それが通常相互反応しない細胞のタイプ、例えば内皮細胞よりむしろ上皮細胞を 標的にするように操作できることを示す。 実施例 以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供され、そして決して制限 するものとして受け取ってはならない。 実施例 １ 本実施例は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）から由来する対応するア ミノ酸により置換されたＦＧＦ−２の表面ループ（残基１１８−１２２）を有す る、ＦＧＦ−２ＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）と名付けられたヒトＦＧＦ−２ 構造アナログの構築を説明する。 ヒトｇｌｕ^3、5ＦＧＦ−２をエンコードする遺伝子は、先ず、その全部を本明 細書で参考として引用する、上記のＳｅｄｄｏｎ、Ａ．Ｐ．らに記述されたよう に製造し、そしてＴ７発現ベクター、ｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）中にクローンされ る。簡単に述べろと、ｐＵＣ１８中にクローンされる１５５アミノ酸型のヒトＦ ＧＦ−２をエンコードする合成遺伝子は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国から購入される。変化されるべきヌクレオチド 配列（２−４９）は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｐＭＩＩによりｐＵＣ１８から切 除され、そしてＦＧＦ−１の第一の５Ｎ末端アミノ酸をエンコードしさらに内部 Ｎｄｅｌ部位を含む合成フラグメントは、ｐＵＣ１８中にクローンされて、３及 び５の位置でグルタミン酸をエンコードする構築物を生ずる。ＦＧＦ−２をエン コードするｃＤＮＡは、次にＮｄｅｌ及びＢａｍＨ１によりｐＵＣ１８から切除 され、そしてｐＥＴ−３ａの誘導体である発現ベクターｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３） のＮｄｅｌ及びＢａｍＨ１制限エンドヌクレアーゼ部位中にクローンされる。 二つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位、ＢｓｔＢ１及びＳｐｌ１は、 ＦＧＦ−２のセグメントＳｅｒ１１７−Ｔｒｐ１２３をエンコードするコドンと 隣接する位置で、エンコードされたアミノ酸に変化を生じさせない（即ち、サイ レント突然変異）ようなやり方で、遺伝子中に導入される（図１）。 構造アナログＩＬ−１β（１１５−１１９）（図１）の対応するループからの ヒト配列Ａｌａ１１５−Ｇｌｎ１１６−Ｐｈｅ１１７−Ｐｒｏ１１８−Ａｓｎ１ １９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３のアミノ酸２３１−２３５）によるＦＧＦ−２の残 基Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０−Ｔｈｒ１２１−Ｓｅｒ１２２（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸１１８−１２２）の置換が、次に行われる。プ ラスミドＤＮＡは、ＢｓｔＢ１及びＳｐｌ１の消化にかけられ、そして大きなＤ ＮＡフラグメントが、アガロースゲル電気泳動を使用して単離される。ＤＮＡフ ラグメントは、ＢｓｔＢ１及びＳｐｌ１の消化により生ずるものと融和できる末 端を含む、２種の合成オリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＡＡＣＧＡＴＴＧ ＧＡ ＡＴＣＴＡＡＴＡ ＡＣＴＡＣＡＡＴＡＣ ＧＴＡＣＣＧＧＴＣＴ ＧＣＧＣＡ ＧＴＴＴＣ ＣＴＡＡＣＴＧＧＴＡ ＴＧＴＧＧＣＡＣＴＴ ＡＡＧＣ−３’（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１）及び５’−ＧＴＡＧＣＴＴＡＡ ＧＴＧＣＣＡＣＡＴ Ａ ＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡ ＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧ ＡＣＣＧＧＴＡＣＧＴ Ａ ＴＴＧＴＡＧＴＴＡ ＴＴＡＧＡＴＴＣＣＡ ＡＴＣＧＴＴ−３’（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ１２）をアニーリングすることにより得られる二本鎖ＤＮＡへＴ４ＤＮ Ａリガーゼを使用して連結される。連結生成物は、菌株ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ 細胞を形質転換するのに使用される。所望の突然変異体プラスミドは、新しく導 入されたＡｆ１２制限部位（アンダーラインされた）での開裂の可能性に基づい て選択され、そして遺伝子の完全な配列決定により確かめられる。Ｅ．ｃｏｌｉ のプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭＤ ２０８５２ 米国に寄託され、そしてＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９４１ ７を有する。 実施例 ２ 本実施例は、ＦＧＦ−１（図１）から由来する対応するアミノ酸により置換さ れたＦＧＦ−２の表面ループ（残基１１８−１２２）を有する、ＦＧＦ−２ＬＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６）と名付けられたヒトＦＧＦ−２構造アナログの構築 を説明する。 ＦＧＦ−１（図１参照）の表面ループ１１５−１２１に相当するウシ配列Ｌｙ ｓ１１５−Ｌｙｓ１１６−Ｈｉｓ１１７−Ａｌａ１１８−Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ １２０−Ｈｉｓ１２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２のアミノ酸１１５−１２１、Ａｓ ｎはヒト配列中）によるＦＧＦ−２のセグメントＡｒｇ１１８−Ｓｅｒ１２２の 置換は、以下のアニーリングされた合成分裂誘発オリゴヌクレオチドを使用して 上記の実施例１に記載されたように達成される。５’−ＣＧＡＡＣＧＡＴＴＧ ＧＡＡＴＣＴＡＡＴＡ ＡＣＴＡＣＡＡＴＡＣ ＧＴＡＣＣＧＧＴＣＴ ＡＡＡ ＡＧＣＡＴＧ ＣＴＧＡＡＡＡＣＡ ＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧ ＧＣＡＣＴＴＡＡ ＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）及び５’−ＧＴＡＣＧＣＴＴＡＡ ＧＴ ＧＣＣＡＣＡＴＡ ＣＣＡＧＴＧＴＴＴＴ ＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴ ＴＴＴＴＡ ＧＡＣＣＧ ＧＴＡＣＧＴＡＴＴＧ ＴＡＧＴＴＡＴＴＡＧ ＡＴＴＣＣＡＡＴ ＣＧ ＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４）。所望の突然変異体プラスミドは 、新しく導入されたＳｐｈ１制限部位（アンダーラインされた）での開裂の可能 性に基づいて選択され、そして遺伝子の完全な配列決定により確かめられる。 実施例 ３ 実施例１及び２で構築されたＦＧＦ−２ＬＡ及びＦＧＦ−２ＬＩ突然変異体は 、この実施例で発現されそして精製される。 配列決定後、上記の実施例１及び２に記載されたＦＧＦ−２ループ突然変異体 を含むプラスミドは、能力Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐｌｙｓ Ｓ中に形質転換 され、そして０．４の６００ｍｍでの吸収に達するまで、５０μｇ／ｍＬのアン ピシリン及び３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａブロス中 で３７℃で培養される。組み換え蛋白の発現は、３７℃で２時間２ｍＭのイソプ ロピルチオガラクトシドの添加により誘発される。 １Ｌの培養物からの細胞は、遠心分離により採取され、０．１ｍＭのＥＤＴＡ 及び０．６ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（３０ｍ Ｌ）中に再懸濁され、４℃で２０分間リゾチーム（１０μｇ／ｍＬ）による処理 により中断させ、そして超音波処理（６×３０秒パルス）した。分解物を遠心分 離（１００００×ｇ；２０分）により澄明にし、そして上清溶液を、一定の回転 とともに４℃で１時間５ｍＬの水和したヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ／ＬＫＢ）とともにインキュベートする。樹脂を、０．８μｍの濾過 装置（Ｎａｌｇｅｎｅ）上の濾過により単離し、０．６ＭのＮａＣｌを含む１０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４により十分に洗い、そして結合した蛋白を３ ＭのＮａＣｌ（２５ｍＬ）を含むトリスバッファーにより溶離する。３ＭのＮａ Ｃｌ溶離液を６倍にトリスバッファーにより希釈し、そしてＴＳＫヘハリン５Ｐ Ｗカラム（０．２１×１５ｃｍ；Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ、ＭＡ）上に加 え、そしてカラムを、３ｍＬ／分の流速で９０分で線状ＮａＣｌ勾配（０．６− ２Ｍ）を使用して展開した。蛋白は、示された７に加えて同じしかも保存された 残基の３６の他の部位を示す。 実施例 ４ 本実施例は、上記の実施例３で単離且つ精製されたＦＧＦ−２突然変異体を使 用する結合及び細胞増殖の研究を記述する。 不動化したヘパリンに関するＦＧＦ−２ＬＡ及びFＧＦ−２ＬＩの親和性は、 約１．５ＭのＮａＣｌでＴＳＫ−ヘパリンカラムからの溶離について野生型ＦＧ Ｆ−２と同じである。 ＦＧＦ−２ＬＩ及びＦＧＦ−２ＬＡは、高い数のＦＧＦ受容体を発現する、幼 児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞への¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃ ｏｒｐ．）の結合について競合するそれらの容量についてテストされる。使用さ れるアッセイは、Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３ １：１２３−１３０（１９８７））により記載されている。簡単に述べると、２ ４穴のプレート上に植え付けられたＢＨＫ細胞を、室温で１時間又は４℃で２時 間、ラベルされていないＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２ＬＩ又はＦＧＦ−２ＬＡループ 突然変異体の連続希釈により５０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２とともにインキュベ ートする。細胞は、次に４℃で３０分間インキュベートされ、ホスフェート緩衝 塩水により２回洗い、２ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒ ドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）ｐＨ７．５により 処理して、低親和性硫酸ヘパリン結合部位に結合する¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２を除く 。¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２を結合した受容体を、０．１Ｍの燐酸ナトリウムｐＨ８中 の０．５％トリトンＸ−１００による細胞の処理によって回収され、そしてγ− 計数計でカウントする。アッセイは、重複して行われる。 図２にプロットされたこの結合アッセイの結果は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２Ｌ Ａ及びＦＧＦ−２ＬＩについて同じであることが見いだされる。対応するＩＬ− １β又はＦＧＦ−１配列によるＦＧＦ−２配列１１８−１２２の置換は、ＢＨＫ 細胞上に存在する高い親和性細胞膜ＦＧＦタイプＩ受容体への¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ− ２結合と競合する突然変異体の蛋白の容量に対して明らかな影響を有しない。突 然変異体は、ＦＧＦ−１及びＩＬ−１β配列を含むので、ＩＬ−１β及びＦＧＦ −１は、ＢＨＫ細胞ＦＧＦ−受容体結合アッセイでテストされる。ＦＧＦ−１は 、ＦＧＦ−２のそれと同じ親和性で、ＢＨＫ細胞ＦＧＦ受容体へ結合し、一方ｈ ｒＩＬ−１β（Ｂｉｏｇｅｎ）に関する結合は検出されない。 図３は、これらのやり方を使用して添加されたラベルされていないＦＧＦ蛋白 の関数として、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞上に存在するＦＧＦ−受容体タイプ１への放 射性ヨード化ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−ＬＡ及びＦＧＦ−ＬＩの結合を 示す。データは、ＦＧＦ−ＬＡ及びＦＧＦ−ＬＩに関する競合結合曲線が、ＦＧ Ｆ−２に関するそれと同じであることを示し、そしてＦＧＦ−２のループ交換が 、細胞表面ＦＧＦ受容体タイプ１（ＦＧＦＲ１）に対する蛋白の受容体結合の性 質に影響を与えないことを立証する。 ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２ＬＩ及びＦＧＦ−２ＬＡの分裂誘発活性は、既に記述 したように（Ｇｏｓｐａｒｄａｒｏｗｉｃｚ、Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．８１：６９６３−６９６７（１９８４））、成熟大動脈弓から由 来するウシ血管内皮細胞を使用して決定される。簡単には、細胞は、ペニシリン （１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びＬ−グル タミン（２ｍＭ）を補足された１０％子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ 、ＵＴ）を含む０．５ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ） 中に２４穴プレート当たり０．８×１０⁴細胞の最初の密度で接種される。植え 付け２時間後、ＤＭＥＭ中のＦＧＦ−２及び突然変異体の連続希釈の２０μＬ分 を加える。ＦＧＦ−２剌激成長の阻害は、固定された濃度のＦＧＦ−２で測定さ れたが、突然変異体蛋白のそれは変化する。培養５日後、重複したプレートをト リプシン処理し、細胞の密度をＣｏｕｌｔｅｒ計数計で細胞の計数により測定す る。測定は、重複して行われる。 この細胞増殖アッセイの結果は、図４でプロットされる。ダッシュされた線は 、添加されたＦＧＦ−２なしで基底細胞成長を示す。黒丸は、ＦＧＦ−２による 剌激を示す。ＦＧＦ−２ＬＩ突然変異体は、白い四角により表され、そしてＦＧ Ｆ−２ＬＡ突然変異体は、白い三角により表される。ＦＧＦ−２ＬＩは、ＦＧＦ −２より約５−１０倍効力が低く、一方ＦＧＦ−２ＬＡは、野生型因子と効力は 同じである。 実施例 ５ 本実施例は、上記の実施例３で単離且つ精製されたＦＧＦ−２突然変異体を使 用して生体外及び生体内の血管生成の研究を記述する。 ＦＧＦ突然変異体によるウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤の誘発が 、評価される。成熟ウシ大勅脈弓内皮（ＡＢＡＥ）細胞を、９６穴プレートに２ ００００細胞／穴で接種し、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイ シン（１００μｇ／ｍＬ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）及び異なる濃度のＦＧ Ｆ−２又は突然変異体を補足された１０％子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇ ａｎ、ＵＴ）を含むＤＭＥＭ中に維持する。２４時間後、細胞を、ホスフェート 緩衝塩水により洗い、そして０．０５％トリトンＸ−１００を含む６０ｍＭのト リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で分解した。細胞に結合したウロキナーゼタイププ ラスミノーゲン活性剤（ｕＰＡ）の活性は、プラスミン発色基質Ｄ−ノルロイシ ル−ヘキサヒドロチロシルリジン ｐ−ニトロアニリド アセテート（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ）を使用して、 上記のＰｒｅｓｔａらにより記載されたように測定される。細胞結合蛋白濃度は 、蛋白へのクーマシーブルー結合を使用して測定される。結果は、図５にプロッ トされる。ＦＧＦ−２ＬＩ及びＦＧＦ−２ＬＡの両者は、ウロキナーゼタイププ ラスミノーゲン活性剤を誘発する有意に低下した容量を示す。 生体外血管形成の評価は、突然変異体が、三次元コラーゲンゲル上に培養され たＡＢＡＥ細胞中の毛細血管様構造を誘発するかどうかを観察することによりな される。三次元コラーゲンゲルプレート（２４穴）は、それぞれの穴に、ＤＭＥ Ｍを含みさらにＮａＨＣＯ₃により中性のｐＨに調節される０．７ｍｇ／ｍＬの ラット尾タイプＩコラーゲン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａ ｒｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）の０．５ｍＬの冷却溶液を加えることにより製 造される。コラーゲンゲルの形成（厚さ約１−２ｍｍ）後、ＡＢＡＥ細胞は、５ ００００細胞／穴で接種される。培養物が密集成長に達するまで（通常、５日、 そのとき細胞はゲル上に単層を形成する）、培養物は、ペニシリン（１００単位 ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びＬ−グルタミン（２ｍ Ｍ）及び異なる濃度のＦＧＦ−２又は突然変異体を補足された１０％子ウシ血清 （Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含むＤＭＥＭ中に３７℃で維持される 。培地は、次に異なる濃度のＦＧＦ−２又は突然変異体を含む新しい培地により 置換される。培養物は、４８時間３７℃で維持され、次に冷メタノール（−２０ ℃）による固定により中止する。 ＡＢＡＥ細胞により形成される毛細血管様構造の発生量は、Ｈａｍａｍａｔｓ ｕ Ｃ２４００ビデオカメラ及びＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｈｏｐ顕微鏡により補 助されたＫｏｎｔｒｏｎ ＩＢＡＳ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する ことにより分析される。ビデオカメラにより得られるそれぞれの映像面の相対照 像は、毛細血管様構造により占められる領域は白色でありそして残りが黒色の背 景である二進像に転換される。生体外の血管形成の程度は、次に白色の領域の％ として測定される。同じ条件の細胞培養は、重複した穴で維持される。それぞれ の穴の三つから四つの領域は、像分折により調べられ、そして平均の値及び標準 偏差が決定される。このコンピュータ補助定量法からの結果は、図６に示される 。突然変異体ＦＧＦ−２ＬＩによる管形成の誘発は、野生型ＦＧＦ−２によるそ れより遥かに少ないが、ＦＧＦ−２ＬＡによるそれは、野生型と匹敵する。 血管形成の生体内モデルでは、ＦＧＦ−２ＬＩは、Ｈｏｗｄｅｎ、Ｇ．Ｆ．及 びＳｉｌｖｅｒ、Ｉ．Ａ．（Ｉｎｔ．Ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃ Ｊ．１３：３−１ ６（１９８０））により改変され改善されたウサギ耳チェンバーシステムを使用 して評価され、変性された成長因子又は他の試薬による成長因子誘発血管新生又 はその阻害を観察する。 ウサギを、筋肉内に投与される５０−７０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ ／ｋｇのキシロジンを使用して、鎮静させる。耳を電気剃刀で剃り、そして水、 次にＢｅｔａｄｉｎｅ（商標）により清浄する。感染の危険を最低にするために 、 ウサギに、耳チェンバーの挿入前に筋肉内に２００００単位／ｋｇのベンザチン ペニシリンを与える。チェンバーは、全ての主な血管により交差されていない約 ０．７５ｃｍの範囲中に挿入される。実験の間、動物の耳チェンバーの観察又は 全ての重要でない取り扱いは、それぞれ１ｍｇ／ｋｇのレベルでＢｕｔｏｒｐｈ ａｎｏｌ（商標）及びアセプロマジンの組み合わせの筋肉内投与を使用して動物 を鎮静することによりなされる。徐放アルギネートカプセル中のヘパリン−Ｓｅ ｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズに結合したＦＧＦ−２又はＦＧＦ−２ＬＩが、耳 チェンバーの一つに含まれ、そして他は、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標 ）アルギネートカプセル媒体のみを含むコントロールとして使用される。従って 、成長因子及び徐放カプセルのみの効果は、同じ動物で同時に観察できる。ＦＧ Ｆ−２及びＦＧＦ−２ＬＩは、３検体で１、１０及び１００ｎｇ／チェンバーで テストされる。動物は、４−６週間保たれ、そして血管新生は、肉眼で観察され 、そして毎週写真で記録される。 このやり方を使用する血管新生の度合の評価に関する基準は、以下に示される 。 図９にプロットされるデータは、ＦＧＦ−２ＬＩが、血管形成を誘発するその 可能性においてＦＧＦ−２より優れていることを示す。ＦＧＦ−２及びＦＧＦ− ２ＬＩの両者は、大きな血管の形成、チェンバーにわたるそれらの成長を剌激し 、活性な血流を有する吻合する血管をもたらす。比較すると、外因的に加えられ る成長因子を欠く、アルギネート−ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビー ズを含むコントロールチェンバーでは、短い毛細血管のみが形成される。ＦＧＦ −２に比較してＦＧＦ−２ＬＩの活性における相違は、定量的且つ定性的の両者 で ある。ＦＧＦ−２に比べてＦＧＦ−２ＬＩの驚くべき剌激活性は、広い範囲の濃 度（即ち、０．１−４００ｎｇ／チェンバー）にわたって観察され、そして豊富 であり、さらにＦＧＦ−２の剌激作用が鎮まったときを越えて保持される。（図 ８参照）。 ＦＧＦ−２は、媒体のみに比べて新しい血管の投与量依存誘発を示すが、ＦＧ Ｆ−２に関する同様な活性は、１０−１００ｎｇ／チェンバーの濃度でのみ観察 され、高い投与量では、減少したレスポンスが観察される。興味あることには、 ４００ｎｇ／チェンバーのＦＧＦ−２では、血管形成は、完全に阻害されるが、 ＦＧＦ−２ＬＩは、同じ投与で、毛細血管及びより大きな血管の形成を非常に剌 激する。従って、ＦＧＦ−２に比べてＦＧＦ−２ＬＩの生物学的活性で観察され る相違が存在する。 生体外のデータは、ＦＧＦ−２ＬＩについて低下した血管原性活性を示唆する が、生体内の研究は、示す。 ４穴組織培養プレートは、Ｎｕｎｃ（Ｒｏｓｋｌｉｄｅ、デンマーク）から得 る。 可溶性のＦＧＦ受容体蛋白は、胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の分泌 型についてエンコードする、アルカリ性ホスファターゼ標識発現ベクター中へ、 マウスＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ−１；ｆｌｇ）、ＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ− ２；ｂｅｋ）又はＫＧＦ受容体（ＦＧＦＲ（ＩＩＩｂ）；ｋ−ｓａｍ）の細胞外 領域をクローンすることにより構築される。ＦＧＦ受容体アルカリ性ホスファタ ーゼ（ＦＲＡＰ）プラスミドは、選択可能なネオマイシン抵抗性遺伝子によるエ レクトロポレーションによりＮＩＨ ３Ｔ３細胞中にともにトランスフェクショ ンされる。クローンは、Ｇ４１８（６００μｇ／ｍＬ）で選択され、そして調整 された培地で分泌ＡＰ酵素活性についてスクリーニングされる。高いレベルのＡ Ｐ活性（２−４Ａ₄₀₅単位／分／ｍＬ）を生じたそれぞれの受容体のクローンは 、次に結合アッセイについて調整された培地を生成するのに使用される。 可溶性の受容体結合反応混合物の成分は、ＦＲＡＰ調整培地（０．２４ ＯＤ 単位／分）、２ｎｇ／ｍＬの¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ及び２００ｎｇ／ｍＬのヘパリンを 含む。ＦＧＦ：ヘパリン：ＦＲＡＰ三元コンプレックスは、蛋白Ａ Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ（商標）にカップリングされた抗ＡＰモノクローナル抗体の１：１ス ラリー（２０μＬ）により免疫沈降される。全ての成分は、室温で混合される。 全容積は、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭの添加により２００μＬ に調節される。結合は、２４℃で１−２時間続けられ、その後結合した受容体コ ンプレックス又はリガンドは、４℃での遠心分離（１０秒、２０００×ｇ）によ り回収される。ペレット化物質は、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ ｍＭ）、グリセロール（１０％）及びトリトンＸ−１００（１％）を含む氷冷バ ッファー５００μＬにより２回洗った。¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ結合は、ガンマ計数計（ ＬＫＢ）でサンプルの計数を行うことにより定量される。別に、ＦＲＡＰ蛋白の ＡＰ酵素活性は、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）に結合したＦＲＡＰ受 容体を、ＰＢＳ５０μＬの容積で平底マイクロタイタープレートに移すことによ り測定される。反応は、基質（２Ｍのジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭのホモアルギニン及び１２ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェートを 含むＡＰアッセイバッファーの２×溶液５０μＬ）の添加により開始される。反 応は、次に運動マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍで室温で行われる。 受容体結合は、受容体からのラベルしたＦＧＦの離脱を定量することにより測 定される。簡単には、硫酸ヘパリン低親和性部位に結合したＦＧＦは、１．６Ｍ のＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む氷冷溶液ｐＨ７．４とともに５分間の インキュベーションにより細胞の表面から離脱され、そして放射能の離脱の量は 、ガンマ計数計で測定される。高い親和性受容体へ結合されるＦＧＦは、２Ｍの ＮａＣｌ（２０ｍＭのアセテートバッファー、ｐＨ４．０）抽出により分離され 、そして離脱したラベルされたＦＧＦは、定量される。 化学的橋かけ結合の実験は、シリコーン化０．５ｍＬ容マイクロ遠心分離管中 で２０μＬの容積で室温で実施される。反応混合物は、蛋白Ａ Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ（商標）にカップリングされた抗ＡＰモノクローナル抗体に対して不動化さ れたＦＧＦ受容体、２００ｎｇ／ｍＬのヘパリン、２ｎｇ／ｍＬの¹²⁵Ｉ−ｂＦ ＧＦ、２０ｍＭのホスフェートバッファー（ｐＨ７．４）及び１４０ｍＭのＮａ Ｃｌを含む。９０分間のインキュベーション後、ジメチルスルホキシドに溶解し たジサクシンイミジルスベラート（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍＬを加えて、最終濃度 を０．１５ｍＭとし、そして混合物をさらに３０分間インキュベートする。反応 を、３０分間２００ｍＭのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬの添 加により停止させる。反応混合物を、２×ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動添加バッファーにより１：１に希釈し、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミド ゲル上で電気泳動する。ＦＧＦ受容体への橋かけ結合したＦＧＦは、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲフィルム上のオートラジオフラフにより検出される。 ＦＧＦ−２中の表面ループの位置は、種々の挿入が生ずる蛋白のＦＧＦファミ リー中の種々の配列領域と一致する。この領域は、測定するリガンド−受容体結 合特異性と含まれるので、ＦＧＦ−２と結合しない、ＦＧＦＲ１（Ｆｌｇ）及び ＦＧＦＲ２サブタイプＩＩＩｂ（ＦＧＦ−７又はＫＧＦ受容体）に対するループ 突然変異体、ＬＡ及びＬＩの結合プロフィルが、測定される。図９Ａ及び９Ｂは 、それぞれ可溶性の受容体からの放射性ヨード化ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−７の置 換を伴う、ＦＧＦ−１ ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７及びループ突然変異体に関する ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ）の可溶性物に対する競合結合曲線を示す 。ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２Ａ及びＦＧＦ−２ＬＩは、等しくＦＧＦ Ｒ−１へ良く結合するが、ＦＧＦ−７の結合は検出されない（図９Ａ）。 ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ）に対する種々のＦＧＦ蛋白の結合に関する結合プロフ ィル（図９Ｂ）は、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−１が、同じ親和性で結合すること、 ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−２ＬＩ突然変異体が、この受容体のタイプと結合しない こと、しかしＧＦＲ２（ＩＩＩｂ）に対するＬＡ突然変異体の結合が、ＦＧＦ− ７又はＦＧＦ−１のそれより僅かに約５倍小さいことを示す。ＦＧＦ−２ＬＡの 結合プロフィルがＦＧＦ−１に関するそれを反映しそしてＦＧＦ−１ループ−宿 主蛋白であるＦＧＦ−２のそれを反映していないことは、受容体−リガンドの特 異性を決めるのにこの表面ループが関連することと一致する。 種々の可溶性のＦＧＦ受容体に対する放射性ラベルＦＧＦ蛋白及びループ突然 変異体の結合特異性は、過剰の未ラベルＦＧＦの存在及び不存在下の受容体に対 する因子の化学的橋かけにより確認される。ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ― ２ＬＡ及びＦＧＦ−２ＬＩはＦＧＦＲ１に結合し、そして過剰の未ラベルＦＧＦ の添加は、¹²⁵Ｉ−ＦＧＦの橋かけを廃止する。ＦＧＦＲ１に対する¹²⁵Ｉ −ＦＧＦ−７の橋かけは、検出されない。同じ橋かけプロフィルは、結合の実験 が、可溶性のＦＧＦＲ２受容体を使用して繰り返されるとき、得られる。ＦＧＦ Ｒ２（ＩＩＩｂ）に関する橋かけプロフィルは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−７及びＦ ＧＦ−２ＬＡのみが、この受容体へ結合すること、そしてＦＧＦ−２及びＦＧＦ −２ＬＩ突然変異体は、結合から排除されることを明らかにしている。橋かけの 研究は、図２、３及び８に示された結合データと一致する。 実施例 ７ ＦＧＦ−７ループ配列は、ＦＧＦ−２中に導入され、そして新しいＦＧＦ−２ ループ突然変異体の性質は、この実施例で観察される。 ＦＧＦ−７からの対応する９残基ループ配列Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ −Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕを含むＦＧＦ−２ＬＫと名付けられ たＦＧＦ−２ループ突然変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８の残基１５４−１６２） は、上記の実施例１及び２に概説された方法を使用して構築される。 ＦＧＦ−２ＬＫは、ヘパリンに対する親和性において明らかな減少を示す。ヘ パリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）からのＮａＣｌ溶離は、野生型蛋白に関す る１．４ＭのＮａＣｌに比べて、約０．７ＭのＮａＣｌである。ＬＫ突然変異体 を溶離するのに必要なＮａＣｌのモル濃度は、ＦＧＦ−７を溶離するのに要求さ れるそれと似ている。ヘパリンに関するＦＧＦ−２ＬＫ突然変異体の低下した親 和性は、ヘパリンへの結合に直接関係していないが、ループ配列がヘパリンへの 蛋白の親和性を改変することができることを示唆している。 上記の実施例６に示されたものと同様な受容体結合実験では、ＦＧＦ−２ＬＫ 蛋白は、ＦＧＦ受容体タイプ１に対する¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−２の結合を置換又は競 合できないが、ＦＧＦ受容体タイプ２（ＩＩＩｂ）に対する¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ−７ の結合と競合でき、一方ＦＧＦ−２は、結合と競合しない。ＦＧＦ−の効力は、 未ラベルＦＧＦ−７を使用して観察される競合より約１００倍弱いが、受容体− リガンド結合プロフィルの明らかな変化が、観察される。 結果は、ＦＧＦ−７からのループ配列が、受容体−リガンドの特異性を与え、 そしてＦＧＦ−７と結合するがＦＧＦ−２と結合しない受容体サブタイプへのＦ ＧＦ−２ＬＫ突然変異体の結合を行わせることを示す。逆に、ＦＧＦ−２宿主分 子中のＦＧＦ−７からのループ配列は、ＦＧＦ受容体１への蛋白の結合を廃止す る。相互反応の親和性が１００のファクターにより減少することは、ＦＧＦ−７ における他の決定因子が、受容体へのリガンドの結合親和性へ寄与することに含 まれることを示唆する。証拠は、又ループ配列が、ヘパリンへの結合を改変でき ることも示唆している。 上記の記述は、本発明をいかに実施するかを当業者に教示する目的のためであ り、そして記述を読んで当業者に明らかになるであろうその全ての明白な改変及 び変化を詳述することを目的としていない。しかし、全てのこれらの明白な改変 及び変化が、請求の範囲に規定されたような本発明の範囲内に含まれることを目 的とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＮ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＴ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，Ｎ Ｚ (72)発明者 セドン，アンドリュー ピーター アメリカ合衆国ニューヨーク州 モンロー サミット ストリート 71 (72)発明者 リー，ルウ−ユアン アメリカ合衆国ニューヨーク州 10956 ニュー シティ ジェラルデイン プレイ ス 20 (72)発明者 ボーレン，ピーター アメリカ合衆国ニューヨーク州 ピークス キル ツー アマルフィ ドライブ（番地 なし) (72)発明者 エイジンガー，マグダレナ アメリカ合衆国ニュージャージー州 デマ レスト パイン テラス 30 (72)発明者 ヤヨン，エイブナー イスラエル国 76100 レホボット ワイ ズマン インスティチュート オブ サイ エンス（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然のＦＧＦ−２のアミノ酸１１８〜１２２、１１５〜１２４又は１１２〜 １２８が他の繊維芽細胞成長因子又は構造的に関連したインターロイキンからの 対応する配列によって置換され、ヘパリンと結合することができ且つ天然の繊維 芽細胞成長因子受容体に対して結合親和力を示す繊維芽細胞成長因子−２構造ア ナログ。 ２．アナログの結合特異性が繊維芽細胞成長因子−２の対応結合特異性と異なる 請求項１記載の構造アナログ。 ３．ＦＧＦ−２のアミノ酸１１５〜１２４又は１１８〜１２２に対応する配列が 置換されている請求項１又は２記載の構造アナログ。 ４．配列番号１のＦＧＦ−２アミノ酸１１５〜１２４に対応するアミノ酸が下記 の（ａ）〜（ｊ）らなる群から選ばれるアミノ酸配列によって置換されいる請求 項１又は２記載の繊維芽細胞成長因子構造アナログ、 （ａ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１２〜１２５； （ｂ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１２〜１２５、但しＨｉｓ１２１はＡ ｓｎ１２１によって置換されている； （ｃ）配列番号４のＦＧＦ−３アミノ酸１２９〜１５４； （ｄ）配列番号５のＦＧＦ−４アミノ酸１６９〜１７８； （ｅ）配列番号６のＦＧＦ−５アミノ酸１７３〜１８８； （ｆ）配列番号７のＦＧＦ−６アミノ酸１７１〜１８０； （ｇ）配列番号８のＦＧＦ−７アミノ酸１５１〜１６４； （ｈ）配列番号９のＦＧＦ−８アミノ酸１３６〜１５６； （ｉ）配列番号１０のＦＧＦ−９アミノ酸１４３〜１６９；及び （ｊ）配列番号３のインターロイキン−１βアミノ酸２３１〜２３５。 ５．配列番号１のアミノ酸１１５〜１２４に対応するアミノ酸が下記の（ａ）〜 （ｃ）からなる群から選ばれるアミノ酸配列によって置換されている請求項４記 載のアナログ、 （ａ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１２〜１２５； （ｂ）配列番号８のＦＧＦ−７アミノ酸１５１〜１６４;及び （ｃ）配列番号３のインターロイキン−１βアミノ酸２３１〜２３５。 ６．配列番号１のＦＧＦ−２アミノ酸１１８〜１２２に対応するアミノ酸が下記 の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれるアミノ酸配列によって置換されている 請求項１又は２記 載の繊維芽細胞成長因子構造アナログ、 （ａ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１２〜１２３； （ｂ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１２〜１２３、但しＨｉｓ１２１はＡ ｓｎ１２１によって置換されている； （ｃ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１５〜１２１； （ｄ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１５〜１２１;但しＨｉｓ１２１はＡ ｓｎ１２１によって置換されている； （ｅ）配列番号４のＦＧＦ−３アミノ酸１３２〜１５２； （ｆ）配列番号５のＦＧＦ−４アミノ酸１７２〜１７６； （ｇ）配列番号６のＦＧＦ−５アミノ酸１７６〜１８６； （ｈ）配列番号７のＦＧＦ−６アミノ酸１７４〜１７８； （ｉ）配列番号８のＦＧＦ−７アミノ酸１５４〜１６２； （ｊ）配列番号９のＦＧＦ−８アミノ酸１４４〜１４８； （ｋ）配列番号１０のＦＧＦ−９アミノ酸１５１〜１６１；及び （ｌ）配列番号３のインターロイキン−１βアミノ酸２３１〜２３５。 ７．配列番号１のＦＧＦ−２アミノ酸１１８〜１２２に対応するアミノ酸が下記 の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるアミノ酸配列によって置換されている 請求項６記載のアナログ、 （ａ）配列番号２のＦＧＦ−１アミノ酸１１５〜１２１； （ｂ）配列番号８のＦＧＦ−７アミノ酸１５４〜１６２；及び （ｃ）配列番号３のインターロイキン−１βアミノ酸２３１〜２３５。 ８．ＦＧＦ−２アミノ酸配列が他の成長因子表面ループ由来の対応するアミノ酸 配列によって置換され、且つアナログの結合特異性が該ループが誘導される繊維 芽細胞成長因子と類似性を示す請求項１〜７のいずれか一つの項記載の構造アナ ログ。 ９．ヘパリンと、ＦＧＦ−２の第９番目及び１０番目のβー鎖に連結する表面ロ ープ、又は該ループ及びステム、又はループ、ステム、及びアンカー部位に対応 する配列中にアミノ酸配列置換を持つ繊維芽細胞成長因子からなる繊維芽細胞成 長因子受容体とに結合することができ、且つ下記の（ａ）〜（ｉ）からなる群か ら選ばれる他の繊維芽細胞成長因子からの対応する配列によって置換されている 、繊維芽細胞成長因子構造アナログ、 （ａ）繊維芽細胞成長因子−１配列Ｌｙｓ１１５−Ｌｙｓ１１６−Ｈｉｓ１１７ −Ａｌａ １１８−Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ１２０−Ａｓｎ１２１； （ｂ）繊維芽細胞成長因子−２配列Ａｒｇ１１８−Ｌｙｓ１１９−Ｔｙｒ１２０ −Ｔｈｒ１２１−Ｓｅｒ１２２； （ｃ）繊維芽細胞成長因子−３配列Ａｒｇ１３２−Ｌｅｕ１３３−Ｔｙｒ１３４ −Ａｒｇ１３５−Ｔｈｒ１３６−Ｖａｌ１３７−Ｓｅｒ１３８−Ｓｅｒ１３９− Ｔｈｒ１４０−Ｐｒｏ１４１−Ｇｌｙ１４２−Ａｌａ１４３−Ａｒｇ１４４−Ａ rｇ１４５−Ｇｌｎ１４６−Ｐｒｏ１４７−Ｓｅｒ１４８−Ａｌａ１４９−Ｇｌ ｕ１５０−Ａｒｇ１５１−Ｌｅｕ１５２； （ｄ）繊維芽細胞成長因子−４配列Ｔｙｒ１７２−Ｌｙｓ１７３−Ｔｙｒ１７４ −Ｐｒｏ１７５−Ｇｌｙ１７６； （ｅ）繊維芽細胞成長因子−５配列Ａｌａ１７６−Ｉｌｅ１７７−Ｈｉｓ１７８ −Ａｒｇ１７９−Ｔｈｒ１８０−Ｇｌｕ１８１−Ｌｙｓ１８２−Ｔｈｒ１８３− Ｇｌｙ１８４−Ａｒｇ１８５−Ｇｌｕ１８６； （ｆ）繊維芽細胞成長因子−６配列Ａｓｐ１７４−Ｌｅｕ１７５−Ｔｙｒ１７６ −Ｇｌｎ１７７−Ｇｌｙ１７８； （ｇ）繊維芽細胞成長因子−７配列Ａｌａ１５４−Ｌｙｓ１５５−Ｔｒｐ１５６ −Ｔｈｒ１５７−Ｈｉｓ１５８−Ａｓｎ１５９−Ｇｌｙ１６０−Ｇｌｙ１６１− Ｇｌｕ１６２； （ｈ）繊維芽細胞成長因子−８配列Ａｌａ１４４−Ｌｙｓ１４５−Ｔｙｒ１４６ −Ｇｌｕ１４７−Ｇｌｙ１４８及び （ｉ）繊維芽細胞成長因子−９配列Ａｓｎ１５１−Ｌｅｕ１５２−Ｔｙｒ１５３ −Ｌｙｓ１５４−Ｈｉｓ１５５−Ｖａｌ１５６−Ａｓｐ１５７−Ｔｈｒ１５８− Ｇｌｙ１５９−Ａｒｇ１６０−Ａｒｇ１６１。 １０．対応するアミノ酸配列がウシ繊維芽細胞成長因子−１からのＬｙｓ１１５ −Ｌｙｓ１１６−Ｈｉｓ１１７−Ａｌａ１１８−Ｇｌｕ１１９−Ｌｙｓ１２０− Ｈｉｓ１２１、ヒトインターロイキン−１βからのＡｌａ２３１−Ｇｌｎ２３２ −Ｐｈｅ２３３−Ｐｒｏ２３４−Ａｓｎ２３５、又は繊維芽細胞成長因子−７か らのＡｌａ１５４−Ｌｙｓ１５５−Ｔｒｐ１５６−Ｔｈｒ１５７−Ｈｉｓ１５８ −Ａｓｎ１５９−Ｇｌｙ１６０−Ｇｌｙ１６１−Ｇｌｕ１６２である請求項９記 載の構造アナログ。 １１．天然の繊維芽細胞成長囚子−２のアミノ酸配列１１８〜１２２、１１５〜 １２４及び１１２〜１２４からなる群から選ばれる第９番目及び１０番目のβー 鎖に連結する繊維 芽細胞成長因子−２のループに対応する配列が他の繊維芽細胞成長因子又はイン ターロイキン１からの対応するループによって置換されている繊維芽細胞成長因 子ー１又は繊維芽細胞成長因子３〜９の系列からの繊維芽細胞成長因子。