JPH09503818A - プロテアーゼ酵素を含んでなる漂白組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基の置換で誘導されたプロテアーゼ酵素（ここで、この前駆酵素において置換された上記複数のアミノ酸残基は＋７６位と、下記残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentusズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）と漂白剤を含んでなる漂白組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼ酵素を含んでなる漂白組成物 この出願は１９９３年１０月１４日付で出願された米国出願第０８／１３６， ６２６号および１９９４年５月２日付で出願された米国出願第０８／２３７，９ ３８号の一部継続出願であり、双方ともそれら全体で引用することにより本明細 書の開示の一部とされる。 発明の分野 本発明は漂白組成物、特に洗濯洗剤と、カルボニルヒドロラーゼ変種である１ 種以上のプロテアーゼ酵素および１種以上の漂白剤、特にブリーチ活性剤含有の 漂白系を用いる方法に関する。 発明の背景 様々なタイプの酵素が布帛からのある種のしみの除去に役立つ洗濯洗剤として 常用されてきた。これらのしみは、典型的には脂質およびタンパク質汚れと関係 がある。しかしながら、酵素は他のタイプの汚れおよびしみに対してはさほど有 効でないことが知られている。 ペルオキシゲンブリーチは布帛からのしみおよび／または汚れ除去に有効であ るが、このようなブリーチは温度依存性であることも長く知られてきた。６０℃ の洗濯液温度のとき、ペルオキシゲンブリーチは部分的に有効なだけである。洗 濯液温度が６０℃より下がると、ペルオキシゲンブリーチは比較的無効になる。 結果として、有効な漂白系を開発する工業的研究が続けられている。 本発明によると、カルボニルヒドロラーゼ変種である新規プロテアーゼ酵素と 漂白剤、特にブリーチ活性剤との組合せは、有効なしみ除去および／または黒ず み除去効果を示すことが見出された。したがって、改善されたしみ除去および／ または黒ずみ除去効果および／または布帛クリーニング効果および／または漂白 性質を有する漂白組成物、特に洗濯洗剤組成物を提供することが本発明の目的で ある。 本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な記載から明らかであろう。 背景技術 １９８７年１月６日付で発行されたBurnsら米国特許第４，６３４，５５１号 明細書では、本発明において用いられるアミドペルオキシ酸漂白化合物とそれら の前駆体について開示している。１９８９年８月１日付で発行されたBurnsら米 国特許第４，８５２，９８９号明細書も参照できる。１９９１年１２月３日付で 発行されたLagerwaardらの米国特許第５，０６９，８０９号明細書では、ＮＯＢ Ｓブリーチ活性剤とリパーゼ酵素LIPOLASEとの組合せについて開示している。リ パーゼ酵素とある種の漂白系との適合性問題の説明に関しては、１９８９年１１ 月１５日付で公開されたLagerwaardらの欧州特許第３４１，９４７号明細書参照 。１９８５年１０月８日付で発行されたSandersonの米国特許第４，５４５，７ ８４号明細書では、過ホウ酸ナトリウム一水和物への活性剤の吸収について開示 している。 発明の要旨 本発明は （ａ）天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種で あり、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基の 置換により誘導された、有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、この前駆酵素にお いて置換された上記複数のアミノ酸残基は＋７６位と、下記残基：＋９９、＋１ ０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９ 、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、 ＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋ ２ ６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置 はBacillus amyloliqueiaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒド ロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentusズブチリシン）の相当 アミノ酸残基に対応する）、 （ｂ）有機ペルオキシ酸であるか、または組成物から形成される漂白溶液中そ の場で活性剤と反応して有機ペルオキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じること ができるペルオキシゲン化合物とブリーチ活性剤との組合せである漂白剤、 および （ｃ）プロテアーゼ酵素および漂白剤と適合する１種以上のクリーニング組成 物物質 を含んでなる漂白組成物を提供する。 本発明には、好ましくは撹拌しながら布帛を上記漂白組成物含有水性液と接触 させることからなる、布帛のクリーニング方法も包含する。その方法は約６０℃ 以下の温度で行えるが、もちろん沸騰までの洗濯温度であるとかなり有効である 。水性洗濯液は、好ましくは少くとも約３００ｐｐｍの慣用的洗剤成分と、少く とも約２５ｐｐｍのブリーチ活性剤および少くとも約２５ｐｐｍの漂白化合物を 含む。好ましくは、上記水性液は約９００〜約２０，０００ｐｐｍの慣用的洗剤 成分と、約１００〜約２５，０００ｐｐｍの漂白化合物および約１００〜約２５ ００ｐｐｍの上記ブリーチ活性剤を含む。 上記方法で用いられる慣用的洗剤成分には、約１〜約９９．８％、好ましくは 約５〜約８０％の洗浄界面活性剤を含む。場合により、洗浄組成物は約５〜約８ ０％の洗剤ビルダーも含むことができる。他の任意洗浄成分も本発明により提供 される完全処方洗剤／ブリーチ組成物に含有される。 すべてのパーセンテージ、比率および割合は、他で指摘されないかぎり重量に よる。引用されたすべての文献は本明細書の開示の一部とされる。 図面の簡単な説明 図１Ａ‐ＣはBacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ 酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6）。 図２はBacillus amyloliquefaciens（ＢＰＮ）′およびBacillus lentus（野 生型）のズブチリシンの中に保存されたアミノ酸残基について示す。 図３Ａおよび３Ｂは４種ズブチリシンのアミノ酸配列について示す。最上列は Bacillus amyloliquefaciensのズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ′とも時々称 される）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7）。第二列はBacillus subt illisのズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.8）。第三列はＢ ．licheniformisのズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.9）。 第四列はBacillus lentusのズブチリシン（ＰＣＴ ＷＯ８９／０６２７６では ズブチリシン３０９とも称されている）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID N o.10）。記号^*はズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の不在につ いて示す。 図４はプラスミドＧＧＡ２７４の作成について示す。 図５はこの出願で用いられるある発現プラスミドへの中間体であるＧＧＴ２７ ４の作成について示す。 図６Ａおよび６ＢはBacillus lentusのズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸 配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対 応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている 。 図７Ａおよび７Ｂは本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列につい て示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６ 位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについ てコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タ ンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンに よりコードされている。 図８はベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴの作成について示す。 図９はベクターｐＵＣＣＡＴＦＮＡの作成について示す。 発明の具体的説明 本発明において用いられる漂白組成物は、布帛の有効で効率的なクリーニング を行い、それにより布帛からしみおよび／または汚れを除去する。プロテアーゼ 酵素と組合せた漂白系は、タンパク質および脂質汚れ、黒ずんだ汚れとしつこい 汚れ、特に求核性および身体の汚れを含めて、布帛から様々なタイプの汚れを除 去する上で特に効率的である。 ここで有用なプロテアーゼ酵素、漂白剤（ペルオキシ酸および漂白系を含む） およびクリーニング組成物物質は、以下で詳細に記載されている。 （１）漂白剤 本漂白組成物は漂白剤を含有し、これは好ましくは組成物の約０．５〜約２０ ｗｔ％である。漂白剤は実質上不溶性で好ましくは固体の有機ペルオキシ酸、ま たは過酸化水素を生じることができるペルオキシゲン漂白化合物とブリーチ活性 剤からなる漂白系、あるいは双方の組合せである。組成物中にあるか、または活 性剤およびペルオキシゲン化合物の組合せにより形成される過酸は、約３〜約６ ．５の範囲内の親水性‐親油性バランス（“Ｈ．Ｌ．Ｂ．”）値を有する対応カ ルボン酸を有することが好ましい。したがって、本発明で有用な好ましいペルオ キシ酸（活性剤からまたは前形成ペルオキシ酸として）を特徴付けるために使用 できる方法は、引用することにより本明細書の開示の一部とされるDavies,J.T., Proc.2nd Internat.Congr,Surface Activity,1,426,Butterworths,London(1957) に記載されたような“Ｈ．Ｌ．Ｂ．スケール”である。このようなＨ．Ｌ．Ｂ． スケール（親水性‐親油性バランス）は、親水（水様）と親油（油様）相への界 面活性剤の分配を表す手段として界面活性剤の研究で用いられてき た。このやり方だと、Ｈ．Ｌ．Ｂ．値は洗液中における活性漂白種の親油（疎水 ）特性の指標（即ち、洗液から離れて汚れ／界面に集まるペルオキシ酸の能力） として用いることができる。 選択されたペルオキシ酸について（対応カルボン酸として）計算されたＨ．Ｌ ．Ｂ．値は下記表Ａで示されている。Ｈ．Ｌ．Ｂ．値を計算するために用いられ る式は ＨＬＢ＝合計（親水基数）−合計（疎水基数）＋７ として示すことができる。 親水基数の値は〔‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ ＆ ‐Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）‐＝２．１〕であ り、疎水基数の値は〔脂肪族／芳香族炭素＝０．４７５ ＆ 極性基間の脂肪族 炭素原子は炭化水素鎖中脂肪族炭素の値の１／２＝（０．４７５）／２〕である 。参考のため、Ｈ．Ｌ．Ｂ．値＞７は物質が主に水溶性であることを示し、Ｈ． Ｌ．Ｂ．値＜７は界面活性および疎水性が増加していることを示す。 前記のように、（直接加えられるかまたはその場で生成される）本発明のペル オキシ酸に関する（対応カルボン酸の）Ｈ．Ｌ．Ｂ．値の好ましい範囲は約３． ０〜約６．５の範囲内である。（直接加えられるかまたはその場で生成される） 本発明で有用なペルオキシ酸に関する（カルボン酸としての）Ｈ．Ｌ．Ｂ．値の 更に好ましい範囲は約４．０〜６．５の範囲内である。（直接加えられるかまた はその場で生成される）本発明のペルオキシ酸に関する（カルボン酸としての） Ｈ．Ｌ．Ｂ．値の最も好ましい範囲は約４．０〜約６．０の範囲内である。 （ａ）ペルオキシ酸 本発明は、有効量のプロテアーゼ酵素と、少くとも約０．１％、好ましくは約 ０．１〜約５０重量％の実質上不溶性の有機ペルオキシ酸を含む漂白系とを含ん でなる洗剤組成物にも関する。ここで有用なペルオキシ酸は、好ましくは組成物 の約０．５〜約２０、更に好ましくは約１〜約１０、最も好ましくは約２〜約７ ｗｔ％である。 好ましい有機ペルオキシ酸は、４‐ノニルアミノ‐４‐オキソペルオキシ酪酸 、６‐（ノニルアミノ）‐６‐オキソペルオキシカプロン酸、１，１２‐ジペル オキシドデカン二酸、ヘプチルスルホニルペルプロピオン酸、デシルスルホニル ペルプロピオン酸、ヘプチル‐、オクチル‐、ノニル‐、デシル‐スルホニルペ ル酪酸およびそれらの混合物からなる群より選択される。 有機ペルオキシ酸の中では、アミドペルオキシ酸（アミド置換ペルオキシカル ボン酸）が好ましい。ここで使用上適切なアミドペルオキシ酸は、双方とも引用 することにより本明細書の開示の一部とされる、各々１９８７年１月６日付およ び１９８７年８月１１日付で発行された双方ともBurnsらの米国特許第４，６３ ４，５５１号および第４，６８６，０６３号明細書で記載されている。適切なア ミドペルオキシ酸は下記式である： 上記式中Ｒ¹は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはア ルカリール基であり（好ましくは、Ｒ¹は約６〜約１２の炭素原子を有するアル キル基である）、Ｒ²は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン、アリレン またはアルカリレン基であり（好ましくは、Ｒ²は約１〜約６の炭素原子を有す るアルキレン基である）、Ｒ⁵はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を有するア ルキル、アリールまたはアルカリール基である（好ましくは、Ｒ⁵はＨである） 。更に好ましくは、Ｒ¹は約８〜約１０の炭素原子を有するアルキル基であり、 Ｒ²は約２〜約４の炭素原子を有するアルキレン基である。 引用することにより本明細書の開示の一部とされる１９８９年８月１日付で発 行されたBurnsらの米国特許第４，８５２，９８９号明細書で記載されたペルオ キシフマレートと、すべて引用することにより本明細書の開示の一部とされる、 各々１９８８年７月１９日付、１９８９年４月２５日付および１９９１年４月２ 日付で発行されたすべてDryoffらの米国特許第４，７５８，３６９号、第４，８ ２４，５９１号および第５，００４，５５８号明細書で記載されたスルホンペル オキシ酸（スルホンペルオキシカルボン酸）も、好ましく使用できる。 米国特許第４，６８６，０６３号明細書の例Ｉは、第８欄４０行目〜第９欄５ 行目のＮＡＰＳＡと、第９欄１５行目〜第９欄６５行目のＮＡＰＡＡの合成の記 載を含んでいる。アミドペルオキシ酸合成の最後に、反応は水で停止され、ロ過 され、一部過剰の硫酸（またはペルオキシ酸が作られた他の強酸）を除去するた めに水で洗浄され、再びロ過される。 こうして得られたアミドペルオキシ酸湿潤ケークは、引用することにより本明 細書の開示の一部とされる１９９０年３月２０日付で発行されたSadlowskiらの 米国特許第４，９０９，９５３号に従い、約３．５〜６、好ましくは約４〜５の ｐＨでリン酸緩衝液と接触させることができる。 貯蔵安定性または発熱コントロール用の他剤も、最終製品中への配合前にアミ ドペルオキシ酸に添加できる。例えば、引用することにより本明細書の開示の一 部とされる１９８７年８月１１日付で発行されたBurnsの米国特許第４，６８６ ，０６３号明細書で開示された発熱コントロール剤、ホウ酸は、約２：１過酸： ホウ酸比で（リン酸緩衝液で洗浄された）アミドペルオキシ酸と混合できる。リ ン酸緩衝液洗浄アミドペルオキシ酸は、適量のジピコリン酸およびピロリン酸四 ナトリウム、キレート化安定系と混合してもよい。キレート化剤は、湿潤ケーク との接触前に、場合によりリン酸緩衝液に含有させることができる。 湿潤ケークは約０．１〜約２６０ミクロン、好ましくは約１０〜約１００ミク ロン、最も好ましくは約３０〜約６０ミクロンの平均粒径の粒子から構成される ことが好ましい。小さな粒度のＮＡＰＡＡ結晶がここでは望ましい。引用するこ とにより本明細書の開示の一部とされる、１９９１年１０月８日付で発行された Gettyらの米国特許第５，０５５，２１８号明細書参照。 このＮＡＰＡＡロ過ケークは、好ましくはリン酸緩衝液で２回洗浄される。２ 連続リン酸緩衝液洗浄でＮＡＰＡＡに最良の安定性を与えることがわかった。 約３〜約１２、最も好ましくは５〜７の理論ＡｖＯ（有効酸素）を有する粒状 （固体）有機ペルオキシ酸が好ましい。 ＮＡＰＡＡがここでは使用上最も好ましい。ペルオキシアジピン酸のノニルア ミド（“ＮＡＰＡＡ”）に関するもう１つの名称は、６‐（ノニルアミノ）‐６ ‐オキソペルオキシカプロン酸である。ＮＡＰＡＡの化学式は以下である： ＮＡＰＡＡの分子量は２８７．４である。 ＮＡＰＡＡを含有した洗剤組成物および漂白組成物は、布帛の極めて有効で効 率的な表面漂白を行う。しみおよび／または汚れは布帛から除去される。これら の組成物は布帛から黒ずんだ汚れを除去する上で特に有効である。 ＮＡＰＡＡの極性アミドまたは置換アミド部分は、非常に低い蒸気圧を有し、 ひいては臭気の小さな、優れた漂白性能を有したペルオキシ酸を作る。アミド基 の極性はペルオキシ酸の蒸気圧の減少と融点の増加を起こすと考えられる。 Ｎ ＡＰＡＡは漂白剤として直接使用できる。それは洗濯適用上低い蒸気圧と良好な 臭気特性を有する。 ＮＡＰＡＡは、例えば、初めにＮＡＡＡ（アジピン酸のモノノニルアミド）、 硫酸および過酸化水素を反応させることにより製造できる。反応生成物は氷水の 添加で冷却され、その後ロ過、蒸留水洗浄、最後に湿潤ケークを回収するために 吸引ロ過される。洗浄はロ液のｐＨが中性になるまで続けることができる。 ＮＡＰＡＡ ｐＨ（水中１０％固形分）は約４．２〜４．８であることも好ま しい。意外にも、このｐＨはより熱的に安定な粒子を作る。 （ｂ）漂白系‐ブリーチ活性剤およびペルオキシゲン漂白化合物 （ｉ）ブリーチ活性剤 ここで有用な漂白系のブリーチ活性剤は、好ましくは下記構造を有する： 上記式中Ｒは約５〜約１８の炭素原子を有するアルキル基であって、カルボニル 炭素を含めてそこから伸びる最長の直鎖アルキル鎖は約６〜約１０の炭素原子を 有し、Ｌは脱離基であり、その共役酸は約４〜約１３、好ましくは約６〜約１１ 、最も好ましくは約８〜約１１の範囲内のｐＫａを有する。 Ｌは本質的にいかなる適切な脱離基であってもよい。脱離基とは、ブリーチ活 性剤でペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃の結果としてブリーチ活性剤か ら離れる基である。このペルヒドロライシス(perhydrolysis)反応では過カルボ ン酸を形成する。通常、その基が適切な脱離基であれば、それは電子吸引効果を 発揮するにちがいない。これはペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃を容易 にする。 Ｌ基は反応が最適の時間枠（例えば、洗浄サイクル）内で起きるほど十分に反 応性でなければならない。しかしながら、Ｌが反応性すぎると、この活性剤は安 定化させることが困難になる。これらの特徴は脱離基の共役酸のｐＫａと通常パ ラレルであるが、この慣例の例外が知られている。 好ましいブリーチ活性剤は下記一般式の場合である： 上記式中Ｒ¹は約６〜約１２の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ²は１〜約 ６の炭素原子を有するアルキレンであり、Ｒ⁵はＨあるいは約１〜約１０の炭素 原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリールであり、Ｌは からなる群より選択される。Ｒ⁶は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン ル、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ³は約１〜約８の炭素原子を有す るアルキル鎖であり、Ｒ⁴はＨまたはＲ³であり、ＹはＨまたは安定基である。Ｙ は好ましくは‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺、‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺、‐ＳＯ₄ ^-Ｍ⁺、（‐Ｎ⁺Ｒ′₃）Ｘおよ びＯ←Ｎ（Ｒ′₃）からなる群より選択され、ここでＲ′は約１〜約４の炭素原 子を有するアルキル鎖であり、Ｍはブリーチ活性剤に安定性を与えるカチオンで あり、Ｘはブリーチ活性剤に溶解性を与えるアニオンである。好ましくは、Ｍは アルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンであり、ナトリウ ムおよびカリウムが最も好ましく、Ｘはハライド、ヒドロキシド、メチル硫酸お よび酢酸アニオンからなる群より選択されるアニオンである。更に好ましくは、 Ｙは‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺および‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺である。溶解基を含まない脱離基のあるブ リーチ活性剤は、それらの溶解を助けるためにブリーチ溶液によく分散させるべ きであることに注意すべきである。好ましくは以下である： 上記式中Ｒ³は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ^-Ｍ⁺または‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺であり 、Ｍは前記のとおりである。 特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ¹が約６〜約１２の炭素原子を有する直鎖 アルキル鎖であり、Ｒ²が約２〜約６の炭素原子を有する直鎖アルキレン鎖であ り、Ｒ⁵がＨであり、Ｌが （上記式中Ｒ³は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺または‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺であ り、Ｍは前記のとおりである）からなる群より選択される場合である。 好ましいブリーチ活性剤は： であり、上記式中ＲはＨ、アルキル、アリールまたはアルカリールである。これ は、引用することにより本明細書の開示の一部とされるHodgeらの米国特許第４ ，９６６，７２３号明細書で記載されている。 好ましいブリーチ活性剤は： または であり、上記式中Ｒ¹はＨまたは約１〜約６の炭素原子を有するアルキル基であ り、Ｒ²は約１〜約６の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｌは前記のとおり である。 更に、好ましいブリーチ活性剤は、Ｌが一般式で定義されたとおりであり、Ｒ¹ がＨまたは約１〜約４の炭素原子を有するアルキル基である、前記一般式の場 合である。 Ｌが一般式で定義されたとおりであり、Ｒ¹がＨである前記一般式のブリーチ 活性剤が更に一層好ましい。 更に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭 素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｌが （上記式中Ｒ、Ｒ²、Ｒ³およびＹは前記のとおりである）からなる群より選択さ れる、前記一般式の場合である。 特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約１２の炭素原子を有するアルキ ル基であって、カルボニル炭素を含めてそこから伸びるアルキル鎖の最長直鎖部 分が約６〜約１０の炭素原子を有し、Ｌが （上記式中Ｒ²は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｙは‐ＳＯ₃ ^- Ｍ⁺または‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺であり、Ｍはアルカリ金属、アンモニウムまたは 置換アンモニウムカチオンである）からなる群より選択される、前記一般式の場 合である。 特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭 素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｌが （上記式中Ｒ²は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺または‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺であ り、Ｍは前記のとおりである）からなる群より選択される、前記一般式の場合で ある。 最も好ましいブリーチ活性剤は下記式を有する： 上記式中Ｒは約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭素原子を有する直鎖アルキ ル鎖であり、Ｍはナトリウムまたはカリウムである。 好ましくは、本ブリーチ活性剤はナトリウムノナノイルオキシベンゼンスルホ ネート（ＮＯＢＳ）またはナトリウムベンゾイルオキシベンゼンスルホネート（ ＢＯＢＳ）である。 更に、本発明漂白組成物で使用上特に好ましいのは、天然ゴム部分を有する機 械で使用上特に安全である下記ブリーチ活性剤である。これはこれらのアミド酸 誘導ブリーチ活性剤のペルヒドロライシス反応により油状ジアシルペルオキシド （ＤＡＰ）種を生じず、むしろ不溶性結晶固体ＤＡＰを形成する結果であると考 えられる。これらの固体物はコーティングフィルムを形成しないと考えられ、こ のため天然ゴム部分は長期間にわたりＤＡＰに暴露されない。これらの好ましい ブリーチ活性剤は下記からなる群より選択されるメンバーである： ａ）下記一般式のブリーチ活性剤： またはそれらの混合物。上記式中Ｒ¹は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキ ル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ²は約１〜約１４の炭素原子を有 するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ⁵はＨあるいは約１ 〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、 Ｌは脱離基である； ｂ）下記一般式のベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤： 上記式中Ｒ₁はＨ、アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルであ り、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール 、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＲ₆（Ｒ₆はＨ またはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同一または異 なる置換基である； ｃ）下記式のＮ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤： Ｒ⁶はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシアリ ールまたはアルカリール基である； ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）の混合物 タイプａ）の好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ¹が約６〜約１２の炭素原子を有 するアルキル基であり、Ｒ²が約１〜約８の炭素原子を有し、Ｒ⁵がＨまたはメチ ルである場合である。特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ¹が約７〜約１０の炭 素原子を有するアルキル基であり、Ｒ²が約４〜約５の炭素原子を有する、前記 一般式の場合である。 タイプｂ）の好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅がＨであり 、Ｒ₁がフェニル基である場合である。 タイプｃ）の上記Ｎ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤の好ましいアシル 部分は式Ｒ⁶‐ＣＯ‐を有し、ここでＲ⁶はＨあるいは１〜１２、好ましくは６〜 １２の炭素原子を有するアルキル、アリール、アルコキシアリールまたはアルカ リール基である。高度に好ましい態様において、Ｒ⁶はフェニル、ヘプチル、オ クチル、ノニル、２，４，４‐トリメチルペンチル、デセニルおよびそれらの混 合からなる群より選択されるメンバーである。 ‐アミド誘導ブリーチ活性剤‐本発明で用いられるタイプａ）のブリーチ活性剤 は下記一般式のアミド置換化合物： またはそれらの混合物であり、上記式中Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁵は前記のとおりであ り、Ｌは本質的にいかなる適切な脱離基であってもよい。好ましいブリーチ活性 剤は、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁵がペルオキシ酸に関して定義されたとおりであり、Ｌ が およびそれらの混合からなる群より選択され、Ｒ¹が約１〜約１４の炭素原子を 有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ³が１〜約８の炭素 原子を有するアルキル鎖であり、Ｒ⁴がＨまたはＲ³であり、ＹがＨまたは安定 基である、前記一般式の場合である。 好ましい溶解基‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺、‐ＣＯ₂ ^-Ｍ⁺、‐ＳＯ₄ ^-Ｍ⁺、‐Ｎ⁺（Ｒ³）₄Ｘ^- およびＯ←Ｎ（Ｒ³）₃、最も好ましくは‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺および‐ＣＯ₂ ^-Ｍ⁺であり、 ここでＲ³は約１〜約４の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｍはブリーチ活 性剤に安定性を与えるカチオンであり、Ｘはブリーチ活性剤に溶解性を与えるア ニオンである。好ましくは、Ｍはアルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモ ニウムカチオンであり、ナトリウムおよびカリウムが最も好ましく、Ｘはハライ ド、ヒドロキシド、メチル硫酸および酢酸アニオンである。溶解基を含まない脱 離基のあるブリーチ活性剤は、それらの溶解を助けるためにブリーチ溶液によく 分散させるべきであることに注意すべきである。 好ましいブリーチ活性剤は、Ｌが （上記式中Ｒ³は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ₃ ^-Ｍ⁺または‐ＣＯＯ^-Ｍ⁺であ り、Ｍは前記のとおりである）からなる群より選択される、前記一般式の場合で ある。 タイプｂ）およびタイプｃ）の場合を含めてブリーチ活性剤のもう１つの重要 なクラスでは、環式環のカルボニル炭素でペルヒドロキシドアニオンによる求核 攻撃の結果として、開環によりここで記載されたような有機ペルオキシ酸を生じ る。例えば、タイプｃ）活性剤の開環反応では過酸化水素またはそのアニオンに よりカプロラクタム環カルボニルで攻撃する。過酸化水素またはそのアニオンに よるアシルカプロラクタムの攻撃が好ましくは環外カルボニルで起きるため、開 環の重要なフラクションを得るには触媒を要するかもしれない。開環ブリーチ活 性剤のもう１つの例は、１９９０年１０月３０日付で発行されたHodgeらの米国 特許第４，９６６，７２３号明細書で開示されたようなタイプｂ）活性剤でみら れる。 ‐ベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤‐Hodgeにより開示されたこのような 活性剤化合物には、下記式を有するベンゾオキサジンタイプ： と、下記タイプの置換ベンゾオキサジン： （上記式中Ｒ₁はＨ）アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルで あり、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリー ル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＲ₆（Ｒ₆は Ｈまたはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同一または 異なる置換基である）を含めた活性剤がある。 ベンゾオキサジンタイプの好ましい活性剤は以下である： 活性剤が用いられるとき、最良の表面漂白性能は、溶液のｐＨがペルヒドロラ イシス反応を促進するために約８．５〜１０．５、好ましくは９．５〜１０．５ である洗浄溶液で得られる。このようなｐＨは、本漂白系の任意成分である、緩 衝剤として普通知られる物質で得られる。 ‐Ｎ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤‐本発明で用いられるタイプｃ）の Ｎ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤は下記式を有する： Ｒ⁶はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシアリ ールまたはアルカリール基である。Ｒ⁶部分が少くとも約６、好ましくは６〜約 １２の炭素原子を有するカプロラクタム活性剤は、前記のような求核およびボデ ィ汚れクリーンアップを示す疎水性漂白を行う。Ｒ⁶が１〜約６の炭素原子を有 するカプロラクタム活性剤は、飲料しみを漂白する上で特に効果的である親水性 漂白種を供する。典型的には１：５〜５：１、好ましくは１：１の重量比にある 疎水性および親水性カプロラクタムの混合物が、混合しみ除去効果のためにここ で用いることができる。 高度に好ましいＮ‐アシルカプロラクタムはベンゾイルカプロラクタム、オク タノイルカプロラクタム、ノナノイルカプロラクタム、３，５，５‐トリメチル ヘキサノイルカプロラクタム、デカノイルカプロラクタム、ウンデセノイルカプ ロラクタムおよびそれらの混合物からなる群より選択される。Ｎ‐アシルカプロ ラクタムの製造方法は当業界で周知である。 米国特許第４，５４５，７８４号明細書の開示とは逆に、ブリーチ活性剤はペ ルオキシゲン漂白化合物に吸収されないことが好ましい。他の有機洗浄成分の存 在下でそうすることは、安全性問題を引き起こすことがある。 タイプａ）、ｂ）またはｃ）のブリーチ活性剤は、漂白系または洗剤組成物の 少くとも０．１重量％、好ましくは約０．１〜約５０％、更に好ましくは約１〜 約３０％、最も好ましくは約３〜約２５％である。 ここで好ましいアミド誘導およびカプロラクタムブリーチ活性剤は、典型的に は１：５〜５：１、好ましくは約１：１の範囲内にあるアミド誘導またはカプロ ラクタム活性剤：ＴＡＥＤの重量比で、ＴＡＥＤのようなゴム安全性、酵素安全 性、親水性活性剤と併用することもできる。 通常漂白メカニズム、特に表面漂白メカニズムは、完全には理解されていない 。しかしながら、ブリーチ活性剤はペルオキシゲンブリーチにより放出される過 酸化水素から生じるペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃をうけて、ペルオ キシカルボン酸を形成すると通常考えられる。この反応はペルヒドロライシスと 通常称される。 活性剤が用いられるとき、最良の表面漂白性能は、溶液のｐＨがペルヒドロラ イシス反応を促進するために約８．５〜１０．５、好ましくは９．５〜１０．５ である洗浄溶液で得られる。このようなｐＨは、本漂白系の任意成分である、緩 衝剤として普通知られる物質で得られる。 （ii）ペルオキシゲン漂白化合物 ここで有用なペルオキシゲン漂白系は、水性液中で過酸化水素を生成できるも のである。これらの化合物は当業界で周知であり、それには過酸化水素と、アル カリ金属ペルオキシド、有機ペルオキシド漂白化合物、例えば過酸化尿素、およ び無機過酸塩漂白化合物、例えば過ホウ酸、過炭酸、過リン酸アルカリ金属など がある。２種以上のこのような漂白化合物の混合物も所望であれば使用できる。 好ましいペルオキシゲン漂白化合物には、一、三および四水和物の形で市販さ れている過ホウ酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムペルオキシ水和物、尿素ペ ルオキシ水和物、過炭酸ナトリウムおよび過酸化ナトリウムがある。過ホウ酸ナ トリウム四水和物、過ホウ酸ナトリウム一水和物および過炭酸ナトリウムが特に 好ましい。貯蔵中非常に安定で、しかも漂白液に非常に速やかに溶解することか ら、過炭酸塩が特に好ましい。このように速やかな溶解はより高レベルの過カル ボン酸を形成し、こうして表面漂白性能を高めると考えられる。 高度に好ましい過炭酸塩は非コート形でもまたはコートされた形でもよい。非 コート過炭酸塩の平均粒度は約４００〜約１２００ミクロン、最も好ましくは約 ４００〜約６００ミクロンの範囲内である。コートされた過炭酸塩が用いられる とき、好ましいコーティング物質にはカーボネート、サルフェート、シリケート 、ボロシリケートまたは脂肪カルボン酸の混合物がある。 ペルオキシゲン漂白化合物は、漂白系または洗剤組成物の少くとも０．１重量 ％、好ましくは約１〜約７５％、更に好ましくは約３〜約４０％、最も好ましく は約３〜約２５％である。 漂白系中におけるブリーチ活性剤対ペルオキシゲン漂白化合物の重量比は、典 型的には約２：１〜１：５の範囲内である、好ましい比率は約１：１〜約１：３ の範囲内である。 ペルオキシゲン漂白化合物により生成される過酸化水素対ブリーチ活性剤のモ ル比は約１．０以上、更に好ましくは約１．５以上、最も好ましくは約２．０〜 約１０である。好ましくは、本漂白組成物は約０．５〜約２０、最も好ましくは 約１〜約１０ｗｔ％のペルオキシゲン漂白化合物を含む。 本ブリーチ活性剤／漂白化合物系はそれ自体ブリーチとして有用である。しか しながら、このような漂白系は界面活性剤、ビルダーなどのような様々な洗浄助 剤を含むことができる組成物で特に有用である。 （２）プロテアーゼ酵素： 本発明には、変種のアミノ酸配列が誘導されている前駆カルボニルヒドロラー ゼと比較して、異なるタンパク質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロフィ ルおよび／または性能特徴を有した、非天然カルボニルヒドロラーゼ変種である プロテアーゼ酵素を含む。前駆カルボニルヒドロラーゼは天然カルボニルヒドロ ラーゼでもまたは組換えヒドロラーゼであってもよい。特に、このようなカルボ ニルヒドロラーゼ変種は天然でみられないアミノ酸配列を有しており、異なるア ミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの「複数アミノ酸残基」の置換により 誘導されている。前駆酵素の「複数アミノ酸残基」は＋７６位と、下記残基：＋ ９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５ 、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、 ＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋ ２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、 その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカ ルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン、例えばBacillus lentusズブチリシ ンの相当アミノ酸残基に対応する。 本発明組成物において有用なプロテアーゼ酵素であるカルボニルヒドロラーゼ 変種は、アミノ酸残基＋７６位の置換を１以上の追加の修飾と共に有する。好ま しくは、本発明で有用な変種プロテアーゼ酵素は下記組合せ：76/99; 76/101; 7 6/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/1 03; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/10 1/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/ 104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123 ; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103 /104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210 ; 76/103/104/126/265および／または76/103/104/222でアミノ酸残基の置換、欠 失または挿入を有する。最も好ましくは、本発明で有用な変種酵素は残基の下記 組合せ：Ｂ．amyloliquefaciensズブチリシンの76/99; 76/104; 76/99/104; 76/ 103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104および76/101/ 104でアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。 このようなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン変種をコードする変種 ＤＮＡ配列は、天然または組換え前駆酵素をコードする前駆ＤＮＡ配列から誘導 される。変種ＤＮＡ配列は、Bacillus amyloliquefaciensにおいて７６、９９、 １０１、１０３、１０４、１０７、１２３、２７、１０５、１０９、１２６、１ ２８、１３５、１５６、１６６、１９５、１９７、２０４、２０６、２１０、２ １６、２１７、２１８、２２２、２６０、２６５および／または２７４位あるい はそのいずれかの組合せに相当する前駆ＤＮＡ配列によりコードされる１以上の 特定アミノ酸残基の置換についてコードするように前駆ＤＮＡ配列を修飾するこ とにより誘導される。ここで修飾について特定されたアミノ酸残基は（すべての ズブチリシンで残基位置を特定する上で常法になった）Ｂ．amyloliquefaciens に適用しうる番号付けに従い特定されているが、本発明において有用な好ましい 前駆ＤＮＡ配列は図６で示されたようなBacillus lentusのＤＮＡ配列である（S eq.ID No.11）。 これらの変種ＤＮＡ配列は、１以上の追加の修飾と共にアミノ酸残基７６の挿 入または置換をコードしている。好ましくは、変種ＤＮＡ配列は下記組合せ：76 /99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99 /104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107 /123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/10 3/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/1 01/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/1 04/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または76/103/104/222でアミノ酸 残基の置換または挿入についてコードしている。最も好ましくは、変種ＤＮＡ配 列は残基の下記組合せ：76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107 ; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104および76/101/104の修飾についてコード している。これらの組換えＤＮＡ配列は、一般的に前駆カルボニルヒドロラーゼ ＤＮＡ配列によりコードされる酵素の同性質とは実質的に異なる少くとも１つの 性質と、新規アミノ酸配列を有する、カルボニルヒドロラーゼ変種をコードして いる。このような性質にはタンパク質分解活性、基質特異性、安定性、変化した ｐＨプロフィルおよび／または向上した性能特徴が含まれる。 有用なプロテアーゼ酵素は、表示されたアミノ酸残基位置で１９種天然Ｌ‐ア ミノ酸のうちいずれかの置換を有している。このような置換はいかなる前駆ズブ チリシン（原核、真核、哺乳動物など）でも行える。この出願全般にわたり、共 通１および３文字コードで様々なアミノ酸について表している。このようなコー ドはDale,J.W.(1989),Molecular Genetics of Bacteria,John Wiley & Sons,Ltd .,Appendix Bと同じである。 好ましくは、特定アミノ酸残基位置の各々で行われる置換には、７６位におけ るＤ、Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｋ、ＰおよびＮを含めた置換；９９位におけるＤ、Ｔ、 Ｎ、Ｑ、ＧおよびＳを含めた置換；１０１位におけるＧ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、Ｅ、 ＳおよびＲを含めた置換；１０３位におけるＱ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、 ＳおよびＡを含めた置換；１０４位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換 ；１０７位におけるＶ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｔ、Ｓ、Ａ、ＮおよびＩを含 めた置換；１２３位におけるＮ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＳを含めた置換；２ ７位におけるＫ、Ｎ、Ｃ、ＶおよびＴを含めた置換；１０５位におけるＡ、Ｄ、 Ｇ、ＲおよびＮを含めた置換；１０７位におけるＡ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、 ＳおよびＡを含めた置換；１０９位におけるＳ、Ｋ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤを含め た置換；１２６位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＧを含めた置換；１２８位にお けるＧ、ＬおよびＡを含めた置換；１３５位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＳおよびＶを 含めた置換；１５６位におけるＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＱおよびＫを含めた置換；１６ ６位 における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；１９５位におけるＥを含めた置換 ；１９７位におけるＥを含めた置換；２０４位におけるＡ、Ｇ、Ｃ、ＳおよびＤ を含めた置換；２０６位におけるＬ、Ｙ、Ｎ、ＤおよびＥを含めた置換；２１０ 位におけるＬ、Ｉ、Ｓ、ＣおよびＦを含めた置換；２１６位におけるＶ、Ｅ、Ｔ およびＫを含めた置換；２１７位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換； ２１８位におけるＳ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＶを含めた置換；２２２位における全１ ９種天然アミノ酸を含めた置換；２６０位におけるＰ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋ およびＤを含めた置換；２６５位におけるＮ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ，Ｋ、ＹおよびＨ を含めた置換；２７４位におけるＡおよびＳを含めた置換があるが、これらに制 限されない。このような各位置で置換される特に好ましいアミノ酸は下記表Ｉで 表示されている。特定のアミノ酸が表Ｉで示されているが、いかなるアミノ酸も 特定残基で置き換わっていてよいことが理解されるべきである。 Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６に相当するアミノ酸残基に おいてＢ．lentusズブチリシンにおいてインビトロ変異を有するこれらのプロテ アーゼ酵素は、前駆ズブチリシンにはない変化した安定性（例えば、修正された 自己タンパク質分解安定性）を示すズブチリシン変種を生じる（表IVおよびVI参 照）。しかも、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおいて＋９９、＋１ ０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９ 、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、 ＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋ ２６０、＋２６５および／または＋２７４に相当する残基のインビトロ変異は、 単独でまたは互いの組合せで、＋７６変異と一緒になって、変化したタンパク質 分解活性、変化した熱安定性、変化したｐＨプロフィル、変化した基質特異性お よび／または変化した性能特徴を示すズブチリシン変種を生じる。 カルボニルヒドロラーゼはＣ（Ｏ）‐Ｘ結合（ここで、Ｘは酸素または窒素で ある）を有した化合物を加水分解するプロテアーゼ酵素である。それらには天然 カルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼがある。天然カル ボニルヒドロラーゼには主としてヒドロラーゼ、例えばズブチリシンまたはメタ ロプロテアーゼのようなペプチドヒドロラーゼがある。ペプチドヒドロラーゼと してはα‐アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラー ゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボ キシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよ びメタロプロテイナーゼがある。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアー ゼと、エンドおよびエキソプロテアーゼが含まれる。 “組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは、天然カルボニルヒドロラーゼをコー ドするＤＮＡ配列がカルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の 置換、挿入または欠失についてコードする変異ＤＮＡ配列を生じるように修飾さ れてなる、カルボニルヒドロラーゼに関する。適切な修飾法は本明細書、ならび に米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０ ４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明細書に開示されており、 それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 ズブチリシンは、タンパク質またはペプチドのペプチド結合を開裂するように 通常作用する細菌または真菌カルボニルヒドロラーゼである。ここで用いられる “ズブチリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブチリシンを意味する。 天然ズブチリシンのシリーズは様々な微生物種により産生されて、しばしば分泌 されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は完全に相 同的ではない。しかしながら、このシリーズのズブチリシンは同一または類似タ イプのタンパク質分解活性を示す。このセリンプロテアーゼは、それらとキモト リプシン関連クラスのセリンプロテアーゼとを区別する触媒三残基(catalytic t riad)を規定する共通アミノ酸配列を有している。ズブチリシンおよびキモトリ プシン関連セリンプロテアーゼの双方はアスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリ ンからなる触媒三残基を有している。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、 これらアミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端にかけて読取ると、ア スパラギン酸‐ヒスチジン‐セリンである。しかしながら、キモトリプシン関連 プロテアーゼでは、相対順序がヒスチジン‐アスパラギン酸‐セリンである。こ のため、本ズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの触媒三残基を有する セリンプロテアーゼを意味する。実施例には図３において特定されたズブチリシ ンを示すが、本発明はそれに限定されない。 “組換えズブチリシン”とは、ズブチリシンをコードするＤＮＡ配列が天然ズ ブチリシンアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入についてコ ードする変種（または変異）ＤＮＡ配列を生じるように修飾されたズブチリシン を意味する。このような修飾を生じて、本明細書に開示されたものと組み合わせ てもよい適切な方法には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６ ）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明 細書に開示されものがある。 “非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびそれらについてコードするＤＮＡは 、多くの原核および真核生物から得られる。原核生物の適切な例には、E.coliま たはPseudomonasのようなグラム陰性生物と、MicrococcusまたはBacillusのよう なグラム陽性細菌がある。カルボニルヒドロラーゼおよびそれらの遺伝子が得ら れる真核生物の例には、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母、Aspergillus sp．のような真菌と、非ヒト哺乳動物源、例えばカルボニルヒドロラーゼキモシ ンついてコードする遺伝子が得られるウシsp．がある。ズブチリシンの場合のよ うに、カルボニルヒドロラーゼシリーズは、そのシリーズのメンバー間で完全に 相同的ではないアミノ酸配列を有するが、それでもなお同一または類似タイプの 生物活性を示す、様々な関連種から得られる。このため、ここで用いられるよう な非ヒトカルボニルヒドロラーゼは、原核および真核源と直接または間接的に関 連したカルボニルヒドロラーゼに関する機能的規定を有する。 “カルボニルヒドロラーゼ変種”は、“前駆カルボニルヒドロラーゼ”のアミ ノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼ （例えばズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）およ び組換えカルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）がある。カルボニルヒドロラ ーゼ変種のアミノ酸配列は、前駆アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失 または挿入により、前駆ヒドロラーゼアミノ酸配列から“誘導”される。このよ うな修飾は、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）酵素自体の操作より もむしろ、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）のアミノ酸配列につい てコードする“前駆ＤＮＡ配列”に関するものである。前駆ＤＮＡ配列のこのよ うな操作に適した方法にはここで開示された方法と、当業者に公知の方法がある （例えば、ＥＰ Ｏ ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９とそこで既に参照さ れた米国特許および出願参照）。 Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６位と、下記位置：＋９９、 ＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１ ０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９ ７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２ 、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当する特定残 基がここでは変異のために特定されている。好ましくは、修飾される残基は下記 組合せ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/ 103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/1 23; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/ 104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/12 3; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265 ; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103 /104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または76/103/104/222 、最も好ましくは76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 6/104/107; 76/101/ 103/104; 76/99/101/103/104および76/101/104から選択される。これらのアミ ノ酸位置番号は、図１で表された成熟Bacillus amyloliquelaciensズブチリシン 配列に当てはめられた場合に関する。しかしながら、本発明において有用なプロ テアーゼ酵素はこの具体的ズブチリシンの変異に制限されず、Bacillus amyloli quefaciensズブチリシンの具体的な特定残基に“相当”する位置でアミノ酸残基 を有する前駆カルボニルヒドロラーゼにもおよぶ。好ましくは、前駆ズブチリシ ンはBacillus lentusズブチリシンであり、置換、欠失または挿入は上記場合に 対応するＢ．lentusの相当アミノ酸残基で行われる。 前駆カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、それが相同的である（即 ち、一次または三次構造の位置に対応する）ならばBacillus amyloliquefaciens ズブチリシンの残基に対応するか、あるいはBacillus amyloliquefaciensズブチ リシンにおける特定残基またはその残基の一部と類似している（即ち、化学的に 化合、反応または相互作用する上で同一または類似した機能的能力を有する）。 一次構造とのホモロジーを確立するために、前駆カルボニルヒドロラーゼのア ミノ酸配列はBacillus amyloliquefaciensズブチリシン一次配列、特に配列が公 知であるズブチリシンにおいて非変種であることが知られた一連の残基と直接比 較される。図２はamyloliquefaciensズブチリシンとＢ．lentusズブチリシンと の間における保存残基について示している。保存残基を並べて、並びを維持する （即ち、予定にない欠失および挿入による保存残基の除去を避ける）ために必要 な挿入および欠失を行った後、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの一次 配列にある特定アミノ酸に相当する残基が明らかにされる。保存残基の並びは、 好ましくはこのような残基の１００％を保存しているべきである。しかしながら 、保存残基の７５％以上または５０％もの少ない並びでも、相当残基を明らかに する上で十分である。触媒三残基Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存 は維持されているべきである。 例えば、図３において、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtillis、 Bacillus licheniformis(carisbergensis)およびBacillus lentusのズブチリシ ンのアミノ酸配列はアミノ酸配列間で最大のホモロジー量を与えるように並べら れている。これら配列の比較では、各配列に多くの保存残基が含まれていること を示している。これらの保存残基（ＢＰＮ′およびＢ．lentus間）は図２で特定 されている。 このため、これらの保存残基は、Bacillus lentusのズブチリシン（１９８９ 年７月１３日付で公開されたＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０６２７９）、ここで 好ましいズブチリシン前駆酵素、または好ましいBacillus lentusズブチリシン と高度に相同的であるＰＢ９２として称されるズブチリシン（ＥＰ Ｏ ３２８ ２９９）のような他のカルボニルヒドロラーゼで、Bacillus amyloilquefaciens ズブチリシンの対応する相当アミノ酸残基を明らかにするために用いられる。こ れらズブチリシンのうちあるもののアミノ酸配列が、保存残基の最大ホモロジー を生じるBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの配列と共に、図３Ａおよび ３Ｂで並べられている。みられるように、Bacillus amyloliquefaciensズブチリ シンと比較してBacillus lentusの配列にいくつかの欠失がある。このため、例 えば、他のズブチリシンにおいてBacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＶ ａｌ１６５に相当するアミノ酸は、Ｂ．lentusおよびＢ．licheniformisの場合 にイソロイシンである。 このため、例えば、＋７６位のアミノ酸はＢ．amyloliquefaciensおよびＢ．l entusズブチリシン双方でアスパラギン（Ｎ）である。しかしながら、本発明で 有用な好ましいズブチリシン変種において、Bacillus amyloliquefaciensズブチ リシンで＋７６に相当するアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。 ここで置換について特定されたすべてのアミノ酸残基vs.このような各位置で好 ましい置換の比較は、説明目的で表IIに示されている。 相当残基は、三次構造がＸ線結晶学で決定された前駆カルボニルヒドロラーゼ の三次構造レベルでホモロジーを調べることにより明らかにしてもよい。相当残 基は、前駆カルボニルヒドロラーゼおよびBacillus amyloliquefaciensズブチリ シンの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣ、お よびＯとＯ）の原子座標が並べた後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内 である場合として明らかにされる。ベストモデルがBacillus amyloliquefaciens ズブチリシンに対して問題のカルボニルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の 原子座標の最大オーバーラップを与えるように配向および配置された後で、並び が実現される。ベストモデルは利用できる最高解像能で実験回折データについて 最低Ｒ因子を与える結晶学モデルである。 Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基と機能的に類似した相当 残基とは、それらがBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基に限ら れかつ属するやり方でタンパク質構造、基質結合性または触媒作用を変更、修飾 またはそれに寄与するようなコンホメーションをとる前駆カルボニルヒドロラー ゼのアミノ酸として規定される。更に、それらは、所定残基の主鎖原子が相同位 置を占めることに基づく一致性の基準を満たさないが、残基の側鎖原子の少くと も２つの原子座標がBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応側鎖原子の ０．１３ｎｍ内に存在する程度まで類似した位置を占める（三次構造がＸ線結晶 学で得られた）前駆カルボニルヒドロラーゼの残基である。Bacillus amyloliqu efaciensズブチリシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開Ｎｏ．０ ２５１ ４４ ６（米国特許出願第０８／２１２，２９１号に相当する、その開示は引用するこ とにより本明細書の開示の一部とされる）に示され、三次構造のレベルで相当残 基を決めるために上記のように使用できる。 置換、挿入または欠失について特定された残基の一部は保存残基であるが、そ の他はそうでない。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天 然でみられるものに相当しないアミノ酸配列を有する変種を生じる置換に限定さ れる。保存残基の場合、このような置換は天然配列で起こらないはずである。本 発明で有用なカルボニルヒドロラーゼ変種には、カルボニルヒドロラーゼ変種の 成熟形とこのようなヒドロラーゼ変種のプロおよびプレプロ形がある。プレプロ 形は、これがカルボニルヒドロラーゼ変種の発現、分泌および成熟を促進するこ とから、好ましい構造である。 “プロ配列”とは、除去されたときにカルボニルヒドロラーゼの“成熟”形を 出現させる、カルボニルヒドロラーゼの成熟形のＮ末端部分に結合されたアミノ 酸の配列に関する。多くのタンパク質分解酵素が翻訳プロ酵素産物として天然で みられ、翻訳後プロセッシングがないとこのまま発現される。カルボニルヒドロ ラーゼ変種、特にズブチリシン変種を生じる好ましいプロ配列はBacillus amylo liquefaciensズブチリシンの推定プロ配列であるが、他のズブチリシンプロ配列 も用いてよい。例では、Bacillus lentus（ＡＴＣＣ ２１５３６）のズブチリ シンの推定プロ配列が用いられる。 “シグナル配列”または“プロ配列”とは、カルボニルヒドロラーゼのＮ末端 部分、あるいはヒドロラーゼの成熟またはプロ形の分泌に関与するプロヒドロラ ーゼのＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。シグナル配列のこの定 義は機能的なもので、天然条件下でズブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラ ーゼの分泌の実施に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌性カルボニルヒ ドロラーゼのＮ末端部分によりコードされるすべてのアミノ酸配列を含めた意味 である。本発明で有用なプロテアーゼ酵素は、ここで記載されたカルボニルヒド ロラーゼ変種の分泌を行うためにこのような配列を利用する。例で用いられる好 ましいシグナル配列は、Bacillus lentus（ＡＴＣＣ ２１５３６）ズブチリシ ンのシグナル配列の残部に融合されたBacillus amyloliquefaciensズブチリシン からのシグナル配列の初めの７アミノ酸残基を含んでなる。 カルボニルヒドロラーゼ変種の“プレプロ”形は、ヒドロラーゼのアミノ末端 に作動的に結合されたプロ配列と、プロ配列のアミノ末端に作動的に結合された “プレ”または“シグナル”配列とを有する、ヒドロラーゼの成熟形からなる。 “発現ベクター”とは、適切な宿主でＤＮＡの発現を行える適切な制御配列に 作動的に結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ組立体に関する。このような制御配 列には、転写を行うプロモーター、このような転写を制御する任意オペレーター 配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位についてコードする配列と、転写およ び翻訳の終結を制御する配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒 子または単純な可能ゲノムインサートである。適切な宿主に形質転換されると、 ベクターは宿主ゲノムから独立して複製および機能するか、あるいは一部の場合 にはゲノム自体の中に組み込まれる。本明細書において、“プラスミド”および “ベクター”は時々互換的に用いられるが、プラスミドが現在最も常用される形 のベクターである。しかしながら、相当する機能を発揮して、当業界で知られる かまたは知られるようになった、このような他の形の発現ベクターもここに含ま れる。 本発明で用いられる“宿主細胞”は、通常それらを酵素的に活性なエンドプロ テアーゼを分泌できないようにするために、好ましくは米国特許第４，７６０， ０２５号（ＲＥ３４，６０６）で開示された方法により操作された原核または真 核宿主である。ズブチリシンを発現させる上で好ましい宿主細胞は、酵素的に活 性な天然プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くBaci llus株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の作成は米国特許第５，２６４，３ ６６号明細書で詳細に記載されている。ズブチリシンを発現させる上で他の宿主 細胞には、Bacillus subtilis １１６８（米国特許第４，７６０，０２５号（Ｒ Ｅ３４，６０６）および米国特許第５，２６４，３６６号明細書でも記載されて おり、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）とＢ ．licheniformis、Ｂ．lentusなどのようないずれか適切なBacillus株がある。 宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて作成されたベクターで形質転換またはト ランスフェクトされる。このような形質転換された宿主細胞は、カルボニルヒド ロラーゼ変種をコードするかまたは望ましいカルボニルヒドロラーゼ変種を発現 するベクターを複製することができる。カルボニルヒドロラーゼ変種のプレおよ びプレプロ形をコードするベクターの場合、このような変種は発現されると、典 型的には宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌される。 “作動的に結合された”とは、２つのＤＮＡ領域間の関係について表すとき、 それらが互いに機能的に関連していることを単純に意味する。例えば、プレ配列 は、それがシグナル配列として機能して、タンパク質の成熟形の分泌に関与し、 おそらくシグナル配列を開裂させるならば、ペプチドに作動的に結合されている 。プロモーターはそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動的に結合 されており、リボソーム結合部位はそれが翻訳を行えるように配置されているな らばコード配列に作動的に結合されている。 天然前駆カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子は、当業者に知られる一 般的方法に従い得られる。その方法では通常関心あるヒドロラーゼの領域をコー ドする推定配列を有した標識プローブを合成し、ヒドロラーゼを発現する生物か らゲノムライブラリーを作り、プローブとのハイブリッド形成により目的の遺伝 子についてライブラリーをスクリーニングする。次いで、陽性ハイブリッド形成 クローンの酵素地図が作成され、配列決定される。例で用いられるＢ．lentus遺 伝子は米国特許第５，１８５，２５８号明細書の例１で記載されたようにクロー ニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。例 で用いられるＢＰＮ′遺伝子はＲＥ３４，６０６明細書の例１で記載されたよう にクローニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とさ れる。 次いで、クローン化カルボニルヒドロラーゼが宿主細胞を形質転換してヒドロ ラーゼを発現させるために用いられる。次いでヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数 プラスミドに結合される。このプラスミドは、それがプラスミド複製に必要な周 知要素：即ち問題の遺伝子に作動的に結合されたプロモーター（それが宿主によ り認識、即ち転写されるならば、遺伝子自体の相同的プロモーターとして供給さ れる）、外来性であるかまたはヒドロラーゼ遺伝子の内在ターミネーター領域に より供給される（ある真核宿主細胞のヒドロラーゼ遺伝子から宿主で転写された ｍＲＮＡの安定性にとり必要な）転写終結およびポリアデニル化領域と、望まし くは抗生物質含有培地中の増殖でプラスミド感染宿主細胞の連続培養維持を行え る抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含んでいるという意味で、宿主で複 製される。高コピー数プラスミドは宿主用の複製起点も含み、それにより染色体 制限なしに細胞質で多数のプラスミドを生成させることができる。しかしながら 、ヒドロラーゼ遺伝子の多数コピーを宿主ゲノム中に組込むことも範囲内とされ る。これは、特に相同的組換えを受けやすい原核および真核生物で容易化される 。 本例で用いられる遺伝子は天然Ｂ．lentus遺伝子および天然Ｂ．amyloliquefa ciens遺伝子である。一方、天然または変異前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブ チリシン）をコードする合成遺伝子も作成してよい。このようなアプローチで、 前駆ヒドロラーゼ（ズブチリシン）のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が決定 される。その後多数の重複合成一本鎖ＤＮＡ断片が合成され、ハイブリッド形成 および結合により前駆ヒドロラーゼをコードする合成ＤＮＡを生じる。合成遺伝 子作成例は米国特許第５，２０４，０１５号明細書の例３で示され、その開示は 引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 天然または合成前駆カルボニルヒドロラーゼ遺伝子がクローニングされると、 いくつかの修飾が天然前駆カルボニルヒドロラーゼの合成以外にも遺伝子の使用 を高めるために行われる。このような修飾には、米国特許第４，７６０，０２５ 号（ＲＥ３４，６０６）およびＥＰＯ公開第０ ２５１ ４４６号明細書で開示 されたような組換えカルボニルヒドロラーゼの産生と、ここで記載されたカルボ ニルヒドロラーゼ変種の産生がある。 下記カセット変異誘発法も本発明において有用なカルボニルヒドロラーゼ変種 の作成および同定を容易にするために用いられるが、部位特異的変異誘発を含め た他の方法も用いてよい。最初に、ヒドロラーゼをコードする天然遺伝子が得ら れ、全部または一部が配列決定される。次いで配列がコードされた酵素で１以上 のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を行うことが望まれる箇所について 操作される。この箇所に隣接する配列は、発現されたときに様々な変異体をコー ドするオリゴヌクレオチドプールで遺伝子の短いセグメントを置換するための制 限部位の存在について評価される。このような制限部位は、好ましくは遺伝子セ グメントの置換を容易にするためにヒドロラーゼ遺伝子内で独特な部位である。 しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子で過度に重複していない好都合な制限部位は いずれも用いうるが、但し制限切断で作られた遺伝子断片は適正な配列で再アセ ンブリーできねばならない。制限部位が選択された箇所から好都合な距離内の位 置（１０〜１５ヌクレオチド）に存在しないならば、このような部位は読取枠だ けでなくコードされたアミノ酸も最終作成で変わらないように遺伝子でヌクレオ チドを置換させることにより作成される。その配列を変えて望ましい配列にする ための遺伝子の変異は、通常知られる方法に従いＭ１３プライマー伸長により行 われる。適切な隣接領域を配置して、２つの好都合な制限部位配列にするために 必要な変化を評価する作業は、遺伝子コードの重複性、遺伝子の制限酵素地図お よび多数の異なる制限酵素によりルーチン化される。好都合な隣接制限部位が利 用しうるならば、上記方法は部位を含まない隣接領域だけと併用される必要があ ることに注意せよ。 天然ＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローニングされると、変異される位置に隣接 した制限部位は同族制限酵素で切断され、複数の末端相補オリゴヌクレオチドカ セットがその遺伝子に結合される。変異誘発は、すべてのオリゴヌクレオチドが 同様の制限部位を有するように合成できて、合成リンカーが制限部位を作成する 上で不要であるため、この方法により簡易化される。 ここで用いられるタンパク質分解活性は、活性酵素ｍｇ当たりのペプチド結合 の加水分解速度として規定される。多くの周知操作がタンパク質分解活性を測定 するために存在する（K.M.Kalisz,″Microbial Proteinases″,Advances in Bio chemical Engineering/Biotechnology,A.Fiechter ed.,1988）。修正タンパク質 分解活性に加えてまたは代えて、本発明の変種酵素はＫ_m、Ｋ_cat、Ｋ_cat／Ｋ_m比 および／または修正基質特異性および／または修正ｐＨ活性プロフィルのような 他の修正された性質を有していてもよい。これらの酵素は、例えば洗濯用途のよ うな加水分解プロセスで存在することが予想される特定基質用に作ることができ る。 １つの目的は前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して変化したタンパク質分解 活性を有する変種カルボニルヒドロラーゼを得ることであり、そうすればこのよ うな活性を（数値的に大きく）増加させて標的基質で更に効率的に作用するよう に酵素を使用できるようになるからである。前駆体と比較して変化した熱安定性 および／または変化した基質特異性を有する変種酵素にも興味ある。好ましくは 、 変異されるカルボニルヒドロラーゼはズブチリシンである。Bacillus amyloliqu efaciensズブチリシンの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１ ０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５ 、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、 ＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または ＋２７４あるいはそれらいずれかの組合せに相当する残基においてズブチリシン タイプカルボニルヒドロラーゼでこのような結果を得るために有用な特定のアミ ノ酸が例で示されている。一部の場合には、低いタンパク質分解活性が望ましい 。逆に、一部の場合には、前駆体よりも変種酵素のタンパク質分解活性を増加さ せることが望まれる。加えて、アルカリまたは熱安定性であろうと、変種の安定 性の増加または減少（変更）が望まれる。Ｋ_cat、Ｋ_mまたはＫ_cat／Ｋ_mの増加ま たは減少は、これらの動力学的パラメーターを決定するために用いられる基質に 特異的である。 しかも、ズブチリシンでいくつか他の修飾と共に＋７６位に相当する残基は酵 素の全体的安定性および／またはタンパク質分解活性を調節する上で重要なこと がわかった。このため、例で示されたように、相当する＋７６位におけるBacill us lentusズブチリシンのアスパラギン（Ｎ）は、得られる変異酵素で高い安定 性および／または高い活性を生じるように、下記アミノ酸残基＋９９、＋１０１ 、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋ １２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２ ０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６ ０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上の修飾と共に、好ましいプロ テアーゼ酵素でアスパラギン酸（Ｄ）により置換することができる。 本発明で有用な最も好ましいプロテアーゼ酵素は例で示されている。これらに は置換残基の下記特定組合せ：N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N7 6D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A /V104Iがある。これらの置換は好ましくはBacillus lentus（組換えまたは天然 型）ズブチリシンで行われるが、置換はいかなるBacillusズブチリシンで行って もよい。 このおよび他の変種ズブチリシンで得られた結果に基づくと、Bacillus amylo liquefaciensの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋ １２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５ ６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６ 、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４ 位に相当するカルボニルヒドロラーゼ（好ましくは、ズブチリシン）の残基が、 これら酵素のタンパク質分解活性、性能および／または安定性と、このような変 種酵素のクリーニングまたは洗浄性能にとり、重要であることは明らかである。 以下は本発明組成物で有用なプロテアーゼ酵素の製造例により示されている。 プロテアーゼ製造例 Ｂ．subtilisでＧＧ３６遺伝子発現用の作成 Ｂ．lentusからのズブチリシン遺伝子の発現のためのクローニングおよび作成 は、米国特許第５，１８５，２５８号明細書で記載された場合と本質的に同様に 行う。プラスミドＧＧＡ２７４（図４に記載）が図５で示されたように下記の方 法で更に修飾される。ＧＧＡ２７４プラスミドの作成時に導入されたＰｓｔＩ部 位は、下記配列：５′ＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＡ３′（Seq.ID N o.1）を有するオリゴヌクレオチドで、下記のオリゴヌクレオチド特異的変異誘 発により除去される。下線“Ａ”残基は制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を除いて、 ２７４位でアラニンからトレオニンに対応アミノ酸残基を変える。２７４位のト レオニンはクローン化Ｂ．lentusズブチリシン遺伝子配列で本来みられる野生型 残基である。ズブチリシンをコードするＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩおよび ＢａｍＨＩの切断でプラスミドＧＧＡ２７４またはその誘導体（図５で示された ＧＧＴ２７４）から切り出される。ＤＮＡ断片は、変異誘発のために、ＭＰ１９ のようなバクテリオファージＭ１３ベースベクター中に逆サブクローニングされ る。変異誘発後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII切断、その後クローニングが、 変異ズブチリシンタンパク質の発現および回収のために、ＧＧＡ２７４のような 発現プラスミド中に変異ズブチリシン遺伝子を逆移動させる上で行われる。 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はZoller,M.et al.(1983),Methods Enzymo l.,100:468-500で記載されたように行われる。例として、配列５′ＧＣＴＧＣＴＣ ＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧ３′（Seq.ID No.2）の合成オリゴヌクレオチドが７ ６位のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）、即ちＮ７ ６Ｄに変えるために用いられる。下線“Ｇ”および“Ｃ”残基は野生型遺伝子配 列からの変化を表す。ＣＡは＋７５位でロイシンを保ち、Ｘｂａｌ制限酵素のＸ ｂａｌ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を導入するようにアミノ酸配列を変化させ、一 方ＧＡＣの変化は＋７６のアスパラギンをアスパラギン酸に変化させる。 ９９、１０１、１０３および１０４位の変異誘発には、異なるオリゴヌクレオ チドが望ましい変異の組合せに応じて使用できる。例えば、配列５′ＧＴＡＴＴ ＡＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴ３′ （Seq.ID No.3）のオリゴヌクレオチドが単一ズブチリシン分子で下記変化：Ｓ ９９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３ＡおよびＶ１０４Ｉを同時に行うために用いられ る。同様に、配列５′ＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣＣＣＡ ＡＧＧＡＴＴＧ３′（Seq.ID No.4）および５′ＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴ ＧＡＧＴＴＴＡＧ３′（Seq.ID No.5）のオリゴヌクレオチドがＩ１０７Ｖおよ びＮ１２３Ｓを各々作るために利用される。同じく、下線残基はアミノ酸配列ま たは制限酵素認識配列で望ましい変化を生じさせる野生型配列からの変化を表す 。 ズブチリシン変種のタンパク質分解活性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の方法に従い、表IIIで掲載された変 種が作られる。これらズブチリシン変種の各々のタンパク質分解活性は表IIIで 示されている。動力学的パラメーターｋ_cat、Ｋ_mおよびｋ_cat／Ｋ_mは、P.Bonnea u el al.(1991)J.Am.Chem.Soc.,Vol.113,No.3,p.1030に記載された方法を用いて 、合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐ ｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドの加水分解に関して測定される。簡単にいえば、少量 のズブチリシン変種ストック溶液がｐＨ８．６の０．１Ｍ_Tris-ＨＣｌ緩衝液に 溶解された基質を含む１ｃｍキュベットに加えられ、２５℃で恒温される。反応 の進行は４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターするこ とにより分光測定で追跡される。動力学的パラメーターは、非直線回帰アルゴリ ズムを用いて各反応毎に反応速度および生成物濃度をMichaelis-Menten式に当て はめることにより得られる。 表IIIに掲載された結果は、試験されたズブチリシン変種のすべてがタンパク 質分解活性を留めていることを示している。更に、データの詳しい分析では、タ ンパク質分解活性がBacillus amyloliquefaciensで７６、９９、１０１、１０３ 、１０４、１０７および１２３位に相当するアミノ酸残基において置換の様々な 組合せによりBacillus lentusズブチリシンで有意に変わっていることを示して いる。 ズブチリシン変種の熱安定性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のプロセスにより作られた本発明のBa cillus lentusズブチリシンおよび変種で観察される熱安定性の比較は表IVで示 されている。５０ｍＭ ＣａＣｌ₂含有または非含有０．１Ｍグリシン、０．０ １％Tween-80ｐＨ１０．０中の精製酵素１５μg/mlを小さな管中に入れ、１０℃ で５分間、１０〜６０℃で１分間および６０℃で２０分間インキュベートする。 次いで管を氷上に１０分間おく。管からの一部は、２５℃に恒温された０．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質サク シニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリ ドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について調べる。初期 の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニ リンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。データは加熱前に 対する活性％として表示される。表IVに掲載された結果は、大多数の変種（２６ 例中２４）が５０ｍＭ ＣａＣｌ₂添加試験条件下でBacillus lentusズブチリシ ンに匹敵する熱安定性を発揮することを示している。５０ｍＭ ＣａＣｌ₂非添 加試験条件下でも、大多数の変種（２６例中１９）がBacillus lentusズブチリ シンよりも有意に安定である。更に、変種N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V 104I、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S10 1R/S103A/V104Iは５０ｍＭ ＣａＣｌ₂非添加試験条件下で単一置換変種Ｎ ７６Ｄよりも有意に安定である。 ファージミドから作られた一本鎖ＤＮＡ鋳型による オリゴヌクレオチド特異的変異誘発 Ａ．Ｂ．lentus変種の作成 変異誘発プロトコールはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記された場合 と本質的に同様である。一本鎖ＤＮＡ鋳型はファージミド法で作る。一本鎖ＤＮ Ａ鋳型作成用のファージミドベクターを作成するために、我々はベクターｐＢＣ ＤＡＩＣＡＴを最初に作成した。ベクター作成のフローチャートは図８で示され ている。初めに、ｐＣ１９４プラスミド（Horinouchi,S.and Weisblum,B.,J.Bac teriol.,150: 8-15,1982）のＣＡＴ遺伝子をコードするＣｌａＩ‐ＣｌａＩ断片 をｐＵＣ１９（New England BioLabs,Beverly,MA）のポリリンカー領域のＡｃｃ Ｉ部位中にクローニングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬを作り、ＧＧ３６ＤＡＩコ ードＤＮＡの５′末端からのＥｃｏＲＩ‐ＤｒａＩ ０．６ＫＢ断片をｐＢＳＫ Ｓプラスミド（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ 部位中にクローニングしてｐＢＣ２ＳＫ５を作る。プラスミドｐＢＣ２ＳＫ５の 単一ＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩ切断により除去し、その後Ｔ４ＤＮＡポリメラ ーゼ触媒で補充し、再結合させて、ＥｃｏＲＩ部位を有しないプラスミドｐＢＣ ２ＳＫ‐５Ｒを作る。ｐＢＣＳＫ‐５Ｒ中にクローニングされたＥｃｏＲＩ‐Ｄ ｒａＩ断片をＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII断片として単離し、ｐＵＣＣＨＬのＰｓｔ Ｉ‐ＨｉｎｄIII部位（ｐＵＣ１９のポリリンカーの一部）中にクローニングし てプラスミドｐＵＣＣＨＬ５Ｒを作る。ＧＧ３６ＤＡＩ遺伝子のコード配列をＥ ｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片として切出し、ｐＵＣＣＨＬ５ＲのＥｃｏＲＩ‐Ｂａ ｍＨＩ部位中にクローニングしてｐＵＣＣＡＴを作る。次いでｐＵＣＣＡＴの大 きなＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII断片をＢＳ２ＫＳ＋のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄI II部位中にクローニングしてプラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。 一本鎖ＤＮＡを作るために、ｐＢＣＤＡＩＣＡＴを含むE.coliをRessel,M.,Ki dd,S.and Kelley,M.R.,GENE,45: 333-338,1986に記載されたプロトコールに従い ファージＲ４０８（Stratagene,Inc.,San Diego,CAから得た）で感染させる。一 本鎖ＤＮＡ鋳型が入手できたら、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記され たような標準変異誘発方法を実施する。ある変異体の作成は説明目的で以下に詳 述されている。 Ｂ．lentus（ＧＧ３６）N76D/S103A/V104I/L217Hの作成では、ＧＧ３６ N76D /S103A/V104IについてコードするＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片をｐＵＣ ＣＡＴの作成（図８参照）に用いて、プラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。一 本鎖ＤＮＡ鋳型を前記プロトコールに従い作った後、下記配列の変異誘発プライ マー を用いて、Ｌ２１７Ｈを作る。前記のように、下線残基は行われたヌクレオチド 変化を表し、ｘＣ１ａＩは存在するＣ１ａＩ部位が変異誘発後に除去されたこと を示す。変異誘発プロトコールは前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で記載 されたとおりである。変異誘発後、プラスミドＤＮＡを初めにＣ１ａＩ部位の除 去についてスクリーニングし、Ｃ１ａＩ部位を欠いたクローンをＤＮＡ配列分析 に付して、２１７位アミノ酸残基でＬからＨに変化したＤＮＡ配列について確認 する。 Ｂ．ＢＰＮ′変種の作成およびＢ．subtilisでのそれらの発現 Ｂ．amyloliquefaciens（ＢＰＮ′）N76D/Q103A/Y104I/Y217Lの作成を２つの 連続工程のほかは同様の方式で行う。Ｎ７６Ｄを最初にＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ中に 導入してＢＰＮ′N76D/Y217Lを作り、第二の変異誘発を行ってＢＰＮ′N76D/Y21 7LをＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lに変換する。第一変異誘発用の一本鎖ＤＮ Ａ鋳型を作るために、ＢＰＮ′Ｙ２１７ＬズブチリシンについてコードするＥｃ ｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片（Wells,J.,et al.,PNAS,84,5167,1087で記載されたＹ ２１７Ｌプラスミドから誘導される）を用いて、プラスミドｐＵＣＣＡＴＦＮＡ を作る（図９参照）。ＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌを含むｐＵＣＣＡＴＦＮＡプラスミド を用いて、ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミドを作成する（図９）。一本鎖ＤＮＡを 前記のように作る。ＢＰＮ′N76D/Y217Lを作るために、下記配列のオリゴヌクレ オチドプライマー を用いて、変化Ｎ７６Ｄを作る。次いで一本鎖ＤＮＡをＢＰＮ′N76D/Y217L保有 ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド（Ｎ７６Ｄ変異誘発後のｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラ スミド）から作り、下記配列のもう１つのオリゴヌクレオチド で変異誘発させて、ＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lを得る。クローニング、一 本鎖ＤＮＡ作成、変異誘発および変異体のスクリーニングに関係するすべての工 程は前記のように実施する。ＢＰＮ′遺伝子およびその変種の発現は、ＲＥ３４ ，６０６に記載されたようなBacillus subtilisのプロテアーゼ欠失株中に直接 プラスミドＤＮＡ（異なる変種のＢＰＮ′遺伝子を含むｐＢＣＦＮＡＣＡＴ）を 組込むことにより行う。 多数の変種をこれらのプロテアーゼ製造例の開示どおりに作る。動力学的デー タおよび安定性データはこのような変種について作る。動力学的データは前記方 法を用いて作り、表Vで示されている。安定性データはここで詳述されたように 作成した。結果は表VIで示されている。熱安定性アッセイ操作 精製酵素は、緩衝液で平衡化されたSephadex G-25からなるカラムに酵素を適 用し、同緩衝液を用いてカラムから酵素を溶出させることにより、０．１Ｍグリ シンｐＨ１０．０、０．０１％Tween-80中に緩衝液交換する。 ６０℃に恒温された０．１Ｍグリシン、０．０１％Tween-80ｐＨ１０．０を含 有する管に緩衝液交換された酵素を加えて、１５μg/mlの最終酵素濃度にする。 一部を様々な時間に６０℃インキュベートから取出し、２５℃に恒温された０ ．１Ｍ trls-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基 質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロ アニリドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について直ちに 調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。 ５０％酵素不活化に要する時間の長さである半減期は、６０℃でインキュベー ト時間の関数として反応速度の一次プロットから決める。 データは同一条件下でBacillus lentusズブチリシン（ＧＧ３６）について決 められた半減期の％として表VIに掲載されている。 （３）クリーニング組成物物質： 本発明のクリーニング組成物は、前記漂白剤およびプロテアーゼ酵素に加えて 、プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質も含んでいる 。ここで用いられる“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリー ニング組成物の具体的タイプおよび製品の形（例えば、液体、顆粒、スプレー組 成物）について選択されるあらゆる液体、固体または気体物質を意味し、しかも その物質は組成物で用いられるプロテアーゼ酵素と適合している。クリーニング 組成物物質の具体的選択は、クリーニングされる表面、物品または布帛と使用中 （例えば、洗浄洗剤使用中）のクリーニング条件にとり組成物の望ましい形につ いて考慮することにより容易に行われる。ここで用いられる“適合する”という 用語は、プロテアーゼが通常の使用状況中に望んでいるほど有効でなくなる程度 までにはクリーニング組成物物質がプロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性を減 少させないことを意味する。具体的なクリーニング組成物物質は以下で詳細に例 示されている。 １種以上の前記プロテアーゼ酵素の有効量がタンパク質汚れ除去の必要な様々 な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有される。このようなクリー ニング組成物には、形態上制限されない（例えば、液体及び顆粒）、硬質表面を クリーニングするための洗剤組成物；形態上制限されない（例えば、顆粒、液体 及び固形処方）、布帛をクリーニングするための洗剤組成物；皿洗い組成物（形 態上制限されない）；形態上制限されない（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口 液処方）口内洗浄組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠剤）義歯クリ ーニング組成物がある。ここで記載される“プロテアーゼ酵素の有効量”とは、 特定のクリーニング組成物で必要な酵素活性を出すために必要な前記プロテアー ゼ酵素の量に関する。このような有効量は当業者により容易に確認でき、用いら れる具体的酵素変種、クリーニング適用例、クリーニング組成物の具体的組成と 、 液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどうかなどのような多く のファクターに基づいている。 好ましくは、本発明のクリーニング組成物は約０．０００１〜約１０％、更に 好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０．００１〜約０．１ ％の１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。しかも好ましくは、プロテアー ゼ酵素は、酵素対ブリーチ比（Ｅ／Ｂ比）としてここでは称される、約１：１〜 約２０：１の範囲内で組成物１００ｇ当たりの活性プロテアーゼｍｇ対洗浄液中 ペルオキシ酸からの理論有効Ｏ₂（“ＡｖＯ₂”）ｐｐｍの比率を示すために十分 な量で組成物中に存在する。プロテアーゼ酵素が用いられた数例の様々なクリー ニング組成物が以下で更に詳細に記載されている。ここで用いられたすべての部 、パーセンテージおよび比率は、他で指摘されないかぎり重量による。 （ｉ）任意の洗浄酵素 本組成物および方法は、特定のプロテアーゼ酵素に加えて、すべての種類の洗 浄酵素と有効である。本発明で有用な任意の洗浄酵素も、例えばタンパク質ベー ス、炭水化物ベースまたはトリグリセリドベース汚れの除去を含めた様々な布帛 洗濯目的と、遊離染料移動の防止のために含有させてよい。配合される酵素には 他のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびペルオキシダーゼ とそれらの混合物がある。他のタイプの酵素も含んでよい。それらは植物、動物 、細菌、真菌および酵母起源のようにいかなる適切な起源であってもよい。しか しながら、それらの選択はｐＨ活性および／または最良安定性、熱安定性、活性 洗剤、ビルダーなどに対する安定性のようないくつかのファクターにより支配さ れる。この点において、細菌アミラーゼおよびプロテアーゼと真菌セルラーゼの ような細菌または真菌酵素が好ましい。 酵素は、洗剤組成物１ｇ当たり重量で約５０ｍｇ以内、更に典型的には約０． ０１〜約１０ｍｇの活性酵素を供給するために十分なレベルで通常配合される。 換言すれば、本発明で用いられる任意酵素の有効量は、典型的には洗剤組成物の 少くとも約０．００１重量％、好ましくは約０．００１〜約５％、更に好ましく は約０．００１〜約１％、最も好ましくは約０．０１〜約１％である。 任意プロテアーゼの適切な例は、Ｂ．subtilisおよびＢ．licheniformsの特定 株から得られるズブチリシンである。もう１つの適切なプロテアーゼは、８〜１ ２のｐＨ範囲で最大活性を有するBacillus subtilisまたはBacillus lichenifor misから得られ、Novo Industries A/Sから登録商品名ESPERASEとして開発および 販売されている、修正された細菌セリンプロテアーゼ酵素である。この酵素およ び類似酵素の製品はNovoの英国特許明細書第１，２４３，７８４号明細書で記載 されている。市販されている他のタンパク質分解酵素には、Novo Industries A/ S（デンマーク）から商品名ALCALASEおよびSAVINASEとして、International Bio -Synthetics,Inc.（オランダ）からMAXATASEとして販売されるものがある。更に 他のプロテアーゼには、プロテアーゼＡ（１９８５年１月９日付で公開された欧 州特許出願第１３０，７５６号明細書参照）およびプロテアーゼＢ（１９８７年 ４月２８日付で出願された欧州特許出願第８７３０３７６１．８号および１９８ ５年１月９日付で公開されたBottらの欧州特許出願第１３０，７５６号明細書参 照）と、１２３位でチロシンがバリンに置き換わり、１２３位でセリンがアスパ ラギンに置き換わり、２７４位でアラニンがトレオニンに置き換わったBacillus からのアルカリセリンプロテアーゼのトリプル変種である、ここでは“プロテア ーゼＣ”と称されるものがある。プロテアーゼＣは、引用することにより本明細 書の開示の一部とされる、１９９１年５月１６日付で公開されたＷＯ９１／０６ ６３７に対応するＥＰ第９０９１５９５８．４号明細書で記載されている。特に プロテアーゼＣの遺伝子的に修正された変種もここに含まれる。 アミラーゼには、例えば英国特許明細書第１，２９６，８３９号（Novo）明細 書で記載されたα‐アミラーゼ、International Bio-Synthetics,Inc．のRAPIDA SEおよびNovo IndustriesのTERMAMYLがある。 本発明で使用しうるセルラーゼには細菌または真菌双方のセルラーゼを含む。 好ましくは、それらは５〜９．５の至適ｐＨを有する。適切なセルラーゼは１９ ８４年３月６日付で発行されたBarbesgoardらの米国特許第４，４３５，３０７ 号明細書で開示されており、そこではHumicola insolensおよびHumicola株ＤＳ Ｍ１８００またはAeromonas属に属するセルラーゼ２１２産生真菌から産生され る真菌セルラーゼと、海洋軟体動物(Dolabella Auricula Solander)の肝膵から 抽出されるセルラーゼについて開示している。適切なセルラーゼはＧＢ‐Ａ‐２ ，０７５，０２８、ＧＢ‐Ａ‐２，０９５，２７５およびＤＥ‐ＯＳ‐２，２４ ７，８３２でも開示されている。 洗剤用に適したリパーゼ酵素には、英国特許第１，３７２，０３４号明細書で 開示されたPseudomonas stutzeriＡＴＣＣ１９．１５４のようなPseudomonas属 の微生物により産生されるものがある。更に１９７８年２月２４日付で公開され た日本特許出願第５３‐２０４８７号のリパーゼ参照。このリパーゼは商品名Li pase P″Amano″として日本、名古屋のAmano Pharmaceutical Co.Ltd.から市販 され、以下″Amano-P″と称される。他の市販リパーゼにはAmano-CES、リパーゼ ex Chromobacter viscosum、例えば日本、田方の東洋醸造社から市販されるChro mobacter viscosum var.lipolyticum NRRLB 3673；ＵＳＡのU.S.Biochemical Co rp．およびオランダのDisoynth Co.からのChromobacter viscosumリパーゼ；リ パーゼex Pseudomonas gladioliがある。真菌Humicola lanuginosaに由来し、宿 主としてAspergillus oryzaeで発現され、Novoから市販されるLIPOLASE酵素（更 にＥ．Ｐ．特許第３４１，９４７号明細書参照）がここで使用上好ましいリパー ゼである。 ペルオキシダーゼ酵素は酸素源、例えばペルカーボネート、ペルボレート、ペ ルサルフェート、過酸化水素などと組合せて用いられる。それらは“溶液漂白” に、即ち洗浄操作中に物品から落ちた染料または顔料が洗浄溶液中で他の物品に 移動することを防ぐために用いられる。ペルオキシダーゼ酵素は当業界で公知で あり、それには例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、リグニナーゼとクロロおよ びブロモペルオキシダーゼのようなハロペルオキシダーゼがある。ペルオキシダ ーゼ含有洗剤組成物は、例えばO.Kirkにより１９８９年１０月１９日付で公開さ れて、Novo Industries A/Sに譲渡された、ＰＣＴ国際出願ＷＯ第８９／０９９ ８１３号明細書で開示されている。 様々な酵素物質と顆粒合成洗剤中へのそれらの配合手段も１９７１年１月５日 付で発行されたMcCartyらの米国特許第３，５５３，１３９号明細書で開示され ている。酵素は１９７８年７月１８日付で発行されたPlaceらの米国特許第４， １０１，４５７号および１９８５年３月２６日付で発行されたHughesの米国特許 第４，５０７，２１９号双方の明細書でも更に開示されている。液体洗剤処方で 有用な酵素物質とこのような処方中へのそれらの配合は、１９８１年４月１４日 付で発行されたHoraらの米国特許第４，２６１，８６８号明細書で開示されてい る。洗剤で有用な酵素は様々な技術で安定化させることができる。酵素安定化技 術は、１９８１年４月１４日付で発行されたHornらの米国特許第４，２６１，８ ６８号、１９７１年８月１７日付で発行されたGedgeらの米国特許第３，６００ ，３１９号および１９８６年１０月２９日付で公開されたVenegasの欧州特許出 願公開第０１９９４０５号、出願第８６２００５８６．５号明細書で開示および 例示されている。酵素安定化系も、例えば米国特許第４，２６１，８６８号、第 ３，６００，３１９号および第３，５１９，５７０号明細書で記載されている。 （ii）酵素安定剤 ここで用いられる酵素は、酵素にカルシウムイオンを供給する最終組成物中の 水溶性カルシウムイオン源の存在により安定化させることができる。追加安定は 様々な他の業界開示安定剤、特にボレート種の存在により得られる：前記Severs onの米国特許第４，５３７，７０６号明細書参照。典型的洗剤、特に液体は最終 組成物１リットル当たり約１〜約３０、好ましくは約２〜約２０、更に好ましく は約５〜約１５、最も好ましくは約８〜約１２ミリモルのカルシウムイオンを含 む。これは存在する酵素の量とカルシウムイオンに対するその応答に応じてやや 変動しうる。カルシウムイオンのレベルは、組成物中でビルダー、脂肪酸などと の錯体形成後に酵素にとり有用な最少レベルで常に存在するように選択されるベ きである。限定されないが、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、リンゴ酸カルシ ウム、水酸化カルシウム、ギ酸カルシウムおよび酢酸カルシウムを含めたあらゆ る水溶性カルシウム塩がカルシウムイオン源として使用できる。通常約０．０５ 〜約０．４ミリモル／リットルの少量のカルシウムイオンも、酵素スラリーおよ び処方水中のカルシウムのために組成物中にしばしば存在している。固形洗剤組 成物でも、処方物は洗濯液中でこのような量を供給するために十分な量の水溶性 カルシウムイオン源を含有していてよい。代わりに、天然水硬度でも十分である 。 本組成物は場合により、但し好ましくは、シリケートコーティングを含めた様 々な追加安定剤、特にボレートタイプ安定剤を含有してもよい。典型的には、こ のような安定剤は（ホウ酸に基づき計算して）ホウ酸または組成物中でホウ酸を 形成できる他のボレート化合物について組成物中約０．２５〜約１０重量％、好 ましくは約０．５〜約５％、更に好ましくは約０．７５〜約３％のレベルで用い られる。ホウ酸が好ましいが、酸化ホウ素、ボラックスおよび他のアルカリ金属 ボレート（例えば、オルト、メタおよびピロホウ酸ナトリウムと五ホウ酸ナトリ ウム）のような他の化合物も適切である。置換ホウ酸（例えば、フェニルボロニ ン酸、ブタンボロニン酸およびｐ‐ブロモフェニルボロニン酸）もホウ酸の代わ りに使用できる。 （iii）洗浄界面活性剤 本発明で提供されるフル処方洗剤組成物中に含有される洗浄界面活性剤の量は 、 用いられる具体的界面活性剤と望まれる効果に応じて、約１〜約９９．８％であ る。好ましくは、洗浄界面活性剤は洗剤成分の約５〜約８０重量％である。 洗浄界面活性剤にはノニオン系、アニオン系、両性、双極性、カチオン系があ る。これら界面活性剤の混合物も使用できる。好ましい洗剤組成物は、アニオン 系洗浄界面活性剤、またはアニオン系界面活性剤と他の界面活性剤、特にノニオ ン系界面活性剤との混合物を含む。 ここで有用な界面活性剤の非制限例には慣用的なＣ₁₁‐Ｃ₁₈アルキルベンゼン スルホネート、一級、二級およびランダムアルキルサルフェート、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈ア ルキルアルコキシサルフェート、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルポリグリコシドおよびそれ らの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈α‐スルホン化脂肪酸エス テル、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレート（特に、 エトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈ベタインおよび スルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アミンオキシド、Ｃ₈‐Ｃ₂₄サ ルコシネート（特に、オレオイルサルコシネート）などがある。他の慣用的で有 用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。 ここで特に有用な補助ノニオン系界面活性剤の１つの具体的なクラスには下記 式のポリヒドロキシ脂肪酸アミドがある： 上記式中、Ｒ¹はＨ、Ｃ₁‐Ｃ₈ヒドロカルビル、２‐ヒドロキシエチル、２‐ヒ ドロキシプロピルまたはそれらの混合物、好ましくはＣ₁‐Ｃ₄アルキル、更に好 ましくはＣ₁またはＣ₂アルキル、最も好ましくはＣ₁アルキル（即ちメチル）で あり、Ｒ²はＣ₅‐Ｃ₃₂ヒドロカルビル部分、好ましくは直鎖Ｃ₇‐Ｃ₁₉アルキル またはアルケニル、更に好ましくは直鎖Ｃ₉‐Ｃ₁₇アルキルまたはアルケニル、 最も好ましくは直鎖Ｃ₁₁‐Ｃ₁₉アルキルまたはアルケニル、あるいはそ れらの混合物であり、Ｚは直鎖ヒドロカルビル鎖とその鎖に直接結合された少く とも２つ（グリセルアルデヒドの場合）または少くとも３つ（他の還元糖の場合 ）のヒドロキシルあるいはそのアルコキシル化（好ましくはエトキシル化または プロポキシル化）誘導体とを有するポリヒドロキシヒドロカルビル部分である。 Ｚは好ましくは還元アミノ化反応で還元糖から誘導され、更に好ましくはＺはグ リシチル部分である。適切な還元糖にはグルコース、フルクトース、マルトース 、ラクトース、ガラクトース、マンノースおよびキシロースとグリセルアルデヒ ドがある。原料として、高デキストロースコーンシロップ、高フルクトースコー ンシロップおよび高マルトースコーンシロップと上記個別の糖が利用できる。こ れらのコーンシロップはＺについて糖成分の混合物を与えることがある。他の適 切な原料を決して排除するつもりはないことが理解されるべきである。Ｚは好ま しくは‐ＣＨ₂‐（ＣＨＯＨ）_n‐ＣＨ₂ＯＨ、‐ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）‐（ＣＨＯＨ ）_n-1‐ＣＨ₂ＯＨ、‐ＣＨ₂‐（ＣＨＯＨ）₂（ＣＨＯＲ′）（ＣＨＯＨ）‐ＣＨ₂ ＯＨからなる群より選択され、ここでｎは１〜５の整数であり、Ｒ′はＨまた は環状単糖または多糖およびそのアルコキシル化誘導体である。ｎが４であるグ リシチル、特に‐ＣＨ₂‐（ＣＨＯＨ）₄‐ＣＨ₂ＯＨが最も好ましい。 式（Ｉ）において、Ｒ¹は例えばＮ‐メチル、Ｎ‐エチル、Ｎ‐プロピル、Ｎ ‐イソプロピル、Ｎ‐ブチル、Ｎ‐イソブチル、Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルまた はＮ‐２‐ヒドロキシプロピルである。最高起泡性のためには、Ｒ¹は好ましく はメチルまたはヒドロキシアルキルである。低い起泡性が望まれるならば、Ｒ¹ は好ましくはＣ₂‐Ｃ₈アルキル、特にｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル 、イソブチル、ペンチル、ヘキシルおよび２‐エチルヘキシルである。 Ｒ²‐ＣＯ‐Ｎ＜には、例えばコカミド、ステアラミド、オレアミド、ラウラ ミド、ミリストアミド、カプリカアミド、パルミトアミド、タロウアミドなどが ある。 本発明で特に有用なノニオン系界面活性剤のもう１つのクラスは、５〜１７、 好ましくは６〜１４、更に好ましくは７〜１２の範囲内の平均親水性‐親油性バ ランス（ＨＬＢ）を有する界面活性剤を与えるような疎水性部分とのエチレンオ キシドの縮合物である。疎水性（親油性）部分は性質上脂肪族でもまたは芳香族 でもよく、いずれか特定の疎水基と縮合されるポリオキシエチレン基の長さは、 親水性および疎水性要素間で望ましいバランス度を有する水溶性化合物を生じる ように容易に調整することができる。 このタイプの特に好ましいノニオン系界面活性剤は、アルコール１モル当たり ３〜８モルのエチレンオキシドを含むＣ₉‐Ｃ₁₅一級アルコールエトキシレート 、特にアルコール１モル当たり６〜８モルのエチレンオキシドを含むＣ₁₄‐Ｃ₁₅ 一級アルコール、アルコール１モル当たり３〜５モルのエチレンオキシドを含む Ｃ₁₂‐Ｃ₁₅一級アルコールとそれらの混合物である。 （iv）洗浄ビルダー 本発明で用いられる任意洗剤成分には、ミネラル硬度のコントロールを助ける 無機および／または有機洗浄ビルダーがある。用いられるならば、これらのビル ダーは洗剤組成物の約５〜約８０重量％である。 無機洗浄ビルダーにはポリホスフェート（トリポリホスフェート、ピロホスフ ェートおよびガラス質ポリマーメタホスフェートで例示される）、ホスホネート 、フィチン酸、シリケート、カーボネート（ビカーボネートおよびセスキカーボ ネートを含む）、サルフェートおよびアルミノシリケートのアルカリ金属、アン モニウムおよびアルカノールアンモニウム塩があるが、それらに限定されない。 しかしながら、非ホスフェートビルダーも一部の場所で要求される。 シリケートビルダーの例はアルカリ金属シリケート、特に１．６：１〜３．２ ：１範囲のＳｉＯ₂：Ｎａ₂Ｏ比を有するものと、１９８７年５月１２日付でH.P. Rieckに発行された米国特許第４，６６４，８３９号明細書で記載された、商標 名“ＳＫＳ”としてHoechstから市販される積層ナトリウムシリケートのような 積層シリケートであり、“ＳＫＳ‐６”が特に好ましい積層シリケートビルダー である。 カーボネートビルダー、特に１０ｍ²/g以上の表面積を有する微細炭酸カルシ ウムが、顆粒組成物で使用できる好ましいビルダーである。このようなアルカリ 金属カーボネートビルト洗剤の密度は、好ましくは４％以下の水分で４５０〜８ ５０g/lの範囲内である。 カーボネートビルダーの例は、１９７３年１１月１５日付で公開されたドイツ 特許出願第２，３２１，００１号明細書で開示されるようなアルカリ土類および アルカリ金属カーボネートである。 アルミノシリケートビルダーは本発明で特に有用である。好ましいアルミノシ リケートは下記式を有するゼオライトビルダーである： Ｎａ_z〔（ＡｌＯ₂）_z（ＳｉＯ₂）_y〕・ｘＨ₂Ｏ 上記式中ｚおよびｙは少くとも６の整数であり、ｚ対ｙのモル比は１．０〜約０ ．５の範囲であり、ｘは約１５〜約２６４の整数である。 有用なアルミノシリケートイオン交換物質は市販されている。これらのアルミ ノシリケートは構造上結晶でもまたは非晶質でもよく、天然アルミノシリケート でもまたは合成してもよい。アルミノシリケートイオン交換物質の製造方法は、 １９７６年１０月１２日付で発行されたKrummelらの米国特許第３，９８５，６ ６９号および１９８６年８月１２日付で発行されたCorkillらの米国特許第４， ６０５，５０９号明細書で開示されている。ここで有用な好ましい合成結晶アル ミノシリケートイオン交換物質はゼオライトＡ、ゼオライトＰ（Ｂ）（ＥＰＯ３ ８４，０７０で開示されたものを含む）およびゼオライトＸという名称で市販さ れている。好ましくは、アルミノシリケートは直径約０．１〜１０ミクロンの粒 度を有する。 本発明の目的に適した有機洗浄ビルダーには様々なポリカルボキシレート化合 物、例えば１９６４年４月７日付で発行されたBergの米国特許第３，１２８，２ ８７号および１９７２年１月１８日付で発行されたLambertiらの米国特許第３， ６３５，８３０号明細書で開示されたようなオキシジサクシネートを含めたエー テルポリカルボキシレートがあるが、それらに限定されない。更に１９８７年５ 月５日付でBushらに発行された米国特許第４，６６３，０７１号の“ＴＭＳ／Ｔ ＤＳ”ビルダー参照。適切なエーテルポリカルボキシレートには、米国特許第３ ，９２３，６７９号、第３，８３５，１６３号、第４，１５８，６３５号、第４ ，１２０，８７４号および第４，１０２，９０３号で記載されたもののような環 式化合物、特に脂環式化合物も含む。 他の有用な洗浄ビルダーにはエーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水 マレイン酸とエチレンまたはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５ ‐トリヒドロキシベンゼン‐２，４，６‐トリスルホン酸、カルボキシメチルオ キシコハク酸と、エチレンジアミン四酢酸およびニトリロ三酢酸のようなポリ酢 酸の様々なアルカリ金属、アンモニウムおよび置換アンモニウム塩と、メリット 酸、コハク酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン‐１，３，５‐ト リカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸およびそれらの可溶性塩のよう なポリカルボキシレートがある。 シトレートビルダー、例えばクエン酸およびその可溶性塩（特にナトリウム塩 ）は、特にゼオライトおよび／または積層シリケートビルダーと組合せて、顆粒 組成物でも使用できる、好ましいポリカルボキシレートである。 本発明の洗剤組成物では、１９８６年１月２８日付で発行されたBushの米国特 許第４，５６６，９８４号明細書で開示された３，３‐ジカルボキシ‐４‐オキ サ‐１，６‐ヘキサンジオエート類と関連化合物も適している。 リンベースビルダーが使用できる状況下、特に手洗い操作で用いられる固形物 の処方において、周知トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムおよび オルトリン酸ナトリウムのような様々なアルカリ金属ホスフェートが使用できる 。エタン‐１‐ヒドロキシ‐１，１‐ジホスホネートおよび他の公知ホスホネー トのようなホスホネートビルダー（例えば、米国特許第３，１５９，５８１号、 第３，２１３，０３０号、第３，４２２，０２１号、第３，４００，１４８号お よび第３，４２２，１３７号明細書参照）も使用できる。 （ｖ）任意の洗浄助剤 好ましい態様として、ここで用いられる慣用的洗剤成分は洗浄界面活性剤およ び洗浄ビルダーのような典型的洗剤組成物成分から選択することができる。場合 により、洗剤成分にはクリーニング性能、クリーニングされる物品の処理を助け るかまたは高めるために、あるいは洗剤組成物の美観を変えるために、１種以上 の他の洗浄助剤または他の物質を含有することができる。洗剤組成物の通常の洗 浄助剤には、引用することにより本明細書の開示の一部とされるBaskervilleら の米国特許第３，９３６，５３７号明細書で示された成分がある。本発明で用い られる洗剤組成物に使用上慣例的な業界確立レベル（通常洗剤成分の０〜約２０ ％、好ましくは約０．５〜約１０％）で含有させることができるこのような助剤 には、カラースペクル(color speckle)、起泡増強剤、起泡抑制剤、曇り防止お よび／または腐食防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ放出剤、色素、フィラー、光学増白 剤、殺菌剤、アルカリ性源、ヒドロトロピー剤、酸化防止剤、香料、溶媒、溶解 剤、土汚れ除去／再沈着防止剤、ポリマー分散剤、加工助剤、布帛柔軟化成分（ 例えば、スメクタイト土）、色素移動阻止剤（例えば、ポリビニルピロリドン） 、静電気抑制剤などがある。 ブリーチ系は場合により、但し好ましくはブリーチを分解する傾向がある重金 属イオンを除去することでブリーチ安定性を高めるだけでなく、茶汚れなどのよ うなポリフェノール系汚れの除去にも役立つキレート化剤も含む。Monsantoから DEQUESTとして市販されるアミノホスホネート、ニトリロトリアセテート、ヒド ロキシエチルエチレンジアミントリアセテートなどを含めた様々なキレート化剤 がこのような使用にとり知られている。好ましい生分解性無リンキレート化剤に はエチレンジアミンジサクシネート（“ＥＤＤＳ”、HartmanおよびPerkinsの米 国特許第４，７０４，２３３号明細書参照）、エチレンジアミン‐Ｎ，Ｎ′‐ジ グルタメート（ＥＤＤＧ）および２‐ヒドロキシプロピレンジアミン‐Ｎ，Ｎ′ ‐ジサクシネート（ＨＰＤＤＳ）化合物がある。このようなキレート化剤は、そ れらのアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、典型的には本組成物の約０． １〜約１０％のレベルで使用できる。 本発明組成物は、顆粒洗剤または洗濯固形物で典型的にみられるような慣用的 洗濯洗剤組成物として特に有用である。１９６５年４月１３日付で発行されたOk enfussの米国特許第３，１７８，３７０号明細書は、固形洗濯洗剤とそれらの製 造方法について記載している。１９８０年９月２３日付で発行されたAndersonの フィリピン特許第１３，７７８号明細書は、合成洗剤洗濯固形物について記載し ている。様々な押出し方法による固形洗濯洗剤の製造方法が当業界で周知である 。 下記例は本発明を更に説明するために示されており、それを制限すると解釈さ れるべきでない。 例１ 下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。成分 重量％ Ｃ₁₂直鎖アルキルベンゼンスルホネート 22 ホスフェート（トリポリリン酸ナトリウムとして） 30 炭酸ナトリウム 14 ケイ酸ナトリウム 3 プロテアーゼ１２ 0.3 過炭酸ナトリウム 5 エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（ＥＤＤＳ） 0.4 硫酸ナトリウム 5.5 ノナノイルカプロラクタム 5 フィラー^*および水 残部１００％まで^* ＣａＣＯ₃、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択できる 洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラッチャー(crutcher)混合 物を調製し、スプレードライし、他の成分はそれらが表示された成分を示された レベルで含有するように混合する。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例２ 下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。成分 重量％ アニオン系アルキルサルフェート 7 ノニオン系界面活性剤 5 ゼオライト（０．１〜１０ミクロン） 10 クエン酸三ナトリウム 2 ＳＫＳ‐６シリケートビルダー 10 アクリレートマレエートポリマー 4 ノナノイルカプロラクタム 5 過炭酸ナトリウム^* 15 炭酸ナトリウム 5 エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（ＥＤＤＳ） 0.4 起泡抑制剤 2 プロテアーゼ１２ 0.3 リパーゼ 0.3 汚れ放出剤 0.2 微量成分、フィラー^**および水 残部１００％まで^* ４００〜１２００ミクロンの平均粒度^** ＣａＣＯ₃、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択でき る 洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラッチャー混合物を調製し 、スプレードライし、他の成分はそれらが表示された成分を示されたレベルで含 有するように混合する。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例３ 洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、但し１５％のベンゾイル カプロラクタム、ノナノイルカプロラクタムおよび（６‐ノナンアミドカプロイ ル）オキシベンゼンスルホネートの１：１：１混合物がノナノイルカプロラクタ ムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は３０％である。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例４ 洗剤組成物を例１の場合と同一の操作で製造するが、但し２０％のベンゾイル カプロラクタムおよび（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネ ートの１：１混合物がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウ ムの量は２０％であり、ホスフェートの量は０％である。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例５ 洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のベンゾオキ サジンタイプ活性剤をノナノイルカプロラクタムの代わりに用いる。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例６ 洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、但し１０％のベンゾオキ サジンタイプ活性剤およびテトラアセチルエチレンジアミンの１：１混合物がノ ナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は２５％である。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例７ 手洗い汚れ布帛用に適した洗濯固形物を標準押出しプロセスにより製造し、以 下を含有させる。成分 重量％ Ｃ₁₂直鎖アルキルベンゼンスルホネート 30 ホスフェート（トリポリリン酸ナトリウムとして） 7 炭酸ナトリウム 25 ピロリン酸ナトリウム 7 ココナツモノエタノールアミド 2 ゼオライト（０．１〜１０ミクロン） 5 カルボキシメチルセルロース 0.2 ポリアクリレート（ｍ．ｗ．１４００） 0.2 （６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート 5 過炭酸ナトリウム 5 増白剤、香料 0.2 プロテアーゼ１２ 0.3^** リパーゼ 0.3 ＣａＳＯ₄ 1 ＭｇＳＯ₄ 1 水 4 フィラー^* 残部１００％まで^* ＣａＣＯ₃、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択できる^** 組成物ｇ当たりの活性酵素ｍｇを表示している 洗剤洗濯固形物を当業界で常用される慣用的石鹸または固形洗剤製造装置で処 理する。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例８ 洗剤組成物を例７の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のベンゾイル カプロラクタムを（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート の代わりに用いる。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例９ 洗剤組成物を例７の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のノナノイル カプロラクタムを（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート の代わりに用いる。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１０ 下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。成分 重量％ アニオン系アルキルサルフェート 7 ノニオン系界面活性剤 5 ゼオライト（０．１〜１０ミクロン） 10 クエン酸三ナトリウム 2 ＳＫＳ‐６シリケートビルダー 10 アクリレートマレエートポリマー 4 ノナノイルカプロラクタム 5 過炭酸ナトリウム^* 15 炭酸ナトリウム 5 エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（ＥＤＤＳ） 0.4 起泡抑制剤 2 プロテアーゼ１２ 0.5 汚れ放出剤 0.2 微量成分、フィラー^**および水 残部１００％まで^* ４００〜１２００ミクロンの平均粒度^** ＣａＣＯ₃、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択でき る 洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラッチャー混合物を調製し 、スプレードライし、他の成分はそれらが表示された成分を示されたレベルで含 有するように混合する。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１１ 洗剤組成物を例１０の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のベンゾイ ルカプロラクタムをノナノイルカプロラクタムの代わりに用いる。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１２ 洗剤組成物を例１０の場合と同一の操作で製造するが、但し１５重量％の（６ ‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートがノナノイルカプロラ クタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は３０％である。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１３ 洗剤組成物を例１０の場合と同一の操作で製造するが、但し１５重量％のベン ゾオキサジンタイプ活性剤がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナ トリウムの量は３０％である。 この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２ ５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて 、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例におい て、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれ の組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１４ 洗浄性能試験 本発明組成物で有用な変種の洗浄性能は、ＥＭＰＡ１１６（コットン上に血液 ／ミルク／カーボンブラック）衣切れ（Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030 ）から汚れの除去を調べることにより評価する。 ギザギザ端のある３×４-1/2インチに切断された６枚のＥＭＰＡ１１６布切れ を、水１０００ｍｌ、硬度１５ｇｐｇ（Ｃａ⁺⁺：Ｍｇ⁺⁺３：１ｗ：ｗ）、洗剤７ ｇおよび適宜に酵素を含有したモデル７２４３Ｓ Terg-O-Tometer（United Sta tes Testing Co.,Inc.,Hoboken,NJ）の各ポットに入れる。洗剤ベースはwfk-Tes tgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13 07 62,D-47759 Krefeld,Germanyの ＷＦＫ１洗剤である： 成分 最終処方の％ ゼオライトＡ ２５％ 硫酸ナトリウム ２５％ ソーダ灰 １０％ 直鎖アルキルベンゼンスルホネート ８．８％ アルコールエトキシレート（７‐８ＥＯ） ４．５％ ナトリウム石鹸 ３％ ケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ₂：Ｎａ₂Ｏ ３：３：１） ３％ このベース洗剤に下記添加を行う： 成分 最終処方の％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物 １３％ コポリマー（Sokalan CP5） ４％ ＴＡＥＤ（Mykon ATC Green） ３％ 酵素 ０．５％ 増白剤（Tinopal AMS-GX） ０．２％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物はDegussa Corporation,Ridgefield-Park,NJ 076 60から得る。Sokalan CP5はBASF Corporation,Parsippany,NJ 07054から得る。M ykon ATC Green（ＴＡＥＤ，テトラアセチルエチレンジアミン）はWarwick Inte rnational,Limited,Mostyn,Holywell,Clwyd CH8 9HE,Englandから得る。Tinopal AMS GXはCiba-Geigy Corporation,Greensboro,NC27419から得る。 ６枚のＥＭＰＡ１１６布切れを６０℃で３０分間酵素入り洗剤で洗浄し、その 後各回毎に水１０００ｍｌで５分間にわたり２回すすぎ洗いする。酵素を標準曲 線では０．０５〜１ｐｐｍ、ルーチン分析では０．２５ｐｐｍの最終濃度で加え る。布切れを乾燥し、プレスし、布切れの反射率をMinolta Chroma Meter,Model CR-200(Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07446)のＬ^*ａ^*ｂ^*スケールでＬ値を 用いて測定する。性能はB.Lentus（ＧＧ３６）プロテアーゼの性能の％として報 告し、同様の汚れ除去性能を示すために必要な変種プロテアーゼの量でB.Lentus （ＧＧ３６）プロテアーゼの量を割り１００を掛けることにより計算する。デー タは表VIIで示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｄ０６Ｌ 3/00 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ディジュリオ，デイビッド ニール アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 アップルシード、ドライブ、8769 (72)発明者 ゲティー，エドワード ユージン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 ローン、レイン、8940 (72)発明者 ウイリー，アラン デイビッド アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 セレスティアル、ストリート、1971 (72)発明者 ハーツホーン，リチャード チモシー イギリス国ニューキャッスル、アポン、 ザ、タイン、キングストン、パーク、ハー シャム、クローズ（番地なし) (72)発明者 ブロウド，フィリップ フレデリック ザ．サード アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 スクワイレルスネスト、レイン、5780 (72)発明者 バーネット，ボビー リー アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 エルクウッド、ドライブ、12175 (72)発明者 ラビン，ドン ネルトン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 シード、ロード、8224

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）プロテアーゼ酵素であって、Bacillus amyloliquefaciensズブチ リシンにおいて＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、 ＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１ ６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１ ７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４からなる 群より選択された場合に相当する１以上のアミノ酸残基位置と、Bacillus amylo liquefaciensズブチリシンにおいて＋７６位に相当する前駆カルボニルヒドロラ ーゼの位置において、複数のアミノ酸残基について異なるアミノ酸の置換をうけ た、天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であっ て、前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、プロテアーゼ酵素の有効量、 （ｂ）有機ペルオキシ酸であるか、または組成物から形成される漂白溶液中そ の場で活性剤と反応して有機ペルオキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じること ができるペルオキシゲン化合物とブリーチ活性剤との組合せである漂白剤、 および （ｃ）プロテアーゼ酵素および漂白剤と適合する１種以上のクリーニング組成 物物質 を含んでなる漂白組成物。 ２． クリーニング組成物物質が界面活性剤、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出 剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵 素安定剤、ビルダー、色素、香料およびそれらの混合物からなる群より選択され る、請求項１に記載の漂白組成物。 ３． 少くとも１種の界面活性剤を含む布帛クリーニング組成物として有用な 形をした、請求項２に記載の漂白組成物。 ４． アルキルベンゼンスルホネート、一級アルキルサルフェート、二級アル キルサルフェート、アルキルアルコキシサルフェート、アルキルアルコキシカル ボキシレート、アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリ グリコシド、α‐スルホネート化脂肪酸エステル、アルキルおよびアルキルフェ ノールアルコキシレート、ベタインおよびスルホベタイン、アミンオキシド、Ｎ ‐メチルグルカミド、ノニオン系一級アルコールエトキシレート、ノニオン系一 級アルコール混合エトキシ／プロポキシとそれらの混合物からなる群より選択さ れる少くとも約５％の界面活性剤を含んでなる、請求項３に記載の漂白組成物。 ５． ゼオライト、ポリカルボキシレート、積層シリケート、ホスフェートお よびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも約５％のビルダーを更に 含んでなる、請求項４に記載の漂白組成物。 ６． 少くとも約３０％の界面活性剤を含む濃縮顆粒布帛クリーニング組成物 の形態の、請求項４に記載の漂白組成物。 ７． クリーニング組成物物質がセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテ アーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される少く とも１種の酵素を含んでなる、請求項１に記載の漂白組成物。 ８． 少くとも１種の溶媒および少くとも１種の界面活性剤を含む液体布帛ク リーニング組成物として有用な形をした、請求項１に記載の漂白組成物。 ９． 水と少くとも５％の界面活性剤を含んでなる、請求項８に記載の漂白組 成物。 １０． クリーニング組成物物質が少くとも１種の布帛柔軟剤を含んでなる、 請求項１に記載の漂白組成物。 １１． プロテアーゼ酵素用の前駆カルボニルヒドロラーゼがズブチリシンで あり、プロテアーゼ酵素がズブチリシン変種であって、置換の組合せが76/99、 76/101、76/103、76/104、76/107、76/123、76/99/101、76/99/103、76/99/104 、76/101/103、76/101/104、76/103/104、76/104/107、76/104/123、76/107/123 、76/99/101/103、76/99/101/104、76/99/103/104、76/101/103/104、76/103/10 4/123、76/104/107/123、76/99/101/103/104、76/99/103/104/123、76/99/101/1 03/104/123、76/103/104/126、76/103/104/135、76/103/104/197、76/103/104/2 22、76/103/104/260、76/103/104/265、76/103/104/126/265、27/76/104/123/27 4、27/76/104/109/123/274、27/76/104/123/218/274、27/76/104/123、27/76/10 4/107/123、27/76/104/109/123、27/76/104/109/123/218/274、27/76/104/123/1 97、27/76/104/123/204、27/76/104/123/206、27/76/104/123/216、27/76/104/1 23/218、27/76/104/123/260、27/76/104/123/195/197、27/76/104/123/195/218 、27/76/104/123/197/218、27/76/104/123/204/218、27/76/104/123/206/218、2 7/76/104/123/218/260、27/76/104/123/195/197/218、76/103/104/217、76/103/ 104/156、76/103/104/166、76/103/104/105、76/101/103/104、76/103/104/128 、76/103/104/210、76/103/104/107、76/103/104/204、76/217、76/103/104/156 /166および76/103/104/128に相当する位置で行われている、請求項１に記載のク リーニング組成物。 １２． プロテアーゼ酵素が76/99、76/101、76/103、76/104、76/107、76/12 3、76/99/101、76/99/103、76/99/104、76/101/103、76/101/104、76/103/104、 76/104/107、76/104/123、76/107/123、76/99/101/103、76/99/101/104、76/99/ 103/104、76/101/103/104、76/103/104/123、76/104/107/123、76/99/101/103/1 04、76/99/103/104/123、76/99/101/103/104/123、76/103/104/128、76/103/104 /260、76/103/104/265、76/103/104/197、76/103/104/105、76/103/104/135、76 /103/104/126、76/103/104/107、76/103/104/210、76/103/104/126/265および／ または76/103/104/222からなる群より選択されるズブチリシン変種である、請求 項１に記載のクリーニング組成物。 １３． 天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種 であって、ズブチリシン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、有効量の プロテアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素はN76D/S99D、N76D/S101R、N 76D/S103A、N76D/V104I、N76D/I107V、N76D/N123S、N76D/S99D/S101R、N76D/S99 D/S103A、N76D/S99D/V104I、N76D/S101R/S103A、N76D/S101R/V104I、N76D/S103A /V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V、N76D/V104I/N123S、N76D/I107V /N123S、N76D/S99D/S101R/S103A、N76D/S99D/S101R/V104I、N76D/S99D/S103A/V1 04I、N76D/S101R/S103A/V104I、N76D/S103A/V104I/N123S、N76D/V104I/I107V/N1 23S、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I、N76D/S99D/S103A/V104I/N123S、N76D/S99D /S101R/S103A/V104I/N123S、N76D/S103A/V104I/S128G、N76D/S103A/V104I/T260P 、N76D/S103A/V104I/S265N、N76D/S103A/V104I/D197E、N76D/S103A/V104I/S105A 、N76D/S103A/V104I/L135I、N76D/S103A/V104I/L126F、N76D/S103A/V104T/L107T 、N76D/S103A/V104I/L126F/S265N、N76D/S103A/V104I/M222Aおよびそれらの混合 物から選択されるズブチリシン変種である）と、 （ｂ）（ｉ）下記式の有機ペルオキシ酸： （上記式中Ｒ¹は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはア ルカリール基であり、Ｒ²は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン、アリ レンまたはアルカリレン基であり、Ｒ⁵はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を 有するアルキル、アリールまたはアルカリール基である）および （ii）組成物から形成される漂白溶液中その場で活性剤と反応して有機 ペルオキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じることができるペルオキシゲン化合 物とブリーチ活性剤との組合せ（上記ブリーチ活性剤は下記一般式を有する： 上記式中Ｒは約５〜約１８の炭素原子を有するアルキル基であって、カルボニル 炭素を含めてそこから伸びる最長の直鎖アルキル鎖は約６〜約１０の炭素原子を 有し、Ｌは脱離基であり、その共役酸は約４〜約１３の範囲内のｐＨを有する） からなる群より選択される漂白剤約０．５〜約２０％と （ｃ）組成物の少くとも約５重量％の界面活性剤および少くとも約５％のビル ダーを含んだ、プロテアーゼ酵素および漂白剤と適合する１種以上のクリーニン グ組成物物質と、 を含んでなる布帛クリーニング組成物。 １４． 溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、 起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵素安定剤、色素、香料およびそれらの 混合物からなる群より選択されるクリーニング組成物物質を更に含んでなる、請 求項１３に記載の布帛クリーニング組成物。 １５． セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダー ゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも１種の酵素を更に含 んでなる、請求項１３に記載の布帛クリーニング組成物。 １６． 液体、顆粒または固体の形態にある、請求項１３に記載の布帛クリー ニング組成物。 １７． プロテアーゼ酵素がN76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D /S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V、N76D/S101R/S103A/V104I 、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I、N76D/S101R/V104Iおよびそれらの混合物から 選択されるズブチリシン変種である、請求項１３に記載の布帛クリーニング組成 物。 １８． プロテアーゼ酵素がN76D/V104I、N76D/S103A/V104Iおよびそれらの混 合物から選択されるBacillusズブチリシン変種である、請求項１３に記載の布帛 クリーニング組成物。 １９． 水性液中で過酸化水素を生じることができる少くとも約０．１重量％ のペルオキシゲン漂白化合物と少くとも０．１重量％の１種以上のブリーチ活性 剤からなる漂白剤を含んでなり、上記ブリーチ活性剤が ａ）下記一般式のブリーチ活性剤： またはそれらの混合物（上記式中Ｒ¹は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキ ル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ²は約１〜約１４の炭素原子を有 するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ⁵はＨあるいは約１ 〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、 Ｌは脱離基である） ｂ）下記式のベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤： （上記式中Ｒ₁はＨ）アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルで あり、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリー ル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、‐ＣＯＯＲ₆ （Ｒ₆はＨまたはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同 一または異なる置換基である） ｃ）下記式のＮ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤： （Ｒ⁶はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシア リールまたはアルカリール基である）と ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）の混合物 からなる群より選択されるものである、請求項１３に記載の布帛クリーニング組 成物。 ２０． 有機ペルオキシ酸漂白剤の対応カルボン酸が約３〜約６．５の範囲内 の親水性‐疎水性バランス値を有する、請求項１３に記載の布帛クリーニング組 成物。 ２１． 組成物１００ｇ当たりのプロテアーゼ酵素ｍｇ対有機ペルオキシ酸の 理論有効Ｏ₂ｐｐｍの比率が約１：１〜約２０：１の範囲内である、請求項２０ に記載の布帛クリーニング組成物。 ２２． （ａ）Bacillus lentusズブチリシンから誘導されるN76D/S103A/V104 Iズブチリシン変種であるプロテアーゼ酵素約０．０００１〜約１０％ （ｂ）水性液中で過酸化水素を生じることができる少くとも約０．１重量％の ペルオキシゲン漂白化合物と少くとも０．１重量％の１種以上のブリーチ活性剤 からなる漂白系約０．５〜約２０％〔上記ブリーチ活性剤が ｉ）下記一般式のブリーチ活性剤： またはそれらの混合物（上記式中Ｒ¹は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキ ル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ²は約１〜約１４の炭素原子を有 するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ⁵はＨあるいは約１ 〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、 Ｌは脱離基である） ii）下記式のベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤： （上記式中Ｒ₁はＨ）アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルで あり、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、およびＲ₅はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリ ール、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、‐ＣＯＯＲ₆（ Ｒ₆はＨまたはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同一 または異なる置換基である） iii)下記式のＮ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤： （Ｒ⁶はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシア リールまたはアルカリール基である）と、 iv）ｉ）、ii）およびiii)の混合物と、 からなる群より選択されるものである〕と、 （ｃ）少くとも約５％の界面活性剤と、 （ｄ）少くとも約５％のビルダーと、そして （ｅ）場合により、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤 、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵素安定剤、色素、香料およ びそれらの混合物からなる群より選択される、プロテアーゼ酵素および漂白系と 適合する１種以上のクリーニング組成物物質と を含んでなる布帛クリーニング組成物。 ２３． 界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネート、一級アルキルサルフェ ート、二級アルキルサルフェート、アルキルアルコキシサルフェート、アルキル アルコキシカルボキシレート、アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サル フェート化ポリグリコシド、α‐スルホネート化脂肪酸エステル、アルキルおよ びアルキルフェノールアルコキシレート、ベタインおよびスルホベタイン、アミ ンオキシド、Ｎ‐メチルグルカミド、ノニオン系一級アルコールエトキシレート 、ノニオン系一級アルコール混合エトキシ／プロポキシとそれらの混合物からな る群より選択され、更にビルダーがゼオライト、ポリカルボキシレート、積層シ リケート、ホスフェートおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求 項２２に記載の布帛クリーニング組成物。 ２４． 上記布帛クリーニング組成物の少くとも約０．００１重量％で、プロ テアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれら の混合物からなる群より選択される少くとも１種の酵素を更に含んでなる、請求 項２３に記載の組成物。 ２５． ブリーチ活性剤がベンゾイルカプロラクタム、ノナノイルカプロラク タム、（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートおよびそれ らの混合物からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。 ２６． ペルオキシゲン漂白化合物が過ホウ酸ナトリウム一水和物、過ホウ酸 ナトリウム四水和物、ピロリン酸ナトリウムペルオキシ水和物、尿素ペルオキシ 水和物、過炭酸ナトリウム、過酸化ナトリウムおよびそれらの混合物からなる群 より選択される、請求項２２に記載の組成物。 ２７． 過酸化水素対ブリーチ活性剤のモル比が約１．０以上である、請求項 ２６に記載の組成物。 ２８． Ｒ¹が約６〜約１２の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ²が約１ 〜約８の炭素原子を有し、Ｒ⁵がＨまたはメチルである、請求項２２に記載の組 成物。 ２９． Ｒ¹が約７〜約１０の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ²が約４ 〜約５の炭素原子を有し、Ｌが （上記式中Ｒ³は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｙは‐ＳＯ₃ ^- Ｍ⁺または‐ＣＯ₂ ^-Ｍ⁺であり、ここでＭはナトリウムまたはカリウムである） からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。 ３０． ベンゾイルカプロラクタム、オクタノイルカプロラクタム、ノナノイ ルカプロラクタム、３，５，５‐トリメチルヘキサノイルカプロラクタム、デカ ノイルカプロラクタム、ウンデセノイルカプロラクタムおよびそれらの混合物か らなる群より選択されるＮ‐アシルカプロラクタムを含んでなる、請求項２２に 記載の組成物。 ３１． クリーニングの必要な布帛を有効量の請求項１に記載の組成物を含有 した洗浄溶液と接触させることからなる、布帛のクリーニング方法。 ３２． クリーニングの必要な布帛を有効量の請求項２２に記載の組成物を含 有した洗浄溶液と接触させることからなる、布帛のクリーニング方法。