JPH09503740A

JPH09503740A - 組換えウイルス・ベクターによる選択された腫瘍増殖の阻害

Info

Publication number: JPH09503740A
Application number: JP6521263A
Authority: JP
Inventors: アールバーバー，ジャック; ジェイ．ジョリー，ダグラス; ジー．レスペス，ジェームス
Original assignee: チロンビアジーンインコーポレイティド
Priority date: 1993-03-17
Filing date: 1994-03-17
Publication date: 1997-04-15
Also published as: EP0689593A1; US5662896A; WO1994021792A2; EP0689593B1; DE69434750T2; AU6411994A; WO1994021792A3; DE69434750D1; US6310045B1; CA2158546A1; ATE328099T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、組換えウイルス・ベクターを使用する選択された腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。簡単に言えば、本発明の１の態様においては、選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、温血動物に、その腫瘍の増殖が阻害されるような、少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物を投与する段階を含んで成る方法を提供する。抗腫瘍剤の代表的な例は、免疫活性化物質及び腫瘍増幅阻害剤を含む。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウイルス・ベクターによる選択された腫瘍増殖の阻害技術分野本発明は、一般的に、癌免疫療法の分野に、そしてより特に、ベクター構築物を利用する選択された腫瘍の増殖の阻害方法に関する。発明の背景癌は、米国における全死亡率の１／５の原因であり、そして死の２番目の原因である。癌は、典型的には、細胞集団の非制御の分裂を特徴とする。この非制御の分裂は、典型的には、腫瘍の形成を導き、これは、その後、他の部位に転移することができる。原発性固形腫瘍は、一般的に、外科的切除により治療されることができる。しかしながら、固形腫瘍をもつ患者の大部分は、その原発性腫瘍部位の先に微小転移も有している。外科手術単独で治療された場合、これらの患者の約70％が、その癌の再発を経験するであろう。外科手術に加えて、多くの癌が、目下、細胞毒性化学療法薬物（例えば、ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン（vin blastine)、シスプラチン(cisplatin)、メトトレキセート（methotrexate）、5- FU、等）を含む療法及び／又は放射線療法の組合せによっても治療されることができる。しかしながら、これに伴う１つの困難性は、放射線療法剤及び化学療法剤が、正常な組織に対して毒性であり、そしてしばしば致死的副作用を引き起こすということである。さらに、これらのアプローチは、しばしば、（その癌のタイプに依存して90％までの）非常に高い失敗／鎮静率をもつ。化学及び放射線療法に加えて、多くが、癌細胞を取り除くために個体自身の免疫系を強め又は増強する（bolster or augment）試みが行われてきた。いくつかの免疫療法は、その腫瘍細胞を破壊するためにその免疫系を刺激するためにアジュバントとしてバクテリア又はウイルスの成分を利用した。このような成分の例は、BCG、内毒素、混合バクテリア・ワクチン、インターフェロン（α，β、及びγ）、インターフェロン誘導物質（例えば、ウシ流産菌（Brucella abortus）、及び各種ウイルス）、及び胸腺因子（例えば、サイモシン・フラクション５、及びサイモシン・アルファー１）を含む（一般的に、“Prirciples of Cancer B iotherapy,”Oldham（ed.），Raven Press，New York，1987を参照のこと。）。このような剤は、一般的に、動物腫瘍モデルにおいては、アジュバント及び非特異的刺激剤として有用であるが、ヒトにおいては一般的に有効であるとは未だ証明されていない。リンホカイン(Lymphokines)も、癌の治療において使用されてきた。簡単に言えば、リンホカインは、さまざまな細胞により分泌され、そして一般的に、免疫応答の生成において特定の細胞に対しての効果をもつ。リンホカインの例は、インターロイキン（IL）−１，−２，−３、及び−４、並びにコロニー刺激性因子、例えば、G-CSF，GM-CSF、及びM-CSFを含む。最近、あるグループが、腫瘍細胞に対して細胞毒性である大量の細胞を増やし、かつ、生産するために末梢血液細胞を刺激するためにIL-2を使用した（Rosen berg et al.，N．Engl．J．Med．31 3：1485-1492，1985）。他は、抗体−仲介抗癌療法の使用を提案している。簡単に言えば、正常細胞に比較して癌細胞に対してユニークであるか又はより優勢であるかのいずれかである特定の細胞表面抗原を認識する抗体を開発することができる。これらの抗体、又は“マジック弾丸(magi c bnllets)”は、腫瘍細胞を特異的に標的とし、そして殺すために毒素と共に又は単独のいずれかで使用されることができる（Dillman，“Antibody Therapy， ”Principles of Camcer Biotherapy，Oldham（ed.），Raven Press，Ltd.，New York，1987）。例えば、Ball et al．（Blood 62：1203-1210，1983）は、急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）をもついくかの患者を、その白血病に特異的ないくつののモノクローナル抗体の中の１以上により治療して、治療の間の循環白血球細胞における顕著な減少をもたらした。同様に、他は、例えば、メラノーマ、結腸直腸癌腫、前立腺癌腫、胸癌腫、及び肺癌腫を含む、さまざまな腫瘍を治療するために治療的に毒素−結合抗体を使用した。（Dillman、前記参照）。しかしながら、１つの困難性は、ほとんどのモノクローナル抗体がネズミ起源であり、そしてそれ故そのネズミ抗体に対する過敏症が、特に反復療法の後に、その効果を制限することができるということである。一般的な副作用は、熱、発汗及び寒感、皮慮の発疹、関節炎、及び神経麻痺を含む。それ故、従来の方法の細胞毒性副作用を伴わずに腫瘍誘発又は進行に対しての自然の宿主防御を増強する組成物及び方法が、癌をもつ患者の鎮静率を増加させ、そしてその生存を高めることができる。本発明は、このような組成物及び方法を提供し、そしてさらに他の関連利点をも提供する。発明の要約簡単に言えば、本発明は、選択された腫瘍の増殖を阻害するための方法に向けられている。本発明の１つの態様においては、温血動物における選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、その腫瘍の増殖が阻害されるような、少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物をその腫瘍に直接投与する段階を含んで成る方法を提供する。本発明の１の態様においては、そのベクター構築物は、組換えウイルス・ベクターにより担持される。好ましい態様においては、この組換えウイルス・ベクターは、組換えレトロウイルス・ベクターである。本発明の１の態様においては、抗腫瘍剤は、免疫活性化物質及び腫瘍増殖阻害剤から成る群から選ばれる。免疫活性化物質（immune activatiors）は、例えば、免疫モジュレーター(immune modulators)及びリンホカイン(lymphokines)を含む。免疫モジュレーターの代表的な例は、CD3，ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3 ，β−２−マイクログロブリン、シャペロン（chaperones）、アルファ・インターフェロン及びガンマ・インターフェロン、B7/BB1，B7-2及び主要組織適合複合体(MHC)を含む。リンホカインの代表的な例は、ガンマ・インターフェロン腫瘍壊死因子、IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，I L-11，IL-12，GM-CSF，CSF-1、及びG-CSFを含む。先に述べたように、本発明の他の態様においては、抗−腫瘍剤は、腫瘍増殖阻害剤、例えば、毒素及びアンチセンス配列を含む。毒素の代表例は、リシン(ricin)、アブリン(abrin)、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン(gelonin)、ヤマゴボウ（pokeweed）、抗ウイルス・タンパク質、トリチン（tritin）、シゲラ毒素（Shigella toxin）、及びシュードモナス外毒素Ａ（Pseudomonas exotoxin A）、単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ(HSVTK)、及びE.coliグアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼを含む。アンチセンス配列の代表例は、アンチセンス・チミジン・キナーゼ、アンチセンス・ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アンチセンスHER2、アンチセンスABL、アンチセンスMyc、及びアンチセンスras を含む。本発明の特に好ましい態様においては、抗腫瘍剤は、膜アンカー（membran an chor）−ガンマ・インターフェロン融合タンパク質である。他の態様においては、抗腫瘍剤は、ガンマ・インターフェロン−インターロイキン−２融合タンパク質である。本発明の追加の態様においては、膜アンカー・ガンマ・インターフェロン融合タンパク質及び膜アンカー抗腫瘍剤融合タンパク質をコードしている単離DNA配列、並びに、これらの配列の発現を指示するベクター構築物、及びこのベクター構築物を担持する組換えウイルス及びレトロウイルス・ベクターを提供する。また、インターロイキン−２−ガンマ・イターフェロン融合タンパク質の発現を指示するベクター構築物を担持している組換えウイルス・ベクター及び組換えレトロウイルス・ベクターをも提供する。また、本発明は、先に討議した組換えレトロウイルス・ベクターに感染した標的細胞、並びに医薬として許容される担体又は希釈剤と共に、先に記載した組換えウイルス又はレトロウイルス・ベクターを含んで成る医薬組成物をも提供する。本発明の他の態様においては、温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害するための方法であって、温血動物に、その腫瘍の増殖を阻害するような、先に記載するような組換えレトロウイルス又はウイルス・ベクターをデリバリーする段階を含んで成る方法を提供する。本発明の他の態様においては、温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する追加の方法であって、（ａ）温血動物からその選択された腫瘍と関連する腫瘍細胞を取り出し、（ｂ）その取り出された細胞を先に記載したような組換えレトロウイルス又はウイルス・ベクターにより感染させ、そして（ｃ）その選択された腫瘍の増殖が阻害されるように、温血動物にその感染細胞をデリバリーする、段階を含んで成る方法を提供する。本発明の各態様において、デリバリーの段階に先立って、線維芽細胞を、取り出した細胞から取り除くことができる。さらに、温血動物への感染細胞のデリバリーに先立って、その感染細胞を失活させることができる。本発明の他の態様においては、温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、（ａ）温血動物から選択された腫瘍と関連する腫瘍細胞を取り出し、（ｂ）それらの細胞がその抗腫瘍剤を発現することができるような、抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物とその細胞を接触させ、そして（ｃ）選択された腫瘍の増殖が阻害されるように、同種（allogeneic）温血動物に段階（ｂ）からの細胞をデリバリーする、段階を含んで成る方法を提供する。本発明のこれらの及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照しながら明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、複製欠陥レトロウイルス・ベクター中へのネズミ・ガンマ−インターフェロンのクローニングを図解する。図２は、Ｌ33及びB16F10細胞系内でのMHCクラスＩタンパク質の発現を示すウェスタン・ブロットである。図３は、インビトロにおいて組換えネズミ・ガンマ−インターフェロンにより処理されたＬ33及びB16F10細胞内のMHCクラスＩ発現を示すウェスタン・ブロットである。図4Aは、Black ６マウスにおける抗−B16F10 CTL応答の誘導を示すグラフである。図4Bは、Black ６マウスにおける抗−B16F10ネズミ・ガンマ・インターフェロン＃４ CTL応答の誘導を示すグラフである。図５は、腹膜内又は筋中の注射のいずれかの後の、マウスにおける抗−B16F10 ネズミ・ガンマ・インターフェロン＃４ CTL応答の誘導を示すグラフである。図６は、B16F10、又はB16F10 ｍγ−IFN ＃４細胞のいずれかを注射されたBl ack ６マウスにおける腫瘍増殖を示す棒グラフである。図７は、照射B16F10細胞又は照射B16F10ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃４細胞のいずれかによる種痘の後の、B16F10細胞により挑戦されたBlack ６マウスにおける腫瘍増殖を示す棒グラフである。図８は、照射B16F10細胞又は照射B16F10ネズミ・ガンマ・インターフェロン＃４細胞のいずれかによる一般的な異なる種痘養生法後の腫瘍増殖を示す棒グラフである。図９は、６×10^６のＬ33細胞、組換えネズミ・ガンマ−インターフェロンにより処理されたＬ33細胞、又はＬ33ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃15細胞のいずれかを注射されたBalb／Ｃマウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。図10は、６×10^６のＬ33細胞、組換えネズミ・ガンマ−インターフェロンにより処理されたＬ33細胞、又はＬ33ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃15細胞のいずれかを注射されたBalb／Ｃマウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。図11は、Ｌ33細胞又はＬ33ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃15細胞のいずれかを注射されたBalb／Ｃヌード・マウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。図12は、CT26細胞、又はプールされたCT26ネズミ・ガンマ−インターフェロン発現細胞のいずれかを注射されたBalb／Ｃマウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。図13は、非腫瘍担持動物におけるプールされたCT26ネズミ・ガンマ−インターフェロン発現細胞（非−クローン・プール）によるCTL誘導を示すグラフである。図14は、照射CT26ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃10発現細胞によるCTL 誘導を示すグラフである。図15は、CT26標的細胞についてのCT26ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃10 のCTL特異性を示すグラフである。図16は、CT26 CTL溶解に対する、CT26ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃10 細胞によるネズミ・ガンマ−インターフェロン発現の効果を示すグラフである。図17は、LLT細胞又はLLTネズミ・ガンマ−インターフェロン発現細胞のいずれかを注射されたC57B1/６マウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。図18は、照射LLTネズミ・ガンマ−インターフェロン発現細胞によるCTL誘導を示すグラフである。図19は、LLT標的細胞についてのLLTネズミ・ガンマ−インターフェロン・エフェクタ−Ｔ−細胞のCTL特異性を示すグラフである。図20は、LLT CTL溶解に対するLLTネズミ・ガンマ−インターフェロン細胞によるネズミ・ガンマ−インターフェロン発現の効果を示すグラフである。図21は、Ｌ33細胞、Ｌ33ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃13細胞、Ｌ33ネズミ・ガンマ−インターフェロン＃15細胞、及びＬ33ネズミ・ガンマ−インターフェロン発現細胞（非−クローン・プール）におけるMHCレベルのFACS分析を示す一連のグラフである。図22は、γ−IFN-発現ヒト・メラノーマにおけるHLAクラスＩにおける増加を示す一連のウェスタン・ブロットである。図23は、メラノーマDM252，DM6、及びDM92についてのパーセント形質導入対感染多重度（“MOI”）を示すグラフである。図24は、濃縮非精製ベクターによるヒト・メラノーマの形質導入を示す、メラノーマ細胞を含む６−ウェル・プレートの写真である。図25は、ベクターにより形質導入されたメラノーマ細胞の高倍率写真である。図26は、ヒト・メラノーマが組織培養中への導入後24時間以内に容易にトランスフェクトされることを示す４つの組織培養プレートの写真である。発明の詳細な説明先に述べたように、本発明は、一般的に、抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物を使用する選択された腫瘍の増殖の阻害方法に向けられる。簡単に言えば、外来病原体、例えば、腫瘍細胞を認識し、そしてそれに対して防御する能力が、免疫系の機能の中心にある。免疫認識を通じて、この系は、“自己（self）” を“非自己（nonself”）（外来）から区別することができ、そして防御機構が宿主組織に対してよりも侵入性存在に向けられるということを保証するために不可欠である。以下、より詳細に記載する方法は、MHC非限定応答、有効なクラスＩ−限定又はクラスII−限定の保護的、且つ治療的CTL応答、並びに体液性(humo ral)応答を含む有効な手段を提供する。特に、本発明は、温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、その腫瘍に、その腫瘍の増殖が阻害されるような、少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物を直接投与する段階を含んで成る方法を提供する。本発明の文脈中、“ 選択された腫瘍の増殖を阻害する(inhibiting the growth of a selected tumor )”とは、（１）腫瘍細胞分裂の直接的阻害、又は（２）免疫細胞仲介の腫瘍細胞溶解、のいずれか、又は両方であって、腫瘍細胞の正味の増加における抑制を導びくものをいう。これらの２つの機構のいずれかによる腫瘍増殖の阻害は、多くのよく知られた方法に基づいて当業者により容易に測定されることができる。例えば、腫瘍阻害は、一定の時間にわたり実際の腫瘍サイズを測定することにより決定されることができる。あるいは、腫瘍阻害は、当業者によく知られた方法を使用して（一定の時間にわたり）腫瘍のサイズを推定することにより決定されることができる。より特に、さまざまな、放射線医学の画像形成法（例えば、シニグルフォトンエミッションCT（single photon cmission computed tomography ）及び陽電子射出断層撮影法（positron emission tomography）；一般的に、“ Nuclear Medicine in Clinical Oncology,”Winkler, C．（ed.）Springer-Verl ag，New York，1986を参照のこと。）を、腫瘍サイズを推定するために使用することができる。このような方法は、例えば、慣用の画像形成剤（例えば、クエン酸ガリウム−67）を含むさまざまな画像形成剤、並びに代謝画像形成、レセプタ画像形成、又は免疫学的画像形成のための特別の試薬（例えば、標識モノクローナル抗体特異的腫瘍マーカー）を使用することもできる。さらに、非放射性方法、例えば、超音波（“Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors”，Kosso ff and Fukuda，（eds.），Igaku-Shoin，New York，1984参照）を、腫瘍のサイズを推定するために使用することもできる。先に討議した腫瘍阻害を測定するためのインビボにおける方法に加えて、さまざまなインビトロ方法を、インビボにおける腫瘍阻害を予測するために使用することができる。代表的な例は、例えば⁵¹ Cr放出検定により決定されるリンパ球仲介抗腫瘍細胞溶解活性、腫瘍依存性リンパ球増殖(Ioannides et al.，J．Immunol．146（5）：1700-1707，1991)、腫瘍特異的抗体のインビトロにおける生成(Herlyn et al.，J．Immunol．Meth．73： 157-167，1984)、インビトロにおける細胞増殖の細胞（例えば、ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞）又は体液（例えば、抗体）仲介阻害（Gazit et al，Cancer Immunol. Immunother 35：135-144，1992）、及び、これらの検定のいずれかのための、細胞前駆体頻度の測定（Vose，Int．J．Cancer 30：135-142(1982)）を含む。あるいは、癌の他の形態については、腫瘍増殖の阻害を、腫瘍マーカーの存在中での変化に基づき決定することができる。これらの例は、前立腺癌の検出のための前立腺特異的抗原（“PSA”）（米国特許第Re 33,405号参照）、及び結腸直腸及び特定胸癌の検出のための癌胚抗原（Carcino-Embryonic Autigen（“CEA” ）を含む。さらに他のタイプの癌、例えば、白血病については、腫瘍増殖の阻害を、代表的な血液細胞カウントにおける白血球の減少数に基づき決定することができる。さまざまな腫瘍細胞を、本明細書中に記載する方法に従う治療のために選択することができる。一般的には、固形腫瘍が好ましい。但し、白血病及びリンパ腫も、それらが固形塊に発達する場合に、あるいは、その腫瘍細胞が非病原性正常細胞から物理的に分離されることができるような好適な腫瘍会合マーカーが存在する場合に、治療されることができる。例えば、急性リンパ球白血病細胞は、その白血病特異的マーカー“CALLA”により他のリンパ球からソートされることができる。好適な腫瘍の代表例は、メラノーマ、結腸直腸癌腫、肺癌腫（大細胞、小細胞、扁平上皮（squcmous）及び腺(adeno)癌腫を含む）、腎細胞癌腫及び胸腺癌腫を含む。先に述べたように、さまざまな抗腫瘍剤を、本発明に従って使用することができる。本発明の文脈中、“抗腫瘍剤(amti-tumor agents)”は、先に討議したような選択された腫瘍の増殖を阻害する化合物又は分子をいう。抗腫瘍剤の代表例は、免疫活性化物質(immune activators)及び腫瘍増殖阻害物質（tumor protife ration iuhibitors）を含む。簡単に言えば、免疫活性化物質は、その免疫系が “プライム（刺激）（primed）”されるように、腫瘍特異的抗原の免疫認識を改良することにより機能する。プライミングは、リンパ球の増殖、分化、又はより高いアフィニティー相互作用への進化から成ることができる。このようにプライムされた免疫系は、腫瘍細胞をより効果的に阻害し又は殺すであろう。免疫活性化は、免疫モジュレーター（リンパ球と腫瘍細胞との間の相互作用に影響を及ぼす分子）及びリンホカインであって免疫エフェクター細胞を増殖させ、活性化し、又は分化させるために作用するものに下位区分することができる。免疫モジュレーターの代表例は、CD3，ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3，β−２−マイクログロブリン、シャペロン、アルファ・インターフェロン及びガンマ・インターフェロン、B7/BB1，B7-2及び主要組織適合複合体(MHC)を含む。リンホカインの代表例は、ガンマ・インターフェロン、腫瘍壊死因子、IL-1，IL-2，IL-3，IL-4， IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，GM-CSF，CSF-1、及びG- CSFを含む。腫瘍増殖阻害剤は、細胞増殖を直接的に阻害することにより、又はその腫瘍細胞を直接的に殺すことにより作用する。腫瘍増殖阻害剤の代表例は、毒素、例えば、リシン（Lamb et al.，Eur．J．Bio chem．148：265-270，1985）、アブリン（Wood et al.，Eur．J．Bio chem．198：723-732，1991；Evensen，et al.， J．of Biol．Chem．266：6848-6852，1991：Collins et al.，J．of Biol． Chem．265：8665-8669，1990；chen et al.，Fed．of Eur．Biochem Soc．309: 115-118，1992）、ジフテリア毒素(Tweten et al.，J．Biol．Chem．260：10392 -10394，1985)、コレラ毒素（Mekalanos et al.，Nature 306：551-557，1983； Sanchez & Holmgren，PNAS 86：481-485，1989）、ゲロニン(Stirpe et al.，J ．Biol．Chem．255：6947-6953，1980)、ヤマゴボウ（Irvin，Pharmac．Ther．2 1：371-387，1983）、抗ウイルス・タンパク質（Barbieri et al.，Biochem．J ．203：55-59，1982；Irvin et al.，Arch．Bio chem．& Biophys，200；418-42 5，1980；Irvin，Arch．Bio chem．& Biophys．169：522-528，1975）、トリチン、シゲラ毒素（Calderwood et al.，PNAS 84：4364-4368，1987；Jackson et al.，Microb．Path．２：147-153，1987）、及びシュードモナス外毒素Ａ(Carro ll and Collier，J．Biol．Chem．262：8707-8711，1987)、単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（HSVTK）(Field et al.，J．gen．Virol．49：115-1 24，1980)、及びE.coliグアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼを含む。腫瘍増殖阻害物質の追加の例は、細胞増殖のために必要とされる必須タンパク質の細胞合成を妨害することにより腫瘍細胞増殖を阻害するアンチセンス配列を含む。このようなアンチセンス配列の例は、アンチセンス・チミジン・キナーゼ、アンチセンス・ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Maher and Dolnick，Arch，Bio c hem．& Biophys，253：214-220，1987；Bzik et al.，PNAS 84：8360-8364，198 7）、アンチセンスHER2（Coussens et al.，Science 230：1132-1139，1985）、アンチセンスABL（Fainstein，et al.，Oncogene 4：1477-1481，1989）、アンチセンスMyc(Stanton et al.，Nature 310：423-425，1984)及びアンチセンスra s 、並びにヌクレオチド生合成経路における酵素のいずれかを遮断するアンチセンス配列を含む。最後に、腫瘍増殖阻害物質は、腫瘍サプレッサー、例えば、p53、網膜芽腫( retinoblastoma(Rb))、並びに結腸直腸癌腫についてのMCC及びAPCをも含む。さらに、本発明のさらなる態様においては、アンチセンスRNAを、有効なクラスＩ限定応答を誘導するために抗腫瘍剤として使用することができる。簡単に言えば、RNAに結合し、そしてそれにより特定のmRNAの翻訳を妨害することに加えて、高いレベルの特異的アンチセンス配列が、大量の２本鎖RNAの形成のために、（ガンマ・インターフェロンを含む）インターフェロンの増加された発現を誘導すると信じられている。ガンマ・インターフェロンの増加された発現は、次に MHCクラスＩ抗原の発現をブーストする。これに関しての使用において好ましいアンチセンス配列は、アクチンRNA、ミオシンRNA、及びヒストンRNAを含む。アクチンRNAとのミスマッチを形成するアンチセンスRNAが特に好ましい。先に記載した抗腫瘍剤をコードする配列は、さまざまな源から得られうる。例えば、抗腫瘍剤をコードする配列を含むプラスミドを、寄託機関、例えば、Amer ican Type Culture Collection(ATCC，Rockville，Maryland)、又は商業的な源、例えば、British Bio-Techrology Limited（Cowley，Oxford England）から得ることができる。上述の抗腫瘍剤をコードする代表的な源配列は、（127アミノ酸の成熟タンパク質をコードするGM-CSF遺伝子を含む）BBG 12、（ガンマ・インターフェロンをコードする配列を含む）BBG６、（TNFをコードする配列を含む） ATCC第39656号、（アルファ・インターフェロンをコードする配列を含む）ATCC 第20663号、（ベータ・インターフェロンをコードする配列を含む）ATCC第31902 号、31902号及び39517号、（インターロイキン−１βをコードする配列を含む） ATCC第67024号、（インターロイキン−２をコードする配列を含む）ATCC第39405号、第39452号、第39516号、第39626号及び第39673号、（インターロイキン−３をコードする配列を含む）ATCC第59399号、第59398号及び第67 326号、（インターロイキン−４をコードする配列を含む）ATCC第57592号、（インターロイキン−５をコードする配列を含む）ATCC第59394号及び第59395号、並びに（インターロイキン−６をコードする配列を含む）ATCC第67153号を含む。あるいは、抗腫瘍剤をコードする公知のcDNA配列を、この配列を発現し又は含む細胞から得ることができる。簡単に言えば、１つの態様においては、着目の遺伝子を発現する細胞からのmRNAを、オリゴdT又はランダム・プライマーを使用して逆転写酵素により逆転写する。次に一本鎖cDNAを、所望の配列のいずれかの側上の配列に相補的なオリゴヌクレオチド・プライマーを使用してPCRにより増幅する（米国特許第4,683,202号、第4,683,195号及び第4,800,159号参照。また、P CR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich (ed.)，Stockton Press，1989参照）。特に、二本鎖DNAを、耐熱性Taq ポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、ATP，CTP，GTP及びTTPの存在中で加熱することにより変性する。二本鎖DNAは、合成が終了したときに作られる。このサイクルを多数回繰り返して、所望のDNAの階乗増幅をもたらすことができる。上記の抗腫瘍剤をコードする配列を、例えば、Applied Biosystems Inc．DNA 合成装置(例えば、ABI DNA synthesizer model 392(Foster City，California)) 上で合成することもできる。先に記載した抗腫瘍剤に加えて、本発明は、例えば、２以上のサイトカイン、免疫モジュレーター、毒素又は分化因子の融合タンパク質を含んで成る抗腫瘍剤を提供することもできる。これに関して好ましい抗腫瘍剤は、アルファ・インターフェロン−インターロイキン−２、インターロイキン−12，GM-CSF-IL-4，GM-CSF-IL-2，GM-CSF-IL-3(米国特許第5,08 2,927号及び第5,108,910号参照)、GM-CSF−ガンマ・インターフェロン、及びガンマ・インターフェロン−IL-4を含む。特に好ましい態様においては、抗腫瘍剤は、ガンマ・インターフェロン−インターロイキン−２融合タンパク質である。他の好ましい態様においては、多抗腫瘍剤（例えば、２以上のリンホカイン）は、以下により詳細に討議するように、内部リボソーム結合部位を使用して単一のベクター構築物から発現されることができる。これらの抗腫瘍剤の構築は、本明細書中に提供する開示が与えられれば容易に行われることができる。特に好ましい抗腫瘍剤、ガンマ・インターフェロン−インターロイキン−２の構築を、以下、実施例1F中により詳細に記載する。本発明の他の態様においては、抗腫瘍剤は、膜アンカー(membrane anchor)を含んで成り、そして例えば、抗腫瘍剤−膜アンカー融合タンパク質として構築されることができる。簡単に言えば、融合タンパク質の膜アンカーの態様は、例えばよく知られた分子のトランスメンブラン・ドメインを含むさまざまな配列から選ばれることができる。一般的には、膜アンカー配列は、上記タンパク質を膜に結合するタンパク質の領域である。慣用的には、細胞膜の外側表面にタンパク質を付着する２つのタイプのアンカー配列がある：（１）細胞膜の脂質二重層にまたがり、そしてその疎水性中心領域と相互作用するトランスメンブラン領域（このような領域を含むタンパク質を膜内在性タンパク質（integral membrane prot eins）という）、及び（２）膜内在性タンパク質と又はその膜の極性表面と相互作用するドメイン（このようなタンパク質を、周辺または表在性（peripheral， or extrinsic）タンパク質という。）。本発明における使用のための膜アンカーは、その膜の１倍以上にわたるトランスメンブラン・ドメインを含むことができる。例えば、グリコホリン(glycophor in)及びグアニリル・シクラーゼ（guanylyl cyclase）においては、その膜結合領域は、その膜の１倍にわたり、一方、ロドプシン(rhodopsin)の膜ドメインは、その膜の７倍にわたり、そしてロドシュードモナス・ビリディス（Rhodopseud omonas viridis）の光合成反応中心のそれは、膜の11倍にわたる（Ross et al. ，J．Biol．Chem．257：4152，1982；Garbers，Pharmac．Ther．50：337-345，1 991；Eugelman et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77：2023，1980；Heijne and Manoil，Prot．Eng．４：109-112，1990を参照のこと。）。タンパク質が膜の数倍にもわたるにも拘らず、その膜スパニング領域（membrane spanning regi on）は、典型的には、類似の構造をもつ。より特に、その膜の内部にあるドメインの20〜25アミノ酸残基部分は、ほとんど全部疎水性残基から成る（Eisenberg et al.，Ann．Rev．Bio chem．53：595-623，1984参照）。例えば、グリコホリンの膜スパニング領域34残基中の28が、疎水性である（Ross et al．；Tomita e t al.，Biochemistry 17：4756-4770，1978参照）。さらに、ベータ・シート及びバレル(barrels)のような構造が生じているにも拘らず、その膜スパニング領域は、典型的には、Ｘ−線回折、結晶学及び架橋試験により決定されるように、アルファ・ヘリックス構造をもつ（Eisenberg et al．at 20；Heijne and Manoi l at 109参照）。所定の配列内のこれらのトランスメンブラン・ヘリックスの位置は、疎水性プロットに基づき、しばしば予言されることができる。Stryer et al.，Biochemistry，3rd．ed．304，1988。本発明における使用のために特に好ましい膜アンカーは、膜シグナル・アンカーとして機能することが立証されている（非免疫原性である）天然の細胞タンパク質（例えば、グリコホリン）を含む。本発明の好ましい態様においては、膜アンカー−ガンマ・インターフェロン融合タンパク質をコードするDNA配列を提供する。１つの態様においては、この融合タンパク質は、Fcレセプタのガンマ鎖の膜アンカーをコードする配列を、ガンカ−インターフェロンをコードしている配列に遺伝子融合することにより構築されることができるこのような抗腫瘍剤の構築を以下、実施例１中により詳細に述べる。一旦、少なくとも１の抗腫瘍剤をコードする配列が得られれば、その配列が腫瘍非形成性タンパク質をコードしていることを確認することが必要である。特定の細胞成分の腫瘍形成性（Tumorigenicity）を評価するさまざまな検定が公知であり、そして容易に行うことができる。代表的な検定は、ヌード・マウス又はラットにおける腫瘍形成、柔寒天中でのコロニー形成、及びトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック・マウスの調製を含む。ヌード・マウス又はラットにおける腫瘍形成は、抗腫瘍剤の腫瘍形成性を測定するために特に重要であり、かつ、感度の良い方法である。ヌード・マウスは、機能的細胞免疫系を欠いており（すなわち、CTLsを有しておらず）、そしてそれ故、細胞の腫瘍形成能力をテストする有用なインビボ・モデルを提供する。正常な腫瘍非形成細胞は、ヌード・マウス中に注射される場合、無制御増殖特性を示さない。しかしながら、形質転換細胞は、ヌード・マウス中で急速に増殖し、そして腫瘍を生成するであろう。要するに、１つの態様においては、ベクター構築物を、同系(syngeneic)ネズミ細胞にデリバーし、その後ヌード・マウス中に注射する。このマウスを、腫瘍の成長を測定するために注射後２〜８週間の期間にわたり視覚的に検査する。また、これらのマウスは、腫瘍が存在するかどうかを決定するために、殺され、そして剖検されることができる。（Giovanella et al .，J．Natl．Cancer Inst．48：1531-1533，1972；Furesz et al.，“Tumorigen icity testing of cell lines considered for production of biological drug s，”Abnormal Cells，New Prodacts and Risk，Hopps and Petricciani(eds.), Tissue Culture Association，1985；及びLavenbook et al.，J．Biol．Std．1 3：135-141，1985）。腫瘍形成性は、柔寒天中のコロニー形成を観察することにより評価されることもできる（MacPherson and Montagnier，Vir．23：291-294，1964）。簡単に言えば、正常な腫瘍非形成性細胞の１の特性は、“接触阻害(contact inhibition) ”である（すなわち、細胞が、それらが隣接する細胞に接触するときに増殖を停止するであろう。）細胞が、半固形寒天支持培地中にプレートされる場合、正常な細胞は、接触阻害され、そして増殖を停止する。一方、腫瘍形成性細胞は、増殖を受け、そして柔寒天中にコロニーを形成するであろう。トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック・マウスを、抗腫瘍剤の腫瘍形成性を評価するために使用することもできる(例えば、Stewart et al. ，Cell 38：627-637，1984；Quaife et al.，Cell 48：1023-1034，1987；及びK oike et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：5615-5619，1989)。トランスジェニック動物においては、着目の遺伝子はその動物の全組織内で発現されることができる。このトランスジーンの非調節の発現は、新たに誘導された遺伝子の腫瘍形成能力についてのモデルとして役立つことができる。腫瘍形成性試験に加えて、投与に先立って、抗腫瘍剤（単数又は複数）の毒性を測定することも一般的に好ましい。当業者によく知られたさまざまな方法であって、例えば、各種タンパク質及び酵素、並びに血液細胞容量及び数の全身レベルを測定する臨床化学検定を含むものを、上記のような毒性を測定するために使用することができる。一旦、抗腫瘍剤が選択されれば、それは、その発現を指示するベクター構築物中に置かれる。本発明の文脈中、“ベクター構築物（vector construct）”は、着目の配列（単数又は複数）又は遺伝子（単数又は複数）の発現を指示することができるアセンブリーをいうと理解される。このベクター構築物は、転写プロモーター要素（単数又は複数）を含むことができ、そして好ましくは、ポリアデニレーションを指示するシグナルを含む。さらに、このベクター構築物は、転写されるとき、着目の配列又は遺伝子に作用可能な状態で連結され、そして翻訳開始配列として作用する配列を含まなければならない。場合により、このベクター構築物は、選択マーカー、例えば、Neo，TK、ハイグロマイシン、フレオマイシン（phleomycin）、ヒスチジノール(histidinol)、又はDHFR、並びに１以上の制限部位及び翻訳終止配列を含むこともできる。さらに、このベクター構築物がレトロウイルス内に置かれる場合、このベクター構築物は、（これらが既に存在しない場合に）使用されるレトロウイルスに適当なパッキング・シグナル、ロング・ターミナル・リピート（LTRs）、並びに正及び負ストランド・プライマー結合部位を含まなければならない。上述のように、本発の１の態様においては、抗腫瘍剤の発現を指示することができるベクター構築物を担持する組換えレトロウイルスを提供する。このような組換えレトロウイルス・ベクターの構築は、“Recombinant Retroviruses”の名称の出願（米国特許第逐次番号第07/586,603号、1990年９月21日出願、これを全体として引用により本明細書中に取り込む。）中に、かなり詳細に記載されている。これらの組換えレトロウイルス・ベクターは、適当なパッケージング細胞系内にそれらを導入することにより、形質導入コンピテント・レトロウイルス・ベクター粒子を生成するために使用されることができる（U．S．S．N．07/800,921参照）。さらに、実施例１，３及び４は、組換えレトロウイルス・ベクターの、並びにいくつかの抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物について記載している。本発明のベクター構築物は、例えば、ポリオウイルス（Evans et al.，Nature 339：385-388，1989、及びSabin J．of Biol．Standardization １：115-118， 1973）；ライノウイルス；ポックス・ウイルス、例えば、カナリア痘ウイルス又はワクシニア・ウイルス（Fisher-Hoch et al.，PNAS 86：317-321，1989；Flex ner et al．，Ann．N．Y．Acad．Sci．569：86-103，1989；Flexner et al.，Va ccine ８：17-21，1990；米国特許第4,603,112号及び第4,769,330号；WO 89/019 73)；SV40（Mulligan et al.，Nature 277：108-114，1979）；インフルエンザ・ウイルス（Luytjes et al.，Cell 59：1107-1113，1989；McMicheal et al.， The New England Journal of Medicine 309：13-17，1983；及びYap et al.，Na ture 273：238-239，1978）；アデノウイルス（Berkner，Bio techniques ６：6 16-627，1988、及びRosenfeld et al.，Science 252：431-434，1991）；パルボウイルス、例えば、アデノ−関連ウイルス（Samulski et al.，Journal of Viro logy 63：3822-3828，1989、及びMendelson et al.，Virology 166：154-165，1 985）；ヘルペス（Kit，Adv．Exp．Med．Biol．215：219-236，1989）；SV40；H IV；麻疹（EP 0 440,219）；及びシンドビス・ウイルス（Xiong et al.，Sience 234：1188-1191，1989）、及びコロナ・ウイルスを含む他のウイルス担体と共に開発され、そして使用されることもできる。さらに、ウイルス担体は、同形（homologous）、非病原性（欠陥）、複製コンピテント・ウイルスであることができ(例えば、Overbaugh et al.，Science 239： 906-910，1988)、そしてそれにもかかわらず、CTLを含む細胞免疫応答を誘導することができる。上述のように、少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物は、腫瘍に直接投与される。腫瘍にベクター構築物を直接投与するために、さまざまな方法を本発明の文脈において使用することができる。例えば、１の態様においては、小さな転移病変を位置決めし、そしてベクターを、腫瘍の体内のいくつかの異なる位置において数回注射することができる。あるいは、腫瘍として役立つ動脈を同定し、そしてその腫瘍に直接ベクターをデリバリーするために、このような動脈内にベクターを注射することができる。他の態様においては、壊死中心をもつ腫瘍を吸引し、そしてベクターを、腫瘍の今は空である中心に直接注射することができる。さらに他の態様においては、ベクター構築物を、例えば、ベクター構築物、又は好ましくは、このベクター構築物を担持する組換えレトロウイルス・ベクターを含む表在局所的医薬組成物の適用により、その腫瘍の表面に直接投与することができる。本発明の他の態様においては、選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、温血動物に、その腫瘍の増殖を阻害するような、少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物をデリバリーする段階を含んで成る方法を提供する。ベクター構築物に加えて、抗腫瘍剤（単数又は複数）をコードする核酸を、さまざまな方法により患者に投与することもできる。代表的な例は、さまざまな物理的方法、例えば、リポフェクション( Felgner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：7413-7417，1989)、直接DNA インジェクション（Acsadi et al.，Nature 352：815-818，1991）；マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（Williams et al.，PNAS 88：2726-2730，1 991）；リポソーム（Wang et al.，PNAS 84：7851-7855，1987）；CaPO₄（Duben sky et al.，PNAS 81：7529-7533，1984）；DNAリガンド（Wu et al，J．of Bio l．Chem．264：16985-16987，1989）；又は死んだアデノウイルスに結合されたD NAの投与（Curiel et al.，Hum．Gene Ther．３：147-154，1992）によるトランスフェクションを含む。組換えレトロウイルス・ベクターの投与のためのさまざまな方法も、本発明の文脈において使用することができ、このような方法は、“ Recombinent Retroviruses”の名称の出願(U．S．S．N．07/586,603)（これを明白に、引用により本明細書中に取り込む。）中に、かなり詳細に記載されている。さらに、（CTLを含む）細胞応答を、その細胞表面上に、抗腫瘍剤、例えば先に討議したものを発現するバクテリアの投与により作り出すこともできる。代表的な例は、BCG（Stover，Nature 351：456-458，1991）及びサルモネラ（Newton et al.，Science 244：70-72，1989）を含む。本発明の他の態様においては、温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、（ａ）温血動物から選択された腫瘍と関連する腫瘍細胞を取り出し、（ｂ）少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物によりその取り出した細胞を感染させ、そして（ｃ）その選択された腫瘍の増殖が、遺伝子修飾された腫瘍細胞に対して作り出された免疫応答により阻害されるように、温血動物にその感染細胞をデリバリーする。段階を含んで成る方法を提供する。本発明の１の態様においては、温血動物からの腫瘍細胞の取り出し後に、単細胞懸濁液を、例えば、物理的破壊又はタンパク質分解消化により作り出すことができる。さらに細胞の分裂を、その組換えウイルス・ベクターの取込み、ゲノム組み込み及び発現を増強するために、各種因子、例えば、メラノーマのためのメラノサイト刺激因子又は胸癌腫のための上皮成長因子の添加により、増加させることができる。本発明の文脈において、取り出された細胞は同一の動物に戻されるだけでなく、他の同種(allogenic)動物において選択された腫瘍細胞の増殖を阻害するたに使用されることもできることが理解されなければならない。このような場合においては、組織適合性がマッチした動物をもつことが一般的に好ましい（常にではないが、例えば、Yamamoto et al.，“Efficacy of Experimental FIV Vaccines ，”1st International Couference of FIV Researchers，University of Calif ornia at Davis，September 1991を参照のこと。）。それ故、本発明のさらに他の態様においては、温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、（ａ）温血動物から選択された腫瘍と関連する腫瘍細胞を取り出し、（ｂ）その細胞が抗腫瘍剤を発現することができるように、抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物により、その細胞を感染させ、そして（ｃ）その選択された腫瘍の増殖が阻害されるように、同種（allogeneic）温血動物に、段階（ｂ）からの細胞をデリバリーする、段階を含んで成る方法を提供する。さらに、さまざまな細胞（標的細胞）であって、例えば、ヒト、アカゲザル(m acaque)、イヌ、ラット及びマウス細胞を含むものを、本発明の文脈において使用することができることが理解されなければならない。細胞は、さまざまな位置から、例えば、選択された腫瘍から取り出されることができる。さらに、本発明の他の態様においては、ベクター構築物を、例えば、皮膚からの細胞（皮膚線維芽細胞）又は血液からの細胞（例えば、末梢血液白血球）を含む腫瘍非形成性細胞に挿入することができる。所望により、細胞、例えば、Ｔ細胞サブセット又は幹細胞の特定の画分を、血液から特別に取り出すこともできる（例えば、PCT WO 91/16116，“Immunoselection Device and Method”の名称の出願を参照のこと。）。次にベクター構築物を、先に記載した技術のいずれかを使用して、その取り出された細胞に接触させその後、好ましくは、腫瘍の近傍に又はその内において、その温血動物にその細胞を戻すことができる。先に記載した方法は、さらに、温血動物から腫瘍細胞を取り出した後に、線維芽細胞又は他の非汚染性腫瘍細胞を除去する段階、及び／又は例えば、照射により、それらの細胞を失活させる段階を含んで成ることができる。先に述べたように、本発明の特定の態様においては、本発明の方法に従って、選択された腫瘍の増殖を阻害するために、同時に又は順番にかのいずれかにおいて、数種の抗腫瘍剤を投与することができる。例えば、本発明の１の態様においては、抗腫瘍剤、例えば、γ−IFNを、病因剤を阻害し又は破壊するために、他の抗腫瘍剤、例えば、IL-2、又はIL-12と共に温血動物に同時又は順番に投与することができる。このような治療組成物は、少なくとも２の抗腫瘍剤の発現を指示する単一のベクター構築物を使用して直接的に投与され、又は、他の態様においては、別のベクター構築物から発現されることができる。あるいは、１の抗腫瘍剤(例えば、γ−IFN)は、ベクター構築物を使用して投与されることができ、一方、他の腫瘍剤（例えば、IL-2）は、（例えば、静脈中、医薬組成物として）直接的に投与されることができる。特に好ましい態様においては、γ−IFN遺伝子とIL-2をコードする他の遺伝子の両方をデリバリーし、かつ、発現するベクター又はVCLsを、患者に投与することができる。このような構築物においては、１の遺伝子が、そのベクターのLTR から発現され、そして他が、そのLTRs間にある追加の転写プロモーターを使用し、又は、たぶん内部リボソーム結合部位を使用して、ポリシストロンmRNAとして発現されることができる。インビボにおける遺伝子転移の後、患者の免疫系は、 γ−IFNの発現により活性化される。炎症細胞による死んだ腫瘍の湿潤は、次に免疫提示を増加させ、そしてさらに、その腫瘍に対する患者の免疫応答を改善する。上述のように、本発明の好ましい態様においては、医薬として許容される担体又は希釈剤と共に、先に記載したベクター構築物の中の１を担持する組換えレトロウイルス又はウイルスを含んで成る医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、液体溶液、又は、投与に先立って溶液中で懸濁される固体形態（例えば、凍結乾燥物）として調製されることができる。さらに、表面投与、注射、経口、経鼻、経膣、舌下、吸入又は直腸投与のいずれかに好適な担体又は希釈剤を含む組成物を調製することができる。医薬として許容される担体又は希釈剤は、使用される投与量及び濃度において受容者に無毒である。注射可能溶液のための担体又は希釈剤の代表例は、水、生理学的pHにおいて好ましくは緩衝化された等張性生理食塩水溶液（例えば、ホスフェート−バッファー生理食塩水又はTris−バッファー生理食塩水）、マンニトール、デキストロース、グリセロール、及びエタノール、並びにポリペプチド又はタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む。特に好ましい組成物は、10 mg／mlマンニトール、１mg／ml HSA，20mM Tris，pH7.2中にベクター又は組換えウイルスを含んで成る。この場合においては、この組換えベクターは、約１μｇの材料を表わすので、それは、高分子量材料の１％未満、そして（水を含む）全材料の１／100,000未満であることができる。この組成物は、少なくとも６ヶ月間−70℃において安定である。本発明の医薬組成物は、さらに、細胞分裂を刺激し、そしてそれ故、組換えレトロウイルス・ベクターの取り込み及び組み込を刺激する因子を含むこともできる。代表的な例は、メラノーマのための、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)、又は胸又は他の上皮癌腫のための上皮成長因子を含む。本発明の医薬組成物は、さまざまな経路（例えば、皮膚内（“ｉ．ｄ．”）、頭蓋内（“ｉ．ｃ．”）、腹腔内（“ｉ．ｐ．”）、鞘内（“ｉ．ｔ．”）、静中（“ｉ．ｖ．”）、皮下（ “ｓ．ｃ．”）、筋中（“ｉ．ｍ．”））により、又は好ましくは、腫瘍内に直接的に、注射されることができる。個々の投与量は、正常には、10⁷〜10⁹ｃ．ｆ．ｕ．（HT 1080細胞上で滴定されたネオマイシン耐性のコロニー形成単位）である。これらは、最初に３又は４投与量について１〜４週間の間隔で投与される。その後のブースター・ショットは、６〜12ヶ月後に１又は２投与量として、そしてその後毎年、与えられることができる。以下の実施例を、限定のためでなく説明のために提供する。実施例実施例１ネズミ・レトロウイルス・プロベクターDNAの調製Ａ．レトロウイルス・バックボーンKT-3の調製 pUC31内に含まれるN2ベクター（Armentano et al.，J．Vir．61：1647-1650， 1987；Eglitis et．al.，Science 230：1385-1398，1985)内のMoloneyネズミ白血病ウイルス（“MOMLV”）からの５’ロング・ターミナル・リピート（“LTR” ）及びgag配列を含むEcoRＩ−EcoRＩ断片を、プラスミドSK⁺(Strctagene，Calif.)にライゲートした。（プラスミドpUC31は、追加の制限部位XhoＩ，BalII，BssHII及びNcoＩがそのポリリンカーのEcoRＩとSacＩ部位の間に挿入されているpUC19(Stratagene，C alifi)から得られる。）得られた構築物を、N2R5と名付けた。このN2R5構築物を、gag発現を妨ぐために、そのATG開始コドンをATTに変更するためにインビトロにおける部位指定突然変異誘発により突然変異させる。この突然変異された断片は、長さ200塩基対（bp）であり、そしてPstＩ制限部位に隣接する。このPstＩ −PstＩ突然変異断片を、上記SK⁺プラスミドから精製し、そして、非突然変異20 0塩基対断片を置換するために、pUC31内のN2 MOMLV５’LTRのPstＩ部位に挿入する。この構築物を、pUC31/N2R5gと名付ける。 N2からの1.0キロ塩基（Kb）のMOMLV ３’LTR EcoRＩ−EcoRＩ断片を、プラスミドSKにクローン化し、N2R3という構築物を得る。1.0Kb ClaＩ−HindIII断片を、この構築物から精製する。ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロモーターを含んで成る、pAFVXMレトロウイルス・ベクター(Kriegler et．al. ，Cell 38：483，1984；St．Louis et al.，PNAS 85：3150-3154，1988)からのC laＩ−ClaＩ優性選択マーカー遺伝子断片を、プラスミドSKにクローン化する。1 .3Kb ClaＩ−BstBＩ neo遺伝子断片を、このプラスミドから精製する。発現ベクターを、３部ライゲーションにより構築する。ここで、以下に記載する着目遺伝子を含むXhoＩ−ClaＩ断片及び1.0Kb MOMLV ３’LTR ClaＩ−HindII I断片を、pUC31/N2R5gプラスミドのXhoＩ−HindIII部位に挿入する。次に、1.3K b ClaＩ−BstBＩ neo遺伝子断片を、そのセンス方向においてこのプラスミドの ClaＩ部位に挿入する。Ｂ．ｍγ−IFNのKT-3へのクローニングｍγ−IFN cDNAを、本質的に以下に述べるようにpUC1813のEcoRＩ部位にクローン化する。簡単に言えば、（γ−IFNをコードする配列を含む）pUC1813を、Ka y et．al.，Nucleic Acids Research 15：2778，1987；及びGray et．al.，PNAS 80：5842，1983により本質的に記載されているように調製する（図1A）。このｍγ−IFN cDNAをpUC1813のEcoRＩ消化により回収し、そしてその単離された断片を、ホスファターゼ処理pSP73（Promega；Madison，Wisc.）のEcoRＩ部位にクローン化する（図1B）。この構築物をsp ｍγ−IFNと名付ける。cDNAの方向を、適当な制限酵素消化及びDNA配列消化により確認する。このセンス方向において、cDNAの５’末端は、pSP73ポリリンカーのXhoＩ部位に隣接し、そしてその３ ’末端は、ClaＩ部位に隣接する。センス方向又はアンチセンス方向のいずれかにおいてｍγ−IFN cDNAを含むXhoＩ−ClaＩ断片を、SPｍγ−IFN構築物から回収し、そしてKT-3レトロウイルス・バックボーンのXhoＩ−ClaＩ部位にクローン化する。この構築物を、KTｍγ−IFNと名付けた（図１）。Ｃ．ｈγ−IFNのKT-3へのクローニング１．PCRを使用するｈγ−IFNをコーディングする配列の調製（ａ）Jurkat細胞のPHA刺激 Jurkat細胞(ATCC No．CRL 8163)を、５％胎児ウシ血清(FBS)を含むRPMI成長培地(Irvine Scientific；Santa Ana，Calif.)中１×10^６細胞／mlの濃度において、158.0μｌの最終容量に再懸濁する。フィトヘモアグルチニン（Phytohemoaggl utinin(“PHA”)）（Curtis Mathes Scientific，Houston，Texas）を、１％の最終濃度までその懸濁液に添加する。その懸濁液を、５％ CO₂中37℃において一夜インキュベートする。これらの細胞を、翌日収穫し、そして３つの50.0ml遠心分離管にアリコートした。この３つのペレットを、50mlの１倍ホスフェート・バッファー生理食塩水(PBS，145mM，pH7.0)中で併合し、そして５分間1000rpmにおいて遠心分離する。この上清をデカントし、そして細胞を50. 0ml PBSで洗浄する。細胞を、RNA単離のために集める。（ｂ）RNA単離 PHA刺激Jurkat細胞を、22.0mlのグアニジニウム溶液（４Ｍグアニジニウム・チオシアネート；20mM酢酸ナトリウム、pH5.0；0.1Ｍジチオトレイトール、0.5 ％サルコシル）中に再懸濁する。次にこの細胞−グアニジウム懸濁液を、細胞膜を破壊するために６回20ゲージの針を通過させる。次にCsCl溶液(5.7 Ｍ CsCl ，0.1Ｍ EDTA)を、11.0mlの破壊細胞−グアニジニウム溶液により重層する。この溶液を、20℃においてSW28.1ローター（Beckman，Fullerton，Calif.）内で28 ,000rpmにおいて24時間遠心分離する。遠心分離後、この上清を、注意して吸引し、そしてそれらの管を吸い取って乾燥させる。ペレットを、500.0μｌの最終容量まで、グアニジニウム−HCl溶液（7.4Ｍグアニジニウム−HCl；25mM Tris -HCl，pH7.5；５mM ジチオトレイトール）中に再懸濁する。この溶液を、マイクロ遠心分離管に移す。12.5μｌの濃氷酢酸(HAc)及び250μｌの100％ EtoHを、そのマイクロ遠心分離管に添加する。この溶液を混合し、そして−20℃において数日間保存してRNAを沈殿させる。保存後、この溶液を、４℃、14,000rpmにおいて20分間遠心分離する。次に、ペレットを75％ EtoH中に再懸濁し、そして４℃、14,000rpmにおけるマイクロフュージにおいて10分間遠心分離する。ペレットを真空下遠心分離により乾燥させ、そして300μｌ脱イオン（DI）H₂O中に再懸濁する。RNAの濃度及び純度を、260 及び28 0nmにおける吸光度を測定することにより決定する。（ｃ）逆転写反応使用直前に、5.0μｌ（3.4mg／ml）の精製されたJurkat RNAを、90℃において５分間熱処理し、そして次に氷上に置く。10.0μｌの10倍PCRバッファー（500mM KCl；200mM Tris-HCl，pH8.4；25mM MgCl₂；１mg／mlウシ血清アルブミン(BSA) ）；10.0μｌの10mM dATP，10.0μｌの10mM dGTP，10.0μｌの10mM dCTP，10.0 μｌの10mM dTTP，2.5μｌ RNasin(40,000 Ｕ／ml，Promega；Madison，Wis.)及び33.0μｌ DI H₂O の溶液を、加熱されたJurkat細胞RNAに添加する。この溶液に、5.0μｌ（108 nmol／ml）のV-OLI ＃56（配列番号１）、と5.0μｌ（200,00 0 Ｕ／ml）MOMLV逆転写酵素（Bethesda Research Laboratories，EC 3．1．27． 5，Maryland）を、マイクロフュージ管内で混合し、そして10分間室温においてインキュベートする。この室温インキュベーション後、反応混合物を、37℃において１時間インキュベートし、そして次に95℃において５分間インキュベートする。次に逆転写反応混合物を、PCRのための調製の氷上に置く。（ｄ）PCR増幅 PCR反応混合物は、100.0μｌ逆転写反応；356.0μｌ DI H₂O；40.0μｌ 10倍P CRバッファー；1.0μｌ（137 nmol／ml）V-OLＩ＃５（配列番号２）；0.5μｌ（ 320 nmol/ml）V-OLI ＃６（配列番号３）、及び2.5μｌ，5,000 Ｕ／ml，Taqポリメラーゼ(EC 2．7．7．7，Perkin-Elwer Cetus，Calif.)を含む。100μｌのこの混合物を、５管のそれぞれにアリコートした。このプライマーは、終止コドンの30塩基対下流のｍγ−IFN cDNA の配列に相補的である。このプライマーは、ATG開始コドンに始まる、ｍγ−IFN遺伝子の５’コーディング領域に相補的である。このプライマーの５’末端は、XhoＩ制限部位を含む。このプライマーは、TAA終止コドンに終わる、ｍγ−IFN遺伝子の３’コーディング領域に相補的である。このプライマーの５’末端は、ClaＩ制限部位を含む。各管を、100.0μｌの鉱物油により重層し、そしてPCR装置（Ericomp Twin Blo ck System，Ericomp，Calif.）内に置く。このPCRプログラムは、その反応容器の温度を、最初に95℃において１分間、次に67℃において２分間、そして最初に 72℃において２分間、に調節する。このサイクルを40回繰り返す。最後のサイクルは、その反応容器の温度を、最初に95℃において１分間、次に67℃において２分間、そして最後に72℃において７分間、調節する。完了したPCR増幅反応は、P CR DNA単離についての調製における１ヶ月の間４℃において保存する。（ｅ）PCR DNAの単離 PCR増幅反応からの水相を、単一のマイクロフュージ管に移す。50μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び500.0μｌのクロロホルム：イソアミル・アルコール（24：１）をこの溶液に添加する。この溶液を、撹拌し、そして次に５分間室温において14,000rpmにおいて遠心分離する。上部の水相を、新たなマイクロフュージ管に移し、そして1.0μｌの100％EtoHを添加する。この溶液を−20℃において 4.5時間インキュベートし、そして次に20分間14,000rpmにおいて遠心分離する。上清をデカントし、そしてペレットを500.0μｌの70％ EtoHにより濯ぐ。このペレットを真空下遠心分離により乾燥させる。単離されたｈγ−IFN PCR DNAを、1 0.0μｌ DI H₂O中で再懸濁する。２．ｈγ−IFNレトロウイルス・ベクターの構築（ａ）ブラント末端ｈγ−IFN PCR DNA断片の創出及び単離ｈγ−IFN PCR DNAを、T4 DNAポリメラーゼを使用してブラント末端にする。特に、10.0μｌのPCR増幅DNA；2.0μｌ，10倍、T4 DNAポリメラーゼ・バッファー（0.33Ｍ Tris-アセテート、pH7.9, 0.66 Ｍ酢酸カリウム、0.10Ｍ酢酸マグネシウム、５mMジチオトレイトール、１mg／mlウシ血清アルブミン(BSA)）；1.0μ ｌ，2.5mM dNTP（dATP，dGTP，dTTP及びdCTPの等モル濃度を含む混合物）；7.0 μｌ DI H₂O；1.0μｌ，5000Ｕ／ml，Klenow断片（EC 2．7．7．7，New England Biolabs，Mass.）；及び1.0μｌ，3000Ｕ／ml，T4 DNAポリメラーゼ（EC 2．7 ．7．7，New England Biolabs，Mass）を、一緒に混合し、そして37℃において1 5分間インキュベートする。次に反応混合物を、室温において40分間インキュベートし、そしてその後68℃において15分間インキュベートする。ブラント末端としたｈγ−IFNを、アガロース・ゲル電気泳動により単離する。特に、2.0μｌのローディング染料（0.25％ブロモフェノール・ブルー；0.25 ％キシレン・シアノール；及び50％グリセロール）を、反応混合物に添加し、そして4.0μｌを、臭化エチジウムを含む１％アガロース／Tris−ボレート−EDTA( TBE)の５レーンのそれぞれにロードする。このゲルの電気泳動を100ボルトにおいて１時間行う。ｈγ−IFNを含む所望のDNAバンド、長さ約500塩基対を、紫外線下、可視化する。このバンドを、NA 45紙（Schleicher and Schuell，Keene，New Hampshire）上に電気泳動的転移により、そのゲルから取り出す。この紙を、DNAを溶出するために、400.0μｌの高塩NETバッファー（１Ｍ NaCl；0.1mM EDTA；及び20mM Tr is，pH8.0）中で40分間68℃においてインキュベートする。このNA 45紙を溶液から取り出し、そして400.0μｌのフェノール・クロロホルム：イソアミル・アルコール（25：24：１）を添加する。溶液を撹拌し、そして５分間14,000において遠心分離する。上の水相を新たな管に移し、そして400.0μｌのクロロホルム・イソアミル・アルコール（24：１）を添加する。この混合物を撹拌し、そして５分間遠心分離する。上の水相を再び、新たな管に移し、そして700.0μｌの100 ％ EtoHを添加する。管を−20℃において３日間インキュベートする。インキュベーション後、DNAを、14,000rpmにおける20分間の遠心分離により管から沈降させる。上清をデカントし、そしてペレットを500.0μｌの70％ EtoHにより濯ぐ。ブラント末端のｈγ−IFN DNAを含むペレットを、真空下遠心分離により乾燥させ、そして50.0μｌのDI H₂Oに再懸濁する。単離したブラント末端ｈγ−IFN DNAを、ポリヌクレオチド・キナーゼを使用してリン酸化する。特に、25.0μｌのブラント−末端ｈγ−IFN DNA，3.0μｌの 10倍キナーゼ・バッファー（0.5 Ｍ Tris-HCl，pH7.6；0.1Ｍ MgCl₂；50mMジチオトレイトール；１mMスペルミジン；１mM EDTA)、3.0μｌの10mM ATP、及び1.0 μｌのT4ポリヌクレオチド・キナーゼ(10,000Ｕ／ml，EC 2．7．1．78，New Eng land Biolabs，Maryland)を混合し、そして37℃において１時間45分インキュベートする。次に酵素を、68℃において30分間のインキュベートにより熱失活させる。（ｂ）ｈγ−IFN PCR DNAのSK^＋ベクターへのライゲーション SK^＋プラスミドを、HincII制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そして先に記載したようにアガロースゲル電気泳動により精製する。特に、5.9μｌ（1.7 m g／ml）SK^＋プラスミドDNA（Stratagene；San Diego，Calif.）；4.0μｌ 10倍U riversalバッファー（Stratagene，Calif.）；30.1μｌ DI H₂O、及び4.0μｌ HincII，10,000Ｕ／mlを、管内で混合し、そして37℃において７時間インキュベートする。インキュベーション後、4.0μｌのローディング染料を、その反応混合物に添加し、そして4.0μｌのこの溶液を、臭化エチジウムを含む１％アガロース／TBEの５レーンのそれぞれに添加する。このゲルの電気泳動を、105ボルトにおいて２時間行う。このHincII断片SK^＋プラスミド、長さ2958塩基対を、紫外線により可視化する。消化されたSK^＋プラスミドを、実施例1C、セクション２（ａ）中に記載した方法を使用してゲルから単離する。このプラスミドのHincII解裂部位の脱リン酸化をウシ腸アルカリ性ホスファターゼを使用して行う。特に、50.0μｌ消化SK^＋プラスミド；5.0μｌ１Ｍ Tris ，pH8.0；2.0μｌ５mM EDTA，pH8.0；43.0μｌ H₂O及び2.0μｌ，1,000 Ｕ／ ml、子ウシ腸ホスファターゼ（“CIP”）（Boehringer Mannheim，Indianapolis ，Indiana）を管内で混合し、そして37℃において15分間インキュベートする。インキュベーション後、2.0μｌ CIPを添加し、そしてその溶液を55℃において9 0分間インキュベートする。このインキュベーション後、2.5μｌの20％ドデシル硫酸ナトリウム（“SDS”）、1.0μｌ 0.5Ｍ EDTA，pH8.0、及び0.5μｌ，20mg ／ml、プロティナーゼＫ(EC3．4．21．14，Boehringer Mannheim，Indianapolis ，Indiaua)を添加し、そしてその溶液を55℃において２時間インキュベートする。この溶液を、室温に冷却し、そして110.0μｌフェノール：クロロホルム：イソアミル・アルコール（25：24：１）を添加する。この混合物を撹拌し、そして14,000rpmにおいて５分間遠心分離する。この上の水相を、新たな管に移し、そして200.0μｌの100 ％ EtoHを添加する。この混合物を70℃において15分間インキュベートする。この管を遠心分離し、そしてペレットを500.0μｌの70％ EtoHにより濯ぐ。次に、このペレットを真空下遠心分離により乾燥する。脱リン酸化されたSK^＋プラスミドを、40μｌ DIH₂O中に再懸濁する。ｈγ−IFN PCR DNAを、T4 DNAリガーゼを使用して上記SK^＋プラスミドにライゲートする。特に、30.0μｌブラント末端、リン酸化、ｈγ−IFN PCR DNA反応混合物、2.0μｌ脱リン酸化SK^＋プラスミド及び1.0μｌ T4 DNAリガーゼを管内で併合し、そして16℃において一夜インキュベートする。DNAを、miniprep手順を使用して単離する。より特に、バクテリア株DH5a(Gibco BRL，Gaithersburg， MD)を、15.0μｌのライゲーション反応混合物により形質転換し、アンピシリン及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールイル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド(X-g al，Gold Biotechnology；St．Louis，Missouri)を含むLuria-Bertani寒天培地（LBプレート）上にプレートし、そして37℃において一夜インキュベートする。 DNAを、Sambrook et al．により記載された手順(Molecular Cloning，Cold Spri ng Harbor Press，1989)を使用して、白いバクテリア・コロニーから単離する。ｈγ−IFN遺伝子の存在は、XhoＩ，ClaＩ，AvaII，DraＩ、及びSspＩによる制限エンドヌクレアーゼ解裂により決定される。ｈγ−IFN遺伝子を含むプラスミドについて予想されたエンドヌクレアーゼ制限解裂断片サイズを、表１中に表わす。単離されたDNAプラスミドを、SK ｈγ−IFNと名付け、そしてレトロウイルス・ベクターの構築において使用する。（ｃ）レトロウイルスベクターへのｈγ−IFN遺伝子のライゲーション SK ｈγ−IFNベクターからXhoＩ及びClaＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによりインターフェロン遺伝子を取り出す。得られたｈγ−IFN遺伝子を含むフラグメントの長さは約500bpであり、これを実施例１Ｃ，２（ｂ）に記載したように１％アガロース／TBEゲル電気泳動法で単離する。次いで、XhoＩ−Cl aＩｈγ−IFNフラグメントをKT-3レトロウイルスのバックボーンにライゲートする。この構築物をKT ｈγ−IFNと称する。ｈγ−IFNの構造と発現の存在は、 DH5a細菌株をKT ｈγ−IFN構築物で形質転換することによって決定する。具体的には、細菌を15.0μｌのライゲーション反応混合物で形質転換する。形質転換後の細菌細胞をアンピシリン含有LBプレートに植える。そのプレートを37℃で一晩インキュベートして、細菌コロニーを選別する。DNAを上記（ｂ）に記載したように単離し、そしてXhoＩ，ClaＩ，DraＩ，NdeＩ及びSspＩで消化する。ｈγ −IFNを含有するプラスミドのエンドヌクレアーゼ制限切断フラグメントの予想される大きさを表２に示す。Ｄ．KT-3へのhIL-2のクローニング KT-3レトロウイルスベクターへのhIL-2のクローニング法は、hIL-2 DNA配列の増幅に必要なプライマーが異なることを除いて、KT-3へｈγ−IFNをクローニングする手順と同じである。以下のhIL-2 PCRプライマー配列を使用する。このプライマーは、停止コドンの下流のhIL-2 cDNAの配列に相補的である。このプライマーは、ATG開始コドンで始まる５’コード領域に相補的なhIL-2遺伝子のセンス配列である。プライマーの５’末端は XhoＩ制限部位を含む。このプライマーは、TAA停止コドンで終わる３’コード領域に相補的なhIL-2遺伝子のアンチセンス配列である。プライマーの５’末端はClaＩ制限部位を含む。Ｅ．KT-3への膜結合ヒトγ−IFNのクローニング１．膜結合ヒトγ−IFNを構築する方法（ａ）膜結合ｈγ−IFNの配列選択細胞表面膜結合ｈγ−IFNタンパク質は、ｈγ−IFNの完全cDNA、ヒトFcレセプターγ−鎖のトランスメンブレン領域及びFcレセプターγ−鎖の変性サイトプラズマ領域を含むキメラタンパク質である。サイトプラズマ領域の変性は、内部欠失から成り、Fcレセプターに付随するシグナル変換を遮断するためである。 DNAの修飾とスプライシングはHortonら(Gene 77：61-68，1978)のオーバーラップ伸長PCR法で行う。ｈγ−IFNのカルボキシル末端をトランスメンブレン領域のアミノ末端においてFcレセプターに結合する。下線を付けたアミノ酸がトランスメンブレン領域配列を示す。ｈγ−IFNとトランスメンブレン領域との間にアミノ酸を数個付加することにより活性領域を細胞表面から離れたところまで伸長することができる。（Kuster ら、J．Bio．Chem．265：6448，1990）。ヒトFcレセプターγ−鎖のトランスメンブレン領域の配列修飾は、アミノ酸Ｓ⁵⁷−Ｙ⁷⁶の欠失を含む。下線を付けたアミノ酸が欠失配列を示す。ヒトFcレセプターγ−鎖細胞内領域修飾細胞内領域（ｂ）PCR増幅ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)混合物はPerkin-Elmer-Cetus，Califによる手順に従い調製する。より具体的には、この反応混合物は0.5 μｇの精製プラスミド、 5.0μｌの10×PCR反応バッファ、それぞれ5.0μｌの2.5mM dATP，dCTP，dGTP及びdTTP，1.0μｌ；0.5μｇの各プライマー、0.5μｌの2.5単位／100.0μｌのTaq ポリメラーゼ並びに8.0μｌの10mM MgCl₂を含有した。次いで、この反応混合物をDI H₂Oで50.0μｌにする。各反応混合物に100μｌの鉱物油を重層し、PCR装置(Ericomp Twin Block Syst em)に配置する。PCRプログラムは反応容器の温度を最初に95℃で１分間、次いで 67℃で２分間、最後に72℃で２分間調節する。このサイクルを40回繰り返す。最終サイクルは反応容器の温度を最初に95℃で１分間、次いで67℃で２分間、最後に72℃で７分間調節する。完了したPCR反応物を４℃で約一ヵ月保存する。（ｃ）ハイブリッドγ−IFN/Fcレセプターレトロウイルスベクターの構築以下のｈγ−IFN PCRプライマー配列を使用する：このプライマーは、ｈγ−IFNのカルボキシ末端領域に対応するセンス配列であり、ｈγ−IFN/P1と称する。このプライマーは、ｈγ−IFNのカルボキシ末端領域に対応するアンチセンス配列であり、ｈγ−IFN/P2と称する。以下のγ−鎖Fcレセプタープライマー配列を使用する：このプライマーは、Fcレセプターγ−鎖のセンス配列であり、γ−鎖Fc／P3と称する。このプライマーは、Fcレセプターγ−鎖のアンチセンス配列であり、γ−鎖Fc ／P4と称する。実施例1C1（ｅ）のｈγ−IFN鋳型DNA，ｈγ−IFN/P1プライマーDNA，ｈγ−IF N/P2プライマーDNA、γ鎖Fcレセプター鋳型DNA，γ−鎖Fc／P3プライマーDNA及びγ−鎖Fc／P4プライマーDNAを一緒にし、95℃で１分間変性させ、そしてさらに別のプライマーを含まないPCR反応混合物の存在下で伸長させる。鋳型プライマーｈγ−IFN DNAの３’末端を鋳型プライマーγ鎖Fc DNAの５’末端にアニールし伸長させてｈγ−IFN/Fc-Recと称するハイブリッド生成物を得る。次いでプライマーのｈγ−IFN/P1とγ−鎖Fc／P4を加えてPCRを40回実施してｈγ−IFN/F c-Rec生成物を増幅する。ｈγ−IFN/Fc-Rec生成物はｈγ−IFN遺伝子の短いフラグメントしか含有しない。このフラグメントは遺伝子内にあるNdeＩ制限エンドヌクレアーゼ部位から遺伝子配列の末端部まで至る。ｈγ−IFN/Fc-RecをNdeＩで消化し、そしてｈγ −IFNのリーダー部分を含むKT ｈγ−IFNへクローニングする。このベクターを KT ｈγ−IFN/Fc-Recと称する。（ｄ）ハイブリッドｈγ−IFN/修飾Fcレセプター細胞内領域レトロウイルスベクターの構築 Fcレセプターのγ−鎖を修飾し、タンパク質の生物活性を消失させる。以下の修飾Fcレセプター細胞内領域PCRプライマー配列を使用する。このプライマーは、修飾Fcレセプター細胞内領域のセンス配列であり、mFc/P5 と称する。このプライマーは、修飾Fcレセプター細胞内領域のアンチセンス配列であり、 mFc/P6と称する。実施例1C3（ａ）のｈγ−IFN/Fc-Rec鋳型DNA、ｈγ−IFN/P1プライマーDNA，m Fc/P5プライマーDNA，mFc/P6プライマーDNA及びγ−鎖Fc／P4プライマーDNAを一緒にし、95℃で１分間変性させ、そしてさらに別のプライマーを含まないPCR反応混合物の存在下で伸長させる。鋳型プライマー(ｈγ−IFN/Fc-Rec鋳型DNA結合ｈγ−IFNプライマーDNA及びmFc/P5プライマーDNA)の３’端を鋳型プライマー( ｈγ−IFN/Fc-Rec鋳型DNA mFc/P6プライマーDNA及びγ−鎮Fc／P4プライマーDNA )の５’端にアニールし伸長させて、20個のアミノ酸コドンを省略した修飾Fcレセプターγ−鎖を得る。次いで、プライマーのmFc/P6及びγ−鎖Fc／P4を加えて PCRを40回実施して修飾生成物を増幅する。このPCR生成物をmFcIRと称する。 KT ｈγ−IFN/Fc-RecベクターをNdeＩで消化する。このベクターから取り出したNdeＩ−NdeＩフラグメントをNdeＩ−NdeＩmFcIR PCR DNAフラグメントに交換する。このベクターをKT ｈγ−IFN/mFc-Recと称する。Ｆ．KT-3へのヒトガンマIFN/ヒトIL-2のクローニング１．ｈγ−IFN/hIL-2ハイブリッドの構築法（ａ）ｈγ−IFN/hIL-2ハイブリッドの配列選択以下、ｈγ−IFN/hIL-2ハイブリッドタンパク質を構築するための方法を二つ記載する。第一の方法は、ハイブリッドタンパク質のカルボキシル末端にγ−IF Nを有する構築物について、また第二の方法は、ハイブリッドタンパク質のカルボキシル末端にヒトインターロイキン−２(hIL-2)を有するものについて記載するものである。 DNAの修飾及びスプライシングはHortonら(Gene 77：61-68，1989)のオーバーラップ伸長PCR法によって行う。第一の構築法では、ｈγ−IFNシグナル配列を含む完全なｈγ−IFNコード配列を、hIL-2シグナル配列を除いては完全なhIL-2コード配列に結合させる。DNA配列は遺伝子銀行（Washington D．C.）から入手される、ｈγ−IFN（HUMIFNINI）。下線を付けた配列は、排除されたシグナルペプチド配列を示す。第二の方法では、hIL-2シグナル配列を含む完全なhIL-2コード配列を、ｈγ− IFNシグナル配列を除いた完全なｈγ−IFNコード配列に結合させる。DNA配列は遺伝子銀行から入手される、hIL-2(HUMIL2 S1，HUMIL2S2，HUMIL2S3)。下線を付けた配列はシグナルペプチド配列を示す。（ｂ）ハイブリッドｈγ−IFN/hIL-2レトロウイルスベクターの構築以下のｈγ−IFNプライマー配列を使用する。このプライマーは、ｈγ−IFNタンパク質のカルボキシ末端領域に対応するセンス配列であり、ｈγ−IFN/P7と称する。このプライマーは、ｈγ−IFNタンパク質のカルボキシ末端領域に対応するアンチセンス配列であり、ｈγ−IFN/P8と称する。以下のhIL-2プライマー配列を使用する。このプライマーは、hIL-2タンパク質のアミノ末端領域に対応するセンス配列であり、hIL-2/P9と称する。このプライマーは、hIL-2タンパク質のアミノ末端領域に対応するアンチセンス配列であり、hIL-2/P10と称する。実施例1C1(ｅ)のｈγ−IFN鋳型DNA，ｈγ−IFN/P7プライマーDNA，ｈγ−IFN/ P8プライマーDNA，hIL-2/P9プライマーDNAからのhIL-2鋳型DNA及びhIL-2/P10プライマーDNAを一緒にし、95℃ で１分間変性させ、そしてさらに別のプライマーを含まないPCR反応混合物の存在下で伸長させる。鋳型プライマーｈγ−IFN DNAの３’端を鋳型プライマーhIL -2 DNAの５’端にアニールし伸長させて、ｈγ−IFN/hIL-2と称する673bpのフラグメントを得る。次いで、プライマーのｈγ−IFN/P7とhIL-2/P10を加えてPCRを 40回実施してｈγ−IFN/hIL-2生成物を増幅する。ハイブリッドｈγ−IFN/hIL-2ベクターを３部ライゲーションによって構築する。KT ｈγ−IFNレトロウイルスベクターの５’端をNdeＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離する。このｈγ−IFN/hIL-2生成物を、NdeＩ及びAflIIで消化し、656塩基対のフラグメントを得る。このフラグメントを単離したKT ｈ γ−IFNの５’端のNdeＩ部位に結合する。KT hIL-2レトロウイルスベクターの３’端をAflII制限エンドヌクレアーゼ消化で単離する。３’−KT hIL-2のAflI I制限部位を構築物のAflII制限部位に結合する。このレトロウイルス構築物をKT ｈγ−IFN/hIL-2と称する。（ｃ）ハイブリッドhIL-2/ｈγ−IFNレトロウイルスの構築以下のhIL-2プライマー配列を使用する。このプライマーは、hIL-2タンパク質のカルボキシ末端領域に対応するセンス配列であり、hIL-2/P11と称する。このプライマーは、hIL-2タンパク質のカルボキシ末端領域に対応するアンチセンス配列であり、hIL-2/P12と称する。以下のｈγ−IFNプライマー配列を使用する。このプライマーは、ｈγ−IFNタンパク質のアミノ末端領域に対応するセンス配列であり、ｈγ−IFN/P13と称する。このプライマーは、ｈγ−IFNタンパク質のアミノ末端領域に対応するアンチセンス配列であり、ｈγ−IFN/P14と称する。 hIL-2/P11プライマーDNAのhIL-2鋳型DNA，hIL-2/P12プライマーDNA、実施例1C 1(ｅ)からのｈγ−IFN/P13鋳型DNA，ｈγ−IFN/P13プライマーDNA及びｈγ−IFN /P14プライマーDNAを一緒にし、95℃で１分間変性させ、そしてさらに別のプライマーを含まないPCR反応混合物の存在下で伸長させる。鋳型プライマーhIL-2DN Aの３’端を鋳型プライマーｈγ−IFN DNAの５’端にアニールし伸長させることで、hIL-2/ｈγ−IFNと称する541bpのフラグメントを得る。次いで、プライマーのhIL-2/P11とｈγ−IFN/P14を加えてPCRを40回実施してhIL-2/ｈγ−IFN生成物を増幅する。ハイブリッドhIL-2/ｈγ−IFNベクターを３部ライゲーションによって構築する。KT hIL-2レトロウイルスベクターの５’端をXbaＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離する。このｈγ−IFN/hIL-2生成物を、XbaＩ及びBstBＩで消化し、507塩基対のフラグメントを得る。このフラグメントを単離したKT hIL-2の５’端のXbaＩ部位に結合する。KT ｈγ−IFNレトロウイルスベクターの３’端をBstBＩ制限エンドヌクレアーゼ消化で単離する。３’−KT ｈγ−IFNのBstB Ｉ制限部位を構築物のBstBＩ制限部位に結合する。このレトロウイルス構築物を KT hIL-2/ｈγ−IFNと称する。実施例２ｈγ−IFN遺伝子の修復レトロウイルスベクターであるKT ｈγ−IFNの引き続く配列決定により、ｈ γ−IFN遺伝子内に１つの塩基対の欠失の存在が証明された。この欠失は、多段階PCR法により元に戻された。Ａ．配列選択配列はIBIプステル(Pustell)配列解析プログラム（Int．Biotech，Inc.ニューヘーブン、コネチカット州）により得られる。以下のｈγ−IFNプライマー配列を使用する。このプライマーは、ｈγ−IFN遺伝子の上流に７つのコドンを延長している開始コドンATG領域に相補的なセンス配列であり、ｈγ−IFN 1bと呼ぶ。このプライマーは、ｈγ−IFN遺伝子のコドン106〜120に相補的なアンチセンス配列であり、ｈγ−IFN Rep Bと呼ぶ。このプライマーは、ｈγ−IFN遺伝子のコドン106〜120に相補的なセンス配列であり、そしてｈγ−IFN Rep Aと呼ぶ。このプライマーは、停止コドンATT領域に相補的なアンチセンス配列であり、ｈ γ−IFN遺伝子の上流に７つのコドンを延長しており、ｈγ−IFN 3bと呼ぶ。Ｂ．最初のPCR 脱イオン水中の１×10^６のKT ｈγ−IFNプラスミド分子398.0μｌ；10×PCR 緩衝液（500mM KClおよび200mMトリス−HCl，pH8.4；25mM MgCl₂；1.0 mg／ml B SA）；50μｌ；2.5mM dATP；5.0μｌ；2.5mn dGTP 5.0μｌ；2.5mM dCTP 5.0μ ｌ；2.5mM dTTP 5.0μｌ；18.6nmol／mlのオリゴヌクレオチドｈγ−IFN 1b 12. 0μｌ；24.6nmol／mlのオリゴヌクレオチドｈγ−IFN RepB 15.0μｌ；そしてTa qポリメラーゼ2.5μｌの溶液をマイクロヒュージ管中で混合し、50μｌを10本のチューブに分注する。同様に395.0μｌの脱イオン水中の１×10^６のKT ｈγ−I FNプラスミド分子；10×PCR緩衝液（500mM KCl；200mMトリス−HCl，pH8.4；25m M MgCl₂；１mg／ml BSA）50μｌ；2.5mM dATP；5.0μｌ；2.5mM dGTP 5.0μｌ； 2.5mM dCTP 5.0μｌ；2.5mM dTTP 5.0μｌ；23.4nmol/mlのオリゴヌクレオチドｈγ−IFN Rep A 13μｌ；18.0mg／mlのオリゴヌクレオチドｈγ−IFN 3b 17.0 μｌ；そしてTaqポリメラーゼ2.5μｌの溶液をマイクロヒュージ管中で混合し、 50.0μｌを10本のチューブに分注する。20本のチューブをPCR装置に入れる（モデル9600、パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus）、ロサンゼルス、カリホルニア州）。PCRプログラムは反応容器の温度を最初のサイクルは94 ℃で２分間制御する。次の35サイクルは94℃で0.5分間、次に55℃で0.5分間、そして最後に72℃で１分間で制御される。最後のサイクルは72℃で10分間で制御される。このサイクルプログラムをプログラム10と呼ぶ。 PCR増幅の後に、各反応チューブの225.0μｌを25.0μｌの充填色素（0.25％ブロムフェノールブルー、0.25％キシレンシアノールおよび50％のグリセロール、アガロースゲル充填色素）と混合し、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウェルに入れる。このゲルを約90ボルトで１時間電気泳動する。紫外線を用いてDNAバンドの分離を目視する。実施例1C2(ａ)ですでに記載したように、NA45紙への電気泳動による移動により、２つのバンド（１つは250塩基対サイズの断片と他の１つは150塩基対サイズ）が単離される。沈降後、２つのDNAペレットのそれぞれ脱イオン水2 0.0μｌに再懸濁し、以後のPCR増幅用に調製される。Ｃ．アニーリングと２回目のPCR 150塩基対のPCR DNA 20.0μｌ；350塩基対のPCR DNA 20.0μｌ；脱イオン水16 1.5μｌ；10×PCR緩衝液（500mM KCl；200mMトリス−塩酸、pH8.4；25mM MgCl₂ ；および１mg／ml BSA）25.0μｌ；2.5mM dATP；2.5μｌ；2.5mM dGTP 2.5μｌ；2.5mM dCTP 2.5μｌ；2.5mM dTTP 2.5μｌおよびTaqポリメラーゼ1.25μｌの溶液をマイクロヒュージ管中で混合し、47.3μｌを５本のチューブそれぞれに分注する。各チューブをPCR装置（モデル9600、パーキン・エルマー・シータス（P erkin Elmer Cetus）、ロサンゼルス、カリホルニア州）に入れる。PCRプログラムは、反応容器の温度を94℃ 0.5分間で５サイクル制御する。次のサイクルは55 ℃で１分間制御される。このサイクルの後にｈγ−IFN 1b 1.2μｌとｈγ−IFN 3b 1.5μｌを反応混合物に加える。次にこのチューブをプログラム10を用いてPC R増幅を行う。この生成物をｒｈγ−IFNと呼ぶ。Ｄ．平滑末端ｒｈγ−IFN PCR DNA断片の作成と単離 PCR増幅したｒｈγ−IFN DNAを、T4ポリメラーゼを用いて平滑末端とした。具体的には、ｒｈγ−IFN PCR溶液120.0μｌを2.5mM dATP；1.25μｌ；2.5mM dGTP 1.25μｌ；2.5mM dCTP 1.25 μｌ；2.5mM dTTP 1.25μｌ；T4DNAポリメラーゼ１μｌ；そしてクレノウ断片1.0μｌと混合する。この混合物を室温で10分間インキュベートする。インキュベート後、この混合物にアガロースゲル充填色素13.0μｌを加え、溶液を１％アガロースゲルに充填する。このゲルを約90 ボルトで１時間電気泳動する。紫外線を用いてDNAのバンドを目視する。実施例1 C2(ａ)に記載のように500塩基対のバンドを電気泳動によりNA45紙上に移動させる。沈降後、DNAペレットを脱イオン水12.0μｌに再懸濁する。単離した500塩基対の断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて平滑末端とする。具体的には、この断片1.0mgを10×キナーゼ緩衝液（0.5mMトリス−塩酸、 pH7.6；0.1mM MgCl₂；50mMジチオスレイトール；１mMスペルミジン：１mM EDTA ）1.5μｌ；10mM ATP 1.5μｌ；そしてT4ポリヌクレオチドキナーゼ1.0μｌと混合し、37℃で30分間インキュベートする。Ｅ．ｒｈγ−IFN PCR DNAのSK^＋ベクターへの連結実施例1C2(ｂ)に記載のようにSK^＋ベクターにｒｈγ−IFN PCRDNAを連結する。ｒｈγ−IFN PCR DNAキナーゼ反応混合物2.0μｌ；CIP処理SK^＋ベクター2.0μ ｌ；およびT4 DNAリガーゼ1.0μｌの溶液を16℃で４時間インキュベートする。D H5a細菌を実施例1C2(ｃ)に記載したように形質転換する。Ｆ．レトロウイルスへのｒｈγ−IFN遺伝子の連結レトロウイルスへのｒｈγ−IFN遺伝子の連結は実施例1C2(ｃ)に記載したように行う。この新しいベクターをKT ｒｈγ−IFNと呼ぶ。実施例３ｍγ−IFNレトロウイルスベクターによるパッケージング細胞系（CAとDA）とマウス癌細胞系（B16F10とＬ33）の形質導入Ａ．プラスミドDNAトランスフェクション 293 2-3細胞（ATCC番号CRL1573 の293細胞由来の細胞系、WO92/05266）５×10^５個を、６cmの組織培養シャーレに約50％の集密においてで接種する。翌日、トランスフェクションの４時間前に４mlの新鮮な培地と交換する。標準的リン酸カルシウム−DNA共沈澱法により、10.0μｇのKT ｍ γ−IFNプラスミドと10.0μｇのMLP Gプラスミドを２Ｍ CaCl溶液と混合して、１×ヘペス緩衝化生理食塩水、pH6.9を加え、室温で15分間インキュベートする。リン酸カルシウム−DNA共沈澱物を293 2-3細胞に移し、次にこれを５％ CO₂で 37℃で一晩インキュベートする。翌朝１×PBS，pH7.0で細胞を３回洗浄する。細胞に新鮮な培地を加え、10％ CO₂で37℃で一晩インキュベートする。翌日細胞を除いた培地を集め、0.45μｍフィルターに通す。この上澄液を用いてパッケージングおよび癌細胞系を形質導入する。Ｂ．パッケージング細胞株の形質導入 CA細胞（ATCC番号6574のCF-2細胞由来の両性細胞株、WO92/05266）を、１×10^５細胞／６cmのシャーレで接種する。新たに採取した0.5mlの293 2-3上澄液をCA 細胞に加える。翌日これらの細胞にG418を加え、１週間にわたって薬剤耐性プールを作成する。96ウェルプレートの各ウェルに0.8〜1.0個の細胞を加えて、この細胞のプールを希釈クローン化する。24個のクローンを24ウェルプレートに拡げ、次に６ウェルプレートに拡張し、ここで力価測定のため細胞上清を集める。ベクター産生のためにCAクローンを選択する。約５×10^６cfu/mlの力価を有するCA クローンを選択し、ｍγ−IFN ＃23と呼ぶ。 ATCC番号CCL-183のD17細胞由来の両性細胞株であるDA細胞（WO92/05266ではDA 2と呼ばれる）を、５×10^５細胞／10cmのシャーレで接種する。−70℃で保存した293 2-3上澄液0.5mlをDA細胞に加える。翌日、これらの細胞にG418を加え、１週間にわたって薬剤耐性プールを作成する。ベクター産生のためにDAクローンを選択する。Ｃ．マウス癌細胞株の形質導入１．Ｌ33 Ｌ33細胞（Dennert，USC Comprehensiveガンセンター、ロサンゼルス、カリホルニア州、Patekら、Int．J．of Cancer 24：624-628，1979）を、１×10^５細胞／６cmシャーレで接種する。−70℃で保存した1.0mlの293 2-3上澄液をＬ33細胞に加える。翌日これらの細胞にG418を加え、１週間にわたって薬剤耐性プールを作成する。96ウェルプレートの各ウェルに1.0個の細胞を加えてこの細胞のプールを希釈クローン化し、24ウェルプレートに拡張し、次に６ウェルプレートに拡張して、主要組織適合性複合体(MHC)発現の解析のために細胞溶解物を調製する。MHC発現レベルが大きく上昇しているクローンであるＬ33／ｍγ−IFN ＃15は、以後のマウスの試験のために使用する。２．B16F10 B16F10細胞（Dennert，USC Comprehensiveガンセンター、ロサンゼルス、カリホルニア州、Warnerら、Nature 300：113-121，1982）を、２×10^５細胞／10cm シャーレで、10μｇ／mlのポリブレン（１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカ−メチレンポリメトブロミド、シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州）と一緒に接種する。これらの細胞にCA ｍγ−IFNプールからの上澄液0.1mlを加え、10％ CO₂で37℃で６時間インキュベートする。インキュベート後G418を加え、薬剤耐性プールを作成する。96ウェルプレートの各ウェルに1.0個の細胞を加えてこの細胞のプールを希釈クローン化する。24個のクローンを24ウェルプレートに拡張し、次に６ウェルプレートに拡張して、MHC発現の解析のために細胞溶解物を作成する。MHC発現レベルが大きく上昇しているクローンであるB16F 10／ｍγ−IFN ＃４を、以後のマウスの試験のために使用する。３．CT26およびルイス(Lewis)肺癌細胞大腸癌26（CT26）（Brattain、ベイラー医科大学（Baylor College of Medici ne）、ヒューストン、テキサス州）とルイス肺癌（LLT）(Wande、サザン研究所( Southern Research Institute)、バーミンガム、アラバマ州、ATCC番号CRL1642) 細胞を、各細胞につき１×10^５細胞／６cmシャーレに10％ FBSと４μｇ／mlのポリブレンを含有するDMEM中に接種し、10％ CO₂で37℃で24時間インキュベートする。インキュベート後、各細胞株に1.0mlのKT ｍγ−IFNレトロウイルスベクター（９×10^６cfu/ml）を加え、10％ CO₂で37℃で24時間インキュベートする。インキュベート後培地を変え、10％ FBSと400μｇ／mlのG418を含有するDMEMで交換する。これらの細胞株を約２週間G418選択下に置く。選択したCT26およびLLT 耐性プールを、96ウェルプレートのそれぞれに1.0個の細胞を加えて希釈クローン化する。２つの96ウェルプレートに、選択した各G418プールを接種する。CT26 とLLTのｍγ−IFN発現クローンを24ウェルプレートに拡張し、次に６ウェルプレートに拡張する。各クローンについて溶解物を調製し、ウェスタンブロット分析により、アップレギュレーション(up-regulation)されるMHCタンパク白発現を分析する。アップレギュレーションされるMHC蛋白発現を有するクローンであるCT2 6／ｍγ−IFN ＃10が選択される。ｍγ−IFNを発現するLLT細胞の非クローン性プールを用いて、すべてのLLT試験を行う。実施例４ｈγ−IFNレトロウイルスベクターによるパッケージング細胞株およびヒトメラノーマ細胞株の形質導入Ａ．プラスミドDNAトランスフェクション 293 2-3細胞（特許出願WO92/05266に記載されている）５×10^５個を、６cmの組織培養シャーレに約50％の集密において接種する。翌日、トランスフェクションの４時間前に３mlの新鮮な培地と交換する。トランスフェクション時に5.0μ ｌのKT ｈγ−IFNプラスミドを、0.1×トリス−EDTA，150mM，pH7.4中のMLP G プラスミド2.0μｇと混合する。標準的リン酸カルシウム−DNA共沈澱法により、 DNAを２Ｍ CaCl溶液と混合して、１×ヘペス緩衝化生理食塩水、２Ｍ，pH6.9を加え、室温で15分間インキュベートする。リン酸カルシウム−DNA共沈澱法を293 2-3細胞に移し、次にこれを５％ CO₂で37℃で一晩インキュベートする。翌朝１ ×PBS，pH7.0で細胞を３回洗浄する。細胞に新鮮な培地を加え、10％ CO₂で37℃ で一晩インキュベートする。翌日細胞を除いた培地を集め、0.45μｍフィルターに通す。フィルターをかけた上澄液をパッケージング細胞形質導入に使用するために−70℃で保存する。Ｂ．パッケージング細胞の形質導入 CA 6BM細胞（CA細胞は６サイクルのBMサイクリンによりマイコプラズマは治癒されている、特許出願WO92/05266に記載のCA細胞）を、１×10^５細胞／６cmシャーレで４μｇ／mlのポリブレンとともに接種する。翌日、実施例4Aで一時的にトランスフェクションした細胞293 2-3細胞を除いた上澄液0.2mlをCA細胞の培地に加える。次にこれらの細胞を５％ CO₂で37℃で一晩培養する。翌日培地を、800 μｇ／mlのG418を含有する新鮮な培地と交換する。細胞を集密になるまで増殖させ、G418選択下で拡張する。次の集落で大部分の細胞は凍結し、培養物はG418なしで維持する。細胞が再び集密に達した時、ウイルス阻害測定法によるｈγ−IF Nの存在の分析のために上澄液を集める。96ウェルプレートの各ウェルに1.0個の細胞を加えて細胞のプールを希釈クローン化する。培地にG418を加える。24 個のクローンを力価測定、ヘルパーウイルスの存在、発現、および発現の機能的移動の分析のために24クローンを拡張する。Ｃ．第２世代トランスフェクション／形質導入１．CA 6BM形質導入 DX細胞（ATCC番号183のD17細胞由来の細胞系、WO92/05266）５×10^５個を、６ cmの組織培養シャーレにコンフルエンス約50％で接種する。翌日、トランスフェクションの3.5時間前に４mlの新鮮な培地と交換する。標準的リン酸カルシウム −DNA共沈澱法により、10.0μｇのKT ｈγ−IFNプラスミドを120mlの２Ｍ CaCl 溶液と混合して、240mlの２Ｍ×ヘペス緩衝化生理食塩水、pH6.9を加え、室温で 15分間インキュベートする。リン酸カルシウム−DNA共沈澱法をDX細胞に移し、次にこれを５％ CO₂で37℃で一晩インキュベートする。翌朝145mM １×PBS，pH7 .0 ３mlで細胞を３回洗浄する。細胞に新鮮な培地を加え、10％ CO₂で37℃で一晩インキュベートする。翌日細胞を除いた培地を集め、0.45μｍフィルターに通し、−70℃で保存する。３日後、CA 6BM細胞を、１×10^５細胞／６cmシャーレで４μｇ／mlのポリブレンとともに接種する。翌日、トランスフェクションしたDX細胞から集めた上清液 5.0mlと1.0mlを、CA 6BM細胞に加える。これらの混合物を10％ CO₂で37℃で４時間インキュベートする。インキュベート後、96ウェルプレートの10および30細胞／ウェルで800μｇ／mlのG418の存在下で細胞を希釈クローン化する。40クローンを24ウェルプレートに拡張し、次に６ウェルプレートに拡張する。細胞の上清液を集め力価を測定する。少なくとも１×10^６cfu/mlの力価を有する細胞をローラービンに入れ、ヘルパーウイルスの生成を追跡する。このパッケージング細胞系をCA／ｈγ−IFNと呼ぶ。２．DA形質導入 DX細胞５×10^５個を、６cmの組織培養シャーレにコンフルエンス約50％で接種する。翌日、トランスフェクションの４時間前に４mlの新鮮な培地と交換する。標準的リン酸カルシウム−DNA共沈澱法により、2.0μｌ，6.0μｇのKT ｈγ−I FNプラスミドを120mlの２Ｍ CaCl溶液と混合して、240mlの２Ｍ１×ヘペス緩衝化生理食塩水、pH6.9を加え、室温で15分間インキュベートする。リン酸カルシウム−DNA共沈澱法をDX細胞に移し、次にこれを５％ CO₂で37℃で一晩インキュベートする。翌朝145mM １×PBS，pH7.0 ３mlで細胞を３回洗浄する。細胞に新鮮な培地を加え、10％ CO₂で37℃で一晩インキュベートする。翌日細胞を除いた培地を集め、0.45μｍフィルターに通す。前の日にDA細胞（すでに特許出願WO92/05266にDA2として記載されている）を１×10^５細胞／６cmシャーレで接種する。新たに採取したDX上澄液1.0mlをDA細胞に加える。翌日これらの細胞にG418を加え、２週間にわって薬剤耐性プールを作成する。96ウェルプレートの各ウェルに1.0個の細胞を加えて細胞を希釈クローン化する。24クローンを24ウェルプレートに拡張し、次に６ウェルプレートに拡張する。細胞の上清液を集めて力価を測定し、少なくとも５×10^５cfu/mlの力価を有する細胞を選択する。DAクローンｈIFN γ＃15を選択し、DA／ｈγ−IFN と呼ぶ。Ｄ．ヒトメラノーマ形質導入ヒトの癌の生検（Dr．Hiliard Seigler，Duke大学およびViagene，Inc）から、癌を１mmの塊に切り刻むか、またはコレクター(Collector)メッシュを通してすりつぶして、それを組織培養フラスコに広げることにより、メラノーマ細胞株 DM6，DM92，DM252，DM265，DM262、およびDM259を確立した。分画トリプシン分解(differen tial trypsinization)により細胞を繰り返し継代した（細胞をトリプシン分解し、線維芽細胞がフラスコから盛り上がる前に癌細胞を取り出した）。一定の増殖が観察され充分な細胞数が産生されるまで細胞を維持し、凍結した。樹立後、各細胞株を10^６細胞／10cmシャーレで４μｇ／mlのポリブレンとともに接種した。翌日、DA／ｈγ−IFNプールからのフィルターをかけた上清５〜10m lを、各細胞培養物に加えた。これは感染多重度(MOI)５〜10に相当する。翌日、細胞を800μｇ／mlのG418で選択した。すべての形質導入した細胞株の上澄液試料を週に２回採取した。上澄液を0.45μｍのフィルターに通し、実施例６に記載のγ−IFN発現の測定まで−70℃で保存した。選択が完全になり、充分な細胞数が産生されるまで培養物を維持し、凍結した。実施例５ MHCクラスＩ発現Ａ．ウェスタンブロット分析によるマウスMHCクラスＩ発現の測定細胞がコンフルエンスになったプレートからRIPA溶解物を調製した。具体的には、まず培地を細胞から吸引除去する。細胞を含有する培養プレートのサイズに依存して、100.0〜500.0μｌの氷冷RIPA溶解緩衝液(10mMトリス、pH7.4；１％ノニデットP40（カルビオケム（Calbiochem）、カリホルニア州）；0.1 ％ SDS；1 50mM NaCl)を細胞に加える。マイクロピペットを用いてプレートから細胞を掻き取り、混合物をマイクロフュージ管に移す。この管を５分間遠心分離して細胞破壊物を沈澱させ、溶解物である上澄液を別の管に移す。溶解物を10％ SDS-PAGE ゲルで電気泳動し、タンパク質バンドを10〜60ボルトで２〜18時間CAPS緩衝液（ 10mM CAPS，pH11.0；10％メタノール）中でイモビロン(Immobilon)膜に移す。この膜をCAPS緩衝液から５％ブロット(Blotto)(５％脱脂乾燥乳；50mMトリス、pH7.4；150mM NaCl；0.02％アジ化ナトリウムおよび0.05％ツイーン20）に移し、ラットIgM抗体、72.14S（Richard Dutton，USCD、サンジエゴ、カリホルニア州）とプローブ結合させる。この抗体プローブはマウスMHCクラスＩ分子の保存細胞内領域に対するものである。膜に対する抗体の結合は¹²⁵Ｉ−蛋白Ａを使用して検出される。Ｂ．ｍγ−IFNレトロウイルスのある場合とない場合のマウス癌細胞株中のMHC発現の分析 MHC発現はウェスタンブロットとFACS分析により確認する。詳しくは、Ｌ33，C T26およびLLT親細胞株は比較的正常レベルのMHCクラスＩ蛋白を発現し、B16F10 親細胞株はダウンレギュレーション(down-regulation)されたレベルのMHCクラスＩ蛋白を有する。これらの細胞株のｍγ−IFNを形質導入したプールとクローンは、対応する親細胞株より高レベルのMHCクラスＩを発現する（これはウェスタンブロットとFACS分析により証明される）。種々のCT26ｍγ−IFN，LLTｍγ−IF Nサブクローンと親CT26およびLLT細胞株は、アップレギュレートされたMHCクラスＩ発現を示す。２つのＬ33ｍγ−IFNサブクローン、２つのB16F10ｍγ−IFNサブクローン、親Ｌ33細胞株および親B16F10細胞株のウェスタンブロット分析は、親細胞に比較してｍγ−IFNクローンのアップレギュレートされたMHCクラスＩ発現を示す（図２）。Ｌ33と２つのＬ33ｍγ−IFNサブクローンのFACS分析は、親細胞に比較してサブクローンではその表面にかなり多くのMHCクラスＩが発現されていることを示している。FACS分析は採取した細胞に対して行われる。具体的には細胞をMHCクラスＩ特異的抗体34.4抗−Ｄ^ｄ抗体（Dutton，UCSD、サンジエゴ、カリホルニア州）でインキュベートする。この結合抗体は、34.4抗−Ｄ^ｄ抗体が結合した細胞を、ウサギ抗マウスIgG抗体（Capell 、ノースカロライナ州）結合フルオレセインでインキュベートして検出される。細胞に結合した抗体−蛍光結合体からの蛍光は、FACSにより検出され定量される（図21）。Ｃ．インビトロで組換えｍγ−IFNで処理された癌細胞中のMHCの発現インビトロで組換えｍγ−IFNで処理した1.0×10^６個の細胞を、処理の前日にプレートに広げ翌日50％集密になるようにする。組換えｍγ−IFN(ジェンザイム (Genzyme)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、０〜500 Ｕ／mlの濃度範囲で、試験される細胞の同じ２つのプレートに加える。プレートを37℃で48時間インキュベートし細胞を溶解し、ウェスタンブロットで分析して、MHCクラスＩ発現の増加を測定する。このデータを図３に示す。外因的に処理した細胞のMHC発現レベルに対する組換えｍγ−IFNのIFN除去後の影響を試験するために、Ｌ33細胞の複数のプレートに処理の前日に接種して翌日50％集密になるようにする。最終濃度200 Ｕ／mlで組換えｍγ−IFNを加え、細胞を48時間インキュベートする。次に細胞をPBSで洗浄し、新鮮な培地を加え、PBSで洗浄した後０，24，48および72時間後に細胞を溶解する。細胞抽出物をM HCクラスＩ発現についてウェスタンブロットで分析する。結果は、IFNの除去後4 8時間までに、細胞性MHCクラスＩ発現が有意に減少し、この現象は時間の経過とともに継続することを示す（図3A）。実施例６ γIFN活性の測定Ａ．ｍγ−IFN測定 γ−IFNの活性は、脳心筋炎(EMC)ウイルスによる細胞死滅性感染に対する防御作用の測定として、Lee Biomolecular、サンジエゴ、カリホルニア州により定量される。マウス細胞系L929(ATCC CCL1)をｍγ−IFN を測定するのに使用する。フィルターにかけた上清は異なる濃度で細胞に加え、次に細胞にEMCウイルスを抗原投与する。マウスγ−IFN試料を適当なNIH参照試薬と一緒に測定し、結果をNIH参照単位（Ｕ／ml）に標準化する(Brennanら、Bio techiniques １：78，1983)。週２回細胞に培地を与える時、すべての形質導入した細胞株の上清試料を採取する。上清を0.45μｍのフィルターにかけ、試験するまで−70℃に保存する。細胞型CT26，BC10ME，LLTおよびB16F10について活性を記載する。このデータは表３と４に示す。実施例７ B16F10およびB16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞の腫瘍形成性 B16F10およびB16F10／ｍγ−IFN ＃４の親細胞を採取し、計測し、ハンクス緩衝化塩溶液（HBSS，Irvine Scientific、カリホルニア州）に８×10^５細胞／ml の濃度で再懸濁する。２匹のブラック６マウス（ハーラン・スプレーグ−ドーレー(Harlan Sprague-Dawley)、インディアナポリス、インディアナ州）にB16F10 細胞懸濁液0.5ml(３×10^５細胞)を静脈注射（ｉ．ｖ．）する。５匹のC57 B1/6 マウスに、B16F10 IFN＃４細胞懸濁液0.5mlを静脈注射する。注射の14日後にマウスから肺を取り出し、染色し、ボウイン溶液(Bouin's Solution)(シグマ(Sigm a)、セントルイス、ミズーリ州)に保存する。肺の４葉を分離し、10×の倍率で検鏡し、それぞれに存在する黒色癌の数を測定する。各群の１つの肺当たりの癌の平均数と標準偏差を図６に示す。実施例８ B16F10 CTL測定Ａ．実験１ B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞に、Salk INstituteで10,000radの⁶⁰Coを照射する。２匹のブラック６マウスに、1.0mlのHBSS中の１×10^７個の照射細胞を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）する。３週後、マウスに0.5mlのHBSS中の３×10^５B16F10生細胞を静脈注射する。２匹のブラック６対照マウスにも、同じ量を投与する。14 日後、マウスから肺と脾臓を取り出す。肺を染色し、ボウイン溶液中で保存する。肺の４葉を分離し、10×の倍率で検鏡し、それぞれに存在する黒色癌の数を測定する。どの肺にも癌は観察されなかった。脾臓から脾臓細胞を取り出し、HBSS で３回洗浄し、T-25フラスコ中のRPMIと５％熱不活性化FBSを含有するCTL培地に３×10^７細胞／10mlで再懸濁する。Salk INstituteで10,000radの⁶⁰Coを照射した60,000個のB16F10細胞を、フラスコに加える。細胞を５％ CO₂で37℃で６日間インキュベートする。インキュベート後、B16F10とB16F10／ｈγ−IFN ＃４細胞を標的として用いて、標準的５時間CTL測定法を行う。このデータを図４に示す。６〜８週齢の雌のBalb／Ｃマウス（ハーラン・スプレーグ−ドーレー(Harlan Sprague-Dawley)、インディアナポリス、インディアナ州）に、室温で10,000rad を照射した１×10^７個のベクターで形質導入した細胞を２回腹腔内注射する。７日後にマウスを屠殺し、３×10^６個の脾臓細胞／mlを、６×10^４個の照射した同系の形質導入細胞／mlとともにT-25フラスコ中でインビトロで培養する。培地は RPMI1640；５％ FBS、熱不活性化；１mMピルビン酸；50mg／mlゲンタマイシンおよび10^-5Ｍ２−メルカプトエタノールよりなる。４〜７日後にエフェクター細胞を採取し、標準的４〜６時間測定法で96ウェルマイクロタイタープレート中で種々のエフェクター：標的細胞比を用いて試験する。この測定は、37℃で１時間100μCiのNa₂ ⁵¹CrO_４で標識した（アマーシャム（Amersham）、アーリントンハイツ、イリノイ州）標的細胞１×10^４細胞／ウェルを最終容量200.0μｌで使用する。インキュベート後、100.0μｌの培地を取り、ベックマンガンマスペクトロメーター(Beckman gamm a spect rometer)（ベックマン；ダラス、テキサス州）で分析する。自然放出（ SR）を標的＋培地からのCPMとして測定し、最大放出（MR）を標的＋1MHClからの CPMとして測定する。標的細胞の溶解の百分率は以下のように計算する：〔(エフェクター細胞＋標的CPM)−（SR）／（MR）−（SR）〕×100。標的の自然放出値は、典型的にはMRの10％〜20％である。Ｂ．実験２ B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞を採取し、HBSS中に再懸濁し、Salk INstituteで 20,000radの⁶⁰Coを照射する。２つの異なる濃度で細胞を採取する：１×10^７細胞／mlと１×10^７細胞／0.1ml。４匹のブラック６マウスよりなる３群に注射する。３匹のマウスの最初の群には細胞を投与せず、第２群には1.0ml(総細胞数1. 0×10^７個)を腹腔内投与し、第３群には0.1ml(総細胞数１×10^７個)を腹腔内投与する。注射の７日後、８×10^５細胞／ml HBSSで0.5mlのB16F10生細胞を静脈注射する。静脈注射の14日後、マウスから脾臓を取り出す。脾臓から脾臓細胞を単離し、 HBSSで３回洗浄し、T-25フラスコ中のCTL培地に３×10^７細胞／10mlで再懸濁する。Salk INstituteで20,000radの⁶⁰Coを照射した60,000個のB16F10細胞をフラスコに加える。細胞を５％ CO₂で37℃で５日間インキュベートする。インキュベート後、B16F10細胞を標的として用いて、標準的6.5時間CTL測定法を行う。このデータを図５に示す。実施例９ B16F10ワクチン試験Ａ．実験１ B16F10細胞とB16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞を採取し、HBSSに再懸濁する。細胞に10,000radの⁶⁰Coを照射する。両細胞懸濁液の細胞濃度を８×10^５細胞／mlに調整する。３匹のブラック６マウスの３群に注射する。最初の群には、0.5mlの4 .0×10^５個の照射したB16F10細胞を静脈注射する。第２群には、0.5mlの照射したB16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞を静脈注射し、最後の群には細胞を投与しない。注射の10日後、９匹のマウスのすべてに6.0×10^５細胞／ml HBSSで、0.5mlのB16 F10生細胞を静脈注射する。静脈注射の14日後にマウスから肺を取り出し、染色し、ボウイン溶液（Bouin's Solution）に保存する。肺の４葉を分離し、10×の倍率で検鏡し、それぞれに存在する黒色癌の数を測定する。各群の１つの肺当たりの癌の平均数と標準偏差を図７に示す。Ｂ．実験２ B16F10／ｈγ−IFN ＃４細胞を採取し、HBSSに再懸濁し、10,000radの⁶⁰Coを照射する。細胞を５つの異なる濃度で分注する：４×10^５細胞／0.5ml，５×10^５細胞/ml，１×10^７細胞／ml，５×10^６細胞／0.1ml、そして１×10^７細胞／0. 1ml。４匹のブラック６マウスの６群に投与する。第１群には細胞を注射しない。第２群には４×10^５B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞0.5mlを静脈注射する。第３群には５×10^６B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞1.0mlを腹腔内投与する。第４群には１×10^７B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞1.0mlを腹腔内投与する。第５群には５ ×10^６B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞0.1mlを筋中（ｉ．ｍ．）投与し、最後の群には1.0×10^７B16F10／ｍγ−IFN ＃４細胞0.1mlをｉ．ｍ．投与する。注射の７日後、すべてのマウスに6.0×10^５細胞／ml HBSSで、0.5mlのB16F10生細胞を静脈注射する。注射の14日後にマウスから肺を取り出し、染色し、ボウイン溶液（Bouin's So lution）に保存する。肺の４葉を分離し、10×の倍率で検鏡し、それぞれの肺の中の黒色癌の数を測定する。各群の１つの肺当たりの癌の平均数と標準偏差を図８に示す。実施例10 ｍγ−IFNおよび組換えｍγ−IFN蛋白で処理した細胞の腫瘍形成性の比較Ａ．実験１ｍγ−IFNで処理した癌細胞はｍγ−IFNを連続的に発現する癌細胞と比較してインビボで増殖が異なるかいなかを試験するために、以下の実験を行う。10匹の Balb／Ｃマウスの３群に、３×10^６個のＬ33細胞、注射の前にインビトロで３日間組換えｍγ−IFN 400単位で処理した３×10^６個のＬ33細胞、またはｍγ−IFN ベクターで修飾したＬ33癌細胞であるＬ33／ｍγ−IFN ＃15のクローンの３×10^６個の細胞を、皮下注射する。注射の前にこれらの細胞を10％ FBSを含有するDM EMを用いて10cmのファルコン（Falcon）組織培養シャーレ中で増殖させる。ベルセン(Versene)（Irvine Scientific、カリホルニア州）で細胞を採取し、1.5×1 0^７個／mlの濃度でHBSSに再懸濁する。上記のＬ33の各サブタイプの3,000,000個の細胞に、各マウスの胸骨の近くに総量0.2mlで皮下注射する。癌の増殖を毎週記録する。ロボツ・インスツルメンツ（Roboz Instruments、ドイツ）のカストロビエジョ・カリパー(Castroviejo Caliper)を用いて、癌の長さ、幅および高さを測定して、各癌の容量を定量する。癌の平均サイズを、他の２群の癌増殖の平均値と比較する。データは、組換えｍγ−IFNで処理したＬ33細胞はＬ33親細胞癌株と同様に増殖することを示す。これに対して、一貫してｍγ−IFNを発現するＬ33／ｍγ−I FN ＃15クローンは排除される（図９と図11）。要約すると、ｍγ−IFNを発現する癌細胞は、インビトロでｍγ−IFNで処理した癌細胞より強力で完全な免疫応答を誘導することができる。Ｂ．実験２この実験は以下の例外を除いて実験１と同じである。３×10^６個のＬ33、組換えｍγ−IFNでインビトロで処理したＬ33、またはＬ33／ｍγ−IFN ＃15細胞の変わりに、各型の６×10^６個の細胞をマウスへの接種物として使用した。データは、２倍の数の細胞を注射すると、ｍγ−IFNを発現する細胞は、インビトロでｍγ−IFNで処理した細胞より強力で完全な免疫応答を誘導することを、示している。Ｃ．ヌードマウスにおけるｍγ−IFNを発現するＬ33細胞の腫瘍形成性Ｔ細胞性免疫が障害されたマウスにおけるＬ33／ｍγ−IFN ＃15細胞の増殖を追跡することにより、腫瘍形成性を測定した。２群の７匹のBalb／Ｃヌードマウスに、６×10^６個のＬ33または６×10^６個のＬ33／ｍγ−IFN ＃15を注射した。癌の増殖を追跡し、２群の間で平均測定値を比較した。データはＬ33ｍγ−IFN ＃15細胞はヌードマウスでは拒絶されないことを示している（図11）。さらにｍγ−IFN発現細胞は、親Ｌ33細胞より約40％成長が遅いことを示している。Ｌ33癌細胞の拒絶には、マウスの免疫系のＴ細胞性成分が必要とされるようである。この応答は、正常な免疫系を有するマウスでは誘導されるが、Ｔ細胞性免疫が障害されたマウスでは誘導されない。実施例11 ｍγ−IFN発現CT26癌細胞によるBalb／Ｃマウスの免疫増強の測定Ａ．ｍγ−IFNを発現するCT26癌細胞の腫瘍形成性腫瘍形成性は、CT26／ｍγ−IFNを注射した正常Balb／Ｃマウスで癌の増殖を観察することにより測定される。２群の10匹のマウスに、各々親株CT26またはｍ γ−IFN発現CT26プールのいずれかを皮下注射する。このプールは、G418で選択した形質導入細胞の非クローン性群である。これらの型の細胞を、DMEMと10％ F BSを使用して10cmファルコン組織培養シャーレで増殖させる。この細胞を、Vers eneを使用して回収し、HBSSに2.5×10^６細胞／mlの濃度で再懸濁する。全量0.1m lの細胞懸濁液を各マウスの胸骨の近傍に皮下注射する。各マウスの癌の計測結果を毎週記録する。平均の癌の計測結果を３群の間で比較する。図12に30日間にわたる癌増殖を示す。このデータは、未修飾のCT26細胞では拒絶は観察されないのに、ｍγ−IFNを発現するCT26細胞は拒絶されることを示している。要約すると、親株の癌細胞には誘導されないある免疫応答が、リンホカインを発現する細胞により誘導されている。Ｂ．CT26およびCT26／ｍγ−IFN発現担癌動物における脾臓細胞の細胞溶解活性観察される拒絶が免疫応答の増強によるものかどうかを決定するために、各々ｍγ−IFNを発現するCT26癌を拒絶したマウスを使用する。具体的には、各々ｍ γ−IFNを発現するCT26癌を拒絶したマウスから脾臓細胞を回収する。これらの癌は、各癌細胞型2.0×10^５細胞を各マウスの胸骨の近傍へ単回皮下注射することにより誘導される。この脾臓細胞回収の方法を簡単に記載する。ハサミを使用して外側の毛皮と内側の腹壁を縦方向に切開することにより、マウスの脾臓を取り出す。次にこの脾臓を、近接する結合組織から無菌的に切り出し、HBSS中に入れる。次にこの脾臓を、新鮮なHBSS ２mlを含む10cm プレートに接種する。一方の末端に小さな裂け目を入れて、続いて23番の針の平らな表面を使用して脾臓を穏やかにさすることにより、この脾臓から脾臓細胞を取り出す。HBSS ７mlを添加することによりこの脾臓細胞を回収する。この細胞懸濁液をピペットで回収し、Nytexスクリーン（Tetco，Elmsford、ニューヨーク州）を通して塊を破壊する。さらに媒体７mlを使用して、残った脾臓細胞のプレートを洗浄して、この混合物をNytexスクリーンに通す。得られる脾臓細胞を15m lのポリプロピレンチューブで室温で1600RPMで５分間遠心分離する。ペレット化した脾臓細胞をHBSS14mlに再懸濁して、室温で1600RPMで５分間遠心分離する。遠心分離の前に、再懸濁した脾臓細胞を分注した希釈物を取り出して、トリパンブルー（Irvine Scientific；サンタアナ、カリフォルニア州）中で計数する。次に脾臓細胞をRPMIと５％熱不活性化FBSに３×10^７脾臓細胞／mlの濃度で再懸濁する。次に脾臓細胞をインビトロで再刺激する。具体的には、RPMI 10mlと５％ FBSを含むT-25cmフラスコ中で、３×10^７個の脾臓細胞を、放射線照射した６ ×10^５個のCT26または他の適切な再刺激細胞と、50：１のエフェクター：再刺激性細胞比で混合し、５％ CO₂で37℃で５〜７日間インキュベートする。インキュベーション後、これらのエフェクターをフラスコから取り出し、計数して、96ウェルブレート中で37℃で４時間、種々の比で⁵¹クロミウム（⁵¹Cr）標識標的細胞と一緒にインキュベートする。インキュベーション後、各エフェクター：標的細胞比の各ウェルから上澄液10μｌをチューブにとり、ガンマカウンターを使用して⁵¹Crの放出を測定する。細胞溶解の百分率を下記の式を使用して求める。このデータは、ｍγ−IFNを発現するCT26細胞を拒絶するマウスにおいて強力な免疫応答が誘導されていることを示す（図13）。要約すると、ｍγ−IFNを発現するCT26細胞は、親株の癌が誘導できない免疫応答を誘導することができる。実施例12 放射線照射したCT26またはCT26／ｍγ−IFN発現癌細胞を使用したBalb／ｃマウスにおける脾臓細胞溶解活性の誘導Ａ．CT26またはCT26／ｍγ−IFN発現細胞の２回の注射を使用した脾臓細胞の細胞溶解活性の生成照射したｍγ−IFN CT26細胞が、照射した未修飾のCT26よりも、CT26に対する免疫活性を増強することができるかどうかを測定するために、一連の注射を行う。２匹のマウスに、１回用量当たり1.0×10^７個の照射したCT26またはCT26／ｍ γ−IFN ＃10細胞を毎週２回注射する。２週間後脾臓を取り出し、各々誘導物質でインビトロで刺激し、⁵¹Cr放出測定においてクロミウム標識CT26標的に対して使用する。このデータは、CT26／ｍγ−IFNエフェクターの細胞毒性は、CT26エフェクターよりも、CT26に対して強力であることを示す（図14）。Ｂ．CT26またはCT26／ｍγ−IFN発現癌細胞の２回の注射により誘導される脾臓細胞の特異性 CT26に対する特異性を証明するために、１×10^７個のCT26／ｍγ−IFN ＃10細胞の２回の投薬処方により作成される脾臓細胞エフェクターを、幾つかの非CT26 標的に対して⁵¹Cr放出測定に使用する。Balb／Ｃマウスの同系株であるBC10ME、およびBalb／Ｃマウスではなく異なる種のマウスC57B1/６（ハーラン・スプレーグ−ドーレー (Harlan Sprague-Dawley)、インディアナポリス、インディアナ州）から得られた癌細胞株であるB16F10が選択される。このデータは、ｍγ−IFNを発現しているCT26細胞が刺激物質として使用される時には、誘導される応答は、CT26に対して特異的であり、同種のマウスであれ無関係の種のものであれ他の細胞型に対しては応答しないことを示す（図15）。Ｃ．CT26γ−IFN発現癌細胞の増強された細胞溶解ｍγ−IFNを発現する⁵¹Cr標識CT26標的細胞は、１×10^７個の照射CT26細胞の２回の投薬処方により作成されるエフェクター脾臓細胞を使用する時、クロミウム放出測定において細胞溶解の増強を示す。図16のデータは、ｍγ−IFNを発現しているCT26細胞が、未修飾のCT26細胞よりも良い標的として作用することを示す。これらの修飾されたCT26標的により発現されたｍγ−IFNが、これらのエフェクターによる有効な細胞溶解をもたらすCT26エフェクターへの大きな親和性を誘導することは可能である。これらの細胞の表面上のこの増強されたレベルのMH C分子も、細胞溶解の増強に寄与しているかも知れない。実施例13 C57BL/６マウスにおけるｍγ−IFN発現LLT細胞による免疫増強の測定Ａ．ｍγ−IFN発現LLT細胞の腫瘍形成性正常C57B1/６マウスへの注射により、ｍγ−IFN発現LLT細胞の発癌性を測定する。２群の10匹のマウスに、親LLT株またはｍγ−IFN発現LLTプールのいずれかを皮下注射する。これらの細胞を、実施例3C3に記載されたように増殖させる。この細胞を実施例13Aに記載されたように採取し、HBSSに2.5×10^６細胞／mlの濃度で再懸濁する。0.1mlの細胞懸濁液を各マウスの胸骨の近傍に皮下注射する。癌の計測結果を毎週記録し、癌の平均サイズを２群間で比較する。図17は 21日間にわたる癌増殖を示す。このデータは、未修飾のLLT細胞に比べて両方のｍγ−IFNを発現するLLT細胞は有意に遅く増殖することを示している。要約すると、このデータは親株のLLT 細胞には誘導されない部分的免疫応答が、ｍγ−IFNを発現する細胞により誘導されていることを意味する。Ｂ．ｍγ−IFN発現LLT細胞の２回の注射を使用した脾臓細胞の細胞溶解活性の生成照射したｍγ−IFN修飾LLT細胞が、照射したLLT細胞よりも、LLT細胞に対する免疫活性を増殖することができるかどうかを決定するために、C57B1/６マウスで一連の注射を行う。マウスに、１×10^７個の照射したLLTまたはLLT/ｍγ−IFNプールを毎週２回注射する。最後の注射から２週間後、脾臓を取り出し、各々誘導物質でインビトロで刺激し、クロミウム放出測定において⁵¹Cr標識LLT標的に対して使用する。このデータは、LLT/ｍγ−IFNエフェクターの細胞毒性は、LLTエフェクターまたはｍγ−IFN発現刺激性細胞の大きな有効性を示している未修飾刺激物質よりも、LLTに対してより強力であることを示す（図18）。Ｃ．γ−IFN発現LLT細胞の２回の注射により誘導される脾臓細胞の特異性 LLTに対する特異性を証明するために、１×10^７個のLLT ｍγ−IFNプール細胞の２回の投薬処方により作成される脾臓細胞エフェクターを、幾つかの非LLT標的に対してクロミウム放出測定に使用する。C57B1/６マウスの同系癌細胞株であるB16F10、およびC57B1/６マウスではなくBalb／Ｃマウスの癌細胞株であるCT26 が選択される。このデータは、ｍγ−IFNを発現しているLLT細胞は刺激物質として使用することにより、誘導される応答は、LLTに対して特異的であり、同種のマウスであれ無関係の種のものであれ他の細胞型に対しては応答しないことを示す（図19）。Ｄ．LLT ｍγ−IFN発現癌細胞の細胞溶解の増強ｍγ−IFNを発現する⁵¹Cr標識LLT標的細胞は、１×10^７個の照射LLT細胞の２回の投薬処方により作成されたエフェクター脾臓細胞を使用する時、クロミウム放出測定において細胞溶解の増強を示す（図20）。このデータは、ｍγ−IFNを発現しているLLT細胞は、未修飾のLLT細胞よりも良い標的として作用することを示す。これらの修飾されたLLT標的により発現されたｍγ−IFNが、これらのエフェクターによる有効な細胞溶解をもたらすLLTエフェクターに対するより大きな親和性を誘導することは可能である。実施例14 形質導入されたヒトメラノーマにおけるHLAクラスＩおよびｈγ−IFNの発現Ａ．ウェスタンブロット分析によるヒトMHC（HLA）クラスＩ発現の測定 HLAクラスＩ特異的抗体W6／32が使用されることを除いて、本質的に実施例5A に記載されたようにマウスのMHCに対するHLAの発現を測定する。Ｂ．ｈγ−IFNレトロウイルスベクターを含む場合と含まない場合のヒトメラノーマにおける分析とHLA発現 DM92，Dn252、またはDM265をｈγ−IFNベクターまたはベクター形質導入の対照としてhIL-2で処理する。図22のデータは、ｈγ−IFNベクターは非形質導入細胞に比較してHLAのレベルを増加させることを示すが、一方IL-2で形質導入したものは増加させなかった。DM265の形質導入は、培地へのｈγ−IFNの分泌がほとんどないか全然ない場合でさえ、HLAの増加をもたらす（表４）。ｈγ−IFNは、チンパンジー細胞系A549，ATCC CCL185で脳心筋炎ウイルスのウイルス阻害により定量される。活性は、認証されたNIH参照試薬との比較により測定され、NIH参照単位（Ｕ／ml）に標準化される（Brennanら、Biotechniques １：78，1983）。幾つかのヒトメラノーマ細胞株についてのデータが表４に報告される。これらのデータは、ｈγ−IFNレトロウイルスベクターで形質導入された全てのヒトメラノーマが、容易に検出可能なレベルの生物学的に活性なｈγ− IFNを発現することを示す。この発現は、しばしば時間の経過に対して安定である（表５，DM252およびDM92）が、時々培養液中では時間の経過とともに低下する(表４，DM6およびDM265)。この時間に依存したｈγ−IFNの低下は、この遺伝子の発現が多少毒性であり、このため細胞にとって有利な低いレベルのｈγ−IF Nを発現する細胞が選択されることを示すのかも知れない。実施例15 レトロウイルスベクターによるヒトメラノーマ細胞株の形質導入性Ａ．非濃縮ベクター上澄液によるヒトメラノーマ細胞株の形質導入ヒトメラノーマ細胞株、DM6，DM92およびDM252を異なるMOIで大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子(CBβgal)を発現するレトロウイルスベクターで形質導入した。CBβgalは、KT-3のHIVIII Bgag/prot遺伝子を大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子で置き換えることにより作成されるベクターである。産生細胞株は、実施例１，３および４に記載された方法と同様の方法で作成された。CBβgalによる形質導入の３日後、細胞をX-gal（Gold Biotechnology、セントルイス、ミズーリ州）で染色し、青い細胞の数を数えて、形質導入百分率を計算した（Nortonら、Molec．a nd Cell．Biol．５：218-290，1985）。この結果は、３つのヒトメラノーマ細胞株は容易に形質導入可能であり、形質導入は100％に近いことを示す。Ｂ．濃縮ベクターを使用するヒトメラノーマの形質導入効率両性のCBβgalベクターをCA産生細胞株から採取し、接線方向のフロー濃縮により40倍に濃縮した。DM252，DM6およびDM92の６ウェルプレートを４×10^４細胞／ウェルで準備した。０日目である次の日に、各メラノーマ細胞株を、濃縮してあるが精製していないCBβgalベクターで50，25，10，５，１および０のMOIで形質導入する。翌日細胞からベクターを除去し、細胞を培地で洗浄する。５日目に、細胞をX-galで染色する。これらの細胞はG418で選択されない。濃縮ベクターを使用する時ヒトメラノーマの形質導入効率は、MOIの増加と共に低下し（図24 ）、これは形質導入に対する阻害物質の存在を示唆している。従って、ベクターの精製は、濃縮ベクターを要する癌へのベクターの直接注射にとって重要である。精製方法は、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーのような、タンパクの精製のために典型的に当業者に用いられる方法を含む。上記実験のMOI＝1.0 の試料の顕微鏡観察によると、このような条件下でさえ、細胞集団の25〜90％は G418選択の助けなしで形質導入されうることを示している。Ｃ．培養開始後の形質導入時間の実験凍結されたヒト癌生検DM26からの厚切り片を解凍し、外科用メスで切り刻み、網を通してすり潰し、10枚の6.0cm組織培養プレートに接種する。培養開始後１，２，３，６，７，８，９，10および13 日目に、１つのプレートを1.0×10^６cfuの未精製CBβgalベクターで形質導入する。20日目に、全てのプレートをX-galで染色する。これらの細胞はG418で選択されない。図26のデータは、培養開始後既に１日目から高い効率で癌が迅速に形質導入可能になることを示している。培養開始直後の形質導入は、メラノーマが迅速に、かつｈγ−IFN毒性による影響または培養中の抗原移動(antigenicdrift )を最小にして患者に戻ることを可能にする。この接種直後の形質導入の高い効率は、ベクターの癌への直接注射によるインビボの形質導入が有効であることを示唆する。実施例16 担癌動物へのベクターの直接投与Ａ．マウスへのベクターの直接投与細胞性免疫応答は、少なくとも１つの抗癌剤を発現するベクター作成体を直接投与することにより増強されることを証明するために、マウスの癌システムを使用することができる。例えば、６〜８週齢の雌のBalb／ＣマウスまたはC57B1/６マウスに、１×10^５〜２×10^５個の癌細胞を皮下に注射し、これをマウスの中で１〜２週間増殖させる。得られる癌は感染または潰瘍形成により傷害されない限り、種々の大きさ（通常１〜４mm^３容量）になる。次にγ−IFNのような抗癌剤（最小力価10^６cfu/ml）を発現するベクター作成体の0.1〜0.2mlを癌の中に注射する（形質導入効率を上昇させるポリブレンまたは硫酸プロタミンが有りまたはなし）。２〜３日毎にベクターを複数回注射する。特定の実験のパラメータのより、ベクター調製物の性質も同様に変動する。ベクターは、ベクター産生細胞株(VCL)からのフィルターをかけたかまたはかけていない上清由来であるか、または濾過、濃縮または透析や調製法により処理される。他の標準的精製方法（例えばゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィー）などを使用してベクターを精製することもできる。例えばVCL自身（これは投与された場合癌増殖を促進することもある）に産生されたγ−IFNを除去するのに透析を使用することができる。形質導入を阻害する可能性のある物質を除去するのにも透析を使用することもできる。さらに広範囲にベクターを導入するための別の方法は、γ−インターフェロンVCL自身を癌内に注射することである。簡単に説明すると、培養液を遠心分離して薬剤的に許容される培地（例えば、PBS＋１mg／ml HSA）に再懸濁した後、細胞を注射する。本発明のこの面において10^５個という少ない細胞を使用こともできる。ベクター作成体の効果は、原発癌の増殖の低下、癌の減少（癌容積の低下により測定される）を測定するか、または癌標的細胞に対するＴ細胞活性の増加（これらの担癌細胞の脾臓から単離されたリンパ球を用いるインビトロ測定系により測定される）を誘導することにより測定することができる。マウスの転写癌モデルでは、まず転移性の癌を注射して、癌の容積が１〜４mm^３になった時この癌の中にベクターを数回注射することにより、効果を測定することができる。次に原発性の癌の移植物の場合は２〜３週間後に外科的に除去することができ、確立された標的臓器（肺、腎臓、肝臓など）に対する転移の減少を数える。標的臓器における転移の変化を測定するには、臓器を取り出し、秤量し、非担癌臓器と比較する。さらに標的臓器における転移の量は、低倍率実態顕微鏡を用いて目視できる転移節の数を数えることにより測定できる。Ｂ．ヒトへのベクターの直接投与ヒトではベクター作成体の直接投与の好適な部位は、癌の位置により変わる。ヒトのγ−インターフェロン遺伝子または抗癌剤をコードする他の配列を、ベクター投与により固形癌の中に直接導入することができる（ベクターは前述したように精製される）。これらはまた、白血病、リンパ腫または腹水癌に送達することもできる。メラノーマのような皮膚の病変には、病変部にまたはその周辺に直接注射することができる。少なくとも10⁵ cfu(好ましくは10⁶cfu)のベクター粒子を、薬剤的に許容される処方（例えば、 10mg／mlマンニトール、１mg／ml HSA，25mMトリスpH7.2および105mM NaCl）で投与されるべきである。内部癌病変の場合は、影響を受けた癌を、Ｘ線、CTスキャン、抗体イメージング法、または当業者に公知の他の癌局在化法を用いて、局在化することができる。ベクター注射は、皮膚を通して内部病変へ、または気管支鏡検査法（肺用）、Ｓ字結腸鏡検査法（結腸直腸癌または食道癌用）、または動脈内または血管内カテーテル（多くの型の血管性固形癌用）を応用して注射することができる。癌病変の中またはその周辺に注射することができる。生物学的応答の誘導の効果は、CTL測定法または癌に対する遅延型過敏症(DTH)反応により測定される。効果と臨床応答は、Ｘ線、CTスキャン、抗体イメージング法、または当業者に公知の他の腫瘍局在化法を用いて、癌の大きさを測定して調べることができる。実施例17 CT26癌細胞を注射したマウスへのβ−GAL直接ベクターの注射ベクターの直接注射により癌細胞がインビボで形質導入されるかを評価するために、大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダーゼ遺伝子（CBβgal）を発現するレポーターベクターを使用した。簡単に説明すると、各２匹のマウスの５群に２× 10⁵個のCT26癌細胞を皮下注射する。別の群の２匹のマウスに、２×10⁵個のCT26 β−gal発現細胞をβ−gal染色の対照として皮下注射する。各マウスの注射部位は、耐水性マーカーで丸で囲う。癌細胞接種の２日後、マウスに0.2mlのPBS＋ポリブレン（４μｇ／ml）、ポリブレン有りまたはなしのCB β −gal(５×10⁶コロニー形成単位（CFU）ml)、またはポリブレン有りまたはなしのDAｈγ−IFN ＃15を注射する。各群のマウスに、耐水性マーカーで印をした部分に２日毎にそれぞれの接種物を注射する。各群に合計４回注射する。最後の注射の２日後に、マウスの群のそれぞれから癌を取り出し、切り刻み、DMEM＋10％ FBSおよび抗生物質を含有する２つの10cm²プレートに接種する。これらの癌の外植体をインビトロで１週間増殖させる。１週間後細胞を採取し、２％ホルムアルデヒドで固定しX-galで一晩染色する。この実験の結果を以下に示す。一晩染色したために、染色対照としての非修飾CT26またはｈγ−IFNを注射したCT26の実質的なバックグランド染色があった（３％）。これらの条件下で、最大のネット値で17％（20％−３％バックグランド）の細胞が染色された。陽性対照（100％形質導入された）は28.6％のみの染色であったため、17％の染色は、（17／28.6）×100すなわち60％の細胞がインビボで形質導入されたことを示す。形質導入される癌細胞は対数期にあり、従って感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）は癌の増殖とともに減少した。以上より、例示のために本発明を具体的な実施態様について説明したが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であることは理解されるであろう。従って本発明は請求の範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 45/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ 37/66 ＧＣ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/02 15/09 ＺＮＡ 9051−4Ｃ 37/54 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョリー，ダグラスジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, ルーカディア，ヒルクレストドライブ 277 (72)発明者レスペス，ジェームスジー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，レイモントストリート 4966

Claims

【特許請求の範囲】１．温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、その腫瘍に、その腫瘍の増殖が阻害されるような、少なくとも１の抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物を直接投与することを含んで成る方法。２．ベクター構築物が組換えウイルス・ベクターにより担持される、請求項１に記載の方法。３．組換えウイルス・ベクターが組換えレトロウイルス・ベクターである、請求項２に記載の方法。４．抗腫瘍剤が免疫活性化物質及び腫瘍増殖阻害剤から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。５．免疫活性化物質が免疫モジュレーター及びリンホカインから成る群から選ばれる、請求項４に記載の方法。６．免疫モジュレーターが、CD3，ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3，β−２− マイクログロブリン、シャペロン、アルファ・インターフェロン、ガンマ・インターフェロン、B7/BB1，B7-2及び主要組織適合複合体(MHC)から成る群から選ばれる、請求項５に記載の方法。７．リンホカインが、ガンマ・インターフェロン、腫瘍壊死因子、IL-1，IL-2 ，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，GM-CSF ，CSF-1、及びG-CSFから成る群から選ばれる、請求項５に記載の方法。８．腫瘍増殖阻害剤が、毒素及びアンチセンス配列から成る群から選ばれる、請求項４に記載の方法。９．毒素が、リシン(ricin)、アブリン(abrin)、ジフテリア毒素（diphtheria Toxin）、コレラ毒(cholera Toxin)、ゲロニン( gelonin)、ヤマゴボウ（pokeweed）、抗ウイルス・タンパク質、トリチン（trit in）、シゲラ毒（Shigella Toxin）、及びシュードモナス外毒素Ａ（Pseudomona s exotoxin A）、単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（herpes simpl ex virus thymidine binase LHSVTK）、及びE.coli．グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼから成る群から選ばれる、請求項８に記載の方法。 10．アンチセンス配列が、アンチセンス・チミジン・キナーゼ、アンチセンス・ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アンチセンスHER2、アンチセンスABL、アンチセンスMyc、及びアンチセンスras から成る群から選ばれる、請求項８に記載の方法。 11．抗腫瘍剤が、ガンマ・インターフェロン−インターロイキン−２融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。 12．膜アンカー−抗腫瘍剤融合タンパク質をコードする単離DNA配列。 13．膜アンカー−ガンマ・インターフェロン融合タンパク質をコードする単離 DNA配列。 14．請求項12又は13に記載のDNA配列の発現を指示するベクター構築物。 15．請求項14に記載のベクター構築物を担持する組換えウイルス・ベクター。 16．請求項14に記載のベクター構築物を担持する組換えレトロウイルス・ベクター。 17．インターロイキン−２−ガンマ・インターフェロン融合タンパク質の発現を指示するベクター構築物を担持する組換えウイルス・ベクター。 18．インターロイキン−２−ガンマ・インターロイキン融合タンパク質の発現を指示するベクター構築物を担持する組換えレトロウイルス・ベクター。 19．請求項16又は18の組換えレトロウイルス・ベクターにより感染された標的細胞。 20．医薬として許容される担体又は希釈剤と共に、請求項15又は17に記載の組換えウイルス・ベクターを含んで成る医薬組成物。 21．医薬として許容される担体又は希釈剤と共に、請求項16又は18に記載の組換えウイルス・ベクターを含んで成る医薬組成物。 22．温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって、温血動物に、その腫瘍の増殖が阻害されるように、請求項15〜18のいずれかに記載の組換えウイルス又はレトロウイルス・ベクターをデリバリーすることを含んで成る方法。 23．温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって：（ａ）温血動物から選択された腫瘍に関連する腫瘍細胞を取り出し；（ｂ）請求項15〜18のいずれかに記載の組換えレトロウイルス又はウイルス・ベクターにより上記の取り出された細胞を感染させ；そして（ｃ）上記の選択された腫瘍の増殖が阻害されるように、温血動物に上記感染細胞をデリバリーする、を含んで成る方法。 24．取り出された腫瘍細胞が線維芽細胞を含み、そしてデリバリーの段階に先立って、線維芽細胞がその取り出された細胞から除去される、請求項22に記載の方法。 25．温血動物への感染細胞のデリバリーに先立って、その感染細胞が失活される、請求項22に記載の方法。 26．温血動物において選択された腫瘍の増殖を阻害する方法であって：（ａ）温血動物から上記選択細胞に関連する腫瘍細胞を取り出し；（ｂ）上記細胞が抗腫瘍剤を発現することができるように、抗腫瘍剤の発現を指示するベクター構築物とその細胞を接触させ；そして（ｃ）上記選択された腫瘍の増殖が阻害されるように、同種（allogeneic）温血動物に段階（ｂ）からの細胞をデリバリーする、を含んで成る方法。