JPH09503902A

JPH09503902A - 組み換えウイルス免疫治療

Info

Publication number: JPH09503902A
Application number: JP6517281A
Authority: JP
Inventors: パオレッティ，エンゾ; タータグリア，ジェームズ; アイコックス，ウィリアム
Original assignee: ヴァイロジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1997-04-22
Also published as: US5942235A; EP0680331A1; DE69434581D1; DE69434581T2; EP0680331B1; US5833975A; US6537594B1; ES2255053T3; EP0680331A4; US6265189B1; AU6165294A; AU684070B2; WO1994016716A1; ATE313639T1; US20030198623A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍に関連した抗原および／またはサイトカインをコードしているＤＮＡを含む弱毒化された組み換えウイルス、それらのウイルスを用いる方法および複合体を開示するとともに請求の範囲とする。組み換えウイルスは、ＮＹＶＡＣあるいはＡＬＶＡＣの組み換え体であっても差支えない。ＤＮＡは、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、野生型あるいは変異型の核リン酸タンパク質p53、ヒトメラノーマ関連抗原、IL-2、ＩＦＮγ、IL-4、GMCSF、IL-12、B7、erb-B-2およびガン胎児性抗原（ＣＥＡ）のうちの少なくとも一つをコードする。組み換えウイルスとその遺伝子産物はガンの治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えウイルス免疫治療発明の分野本発明は改良されたポックスウイルス及びその使用と製造の方法に関するものである。さらに特筆すべき点は、本発明は、免疫治療への利用と同様、多種の病原菌に対する防御のための安全な遺伝子の導入手段としての利用を目的として、外来遺伝子の導入と発現のための改良されたベクターに関するものである。いくつかの文献が本出願で参照された。これらの引用文献の全ては、請求範囲に先立つ明細書の最後の部分に、またはそれらが言及されている場所に記載されており、これらの引用文献の各々は、ここにおいて参考文献として取り込まれたものとする。これらの文献は本発明が関係している技術に関するものである。発明の背景ワクシニアウイルスおよび近年では他のポックスウイルスが、外来遺伝子の導入および発現のために使われている。外来遺伝子を、感染可能な生ウイルスに導入する基本的な技術は、供与体プラスミド中のポックスウイルスのＤＮＡ配列を両端に持つ外来遺伝子と、レスキューポックスウイルス中の相同な配列との組み換えに関するものである。（Piccini等,1987）とりわけ、組み換えポックスウイルスは、当業者に知られているように二段階で、そして例えば、参考文献としてここに取り込まれている米国特許第4,769,33 号0、第4,772,848号、第4,603,112号、第5,100,587号および第5,179,993号に記述されたワクシニアウイルス、アビポックスウイルスなどの人工組み換え体を創出する方法の類似の方法によって構築されている。第一に、ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列、特に非ポックス由来のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ポックスウイルスの一部のＤＮＡと相同なＤＮＡがすでに挿入されている大腸菌プラスミド構築物の中へ設置される。別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列はプロモーターに連結される。プロモーターと連結した遺伝子は、ポックスＤＮＡ中の欠損可能な遺伝子座を含む部分の両端にあるＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列を両端に持つようにプラスミド構築物中に設置される。生成されたプラスミド構築物は大腸菌の増殖により増幅され、単離される。第二に、挿入されるＤＮＡ配列を含む単離されたプラスミドは、培養細胞即ちニワトリ胚繊維芽細胞に、ポックスウイルスとともに導入される。プラスミド中のポックスＤＮＡと相同な配列と、ウイルスゲノムとの組み換えは、染色体の欠損可能領域に外来ＤＮＡ配列を持つことを特徴とする組み換えウイルスを生ぜしめる。「外来」ＤＮＡとは、特に非ポックス由来で、その遺伝子が入れられたゲノムによっては本来生産されない遺伝子産物をコードしている異種ＤＮＡと定義する。一般に遺伝的組み換えとは、二本のＤＮＡ鎖の間でのＤＮＡの相同な部分の組み換えである。あるウイルスにおいてはＲＮＡがＤＮＡに代わることもある。核酸の相同な部分とは、同じ塩基配列をもつ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）部分のことである。遺伝的組み換えは、感染した宿主細胞中での複製、即ち新しいウイルスゲノムの製造の間に自然に起こることもある。故に、二つあるいはそれ以上のウイルスあるいは遺伝子構築物の共感染した宿主中で行われる複製の間にも遺伝的組み換えは起こりうる。第一のゲノムからのＤＮＡの一部が、共感染している第二のウイルスのゲノムの、第一のウイルスゲノムと相同性が高い部分の構築に互いに交換するように使われうる。しかしながら、遺伝的組み換えは異種のゲノム中の完全には相同ではないＤＮＡの部分の間でも起こりうるのである。そのような完全に相同ではないＤＮＡの部分が次のような第１のゲノムの一部であれば、すなわち、該第１のゲノムの一部が、例えば遺伝子マーカーや抗原決定基をコードしている遺伝子などが相同なＤＮＡの一部分の内部に挿入されて存在していること以外は第２のゲノムの一部と相同であれば、組み換えは起こり得るものであり、組み換えによる生産物は、組み換えウイルス染色体内の遺伝子マーカーあるいは遺伝子の存在により検出可能である。さらなるワクシニアウイルス開発のための戦略が近年報告された（Sc heiflinger等,1992;Merchlinsky and Moss,1992）。改変された感染可能なウイルスによる挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるには、ふたつの条件が要求される。第一には改変されたウイルスが生存できるように、挿入は、ウイルスの可欠領域に行われければならない。第二には、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモータを存在させることである。プロモータは発現されるべきＤＮＡ配列の上流に位置されていなければならない。ワクシニアウイルスは、天然痘に対する免疫誘導に効果的に利用され、1980年に世界中での天然痘根絶を完結させた。その歴史において、多くのワクシニア株が創生された。これらの異なった株は多様な免疫原性を示し、潜在的合併症に関して種々な程度に関与している。そのなかでもっとも深刻なものは、ワクチン後の脳炎と全身性痘疱である（Behbehani,1983）。天然痘の根絶とともに、ワクシニアの新しい役割（すなわち、遺伝的に操作をされた外来遺伝子の発現のためのベクターとしての役割）が重要になった。数多くの異種の抗原をコードしている遺伝子がワクシニア内で発現され、しばしば対応する病原菌の攻撃誘発に対する防御免疫となった（Tartaglia等、1990a,b）。ワクシニアベクターの遺伝的な背景が、発現された外来抗原の防御効果に影響を与えることが示されてきた。例えばエスプテインバーウイルス（Epstein Barr Virus（ＥＢＶ））gp340のワクシニアウイルスWyethワクチン株中での発現は、ＥＢＶウイルス誘導のリンホーマに対してコットントップタマリン（cotton top tamarins）を防御しなかったが、同じ遺伝子をワクシニアウイルスＷＲ実験室株で発現させた場合は防御作用を有していた（Morgan等,1988）。ワクシニアウイルスをベースとした組み換え体ワクチンの候補における安全性と好ましいバランスは極めて重要である。組み換えウイルスは、ワクチン接種された動物中で防御的な免疫反応を引き起こさせるがいかなる重大な病原性をも有さない免疫抗原として提供されなくてはならない。それゆえに、ベクター株の弱毒化は現在の技術水準を超えた非常に望ましい進歩であると思われる。培養組識中でのウイルスの増殖に必須ではなく、その欠失や不活性化がいろいろな動物系中での病原性（virulence）を減少させるような多くのワクシニア遺伝子が同定されてきた。ワクシニアウイルスチミジンキナーゼをコードしている遺伝子がマッピング（特定遺伝子の遺伝子地図上での位置を決定すること）され（Hruby等，1982年）、配列が決定された。（Hruby等，1983年；Weir等1983年）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の不活性化あるいは完全欠損は、幅広い種類の細胞中における組識培養でのワクシニアウイルスの増殖をさまたげない。ＴＫ^-ワクシニアウイルスは数多くの経路により生体内の種々の宿主中の、接種された場所で複製可能である。ヘルペス単式ウイルス（herpes simplex viras）Type２については、ＴＫ^-ウイルスのモルモット（guinea pig）への腟内接種（intravaginal inoculation）は、脊髄（Spinal cord）でのウイルス価（virus titer）がＴＫ⁺ウイルスを接種した場合と比較して顕著に低かった（Stanberry等，1985年）。ヘルペスウイルスにコードされたＴＫの生体外での活性は活発に代謝している細胞中でのウイルスの増殖にとって重要ではないが、静止状態の細胞（quiescent Cell）中では要求されることが示された（Jamieson等，1974年）。大脳内（intracerebral）および腹腔内（intraperitonea）経路で接種されたＴＫ^-ワクシニアの弱毒化がネズミ体内でみられた（Buller等，1985年）。弱毒化はＷＲ神経毒実験室株とWyethワクチン株の両方でみられた。皮内（intraderm al）ルートで接種されたネズミにおいては、ＴＫ^-組み換え体は親株であるＴＫ⁺ ワクシニアウイルスと比較して等量の抗ワクチン中和抗体を生産し、このテストシステムにおいてはＴＫ機能の欠除はワクシニアウイルスベクターの免疫原性を著しくは減少させないことが示された。ＴＫ^-およびＴＫ⁺の組み換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）のネズミへの鼻腔内（intranasal）接種では、脳を含む他の場所へのウイルスの伝ぱん（dissemination）がかなり少ないことがわかった（T aylor等，1991年）。ヌクレオチド代謝に関与する他の酵素はリボヌクレオチド還元酵素である。ヘルペス単式ウイルス（herpes simplexvirus（ＨＳＶ））における、ウイルスにコードされたリボヌクレオチド還元酵素活性のラージサブユニットをコードしている遺伝子の欠失による消失は、ウイルスの成育にも生体外で細胞を分割する際のＤＮＡの合成にも影響を与えないが、血清欠培地においては著しくウイルスの増殖能力を抑制した（Goldstein等，1988）。ネズミモデル系での、目へのＨＳＶの急性感染および三又神経節での再活性化しうる潜在感染（reactivatable,la tent infection in the trigeminal ganglia）においても、リボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットを欠損させたＨＳＶの毒性は、野生株のＨＳＶの毒性に比べて小さかった（Jacobson等，1989）。ワクシニアウイルスのリボヌクレオチド還元酵素のスモールサブユニット（Sl abaugh等,1988）もラージサブユニット（Jacobson等,1989）もともに同定されている。遺伝子の挿入によるワクシニアウイルスＷＲ株のリボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットの不活性化は、脳内経路で接種されたネズミによって測定されたウイルスの弱毒化をもたらす（Child等,1990）。ワクシニアウイルス血球凝集素遺伝子（ＨＡ）はマッピングされ、配列が決定された（Shida,1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は組識培養での増殖には必須ではない（Ichihash等,1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子の不活性化は脳内経路で接種されたウサギ体内での神経毒性を減少させ、皮内接種場所での障害（lesion）をより少なくする結果とになる（Shide等,1988）。ＨＡ座は、ＷＲ株（Shida等,1987）派生体であるリスター（Lister）株（Shiba et a.,19 88）およびコペンハーゲン株（Guo等,1989）において外来遺伝子の挿入座として使われる。組み換えの外来遺伝子を発現するＨＡ^-ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo等,1989,Itamura等,1990,Shida等,1988,Shida等,1987）、関係する病原菌の投与に対して防御的に作用する（Gou等,1989;Shida等,1988）。牛痘ウイルス（Brighton red strain）は出血促進性の赤痘疹をトリの卵の漿尿膜上につくる。牛痘ゲノム内での自発的な欠失により、白い痘疹を生じさせるミュータントが生じてくる（Pickup等,1984）。出血促進性機能（hemorrhagic f unction（ｕ）は初期遺伝子によってコードされている38Ｋダルトン（ＫＤａ）のタンパク質にマップされている（Pickup等,1986）。この遺伝子はセリンプロテアーゼのインヒビターと相同性があり、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症反応を阻害し（Palumbo等,1989）、同時に血液凝固の阻害剤としても機能する。Ｕ遺伝子はワクシニアウイルスＷＲ株にも存在する（Kotwal等,1989b）。Ｕ遺伝子が外来遺伝子の挿入によって不活性化されているＷＲワクシニアウイルス組み換え体を接種されたネズミは、Ｕ遺伝子が未処置のままである上記類似のワクシニアウイルス組み換え体を接種されたネズミと比較して、外来遺伝子の生産物に対してより高い抗体価を示す（Zhou等,1990）。Ｕ領域はワクシニアウイルスコペンハーゲン菌株の欠損無機型（defective nonfunctional form）にも存在する（ＯＲＦＢ13，Ｂ14，名称はGoebel等,1990a,bの報告に従う）。牛痘ウイルスは感染した細胞内で、細胞質（cytoplasmic）Ａ型封入体（inclu sion body）（ＡＴＩ）に局在する（Kato等,1959）。ＡＴＩの機能は、牛痘ウイルス粒子が動物間を伝ぱしている間の牛痘ウイルスに対する防御機能であると考えられている（Bergion等,1971）。牛痘ウイルスのＡＴＩ領域遺伝子はＡＴＩボディのマトリックスを形成する160ｋＤａのタンパク質をコードしている（Funah ashi等,1988;Patel等,1987）。ワクシニアウイルスは、染色体上に相同性のある部分をコードしているが、一般にＡＴＩを生産しない。ワクシニアＷＲ株は染色体上のＡＴＩ領域は94ＫＤａのタンパク質として翻訳されている（Patel等,1988 ）。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株では、ＡＴＩに相当するＤＮＡの配列のほとんどは欠失しており、ＡＴＩ領域の上流域と融合した３′末端が残っており、ＯＲＦＡ26Ｌを形成している（Goebel等,1990a,b）。多様なワクシニアウイルスノゲムの左端付近の自発的（Altenburger等,1989;D rillien等,1981;Lai等,1989;Moss等,1981;Paez等,1985;Perkus等,1989;Perkus等 ,1986）あるいは遺伝子操作された、欠損が報告されている。ひとつの10ｋｂの自発的欠失をもつワクシニアウイルスＷＲ株は、脳内（intracranial）接種でのネズミ中で弱毒化されることが示された。この欠失は、17の潜在的ＯＲＦを含んでいることがのちに判明した。欠失した領域内にある特定の遺伝子はVirokine Ｎ１Ｌおよび35ＫＤａのタンパク質（Ｃ３Ｌ Soehelらの報告での命名1990a.b ）であった。挿入によるＮＩＬの不活性化は、普通のネズミおよびヌードネズミの脳内（intracranial）接種での毒性を減少させる（Kotwal等,1988a）35ＫＤａタンパク質はＮ１Ｌのようにワクシニアウイルスに感染した細胞の培地中へ分泌される。このタンパク質は補体制御（complement control）タンパク質のファミリー、とくに補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）と相同性が高い（Kotwal等,1 988a）。細胞のＣ４ｂｐのように、ワクシニア 35ＫＤａタンパクは、第四の補体複合体と結合し、補体活性化（classical complement）カスケードを阻害する（Kotwal等,1990）。かくして、ワクシニア35ＫＤａタンパク質は、ホストの有する防御機構に対してウイルスが侵入するのを助けるのに関与しているように見える。ワクシニアゲノムの左端は、宿主範囲遺伝子Ｋ１Ｌ（Gillard等,1986）およびＣ７Ｌ（Perkus等,1990）と同定された２つの遺伝子を含んでいる。これら２つの遺伝子の両方の欠損は、種々のヒト細胞系統でのワクシニアウイルスの増殖能力を減少させる（Perkus等,1990）。２つの付加的なワクチンベクター系が、自然に宿主が制限されたポックスウイルスであるアビポックスウイルスの利用に関与している。鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）およびカナリアポックスウイルス（ＣＰＶ）の両方が，外来遺伝子の発現のため遺伝子工学的に操作されてきた。鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）はポックスウイルス科のアビポックス属の原型とも言うべきウイルスである。このウイルスは、経済的に重要な家禽の1920年代から弱毒化された生ワクチンの利用によってコントロールされている病気をひきおこす。アビポックスウイルスの複製は鳥類の種に限られており（Mattheus,1982b）、人間を含む鳥以外の種への生産的な自己増殖性感染（productive infection）をひきおこすアビポックスウイルスに関する文献はない。この宿主制限は、ウイルスの他の種への伝ぱに対する内在的な安全バリアを提供し、アビポックスウイルスベースのワクチンベクターを獣医学および人間の治療に応用する意義を高める。ＦＰＶは、家禽の病原菌由来の抗原を発現させるベクターとして有用に利用されている。有毒な鳥インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）タンパク質がＦＰＶ組換え体によって発現された（Taylor等,1988 a）。組み換え体をニワトリと七面鳥に接種したのち、同種または異種の有毒インフルエンザウイルスの抗原投与に対して防御的な免疫反応が誘導された（Taylor等,1988a）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現しているＦＰＶ組み換え体もまた開発された（Taylor等,1990;Edbaner等,1990）。ＦＰＶおよびＣＰＶが複製可能な宿主が鳥系に制限されているにもかかわらず、これらのウイルスから派生した組み換え体は、鳥以外の起源の細胞中でも、外因性のタンパク質を発現する。さらに、そのような組換えウイルスは、外来遺伝子産物を標的とした免疫学的反応を誘発することが示され、好ましい例では、一致する病原菌の抗原投与に対して防御するだけの余裕があることを示した（Tartag lis等,1993a,b;Taylor等,1992;1991b;1988b）。過去にウイルスはガン免疫療法に利用できることが示され、そこにおいては、それらは腫瘍の免疫反応性を早める手段を供給する。ニューカッスル病ウイルス（Cassel等,1983）、インフルエンザウイルス（Lindenmann,1974;Lindenmann,19 67）およびワクシニアウイルス（Wallack等,1986;Simizu等,1988;Simizu等，198 4;ujimara等,1984）が、腫瘍修飾抗原または腫瘍特異的および腫瘍非特異的免疫効果エフェクター機構を誘導するところのアドジュバント（免疫助成剤）として行動しうることを示す例が存在する。しかしながら、腫瘍生物学、分子生物学、免疫学分野での進歩により、このようなアプローチは、より目的を絞ったガンの免疫療法のアプローチに道をゆずった。例えばサイトカインを発現させるための腫瘍細胞および免疫エフェクター細胞（すなわち腫瘍浸潤化リンパ球）の遺伝子工学的改変は、腫瘍特異的免疫反応を増大させるという点で動物モデルおよび人間において有望な結果を供給してきた（Paradoll,1992;Rosenberg,1992）。さらに、腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）の決定は、ある種のガンの免疫学的生物学上における前記ＴＡＡの役割（最終的にはガンの予防や治療を行う際に適用されるかもしれない）を調査する機会を提供した（van der Braggen,1992）。真核性のワクチンベクターの利用の進歩は、ガン予防および治療におけるウイルスの新しい興味を供給してきた。外来遺伝子産物の発現のために遺伝子操作されたウイルスにはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレトロウイルスがある。もっとも注目すべきことにはレトロウイルス，アデノウイルスおよびポックスウイルスを基にした組み換えウイルスが、ベクターに基づいたワクチン、遺伝子治療およびガン治療における生体内での利用を意図して開発されたことである（Tartaglia,in p ress Tartaglia,1990）。ガンや新生物との戦いへの免疫治療法的アプローチは、古典的なワクチン接種の方式（scheme）または細胞ベースの治療の形をとる。免疫治療ワクチン接種は、腫瘍細胞において特異的にあるいは高レベル発現されるところの抗原決定基に対するガン患者の免疫反応を誘導または促進するためのものである。腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）は一般に免疫原性が弱いので、腫瘍は患者の免疫系に妨害されずに増殖可能である。通常は、病気の度合の深刻さは、腫瘍細胞に対する免疫反応の創出より腫瘍の増殖が早いことに関連している。当然の結果して、患者は腫瘍の増殖および拡散を制御および防止するために十分な免疫反応が立ちあがる前に、腫瘍に屈してしまう。ポックスウイルスベクター技術は、ＴＡＡに対する免疫反応の誘発に利用されている。ＴＡＡを発現するポックスウイルスベースの組み換え体が、動物モデルにおいて、実験室内で誘導された腫瘍の免疫予防および免疫治療において有用性を示した例が存在する。ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードしている遺伝子が、ヒト結腸腫瘍細胞から単離され、ワクシニアウイルスゲノム中に挿入された（Ka ufman等,1991）。ワクシニアベースＣＥＡ組み換え体の接種は、ＣＥＡ特異的抗体および抗腫瘍活性をネズミモデルで誘導した。この組み換えウイルスは、体液性の細胞を仲介した反応をアカゲザル，マカク（サルの一種）で誘導することが示されている（Kantor等,1993）。ヒトメラノーマＴＡＡ（ｐ97）もまたワクシニアウイルスに挿入され、ネズミを腫瘍移植片から防御することが示されている（Hu等,1998;Estin等,1987）。さらなる例がBernards等,(1987)によって記述されている。これらの研究者は、ラットのｎｅｕにコードされた膜内外（transmem brane）糖タンパク質の（ｐ185）の細胞外部分を発現するワクシニア組換え体を構築した。この組み換え体ウイルスで免疫化されたネズミは、ｎｅｕ遺伝子産物に対して強力な体液性反応を示し、それに続く腫瘍抗原投与に対しても防御された。分泌型あるいは膜結合型の胸部ガン関連上皮（epithlical）腫瘍抗原（ＥＴＡ）を発現するワクシニアウイルス組換え体が開発された（Hareuveni等,1991;1 990）。これらの組み換えウイルスは、抗ＥＴＡ抗体をネズミ中で誘導し、ｒａｓ −を形質転換した腫瘍化（tumorigenic）抗原投与に対してネズミを防御した（Hareuveni等,1990）。さらに、ポリオーマウイルス（polyoma virus）派生Ｔ −Ａｇを発現するワクシニアウイルス組換え体は、ネズミ腫瘍モデル系での治療および予防に効果的であることが示された（Lathe等,1987）。組み換えワクシニアウイルスは、サイトカイン遺伝子の発現にもまた利用される（Rnby等,1992）。ある種のサイトカイン（ＩＬ−２，ＩＦＮ−α，ＴＮＦ− α）の発現は、ネズミ中でのワクシニアウイルス感染の自己制限につながり、この性質によりウイルスを弱毒化するように働く、他のサイトカイン（すなわち、ＩＬ−５，ＩＬ−６）の発現は、共発現（modulate）された外因性の免疫原への免疫反応をやわらげることが示された（Reviewed by Ruby等,1992）。しばしば，腫瘍細胞に対する免疫反応はＴ細胞、特に腫瘍細胞およびウイルス感染した細胞を殺すことができる白血球細胞である細胞障害性リンパ球（ＣＴＬｓ）によって仲介される。ＣＴＬｓのふるまいは、サイトカインと呼ばれる水溶性ファクターによって制限される。サイトカインは、ＣＴＬｓの増殖、分化および機能特性、並びに他の免疫効果を有する細胞の増殖、分化および機能特性を制御する。動物のモデルにおいて、細胞ベースの免疫療法がウイルスおよび腫瘍に対する効果的な治療を供給することが示されている（Greehberg,1991;Pardoll,1992;Ri ddel等,1992）。サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）（ＣＭＶ）特異性ＣＴＬクローンが骨髄提供者から近年単離された。これらのクローンはin vitroで繁殖され、拡大され、最後には免疫不全骨髄患者に戻された。これらの移されたＣＭＶ−特異性ＣＴＬクローンは、毒性は全く示さず、移植された患者の中でＣＭＶ感染を防ぐＣＤ₈₊ＣＭＶ特異的ＣＴＬ反応が持続した（Riddel等,1992）。細胞ベースの免疫治療には２つの型がある。これらは、ひとつは腫瘍と反応するリンパ球をin vitroでふやし、ふたたび宿主へもどすという方法に関与する養子関係の免疫治療で、もうひとつは腫瘍細胞を免疫化し、潜在している既存の腫瘍特異性免疫反応を促進するかまたは新しい腫瘍特異性免疫反応を誘導し、抗腫瘍免疫系を供給することに関与する能動的な免疫治療である。免疫治療用ワクチン接種は、ガン患者の腫瘍細胞において特異的に発現されるかまたは高度に発現されているところの抗原決定基に対するガン患者の免疫反応を促進または誘導するものである。ＮＹＶＡＣ，ＡＣＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ等の安全性が高められた新しい菌株を提供することは、現在の技術水準を超える非常に望ましい進歩であると思われる。例えば、より安全なワクチン、またはウイルスによる遺伝子または遺伝子発現によるより安全な遺伝子産物を提供するために有用である。発明の目的それゆえ、本発明の目的は安全性を有する改良された組み換えウイルスおよびそのような組み換えウイルスの製造方法の提供することである。公知の組み換えポックスウイルスワクチンと比較して、安全性の高い組み換えポックスウイルスワクチンを提供することもまた、本発明の目的の一つである。宿主中での弱毒化のために改良された宿主中で遺伝子産物を発現するベクターを提供することも、さらなる本発明の目的である。改良された組み換えウイルスまたは改良されより安全性の高められたベクターを用いた、in vitroで培養された細胞中での遺伝子産物の発現の方法を提供することもまた本発明の別の目的である。これらのおよび他の本発明の目的および利点は以下の記載により明白になるであろう。発明の記載本発明はその一つの側面において、ウイルスにコードされた遺伝子機能が不活性化され、それによってして弱毒化されて安全性が高められている改良された組み換えウイルスに関するものである。上記不活性化は、必須ではない遺伝子機能に対して行われることがあり、あるいは毒性に関与するものに対して行われ得る。ウイルスは好ましくはポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスやカナリアポックスウイルスのようなワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルスである。改良された組み換えウイルスはウイルスゲノムの可欠領域中に病原菌、腫瘍関連抗原、サイトカインまたはそれらの組み合わせから派生した抗原タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を有することができる。本発明はもう一つの側面において、ウイルスにコードされた可欠の機能が不活性化され、それによって弱毒化されて安全性が高められたウイルスと担体よりなる、接種された宿主動物内の抗原反応を誘発するところのワクチンに関するものである。本発明のワクチンで使われるウイルスは好ましくはポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスやカナリアポックスウイルスなどのワクシニアウイルスおよびカナリアポックスウイルスである。改変された組み換えウイルスは、ウイルスゲノムの可欠領域内に、病原菌由来のもの、腫瘍関連抗原、サイトカインおよびこれらの組合せなどの外来ＤＮＡ配列を有することが可能である。本発明はさらに別の側面において、ウイルスにコードされた可欠の遺伝子機能が不活性化され、それによって弱毒化されて安全性が高められた改良された組み換えウイルスを含む免疫原性混合物（immunogenic composition）に関するものである。この改良された組み換えウイルスは、ウイルスゲノムの可欠領域内に、病原菌由来のもの、腫瘍に関係した抗原、サイトカインまたはそれらの組み合わせなどの異種ＤＮＡ配列を有することが可能であり、前記免疫原性混合物は、宿主に投与された際には、病原菌にコードされたタンパク質に特異的な免疫学的反応を誘導することが可能である。本発明はさらに別の側面において、弱毒化されて安全性が高められた改良された組み換えウイルスの導入によるin vitroで培養された細胞中での遺伝子産物の発現に関するものである。この改良されたウイルスは、病原菌由来のもの、腫瘍に関係した抗原、サイトカインまたはそれらの組み合わせなどである。本発明はさらにまた別の側面において、ウイルスにコードされた可欠の機能が不活性化されそれによって弱毒化された改変された組み換えウイルスであってゲノムの可欠領域中に外来ＤＮＡを有するものに関する。外来ＤＮＡは病原菌由来のもの、腫瘍に関係した抗原、サイトカインまたはそれらの組み合わせなどをコードし得る。特に、毒性の要素となるオープンリーディングフレームを欠失させることにより、自然に宿主が限定されたウイルスの遺伝子機能が不活性化されている。本発明にしたがって利用されるウイルスは、好ましくはポックスウイルス特に鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなどのワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルスである。好ましくは、前記オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ，Ｂ13Ｒ，＋Ｂ14Ｒ，Ａ26Ｌ，Ａ56Ｒ，Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌ（Goebel等,1990 a,bによる命名による）およびそれらの組合せより成るグループから選ばれたものである。この点に関し、前記ＯＲＦはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａタイプ封入体遺伝子、血球凝集遺伝子、宿主範囲遺伝子領域またはリボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットあるいはこれらの組合せより成る。改変されたワクシニアウイルスコペンハーゲン株がＮＹＶＡＣと同定された（Tariaglid等,1992）。図面の簡単な説明以下の詳細な記述は例として示されたものであり、本発明を記述された実施例のみに限定することを意図するものではない。以下の記述は、添付の図面を参照することにより良く理解されるであろう。第１図は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の欠失のためのプラスミドｐＳＤ 460の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ410の開発方法を図式的に示している。第２図は、出血性領域の欠失のためのプラスミドｐＳＤ486の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ553の開発方法を図式的に示している。第３図は、ＡＴＩ領域の欠失のためのプラスミドｐＭＰ494△の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ618の開発方法を図式的に示している。第４図は、血球凝集素の欠失のためのプラスミドｐＳＤ467の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ723の開発方法を図式的に示している。第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＫ１△の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ804の開発方法を図式的に示している。第６図は、リボヌクレオチド還元酵素ラージユニットの欠失のためのプラスミドｐＳＤ548の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ866（ＮＹＶＡＣ）の開発方法を図式的に示している。第７図は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をＴＫ欠失座への挿入するためのプラスミドｐＳＤ548の構築方法および組み換えワクシニアウイルスｖＰ879の開発方法を示している。第８図は、Ｃ５ＯＲＦを含むカナリアポックスＰｖｕII断片のＤＮＡ塩基配列（配列番号６８）を示している。第９Ａ図および第９Ｂ図は、組み換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ65（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築方法を図式的に示している。第10図は、ＮＹＶＡＣ開発のために欠失されたＯＲＦを図式的に示している。第11図は、Ｆ８ＯＲＦを含んでいるＴＲＯＶＡＣのＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号７７）を示している。第12図は、Ｆ７ＯＲＦを含んでいる2356ｂｐのＴＲＯＶＡＣのＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号７８）を示している。第13Ａ図より第13Ｄ図までは、同じあるいは別のワクチンで前もって免疫化されたボランティアの体内での、ＨＤＣおよびｖＣＰ65（10^5.5ＴＣＩＤ50）の追加免疫効果を示す狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＩＩＵ／ｍｌ）のグラフを示している。第14Ａ図より第14Ｃ図までは、ＡＬＶＡＣＣ３挿入サイトを含む7351ｂｐの断片の塩基配列を示しいる。第15図は、ｖＣＰ245由来の、Ｈ６／ＴＮＦ−α発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号７９）を示している。第16図は、ｖＰ1200由来の、Ｈ６／ＴＮＦ−αの発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号８９）を示している。第17図は、ｖＰ1101由来の、Ｈ６／ｐ53（野生型）発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号９９）を示している。第18図は、ｖＣＰ207由来の、Ｈ６／ｐ53（野生型）発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号103）を示している。第19図は、ｖＣＰ235由来の、Ｈ６／ＭＡＧＥ−１発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号109）を示している。第20図は、ｐＭＡＷ037由来の、Ｈ６／ＭＡＧＥ−１発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号110）を示している。第21Ａ図および第21Ｂ図は、ｐ126.15血清ｃＤＮＡインサートの塩基配列と推定されるアミノ酸配列に沿って（配列番号119；配列番号120）を示している。第22図は、ｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３．２由来の、Ｈ６／ＣＥＡ発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号144）を示している。第23図は、ｐＨ６．ＣＥＡ．ＨＡ由来の、Ｈ６／ＣＥＡ発現カセットおよびそれに隣接している領域の塩基配列（配列番号145）を示している。第24図は、ネズミＩＬ−２遺伝子の翻訳開始コドンから終始コドンまでの塩基配列（配列番号150）を示している。第25図は、修正されたヒトＩＬ−２遺伝子の翻訳開始コドンから終始コドンまでの塩基配列（配列番号159）を示している。第26図は、Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγ発現カセットの塩基配列（配列番号163）を示している。第27図は、Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮγ発現カセットの塩基配列（配列番号168）を示している。第28図は、ｐＣ６ＨIII ３ｋｂ中のカナリアポックスインサートの塩基配列（配列番号169）を示している。第29図は、ｐＣ６Ｌの塩基配列（配列番号174）を示している。第30図は、Ｅ３Ｌ／ネズミＩＬ−４発現カセットの塩基配列（配列番号178）を示している。第31図は、Ｅ３Ｌプロモーターの支配下にあるヒトＩＬ−４遺伝子より成る発現カセットの塩基配列（配列番号186）を示している。第32図は、ワクシニアＥ３Ｌ／ｈＧＭＣＳＦ発現カセットの塩基配列（配列番号191）を示している。第33図は、ＥＰＶ 42ｋＤａ／ヒトＩＬ−12 ｐ40発現カセットの塩基配列（配列番号194）を示している。第34図は、ワクシニアＥ３Ｌ／ヒトＩＬ−12 ｐ35発現カセットの塩基配列（配列番号199）を示している。第35図は、ネズミＢ７遺伝子の塩基配列（配列番号202）を示している。第36図は、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣに感染されたネズミ腫瘍細胞中でのネズミＢ７の発現のフロー血球計算による分析を示している。第37図は、ヒトＢ７遺伝子の塩基配列（配列番号207）を示している。第38図は、ネズミｐ53をコードしている配列（配列番号214）を示している。第39図は、ヒトｐ53をコードしている遺伝子の配列（配列番号215）を示している。発明の詳細な記述新しいワクシニアワクチン株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）の開発のため、ワクシニアウイルスコペンハーゲンワクチン株が、ゲノム上の既知または潜在的毒性要素をコードしている六つの可欠領域を欠損させることにより、改変された。一連の欠失の過程を以下に詳述する。すべてのワクシニア制限酵素断片ＯＲＦおよび拡散の位置はCoebel等,1990 a，bの報告に基づいている。欠失座（loci）はまた、外来遺伝子挿入のための座として操作された。ＮＹＶＡＣにおいて欠失された領域を以下に列挙した。同時に、略語および欠失されたオープンリーディングフレームの名称（Coebel等,1990 a b）、並びに所定の遺伝子１つずつを欠失させていって最後に所定の遺伝子すべてを欠失させたワクシニア組み換え体も列挙した。 (1)チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ410 (2)出欠性領域遺伝子（Ｕ；ＢＢＲ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ553 (3)Ａタイプ封入体領域遺伝子（ＡＴＩ；Ａ２６Ｒ）ｖＰ618 (4)血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ56R）ｖＰ723 (5)宿主範囲領域遺伝子（Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ）ｖＰ804 (6)リボヌクレオチド還元酵素Ｌサブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ866（ＮＹＶＡＣ）ＮＹＶＡＣは毒性および宿主範囲に関連した遺伝子産物をコードしている18のＯＲＦの特異的欠失により開発された遺伝子操作されたワクシニアウイルスである。ＮＹＶＡＣは1)新生ネズミにおける大脳内の接種後毒性が小さいこと、2)遺伝的に（ｎｕ⁺／ｎｕ⁺）または化学的に（シクロホスファミド：cyclophosphami de）免疫無防備状態のネズミに接種できること、3)免疫無防備状態のネズミ間で拡散的感染を引きおこさないこと、4)ウサギ皮膚上に重大な硬化および潰瘍を引き起こさないこと、5)接種地点から迅速に消えること、6)ヒトの器官由来のものを含む、さまざまな組識培養細胞上での複製能力が大きく減少することなどの多くの基準からみて、非常に弱毒化されている。にもかかわらず、ＮＹＶＡＣをベースとしたベクターは外来の免疫原へのすばらしい反応を誘導し、防御免疫を提供する。ＴＲＯＶＡＣとは、生後１日のニワトリに認可されている鶏痘ウイルスのワクチンＦＰ−１から派生し、プラーククローンで単離された弱毒化された鶏痘ウイルスをいう。ＡＬＶＡＣは認可されたカナリアポックスワクチン、カナポックス（Tartaglia等,1992）よりプラーククローンされた派生体であるカナリアポックスウイルスをベースとした弱毒化されたベクターである。ＡＬＶＡＣは、カナポックスのいくつかの一般的な特徴と同じ一般的な特徴を有する。ＡＬＶＡＣをベースとした、外来免疫原を発現する組み換えウイルスは、ワクチンベクターとして効果的であることも示されている（Tartaglia等,1993 a，b)。このアビポックスウイルスベクターは、増殖的な複製は鳥類の種に限られているヒト細胞培養においてはカナリアポックスウイルスの複製はウイルスＤＮＡ合成以前のウイルス複製の初期段階で停止する。しかしながら、カナポックスウイルスは外来の免疫原の発現のために操作されると、確認できる発現およびプロセシングがin vitro の哺乳類の細胞でみられ、また種々の哺乳類種に接種すると、外来抗原に対する抗体および細胞の免疫反応を誘導し、抗原のもとになった病原菌の投与に対して防御を提供する（Taylor等,1992,Taylor等,1991）。最近のヨーロッパ、アメリカ両方でのフェーズ１臨床試験でカナリアポックス／狂犬病糖タンパク組み換え体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）は、実験的ワクチンは十分に耐性で防御的レベルの狂犬病抗体中和抗体価を誘導したことが示された（Cadoz等,1992）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧワクチンから派生した末梢血単核細胞ＰＢＭＣｓは、精製された狂犬病ウイルスで刺激されたときに重大なレベルのリンパ球拡散を示した。（Fries 等,1992）。ウイルスやベクターなどの遺伝子材料の物理的封じ込めのガイドライン、すなわち特定のウイルスやベクターの病原性に基づいたこのようなウイルスやベクターの利用の安全手順のガイドラインを協議しているＮＩＨ（National Institute of Health,US,Public Health Service）の組み換えＤＮＡ監視委員会（Recombi nant ＤＮＡ Advisory Committee）が、ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは物理的封じ込めをＢＬ２からＢＬ１に下げることを承認した点において、これらＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣはすべてのポックスウイルスのなかでユニークである。他のポックスウイルスでＢＬ１の物理的封じ込めレベルを有するものはいない。ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ですら（ありふれた天然痘ワクチンですら）より高い物理的封じ込めレベル、すなわちＢＬ２を有する。したがってＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは他のポックスウイルスとくらべて毒性が低いことが認識される。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベースの組み換えウイルスはin vitroでヒトＰＢＭＣｓ由来のＣＤ₈ ⁺ＣIIsを刺激することが示された（Tartaglia等,1993a）。いろいろな型のＨＩＶ−１エンベローブ糖タンパク質（envelope glycoprotein）を発現するＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの組み換え体で免疫化されたネズミにおいては、最初のＨＩＶ特性ＣＴＬ反応および二度目の接種で呼び起こされたＨＩＶ特性ＣＴＬ反応を起きた（Tartaglia等,1993 a）。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖおよびＮＹＶＡＣ−ｅｎｖ組み換え体（ＨＩＶ−１エンベローブ糖タンパク質（envelo pe glcoprotein）を発現）は、ＨＩＶ−１に感染した個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）からの強いＨＩＶ特異的ＣＴＬ反応を刺激した（Tartaglia等,1993a ）。急性感染された自家ＰＢＭＣが、残りのＰＢＭＣへの刺激を与える細胞として使用された。異種ＩＬ−２の非存在下で10日間の保温のあと細胞中のＣＴＬ活性が測定された。ＮＹＶＡＣ−ｅｎｖおよびＮＹＶＡＣ−ｅｎｖは高いレベルの抗ＨＩＶ活性を刺激していた。ゆえに、これらのベクターは、抗原反応性リンパ球のex vivoでの刺激に十分に有用である。例えば生体外で腫瘍反応性リンパ球を発現させそれを宿主（患者）にもどすなどの養子免疫治療に有用である。患者の腫瘍細胞によって作られたＴＡＡを発現するＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣをベースにした組み換えウイルスを用いて患者を免疫することにより、腫瘍の拡散を妨げるか防止するし、腫瘍による潜在的な患者の負担をなくすのに十分なレベルまで抗腫瘍免疫反応をより早くすることができる。ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣベクターの弱毒化の概要と、外来免疫原に対する体液および細胞免疫反応を誘導する上記ベクターの能力（Tartag lia等,1993 a,b，Taylor 1992,Konishi 1992）に基づいて、このような組み換えウイルスは、前述のワクシニアベースの組み換えウイルスをこえてきわ立った利益を提供する。免疫治療のワクチンまたは混合物の形態で使用するこのような組み換えウイルスの免疫化の手順は、非経口の経路（皮内，筋肉，皮下）である場合もある。そのような投与は、特定のＴＡＡに対する体系的な免疫反応を可能にする。他の選択としてはワクチンまたは混合物を直接腫瘍部分，腫瘍内に投与することもありうる。そのような経路の投与によって、腫瘍に特異的に関連しているリンパ球の抗腫瘍活性を促進可能である（Rosenberg.1992）。患者の腫瘍細胞によって生産されたＴＡＡｓを発現するＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣあるいはＴＲＯＶＡＣをベースとした組み換えウイルスによって患者を免疫化すると、、抗腫瘍免疫反応をより速くすることができ、腫瘍の拡散を妨害または停止しかつ腫瘍による患者の負担を潜在的に排除するのに十分なレベルまで抗腫瘍免疫反応を高めることができる。ポックスウイルスベースの組み換えワクチンのワクチン接種の結果生じるこの高められた腫瘍特異的免疫反応性は、腫瘍を永久に沈静化することをも含めた沈静化という結果をもたらす可能性である。組み換えポックスウイルスが開発されかつ本発明に従って遺伝子治療に用いられるところの既知のＴＡＡの例としては、p53（Hollatein等,1991），p21-ras（Almoguera等,1988），HER-2（Fendly 等,1990）およびメラノーマ関連抗原（MAGE-1，MZE-2）（vanderBruggen等,1991 ）およびｐ97（Hu等,1988）および結腸，直腸のガンに関するガン胎児性抗原（K antor等,1993，Fishbein等,1992，Kaufman等,1991）などが挙げられるが、とくにこれらに限定されるわけではない。より一般的には、工夫されたワクチンまたは混合物（本発明の組み換えポックスウイルスを含むワクチンまたは混合物）は、関連の当業者によってよく知られている標準的な技術に従って準備される。このようなワクチンまたは混合物は、医学関係の当業者によって、患者の年令、性別、体重および状態；並びに投与の方法を考慮して、必要に応じて、適量で患者に投与することができる。このワクチンまたは混合物は、他の、抗壊死剤、抗腫瘍剤または抗ガン剤および／あるいは抗壊死剤、抗腫瘍剤または抗ガン剤の副作用を減少または軽減させる薬と同時にまたは連続して、投与の経路、患者の状態、体重、性別、年齢などを考慮に入れながら投与できる。本発明のワクチンまたは混合物の例としては、開口部すなわち口，鼻，尻，腟など用の液体製剤；懸濁液、シロップあるいはアルコール溶液での投与；無菌懸濁液またはエマルジョン等の非経口投与、皮下投与、皮内投与、筋肉投与および静脈内投与（すなわち注射での投与）などが考えられる。このような混合物中において、組み換えポックスウイルスは、滅菌水，生理食塩水，ブドウ糖等の適当な担体，希釈液または賦形剤との混合物中となっている。本発明の組み換えポックスウイルスは、例えば等浸透圧水溶液，等塩緩衝液中で元の状態に戻るような、凍結乾燥状で提供しうる。さらに、本発明は組み換えウイルスが提供されたキットをも内包している。本キットは、適当な担体，希釈液または賦形剤を含んでいる別々のコンテナを含むこともある。本キットはまた、抗ガン剤，抗腫瘍剤または抗壊死剤および／または抗壊死，抗腫瘍または抗ガン剤の副作用を軽減させる薬を同時あるいは引き続いて投与のために含むこともある。さらに、本キットは、各成分の混合あるいは組合せの仕方、および／または投与の仕方の指示を含ませることもできる。ポックスウイルスベクター技術は、リンパ球や腫瘍細胞をガンの細胞ベースの免疫治療用に操作するための注目すべきアプローチを提供する。このような用途での有用性を付与するＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣベクターの特徴しては、 1) それらの、細胞へ侵入するための特異的なレセプターが明白に独立していること。 2) それらの起源が種または組織特異的であるにかかわらず、外来遺伝子の細胞基質内での発現が可能であること。 3) 宿主細胞による制限を受けないで外来遺伝子を発現できること。 4) ポックスウイルス組み換え体ウイルスの利用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＡｓ）からの特異的ＣＴＬ反応性を増幅できるみこと。 5) 既存のワクシニアウイルス株と比較して、非常に弱毒化されていること、などがあげられる。（Tartaglia等,1993 a,Tartaglia等,1990により総括されている）ＮＹＶＡＣ，ＡＣＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣを元にした組み換えウイルスによる特異的なサイトカインの発現または特異的なサイトカインとＴＡＡの共発現は、腫瘍細胞の排除または逓減効果に関連したＣＴＬの数と抗腫瘍活性を促進する。この観点から有用な効果を持つサイトカインの例として腫瘍懐死因子の（ＴＮＦα），インターフェロン−ガンマ（ＩＮＦ−γ），インターロイキン−２（ＩＬ−２），インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−７（ＩＬ−７）が挙げられる（Pardoll，1992により総括）。サイトカイン，インターロイキン２（ＩＬ−２）は、免疫的に仲介された細胞の促進に中心的な役割を果たす。リンパ球のサブセットＴ_H１によって分泌されたＩＬ−２はＣＤ₄ ⁺およびＣＤ₈ ⁺の両方のＴ細胞の分裂を刺激するＴ細胞増殖因子である。さらに、ＩＬ− ２はＢ細胞単球およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）もまた活性化し、ＩＬ −２は単球およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）もまた活性化し、ＩＬ−２の生物学的効果は、かなりの程度、ＩＦＮγの生成の誘導における役割によるものである。ＩＬ−２を発現する組み換えワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して弱毒化されている。これは、ワクシニアによって発現されたＩＬ−２がネズミＮＫ細胞を刺激し、ＩＦＮγを生産させ、組み換えワクシニアウイルスの成長を制限することによるものである（Karupiah等,1990）。同様に、免疫欠損、胸線欠損ネズミに対して、ＩＬ−２とインフルエンザＨＡ遺伝子の両方を発現する組み換えワクシニアウイルスで接種すると、それに続くインフルエンザウイルスの投与に対して防御能を有するようにすることができる（Karu piah等,1992）。サイトカイン，インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）はリンパ球Ｔ_H１サブセットによって分泌される。ＩＦＮγは免疫反応で仲介されたＴ_H１セルを促進するが、他方Ｔ_H２（抗体）反応を抑制する。ＩＦＮγは細胞内に存在する抗原上の主要組識適合性複合体（Major histocompatibility complex，ＭＨＣ）分子の発現を促進し、マクロファージのphagocytic activityの促進に加え、ＩＮＦγ はＮＫ細胞の細胞毒性も強める。ＩＦＮγが複製している組換えワクシニアウイルス中で発現されたとき、このＩＦＮγは組み換えウイルスの増殖を抑制する。これによりＴ細胞免疫欠損ネズミの感染を抑制することが可能になる（Kohonen Corish等,1990）。サイトカイン，インターロイキン４（ＩＬ−４）は、リンパ球Ｔ_H２サブセットにより分泌される。ＩＬ−４はＴ_H２（antibody）反応を促進するが、一方では免疫反応で仲介されたＴ_H１を阻害するＩＬ−４を発現する組み換えワクシニアウイルスは、野生株と比較して増加された毒性をネズミ中で示す（Ramshaw等, 1992）。サイトカイン、白血球マクロファージコロニー刺激因子（grahulocyte macrop hage colony stmulating factor）（ＧＭＣＳＦ）は多面発現である。ＧＭＣＳＦは白血球（grahulocyte）およびマクロファージの両種の細胞の拡散を刺激することに加え、インターロイキン３および５（ＩＬ−３およびＩＬ５）との交錯競合において、造血に関する他の多くの側の面に影響し、腫瘍細胞の増殖の促進に関してある役割を果す。ＧＭＣＳＦは、骨髄移植につづく造血の最構築に臨床的に利用される。サイトカインインターロイキン12（ＩＬ−12）は、以前はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞刺激因子として知られていたが、35ｋＤａと40ｋＤａのサブユニットより構成されるヘテロ二量体である。ＩＬ−12は、単核細胞マクロファージ、Ｂ細胞および他のアクセサリー（accessory）細胞により生産される。ＩＬ12は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方に多面発現効果をもつ。部分的にはＩＦＮγの生産を誘導するが、主要な役割は免疫反応を仲介したＴ_H１細胞の促進であり、他方でＴ_H２反応を抑制する（Trinchieri,1993により総括）。近年、組み換えネズミＩＬ−12は、潜在的抗腫瘍および抗転移効果をネズミ中で有することが示された（Brvhda等,1993）。Ｂ７（ＢＢ−１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、抗原を示す細胞の表面に存在する。抗原を示す細胞に存在しているＢ７分子と、Ｔ細胞上のそのレセプターとの相互作用により、ＩＬ−12を含む、Ｔ細胞活性化に必要な共同刺激信号（co-stimulatory signals）が提供される（Schwartz 199 2）。近年、実験的なＢ７と腫瘍抗原とのネズミメラノーマ細胞上での共発現は、ネズミ中での腫瘍の退化につながることが示された。これは腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞のＢ７に助けられた活性化によってなされたものである（Chen等,1 992）。Ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２遺伝子は、セキツイ動物間で保存されているが、潜在的な受容体タンパク質をコードしている185ＫＤａの翻訳産物は上皮成長因子（epide rmal growth factor：ＥＧＦ）レセプターのキナーゼ部分と相同性の高いリン酸化酵素部分を含んでいる。Ｃ−ｅｒｂ−Ｂ−２遺伝子は、セキツイ動物間で保存されているが、ラットのｎｅｕ遺伝子でも保存されており、多数のラット神経／グリア芽細胞種neuro/glioblastomaについて発見されている。ヒトＣ−ｅｒｂ −Ｂ−２遺伝子は、ＨＥＲ２としても知られており、ある種の壊死中で（もっとも有名なのは胸部ガン中）増幅されている。胃ガン細胞系統において、ＭＫＮ− ７はノーマルの4.6ｋｂのＣ−ｅｒｂ−Ｂ−２をコードしている転写部分と、2.3 ｋｂの推定上のレセプター（putative receptor）の細胞外部分として知られている転写部分との両方が、レベルが上がった状態で合成されている（Yamamoto等 ,1986）。この細胞外部分は、活性な、胸部ガンの特異的免疫治療のための潜在的免疫原であると考えられる。ＮＹＶＡＣ−，ＡＬＶＡＣ−およびＴＲＯＶＡＣ−をベースとした養子（adop tive）免疫治療のための、あるサイトカインとともに、あるいはサイトカインなしでＴＡＡｓを発現する組み換えウイルスは、いくつかの型をとることができる。その一つには、ベクターで仲介されたＴＡＡｓ、サイトカイン遺伝子または他の遺伝子の導入によってなされているＰＢＭＣｓの遺伝的改良と、その後に患者の体内へもどすというものがある。このような投与は排液に依存するか、あるいは腫瘍特異的な免疫反応を誘導する目的で、改良されたＰＢＭＣｓを細胞内皮系（reticuloendothial system,RES）経由でリンパ球組識（すなわちすい臓、リンパ節）に移動させる仕方に依存する。適切なＮＹＶＡＣ−ＡＬＶＡＣ−およびＴＲＯＶＡＣベースの組み換え体に感染させられて改良されたＰＢＭＣｓは、例えばＴＡＡ特異的なＣＴＬｓを患者に再投入させる目的でin vitroで増大させることなどに利用できる。腫瘍部分から派生した腫瘍浸潤リンパ球（Tumor-infiltra ting lymphocytes ＴＩＬｓ）は、単離され、増幅され、そして患者の体内に再び戻される前に、ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣをベースにした組換え体を使った適切な遺伝子発現のために改良することができる。ＴＩＬは再び対象に導入されたときに腫瘍にもどる可能性もある（ホーミング；homing）（Ro rsenberg，1992）。ゆえに、それらは細胞障害性または細胞増殖抑制性サイトカインを腫瘍部分へ運ぶための便利な手段を提供する。細胞ベースの活動免疫治療はまた、ＮＹＶＡＣ−ＡＬＶＡＣ−およびＴＲＯＶＡＣベクターを用いたいくつかの可能性のある様式をとることができる。腫瘍の細胞を、ＴＡＡ、サイトカインあるいは他の新しい抗原（例えば、クラス１，クラス２の主要な組識適合遺伝子）を発現できるように改良することができる。このように改良された腫瘍細胞は、後の能動的免疫化に利用できる。このような投与が治療に利用できることは、これらの改良された細胞が有する、サイトカインを分泌する能力および体系的な抗腫瘍活性発現のためのＴＡＡｓの存在量を変化せしめ得る能力に基づいている。改良された腫瘍細胞はまた、患者の体内への再投入することを目的とした、腫瘍特異的ＣＴＬのin vitroでの増大にも利用しうる。本発明のより高度な理解およびその多くの利点は、説明のために以下に与えられた例よりもたらされるであろう。実施例ＤＮＡのクローニグと合成プラスミドを標準的な方法で構築し，検索し，増幅した（Maniatis等,1982;Pe rkus等,1985;Piccini等,1987）。制限酵素はBethesda Research Laboratories（ Gaithersburg,ＭＤ），New England Biolabs（Beverly，ＭＡ）およびBoehringe r Mannheim Biochemicals（Indianapolis，ＩＮ）より得た。E.coliポリメラーゼクレノー断片はBoehringer Mannheim Biochemicalsから得た。ＢＡＬ−31エキソヌクレアーゼおよびＴ₄ファージＤＮＡリガーゼはNew England Biolabsより得た。これらの試薬を、さまざまな供給者が特定した方法により使用した。合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述したように（Perkus等,1989）ＤＮＡ合成機Biosearch 8750またはApplied Biosystems 380Ｂにより調製した。ＤＮＡの塩基配列決定は、前述したように（Guo等，1989）、Sequenase（Tabor. 等，1987）を用いてジデオキシチェーンターミネーター法（dideoxy chain term ination method）により（Sanger等，1977）行った。配列検証のための（Engelk 等，1988）複製連鎖反応（PCR）法による、ＤＮＡの増幅は、特別に合成したオリゴヌクレオチドプライマーおよび、GeneAmp．ＤＮＡ増幅試薬キット（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT）を用いて、自動化されたPerkin Elmer Cetus製ＤＮＡサーマルサイクラー中で行った。制限酵素による消化とそれに続くＢＡＬ−31 エキソヌクレアーゼによる制限消化、およびオリゴヌクレオチドを用いた変異（ Mandecki，1986）により、過剰のＤＮＡ配列をプラスミドから除いた。細胞、ウイルス、形質導入ワクシニアウイルス、コペンハーゲン株の由来および培養条件は以前に記述された通りである。（Guo等，1989）。組み換えによる組み換えウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターを用いた原位置ハイブリダイゼーション、およびβ−ガラクトシダーゼ活性の検索は以前に記述された通りに行った（Piccini等，1987）。ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびＮＹＶＡＣの由来および培養条件は、前述した（Guo等，1989，Tartaglia等，1992）通りである。組み換えによる組み換えウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターを用いた原位置のハイブリダイゼーション、およびβ−ガラクトシダーゼ活性のスクリーニングは前述シた通りに行った（Panicali等，1982，Perkus等，1989）。親株のカナリアポックスウイルス（Rentschler株）は、カナリア用のワクチンの株である。このワクチン株を野生株の単離体から得て、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ細胞）上での200回以上の継代（passages）により弱毒化した。親ウイルス集団の前培養より寒天を用いた4回のプラーク精製を行ない、ひとつのプラーククローンをさらなる5回の継代で増幅して用意された保存用ウイルスを生体外組み換え試験で親ウイルスとして使用した。プラーク精製したカナリアポックス単離体をＡＬＶＡＣと命名した。鶏痘ウイルス（ＦＤＶ）のＦＰ−１と命名された株については前述されている（Taylor等，1988a）。この株は生後1日のニワトリを予防接種するのに有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Duvetteを、ニワトリから鶏痘のうろこ状のものとして、フランスで得た。このウイルスを約50回のふ化鶏卵（embr yonated egg）中での継代と、それに続く25回のニワトリ繊維芽細胞での継代により弱毒化した。このウイルスを4回連続のプラーク精製にかけた。ひとつのプラーク単離をさらに初期ＣＥＦ細胞で増幅しＴＲＯＶＡＣと命名した保存用ウイルスを得た。ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクター並びにそれらの派生体を前述した通りに増殖した（Piccini等，1987;Taylor等.，1988a.b）。Ve ro細胞およびニワトリ繊維芽細胞を前述した通りに増殖した(Taylor等，1988a,b ) 実施例１ −チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ460の構築第１図に示したとおり、プラスミドｐＳＤ406はｐＵＣ８にクローン化されたワクシニアHindIIIＪ遺伝子（位置83359-83377）を含んでいる。ｐＳＤ406をHin dIIIおよびPruIIで切断し1.7kbのHindIIIＪの左側部分をHindIII／SmaIで切断したpＵＣ８中にクローン化し、ｐＳＤ447を構築した。ｐＳＤ447はＪ2Ｒ（位置83 855-84385）遺伝子全体を含んでおり、開始コドンはＮlaIIIサイトの内側にあり、終止コドンはＳspＩサイトの内側にある。転写方向を第１図中に矢印で表した。左側に連結するワクシニアのアーム（連結用配列）を得るために、0.8kbのHin dIII／EcoRI断片をｐＳＤ447から単離し、次いでNlaIIIで消去し、0.5kbのHindI II／ＮlaIII断片を単離した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ4 3（配列番号１）およびＭＰＳＹＮ44（配列番号２）を、0.5kbのＨｉｎｄIII／ＮｌａIII断片と連結後、ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩで切断したpＵＣ18ベクタープラスミド中に組み込んでpＳＤ449を構築した。右側に隣接するワクシニアアームとpＵＣベクターの配列を含む制眼断片を得るため、ｐＳＤ447を、ＳｓｐＩでワクシニア配列内を部分消化し、ＨｉｎｄIII によりpＵＣ／ワクシニア結合部分で切断し、2.9kbのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ45（配列番号３）およびＭＰＳＹＮ４６（配列番号４）と連結し、ｐＳＤ459を構築した。左と右の連結用アームを一つのプラスミド中に統合するために、ｐＳＤ449から0.5kbのＨｉｎｄIII／ＳｍａＩ断片を単離し、ＨｉｎdIII／ＳｍａＩで切断したpＳＤ459と連結し、プラスミドpＳＤ460を構築した。pＳＤ460を野生型の親株ワクシニアウイルスであるコペンハーゲンＶＣ−２株の組み換えの供与体プラスミドとして用いた。³²Ｐで標識化されたプローブは、ＭＰＳＹＮ45（配列番号３）をテンプレートとして用い、20塩基の相補的オリゴヌクレオチドＮＰＳＹＭ47 （配列番号５）をプライマーとして用いてプライマー伸長法により合成した。組み換えウイルスＶＰ410をプラークハイブリダイゼーションにより同定した。実施例２ −出血性領域（Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ）の欠失のためのプラスミドpＳＤ486 の構築第２図に示すように、プラスミドpＳＤ419は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩＧ（位置160,744-173,351）を含んでいる。ｐＳＤ422は、ＳａｌＩＧの右に隣接するワクシニアＳａｌＩ断片である、ｐＵＣ８にクローン化されたＳａｌＩＪ遺伝子（pos.173,351-182,746）を含んでいる。出血性領域遺伝子u,Ｂ13Ｒ−Ｂ14Ｒ（位置172,549-173,552）を除いたプラスミドを構築するために、ｐＳＤ419を左の連結アームの供給源として用い、pＳＤ422を右の連結アームの供給源として用いた。u領域の転写の方向を第２図中で矢印で示す。望ましくない配列をｐＳＤ419から除くために、ＮｃｏＩサイト（位置172,253 ）の左側の配列を、ＮｃｏＩ／ＳｎａＩでのｐＳＤ419の消化に続いて、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片による平滑末端化と連結により除去し、ｐＳＤ476を構築した。ワクシニアの右の連結アームは、ｐＳＤ422をＨｐａＩによりＢ14Ｒ終止コドンで切断し、そこから0.3kbだけ右側でＮｒｕＩにより切断することにより得た。この0.3kbの断片を単離し、pＳＤ476から単離した3.4kbのＨｉｎｃIIベクター断片と連結し、プラスミドpＳＤ477を構築した。pＳＤ477中のワクシニアｕ領域での部分的欠失の位置を三角形により示す。pＳＤ477中に残存しているＢ13Ｒをコードしている配列を、ＣｌａＩ/ＨｐａＩによる消化で除き、得られたベクター断片を、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドＳＤ22mer （配列番号６）およびＳＤ20mer（配列番号７）と連結し、pＳＤ479を構築した。pＳＤ479はＢａｍHIサイトがすぐ後にある開始コドン（下線）を有する。ｕプロモーターの支配のもとでE.coli β−ガラクトシダーゼをＢ13−Ｂ14（ｕ）欠失座に位置づけるため、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む3.2ｋｂのＢａｍＨＩ（Shapira等，1983）をpＳＤ479のＢａｍＨＩサイトに挿入し、pＳＤ479ＢＧを構築した。pＳＤ479ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ410の組み換えのために供与体プラスミドとして用いた。組み換えワクシニアウイルスｖＰ533を、色素産生の基質X-galの存在下でのブループラークとして単離した。ｖＰ533中では、Ｂ13Ｒ−Ｂ14Ｒ領域が欠失され、β−ガラクトシダーゼに置換されている。 β−ガラクトシダーゼ配列をｖＰ533から取り除くために、ポリリンカー領域を含んでいるが、ｕ欠失結合部分に開始コドンを持たない、pＳＤ477の派生体であるプラスミドpＳＤ486を用いた。最初に、前記pＳＤ477からのＣｌａＩ/ＨｐａＩベクター断片を、アニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ42mer（配列番号８）およびＳＤ40mer（配列番号９）に連結し、プラスミドpＳＤ478を構築した。続いてpＳＤ478をＥｃｏＲＩで消化し、その後E.coliポリメラーゼ（polymerase）のクレノー断片で平滑末端化して連結することによりｐＵＣ／ワクシニア結合部分のＥｃｏＲＩサイトを破壊し、プラスミドpＳＤ478Ｅ^-が構築した。pＳＤ478Ｅ^-をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩで消化し、アニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５（配列番号10）およびＨＥＭ６（配列番号11）と連結し、プラスミドpＳＤ486を構築した。 pＳＤ486は、組み換えワクシニアウイルスｖＰ533の組み換えに、供与体プラスミドとして用いられてｖＰ553を構築した。このｖＰ553は、、X-galの存在下で透明プラークとして単離した。実施例３ −ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）の欠失のためのプラスミドpＭＰ494Δの構築第３図に示した通り、pＳＤ414はpＵＣ８にクローン化されたＳａｌＩＢを含む。Ａ26Ｌ領域の左側にある望ましくないＤＮＡ配列を除くため、pＳＤ414、ワクシニア配列内部（位置137,079）をＸｂａＩによりpＵＣ／ワクシニア結合部分をＨｉｎｄIIIにより切断し、次いでE.coliポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化して連結し、プラスミドpＳＤ483を得た。Ａ26Ｌ領域の右側にある望ましくないワクシニアＤＮＡ配列を除くため、pＳＤ483をＥｃｏＲＩで（位置140, 665,およびpＵＣ／ワクシニア結合部分）切断して後連結し、プラスミドpＳＤ48 4を構築した。Ａ26Ｌをコードしている領域を除くため、ｐＳＤ484、Ａ26ＬＯＲＦのわずかに上流にある部分(位置139,004)をＮｄｅＩで部分的に、Ａ２６ＬＯＲＦのわずかに下流にある部分（位置137,889）をＨｐａＩで切断した。5.2kb のベクター断片を単離し、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３（配列番号12）およびＡＴＩ４（配列番号13）と連結し、Ａ26Ｌの上流の領域を再構築し、ここに示したようにＢｇｌII、ＥｃｏＲＩ、およびＨｐａＩの制限酵素サイトを持つ短いポリリンカー領域によりＡ 26ＬＯＲＦを置き換えた。構築したプラスミドを、pＳＤ485と命名した。pＳＤ485のポリリンカー領域中のＢｇｌ IIおよびＥｃｏＲＩサイトは特有ではないので、プラスミドpＳＤ483をＢｇｌ II（位置140,136）により、そしてpＵＣ／ワクシニア結合部分でＥｃｏＲＩにより切断し、E.coliポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化し、連結することにより、望ましくないＢｇｌ II、およびＥｃｏＲＩサイトを除いた。構築したプラスミドをpＳＤ489と命名した。Ａ26ＬＯＲＦを含むpＳＤ489由来の1.8kbの断片を、それに対応する0.7kbのポリリンカーを含む、pＳＤ485由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ断片によって置き換え、pＳＤ492 を構築した。pＳＤ492のポリリンカー領域中のＢｇｌ IIおよびＥｃｏＲＩサイトは特有のものである。ワクシニア11kDaプロモーター（Bertholet等,1985．Perkus等,1990）によって支配されているE.coliβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira等,1983）を含む3. 3kbのＢｇｌ IIカセットを、pＳＤ492のＢｇｌ IIに挿入し、pＳＤ493ＫＢＧを構築した。プラスミドpSD493ＫＢＧをレスキューウイルスｖＰ553との組み換えに用いた。Ａ26Ｌ欠失領域に、β−ガラクトシダーゼを含む、組み換えワクシニアウイルスｖＰ581をＸ−galの存在下でブループラークとして単離した。 β−ガラクトシダーゼ配列を組み換えワクシニアウイルスｖＰ581から取り除くためのプラスミドを構築するため、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ177（配列番号14）を用いた変異により（Mandecki,1986）プラスミドｐＳＤ492のポリリンカー領域を、欠失した。構築したプラスミドpＭＰ494Δ中で、Ａ26ＬのＯＲＦの全領域を含む位置（137,889-138,937）を包囲するワクシニアＤＮＡが除かれている。pＭＰ494Δと、β−ガラクトシダーゼを含んでいるワクシニア組み換え体ｖＰ581との間の組み換えによりワクシニア欠失変異株ｖＰ618が得られた。このｖＰ618はＸ−galの存在下で透明プラークとして単離した。実施例４ −血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠失のためのプラスミドpＳＤ467の構築第４図に示したように、ワクシニアSalI Ｇ制限酵素断片（位置160,744-173,3 51）はＨｉｎｄ III Ａ／Ｂ結合点（位置162,539）を横断している。pＳＤ419は、pＵＣ８にクローン化されたワクシニアＳａｌＩＧ遺伝子を含んでいる。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図中に矢印で示す。pＳＤ419をワクシニア配列内部およびpＵＣ／ワクシニア結合点でＨｉｎｄIIIにより消化した後、Ｈｉｎｄ III Ｂ遺伝子から派生したワクシニア配列を除去した後連結した。構築したプラスミドpＳＤ456は、左側に0.4kbのワクシニア配列を持ちかつ右側に0.4kb のワクシニア配列を持つＨＡ遺伝子Ａ56Ｒを含んでいる。Ａ56Ｒをコードしている配列は、pＳＤ456を、Ａ56Ｒをコードしている配列の上流（位置161,090）でＲｓａＩにより部分的に、遺伝子の末端に近い部分（位置162,054）でＥａｇＩにより切断することにより除去した。pＳＤ456由来の3.6kbのＲｓａＩ／ＥａｇＩベクター断片を単離し、アニーリングした合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ59（配列番号15）、ＭＰＳＹＭ62（配列番号16）、ＭＰＳＹＮ60（配列番号17）およびＭＰＳＹＮ61（配列番号18）と連結され、Ａ56R ＯＲＦの上流域のＤＮＡ配列を再構築し、Ａ56ＲＯＲＦを前記ポリリンカー領域で置き換えた。こうして構築されたプラスミドはpＳＤ466である。p ＳＤ466中のワクシニア配列の欠失は位置（161、185-162、053）を包囲している。 pＳＤ466の欠失部分を第４図中に三角形で示す。ワクシニア11kDaプロモーター（Bertholet等,1985,Guo等,1989）の支配下にあるE.coliβ−ガラクトシダーゼ（Shapira等,1983）を含んでいる、3.2kbのＢｇｌ II／ＢａｍＨＩ（部分分解）カセットを、pＳＤ466のＢｇｌIIサイトに挿入し、pＳＤ466ＫＢＧを構築した。プラスミドpＳＤ466ＫＢＧをレスキューウイルスｖＰ708との組み換えに用いた。Ａ56Ｒ欠失部位にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つ、組み換えワクシニアウイルスｖＰ708を、Ｘ-galの存在下でブループラークとして単離した。供与体プラスミドpＳＤ467を用いて、β−ガラクトシダーゼ配列をｖＰ708から除去した。pＳＤ467は、pＳＤ466をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理後、E.coliポリメラーゼにより平滑末端化して連結することによりpＵＣ／ワクシニア結合部分からＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ，およびＢａｍＨＩサイトが除かれていること以外は、pＳＤ466と全く同一である。ｖＰ708とｐＳＤ467との組み換えにより、組み換えワクシニア欠失変異体ｖＰ723が得られた。このｖＰ723は、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。実施例５ −オープンリーディングフレームＣ７Ｌ−ＫＩＬの欠失のためのプラスミドpＭＰＣＳＫ１Δの構築第５図に示すように、以下のワクシニアクローンをpＭＰＣＳＫ１Δの構築に利用した。pＳＤ420はpＵＣ８にクローン化されたＳａｌＩＨ遺伝子である。pＳＤ435はpＵＳ18にクローン化されたＫｐｎＩＦ遺伝子である。pＳＤ435はＳｐｈＩで切断して再び連結し、pＳＤ451を構築した。pＳＤ451において、ＨｉｎｄII ＩＭ遺伝子中の、ＳｐｈＩサイト（位置27,416）の左側のＤＮＡ配列は取り除かれている（Perkus等,1990）。pＳＤ409はpＵＣ８にクローン化されたＨｉｎｄII I Ｍ遺伝子である。ワクシニア由来の遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠失のための基質を提供するために、最初にE.coliβ−ガラクトシダーゼを、以下のようにワクシニアＭ２Ｌ欠失座に挿入した（Guo等，1990）。pＳＤ409中のBglIIサイトを除去するために、プラスミドはワクシニア配列内のＢｇｌIIサイト（位置28,212）をＢｇｌ IIで、およびpＵＣ／ワクシニア結合部分をＢａｍＨＩで切断し、次いで連結してプラスミドpＭＰ409Ｂを形成した。プラスミドpＭＰ409Ｂを単一のＳｐｈＩサイト（位置27,416）で切断した。Ｍ２Ｌをコードしている配列は合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ82（配列番号19）を用いた変異（Guo等,1990;Mandecki,1986）により除去した。構築されたプラスミドpＭＰ409Ｄは、前記のようにＭ２Ｌ欠失座中に特有のＢｇｌIIサイトを、持つ。11kDaプロモーターの支配下にある（Bertholet等,1985）、Ecoliのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira等，1983）を持つ3.2kbのＢａｍＨＩ（部分分解）／ＢｇｌIIカセットを、ＢｇｌIIで切断されたpＭＰ409Ｄに挿入した。このように構築されたプラスミドpＭＤ409ＤＢＧ（Guo等，1990）は、レスキューワクシニアウイルスｖＰ723との組み換えに用いた。組み換えワクシニアウイルスｖＰ7 84をＸ−galの存在下でブループラークとして単離した。このｖＰ784はＭ２Ｌ欠失座に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有している。ワクシニア遺伝子Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌが欠失したプラスミドを、ＳｍａＩ，ＨｉｎｄIIIで切断し、E.coliポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化したpＵＣ８中に集めた。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｃ配列よりなる左側の連結アームは、pＳＤ4 20（位置18,628）をＸｂａＩで切断し、その後E.coliポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化し、位置19,706をBglIIで切断することにより得た。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｋ配列よりなる右側の連結アームは、pＳＤ451をＢｇｌIIでの（位置29,062）、およびＥｃｏＲＶでの（位置29,778）消化により得た。構築したプラスミドpＭＰ581ＣＫは、ＨｉｎｄIIIＣ遺伝子内のＢｇｌIIサイト（位置29,06 2）の間のワクシニア配列が除去されている。プラスミドpＭＰ581ＣＫ中のワクシニア配列の欠失部分を、第５図中で三角形により示す。ワクシニア欠失結合部分の過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドpＭＰ5 81ＣＫをワクシニア配列内部のＮｃｏＩサイト（位置18,811;19,655）で切断し、Bal-31エキソヌクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ233 （配列番号20）を用いた変異を施した（Mandecki 1986）。このように構築されたプラスミドpＭＰＣＳＫ１Δは、12のワクシニアオープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を含むワクシニア配列（位置18,805-29,108）が欠失されている。pＭＰＣＳＫ１Δと、β−ガラクトシダーゼを含むワクシニア組み換え体ｖＰ784との組み換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ804が生産された。このｖＰ804をＸ−ga l存在下で透明プラークとして単離した。実施例６ −リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）の欠失のためのプラスミドpＳＤ548の構築第６図に示した通り、プラスミドpＳＤ405はpＵＣ８にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄIII Ｉ遺伝子（位置63,875-70,367）を含んでいる。pSＤ405を、ワクシニア配列内（位置67,933）でＥｃｏＲＶにより、pＵＣ／ワクシニア結合部でＳｍａＩにより切断し、連結し、プラスミドpＳＤ518を構築した。pＳＤ518 は、pＳＤ548の構築に用いられた全てのワクシニア配列の制限酵素断片の供給源として用いた。ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は、67、317-65、059の位置にわたっている。Ｉ４Ｌの転写の方向を第６図に矢印によって示す。Ｉ４Ｌをコードしている配列の部分が欠失しているベクタープラスミド断片を得るために、pＳＤ518を、ＢａｍＨＩ（位置65,381）で、ＨｐａＩ（位置67,001）で切断し、E.coliポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化した。この4.8kbのベクター断片を、ワクシニア11kＤａプロモーター（Bertholet et.al.,1985;Perkus等,1990）に支配されたE.coliのβ −ガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira等,1983）を含む3.2kbのＳｍａＩカセットと連結し、プラスミドpＳＤ524ＫＢＧを構築した。pＳＤ524ＫＢＧをワクシニアウイルスｖＰ804との組み換えに供与体プラスミドとして用いた。組み換えワクシニアウイルスｖＰ855はβ−ガラクトシダーゼをＩ４Ｌ遺伝子の部分的欠失部分に持つ。このｖＰ855をＸ−gal存在下でブループラークとして単離された。 β−ガラクトシダーゼおよびＩ４ＬＯＲＦの残りをｖＰ855から除くため、欠失プラスミドpＳＤ548を構築した。左および右に隣接するワクシニア連結アームを、以下に詳述されるように、また、第６図に図式的に示すように別々にpＵＣ８中に集めた。左側のワクシニア連結用アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、pＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングされた合成オリゴヌクレオチド518Ａ１（配列番号21）および518Ａ２（配列番号22）と連結し、プラスミドpＳＤ531を構築した。pＳＤ531を、ＲｓａＩ（部分的に）およびＢａｍＨＩで切断し、2.7kbのベクター断片を単離した。pＳＤ518をＢｇｌ II（位置64,459）で、ＲｓａＩで（位置64,994）で切断し、0.5kbの断片を分離した。二つの断片を一緒に連結し、プラスミドpＳＤ537を構築した。このｐＳＤ537は、Ｉ４Ｌをコードしている配列の左に完全なワクシニア連結用アームを有する。右側のワクシニア連結アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングした合成オリゴヌクレオチド518Ｂ１／518Ｂ２（配列番号23／配列番号24）と連結し、プラスミドｐＳＤ532を構築した。ｐＳＤ532をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、2.7ｋｂのベクター断片を単離した。ｐＳＤ518をワクシニア配列（位置67.436）内のＲｓａＩおよびワクシニア／ｐＵＣ接合部でのＥｃｏＲ１で切断し、0.6ｋｂの断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ5 38を構築した。このｐＳＤ538は、Ｉ４Ｌをコード化している配列の右側に完全なワクシニア連結アームを持っている。右側のワクシニア連結アームを、ｐＳＤ538からの0.6kbのEcoＲＩ／BglＩＩ断片として単離し、EcoＲＩ／BglＩＩで切断したpＳＤ5F37ベクタープラスミドと連結した。構築されたプラスミドpＳＤ539において、Ｉ４ＬＯＲＦ（位置65,0 47-67,386）をポリリンカー領域で置き換えた。このポリリンカー領域は右側で0 .6k.のワクシニアＤＮＡ，左側で0.6kbのワクシニアＤＮＡに隣接しており、全てpＵＣベクター中にある。第６図において、ワクシニア配列内の欠失部分を三角で示す。pＳＤ539中のpＵＣ由来の部分にあるβ−ガラクトシダーゼと、組み換えワクシニアウイルス中のβ−ガラクトシダーゼ配列との起こりうる組み換えを防ぐため、ワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットを、pＳＤ539から除いてβ−ガラクトシダーゼ配列がすべて除かれてポリリンカー領域で置き換えられているpＵＣ派生体であるpＲＣ11（Colinas.等,1990）へと移した。pＳＤ539をEcoＲＩ／Ｐs t Ｉで切断し、1.2kbの断片を単離された。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断されたpＲＣ11（2.35kb）中へ挿入し、プラスミドpＳＤ548を構築した。pＳＤ 548とβ−ガラクトシダーゼを持つワクシニア組み換え体ｖＰ855との間で組み換えを行い、ワクシニア欠失変異体株ｖＰ866を得た。このｖＰ866は、Ｘ−galの存在下で透明プラークとして単離した。組み換えワクシニアウイルスｖＰ866由来のＤＮＡを制限酵素による消化とそれに続くアガロースゲル電気泳動により分析した。制限酵素パターンは予期した通りであった。ｖＰ866をテンプレート（鋳型）として、前述した６つの欠失座の隣接部分をプライマーとして用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）により、予期していたサイズのＤＮＡ断片を産生した。ＰＣＲによって産生された欠失結合部分のまわりの断片の塩基配列を解析することにより、欠失結合部分は予期した通りであることが確認された。組み換えワクシニアウイルスｖＰ866は前述したように６つの遺伝子操作された欠失を持ち、ワクシニアワクチン株“ＮＹＶＡＣ”と命名した。実施例７ −ＮＹＶＡＣへの狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子の挿入狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする、ワクシニアＨ６プロモーターの支配下にある遺伝子（Taylor等,1988a.b）を、ＴＫ欠失プラスミドpＳＤ513に挿入した。 pＳＤ513は、ポリリンカー領域が存在することを除いてプラスミドpＳＤ460（第１図）と同一である。第７図に示した通り、pＳＤ460をＳｍａＩで切断し、プラスミドベクターをアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ（配列番号25）およびＶＱ１Ｂ（配列番号26）と連結することによりポリリンカー領域を挿入し、ベクタープラスミドpＳＤ513 を構築した。pＳＤ513はＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーターによる支配下にある狂犬病糖タンパクＧ遺伝子をコードしている遺伝子を含むＳｍａＩ末端を持つ、1.8kbのカセット（Taylor等,1988a.b）と連結した。構築されたプラスミドをpＲＷ842と命名した。pＲＷ842は、レスキューウイルスＮＹＶＡＣとの組み換えに供与体プラスミドとして用いた。³²Ｐで標識化された、狂犬病糖タンパク質Ｇをコードしている配列に対するＤＮＡプローブを用いて、プラークハイブリダイゼーションにより組み換えワクシニアウイルスｖＰ879を同定した。本発明の改変された組み換えウイルスには、組み換えワクチンベクターとしての利点がある。ベクター毒性が弱められるために、接種された個体中の、接種によるランアウェイ感染（runaway infection）の可能性が減少し、また接種された個体から接種されていない個体への伝播あるいは環境汚染が減少する。改変された組み換えウイルスはまた、生体外で培養した細胞中で遺伝子産物を発現する方法であって、この細胞中の遺伝子産物をコード化し発現する外来ＤＮＡを有する改変された組み換えウイルスをその細胞中に導入することによる方法に好ましく利用できる。実施例８ −ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質およびフュージョンを発現するＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築本実施例は、鶏痘ウイルスベクターＴＲＯＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名された鶏痘ニューカッスル病ウイルス組み換え体の開発、並びにその安全性と効果を記述するものである。鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）ベクターであって、毒性ＮＤＶテキサス株のＦおよびＨＮ遺伝子の両方を発現するものを構築した。この構築した組み換え体をＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名した。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶは、組み換えウイルスに感染した鳥類の細胞中で確実にプロセシングしたＮＤＶ糖タンパク質を発現し、生後一日のニワトリに接種を行ってそれに続く毒性ＮＤＶ追加抗原投与から保護する。細胞とウイルスＮＤＶのテキサス株は短期潜伏性（velogenic）株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローンの調整については、前述している（Tayl or等,1990,Edbauer等，1990）。ＦＤＶのＦＰ−１と名付けられた株についても、前述している（Taylor等,1988a）。これは生後一日のニワトリのワクチン接種に有用である。親ウイルス株Duvetteは、ニワトリから鶏痘カサブタとしてフランスで得た。ウイルスを約50回、ふ化鶏卵中で継代され、続いて25回、ニワトリ繊維芽細胞中で継代され、弱毒化した。ウイルスを４回の継続的なプラーク精製にかけた。ひとつのプラーク単離体をさらに、初期ＣＥＦ細胞中で増殖させ、ＴＯＲＶＡＣと命名されたストックを構築した。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを作成する生体外の組み換え試験に用いたこのストックウイルスは、プラーク単離体からの初期（primary）ＣＥＦ細胞中で、12回の継代にかけたものである。ＮＤＶ−Ｆカセットの構築Ｆタンパクをコードしている配列の５′末端から22残基を除いた全てのヌクレオチドを含む1.8kbpのＢａｍＨＩ断片を、pＮＤＶ81（Taylor等,1990）から切り出し、pＵＣ18のＢａｍＨＩサイトに挿入し、pＣＥ13を構築した。前記ワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Taylor等,1988a,b; Guo等,1989; Perkus等,1989 ）を以下の方法によりpＣＥ13に挿入した。この方法は、pＣＥ13をＳａｌＩで消化し、粘着末端をE.coliＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化したあとＨｉｎｄIIIで消化することによるものである。続いてＨ６プロモーター配列を含むＨｉｎｄIII-EcoＲＶ断片を、pＣＥ13に挿入し、pＣＥ38を構築した。pＣＥ38をＫｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化し、アリーリングしリン酸化したオリゴヌクレオチドＣＥ75（配列番号27）およびＣＥ76（配列番号28）に挿入することにより、完全な５′末端を形成して、pＣＥ47を構築した。非コード配列をＮＤＶ−Ｆの３′末端から除くために、pＣＥ13からのＳｍａＩ／ＰｓｔＩ断片をpＵＣ18のＳｍａＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入し、pＣＥ23を構築した。非コード配列を続いてのpＣＥ23のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソヌクレアーゼIII、Ｓ１ヌクレアーゼ、およびＥｃｏＲＩによる消化によって除いた。アニーリングしリン酸化したオリゴヌクレオチドＣＥ42（配列番号29）およびＣＥ43（配列番号30）を挿入し、pＣＥ29を構築した。次いで、pＣＥ29由来のＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をpＣＥ20のＰｓｔＩおよびＳａｃＩサイトにクローニングすることによりすでにＮＤＶ−Ｆの５′末端を持つプラスミドにＮＤＶ−Ｆ配列の３′末端を挿入し、pＣＥ32を構築した。pＣＥ20の構築は、Taylor等1990の文献に記述されている。Ｈ６プロモーターとpＣＥ47に含まれているＮＤＶ−Ｆ５′配列とをpＣＥ32に含まれている３′ＮＤＶ−Ｆにを配列させるため、pＣＥ47のＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ断片をpＣＥ32のＨｉｎｄIIIおよびＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＣＥ49を構築した。ＮＤＶ−Ｆを支配しているＨ６配列は、pＣＥ49由来のＨｉｎｄIII−ＮｒｕＩ断片を以下に詳述するpＪＣＡ002のＨｉｎｄIII−ｓｍａＩサイトにクローニングして、pＣＥ54を構築することにより、以下に詳述するＯＲＦが欠失したＦ８座に移した。pＣＥ54をＳａｃＩで消化し、ＢａｍＨＩで部分的に消化したあと、アニーリングしリン酸化したオリゴヌクレオチドＣＥ166（配列番号31 ）およびＣＥ167（配列番号32）を挿入することにより、転写終結シグナルをpＣＥ54に挿入して、pＣＥ58を構築した。ＮＤＶ−Ｆの完全な３′末端をpＣＥ54をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＣＥ182（配列番号33）およびＣＥ183（配列番号34）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得た。ＣＲ断片をＰｖｕIIおよびＨｐａＩにより消化し、ＨｐａＩで消化しかつＰｖｕIIで部分的に消化されたpＣＥ58中にクローニングした。生成したプラスミドをｐＣＥ64と命名した。完全なＨ６プロモーターおよびpＣＥ64からのＦをコードしている配列を持つＨｉｎｄIII−ＨｐａＩ断片をpＲＷ846のＨｉｎｄIII−ＨｐａＩサイトにクローニングすることにより、転写終結シグナルを挿入し、ＮＤＶ−Ｆの最終的なカセットであるpＣＥ71を構築した。プラスミドpＲＷ846は、Ｈ６プロモーターおよび転写終止シグナル並びに翻訳終止シグナルを含むこと以外は、以下に詳述するプラスミドpJＣＡ002とほとんど同じである。pＲＷ846をHindIII およびHpaＩで消化すると、Ｈ６プロモーターは除かれるが、転写および翻訳終止シグナルはそのまま残される。ＮＤＶ−ＨＮ用のカセットの構築プラスミドpＲＷ802の構築は以前にEdbaue r等，1990の文献中で記述されている。このプラスミドは、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′末端に連結されたＮＤＶ−ＮＨ配列をpＵＣ９ベクター中に持つ。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５′末端を含むＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＶ断片を、pＲＷ802のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＶサイトに挿入し、pＲＷ830を構築した。アニーリングし、リン酸化したオリゴヌクレオチドＣＥ 162（配列番号35）およびＣＥ163（配列番号36）をpＲＷ830のＥｃｏＲＩサイトに挿入することにより、ＮＤＶ−ＨＮの完全な３ ′末端を得て、最終的なＮＤＶ−ＨＮカセットであるpＣＥ59を構築した。ＦＰＶ挿入ベクターの構築プラスミドpＲＷ731-15は、ゲノムＤＮＡからクローニングされた10kbのＰｖｕ II／ＰｖｕII断片を含んでいる。3660ｂpのＰｖｕII／ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を両方向から決定した。ここでＦ８と命名されたＯＲＦの範囲（limit）を決定した。プラスミドpＲＷ761は、2430ｂpのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＶ断片を持つpＲＷ731-15のサブクローンである。Ｆ８ＯＲＦは、pＲＷ761中のＸｂａＩサイトとＳｓａＩサイトとの間に完全に含まれていた。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡとの組み換えによって、Ｆ８ＯＲＦを欠失する可能性のある挿入プラスミドを構築するため、以下の段階を実行した。プラスミドpＲＷ761を、ＸｂａＩで完全消化、ＳｓｐＩで部分消化した。3700bpのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドを、ゲルから単離し、アニーリングし二本鎖にしたオリゴヌクレオチドＪＣＡ017（配列番号37）およびＪＣＡ018（配列番号38）に連結した。この連結により構築したプラスミドをpＪＣＡ002と命名した。ＮＤＶＦおよびＨＮの二重挿入ベクターの構築 E.coliＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片により平滑化され、pＣＥ59由来のＨｉｎｄIII断片を、pＣＥ71 のＨｐａＩサイトにクローニングすることにより、これにより、Ｈ６プロモーター支配ＮＤＶ−ＨＮ配列を、Ｈ６プロモーター支配ＮＤＶ−Ｆカセットに挿入してプラスミドpＣＥ80を構築した。された。プラスミドｐＣＥ80をＮｄｅＩで完全消化し、ＢｇｌIIで部分消化し、共にＨ６プロモーターに支配されＦ８連結アームに連結されているＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を含む4760ｂpのＮｄｅＩ−Ｂｇｌ II断片を生成した。プラスミドpＪＣＡ021は、pＲＷ731-15由来の4900bp のＰｖｕII／ＨｉｎｄIII断片をpＢＳＳＫ＋のＳｍａＩおよびＨｉｎｄIIIサイトへ挿入することにより得た。プラスミドＰＪＣＡ021を続いてＮｄｅＩおよびＢｇｌ IIで消化し、pＣＥ80の4760bpのＮｄｅＩ／ＢｇｌII断片と連結し、pＪＣＡ024を構成した。故にプラスミドpＪＣＡ024はＦＰＶ連結アームの間に、３′ 末端が接して反対方向に挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＮＨ遺伝子を有する。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されている。ＮＤＦ−Ｆ配列の右に隣接している連結アームは2350bpのＦＰＶ配列より成る。ＨＤＦ−Ｆ配列の左側に隣接している連結アームは1700bpのＦＰＶ配列より成る。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの開発前述した（Panicali等，1982,Piccini等，1987 ）リン酸カルシウム沈殿法を用いてプラスミドpＪＣＡ024をＴＲＯＶＡＣに感染した初期ＣＥＦ細胞中に、形質導入した。陽性プラークは、放射性標識化されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ特異プローブを用いたハイブリダイゼーションに基づいて選択し、純粋な集団が達成されるまで５回の連続的なプラーク精製にかけた。ひとつの代表プラークを増幅し、生じたＴＲＯＶＡＣ組み換え体をＴＲＯＶＡＣ− ＮＤＶ（ｖＦＰ96）と命名した。蛍光抗体法（immurofluorescence）ポリクローナル抗ＮＤＶ血清、および単一特異的試薬として、ＮＤＶ−ＦあるいはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルスに対するウサギ体内で産生された血清を用いて、間接蛍光抗体法を記述されたように（Taylor等，1990）行った。免疫沈降反応（immunoprecipitation）ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．，（Ｓｔｏｒｒｓ．ＣＴ）より得られたポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いて免疫沈降反応を、記述されたように（Taylor等，1990）行った。保存用ストックウイルスを原位置プラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、Ｆ８ＯＲＦを欠失していることが確認した。ＮＤＶ遺伝子のＴＲＯＶＡＣゲノムへの正確な挿入およびＦ８ＯＲＦの欠失の確認もまた、サザンブロットハイブダイゼーションにより確認した。ＮＤＶに感染した細胞内において、Ｆ糖タンパク質はカルボキシル末端近くの疎水性の膜内外の領域で、膜につながれており、前駆体Ｆ₀の、ジスルフィド結合したふたつのポリペプチドＦ₁およびＦ₂への転写後の分解が必要となる。Ｆ₀ の分解は、ＮＤＶ株の病原性の決定に重要であり（HommaおよびOhuchi,1993,Nag ai等,1976;Nagai等,1980）、分解される部位のアミノ酸配列は、それゆえウイルスの毒性の決定に重要である。組み換え体vＦＰ29を生成するためにＦＰＶに挿入されたＮＤＶ−Ｆ配列中の、分解される部位のアミノ酸配列は、毒性ＮＤＶ株に要求される配列と（Chambers等,1986;Espion等,1987;Le等,1988;McGinnes and Morrison，1986;Toyoda等，1987;）一致するArg-Arg-Gln-Arg-Arg（配列番号39 ′）（Taylor等，1990）であることが決定された。有毒なＮＤＶ株に感染した細胞内で合成されるＨＮ糖タンパク質は、分解されていない74kＤaの糖タンパク質である。極端に非病原性のUlsterやQueenslandのような株は、活性化のための分解を必要とするＨＮ前駆体（ＨＮ０）をコードしている。ＦおよびＨＮ遺伝子のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中での発現を解析し、遺伝子産物が確実にプロセシングされ提供されることを確認した。ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を用いた間接蛍光抗体法により、免疫反応するタンパク質が感染細胞の表面に現れていることを確認した。両方のタンパク質が原形質膜（plasma m embrane）上にあることを決定するため、ＦまたはＨＮ糖タンパクのいずれかを発現するワクシニア組み換え体に対して単一特異的ウサギ血清を調製した。これらの血清を用いた間接蛍光抗体法により、両方のタンパク質が表面に存在することを確認した。免疫沈降反応実験は、親株および組み換え体に感染した、³⁵Ｓメチオニンで標識化されたＣＥＦ細胞の破砕液を用いて行った。Ｆ₁，Ｆ₂のグリコシル化された形態の期待される見かけの分子量はそれぞれ、54.7および10.3ＫＤａである（Ch ambers等，1986）。ポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いた免疫沈降反応実験では、ＮＤＶ−Ｆ単独組み換え体ＶＦＰ29（Taylor等，1990）およびＴＲＯＶＡＣ− ＮＤＶ二重組み換え体ＶＦＰ96から、適当な大きさのＦ遺伝子特異的産物を検出した。ＮＤＶ−ＮＨ単独組み換え体ＶＦＰ−47（Edbauer等，1990）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶから適切な大きさのＨＮ糖タンパク質を検出した。ウイルス感染していないＣＥＦ細胞および親ＴＲＯＶＡＣ株に感染したＣＥＦ細胞からはＮＤＶ特異的産物は検出されなかった。ＣＥＦ細胞中において、ＦおよびＨＮ糖タンパク質は、ＮＤＶ免疫血清によって認識される場合には、感染した細胞表面に適切に現われている。免疫沈降反応の分析により、Ｆ₀タンパク質が毒性株で要求されるようにＦ₁およびＦ₂複合体へと確実に分解されていることを示した。同様に、ＨＮ糖タンパク質を、組み換えＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶに感染したＣＥＦ細胞中で確実にプロセシングした。以前の報告（Taylor等，1990；Edbauer等，1990; Bourshell等，1990 a，b，c ，Ogawa等，1990）は、ＨＮまたはＦのいずれか単独の発現が、ＮＤＶ投与に対する防御免疫の誘発に十分であることを示唆した。しかしながら、他のパラミクソウイルス(paramyxovirus)に関する研究は、完全な防御免疫のためには、両方のタンパク質に対する抗体が必要である事を示した。ＳＶ５ウイルスは、ＨＮ糖タンパクに対する抗体の存在下で組織培養において拡散可能であるが、Ｆ糖タンパクに対する抗体の存在では拡散できない（Merz等，1980）ことが示された。さらに、殺されたウイルスを用いたワクチンでの麻疹ワクチン失敗は、融合複合体の不活性化によるものであるという説が提唱されている（Norrby等,1975）。両方のＮＤＶ糖タンパク質はウイルス中和抗体の誘発に関与していることが示されており、また両方の糖タンパク質は、個々に鶏痘ベクター中で発現されたときに防御免疫反応を誘導することが可能であるので、もっとも効果的なＮＤＶワクチンには両方の糖タンパク質を発現させるべきだと考えられる。実施例９ −狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組み換え体の構築この実施例は、カナリアポックスウイルスベクターＡＬＶＡＣ、およびＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名されたカナリアポックス／狂犬病組み換え体の開発、およびその安全性と効果を記述するものである。細胞およびウイルス親カナリアポックスウイルス（Rentshler株）はカナリアのワクチン用株である。ワクチン株を野生型単離体から得て、ニワトリ繊維芽細胞上で200回以上継代することにより弱毒化した。親ウイルス集団を前培養し、寒天を用いた４回の連続的なプラーク精製にかけ、ひとつのプラーククローンはさらに５回の継代を通して増幅した。その後この保存用ウイルスを生体外組み換え試験で親株として用いた。プラーク精製したカナリアポックス単離株はＡＬＶＡＣと命名されている。カナリアポックス挿入用ベクターの構築 880ｂｐのカナリアポックスＰｒｕ II断がｐＵＣ９のＰｒｕ IIサイトの間にクローニングし、プラスミドｐＲＷ764 .5を構築した。この断片の配列を第８図中の1372地点から2251地点までの間に示す。Ｃ５と命名されたＯＲＦの範囲を定義した。ＯＲＦは断片内の166地点から開始されて487地点で終了されている。Ｃ５欠損をＯＲＦを妨害することなく作った。167地点から455地点までの塩基を配列（配列番号39）で置換した。この置換された配列はＨｉｎｄ III、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ挿入サイトとそれに続く翻訳終了部位およびワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼに認識される転写終止シグナルを持つ（Yuen等，1987）。Ｃ５ＯＲＦの欠失は下記のとおりに行った。プラスミドｐＲＷ764.5をＲｓａＩで部分消化し、線状の成生物を単離した。ＲｓａＩ直線状断片は再びＢｇｌIIIで切断し、156地点から462地点までのＲｓａＩからＢｇＬIIが欠失したｐＲＷ764.5断片を単離し、以下の合成ヌクレオチドＲＷ145（配列番号40）、ＲＷ146（配列番号41）のためのベクターとして用いた。オリゴヌクレオチドＲＷ145およびＲＷ146をアニーリングし、前記ｐＲＷ764.5 ＲｓａＩおよびＢｇｌIIベクター中に挿入した。構築したプラスミドをｐＲＷ831と命名した。狂犬病Ｇ遺伝子を含む挿内用ベクターの構築ｐＲＷ838の構築は以下のとおりである。Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンが狂犬病Ｇ遺伝子のＡＴＧと重なっているオリゴヌクレオチＡからＥをｐＵＣ９中にｐＲＷ737としてクローン化した。オリゴヌクレオチドＡからＥは、ＮｒｕＩサイトから始まるＨ６プロモーターから、あとにはＢｇｌIIIがつづく狂犬病ＧのＨｉｎｄIIIサイトまでにわたっている。オリコヌクレオチドＡからＥの配列は以下の通りである。（配列番号42）−（配列番号46）アニーリングされたオリゴヌクレオチドＡからＥの一覧図（diagram）は以下の通りである。オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングし（95℃５分間、その後室温まで冷やされた）、そしてｐＵＣ９のＰｖｕIIサイト間に挿入した。構築したプラスミドｐＲＷ737をＨｉｎｄIIIおよびＢｇｌIIで切断し、ｐｔｇ 155ＰＲＯ（Kieny等，1984）の1.6ｋｂｐのＨｉｎｄIII／ＢｇｌII断片のベクターとして用い、ｐＲＷ739を構築した。ｐｔｇ155 ＰＲＯ中のＨｉｎｄIIIサイトは狂犬病Ｇ遺伝子の翻訳開始コドンの86ｂｐだけ下流域にある。ＢｇｌIIサイトはｐｔｇ155ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ遺伝子の翻訳終止コドンの下流にある。ｐＲＷ7 39をＮｒｕＩで部分消化し、ＢｇｌIIで完全消化し、前述したＨ６プロモーターの３′末端（Taylor等，1988a，b; Guo等，1989;Perkus等，1989）および狂犬病Ｇ遺伝子の全長を含む1.7ｋｂｐのＮｒｕＩ／ＢｇｌII断片を、ｐＲＷ824のＮｒｕＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入した。こうして構築したプラスミドをｐＲＷ832と命名する。ｐＲＷ824への挿入によりＨ６プロモーターのＮｒｕＩサイトからの５′部分が付与された。ｐＲＷ824のＢａｍＨＩとそれにつづくＳｍａＩの配列は（配列番号47）である。ｐＲＷ824は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を含むプラスミドである。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの消化により完全にこの非関連遺伝子は取り除かれた。Ｈ６プロモーター支配の狂犬病Ｇ遺伝子を含む1.8ｋｂｐのｐＲＷ832 ＳｍａＩ断片をｐＲＷ831のＳｍａＩに挿入し、ｐＲＷ838を構築した。ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発前記リン酸カルシウム共沈殿法（Panicali等，1982 ;Piccini et al，1987）を用いてプラスミドｐＲＷ838を、ＡＬＶＡＣに感染した初期ＣＥＦ細胞に形質移入した。狂犬病Ｇ特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団となるまで６回連続のプラーク精製にかけた。一つの代表プラークを増幅し、生成したＡＬＶＡＣ組み換え体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）と命名した（第９図も参照されたし）。狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの続いておこる変異のない挿入はシークエンス解析によって確認した。蛍光抗体法狂犬病ウイルスの成熟した部分品を集合させる最後の段階で、糖タンパク質複合体は、ゴルジ体から原形質膜へ輸送され、そこでカルボキシル末端が細胞質中に延び、タンパク質の大部分が細胞膜の外側の表面にある状態で集積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ中に発現される狂犬病糖タンパク質が正確に発現されていることを確認するため、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染した初期ＣＥＦ細胞に対して蛍光抗体法（実験）を行った。蛍光抗体法は狂犬病Ｇモノクローナル抗体を用いて前記のように行われた（Taylor等，1990）。強力な表面の蛍光がＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したＣＥＦ細胞から検出されたが、親のＡＬＶＡＣに感染した方からは検出されなかった。免疫沈降反応初期ＣＥＦ細胞、Vero細胞（アフリカグリーンモンキー腎臓細胞系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）、およびＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児肺組織より派生した繊維芽細胞様細胞系統＃ＣＣＬ171）の予め形成した単層に、細胞あたり 10ｐｆｕの親ＡＬＶＡＣおよび組み換えＡＬＶＡＣ−ＲＧを、放射性標識化された³⁵Ｓメチオニン存在下で接種し、前述のように処理した（Taylor等，1990）。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて免疫沈降反応を行った。組み換え体ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いた場合には分子量が約67kDaの狂犬病Ｇ特異的糖タンパク質の効果的な発現が検出された。感染していない細胞、または親ＡＬＶＡＣに感染した細胞では狂犬病特異的産物は検出されなかった。連続継代実験ＡＬＶＡＣウイルスの鳥類以外の種の範囲での研究において、拡散的感染または明白な病状は見られなかった（Taylor等,1991）。しかしながら、親株も組み換え体も鳥類以外の細胞中では増殖可能になるようには適応できないことを確認するため、連続継代実験を行った。ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧの２種類のウイルスは、３種類の細胞の系統の10回連続の無作為の継代で接種した。 (1)11日経過した白レグホン胚から調製された初期ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞 (2)Ｖｅｒｏ細胞（アフリカグリーンモンキー腎臓細胞の継続的な系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）） (3)ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児肺組織から派出した二倍体細胞系統（ＡＴＣＣ＃ＣＬ171））細胞あたり0.1ｐｆｕの感染重合度（m.o.i.）で、皿当り２×10⁶の細胞を含んでいるおのおのの細胞系統の60ｍｍの皿３枚を用いて最初の接種を行った。ひとつの皿はＤＮＡ複製の阻害剤である40μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（AraC）の存在下で接種した。37℃、１時間の吸収時間のあと、接種物を除き、単層を洗浄して吸収されなかったウイルスを除いた。今回は培地を５ｍｌのＥＭＥＭと２％ＮＢＣＳを含む２つの皿（サンプルｔ０，ｔ７）に配置し、40μｇ／ｍｌのＡｒａＣを含む５ｍｌのＥＭＥＭと２％ＮＢＣＳを含む３番目の皿（サンプルｔ７Ａ）に配置した。サンプルｔ０を−70℃で凍結させて、投入したウイルスの残存量を得た。サンプルｔ７およびｔ７Ａを７日間37℃で保温し、その後、中身を集めて、細胞を間接超音波破砕した。各々の細胞系統のサンプルｔ７のうちの１ｍｌを同じ細胞系統の三つの皿（ｔ０，ｔ７およびｔ７Ａを準備するため）および初期ＣＥＦ細胞一つの皿に希釈せずに接種した。サンプルｔ０、サンプルｔ７、サンプルｔ７Ａを継代１回目と同じように処理した。鳥類以外の細胞中で存在しているウイルスの、より高感度な検出を行うために増幅する段階を提供するためにＣＥＦ細胞へのさらなる接種を用意した。この手順によりＣＥＦとＭＲＣ−５については10回、Ｖｅｒｏについては８回、連続的継代を単純に繰り返した。それからサンプルを３回凍結融解し、初期ＣＥＦ単層上での滴定でアッセイした。各々のサンプル中のウイルスの収量は、寒天を用いた下のＣＥＦ単層上でのプラーク滴定により決定した。実験結果を表１および２にまとめて示す。この結果より、親ＡＬＶＡＣおよび組み換え体ＡＬＶＡＣ−ＲＧがＣＥＦ単層上では力価を失わずに持続性の複製（sustained reprication）を行えることが示された。Ｖｅｒｏ細胞では、ＡＬＶＡＣは２回の継代で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは１回の継代で、ウイルスのレベルが検出限界以下に下がった。ＭＲＣ−５細胞においても、同様な結果がみられ、１回継代したあとにはウイルスが検出されなかった。表１および２には４継代までの結果のみが示されているが、継代はＶｅｒｏでは８回、ＭＲＣ−５では10回行われ、どちらのウイルスも鳥類以外の細胞中での増殖にたいする、検出可能な適応はみられなかった。ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５の１回目の継代では、比較的高いレベルのウイルスがｔ７サンプル中に存在した。しかしながら、そのレベルは、ウイルス複製のおこらないシトシンアラビノシド存在下で保温されたｔ７Ａ、およびｔ０と同程度のレベルであった。このことより、鳥類以外の細胞中で７日目にみられたウイルスのレベルは残存ウイルスを示すものであり、新たに複製されたウイルスを示すものではないということが明らかとなった。アッセイの感度をより敏感にするため、７日間に各々の細胞系統から採取した一部を、ウイルスの増殖を許容するＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（cytopa thic effect;CPE）がみられた時点において、またはＣＰＥがみられない場合は７日間で回収した。これらの実験の結果を表３に示す。ウイルスの増殖を許容する細胞系統を通しての増幅の後であっても、ウイルスはＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞中でさらに２回の継代においてのみ検出された。今回使用した条件下では、どちらのウイルスもＶｅｒｏ細胞またはＭＲＣ−５細胞中において増殖への適応がなかったことが示された。サルの接種表４に記述されているように、４匹のＨＩＶ血清反応陽性のマカク（訳注ニホンザル、原文macaque）に最初に接種した。100日後に、追加免疫効果（booster effect）を決定するためにこれらの動物は再び接種し、付加的な七匹の動物に適容量の範囲内で接種した。血液は、適当な間隔をおいて採取して、 56℃と30分間の熱失活のあと高速抗体蛍光焦点阻害アッセイ（Rapid Fluorescen t Focus Inhibition Assay、RFFI; Smith等，1973）を用いて、抗狂犬病抗体の存在について血清分析を行った。チンパンジーへの接種２匹の成体雄チンパンジー（50から65kgの体重範囲）に筋肉内または皮下に、１×10⁷ｐｆｕのＶＣＰ65を接種した。動物の反応を観察し、また規則的な間隔をおいて、ＲＦＦＩ試験（Smith等,1973）による抗狂犬病抗体存在の分析のために採血した。動物には最初の接種から13週間後に等量が再び接種された。マウスへの接種いくつかのグループのネズミに異なったバッチのｖＣＰ65の希釈液を50−100ｍｌの範囲で接種した。ネズミには足部に接種した。14日後、ネズミにネズミ半数致死量が15から43の狂犬病ウイルスの毒性ＣＶＳ株がを頭蓋内に投与した。接種後28日目に生存数わ調べ、半数防御量（ＰＤ₅₀）を計算した。犬および猫への接種 10匹の生後５ヵ月のビーグル犬、および生後４ヵ月の10 匹の猫の皮下に6.7または7.7ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。４匹の犬と４匹の猫には接種しなかった。接種から14日後および28日後に動物から採血し、ＲＦＦＩ試験により抗狂犬病抗体を評価した。6.7ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物において、接種後29日目に、犬には3.7 ｌｏｇ₁₀ネズミＬＤ₅₀のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を猫には4.3ｌｏｇ₁₀ネズミＬＤ₅₀のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。リスザルへの接種３グループの、４匹ずつのリスザル（Saimiri scivreus）に、３種類のウイルス(a)ＡＬＶＡＣ、親カナリアポックスウイルス、(b)ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組み換え体、または(c)ｖＣＰ 37、ネコ白血病ウイルスの外膜糖タンパク質を発現する組み換え体のうちの一つを接種した。接種は麻酔をした状態で行った。それぞれの動物には、(1)乱刺法なしでの右眼表面への点眼で20μｌ、(2)口中への数滴の滴下で100μｌ、(3)毛をそった右腕の外面の２箇所の皮内注入場所各々へ100μｌずつおよび(4)右腿前方筋肉へ100μｌ、という接種を同時に行った。４匹のサルのうち、それぞれのウイルスについて、２匹には全量で5.0ｌｏｇ₁ ₀ ｐｆｕの量を、他の２匹には7.0ｌｏｇ₁₀ｐｆｕの量を接種した。規則的な間隔で動物から採血し、ＲＦＦＩ試験（Smith等，1973）により、抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。ワクチン接種に対する反応について毎日観察した。最初の接種から６ヵ月後、最初にＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した４匹、最初にｖＣＰ37を接種した２匹および最初にＡＬＶＡＣを接種した２匹、並びにワクチン接種されていない一匹に、6.5ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下に接種した。血清をＲＦＦＩ試験（Smith等，1973）により、狂犬病中和抗体の存在について調べた。ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種ウイルスが自己増殖的に複製できない鳥類以外の細胞中で、効果的な外来遺伝子の発現が得られるかを調べるため、１種類は鳥類で残り４種類は鳥類以外である５種類の細胞を、ウイルスの収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現、およびウイルス特異的ＤＮＡの蓄積について調べた。接種された細胞は、 (a)Ｖｅｒｏ細胞（アフリカグリーンモンキー腎臓，ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81） (b)ＭＲＣ−５細胞（ヒト胚肺，ＡＴＣＣ＃171） (c)ＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜，ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ25） (d)デトロイト532細胞（ヒト包皮，ダウン症ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54）、および (e)初期ＣＥＦ細胞である 11日経過した白レグホン胚からつくられたニワトリ繊維芽細胞を陽性比較対照として用いた。すべての接種は以下に記述されているように２×10⁶個の単層上で行った。Ａ．ＤＮＡ分析方法それぞれの細胞系統の３つの皿に５ｐｆｕ／細胞のウイルスをテストで接種し、それぞれの細胞系統のもう一皿ずつには接種しなかった。ひとつの皿を40μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の存在下で保温した。37℃60分間の吸着期間のあと、接種物を除いて、単層を２回洗浄して、吸着されなかったウイルスを除いた。次にＡｒａＣを含むか、または含まない培地を配置した。ひとつの皿（ＡｒａＣなし）中の細胞を時間ゼロのサンプルとして回収した。残りの皿は37℃で72時間保温し、その後細胞を回収しＤＮＡ蓄積の分析に用いた。それぞれのサンプルの２×10⁶個の細胞を40ｍｌＭ−ＥＤＴＡを含む0.5ｍｌのリン酸で緩衝された生理食塩水中に再び懸濁し、37℃で５分間保温した。42℃で前もって保温されていた120ｍＭ−ＥＤＴＡを含む等量の1.5％アガロースを細胞懸濁液に加え、静かに混合した。懸濁液を寒天プラグ鋳型に移し、少なくとも15分間固化した。寒天プラグを型から取り出し、プラグを完全にカバーする量の溶解バッファー（１％サルコシル、100μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ、10ｍＭトリス塩酸pH7.5 、200ｍＭＥＤＴＡ）中50℃で、12−16時間に亘り保温した。続いて溶解バッファーを5.0ｍｌの滅菌済0.5×ＴＢＥ（44.5ｍＭトリスーホウ酸、44.5ｍＭホウ酸、0.5ｍＭＥＤＴＡ）でおきかえ、ＴＢＥを３回取りかえて４℃で６時間に亘り平衡化した。プラグ内のウイルスＤＮＡをパルスフィールド電気泳動により細胞のＤＮＡおよびＲＮＡから分画した。電気泳動は15℃、0.5×ＴＢＥ中で50−90 秒の斜面で180Ｖ、20時間行った。ＤＮＡをラムダＤＮＡ分子量標準品とともに泳動させた。電気泳動後、ウイルスＤＮＡバンドをエチジウムブロマイドにより染色し、可視化した。続いてＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、精製したＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射性標識化されたプローブを用いて追跡した。Ｂ．ウイルス収量の評価皿は、入力感染多重度が0.1ｐｆｕ／細胞であったことを除いて正確に上記に従い接種した。感染後72時間で、細胞を連続した３回の凍結融解により溶解した。ウイルス収量をＣＥＦ単層上のプラーク滴定により評価した。Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の解析皿には親ウイルスまたは組み換えウイルスを10ｐｆｕ／細胞の感染多重度で接種し、別にウイルス非感染比較対照としてもうひとつ皿を用意した。１時間の吸収の期間の後、培地を除いて、メチオニンの入っていない培地と置き換えた。 30分後、培地は、メチオニンの入っていない培地に25μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを加えたところの培地で置換した。感染した細胞を一夜（約16時間）で標識化し、Ａ溶解バッファーを加えることによって溶解した。狂犬病Ｇ遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いて、免疫沈降反応を前述したとおりに行った。（Ta ylor等，1990）。結果：ウイルス収量の評価 0.1pfu／細胞での接種から72時間後の収量についての滴定の結果を表５に示す。この結果より、鳥類の細胞中では増殖的な感染が達成されるが、この方法では、鳥類以外の４つの細胞系ではウイルス収量の増加は検出されなかったことが分かる。ウイルスＤＮＡの蓄積の解析鳥類以外の細胞中で増殖的なウイルスの複製に対する抑制が、ＤＮＡ複製の前あるいは後に起こっているかどうかを決定するために、細胞溶解物からのＤＮＡを、電気泳動で分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的ＤＮＡの存在について調べた。感染されていないＣＥＦ細胞からのＤＮＡ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染後時間ゼロのＣＥＦ細胞からのＤＮＡ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染後72時間経過したＣＥＦ細胞からのＤＮＡ、およびＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染後40μｇ／mlのシトシンアラビノシド存在下で72時間経過したＣＥＦ細胞からのＤＮＡはすべて同じバックグラウンド活性を示し、これは放射性標識化されたＡＬＶＡＣＤＮＡプローブ調整時のＣＥＦ細胞ＤＮＡの混在によるためであると思われた。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染後72時間経過したＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡの蓄積を示す約350kbpの強いバンドを示した。ＤＮＡ合成阻害剤であるシトシンアラビノシド存在下で培養されたときは、このようなバンドは検出されなかった。Vero細胞中で作られた同等のサンプルでは、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染後ゼロ時間のサンプルが、約350kbpの部分に極めてかすかなバンドを示した。これは残存ウイルスの量を示している。バンドの強さは、感染後72時間経過したサンプルでは増幅されるが、これはある程度のウイルス特異的ＤＮＡの複製がVero細胞中で行われているが、ウイルスの後代を増やすには至らなかったことを示していた。ＭＲＣ−５細胞中で作られた同等のサンプルは、この系統の細胞では、これらの条件においてはウイルス特異的ＤＮＡの蓄積が起こらないことを示していた。この実験は、他のヒト細胞、特にＷＩＳＨ細胞およびデトロイト532細胞に対しても拡張され行なわれた。ＡＬＶＡＣに感染したＣＥＦ細胞は陽性の比較対象として提供された。ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積はＡＬＶＡＣ− ＲＧを接種したＷＩＳＨ細胞またはデトロイト細胞のいずれにも検出されなかった。しかし、この方法での検出限界以下のウイルスＤＮＡの蓄積は起きている可能性があることに注意すべきである。ウイルスＤＮＡの複製が³Ｈチミジンの取り込みで測定された他の実験は、Vero細胞およびＭＲＣ−５細胞で得られた結果を裏付けている。狂犬病遺伝子発現の解析ウイルスＤＮＡの複製が行われていなくても、ウイルスの遺伝子、特に挿入された異種遺伝子の、ヒト細胞系統中での発現が起こるか否かを決定するため、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染した、³⁵Ｓメチオニンで標識化された、鳥類および鳥類以外の細胞破砕液について免疫沈降反応実験を行った。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降の結果は、ＡＬＶＡＣに感染したＣＥＦ細胞、Vero細胞およびＭＲＣ−５細胞、ＷＩＳＨ細胞およびデトロイト細胞中に、67kDaの糖タンパク質が特異的な免疫沈降反応を示した。感染していない細胞の細胞破砕液および親株に感染した細胞の細胞破砕液中にはこのような狂犬病遺伝子産物は検出されなかった。この実験の結果は、解析されたヒト細胞系統においては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組み換え体は、感染を開始し、外来遺伝子産物をＨ６早期／後期ワクシニアウイルスプロモーターの転写調節のもとに発現することは可能だが、ＤＮＡの複製を通じての複製は進められず、他の検出可能な生産されたウイルスの後代も存在しなかったことを示している。Vero細胞においては、ある程度のレベルはＡＬＶＡＣ −ＲＧ特異的ＤＮＡの蓄積が観察されたが、これらの方法ではウイルスの後代は検出されなかった。これらの結果は、解析されたヒト細胞系統において、ウイルス複製に対する抑制がＤＮＡ合成に先立って起こるが、一方でVero細胞中では、ウイルスＤＮＡ複製の開始に続いて抑制が起こることを示している。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ中で発現された狂犬病糖タンパク質が、免疫原性かどうかを確認するため、多数の動物をこの組み換え体の接種によって調べた。現在の狂犬病ワクチンの効果はネズミモデル系で評価されている。ゆえにＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて同じテストを行った。前培養されたウイルスを培養組識で10回継代して作った一つのワクチンバッチ（Ｊ）を含む、感染力価が6.7から8.4 log₁₀ＴＣＩＤ₅₀までの範囲にある９種の異なったウイルス溶液を順次希釈し、50から100μl の希釈液を生後４から６週間のネズミの足部に接種した。14日後にネズミに、対照ネズミのグループ内での致死滴定で測定されたＬＤ₅₀値の１５倍から４５倍の狂犬病ウイルスＣＶＳ株300μlを脳内経由で投与した。ＰＤ₅₀（半数防御量）で示された効力を投与後14日目に計算した。この実験結果を表６に示す。ＡＬＶＡＣ−ＲＧは3.33から4.56まで（平均3.73、標準偏差0.48）の範囲のＰＤ₅₀値の狂犬病ウイルス投与に対して常にネズミを防御できることが結果より示された。この研究の延張線として、オスのネズミに脳内経由で50μlの6.0 log₁₀ＴＣＩＤ₅₀ のＡＬＶＡＣ−ＲＧを含むウイルス液、または等量の感染させてない細胞懸濁液を接種した。ネズミを接種後１，３，６日後に殺し、脳を取り出して固定し解体した（Sectioned）。組識病理学的試験において、ネズミにおいてＡＬＶＡＣ− ＲＧの神経毒性の証拠は示されなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧの犬および猫に対する安全性と効果を評価するために、生後 14.5か月のビーグル犬および生後14.4か月の猫のグループを調べた。それぞれの種の４匹の動物にはワクチンを接種しなかった。５匹の動物には6.7 log₁₀ＴＣＩＤ₅₀を皮下で接種し、他の５匹の動物には7.7 log₁₀ＴＣＩＤ₅₀を同経路で接種した。動物から採血し、抗狂犬病抗体を調べた。接種しなかったか、または6. 7 log₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物には、接種後29日目に、3 .7 log₁₀ネズミＬＤ₅₀（犬用、側頭筋へ）、あるいは4.3 log₁₀ネズミＬＤ₅₀（猫、首へ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。実験結果を表７に示す。接種による副作用は、犬にも猫にも、どちらの投与量でも見られなかった。6. 7 log₁₀ネズミＬＤ₅₀を投与した犬５匹中の４匹が接種後14日目で抗体価を持ち、すべての犬が29日目には抗体価を持っていた。すべての犬が、対照の４匹中の３匹を殺す投与から保護された。猫においては、6.7 log₁₀ネズミＬＤ₅₀を投与された５匹のうち３匹が14日目で抗体を持ち、すべての猫が29日目ではすべて陽性だったが、平均の抗体価は2.9ＩＵと低かった。対照の猫をすべて殺した投与に対し、５匹のうち３匹が生存した。7.7 log₁₀ネズミＬＤ₅₀で免疫したすべての猫は14日目および29日目に抗体価を持ち、相乗平均は国際単位で8.1と計算された。リスザルの（Saimiri sciureus）のＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび関係のないカナリアポックスウイルス組み換え体の接種に対する免疫反応を調べた。サルのグループに前述したように接種し、狂犬病特異的抗体の存在について調べた。皮内接種による微少な典型的な皮の反応は別にして、すべてのサルにおいて副作用は見られなかった。皮内接種後２日目および４日目にのみ少量の残存ウイルスを皮の傷より単離した。すべての検体は７日目以降は陰性であった。筋肉接種による局地反応はみられなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した４匹のサルのすべてが、ＲＦＦＩテストで測定される、抗狂犬病血清中和抗体を産生していた。最初の接種から約６か月後にすべてのサルおよび別の一匹の免疫化されていないサルに、6.5 log₁₀ネズミＬＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを、左腿の外面に皮下の経路で再接種した。血清中の抗狂犬病抗体の存在を調べた。結果を表８に示す。狂犬病を接種していないサル５匹のうちの４匹は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種後７日で血清の応答を示した。接種後11日までに５匹すべてのサルが検出可能な抗体を有した。以前に狂犬病糖タンパク質を接種されていたサル４匹のうちのすべてが、再接種後３−７日の間に顕著な血清中和力価の増加を示した。この結果より、リスザルへのＡＬＶＡＣ−ＲＧのワクチン接種は、副作用を起こさず、初期中和抗体反応が誘導されることが示された。再接種により、既往抗体反応も誘導される。ＡＬＶＡＣまたは関係ない外来遺伝子を発現するカナリアポックス組み換え体への事前の接触は、再接種の際の抗狂犬病免疫反応の誘導を妨害しない。ＨＩＶ−２血清陽性のサルの、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫反応を評価した。動物を前述のように接種し、抗狂犬病血清中和抗体をＲＦＦＩ試験により調べた。表９に示す結果より、皮下経路で接種したＨＩＶ−２陽性の動物は、一回の接種後11日までに抗狂犬病抗体を産生した。既往抗体反応が、最初の接種から約３か月後の追加免疫接種後に検出された。経口で組み換え体を接種された動物では反応は検出されなかった。さらに、一連の６匹の動物に、筋肉あるいは皮下の経路で少量のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。接種した６匹のうち５匹が、接種後14日までに同程度の抗体価で反応した。事前にＨＩＶに接触させた２匹のチンパンジーに、7.0 log₁₀pfuのＡＬＶＡＣ −ＲＧを皮下または筋肉経路で接種した。接種後３か月で両方の動物は同一の方式で再接種した。結果を表10に示す。接種による副作用は、筋内および皮下経路のどちらでも見られなかった。両方のチンパンジーは、最初の接種に対し14日目までに応答し、引き続いての再接種においては強い増加した反応が検出された。実施例10−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ65）を用いたヒトの免疫化ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）を実施例９、第９Ａ図、および第９Ｂ図内で記述された通りに開発した。ワクチン製造および規模の拡大のため、ＡＬＶＡＣ− ＲＧ（ｖＣＰ65）を、病原性のない特別な卵から派生した初期ＣＥＦ中で増殖した。細胞を0.01の感染多重度で量だけ感染させ、３日間37℃で保温した。血清のない培地中で、感染した細胞を超音波破砕により、ワクチンウイルス懸濁液を得た；続いて細胞の残渣を遠心分離およびろ過により除いた。生成した浄化された懸濁液に、凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を加え、１回分のバイアルに分けて凍結乾燥した。凍結乾燥に先立って、血清の無い培地と凍結乾燥安定剤との混合物でウイルス懸濁液を10倍ごとに希釈することにより、力価の弱められた３個の希釈液を調製した。実験室のげっ歯類の接種および外来物質の検索に特に配慮して、細胞基質、培地、前培養されたウイルスおよび最終生産物などについて品質管理試験を行った。望ましくない特性は認められなかった。臨床前のデータ in vitroでの研究においてＶＥＲＯあるいはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）の増殖を維持しないことが示された。ＶＥＲＯでの８回の、およびＭＲＣでの10回の連続した無作為の継代においては、これらの鳥類でない系統中での増殖するウイルスに検出可能な適応は見られなかった。ヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、デトロイト532、ＨＥＬ、ＨＮＫまたはＥＢＶ形質変換されたリンパ芽球細胞）は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）で感染あるいは接種されると、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積を示さず、これらの細胞中でのＤＮＡ合成以前に複製が抑制されることを示唆した。しかし注目すべきことに、狂犬病ウイルス由来糖タンパク質遺伝子のすべての細胞系統での発現を調べたところ、ウイルスＤＮＡの複製に先立つ、カナリアポックス複製サイクル中での中止段階が示された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）の安全性および効果が一連の動物実験で裏付けられた。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験用げっ歯類（乳児期および成体ネズミ）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよび犬、リスザル、アカゲザルマカクおよびチンパンジー等の多くの種に、10⁵から10⁸pfuの範囲で接種した。多種の経路を用い、最も多くは皮下、筋肉、皮内を用いたが、経口（サルとネズミ）および大脳内（ネズミ）もまた用いた。カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）は接種地点に“take”外傷を引き起こしたが、病気または死には至らなかった。ウサギへの皮肉接種により、拡散せずに７日から10日で回復する典型的なポックスウイルス接種反応が見られた。どの動物実験においても、カナリアポックスによる副作用は見られなかった。引き続いてのＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）の接種により、げっ歯類、犬、猫、および霊長類中で、抗狂犬病抗原が産生されたことが、Rapid Fluorescen t Focus Inhibition Test（ＲＦＦＩＴ）による測定で示され、免疫原性が示された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（vＣＰ65）で免疫化したネズミ、イヌ、およびネコにおいて、狂犬病ウイルス投与実験により防御が確認された。ボランティア狂犬病免疫をされたことがない20-45才の健康な成人が25人登録した。彼らの健康状態を、完全な病歴、生理的試験、血液学的および血液化学的分析により評価した。排除基準は、妊娠、アレルギー、あらゆる免疫不全、慢性衰弱病、ガン、過去三ケ月間の免疫グロブリンの注射、およびヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原への血清陽性反応であった。研究計画参加者に、ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチンのバッチNo.Ｅ0751（Pas teur Merieux Serums & Vaccine，Lyon，France）または、本研究のワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（vＣＰ65）のうちのいずれかを接種するよう無造作に割り当てた。研究は、投与量を段階的に増やすものを選定した。実験用ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（vＣＰ65）ワクチンのバッチを、三つのボランティアのグループ（グループＡ、Ｂ、およびＣ）に、おのおのの段階の間に二週間の間隔をおいて皮下接種した。三つのバッチの濃度はそれぞれ一回あたり10^3.5、10^4.5、10^5.5組識培養感染量（Tissue Culture Infectious Dose;ＴＣＩＤ₅₀）であった。おのおののボランティアに２回のワクチンを三角筋部に４週間の間隔をおいて皮下接種した。注射したワクチンの性質は最初の注射の時には参加者には知らされなかったが調査者には知らされた。２回目の注射の時の即時過敏症の危険を最小限にするため、中間の量の実験ワクチンを接種したグループＢのボランティアに１時間早く少ない量を注射し、多量を接種した人々（グループＣ）に１時間間隔で少ない量と中間の量を接種した。６ケ月後、もっとも多量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）およびＨＤＣワクチンを受けた人々（グループＣ）に、三回目のワクチンを接種した。彼らを前と同じワクチン、または前とは別のワクチンを受けるよう無作為に分けた。その結果以下の免疫図式に相当する４つのグループを形成した。１．ＨＤＣ，ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ，ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65），ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65），ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65），ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）副作用の観察すべての被験体を注入後１時間にわたって観察し、以降５日間は毎日再検査した。彼らに局所的および全身的反応を次の三週間にわたって記録するよう依頼し、１週間に２度問診した。実験室の調査員血液検体を登録前、おのおのの接種の２，４，６日後に採取した。分析項目は血球の計数肝臓酵素およびクレアチンキナーゼのアセッイであった。抗体アッセイ抗体アッセイを、最初のアッセイの７日前、７，28，35，56， 173，187および208日目に行った。狂犬病に対する中和抗体のレベルを高速蛍光焦点阻害試験（Rapid Fluorescen t Focus Inhibition Test；ＲＦＦＩＴ）により（Smith & Yaeger，In Laborato ry Technigues on Rabies）決定した。カナリアポックス抗体を直接ＥＬＩＳＡにより測定した。抗原として、精製されたカナリアポックスウイルスを0.1 ％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００で崩壊させた懸濁液をマイクロプレートに塗布した。血清の固定された希釈液を２時間室温で反応させ、反応した抗体をペルオキシダーゼで標識化された抗ヒトＩｇＧヤギ血清により検出した。結果は490nmでの吸光度で表す。分析 25名の被験者が登録され、研究を完了した。10名の男性と15名の女性で平均年令は31.9才だった（21から48）。３名を除いたすべての人々は以前の天然痘のワクチン接種の証拠があったが３名は一般的なはん痕と接種歴がなかった。３名はより少量の実験用ワクチン（１０^3.5および１０^4.5ＴＣＴＤ₅₀）を受け、９名は１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀を受け、１０名はＨＤＣワクチンを受けた。安全性（表11）免疫化の間、注入後24時間以内に37.7℃をこえる熱がＨＤＣを接種された１人（37.8℃）およびｖＣＰ65 10^5.5ＴＣＩＤ₅₀を接種された１人（38℃）において認められた。ワクチン接種を原因とする他の全身反応はどの被験者にも見られなかった。局在反応が、ＨＤＣワクチンを皮下注射された10名中９名に、ｖＣＰ65を10^3. ⁵ ，10^4.5，10^5.5ＴＣＩＤ₅₀だけめいめい注射された３人、３人、９人中のそれぞれ０人、１人、９人に見られた。圧痛がもっとも多くみられた症状で常に軽かった。他の局所反応としては赤化や硬化がみられたがいずれも軽く一過性であった。すべての症状は常に24時間以内に現れ、72時間以上は続かなかった。血球数、肝臓酵素、クレアチンキナーゼの値にも著しい変化は見られなかった。免疫反応：狂犬病中和抗体（表12）最初の注入から28日経過した後ＨＤＣをＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）を接種した人が、グループＡおよびグループＢ（１０^3.5および１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀）では０人、グループＣ（１０^5,5ＴＣＩＤ₅₀ ）では９人中２人だけ、この防御的力価に達していた。 56日後（すなわち、２回目の接種から２８日後）には、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）ワクチンを接種した人は、グループＡで３人中０人、グループＢで３人中２人、グループＣでは９人中９人が防御的免疫を達成しており、ＨＤＣを接種された人では10人すべての人が持続していた。 56日目の力価の幾何平均値はグループＡ，Ｂ，ＣおよびＨＣＰにおいてそれぞれ0.05，0.47，4.4および11.5IU／mlであった。 180日目では狂犬病抗体価はすべての人で大幅に減少していたが、最少の防御的力価0.5 IU／mlを超えて残存していたのはグループＨＣＤで10人中５人およびグループＣで９人中５人であった。力価の幾何平均値はグループＨＣＤおよびグループＣでそれぞれ0.51および0.45IU／mlであった。カナリアポックスウイルスに対する抗体（表13）最高の力価を有するこれらの対象者においては事前に鳥のカナリアとの接触が全くなかったにもかかわらず、免疫化以前に測定された力価は0.22から1.23Ｏ．Ｄ．単位まで幅広く変化していた。免疫前と２回目の接種後とで２倍以上値が変化していたことを血清変換と定義すると、血清変換はグループＢで３人中１人、グループＣで９人中９人で認められていた一方、グループＡまたはグループＨＤＣでは認められなかった。追加免疫接種６ケ月後の追加免疫接種時に、ワクチンは同様に実施した。ＨＤＣを追加免疫したグループでは９人中２人に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）を追加免疫したグループでは10人中１人に熱がみられた。局在反応が認められたのは、ＨＤＣグループでは９人中５人、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）グループでは10人中６人であった。観察第13図は狂犬病中和抗体価（高速蛍光焦点阻害試験：Rapid Fluorescen t Focus Inhibition Test;ＲＦＦＩＴ IU/ml）、すなわち、ＨＤＣおよびｖＣＰ65（１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀）による事前に同じまたは別のワクチンで免疫化したボランティア中における付加免疫効果を示している。ワクチンは０日，28日および180日に投与した。抗体価は０，７，28，35，56，173，187および208日目に測定した。第13Ａ図から第13Ｄ図に示すように、なされた追加免疫は、免疫図式にかかわりなくすべての対象者で狂犬病抗体価をさらに上昇させた。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）での追加免疫は全体的にＨＤＣ追加免疫より低い免疫反応を誘発し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65） −ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）のグループは他の３グループと比較して抗体価が大幅に低かった。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）追加免疫接種を行ったことにより前にＨＤＣワクチンを接種した５人中３人において、そして前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ65）で免疫化した５人すべてにおいてカナリアポックス抗体価が上昇した。概して、局所的ウイルス複製を示すｖＣＰ65の投与による局所的副作用は全く見られなかった。特に、ワクチン接種後に見られるような外傷は存在しなかった。ウイルス複製が非存在しないことが明白であるにもかかわらず、接種により、ボランティアはカナリアポックスベクターに対する抗体、及び発現された狂犬病糖タンパク質に対する抗体を共に多量に産出した。狂犬病中和抗体を、ネズミでの血清中和試験と相関関係があることが知られている高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によりアッセイした。10^5.5ＴＣＩＤ₅ ₀ を接種した９人のうち５人が、初回より低い値の反応を示した。接種量が最大であったグループ全員、並びに接種量が中位のグループさえも３人中２人において、２回目の接種後には狂犬病抗体の防御的力価が認められた。本研究において、両方のワクチンを、普通は生ワクチンに推奨されているが不活性化されたＨＤＣワクチンには推奨されていない皮下経路で投与した。この経路は、接種地点をもっとも注意を払いながら試験できるために選ばれた。これで、ＨＤＣを接種したグループで抗体の現れが遅かったことを説明できるであろう。実際、ＨＤＣグループは７日目には抗体が増加したものはいなかったが、一方で、ＨＤＣワクチンを筋内経路で投与したほとんどの研究においては、かなりの割合の対象者で抗体が増加している（Klietmann等Int′l Green Cross-ジュネーブ,1981；Kuwert 等、Int′l Green Cross−ジュネーブ，1981）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路での投与に限定されるものではない。狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何学平均力価）は、今回実験したワクチンによるものは比較対照であるＨＤＣによるワクチンより低かったが、しかしながら防御に要求される最少の力価を十分上回っていた。本研究で用いられた三段階投与でみられた投与量による反応効果は、より多い投与量が、より強い反応を誘発する可能性を示唆している。この開示により、当業者は所定の患者に適当な投与量を選択することができる。抗体反応を追加免疫する能力も、本実施例の別の重要な結果である。実際、免疫図式に関りなく、接種の６ケ月後には全ての対象者で狂犬病抗体価の増加が見られた。カナリアポックスベクターあるいは狂犬病糖タンパク質のうちいずれかにより誘発された、前から存在する免疫系には、組み換え体ワクチンの候補または既知のＨＤＣ狂犬病ワクチンによる追加免疫に対する抑制効果がないことが示された。この事は、ヒト中のワクシニア組み換え体についての、免疫反応は事前に存在する免疫系により抑制されるという他者の発見（Cooney等，I.ancet 199, 337:567-72; Etlinger等，Vaccine 9: 470-72，1991）と好対照をなす。ゆえに、自ら複製しないボックスウイルスは、複製され得る部分により免疫反応が生じるという利点の全てを伴ない、完全複製され得るウイルスによって引き起こされてる安全性の問題なくして、ヒト中で免疫化のためのベクターとして機能できるということが本実施例によって明確に示された。実施例11 ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと他の様々なワクシニアウイルス菌株との半数致死量（ＬＤ₅₀）の比較ネズミ雄の異系交配したスイスウェブスターネズミをTaconic Farms（Germa n town，NY）から購入し、生後３週間で使われるまでネズミ餅と水（ad libitum ）で育てた（普通ネズミ）。新生の異系交配した両性のスイスウェブスターネズミをTaconic Farmsで行われた好時期の続いての妊娠により得た。使用された全ての新生ネズミは２日間以内に配達されたものであった。ウイルスＡＬＶＡＣを、カナリアポックスウイルス集団からプラーク精製によって派生し、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）中で調製した。ショ糖密度勾配遠心による精製後に、ＣＥＦ細胞中でのＡＬＶＡＣをプラーク形成単位で測定した。ワクシニアウイルス派生体ＷＲ（Ｌ）をＷＲの大プラーク表現型により選択し、派生した（Panicali等.，1981）。ワクシニアウイルスのWyeth New Yor k State Board of Healthワクチン株を、子牛リンパ型ワクチン製剤 Dryvax対照番号302001ＢとしてPharmaceuticalsから得た。ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ−２をフランスのInstitut Mevieuxより得た。ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株をハコペンハーゲンＶＣ−２株より派生した。Ｗｙｅｔｈ株を除く全てのワクシニアウイルス株を、Ｖｅｒｏアフリカグリーンモンキーの腎臓細胞中で培養し、ショ糖密度勾配遠心で精製した、Ｖｅｒｏ細胞でのブラーク形成単位を測定した。Ｗｙｅｔｈ株をＣＥＦ細胞中で増殖し、ＣＥＦ細胞で測定した。接種 10匹の普通ネズミのグループに、リン酸で緩衝した減菌生理食塩水で10 倍階段希釈することにより調製したいくつかのウイルス希釈液のひとつを0.05ml の量で脳内経路により接種した。いくつかの場合には、希釈していないウイルス液を接種に用いた。 10匹の生後１から２日の新生ネズミのグループを、接種量が0.03mlであった点を除いて普通ネズミと同様に脳内接種した。全てのネズミを接種後、14日間（新生ネズミ）あるいは21日間（普通ネズミ）の期間、死亡率を調べるため毎日観察した。接種日の翌朝に死亡したのが発見されたネズミは、トラウマによる死の可能性もあるので除外した。実験した集団の50％が死亡するのに要求される致死量（半数致死量、ＬＤ₅₀）をReedとMuenchの比例方式で求めた。異系交配された新生普通ネズミに対する脳内経路接種時のＬＤ₅₀についてのＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと他の様々なワクシニアウイルス株との比較新生、普通ネズミ中では、ＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣの毒性は試験した他のワクシニアウイルス株と比較して数ケタの規模で低かった（表14）。ＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣは、普通ネズミ中でＷｙｅｔｈ株の3,500倍以上、親ＶＣ−２株の12,500倍以上、ＷＲ（Ｌ）派生体の63,000,000倍以上毒性が低いことが判明した。これらの結果は、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア株と比較して非常に弱毒化されており、ＡＬＶＡＣは一般に脳内経路で投与されたときに新生ネズミに対して毒性がないが、両方とも極めて多量（3.85×10⁸pfuのＡＬＶＡＣおよび３×10⁸pfuのＮＹＶＡＣ）にこの経路で接種したネズミを未知の機構で死なせ得ることを示唆していた。異系交配された新生普通ネズミに対する脳内経路接種時のＬＤ₅₀についてのＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣとの他の様々なワクシニアウイルス株との比較脳内経路投与モデル系での滴定により、５種類のポックスウイルスの普通、新生ネズミに対する相対毒性を調べた（表15）。最後の致死性として、ＬＤ₅₀値は、ＡＬＶＡＣはワクシニアウイルスＷｙｅｔｈワクチン株の100,000倍以上、ワクシニアウイルスコペンハーゲンＶＣ−２株の200,000倍以上、ワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ派生体の25、000、000倍以上、毒性が弱いことを示した。にもかかわらず、試験した内でもっとも大量の6.3×10⁷pfuにおいては死亡率は100％であった。6. 3×10⁶pfuでは死亡率は33.3％であった。死因は実際には分かっていないが、もっとも大量に投与された（約6.3ＬＤ₅₀）グループのネズミの平均生存時間（ＭＳＴ）は6.7±1.5日であったことから、中毒性またはトラウマによる性質によるものではないと思われた。投与量が５ＬＤ₅₀でのＷＲ（Ｌ）ではＭＳＴは4.8±0 .6日で、これと比較するとＡＬＶＡＣを投与したネズミのＭＳＴは非常に長い。ＮＹＶＡＣと比較して、Ｗｙｅｔｈは15、000以上、ＶＣ−２は35、000倍以上、そしてＷＲ（Ｌ）は3、000、000倍以上有毒であった。ＡＬＶＡＣ同様、６×10⁸および６×10⁷の大量投与では、死亡率100％であった。しかしながら、380ＬＤ₅₀ に相当する最多量を投与したネズミのＭＳＴはわずか２日であった。（２日目に９匹が死亡し、４日目に４匹が死亡）。対照的に500ＬＤ₅₀相当の最多量のＷＲ −（Ｌ）を投与した全てのネズミは４日目まで生き延びた。実施例12−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ879）の評価免疫沈降反応鳥類の、あるいは鳥類以外の細胞の単相に、10pfu／細胞の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）またはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ879）ウイルスを接種した。接種はメチオニンの入っていないＥＭＥＭ中で行ない、２％の透析された牛胎児血清を添加した。１時間の保温ののち、接種物を除去し、培地をメチオニンの入っていないＥＭＥＭに20μＣｉ／mlの³⁵Ｓ−メチオニンを添加したものに置きかえた。一晩（16時間）保温した後、細胞はＢｕｆｆｅｒＡ（１％Noni detP-40，10mMトリスpH7.4，150mM塩化ナトリウム，１mMＥＤＴＡ，0.01mMアジ化ナトリウム，500unit/mlアプロチニンおよび0.02％フェニルメチルスルホニルフッ化物）を加えることにより溶解した。免疫沈降反応はDr．C．Trinarchi，Gr iffith Laboratories,ニューヨーク州保健部、Albany，NYによって提供された、 24−３Ｆ10と命名された狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体および、ベーリンガーマンハイム社（Cat,＃605-500）より得られたラット抗ネズミ複合体を用いた。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社（Piscataway，NJ）から得たプロテインＡセファロースＣＬ−48を支持担体として用いた。免疫沈降反応物をDreyfussらの方法により（1984）10％ポリアクリルアミドゲルを用いて分画した。ゲルを固定化し、間接撮影のため１モル濃度のサリチル酸ナトリウムで１時間処理した後、コダックＸＡＲ−２フィルムに露出し、免疫沈降されたタンパク種の種を可視化した。動物の供給源ニュージーランド白ウサギをHare-Marland（Hewitt,ニュージャジー州）から得た。異系交配された生後３週間の雄のスイスウェブスターネズミ、異系交配された妊娠中の雌のスイスウェブスターネズミ、および生後４週間のスイスウェブスター（Swiss Webster）ヌード（nu⁺nu⁺）ネズミをTaconic Far ms社（Garmantown,ニューヨーク）より得た。すべての動物はＮＩＨのガイドラインに沿って育てたものである。すべての動物議定書が施設のＩＡＣＵＣによって承認された。必要とみなされたときは、明らかに末期的段階にあるネズミを安楽死させた。ウサギの傷の評価二匹のウサギのそれぞれに、10⁴，10⁵，10⁶，10⁷または10⁸ pfuの試験ウイルスを含むＰＢＳ、またはＰＢＳのみを0.1ｍｌの量だけ数ヶ所に皮内接種した。ウサギを４日目から傷が直るまで毎日観察した。硬化と潰瘍化を測定し記録された。接種地点からのウイルスの回収一匹のウサギに、10⁶，10⁶，10⁷pfuの試験ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを0.1ml数ヶ所に接種した。11日後、ウサギを安楽死させ、おのおのの接種地点から採取した皮の生検材料を、ウイルス回収用に機械的崩壊および間接的超音波粉砕により無菌的に調整した。ウイルス感染をＣＥＦ単相上のプラーク滴定によりアッセイした。ネズミ内での毒性 10匹のネズミのグループまたはヌードネズミ実験では５匹にいくつかの0.5mlの減菌ＰＢＳ中のウイルスの希釈液のひとつを接種した。実施例11を参照する。シクロホスホアミド（Cyclophosphamide; CY）処理ウイルス注入の２日前に、ネズミに４mg（0.02ml）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ）を皮内（ｉｐ）経路で注入し、注入日を０日とした。注入後以下の日に以下の量をネズミにＣＹｉｐ経路でを注入した；１日目に４mg、４，７，11日目に２mg、14，18，21，25および28日目に３mg。 11日目にコールターカウンター（Coulter Counter）を用いて白血球を計数することに免疫抑制を間接的に観察した。平均の白血球数は非処理ネズミは13,500細胞／μｌ（ｎ＝４）およびＣＹ処理した対照ネズミは4,220細胞μｌ（ｎ＝５）であった。ＬＤ₅₀の計算 50％の死亡率を達成するのに必要な致死量（半数致死量）をリードおよびムエンチの比例方法（Reed and Muench 1938）により決定した。ネズミ中のＮＹＶＡＣ−ＲＧの有効性試験生後４週間から６週間のネズミに、2.0−8.0log₁₀組織培養感染量50％（ＴＣＩＤ₅₀）の範囲にある、ＶＶ−ＲＧ（Kieny等，1984）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Taylor等，1991b）、またはＮＹＶＡＣ −ＲＧのいずれかの希釈液を50から100ml，足部に接種した。おのおののグループは８匹のネズミより成っていた。接種後14日目に、15ＬＤ₅₀の狂犬病ウイルスＣＶＳ株（0.03ml）を、脳内経路でそれらのネズミに投与した。28日目に、生存しているネズミを数え、半数防御率（protective dose 50％；ＰＤ₅₀）を計算した。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）の誘導ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株は、プラーククローン化したコペンハーゲンワクチン株の単離体ＶＣ−２より製造した。ＶＣ−２よりＮＹＶＡＣを製造するために、本発明の前半部分で記述したように、毒性に関した多くのウイルス機能を含む18の読み取り枠を、一連の連続的な操作により欠失された。これらの欠失を、新しい不要な読み取り枠が現れることを防ぐことを目的として計画された方法に従って構築した。第10図はＮＹＶＡＣを製造するために欠失した読み取り枠を模式的に表している。第10図の上部にはワクシニアウイルス染色体（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン株）のHindＩ II制限酵素地図が示されている。拡大されている部分は、ＮＹＶＡＣを製造する際に連続して欠損したＶＣ−２の６つの領域である。この欠損は本発明に前述している（例１から例６）。そのような欠損座の下部には、その座から欠失された読み取り枠がそれらの遺伝生産物の機能または相同性および分子量とともに列挙されている。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのヒト組織細胞系統中での複製の研究ヒト由来細胞中でのワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株（ｖＰ866）の複製のレベルを決定するため、６種類の細胞系統を0.1pfu細胞の投入量で液体培養下で接種し、72 時間保温した。コペンハーゲン親クローン（ＶＣ−２）を並行して接種した。初期ニワトリ胚繊維芽細胞（受精後10から11日経過した、ＳＰＦ起源（Spafas，In c．Storrs，CT）の卵から得た）についてもまた、すべてのウイルスが許容できる細胞基質の代表として実験を行った。培養を２つの基準に基づいて分析した。それは、自己増殖的なウイルス複製の有無および外来抗原の発現である。多くのヒト由来細胞中でのＮＹＶＡＣ複製能力を表16に示すた。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣの両方はＣＥＦ細胞中で自己増殖的に複製可能であったが、ＮＹＶＡＣはわずかに少ない収量であった。ＶＣ−２はまたＥＢＶが転質転換されたリンパ芽球細胞系統ＪＴ−１（エプスタイン−ハ゛ーウイルスによって形質転換したヒトリンパ芽細胞系統、Rickinson等，1984を見よ）を除いて６種類のヒトから派生した細胞中でＣＥＦと同等の収量で自己増殖的に複製可能であった。これと対照的にＮＹＶＡＣは、試験したヒトから派生したどの細胞手続中でも自己増殖的複製能力が非常に弱められていた。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171、ヒト胚肺由来）、デトロイト532細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54，ヒト包皮，ダウン症候群）、ＨＥＬ299（ＡＴＣＣ＃137、ヒト胚由来）、およびＨＮＫ細胞（ヒト新生児腎臓由来Whittiker Bioproducts，Inc．Walkersv ille，MD，Cat＃70-151）より、残存ウイルスレベル以上の感染可能なウイルスが少量増加した。ＮＹＶＡＣのこれらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣを感染させたＣＥＦ細胞でのウイルス収量あるいは親ＶＣ−２株のウイルス収量と比較して、著しく減少していた。ＮＹＶＡＣとＶＣ−２の両方のＣＥＦ細胞における24時間でのウイルスの収量が、72時間での収量に等しかったことは注目すべきことである。ゆえに、ヒト細胞系統培地を、さらに48時間（２回のウイルス増殖サイクル）保温しておけば、得られる相対ウイルス収量が増幅されているであろう。ヒト由来細胞系統であるＭＲＣ−５およびデトロイト532より得られたウイルス収量の低さと一致して、ＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積レベルは、検出可能ではあるが減少されていたことが示された。ＮＹＶＡＣに感染したＣＥＦ細胞中のＤＮＡ蓄積レベルに比例するＭＲＣ−５およびデトロイト532のＮＹＶＡＣに感染した細胞系統中のＤＮＡ蓄積レベルは、相対的なウイルスの収量に平行した。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積は、どのヒト由来細胞においても見られなかった。同様の実験をアビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣを用いて行った。ウイルス複製についての結果を表16に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主範囲制限と一致するどのヒト細胞系統にも後代ウイルスは検出されなかった。また、ＡＬＶＡＣのヒト由来細胞中での自己増殖的複製能力の欠如と、ＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡの蓄積がどのヒト由来細胞系統中においても検出されなかったという知見とは一致している。狂犬病抗タンパク質のＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ876）によるヒト細胞中での発現自己増殖的な高レベルのウイルスの複製のない状態で効率よい外来遺伝子の発現が行えるかどうかを決定するため、³⁵Ｓ−メチオニン存在下で狂犬病ウイルス糖タンパクを発現するＮＹＶＡＣ組み換え体（ｖＰ879、実施例７）を、前述したのと同様の細胞系統に接種した。狂犬病タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いて、放射性標識化された培地破砕液について、狂犬病糖タンパク質の免疫沈降を行った。完全なグリコシル化形態の狂犬病糖タンパク質と一致する67 ｋＤａのタンパク質が免疫沈降したのを検出した。感染していないか、または親ＮＹＶＡＣに感染した細胞破砕液からは血清学的交又反応物は検出されなかった。分析した他の全てのヒト由来細胞について同様の結果が得られた。ウサギ皮膚への接種皮内接種（ｉｄ）に続くウサギ皮膚病斑の誘導および性質は、ワクシニアウイルス株の病原性の尺度として用いられてきた（Buller等， 1988; Child等，1990; Fenner，1985，Flexner等，1987; Ghendon and Chernos 1964）。ゆえに、ワクシニア株ＷＲ（ＣＶ−１細胞でプラーク精製したＡＴＣＣ＃ＶＲ119.、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ70，Ｌ派生体と命名されたプラーク単離体、選択したＡＴＣＣ＃ＶＲ2035、Panicali等，1981に記述されている）、ＷＹＥＴＨ（ＤＲＹＶＡＣとしてWyeth Laboratories，Marietta，PAより販売されているＡＴＣＣ＃ＶＲ325）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡＣをｉＤ接種したことに関する病斑の性質を２匹のウサギ（Ａ069およびＡ128）Ｋ接種により、評価した。２匹のウサギはウイルスに対する全体として異なった感受性を示し、ウサギＡ128はＡ069より軽い反応を示した。ウサギＡ128においては、病斑は比較的小さく、接種後27日後迄に回復した。ウサギＡ069においては、病斑は強烈（とくにＷＲ接種場所で）で、49日後に回復した。病斑の強さは、リンパ排出経路に関連し接種地点の場所にも依存した。特に、後部セキツイ（back s pine）上に位置していた全ての接種地点が、より強い病斑を示し、側腹部に位置していた外傷は回復に、より長い時間を要した。全ての病斑を４日目から最後の病斑が消えるまで毎日測定し、最大の病斑の大きさの平均および回復までに要した日数を計算した（表17）。対照としてＰＢＳを注入した地点には局所反応はみられなかった。ＷＲ，ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨワクシニアウイルス株を注入した地点では潰瘍性病斑がみられた。注目すべきことに、ＮＹＶＡＣを接種した地点では硬化あるいは潰瘍性病斑は認められなかった。接種地点における感染可能なウイルスの存在の持続接種地点におけるこれらのウイルスの相対的持続性を検討するために、10⁶，10⁷または10⁸pfuいずれかの濃度のＶＣ−２，ＷＲ，ＷＹＥＴＨあるいはＮＹＶＡＣのいずれかを含む0.1ml のＰＢＳを一匹のウサギの複数の地点に接種した。おのおののウイルスについて、後部セキツイ（back spine）上に10⁷pfuを接種し、10⁷pfuの隣の位置に10⁶pfu および10⁸pfuをそれぞれ接触した。接種地点を11日間にわたって毎日観察した。ＷＲがもっとも強い反応を誘発し、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨがこれに続いた（表18）。潰瘍が、９日目にＷＲおよびＷＹＥＴＨで最初に見られ、10日目にＶＣ −２で見られた。ＮＹＶＡＣまたは対照のＰＢＳを接種された地点では潰瘍あるいは硬化は見られなかった。接種後11日目に、接種地点から皮膚サンプルを切り出し、機械的に崩壊し、そしてウイルスをＣＥＦ細胞上で滴定した。結果を表18 に示す。この時点では、投与時より多くのウイルスが回収された場合は皆無であった。ワクシニア株ＷＲの回収量はおのおのの地点で、ウイルスの投与量にかかわりなく約10⁶pfuであった。ワクシニア株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収量はおのおのの地点で、投与量に関りなく10³pfuから10⁴pfuであった。ＮＹＶＡＣを接種した地点からは感染可能なウイルスは回収されなかった。遺伝的または化学的免疫欠損ネズミへの投与多量のＮＹＶＡＣ（５×10⁸pfu ）またはＡＬＶＡＣ（10⁹pfu）のヌードネズミの心膜内（ｉｐ）への接種は、10 0日間の観察期間を通して、死も、病斑も、明白な病気も引き起こさなかった。これと対照的に、ＷＲ（10³pfuから10⁴pfu）、ＷＹＥＴＨ（5×10⁷pfuまたは5× 10⁸pfu）あるいはＶＣ−２（10⁴pfuから10⁹pfu）を接種したネズミには、ポックスウイルスの典型的な散在性の病斑が最初に爪先、続いて尾に現れ、数匹では続いて重い睾丸炎が見られた。ＷＲまたはＷＹＥＴＨに感染したネズミでは、散在性病斑の現れは概ね最終的には死につながっていたが一方で、ＶＣ−２に感染していたネズミの大部分は最終的には回復した。計算し半数致死量（ＬＤ₅₀）の価を表19に示すた。特に、ＶＣ−２を接種したネズミは爪先に病斑（赤色の丘疹）を現わし始め、１日か２日後に尾に現わし始めた。これらの病斑は、多量（10⁹pfu，10⁸pfu，10⁷ pfuおよび10⁶pfu）の投与を行ったネズミでは接種後（post-inoculation，pi） 11日目から13日目に認められ、10⁵pfuを投与したネズミでは接種後16日目に、10⁴ pfuを投与したネズミでは、接種後21日に認められた。10³pfuおよび10²pfuを接種しネズミでは、100日間の観測期間中には病斑が見られなかった。睾丸炎が、1 0⁹pfuおよび10⁸pfuの量を接種したネズミでは接種後23日目に、そしてそのさらに約７日後には10⁷pfuから10⁴pfuを投与した他のグループで見られた。睾丸炎は、10⁹pfuおよび10⁸pfuを投与したグループで特に強烈で、減退しながらではあったが、100日間の観察期間の最後まで認められた。いくつかのポックスに類似した病斑が２、３匹のネズミの皮膚上に接種後30日から35日頃に認められた。ほとんどの病斑が普通は接種後60日から90日後に治った。10⁹pfuを接種したグループのうちの一匹だけが、接種後34日目に、10⁸pfuを接種したグループのうちの一匹が接種後、94日目に死亡した。他にＶＣ−２を接種したネズミでの死亡例は見られなかった。 10⁴pfuのワクシニアＷＲ株を接種したネズミは接種後17日目にポックス病斑を現わし始めた。これらの病斑はＶＣ−２を接種したネズミに見られた病斑と同様のようであった（爪先、尾に拡がった）。10³pfuのＷＲ株を接種したネズミは接種後34日目まで病斑を示さなかった。睾丸炎は、10⁴pfuのＷＲを接種したネズミのグループにおいてのみ見られた。観察期間の後半には病斑が口のまわりにも現れ、ネズミは摂食を停止した。10⁴pfuのＷＲを接種したネズミは接種後21日目から31日目の間に、全て死亡したか、あるいは必要と判断された時は安楽死させた。10³pfuのＷＲを接種したネズミ５匹の内の４匹は、接種後35日目から57日目の間に死亡したか、あるいは必要と判断された時は安楽死させた。より少量（10⁰p fuから10²pfu）のＷＲを接種したネズミにおいては死亡例は見られなかった。多量の（５×10⁷pfuおよび５×10⁸pfu）のワクシニアウイルスＷＹＥＴＨ株を接種し、ネズミは、爪先と尾に病斑を示し、睾丸炎を起こし、死亡した。５×10⁶ pfuあるいはそれ以下の量のＷＹＥＴＨを接種したネズミは病斑も病気の兆候も示さなかった。表19に示したように、ＣＹ処理したネズミのポックスウイルス毒性アッセイのモデルは、ヌードネズミのモデルより高感度であった。このモデル系における、ワクシニアウイルスＷＲ株、ＷＹＥＴＨ株、およびＶＣ−２株についての半数致死量（ＬＤ₅₀）の値は、ヌードモデルのときの値と比較して著しく低かった。さらにワクシニアウイルスＷＲ株、ＷＹＥＴＨ株、およびＶＣ−２株を接種したネズミにおいて形成された病斑については、以下に示すように、おのおののウイルスの投与量が増加するについて、病斑の形成がより早くなることが判明した。ヌードネズミにおいて見られたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを接種したＣＹ処理ネズミは、病斑を示さなかった。しかしながら、ヌードネズミとは異なり、ＮＹＶＡＣあるいはＡＬＶＡＣを投与したＣＹ処理ネズミにおいては、投与量にかかわらず、数件の死亡例が見られた。これらの無作為の偶発的な事象が死の原因と考えられている。 9.5×10⁴pfuから9.5×10⁸pfuの量のＷＹＥＴＨを投与したネズミの全てが、ポックス病斑を、それらの爪先および／あるいは尾に、接種後７日目から15日目の間に示した。さらに、爪先と尾は腫れ上がった。尾の病斑の進行は丘疹、潰瘍、最後にはかさぶたが形成されるというポックス病斑に典型的なものであった。1. 65×10⁵pfuから1.65×10⁹pfuの投与量のＶＣ−２を投種したネズミの全てが、ＷＹＥＴＨを接種したネズミと類似のポックス病斑を尾および／または爪先に示した。これらの病斑は接種後７日目から12日目の間に観察された。より少ない投与量でＷＲ株を接種したネズミにおいては、病斑は見られなかったが、それらのグループ内で死亡例が生じた。ＮＹＶＡＣ−ＲＧの有効性の試験ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化が、弱毒化産物であるＮＹＶＡＣ株の、有用なベクターであるという能力を大きく変えることなく行われたこと検討するために、有効性の比較実験を行った。ウイルスの弱毒化のための一連の遺伝子工学的操作の間に免疫原生を監視するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質が外来抗原レポーターとして用いられた。狂犬病タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御的効果を、狂犬病に対する標準ＮＩＨネズミ有効性試験（standard NIH mouse potency test for rabies）により（Seligmann，1973）評価した。表20は、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣベクターより得られたＰＤ₅₀値が、ｔｋ座に狂犬病ウイルスを含んでいるコペンハーゲン株をベースとした組み換え体を用いて得られた値（Kieny等，1984）と同一であることおよび、鳥類種に複製が限定されているカナリアポックスウイルスをベースとしたベクターであるＡＬＶＡＣ−ＲＧから得られたＰＤ₅₀とも近いことを示している。観察既知の毒性遺伝子が欠失され、生体外での成長特性が制限されているＮＹＶＡＣを、動物モデル系において分析してその弱毒化された特徴を評価した。これらの研究は、神経毒性ワシニアウイルス実験株であるＷＲ，２つのワクシニアウイルスワクチン株であるＷＹＥＴＨ（ニューヨーク市保健局：New York Cit y Board of Health）およびコペンハーゲン株（ＶＣ−２）、並びにカナリアポックスウイルス株ＡＬＶＡＣ（実施例11を参照）との比較によって行った。同時にこれらのウイルスは、ネズミ投与モデルとウサギ皮膚モデルにおいて、相対病原可能性のスペクトル（Spectrum of relative pathogenic potentials）を提供した。ＷＲ株がもっとも有毒でありＷＹＥＴＨ株コペンハーゲンＶＣ−２株が、書類に示された特性を持つ以前に用いた弱毒化ワクチンを提供し、ＡＬＶＡＣ株が複製が鳥類種のみに制限されているポックスウイルスの例を提供した。これらのin vivoでの分析は明白に、ワクシニアウイルスＶＲ株、ＷＹＥＴＨ株およびコペンハーゲン（ＶＣ−２）株と比較したときＮＹＶＡＣは非常に弱毒化された性質を有することを示している。（表14-20）。重要なことに、ＮＹＶＡＣについて得られたＬＤ₅₀値は、鳥類に宿主が制限されているアビポックスウイルスであるＡＬＶＡＣについて得られた値とも匹敵した。ＡＬＶＡＣと同様に、ＮＹＶＡＣによる死亡例は極めて多量のウイルスが生体内へ大脳経路で投与されたときにのみ見られた（実施例11、表14，15，19）。これらの死が、多量のタンパク質（high protein mass）の投与による非特異的な（ＮＹＶＡＣにかぎらない）必然的な結果であるかどうかはまだ決定されていない。免疫不全ネズミモデル（ヌードおよびＣＹ処理）の分析の結果もまた、ＷＲ株、ＷＹＥＴＨ株およびコペンハーゲン株と比較して相対的に高く弱毒化されているＮＹＶＡＣの性質を示した（表17および表18）。重要なことに、観察期間中、ＮＹＶＡＣに感染した動物およびＡＬＶＡＣに感染した動物の間では、ワクシニア感染の拡散、あるいはワクシニアに起因する病気の証拠が見られなかった。ＮＹＶＡＣ内での多数の毒性関連遺伝子の欠損が、病原性の観点からは相乗効果を示した。ウサギ皮膚への皮内投与により、別のＮＹＶＡＣの接種法が得られた（表17および18）。鳥類以外の種では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣの結果を考えると、接種地点での複製能力は反応可能性とのみ相関しているのではない。なぜならＡＬＶＡＣの皮内接種は、投入量に依存して、硬化した範囲を生じさせるからである。それゆえ、ウイルスの複製能力以外の要素が病斑の形成に貢献していることが考えられる。ＮＹＶＡＣ中の遺伝子の欠損は病斑の発生を防ぐ。本実施例での結果と実施例11を含む以前の実施例との結果を合わせみると、ＷＲ株および以前用いたワクシニアウイルスワクチン株、ＷＹＥＴＨ株およびコペンハーゲン株と比較して非常に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質が示されている。事実、動物モデル系で試験したＮＹＶＡＣの毒性の特性は、鳥類種中でのみ自己増殖的に複製することが知られているポックスウイルスであるＡＬＶＡＣのものと類似していた。ヒト由来（表16）、およびネズミ、ブタ、犬および馬を含む他種の細胞内での、明らかに制限されたＮＹＶＡＣの自己増殖能力は、ワクチン接種された個体内での拡散の可能性が減少したベクターを提供することに加え、接触によるワクチン化されてない他の個体への、あるいは一般の環境への伝達の怖れを防ぐか、または制限するという重要な防護壁を提供する。重要なことに、ＮＹＶＡＣをベースとしたワクチンの候補株は有効であることが示されている。多数の病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組み換え体は霊長類を含む数種類の動物種において、外来遺伝子産物に対する免疫学的な反応を誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体は、致死的な狂犬病ウイルスの投与からネズミを防御する。ＮＹＶＡＣをベースにした狂犬病糖タンパク質を組み換え体の効力は、狂犬病糖タンパク質をｔｋ遺伝子にもつコペンハーゲン株をベースとした組み換え体によるＰＤ₅₀と匹敵する（表20）。ＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体はまた、麻疹ウイルス中和抗体をウサギ体内で誘導させ、偽狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルスのブタへの投与に対し防御することが示された。非常に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒトおよび獣医学上の応用へ安全性の利益をあたえる（Tartaglia 等，1990）。さらに、一般的な実験室用の発現ベクター系としてのＮＹＶＡＣを使用すると、ワクシニアウイルス使用に関する生物学的危険（biological hazar ob）が大幅に減少するであろう。以下の基準により、本実施例およびここでの、実施例11を含む実施例は、ＮＹＶＡＣは非常に弱毒化されていることを示している。；ａ）接種地点において、硬化あるいは潰瘍化が見られない（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種地点からの速やかなる消失（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎の不在（ヌードネズミ）；ｄ）大幅に減少された毒性（能内投与、新生および生後３ヶ月のネズミ）；ｅ）大幅に減少された病原性および免疫欠損体中での不拡散（ヌードおよびＣＹ処理ネズミ）；およびｆ）多様なヒト組織培養細胞中での劇的に減少された複製能力。しかし、このように非常に弱毒化されてはいるが、ＮＹＶＡＣはベクターとして強い外来抗原に対する強力な免疫反応を誘導する能力を保持しているのである。実施例13−鳥インフルエンザウイルスの血球凝集素糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ組み換え体の構築本実施例では、鳥インフルエンザウイルスの三つの抗原型の血球凝集遺伝子を発現する鶏痘ウイルス組み換え体（ＦＰＶ）の開発について説明する。細胞およびウイルスＨ４，Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンからなるプラスミドを、ロバート・ウェブスター博士（Dr.Robert Webster, St.Jude Children′s Research Hospital,Memphis Tennessee）から入手した。ＦＰ−１の名称のＦＰＶ株はすでに説明した通りである（Taylor等,1988a,b）。ワクチン株は生後２日目のニワトリのワクチン接種に有用である。フランスでは、親ウイルスのデュベッテ株を鶏痘かさぶたとしてニワトリから生成している。このウイルスはふ化鶏卵で約50回継代させ、その後ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞で25回継代させて弱毒化させている。1980年９月にはRhone Merieux,Lyon,F ranceがこのウイルスを入手して保存用ウイルスストックを作った。1989年９月にVirogeneticsにこのウイルスは預け、そこで連続して４回プラーク精製を行った。１個のプラーク単離体を初期ＣＥＦ細胞でさらに増幅させて、ＴＲＯＶＡＣという名のウイルスストックを生成した。生体外組み換え試験におけるＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ89）とＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ）の生成に用いた前記ウイルスストックを、初期ＣＥＦ細胞内で８回継代させてさらに増幅した。一方、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ100）の生成に使用したウイルスストックは初期ＣＥＦ細胞内で12回継代させてさらに増幅させた。鶏痘ウイルスのＦ８座の挿入用プラスミドの構築プラスミドｐＷ731.51は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローン化された10ｋｂｐのＰｖｕII−ＰｖｕII 断片からなる。3659ｂｐのＰｖｕII−ＥｃｏＲＶ断片の両方のストランドについて塩基配列を決定した。この配列を表IIに示す（配列番号77）。当該実験室でＦ８と名付けたＯＲＦの制限範囲をこの配列内で決定した。前記ＯＲＦ位置は495 より始まって位置1887で終結する。後から説明するように位置779から位置1926 までを欠先させた。プラスミドｐＲＷ761は、2430ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片からなるｐＲＷ731.15のサブクローンである。前記プラスミドｐＲＷ761をＸｂａＩでは完全に消化させ、次にＳｓｐＩで部分的に消化させた。3700ｂＰのＸｂａＩ−ＳｓｐＩハンドを単離させ、その後アニーリング処理した二本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ 017（配列番号37）とＪＣＡ 018（配列番号38）に連結させた。この結果生じたプラスミドをｐＪＣＡ002と命名した。プラスミドｐＪＣＡ004 は、プラスミドｐＪＣＡ002中のワクシニアウイルスＨ６プロモーターに結合した非関連（non-pertinent）遺伝子を含んでいる。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列はすでに説明した通りである。（Taylor等,1988a,b;Gvo等,1989; Perkus et al.,1989）。プラスミドｐＪＣＡ004をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化させると前記非関連遺伝子と、Ｈ６プロモーターの３′末端の一部が取り除かれる。アニール処理したオリゴヌクレオチドＲＷ178（配列番号48）とＲＷ179（配列番号49）を、ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断し、その後、ＪＣＡ004のＥｃｏＲＶサイトとＢａｍＨＩサイトとの間に挿入させてＰＲＷ846を生成させた。従って、プラスミドＰＲＷ846には、ＯＲＦを取り除いたＦ８座にＥｃｏＲＶサイトのＨ６プロモーター５′側配列が含まれる。ｐＲＷ846のＨ６プロモーターの３′側ＨｉｎｃIIサイトの後には、翻訳終了コドンや、ワクシニアウイルス早期プロモーター（early promter）が認識する転写停止配列（Yuen等,1987）、それにＳｍａＩサイトが続いている。鶏痘ウイルスのＦ７座への挿入用プラスミドの構築本来のＯＲＦを取り除いていないＦ７座挿入用プラスミドｐＲＷ731.13にはｐＶＣ９のＰｖｕIIサイトにある5.5ｋｂＦＰゲノムＰｖｕII断片が含まれている。前記挿入サイトは、これらの配列に固有なＨｉｎｃIIサイトである。第12図の塩基配列（配列番号78）を決定してＨｉｎｃIIサイトを取り囲んでいる2356ｂｐ領域を求める。この配列の解析の結果、固有ＨｉｎｃIIサイト（第12図、下線部分）は、90アミノ酸基より成るポリペプチドをコード化するＯＲＦ中に存在していることが判明した。このＯＲＦは、位置1531のＡＴＧより始まって位置898で終結する（第12図中で矢印を付した地点）。ｐＲＷ731.13をテンプレートとして用いながら、ＯＲＦを取り除いた挿入用プラスミドのアーム（arm）をＰＣＲで生成した。ＯＲＦの上流に相当する596ｂｐアーム（ＨＢと称す）を、オリゴヌクレオチドＦ73ＰＨ２（配列番号50）とＦ73ＰＢ（配列番号51）で増幅した。一方、ＯＲＦの下流に相当する270ｂｐアーム（ＥＨと称す）は、オリゴヌクレオチドＦ75ＰＥ（配列番号52）とＦ73ＰＨ１（配列番号53）で増幅させた。断片ＥＨをＥｃｏＲＶで消化させると126ｂｐの断片が生成された。ＥｃｏＲＶサイトは３′末端にあり、ＰＣＲで５′末端を形成するとＨｉｎｃIIサイトの３′末端が含まれる。ＨｉｎｃIIで消化させたｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene,La Jo lla,ＣＡ）にこの断片を挿入すると、プラスミドｐＦ７Ｄ１が形成される。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析法で確認する。プラスミドｐＦ７Ｄ１をＡｐａＩで線状化し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化処理し、さらに596ｂｐのＨＢ断片に結合させる。こうして得られたプラスミドをｐＦ７Ｄ２と称す。配列および配位（orientation）の全体は塩基配列解析法で確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶとＢｇｌIIで消化させると600ｂｐの断片が生成される。この断片をＡｐａＩで消化させたｐＢＳ−ＳＫに挿入させ、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行い、さらにＢａｍＨＩで消化させた。こうして生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と称す。このプラスミドには 404ｂｐのＨＢアームと126ｂｐのＥＨアームが含まれている。プラスミドｐＦ７Ｄ３をＸｈｏＩで線状化し、２ｍＭｄＮＴＰｓが存在する中でＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて平滑末端化処理した。こうして線状化されたプラスミドを、アニール処理されたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列番号54）およびＦ７ＭＣＳＡ（配列番号55）に結合させた。これは、ＨｉｎｄIII，ＰｓｔＩ，ＳｍａＩの制限酵素サイトから成るマルチクローニング領域をＥＨアームとＨＢアームの間に挿入するためのものである。こうして得られたプラスミドをｐＦ７ＤＯと称す。Ｈ４血球凝集素のＦ８座の挿入用プラスミドの構築ウェブスター博士（Dr.R .Webster）からは、Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／833／80から生成した鳥インフルエンザＨ４をコード化するｃＤＮＡコピーをプラスミドｐＴＭ４Ｈ833の状態で入手した。このプラスミドをＨｉｎｄIIIとＮｒｕＩで消化させ、次にＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いてｄＮＴＰｓが存在する中で平滑末端化処理した。平滑末端化処理された2.5ｋｂｐのＨｉｎIII−ＮｒｕＩ断片にはＨ４コード化領域が含まれており、この断片をｐＩＢＩ25（Internationae Biotechnologies,Inc. ,New Haven,ＣＴ）のＨｉｎｃIIサイトに挿入する。こうして得られたプラスミドｐＲＷ828をＢａｎIIで部分的に切断し、線状化させた産生物をＨｉｎIIIで単離させて再切断した。ここで100ｂｐＨｉｎｄIII−ＢａｎII欠失を有しているプラスミドｐＲＷ828を、合成オリゴヌクレオチドＲＷ152（配列番号56）とＲＷ15 3（配列番号57）のベクターとして用いる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶサイトからＨ６プロモーターの３′までを表わしており、またプロモーター配列のＡＴＧとＨ４ｃＤＮＡのＡＴＧを揃える働きをしている。これらのオリゴヌクレオチドをアニール処理し、次に、ＢａｎIIおよびＨｉｎｄIIIで切断し、その後前述のＨｉｎｄIII−ＢａｎIIで切除したｐＲＷ828ベクターの中に挿入する。こうして得られたプラスミドｐＲＷ844をＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断し、３′Ｈ６プロモーター支配のＨ４コード化配列からなる1.7ｋｂｐの断片を（前述の）ｐＲＷ846のＥｃｏＲＶサイトとＨｉｎｃIIサイトの間に挿入すると、ｐＲＷ848が生成された。このため、鶏痘ウイルス中のＯＲＦが取り除かれたＦ８座にあるワクシニアウイルスＨ６プロモーターと結合したＨ４コード化配列が前記プラスミドｐＲＷ848には含まれている。Ｈ５血球凝集素のＦ８座への挿入プラスミドの構築鳥インフルエンザＨ５のＡ／Tuker／Ireland／1378／83から生成されたｃＤＮＡクローンをプラスミドｐＴＨ29の状態でウェブスター博士（Dr.R.Webster）から入手した。合成オリゴヌクレオチドＲＷ10（配列番号58）からＲＷ13（配列番号61）の全体にわたる部分は、前述のワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンとＨ５遺伝子のＡＴＧを重ね合わせるようになっている。この配列はＨ５遺伝子の５′ＳａｌＩサイトの全体にわたって続いており、Ｈ５停止コドンを含む３′Ｈ５ＤｒａＩサイトから再び始まる。オリゴヌクレオチドを95℃の温度で３分間アニール処理し、その後室温で徐々に冷却した。この結果、以下のような末端を有した二本鎖構造が得られた。ｐＲＷ742ＢのＥｃｏＲＶサイトとＰｓｔＩサイトの間のオリゴヌクレオチドをクローニング処理するとによりｐＲＷ744が得られた。プラスミドｐＲＷ742Ｂには、前述のｐＲＷ731.15のＨｉｎｃIIサイトに挿入された非関連（non-peritn ent）遺伝子に結合したワクシニアウイルスＨ６プロモーターが含まれている。ＰｓｔＩとＥｃｏＲＶで消化を行うと非関連遺伝子とＨ６プロモーター配列の３ ′末端が取り除かれた。ここで、プラスミドｐＲＷ744には、鳥インフルエンザＨ５のＡＴＧと重なり合ったＨ６プロモーターの３′部分が含まれている。また、このプラスミドには５′ＳａｌＩサイト全体にわたるＨ５配列やＤｒａＩサイトを含むＨ５停止コドンから始まる配列も含まている。ＤｒａＩサイトを用いるとＨ５３′非コード（non-coding）末端が除去される。オリゴヌクレオチドは、早期（eatly）ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Yuen等,1987）が認識する転写終結シグナルを付加する。Ｈ６プロモーター支配のＨ５遺伝子を完成させるため、Ｈ５をコード化領域をｐＴＨ29から1.6ｋｐｂＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片として単離する。プラスミドｐＲＷ744をＤｒａＩで部分的に消化させて、その後、直線状断片を単離させてからＳａｌＩで再び切断する。ＳａｌＩとＤｒａＩとの間にあって塩基が８個欠如しているプラスミドを1.6ｋｂｐのｐＴＨ29ＳａｌＩとＤｒａＩの断片用ベクターとして用いた。こうして得られたプラスミドｐＲＷ759をＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断した。３′Ｈ６プロモーターとＨ５遺伝子からなる1.7ｋｂｐのＰＲＷ759 ＥｃｏＲＶとＤｒａＩ断片を（前述の）ｐＲＷ846のＥｃｏＲＶサイトとＨｉｎｃIIサイトの間に挿入させた。この結果得られたプララスミドｐＲＷ849のＯＲＦが除かれたＦ８座内にはＨ６プロモーター支配の鳥インフルエンザウイルスＨ５遺伝子が含まれている。Ｈ７血球凝集素のＦ７座への挿入ベクターの構築Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／85 から生成したＨ７血球凝集素を含むプラスミドｐＣＶＨ71をウェブスター博士（ Dr.R.Webster）から入手した。Ｈ７遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化処理し、ｐＩＢＩ25のＨｉｎｃ IIサイトとＰＲＷ827として挿入した。合成オリゴヌクレオチドＲＷ165（配列番号62）とＲＷ166（配列番号63）をアニール処理し、次にＨｉｎｃIIとＳｔｙＩで切断し、その後ｐＲＷ827のＥｃｏＲＶサイトとＳｔｙＩサイトの間に挿入させて、ｐＲＷ845を生成させた。オリコヌクレオチドＲＷ165（配列番号62）とＲＷ166（配列番号63）は、Ｈ６プロモーターの３′部分をＨ７遺伝子に結合させる働きをする。ｐＲＷ845のＡｐａＬＩ消化作用で生成された線状生成物を単離し、ＥｃｏＲＩで再切断し、その後最大の断片を単離し、さらに合成オリゴヌクレオチドＲＷ227（配列番号64 ）とＲＷ228（配列番号65）とアニールさせてＨ７遺伝子の３′非コード化末端を除去した。こうして得られたプラスミドがｐＲＷ854である。ＰＲＷ854内のＨ７遺伝子の停止コドンの後にはＨｐａＩサイトが続いている。ＯＲＦが欠如されたＦ７座（後で説明する）にあり中間Ｈ６プロモーターに支配されたＨ７遺伝子は、ＥｉｏＲＶで切断してそのＰｓｔＩサイトを平滑末端化処理したｐＲＷ858の中へｐＲＷ854ＥｃｏＲＶ−ＨｐａＩ断片を移動させて生成した。プラスミドｐＲＷ858（以下に詳述）には、ＯＲＦが欠除したＦ７挿入プラスミドの中のＨ６プロモーターが含まれている。非関連（nen-pertinent）遺伝子に結合したＨ６プロモーターを含む850ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、前述のｐＦ７ＤＯのＳｍａＩサイトへ挿入するとプラスミドｐＲＷ858が生成された。これらの非関連配列を、ＥｃｃＲＶ（Ｈ６プロモーターの３′末端上流側の24ｂｐサイト）とＰｓｔＩでｐＲＷ858を消化させることによって取り除いた。その結果生じた3.5ｋｂの断片を単離し２ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて平滑末端化処理した。こうして平滑末端化処理された断片を、ｐＲＷ854（前出）から生成した1700ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に結合させた。このＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片には鳥インフルエンザウイルスＨＡ（Ｈ７）の全体が含まれており、当該鳥インフルエンザウイルスの３′はワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′末端24ｂｐに並列である。こうして得られたプラスミドをｐＲＷ 861と称す。 126ｂｐのＥＨアーム（すでに定義済み）をｐＲＷ861の中で延長させてＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡとの組み換え頻度を高めた。このｐＲＷ731.13（すでに定義済み）から、575ｂｐのＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片を生成した。この断片を単離させて、ｐＲＷ861のＡｃｃＩサイトとＮａｅＩサイトとの間に挿入させた。こうして生成されたプラスミドには鳥インフルエンザＨ７遺伝子が含まれており、その一端には725ｂｐのＥＨアームが、また、もう一端には404ｂｐのＨＢアームが隣り合っている。このプラスミドをｐＲＷ869と称す。従って、プラスミドｐＲＷ869はＨ７コード化配列を有し、その配列の５′末端はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに結合している。ＯＲＦを欠いたＦ７座への挿入を行わせる、左側に位置するアームはＴＲＯＶＡＣ配列の404ｂｐからなり、また右側に位置するアームはＴＲＯＶＡＣ配列の725ｂｐからなる。ＴＲＯＶＡＣ−鳥インフルエンザウイルス組み換え体の開発鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）のＨＡコード化配列からなる挿入プラスミドを、上述のリン酸カルシウム沈殿法（Panicali等,1982;Piccini等,1987）を用いて、ＴＲＯＶＡＣに感染した初期ＣＥＦ細胞の中に別々に導入させた。特異的に放射性標識化されたＨＡプローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が得られるまでプラーク精製を継続的に行った。その後代表的なプラークを増幅させてウイルスストックを生成した。次に、プラスミドｐＲＷ84 9を生体外での組み換え試験に用いてＨ５血球凝集素を発現する組み換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ89）を生成した。次に、プラスミドｐＲＷ848を用いてＨ４血球凝集素を発現するＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ92）を生成した。さらに、プラスミドｐＲＷ869を用いてＨ７血球凝集素を発現するＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ100）を生成した。免疫蛍光法インフルエンザウイルスに感染された細胞内でＨＡ分子を合成し、その後粗面小肪体においてプレカーサー分子としてグコシル化する。原形質膜を通過する間に、このプレカーサー分子は翻訳後に大幅に修飾され、プロテアーゼ分解によりジスルフィド結合したＨＡ、サブユニットとＨＡ₂サブユニットとなり、次に宿主細胞膜の中に挿入されそこで成熟したウイルス外膜にとり込まれる。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＶ組み換え体ウイルスに感染した細胞で生成されるＨＡ分子が細胞表面に発現するかどうかを調べるため、免疫蛍光試験を行った。間接免疫蛍光法はすでに行った説明の（Taylor等,1990）とおりに行った。ＴＲＯＶＡＣ −ＡＩＨ５のＨ５血球凝集素（Ｈ５ＨＡ）、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４のＨ４血球凝集素（Ｈ４ＨＡ）およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７のＨ７血球凝集素（Ｈ７ＨＡ）の表面での発現を間接免疫蛍光法で確認した。Ｈ５血球凝集素の発現は、Ｈ５ＨＡに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて検出した。Ｈ４ＨＡの発現は、抗−Ｈ４ヤギ血清を用いて分析した。Ｈ７ＨＡの発現はＨ７特異モノクローナル抗体を用いて分析した。免疫沈降反応ウイルス粒子が感染するには血球凝集素ポリペプチドの分解が必要であるため、血球凝集素分子の分解サイトの周辺にある配列がウイルスの毒性の決定に重要な役割を果していることが判明した。Ｈ５またはＨ７毒性ウイルスの血球凝集素タンパク質は、ＨＡ１のカルボキシル末端に１個以上の塩基性アミノ酸を有している。このため一連の塩基性アミノ酸配列を認識する細胞のプロテアーゼは血球凝集素を分解でき、また感染性ウイルスが生体外および生体内に拡散できるものと考えられる。Ｈ４株の血球凝集素分子は、異種のトリプシンが添加されない限り組識内では分解されない。ＴＲＯＶＡＣ組み換え体によって発現した血球凝集素分子が、間違いなく処理されていることを調べるため、上記の特異的な試薬を用いて前述のように（Tayl or等,1990）免疫沈降反応を行った。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ（ｖＦＰ89）によって発現したＨ５−血球凝集素の免疫沈降反応分析の結果、明らかに糖タンパク質は２つの分解生成物ＨＡ₁とＨＡ₂でありその分子量はそれぞれ約44ｋＤａと約23ｋＤａであることが分った。感染されていない細胞や親ＴＲＯＶＡＣに感染された細胞からはこのようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ100）によって発現した血球凝集素の免疫沈降反応分析では分解生成物ＨＡ₂の特異的沈殿がみられたが、分解生成物ＨＡ₁は検出されなかった。無感染ＣＥＦ細胞やＴＲＯＶＡＣに感染したＣＥＦ細胞からはタンパク質の沈殿としたものは特に何もみられなかった。これとは対照的に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ92）によって発現した生成物を免疫沈殿反応分析した結果、プレカーサータンパク質ＨＡ_oの発現のみが観察された。これは組識培養における無毒な亜型の血球凝集素には開裂がないという事実に一致している。無感染ＣＥＦ細胞やＴＲＯＶＡＣに感染した細胞からはＨ４に特異的なタンパク質は検出されなかった。組み換え技術による組み換えウイルスの生成、その位置でのニトロセルロースフィルターのハイブリダイゼーション、β−ガラクトシダーゼ活性のためのスクリーニングはすべてに述べた通りである（Panicali等,1982;Perkas等,1989）。実施例14 −ヒト腫瘍懐死因子のα（ＴＮＦ−α）のコード化遺伝子からなるＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣをベースとする組み換え体の生成ＴＮＦ−αはＣＴＬで生成したサイトカインである。これは、免疫応答の時に腫瘍細胞を殺すことができる細胞生成物の一つである。組み換えＴＮＦを注入すると様々な既定のネズミのガンの懐死や後退作用が媒介されることはすでに分っている。（Asher等,1987）。この抗腫瘍活性の正確なメカニズムは今だ不明であるが、ＴＮＦが腫瘍の血管の供給に影響を与えているのは明らかである（Asher 等,1987）。ＴＮＦ−αの分泌形態や膜結合形態はどちらもその抗腫瘍活性の点で重要となることがある（Kriegler等,1987）。ヒト腫瘍懐死因子α遺伝子を含むプラスミドｐＥ４を、該プラスミドｐＥ４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉから抽出した。ｐＥ４で形質転換したＥ．ｃｏｌｉはＡＴＣＣから得た（ATCC # CLN−39894）。ＰＣＲ断片ＰＣＲ−ＴＮＦ４（755bp ）の生成には、テンプレートとしてのｐＥ４と、ワクシニアＨ６プロモーターの最も３′側の領域（ＮｒｕＩサイトから末端まで；Perkus等,1989）とＴＮＦ− αコード化配列の最初の21個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドＴＮＦ３（配列番号66）と、ＴＮＦ−αコード化配列の最後の15個の塩基対とワクシニア早期(early)転写終結シグナル（T₅NT;Yuen and Moss,1986）とＸｂａＩ制限酵素サイトを含むオリゴヌクレオチドＴＮＦ２（配列番号67）とが用いられた。ＮｒａＩ／ＸｂａＩで完全に消化し、その結果得られた735ｂｐの断片を単離し、属に固有な挿入プラスミドｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを消化させて得られた4.8ｋｂのＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片に挿入した。こうして得られたプラスミドをｐＭＡＷＯ48と称す。Ｈ６−ＴＮＦ−αの発現カセット全体の塩基配列を、Goebel等，（1990）が説明している方法で確認した。プラスミドｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを以下のように生成した。Ｃ５の上流1535ｂｐと、ＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＸｂａＩ，ＮｏｔＩの各サイトを有するポリリンカーと、カナリアポックスＤＮＡの404ｂｐ（Ｃ５コード化配列の31ｂｐと下流側配列の373ｂｐ）とからなるＣ５挿入ベクターを以下のように生成した。コスミドベクターｐＶＫ102（Knauf等,1982）の中にカナリアポックスゲノムＤＮＡのライブラリーを生成しｐＲＷ764.5で検索され、29kbのインサートからなるクローンを同定した（ｐＨＣＯＳ１）。そしてＣ５領域を含むｐＨＣＯＳ１由来の3.3ｋｂＣｌａＩ断片を同定した。ＣｌａＩ片の配列解析を利用して第８図中の配列（配列番号68）すなわちヌクレオチド１から1372までを拡張させた。Ｃ５挿入ベクターは次のような構造をしている。ＰＣＲ増幅で1535ｂｐ上流側配列を生成するが、この時オリゴヌクレオチドＣ５Ａ（配列番号69）とＣ５Ｂ（配列番号75）と、テンプレートとして精製したカナリアポックスゲノムＤＮＡを使用した。この断片をＥｃｏＲＩで（オリゴヌクレオチドＣ５Ａ内で）消化させ、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消化されているｐＵＣ８でクローン化させるとｐＣ５ＬＡＢが生成された。オリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（配列番号71）とＣ５ＤＡ（配列番号72）を用いながらＰＣＲ増幅を行って404ｂｐアームを生成した。この断片をＰｓｔＩ（オリゴヌクレオチドＣ５ＤＡ内部で）消化させ、次にＳｍａＩ／ＰｓｔＩで消化されたｐＣ５ＬＡＢ中でクローン化させると、ｐＣ５Ｌが構築された。ｐＣ５ＬをＡｓｐ718とＮｏｔＩを用いてポリリンカーの内部で消化させ、アルカリホスファターゼで処理し、リン酸化処理とアニーリングを施したオリゴヌクレオチドＣＰ26（配列番号73）とＣＰ27（配列番号74）（不活性Ａｓｐ718サイト；６つの読み取り枠中に納められた翻訳終結コドン；ワクシニア早期転写終結シグナル（Yuen and Moss,1987）；ＢａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＸｈｏＩ，ＸｂａＩ，ＣｌａＩ，ＳｍａＩの各制限酵素サイト；ワクシニア早期転写終結シグナル、６つの読み取り枠に納められた翻訳終結コドン、不活性ＮｏｔＩサイトを含む）に結合させるとプラスミドｐＣ５ＬＳＰが構築された。オリゴヌクレオチドＣＰ30（配列番号75）とＣＰ31（配列番号76）を用いて、プロモーターを含むプラスミドからＰＣＲで早期(early)／終期（lat e）Ｈ６ワクシニアウイルスプロモーター（Perkus等,1989）を生成した。このＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ（ＰＣＲによって５′および３′末端に生成されたサイト）で消化させ、同様に消化させたｐＣ５ＬＳＰに結合させると、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰが構築された。ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）をレスキューウイルスとする生体外組み換え実験にｐＭＡＷ048を用いて、組み換えウイルスｖＣＰ245を生成させた。このプラスミドの挿入によってＣ５のＯＲＦの２つのコピーはヒトＴＮＥ−α発現カセットに置き換えられた。第15図はｖＣＰ245（配列番号79）の内部にあるＨ６／ＴＮＦ− α配列とそれに隣接する領域を示している。Ｈ６プロモーターは位置74から始まる。ＴＮＦ−α開始コドンは位置201にあり、ＴＮＦ−α終始コドンは位置902である。位置１から73までと位置903から965まではＨ６／ＴＮＦ−α発現カセットに隣接している。ＰＣＲ断片ＰＣＲ−ＴＮＦＨ６（156ｂｐ）をプラスミドＰＢＳＨ６で増幅する時、Ｈ６プロモーター領域の最初から21番目までの塩基対にＨｉｎｄIIIサイトが含まれたＨ65ＰＨ（配列番号80）と、Ｈ６プロモーターの最も３′側の19個のヌクレオチドとＴＮＦコード化配列の最も５′側の18個のヌクレオチドからなるＴＮＦＨ６（配列番号81）を用いた。プラスミドｐＢＳＨ６は、次のように構築した。ＰＣＲと、プライマーＨ６ＰＣＲ２（配列番号82）と、Ｈ６ＰＣＲ１（配列番号83）とを用いて、ＥｃｏＲＶサイトまで全体に及ぶワクシニアＨ６プロモーターを、合成Ｈ６プロモーター（Perkus等，1989）を含むプラスミドから生成させると５′ＨｉｎｄIIIサイトが構築された。この122ｂｐのＰＣＲ生成断片をＨｉｎｄ IIIとＥｃｏＲＶで消化させ、その後、同様に消化させたｐＢＳ−ＳＫ⁺（Strata gene，La Jolla,CA）に連結させると、ｐＢＳＨ６が構築された。このインサートを塩基配列解析法で確認した。ＴＮＦ−αコード化配列の最初の18個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドＴＮＦ１（配列番号84）とＴＮＦ２（配列番号67）を用いて、プラスミドｐＥ４でＰＣＲ断片ＰＣＲ−ＴＮＥ（721ｂｐ）を増幅させた。ＰＣＲ断片、すなわちＰＣＲ−ＴＮＦ融合物（8 59ｂｐ）を生成する際にＰＣＲ−ＴＮＦＨ６とＰＣＲ−ＴＮＦをテンプレートとして、また、オリゴヌクレオチドＨ65ＰＨ（配列番号80）とＴＮＦ２（配列番号 67）をプライマーとして使用した。ＰＣＲ−ＴＮＦ融合物をＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで消化させ、その結果生じた841ｂｐの断片を、ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで消化させたｐＢＳ−ＳＫ⁺(Stratagene，La Jolla，CA)に挿入した。こうして得られたプラスミドをｐＭＡＷＯ47と命名し、Ｈ６−ＴＮＦカセットを前述のように (Goebel等，1990)塩基配列解析法で確認した。Ｈ６−ＴＮＦ−αの発現カセットを含む841ｂｐのＨｉｎｄIII／ＸｂａＩ断片を、ｐＭＡＷＯ47から単離し、次に２ｍＭのｄＮＴＰが存在する中でＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて平滑末端化処理し、ワクシニア挿入プラスミドｐＳＤ541に挿入した。こうして生成されたプラスミドをｐＭＡＷＯ49と命名した。プラスミドｐＳＤ541は次のように生成した。ＡＴＩ領域に隣接するアームをＰＣＲで生成させる時にコペンハーゲンＨｉｎｄIIIＡ領域のサブクローンをテンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ267（配列番号85）とＭＰＳＹＮ268（配列番号86）を用いてＡＴＩ欠損部の右側に420ｂｐのワクシニアアームを産生させた。また、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ269（配列番号87）とＭＰＳＹＮ270（配列番号88）を用いて欠損部の左側に420ｂｐのワクシニアアームを産生させた。左と右のアームはＰＣＲで融着させるが、この左右のアームはＢｇｌII，ＳｍａＩ，ＸｈｏＩのそれぞれの制限酵素サイトを特定するポリリンカー領域を挟んで隔てられている。ＰＣＲで生成した断片をＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで消化させて、粘着末端を生成させ、その後ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで消化させたｐＵＣ８に連結させて、ｐＳＤ541を生成させた。プラスミドｐＭＡＷＯ47を生体外での組み換えアッセイ(Piccini等,1987)に用いる際にＮＹＶＡＣ（ｖＰ866；Tartaglia等，1992）をレスキューウイルスとして利用した。このプラスミドとの組み換えによって、ＡＴＩのＯＲＦはＨ６−ＴＮＦ-α発現カセットに置き換えられた。Ｈ６−ＴＮＦ-α発現カセットを含むＮＹＶＡＣ組み換えウイルスをｖＰ1200と命名した。第16図は、ＮＹＶＡＣ組み換え体、すなわちｖＰ1200に組み込まれたＨ６−ＴＮＦ−α発現カセットとその隣接ＮＹＶＡＣ配列（配列番号89）を示している。Ｈ６プロモーターは位置59から始まる。ＴＮＦ−α開始コドンは位置185にあり、ＴＮＦ−αの終始コドンは位置884にある。位置１から58までの部分と位置885から947までの部分はＨ６−ＴＮＦ−α発現カセットに隣接している。ｖＰ1200（ＮＹＶＡＣ−ＴＮＦ−α）とｖＣＰ245（ＡＬＶＡＣ−ＴＮＦ−α ）による発現を市販のキット（Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA，cat，#19 15-01）を用いてＥＬＩＳＡアッセイで測定した。ＮＹＶＡＣ組み換え体を感染させたＶｅｒｏ細胞と、親ウイルスＮＹＶＡＣを感染させたＶｅｒｏ細胞と、組み換え体を感染させた初期ＣＥＦ細胞と、親ウイルスＡＬＶＡＣを感染させた初期ＣＥＦ細胞とを用意してサンプルを作成した。ＣＰＥがみられた時点でこれらのセルを回収し、その後、超音波破砕を行い、また、500ｘｇで10分間遠心分離を行って清澄化処理してから細胞溶解液をＥＬＩＳＡアッセイに用いた。２個のサイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）タンパク質すなわち、ｇＢとｐｐ65 を発現するｖＰ1196を一対照としてＴＮＦ−α組み換え体と同じ方法で生成した。もう一つの対照であるＡＬＶＡＣ親株は部分精製されたストックウイルスであった。どのサンプルにも約10⁷ＰＦＵ／ｍｌのウイルスが含まれていた。表21の結果から分かるようにｖＰ1200とｖＣＰ245はどちらもヒトＴＮＦ−αを発現している。生体内でのこのようなレベルの発現は治療に利用できる。実施例15 −ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとしたｐ53組み換えウイルス核リンタンパク質であるｐ53は、通常の細胞で、非常に低い安定状態で見られる。ｐ53の発現は細胞周期を通して厳しく規制されており、発現は細胞の増殖の制御に関与されていると思われている。ｐ53は２つの形態で存在していると見られているがｐ53が自身の有する腫瘍抑制効果を有する分子機構は未だ明らかではない。一つの型は、野生型ｐ53で、細胞周期の進行の抑制能力に関連しているが、もう一つの型は細胞増殖を促進する能力に関連があり、野生型にも変異型にも見られる(Ulrichら、1992)ｐ53は各種のヒトの腫瘍において変位が見られることが最も多い遺伝子である。（Hollsteinら、1991）。ｐ53の変異に関連したガンで最も研究が進んでいるのはおそらく胸部ガンであろう。ｐ53の変異は初期胸部ガン患者におけるｐ53遺伝子細胞の過剰発現という結果になることが知られている（Davidoffら，1991）。ｐ53の発現の度合が高い腫瘍中においても低い腫瘍中においてもｐ53特有なｍＲＮＡの量は殆ど同じであることから、ｐ53過剰発現の基本は、転写後の機構によるものであることが明らかになっている。さらに、高発現している腫瘍由来のｐ53ｍＲＮＡは、高度に保存された遺伝子領域中でのミスセンス変異を有していることが明らかになっている。この変異は、熱ショックタンパク質70（ＨＳＰ-70）と複合体を形成するより安定なｐ53タンパク質の型を増加させることが引き続いて発見された。ＨＳＰ −70タンパク質は抗原のプロセシングに関連しているので、胸部ガン患者の一部で観察されたｐ53に対する体液の反応が、複合体に固有のプロセシングあるいは複合体の存在様式によって起こされたであるということだけでなく、そのような関連はまた細胞の抗ｐ53タンパク質反応をも誘導する（Davidoffら，1992）であろうということが考えられる。このような抗ｐ53細胞性免疫反応は、そのようなガンの最終的な免疫治療により適していると考えられる。野生株および変異型のヒトｐ53遺伝子産物を発現する、ポックスウイルスをベースとした組み換えウイルスの開発野生型のヒトｐ53遺伝子配列を含むｐ53ｗｔＸｂａＩＳＰ６／Ｔ３および２つの変異型を含むｐ53−217ＸｂａＩ、ｐ53−238ＸｂａＩの３つのプラスミドはデューク大学のマークス博士（Dr．Jeffrey Marks）により得られた。ｐ53−217ＸｂａＩは、217番号のコドンを欠失しているｐ53生産物をコードしているｐ53遺伝子を含んでおり、ｐ53−238ＸｂａＩは、238番目のアミノ酸がシステインからアルギニンへ置き換えられているｐ53遺伝子産物をコードしている。野生型ｐ53 ｃＤＮＡ配列およびそれより推定されるアミノ酸配列は前に記述されている（La mb and crawford，1986; 図３）。３つのｐ53遺伝子のすべてはPerkusら，1989に記述された改変ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′側に個別に並べて置かれた。これらの操作は以下の方法により行った。オリゴヌクレオチドＭＭ002（配列番号90）およびＲＷ425（配列番号91）を用い、プラスミドｐＲＷ825をテンプレートとしたＰＣＲにより227ｂｐの断片が産生された。これらのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲは、ｐＲＷ825より、プロモーターの３′末端が正確にｐ53をコードしている配列の最も５′側の部分に連結されているワクシニアＨ６プロモーター配列を増幅する。プラスミドｐＲＷ825 は、非関連遺伝子に連結されたワクシニアウイルスＨ６プロモーター(Percusら，1989)を含んでいる。ＰＣＲは、ｐ53ｗｔＸｂａＩＳＰ６／Ｔ３より480ｂｐおよび250ｂｐの断片を産生するためにも用いられた。480ｂｐの断片はオリゴヌクレオチドＭＭ003(配列番号92) およびＭＭ008（配列番号93）を用いて産生された。この断片はワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′部分およびｐ53をコードしている遺伝子のＳｇｒＡＩサイトまでの部分を含んでいる。250ｂｐの断片はオリゴヌクレオチドＭＭ005（配列番号94）およびＭＭ007（配列番号95）を用いて増幅された。このＰＣＲ断片はｐ53をコードしている配列の３’末端の、ＳｔｕＩ制限酵素サイトから始まる部分を含んでいる。480ｂｐおよび250ｂｐのＰＣＲ産物は、ＭＭ005／ＭＭ007（配列番号94／95）を用いて作られた断片の５’末端がＭＭ003/ＭＭ008(配列番号92／93)を用いて作られた断片の３’末端に重なるように作られた。 227ｂｐ、480ｂｐ、250ｂｐのＰＣＲ産物は貯蔵され(Pooled)、オリゴヌクレオチドＭＭ006（配列番号96）およびＭＭ005（配列番号94）を用いたＰＣＲで融合された。783ｋｂｐの融合されたＰＣＲ産物は、ｐ53をコードしている配列の（ＳｇｒＡＩ制限酵素サイトまでの）５′部分の５′側にＨ６プロモーターが置かれ、５′部分のあとにはｐ53 をコードしている配列のＳｔｕＩサイトからの３′末端が続いている。ｐ53をコードしている配列のあとには、早期(early)ワクシニア転写終結(Yuen and Moss, 1986)を提供するＴ５ＮＴ配列モチーフ(motif)および唯一のＸｈｏＩサイトが付加された。最終的に得られたＨ６−ｐ53ＰＣＲ融合生産物（783ｂｐ）は、ＳｇｒＡＩ制限酵素サイトとＳｔｕＩサイトとの間にｐ53をコードしている配列を含んではいない。 783bｐの融合生産物はＢａｍＨＩ（５′末端）およびＸｈｏＩ（３′末端）で消化され、プラスミドｐＳＤ550に挿入され、プラスミドｐＭＭ105が得られた。プラスミドｐＳＤ550はＩ４Ｌをコードしている配列を置換することにより外来遺伝子をワクシニアＩ４Ｌ座へ挿入することを可能にする。このプラスミドは、ｐＳＤ548(Tartagliaら,1992)より派生した。ｐＳＤ548は最初にＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩで消化され、アニーリングされたオリゴヌクレオチド539Ａ（配列番号97）および539Ｂ（配列番号98）と連結され、ｐＳＤ550とされた。Ｈ６プロモーターの３′側に並置された完全なｐ53遺伝子（野生型あるいは変異型）を含むプラスミドが最初にＳｇｒＡＩおよびＳｔｕＩにより消化することにより構築された。795ｂｐのＳｇｒＡＩ／ＳｔｕＩ断片がｐ53ｗｔＸｂａＩＳＰ６／Ｔ３およびｐ53−238ＸｂａＩより、一方で793ｂｐの断片がｐ53−238ＸｂａＩよりそれぞれ単離された。これらの断片は個々にＳｇｒＡＩ／ＳｔｕＩ消化されたｐＭＭ105と連結され、それぞれｐＭＭ106、ｐＭＭ108、ｐＭＭ107となった。プラスミドｐＭＭ106、ｐＭＭ107、およびｐＭＭ108は、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866 ；Tartagliaら，1992）をレスキューウイルスとした標準的な人工環境での組み換え実験（Piccini et al.，1987）に用いられ、ｖＰ1101、ｖＰ1096、ｖＰ1098 がそれぞれ創出された。第17図はｖＰ1101内の野生型ｐ53発現カセットおよび隣接する領域の塩基配列を示している（配列番号99）。Ｈ６プロモーターは位置14 5から始まる。ｐ53開始コドンは位置269から始まり、ｐ53終止コドンは位置1450 にある。位置１から144まで、および1451から1512までがＨ６／ｐ53発現カセットに連結されている。ｖＰ1096およびｖＰ1098内部の配列は、ｖＰ1096は920から922までの３塩基を欠失している点、ｖＰ1098は位置980にＴからＣの点変異(P oint mutation)を含んでいる点を除いて全く同一である。ｐ53特異的モノクロール抗体（ｐＡＢ1801、Oncogene Science，Dr．J．Marks により提供された）を用いて、ｖＰ1101、ｖＰ1098、ｖＰ1096がそれぞれ感染されたVero細胞中でのｐ53の発現を調べるために免疫蛍光法および免疫沈殿の両方のアッセイが行われた。これらのアッセイは前の方法（Taylorら，1990）に従って行われた。免疫蛍光法アッセイはｐ53特異的蛍光染色を、ｖＰ1101，ｖＰ1096 ，またはｖＰ1098に感染させた細胞において示した。ｐ53抗原は感染させた細胞の核と細胞質との両方に存在していた。しかしながら、ｖＰ1101に感染させた細胞においては、核での染色がより強烈であった。これらの結果は、ｐ53の野生型および変異型を発現可能なワクシニア組み換え体を用いた（Ronenら，1992）の報告と同様なものであった。親株であるＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）を感染させたVer o細胞中ではｐ53に特有な染色は見られなかった。ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）へのｐ53挿入のためのプラスミドを構築するために、ｐＭＭ106、ｐＭＭ107、およびｐＭＭ108をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐ53発現カセットを取り出し、個々にＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ−７へ挿入した。1320ｂｐのＨ６−ｐ53発現カセットを含む、ｐＭＭ106、ｐＭＭ108由来のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片はｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ−７へ挿入され、２ｐＭＭ110，ｐＭＭ112となり、ｐＭＭ107由来の1317ｐｂのＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ断片はｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ−７へ挿入され、ｐＭＭ111となった。プラスミドは以下の方法により構築された。ｐＣ５ＬＳＰ（実施例１で定義）は、ＢａｍＨＩで消化され、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＣＰ32（配列番号100）およびＣＰ33（配列番号101）に連結され、プラスミドｐＶＱＣ５ＬＳＰ６が構築された。ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６はＥｃｏＲＩで消化され、アルカリホスファターゼ処理され、リン酸化され、自身とアニーリングしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列番号102）と連結された後、ＮｏｔＩで消化され、直鎖状プラスミドとして精製された後で自己ライゲーションされた。この手順によりｐＶＱＣ５ＬＳＰ６にＮｏｔＩサイトが付与され、ｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ−７が構築された。挿入用プラスミドｐＭＭ110、ｐＭＭ111、ｐＭＭ112はＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）をレスキューウイルスとして用いた標準的な人工環境での組み換え実験(Picci ni etal.，1987)において使われ、それぞれｖＣＰ207、ｖＣＰ193およびｖＣＰ1 91が創出された。ｐ53遺伝子生産物の発現の確認は上記の免疫沈降反応によって成された。第18図はＨ６／ｐ53（野生型）発現カセットとそれに隣接する部分の塩基配列を示している（配列番号103）。Ｈ６プロモーターは位置109から始まる。ｐ53開始コドンは位置233にあり、終止コドンは位置1414にある。位置１から2 32まで、および位置1415から1483がＨ６／ｐ53発現カセットに隣接している。ｖＣＰ193およびｖＣＰ191内の塩基配列は、ｖＣＰ193は位置973から975までの３塩基が欠失している点、ｖＣＰ191は位置94のヌクレオチドのＴからＣへの点変異を含んでいる点を除いて第18図と同一のものである。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとしたｐ53組み換えウイルスのリストが、表22に示されている。実施例16−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとした、ＭＡＧＥ−１遺伝子を含む組み換えウイルスの利用ヒトメラノーマ関連抗原ＭＺ２−Ｅは、ＭＡＧＥ−１遺伝子によってコードされている（Vander Bruggen and Vander Eynde，1992）。ＭＡＧＥ−１は初期メラノーマ腫瘍細胞、メラノーマから派生した細胞系統、およびメラノーマ以外の起源を持つある種の腫瘍において発現されるが、通常の細胞中では精巣を除いて発現されない（Coulieら，1993）。免疫学的な見地からの興味としては、ＨＬＡ −Ａ１ＭＨＣハプロタイプのメラノーマ提供患者からのＣＴＬｓは、ＭＺ２−Ｅ遺伝子生産物からノナペプチド（nonapeptide）を認識することが知られている（Traveseriら，1992）。したがって、このような抗原を定義することにより、ＨＬＡタイプの（ＨＬＡ−ＡＩ）メラノーマ患者の目標とする免疫治療のための機構を提供することができる。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとした、ＭＡＧＥ−１遺伝子を含む組み換えウイルスＰＣＲ断片ＰＣＲ−１−16（162bｐ）が、ｐＢＳＨ６（実施例１４で記述）をテンプレートとして、そしてオリゴヌクレオチドＨ65ＰＨ（配列番号80）およびＨ６プロモーターの最後の18塩基およびＭＡＧＥ−１遺伝子の最初の24塩基を含むＭ１−４（配列番号104）を用いて生成された。２つめのＰＣＲ断片（ＰＣＲ−Ｍ１）は、オリゴヌクレオチドＭ１−１（配列番号105）およびＭ１−２（配列番号106）を用いてプラスミドｐＴＺ18ＲＭＡＧＥ１から増幅された。生成されたＰＣＲ断片はＭＡＧＥ−１をコードしている配列の最初の546ｂｐを有している。プラスミドｐＴＺ18ＲＭＡＧＥ１はＭＡＧＥ−１遺伝子のｃＤＮＡクローンを含んでいる。この遺伝子はＭＺＥ−２ヒトメラノーマ拒否抗原をコードしている。このプラスミドは、Dr．Thierry Boon（Ludwig Inst．for Cancer Research， Brussels，Belgium）からプラスミドを手に入れたDr．Lloyd Old（Memorial Slo an-Kettering，NY.,NY）によって提供された。ＰＣＲ融合物ＰＣＲ−Ｈ６Ｍ１は、ＰＣＲ−Ｈ６およびＰＣＲ−Ｍ１をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＨ65ＰＨ（配列番号80）およびＭ１−２（配列番号106）をプライマーとして用いて生成された。ＰＣＲ−Ｈ６Ｍ１はＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩで完全消化され、それによって生じた556ｂｐの断片が次のクローニングのために精製された。ＰＣＲ断片ＰＣＲ−Ｍ３′（535ｂｐ）は、ｐＴＺ18ＲＭＡＧＥ−１からオリゴヌクレオチド−Ｍ１−２の配列から約200残基上流側にある領域と相補的な24 残基を含むオリゴヌクレオチドＭ１−３（配列番号107）およびＭＡＧＥ−１をコードしている最後の15残基、ワクシニア早期（early）転写終結シグナル（Ｔ５ＮＴ）、およびＸｂａＩ制限酵素サイトを含むＭ１−５（配列番号108）を用いて増幅された。ＰＣＲＭ３′はＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化された。その結果生じた414 ｂｐの断片が単離され、556ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ消化されたＰＣＲ断片ＰＣＲ−Ｈ６Ｍ１と共に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化されたｐＢＳ −ＳＫ（＋）中へ挿入された。こうして生成されたプラスミドは完全なＨ６−ＭＡＧＥ−１発現カセットを含み、ｐＭＡＷ034と命名された。Ｈ６−ＭＡＧＥ− １カセットは塩基配列解析によって確認された（Goebelら，1990）。ｐＭＡＷ034より、864ｂｐのＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片が単離され、同じ制限酵素で消化されたｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ（実施例１４で記述）中に挿入された。生成されたプラスミドはｐＭＡＷ０36と命名された。このプラスミドＡＬＶＡＣゲノム中の二つのＣ５ＯＲＦをＨ６−ＭＡＧＥ−１発現カセットで置換するための挿入プラスミドとして用いられた。プラスミドｐＭＡＷ０36はＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとして用いた生体外での標準的な人口環境での組み換え実験において用いられた。組み換えウイルスは、ＭＡＧＥ−１特異的な放射性標識化されたＤＮＡプローブを用いた現場プラーク（plaque）ハイブリダイゼーションアッセイによって同定された。組み換えウイルスはプラーク精製され、増幅された。創生されたＡＬＶＡＣをベースとした、ＭＡＧＥ−１遺伝子を持つ組み換え体はｖＣＰ235と命名された。第19図は、ｖＣＰ235内部に含まれたＨ６／ＭＡＧＥ−１発現カセットおよびそれに隣接している部分の塩基配列である（配列番号109）。Ｈ６プロモーターは位置74 より始まる。ＭＡＧＥ−１開始コドンは位置201にあり、ＭＡＧＥ−１終始コドンは位置1031にある。位置１から73まで、および位置1032から1094までが、Ｈ６／ＭＡＧＥ−１発現カセットに隣接している。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）挿入用プラスミドｐＭＡＷ037が構築された。最初にＰＭＡＷ034がＮｒｕＩ／ＢａｍＩで消化され、生じた879ｂｐの断片が単離され、ＮｒｕＩ／ＢａｍＩで消化されたｐＳＰＨＡＨ６中に挿入された。生成されたプラスミドはｐＭＡＷ037と命名された。プラスミドｐＳＰＨＡＨ６は以下の方法で構築された。プラスミドｐＳＤ544 （ＨＡ遺伝子をポリリンカー領域および６つの読み取り枠の翻訳終了コドンで置き換えてあり、ＨＡ遺伝子の回りのワクシニア配列を含んでいる）がポリリンカー内部でＸｈｏＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー断片により平滑末端化されアルカリホスファターゼ処理された。ＳＰ126（ワクシニアＨ６プロモーターを含む）はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、クレノー酵素処理後ＳｍａＩで切断され、Ｈ６プロモーターが単離された。Ｈ６プロモーター断片をｐＳＤ544 へ連結し、ポリリンカー領域にＨ６プロモーターを（ＨＡ転写方向で）有するＳＰＨＡ−Ｈ６が構築された。プラスミドｐＭＡＷ037はＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）をレスキューウイルスとした人口環境での標準的な組み換え実験（Picciniら，1987）に用いられた。第20図は、ｐＭＡＷ037内部のＨ６／ＭＡＧＥ−１発現カセットおよび隣接領域の塩基配列を示している（配列番号110）。Ｈ６プロモーターは位置179、ＭＡＧＥ−１終止コドンは位置1009にある。位置１から59、および位置1010から1084までがＨ６／ＭＡＧＥ−１発現カセットに隣接している。実施例17 −ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした、ＣＥＡ組み換えウイルスの開発ＣＥＡをコードしている領域（2,109塩基）と同様、５′および３′の翻訳されていない領域も含んでいるプラスミドｐＧＥＭ．ＣＥＡ中のＣＥＡ遺伝子が提供された（Dr．J．Schlom，NCI-NIH）。構築されたＣＥＡは、５′末端の翻訳されていない配列を取り除かれ、ＣＥＡ開始コドンであるＡＴＧの前にワクシニアＨ６プロモーター配列が置かれるという改変がなされた。この改変はオリゴヌクレオチドペアのＣＥＡ１（配列番号111）とＣＥＡ２（配列NO．112）及びプラスミドｐＧＥＭ，ＣＥＡをテンプレートとして用いたＰＣＲによって行われた。生成された断片は、30残基のＨ６プロモーターの３′側にＣＥＡ開始コドンを連結し、ＣＥＡをコードしている配列の位置278ＡｐａＩサイトから22残基拡張し、プライマーＣＥＡ２（配列番号112）によって導入されたＢｇｌIIサイトで終っている。クローニングに先立ち、この断片はＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３′末端にあるサイト）およびＢｇｌIIで消化された。プラスミドｐＩ４Ｌ．Ｈ６よりＮｃｏＩ／ＢｇｌIIベクター断片及びＨ６プロモーターの５′部分を含むＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ断片が切り出され、消化された５ ′ＰＣＲ断片はこれら２つの断片とともに３ヶ所を連結された。構築されたプラスミドはｐＩ４Ｌ．Ｈ６．ＣＥＡ−５′と命名され、ＡＴＧコドンから位置278 のＡｐａＩサイトまでのＣＥＡ断片に連結された完全Ｈ６プロモーターを含んでいる。ＣＥＡの３′末端は、３′側で翻訳されていないＣＥＡ領域が除かれ、ＴＡＧ終了コドンのあとには、ワクシニア早期（early）転写終結シグナル（ＴｓＮＴ）とそれに続く一連の制限酵素サイト（ＸｈｏＩ，ＸｂａＩ，ＳｍａＩ，ＨｉｎｄIII）が設置された。この改変はプラスミドｐＧＥＭ．ＣＥＡをテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＣＥＡ３（配列番号113）及びＣＥＡ４（配列番号114）とともに用いたＰＣＲによって成された。生じた断片は、位置1203にあるＣＥＡ遺伝子のＨｉｎｄIIIサイトから32残基上流の地点から、ＣＥＡをコードしている３′末端までを含んでいた。この断片はＨｉｎｄII／ＨｉｎｄIII消化されたｐＧＥＭ．ＣＥＡ中にＨｉｎｄII／ＨｉｎｄIII断片としてクローン化された。生成されたプラスミドはｐＧＥＭ．ＣＥＡ−３′と命名され、ｐＧＥＭ。ＣＥＡで見られたＣＥＡ遺伝子を３′側で翻訳されていない領域を取り除きＴ₅ＮＴシグナルとそれに続く制限酵素サイト（ＸｈｏＩ，ＸｂａＩ，ＳｍａＩ，Ｈｉｎｄ III）でおきかえられるという改変を施したＣＥＡ遺伝子の全長を有している。ＣＥＡ遺伝子を含むＡＬＶＡＣＣ３供与体プラスミドが構築された。ｐＩ４Ｌ．Ｈ６．ＣＥＡ−５′よりＨ６プロモーターに連結されたＣＥＡの５′末端を含むＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ断片が得られた。ｐＧＥＭ．ＣＥＡ−３′より残りのＣＥＡ遺伝子（およびＴ₅ＮＴ）を含むＡｐａＩ／ＸｈｏＩ断片が得られた。さらに、プラスミドｐ126.Ｃ３．よりＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩＣ３ベクター断片が得られた。これらの断片の３ヶ所を連結し、プラスミドｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３が得られた。このプラスミドは、ＡＬＶＡＣゲノムのＣ３サイトへの挿入のための左右のＡＬＶＡＣＤＮＡ連結アームの間に挿入された、Ｈ６／ＣＥＡ発現カセットの全長を有している。ＣＥＡの転写方向は右から左へ向かっている。プラスミドＰ126．Ｃ３はＡＬＶＡＣＣ３供与体プラスミドで、以下のように構築された。このプラスミドは昆虫ポックスウイルス42Ｋ早期（early）プロモーター支配下の；Plasmodium falciparum由来ＳＥＲＡ遺伝子（Li et al.，19 89; Bzikら，1989; Knapp et al.，1989; 原注、ＳＥＲＡはＳＥＲＰＩおよびｐ 126としても知られている）のｃＤＮＡよりなっている。Ａ．ｐ126.Ｃ３の開発の方法１．P．talciparum ＦＣＲ３株血液段階（blood stage）ｃＤＮＡライブラリーの構築 P．falciparum ＦＣＲ３株に感染したヒトの赤血球からの全ＲＮＡがDr．P．D elplaceによって提供された（ＩＮＳＥＲＭ−Ｕ42）。ポリＡ⁺ＲＮＡが、オリゴ（ｄＴ）セルロース（Stratagene，La Jolla，CA.）を用いて、Aviv and Leder （1972）によって記述されKingston（1987）によって改良された方法でサンプル中から取り出された。簡潔に説明すると、全ＲＮＡはオリゴ（dT）セルロースと結合バッファー（0.5M NaCl，0.01Mトリス−Cl，pH7.5）と混合され、室温で30 分間保温された。ポリＡ⁺ＲＮＡとオリゴ（ｄＴ）複合体は遠心分離によって沈殿され、結合バッファーで３回洗浄された。純化されたポリＡ⁺は溶出バッファー（0.01Mトリス−Cl，pH7.5）中でオリゴ（ｄＴ）セルロースから溶出された。ＤＥＰＣ処理されたｄＨ₂Ｏでの２回目の溶出が行われ、溶出画分は保存され、ポリＡ⁺ＲＮＡはエタノール沈殿により回収された。精製されたポリＡ⁺ＲＮＡが逆転写酵素によるオリゴ（ｄＴ）中での最初のＤＮＡ鎖合成反応でのテンプレートとして用いられた（Watson and Jackson，1985 ; Klickstein and Neve，1987）。この反応において、12μｇのpolyＡ⁺ＲＮＡが、105ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（Life Sciences，Inc.，St．Petersburg，FL .）とともに100mMトリス−Cl pH8.3，30mM ＫＣｌ，６mM ＭｇＣｌ₂，25ｍＭＤＴＴ，80ユニットＲＮａｓｉｎ，１mM各ｄＮＴＰ，およびプライマーとしての 24μｇ／mlオリゴ（ｄＴ）12−18を含む反応系中で42℃で２時間保温された。有機的抽出の後、二本鎖を用いて得られた（Watson and Jackson，1985; Klickstein and Neve，1987）。最初のＤＮＡ鎖は25ユニットのＤＮＡポリメラーゼおよび１ユニットのＲＮａｓｅＨとともに、20mMトリス−Ｃｌ pH６，５mM ＭｇＣｌ₂ ，10mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，100mM ＫＣｌ，500μｇ／ml ＢＳＡ，25mM ＤＴＴ，および0.1mM各ｄＮＴＰを含む反応系中で、12℃で１時間保温後、室温で１時間保温され、第二のｃＤＮＡ鎖が合成された。二本鎖ｃＤＮＡは有機的抽出の後、エタノール沈殿により回収された。二本鎖の血液段階ｃＤＮＡは続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端化され、ＥｃｏＲＩメチラーゼ処理により内部にあるＥｃｏＲＩサイトが保護された。ＥｃｏＲＩリンカーが付加され、続いてＥｃｏＲＩで消化され、５−25 ％のショ糖密度勾配により、大きさで分離された。長いｃＤＮＡ（1-10kb）を含む画分が保存され、ＥｃｏＲＩで分離されたラムダＺＡＰIIベクター（Stratage ne，La Jolla，CA.）へ連結された。その結果生じたファージはパッケージ化され、E．coli ＸＬ−１ Blue株（Strat agene）の感染に用いられた。ファージはそれら細胞から回収され、さらにもう一度ＸＬ−１ Blueへの感染サイクルにより増幅され、高い力価のＦＣＲ３株血液段階ｃＤＮＡライブラリーが構築された。２．ＳＥＲＡｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡライブラリーからの検索ＦＣＲ３株ｃＤＮＡライブラリーは、³²Ｐで末端を標識化された、公知のＳＥＲＡの配列をもとに作られたオリゴヌクレオチドとのｃＤＮＡ検出のためのプラークハイブリダイゼーションによって検出された。ｃＤＮＡライブラリーは150m mの皿に入れられたＸＬ−１４ Blue（Stratagene）のlawn上で100,000プラーク／皿の密度でプラークを形成した。プラークはニトロセルロースフィルターに移され、つづいてフィルターは1.5ＭＮａＣｌ／0.5ＭＮａＯＨに２分間、1.5 ＭＮａＣｌ／0.5ＭトリスＣｌ pH８の溶液に５分間、0.2Ｍトリス−Ｃｌ pH 7.5／２ＸＳＳＣに１分間連続して侵され、80℃の真空オーブンで２時間焼かれた。フィルターは６×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，20mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、 500μｇ／mlサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、２時間、42℃でプレハイブリダイゼーションされた。ハイブリダイゼーションは、0.4％ＳＤＳ、６×ＳＳＣ，20m M ＮａＨ₂ＰＯ₄，500μｇサケ精子ＤＮＡを含む反応系中で、³²Ｐで標識化されたオリゴヌクレオチド添加後、18時間行われた。ハイブリダイゼーション後、フィルターは６×ＳＳＣ，0.1％ＳＤＳを含む溶液中で室温で10分間、３回すすがれ、続いて58℃で５分間洗浄された。フィルターはその後Ｘ線フィルムに−70℃ で密着された。プラークとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプロークは皿から集められ、４％のクロロホルムを含むＳＭバッファーにＣ100mM ＮａＣｌ，８mM ＭｇＳＯ₄，50mＭトリス−Ｃｌ pH7.5，0.01％ゼラチンに再懸濁された。このようなファージのストックの希釈液は再びＸＬ−１ Blueを感染させるために使われ、プラークはニトロセルロースフィルターに移され、フィルターは³²Ｐで標識化されたオリゴヌクレオチッドとハイブリダイゼーションが行われた。単離された陽性プラークが選択され、２回の更なる今回記述された方法での精製が行われた。３．陽性ファージクローンからのＳＥＲＡｃＤＮＡを有するプラスミドの単離ラムダＺＡＰII（Stratagene）用に開発された生体切り出しプロトコルを用いてpBluescriptプラスミドベクター（Stratagene）中にＳＥＲＡｃＤＮＡが得られた。すなわち、純化された組み換えラムダファージストックがＸＬ−１ Bl ue細胞および糸状Ｒ408ヘルパーファージとともに37℃で15分間保温された。２ＸＹＴ培地（１％ＮａＣｌ，１％酵母エキス、1.6％Bacto-tryptone）が添加された後、37℃で３時間更に保温され、続いて70℃で20分間保温された。遠心分離後、pBluescriptファージミド（phagemid）をｃＤＮＡインサートとともに有する糸状ファージの小片は、上清中に回収された。回収された糸状ファージストックの希釈液はＸＬ−１ Blueと混合され、ＳＥＲＡｃＤＮＡインサートを有する pBluescriptプラスミドを含むコロニーを得るために平板上に塗布された。４．マラリアｃＤＮＡのＰＣＲによる開発ＰＣＲ法の利用により、ＳＥＲＡをコードしている配列の５′部分が、最初のｃＤＮＡ鎖をテンプレートとして用いて増幅された（Saikiら，1988; Frohmanら，1998）。ＳＥＲＡに特有な最初のｃＤＮＡは、上述された反応条件および特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素を用いて合成された。続いてＰＣＲ反応に先立ってＲＮａｓｅＡ処理によりＲＮＡが除かれた。ＰＣＲにはGeneAmp ＤＮＡ増幅キット（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT.）が用いられた。簡潔に説明すると、最初のＤＮＡ鎖（50mM ＫＣｌ，10mMトリス−ＣｌpH 8.3，1.5mM ＭｇＣｌ₂，0.01％ゼラチンを含む溶液中にある）は、200μＭの各ｄＮＴＰ，１μＭの各プライマー、2.5ユニットのＴａｑポリメラーゼと混合された。反応はサーマルサイクラー（Thermal Cycler）（Perkin Elmer Cetus）中で、変性、アニーリング、、伸張がそれぞれ94℃２分間、43℃３分間、72℃40分間の条件で１サイクル、94℃１分間、43℃２分間、72℃４分間の条件で40サイクル、続いて94℃１分間、43℃２分間、72℃20分間の最後のサイクルという順序で行われた。ＰＣＲに使われたプライマー中の制限酵素サイトの存在により、増幅されたＳＥＲＡｃＤＮＡのプラスミドベクター中へのクローニングが可能になった。別々の２回のＰＣＲより得られたｃＤＮＡを含むクローンは、それぞれＳＥＲＡｃＤＮＡで、Ｔａｑポリメラーゼのエラーを調節するために増幅された。Ｂ．結果１．ＳＥＲＡｃＤＮＡの挿入、クローニングおよび諸性質の検討 P．falciparum ＦＣＲ３株より、ＳＥＲＡをコードしている配列を含むｃＤＮＡクローンが単離された。位置1892（番号付けはＦＣＢＲ株のＳＥＲＰＩ遺伝子に基づいている；Knappら,1989）のＥｃｏＲＩサイトからコードしている領域の３′末端までにわたるＰ126.6ｃＤＮＡライブラリＫ−からＳＥＲＡをコードしている遺伝子の３′末端部分から派生した（Bzik et al.，1989; Knapp et al .，1989）ＳＥＲＡ特異的オリゴヌクレオチドＪＡＴ２（配列NO．115）とのハイブリダイゼーションによって単離された。ＳＥＲＡをコードしている配列の５′部分は、ＪＡＴ15（配列NO．116）およびＪＡＴ16（配列NO．117）をプライマーとして、および最初のＳＥＲＡｃＤＮＡ鎖（オリゴヌクレオチドプライマーＪＡＴ17(配列番号118)により得られた）をテンプレートとしたＰＣＲにより得られ、ｐＶＣ19（New England Biolabs，B everly，MA）中にクローン化された。これらの1923ｂｐのｃＤＮＡは、開始コドンから、内部ＥｃｏＲＩサイトから31残基３′側の部分まで（位置1982）、を含んでいた。このようなｃＤＮＡのひとつであるｐ126.8は、位置1357のヌクレオチドにＴａｑポリメラーゼのエラーを含んでいることが、ＤＮＡ塩基配列解析により判明した。このエラーは、ＡからＧへの置換であり、315ｂｐのＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片内に存在していた。第二のＳＥＲＡ５′ｃＤＮＡであるｐ 126.9はＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ断片内に変異を有していなかった。ｐ126.8中のＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ断片をｐ126.9のＫｐｎＩ／ＮｄｅＩで置き換えることにより、変異の内５′ＳＥＲＡｃＤＮＡが開発され、ｐ126.14と命名された。ｐ126.14の５′ｃＤＮＡのＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩで部分消化されたｐ126.6ベクター断片中に連結することにより、全長のＳＥＲＡｃＤＮＡを含むｐ126.15が構築された。ｐ126.15ＳＥＲＡｃＤＮＡインサートの完全な塩基配列が決定され、それより推定されるアミノ酸配列（配列番号120）とともに第21Ａおよび21Ｂ図（配列番号119）中に示された。このｃＤＮＡは、ＦＣＲ３株のＳＥＲＡ対立遺伝子IIおよびＦＣＢＲＳＥＲＰＩ遺伝子と同一な984残基のアミノ酸をコードしている295 5ｂｐのオープンリーディングフレームを有していた（Li et al.，1989; Knapp et al.，1989）。ＳＥＲＡｃＤＮＡはｐ126.15より３ｋｂのＸｍａＩ／ＥｃｏＲＶとして単離され、ＸｍａＩ末端は、ＸｍａＩ／ＢｇｌIIで消化されたｐＣＯＰＣＳ−５Ｈのベクター断片に連結された。ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片によりｐＣＯＰｃｓ −５ＨのＢｇｌIIサイトは平滑末端化され、続いてＥｃｏＲＶ末端と連結され、ｐ126.16が構築された。このプラスミド中で、ＳＥＲＡは早期／後期（early/la te）ワクシニアｈ６プロモーターの支配下にある。２．ＳＥＲＡｃＤＮＡの改変ＳＥＲＡｃＤＮＡの３′末端が改変され、ワクシニア早期（early）転写終結シグナル（Ｔ₅ＮＴ；Yuen and Moss，1987）および一連の制限酵素サイト（ＸｈｏＩ，ＳｍａＩ，ＳａｃＩ）が、ＴＡＡ終了コドンの直後に設置された。この改変は、オリゴヌクレオチドＪＡＴ51（配列番号121），ＪＡＴ52（配列番号122）およびテンプレートとしてｐ126.16を用いたＰＣＲにより成された。その結果生じる〜300ｂｐ増幅された断片は、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩで消化されたｐ126.1 6中にＰｓｔＩ／ＳａｃＩ断片としてクローン化され、ｐ126.17が構築された。ｐ126.17中のＳＥＲＡｃＤＮＡの５′末端は改変され、いくつかの制限酵素サイト（ＨｉｎｄIII，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩ）および42Ｋ昆虫ポックスプロモーターが、ＡＴＧ開始コドンの前に設置された。この改変は、オリゴヌクレオチドＪＡＴ53（配列番号123）、ＪＡＴ54（配列番号124）、およびテンプレートとしてプラスミドｐ126.16を用いたＰＣＲにより成された。その結果生じた250ｂｐ増幅された断片は、ＨｉｎｄIII／ＨｉｎｄII／断片として、ＨｉｎｄIII/ＨｉｎｄIIで消化されたＰ126.17中にクローン化され、Ｐ126. 18が構築された。このプラスミドは、42Ｋ昆虫ポックスプロモーター支配下にあるＳＥＲＡｃＤＮＡカセットを、ワクシニア早期転写終結シグナルとともに、制限酵素サイト（５′末端側はＨｉｎｄIII，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩで、３′末端側はＸｈｏＩ，ＳｍａＩ，ＳａｃＩ）に隣接した状態で有している。 42ｋプロモーター／ＳＥＲＡカセットは、ｐ126.18よりＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片として単離され、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＳＤ553ベクター断片中にクローン化された。その結果生じたプラスミドは、ｐ126.ＡＴＩと命名された。３．ｐ126.Ｃ３の開発 42Ｋ／ＳＥＲＡは発現カセットは、ｐ126.18よりＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片として単離され、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化されたＶＱＣＰ３Ｌベクター断片中にクローン化された。生じたプラスミドは、ｐ126.Ｃ３と命名されたＡＬＶＡＣＣ３共与プラスミドである。４．ｐＳＤ553の構築ｐＳＤ553ワクシニア供与体プラスミドがｐ126.ＡＴＩの開発に用いられた。そのプラスミドは、ＡＴＩ領域（ORFA25L，A26L; Goebel等，1990a，b）を置換しているワクシニアＫ１Ｌ宿主範囲遺伝子（Gellard等，1986）を、コペンハーゲンワクシニアアーム内に隣接して有している。ｐＳＤ553は以下のように構築された。左および右のワクシニア連結用アームは、ワクシニアＳａｌＩＢ遺伝子（Goeb 等，1990;a，b）のｐＵＣ８をベースとしたクローンであるｐＳＤ414をテンプレートとして用いたＰＣＲにより構築された。左のアームは合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹ267（配列番号85）およびＭＰＳＹＮ268（配列番号86）をプライマーとして生成された。右のアームは合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ269（配列番号87）およびＭＰＳＹＮ270（配列番号88）をプライマーとして生成された。ＰＣＲによって作られた２つの左および右のアームを含むＤＮＡ断片は、更にＰＣＲ反応によって結合された。生成分はＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで切断され、0.9ｄｋｂの断片が単離された。この断片はＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで消化されたｐＵＣ８に連結され、ｐＳＥ541が生成された。ワクシニア欠失座に付置するポリリンカー領域は以下のように拡大された。ｐＤＥ541はＢｇｌII／ＸｈｏＩで切断され、アニーリングされた相補的な合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ333（配列番号125）およびＭＰＳＹＮ334（配列番号126）に連結され、プラスミド552が形成された。Ｋ１Ｌ宿主範囲遺伝子は、プラスミドｐＳＤ452（Perdus et al.，1990）よりＢｇｌII（限定分解）／ＨｐａＩ（完全分解）断片として単離去れた。ｐＳＤ553が構築された。５．ＶＱＣＰ３Ｌの構築ＶＱＣＰ３ＬＡＬＶＡＣ供与体プラスミドはｐ126.Ｃ３の開発に用いられたが、その構築の手順は以下の通りである。挿入プラスミドＶＱＣＰ３Ｌは以下のように開発された。8.5ｋｂのカナリアポックスＢｇｌII断片がｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターのＢａｍＨＩサイトにクローン化され、プラスミドｐＷＷＳが形成された。塩基配列解析が行われ、Ｃ３挿入部位を含むＡＬＶＡＣゲノム由来の 7351ｂｐの断片が第14Ａ図から14Ｃ（配列番号127）に示された。Ｃ３のＯＲＦは位置1458から2897に存在していた。Ｃ３ＯＲＦを完全に取り除いたＣ３座に外来遺伝子を挿入するための供与体プラスミドの構築することを目的に、Ｃ３遺伝子に関連した５′部分および３′部分の増幅のためのＰＣＲプライマーが用いられた。５′配列用のプライマーはＲＧ277（配列番号128）およびＲＧ278（配列番号129）である。３′配列用のプライマーはＲＧ279（配列番号130）およびＲＧ280（配列番号131）である。これらの配列はワクシニア転写および翻訳終結シグナルに隣接したマルチクローニングサイトを有するよう設計された。左腕および右腕の５′末端および３′末端には、適当な制限酵素サイトがあり（左腕にはＡｓｐ718およびＥｃｏＲＩ，右腕にはＥｃｏＲＩ，およびＳａｃＩ）、これによって２つの腕をＡｓｐ 718／ＳａｃＩ消化されたｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクター中に連結することが可能であった。生成されたプラスミドはｐＣ３Ｉと命名された。プラスミドｐＷＷ５をＮｓｉＩおよびＳｓｐＩで消化することにより、Ｃ３座の直前の上流域のカナリアポックスＤＮＡ断片（908ｂｐ）が得られた。オリゴヌクレオチドＣＰ16（配列番号132）およびＣＰ17（配列番号133）、およびｐＷＷ５をテンプレートとして用いたＰＣＲにより、604ｂｐのカナリアポックスＤＮＡ断片が得られた。604ｂｐの断片はＡｓｐ718およびＸｈｏＩ（サイトはそれぞれ、オリゴヌクレオチドＣＰ16およびＣＰ17の５′の末端にある）で消化され、Ａｓｐ718／ＸｈｏＩ消化され、アルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ25（International Biotechnologies，Inc.，New Haven，ＣＴ）中にクローン化され、プラスミドはＳＰＣ３ＬＡが生成された。ＳＰＣ３ＬＡはＩＢＩ 25内部をＥｃｏＲＶで、またカナリアポックスＤＮＡ内部をＮｓｉＩで消化され、908ｂｐのＮｓｉＩ−ＳｓｐＩ断片に連絡され、Ｃ13座の上流域のカナリアポックスＤＮＡの1444残基を含むＳＰＣＰＬＡＸが構築された。ｐＢＳ−ＳＫのＰｓｔＩサイト中にクローン化された6.5ｋｂｐのカナリアポックスＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＸＸ４より、2178ｂｐのＢｇｌII／ＳｔｙＩカナリアポックスＤＮＡ断片が単離された。オリゴヌクレオチドＣＰ19（配列番号134）およびＣＰ20（配列番号135）、およびテンプレートとしてプラスミドｐＸＸ４を用いたＰＣＲにより、279ｂｐのカナリアポックスＤＮＡが単離された。279ｂｐの断片はＸｈｏＩおよびＳａｃＩ（サイトはオリゴヌクレオチドＣＰ19およびＣＰ20の５′末端にそれぞれ存在）で切断され、ＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化された後、アルカリフォスファターゼ処理されたＩＢＩ25中にクローン化され、プラスミドＳＰＣ３ＲＡが生成された。ポリリンカーへ新たな唯一のサイトを付加するため、ｐＣ３Ｉがポリリンカー領域内部をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化されたオリゴヌクレオチドＣＰ12（配列番号136）およびＣＰ13（配列番号137）より成るＥｃｏＲＩ粘着末端、ＸｈｏＩサイト、ＣｌａＩに相当する粘着末端を有する配列に連結され、プラルミド５ＰＣＣＰ３５が生成された。ＳＰＣＰ３Ｓはカナリアポックス配列中のＣ３座下流内をＳｔｙＩおよびＳａｃＩで切断され、ｐＸＸ４由来の2178ｂＰのＢｇｌII−ＳｔｙＩ断片およびＳＰＣ３ＲＡ由来の 261ｂｐのＢｇｌII−ＳａｃＩと連結され、Ｃ３座下流域の2572ｂｐのカナリアポックスＤＮＡを含むプラスミドＣＰＲＡＬが構築された。ＳＰＣＰ３ＳはＣ３座上流域のカナリアポックス配列内をＡｃｃＩ，ｐＢＳ−ＳＫ内をＡｓｐ718で消化され、ＳＰＣＰＬＡＸ由来の1436ｂｐのＡｓｐ718−ＡｃｃＩ断片と連絡され、Ｃ３座上流域の1457ｂｐのカナリアポックスＤＮＡを有するプラスミドＣＰＬＡＬが生成された。構築されたプラスミドはＳＰＣＰ３Ｌと命名された。ｐＳＰＣＰ３ＬをＸｍａＩで消化し、線状化されたプラアスミドをホスファターゼ処理し、アニーリングされリン酸化されたオリゴヌクレオチドＰ23（配列番号138 ）およびＣＰ24（配列番号139）と連結することによりＶＱＣＰ３Ｌが開発された。ｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３の塩基配列解析によって、ＣＥＡをコードしている領域の位置1203で一つの塩基（Ｔ）の欠失が、前述のクローニングの段階において生じていることが判明し、これによってＨｉｎｄIIサイトが失われていた。この欠失は、位置501から1548までの1047ｂｐのＭｓｃＩ断片を、ｐＧＥＭ，ＣＥＡ由来の変異のないＭｓｃＩ断片と交換することにより補正された。生成されたプラスミドはｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３．２と命名された。ＮｏｔＩ−によって直線化された供与体プラスミドｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３．２とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、ＣＥＡがＡＬＶＡＣ内に挿入された。ＣＥＡを含む組変え体は、ＣＥＡをコードしている配列を全長を含むＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ断片より作成されたＤＮＡプローブとのプラークハイブリダイゼーションにより同定された。ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ断片はｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３．２より単離され、Ｈ６プロモーターの３′末端に連結されたＣＥＡをコードしている配列の全長を有している。この断片は、ＨＡ供与体プラスミドｐＳＤ544にＨ６プロモーターを含む断片の挿入により開発されたところのｐＳＰＨＡ．Ｈ６をＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ消化したベクター断片と連結された。生成されたプラスミドはｐＨ６．ＣＥＡ．ＨＡと命名され、再改変されたＨ６プロモーターに連結されたＣＥＡをコードしている領域を有している。ｐＨ６．ＣＥＡ．ＨＡ供与体プラスミドは、Ｈ６／ＣＥＡ発現カセットをＮＹＶＡＣのＨＡサイトへ挿入することを目的としている。ＣＥＡの転写は左から右に開始される。プラスミドｐＳＤ544は以下のように構築された。ｐＳＤ456はコペンハーゲンワクシニアＤＮＡのＨＡ遺伝子（A56R; Goebelら，1990a，b）およびその周辺の領域を含むサブクローンである。Ｐｓｄ456は、Ａ56ＲＯＲＦに隣接する左および右のワクシニアアールを生成するためのＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いれれた。左のアームは合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ279（配列番号140）およびＭＰＳＹＮ280（配列番号141）をプライマーとして用いて合成された。右アームはＭＰＳＹＮ281（配列番号142 ）およびＭＰＳＹＮ312（配列番号143）をプライマーとして用いて合成された。左および右アームのためのＰＣＲ産物は、ゲルで精製され、されにＰＣＲ反応で結合された。生成されたＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで切断された。切断により生じた0.9ｋｂの断片はゲルで精製され、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで消化されたｐＵＣ８に連結され、プラスミドｐＳＤ544が構築された。第22図および第23図は、それぞれ、プラスミドｐＨ６．ＣＥＡ．Ｃ３．２およびｐＨ６。ＣＥＡ．ＨＡ中のＨ６／ＣＥＡ発現カセットおよび隣接している領域の配列（それぞれの配列番号144，配列番号145）を示している。第22図において、Ｈ６プロモーターは位置57から始まる。ＣＥＡ開始コドンは位置１から58、および位置2290から2434がＨ６／ＣＥＡ発現カセットに隣接している。第23図において、Ｈ６プロモーターは位置60から始まる。ＣＥＡ開始コドンは位置184から始まり、終止コドンは229で終わる。位置１から59、および位置2293から2349がＨ６／ＣＥＡ発現カセットに隣接している。実施例18 −ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのネズミＩＬ−２の挿入ネズミＩＬ−２のＡＬＶＡＣへの挿入プラスミドｐｍｕｔ−１（ＡＴＣＣ N O.37553）はAmerican Type Culture Collection，Rockville，MDより得たネズミＩＬ−２遺伝子を含んでいる。ＩＬ−２遺伝子をワクシニアＨ６プロモーターの支配下におき（Perkus等，1989），ＩＬ−２の３′側のコードしていない末端（ noncoding end）を以下の方法により除去した。Ｈ６プロモーターおよび非関連（nonpertinent）遺伝子を含むｐＲｗ825をテンプレートとして、ＭＭ104（配列番号146）およびＭＭ105（配列番号147）をプライマーとして用いたＰＣＲ反応が行われた。ＭＭ104の５′末端は、ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩおよびＳｍａＩサイトを持ち、それに、Ｈ６プロモーターの５′末端から３′末端へ向かう配列が続いている。ＭＭ105の５′末端はＩＬ−２の５′末端と重なっており、ＭＭ105はＨ６プロモーターの３′末端から５′末端へ向かう配列を提供している。得られた228ｂｐのＰＣＲ産物である断片は、Ｈ６プロモーターに支配された最も５′末端側のＩＬ −２の塩基対を含んでいる。テンプレートのプラスミドｐｍｕｔ−１を、プライマーＭＭ106（配列番号148 ）ＭＭ107（配列番号149）とともに２回目のＰＣＲで用いた。ＭＭ105の５′末端はＨ６プロモーターの３ ′末端と重なっており、ＩＬ−２の５′末端から３′末端へ向かう配列を提供する。ＭＭ107の５′末端はＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩサイトを有し、ＩＬ−２の３′ 末端から５′末端へ向かう配列がそれに続いている。ＰＣＲ産物として得られた 546ｂｐの断片を前出の228ｂｐのＰＣＲ産物とともに集め、ＭＭ104およびＭＭ1 07をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。その結果生産された、Ｈ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子を有する739ｂｐの断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断して725ｂｐの断片を得て、ｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene，La Jolla，C A）のＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ｐＭＭ151を構築した。Ｈ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子を含むｐＭＭ151由来の755ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を、Ｃ３ベクターｐＣＰ３ＬＳＡ−２のＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間に挿入した。構築したプラスミドｐＭＭ153はＨ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子をＣ３座中に有する。ネズミＩＬ−２の翻訳開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を、第24図（配列番号150）に示す。Ｃ３ベクタープラスミドｐＣＰ３ＬＳＡ−２を以下の方法により構築した。プラスミドＳＰＣＰ３Ｌ（実施例17）をＮｓｉＩおよびＮｏｔＩで消化し、6433ｂｐの断片を単離し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＣＰ34（配列番号151 ）およびＣＰ35（配列番号152）に連結し、プラスミドｐＣＰ３Ｌ−２を構築した。供与体プラスミドｐＭＭ153とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ275を創出した。ｖＣＰ275はワクシニアＨ６支配下のネズミＩＬ−２遺伝子をＣ３座内に有する。ネズミＩＬ−２のＮＹＶＡＣへの挿入前出のプラスミドｐＭＭ151をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、Ｈ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子を含む755 ｂｐの断片を単離した。このＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片を、ＮＹＶＡＣＴＫベクターｐＳＤ542のＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間に挿入した。構築したプラスミドｐＭＭ154は、Ｈ６支配下にあるＩＬ−２遺伝子をＴＫ座内に有する。プラスミドｐＳＤ542を以下の方法により開発した。ポリリンカー領域を改変するため、ＴＫベクタープラスミドｐＳＤ513（実施例７）をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで切断し、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ288（配列番号153）およびＭＰＳＹＮ299（配列番号154）に連結し、プラスミドｐＳＤ542を構築した。供与体プラスミドｐＭＭ154とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1239を創出した。ｖＰ1239はＨ６プロモーター支配下にあるネズミＩＬ−２遺伝子をＴＫ座内に有する。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換えウイルスによるネズミＩＬ−２の発現ＥＬＩＳＡアッセイＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体であるｖＣＰ275およびｖＰ1239によって生産されたネズミＩＬ−２の発現レベルを、Genzyme Corporation社（Cambridge，MA）のＥＬＩＳＡキット（Inter Test-2xネズミIL-2 ELISAキット、Genzyme Corporation，Code＃2122-01）を用いて定量化した。ネズミＬ−929細胞（2×10⁶細胞／皿）の融合性の単層を含んだ皿２つずつを、ネズミＩＬ−２を発現する組み換えウイルスｖＣＰ275またはｖＰ1239に感染されるか、あるいは親株であるＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣに感染させた。37℃での一晩の保温に続いて、上清を回収し、ネズミＩＬ−２の発現を、Inter Test−２ＸネズミＩＬ−２ＥＬＩＳＡキットを用いて、製造者（Ge nzyme Corporation，Cambride，MA）の支持する方法で測定した。Inter Test− ２ＸネズミＩＬ−２ＥＬＩＳＡキットは、マルチ抗体のサンドイッチ原理を用いた固相酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡプレートを490ｎｍで読んだ。ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣの試料からバックグラウンドを差し引き、２つの皿の値の平均をとった。分泌したネズミＩＬ−２の量をpg／mlで示す（これはpg /10⁶細胞に等しい）。（表23）実施例19−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのヒトＩＬ−２の挿入ヒトＩＬ−２のＡＬＶＡＣへの挿入プラスミドｐＴＧＦ−11（ATCC No.3967 3）はAmerican Type Culture Collection，Rockville，MDより得たヒトＩＬ−２遺伝子を含んでいる。ＩＬ−２遺伝子をワクシニアＨ６プロモーターの支配下におき（Perkus等，1989）、２つのコドンを修正し、ＩＬ−２の３′側のコードしていない末端（noncoding end）を以下の方法で除去した。Ｈ６プロモーターおよび非関連（nonpertinent）遺伝子を含むプラスミドｐＲＷ825をテンプレートとして、プライマーＭＭ104（配列番号146）およびＭＭ109（配列番号155）とともにＰＣＲ反応で用いた。ＭＭ104の５′末端はＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩ，およびＳｍａＩを有し、それに続くワクシニアＨ６プロモーターの５′末端から３ ′末端へ向かう配列を提供している。ＭＭ109の５′末端はＩＬ−２の５′末端と重なっており、ＭＭ109はＨ６プロモーターの３′末端から５′末端へ向かう配列を提供している。ＰＣＲにより得られた230ｂｐの断片は、Ｈ６プロモーターに支配されているＩＬ−２の最も５′末端側の塩基対を有している。プラスミドｐＴＣＧＥ−11をテンプレートとして、プライマーＭＭ108（配列番号156）およびＭＭ112（配列番号157）とともにＰＣＲ反応で用いた。ＭＭ108の５′末端はＨ６プロモーターの３′末端と重なっており、ＩＬ−２５′末端から３′末端方向への配列を提供している。ＭＭ112はヒトＩＬ−２配列（第25図）中の位置100から５′末端へ向かう配列を提供している。ＰＣＲによって生じた118ｂｐの断片は、Ｈ６プロモーターの最も３′側の塩基対およびＩＬ−２遺伝子の５′末端からの100ｂｐを有している。アメリカ型Culture Colletionから得たプラスミドｐＴＣＧＦ−11をシークエンスし、その配列を公表された配列（Clark等，1984）と比較した。２つのアミノ酸変化を引き起こす変異を発見された。オリゴヌクレオチドプライマーＭＭ11 1（配列番号158）およびＭＭ112を用いてｐＴＣＧＦ−11中の２つ塩基の変異を修正した。ヒトＩＬ−２の翻訳開始コドンから終止コドンまでの修正した配列を（配列番号159）第25図に示す。ｐＴＣＧＦ−11中の位置114でのＧ→Ｔ系のサイレント変異を除いて、第25図の配列はClark，等，1984で記述されたものと同じである。第25図中での位置41 でのＴはｐＴＣＧＦ−11中ではＣであり、コドンはロイシンからプロリンへ変化している。第25図中での位置134でのＴはｐＴＣＧＦ−11ではＣで、コドンはロイシンからセリンに変化している。他のヒト、牛、ネズミ、ヒツジ、およびブタのＩＬ−２単離体の推定アミノ酸配列をClark，等，1984中の配列と比較したが、コドンは位置41と134のどちらもロイシンで保存されていた。テンプレートｐＴＣＧＦ−11をプライマーＭＭ110（配列番号160）およびＭＭ111とともにＰＣＲ反応に用いた。ＭＭ110の５′末端はＥｃｏＲＩサイトとＳｍａＩサイトを有し、それに続いてＩＬ−２の３′末端から５′末端方向への配列を提供している。ＭＭ111は位置75からＩＬ−２３′末端方向への配列を提供している。ＰＣＲ産物である400ｂｐの断片を前述の230ｂｐおよび118 ｂｐのＰＣＲ産物とともに保存し、プライマーＭＭ104およびＭＭ110を用いてＰＣＲ反応を行った。その結果生産された680ｂｐのＰＣＲ断片は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるＩＬ−２遺伝子を有ている。このＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢＳ−ＳＫ（Stratgene，La Jolla，CA）のＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトとの間に挿入し、ｐＲＷ956を構築した。プラスミドｐＲＷ956をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、Ｈ６プロモーターの支配下にあるＩＬ−２遺伝子を含む700ｂｐの断片を単離した。この断片をＣ３ベクタープラスミドｐＣＰ３ＬＳＡ−２（実施例18）のＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間に挿入した。構築したプラスミドｐＲＷ958はＣ３座内にＨ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子を含んでいる。供与体プラスミドｐＲＷ958とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ277を創出した。ｖＣＰ277はＨ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子をＣ３座内に有している。ヒトＩＬ−２のＮＹＶＡＣへの挿入先に定義したプラスミドｐＲＷ956をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、700ｂｐの断片を単離した。この断片はワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるヒトＩＬ−２遺伝子を有している。この断片をＮＹＶＡＣＴＫベクタープラスミドであるｐＳＤ542（実施例18）のＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に挿入した。構築したプラスミドｐＲＷ957はＨ６プロモーター支配下のＩＬ−２遺伝子をＴＫ座中に有している。供与体プラスミドｐＲＷ957とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えによって組み換えウイルスｖＰ1241を創出した。ｖＰ1241はＨ６プロモーター支配下のヒトＩＬ−２遺伝子をＴＫ座内に有している。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体によるヒトＩＬ−２の発現ＥＬＩＳＡアッセイＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＣＰ277およびｖＰ1241によって生産されたヒトＩＬ−２の発現レベルを、Col laborative Biomedical Products，Inc．（Becton Dickinson，Bedford,MA）より得られたヒトInterleukin−２ＥＬＩＳＡキットを用いて調べた。このキットはＩＬ−ＩＳＡ２（登録商標）Cat．No.30020であった。ヒトＨｅＬａ細胞（2×10⁶細胞/皿）の融合的な単層を含む皿を２つずつ、組み換えウイルスｖＣＰ277またはｖＰ1241に感染させるか、あるいは親株ウイルスであるＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣに感染させた。37℃で一晩保温した後、上清を回収し、ＩＬ− ＩＳＡ２ヒトInterleukin−２ＥＬＩＳＡキットを製造者（Collaborative B iomedical Products，Inc.，Becton Dickinson，Bedford，MA）の指示に従って用いてヒトＩＬ−２の発現を調べられた。ＩＬ−ＩＳＡ２キットをマルチ抗体サンドイッチ原理を用いた固相酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡプレートは 490nmで読んだ。ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣサンプルのバックグラウンドを差し引き、２つずつの皿の値平均をとった。ＩＬ−ＩＳＡ２キットでは、ヒトＩＬ−２をBiological Response Modifies Program（BRMP）単位で定量する（Gerr ard等，1993）。分泌されたヒトＩＬ−２の量をＢＲＭＰ単位／mlで示すが、これはＢＲＭＰ単位／10⁶細胞に等しい。（表24）実施例20−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのネズミＩＦＮγの挿入ネズミＩＦＮγのＡＬＶＡＣへの挿入プラスミドｐｍｓ10をＡＴＣＣより得た（＃63170）。プラスミドｐｍｓ10には、ｐＢＲ322のＰｓｔＩサイトにクローン化されたフランキング領域により全ネズミＩＦＮγをコードしている配列を取り囲むｃＤＮＡがある。プラスミドｐＭＰＩ３ＨはｐＵＣ８中にワクシニアＩ３Ｌプロモーター（Perk us等，1985;SchmittおよびStunnenberg，1988）を含んでいる。プラスミドｐＭＰＩ３Ｈは、プロモーター内のＨｐａＩサイトと下流ポリリンカー領域のあるサイトで分解して、外来遺伝子に連結したＩ３Ｌプロモーターの３′末端の下流領域を付加できるように設計されている。１３ＬプロモーターとネズミＩＦＮγ遺伝子の連結；ｐＭＰＩ３ｍＩＦの構築オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ607（配列番号161）およびＭＰＳＹＮ608（配列番号162）をプライマーとして、プラスミドｐｍｓ10をテンプレートとして用いたＰＣＲ反応によりＩ３Ｌプロモーターと連結したネズミＩＦＮγをコードしている配列を合成した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで切断し、510ｂｐの断片を単離し、ＨｐａＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰＩ３Ｈと連結した。配列の確認後、構築したプラスミドをｐＭＰＩ３ｍＩＦと命名した。Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットのＣ３座への挿入；ｐＭＰＣ３Ｉ３ｍＩＦの構築プラスミドｐＭＰＥ３ｍＩＦはＨｉｎｄIIIで切断し、E．coliポリメラーゼのクレノー断片により平滑末端化した。その後ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットを含む0.6ｋｂｐの断片を単離した。この断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＶＱＣ３ＬＳＡ−３と連結し、挿入プラスミドｐＭＰＣ３Ｉ３ｍＩＦを得た。Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγ発現カセットの塩基配列を第26図に示す（配列番号16 3）。ネズミＩＦγ遺伝子の開始コドンは位置101にあり、終止コドンは位置596 にある。プラスミドｐＶＱＣ３ＬＳＡ−３０以下の方法により構築した。ＡＬＶＡＣＣ３座挿入プラスミドＶＱＣＰ３Ｌ（実施例17）をＮｓｉＩおよびＮｏｔＩで消化し、6503ｂｐの断片を単離し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＣＰ34（配列番号151）およびＣＰ35（配列番号152）と連結され、プラスミドＶＱＣＰ３ＬＳＡ−３を構築し、（原注；プラスミドＶＱＣＰ３ＬＳＡ−３は、以降の実施例、例えば24，25，26で、用いられているプラスミドＶＱＣＰ３ＬＳＡ−５およびＶＱＣＰ３ＬＳＡと同一のものである）。供与体プラスミドｐＭＰＣ３Ｉ３ｍＩＦとレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ271を創出した。ｖＣＰ271はＩ３Ｌプロモーター支配下にあるネズミＩＮＦγ遺伝子をＣ３座内に有する。ネズミＩＦＮγのＮＹＶＡＣへの挿入Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットのＴＫ座への挿入；ｐＭＰＴＫＩ３ｍＩＦの構築以前に定義したプラスミドｐＭＰＩ３ＭＩＦを、ＨｉｎｄIIIで切断しE．co liポリメラーゼのクレノー断片により平滑末端化した。次いでＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットを含む0.6ｋｂｐの断片を単離した。この断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化したＮＹＶＡＣＴＫベクタープラスミドｐＳＤ542（実施例18）と連結し、挿入プラスミドｐＭＰＴＫＩ３ｍＩＦを構築した。供与体プラスミドｐＭＰＴＤＩ３ｍＩＦとレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1237を創出した。ｖＰ1237はＩ３Ｌプロモーター支配下のネズミＩＦＮγ遺伝子をＴＫ座内に有する。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体によるネズミＩＮＦγ の発現ＥＬＩＳＡアッセイＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＣＰ271およびｖＰ1237によって生産したネズミＩＦＮγの発現レベルを、Gen zyme Corporation（Cambrige,MA）のＥＬＩＳＡキット（InterTest-γキット、G enzyme Corporation，cat＃1557-00）を用いて定量した。ネズミＬ−929細胞（2 ×10⁶細胞／皿）の融合性の単層を含む皿２つずつを、ネズミＩＮＦγを発現する組み換えウイルスｖＣＰ271またはｖＰ1237に感染させたか、あるいは親株であるＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣウイルスに感染させた。37℃で一晩保温した後、上清を回収し、InterTest−γキットを製造者（Genzyme Corporation，Cambri dge，MA）の指示に従って用いて測定を行った。InterTest−γキットは、マルチ抗体サンドイッチ原理を利用した固相酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡプレートを490nmで読んだ。ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣサンプルからのバックグラウンドを差し引き、２つの皿の値の平均をとった。分泌されたネズミＩＦＮγの量をng／mlで現わす。これはng／10⁶細胞に等しい。（表25）生物学的アッセイＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体により発現されたネズミＩＮＦγの生物学的活性を、標準化したＩＦＮγバイオアッセイ（Vogel等，1991）を用いて定量した。このアッセイは、Ｌ−929細胞をＶＳＶ（vesicular stomatitis virus）に誘導された細胞変性効果（ＣＰＥ）から防御する活性を滴定することにより、ＩＦＮ活性を定量するものである。ネズミＬ−929細胞の融合性単相（2Ｘ10⁶細胞／皿）をＮＹＶＡＣ，ｖＰ1237 、ＡＬＶＡＣ，またはｖＣＰ271に、偽感染または感染多重度５で感染させた。皿は２つずつ接種した。１時間の吸着期間に続いて、１ｍｌの新しい培地をそれぞれの皿に加え、37℃で一晩保温した。両方の皿の上清を保存し、0.22μｍのフィルターを通して濾過し、以下に詳述するようにＩＦＮ活性を測定した。２倍ごとに希釈された上清を試験した。はじめは希釈されていない偽感染、ＮＹＶＡＣ感染、ＡＬＶＡＣ感染をテストするか、または100倍および1000倍に希釈したｖＣＰ27およびｖＰ1237感染のサンプルをテストした。ＩＦＮ−γバイオアッセイにおいて、96ウェルプレートの全てのウェルに50μ ｌの培地を加え、続いて50μｌの、市販のＩＦＮγ（Genzyme Corporation，MG- IFN,lot#3649）株の連続希釈物または上記上清の一連の希釈液をそれぞれのウェルに加えた。次いで、50μｌのＬ−929細胞（３×10⁴細胞）をおのおののウェルに加え、プレートを37℃で一晩保温した。24時間後、細胞を100μｌのＶＳＶ（感染多重度0.1）に感染させた。プレートを37℃で一晩保温した。24時間後、ＣＰＥを測定した。インターフェロンが存在しない状況下でのＶＳＶと同じＣＰＥを与えたウェルを１単位／ｍｌのインターフェロンを持つと定義した。この方法をインターフェロン標準ウェルについても同時に行った。上清中のインターフェロンの濃度を、１単位／ｍｌのインターフェロンのスタンダードと同程度のＣＰＥを示す希釈率の逆数で示す。偽感染細胞、ＮＹＶＡＣ感染細胞およびＡＬＶＡＣ感染細胞では20単位／ｍｌ未満のインターフェロンが生産された。ｖＰ1237感染細胞では14,000単位／ｍｌのＩＦＮγが生産され、ｖＣＰ271感染細胞では3,600単位／ｍｌのＩＦＮγが生産される。ｖＰ1237はｖＣＰ271の４倍多いレベルでＩＦＮγを生産したが、これは上述したＥＬＩＳＡアッセイの結果とよく一致していた。偽感染されたか、または親株ウイルスに感染した細胞からの上清で見られた防御の欠如から、ｖＰ1237およびｖＣＰ271に感染した細胞からの上清中の防御活性は、ＩＦＮγによるものであることが分かる。このことは中和アッセイによっても確認された。このことなら、ネズミＩＦＮ −α／βに対する抗血清（Lee Biomolecular Research，Inc.，San Diego，CA， No.25301，Lot.#89011）、またはネズミＩＮＦ−βに対する抗血清（Lee Biomol ecular Research，Inc.,No．25101，Lot,#87065）はこれらの組み換え体により生産された防御活性を中和できなかったが、ＩＦＮγに対する抗血清（Genzyme Corporation Monoclonal hamster anti-murine INFγ,1222-001,1ot#B3847）は中和できたことが分かった。実施例21 −ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのヒトＩＦＮγの挿入ＡＬＶＡＣへのヒトＩＦＮγの挿入プラスミドｐ52をＡＴＣＣより得た（No .65949）。プラスミドｐ52は、ヒトＩＦＮγをコードしている配列のカルボキシル末端側の３分の２、および翻訳されていない３′領域をコードしているＣＤＮＡをｐＢＲ322のＰｓｔＩサイトにクローン化したものを含んでいる。ヒトＩＦＮγ遺伝子のＩ３Ｌプロモーターとの連結；ｐＭＰＩ３ｈＩＦの構築（A）ヒトＩＦＮγ遺伝子の欠けている領域を、外来性テンプレートは用いずに、長い、重なっているＰＣＲプライマーＭＰＳＹＮ615（配列番号164）およびＭＰＳＹＮ616（配列番号165）を用いて合成した。ＭＰＳＹＮ615の末端は、ｐＭＰＩ３Ｈ（実施例20）のＨｐａＩサイトへのクローニングのために設計されている。ＭＰＳＹＮ615およびＭＰＳＹＮ616には25ｂｐの重なっている部分が存在している。179ｂｐのＰＣＲ産物を単離した。（B）ヒトＩＦＮγ遺伝子の残りをｐＣＲプライマーＭＰＳＹＮ617（配列番号 166）およびＭＰＳＹＮ618（配列番号167）をテンプレートとしてのプラスミドｐ52とともに用いて合成した。ＭＰＳＹＮ61 7には欠失している領域と重なる25ｂｐがある。ＭＰＳＹＮ618は、ｐＭＰＩ３Ｈの下流ＢａｍＨＩサイトにクローン化するために設計されている。その結果、約 350ｂｐのＰＣＲ断片を単離した。（A）および（B）において分離した断片、並びに外側のプライマーとしてＭＰＳＹＮ615およびＭＰＳＹＮ618を用いて（A＋B）を統合するためのＰＣＲを、行った。ＰＣＲ由来産物をＢａｍＨＩで消化し、約510ｂｐの断片を単離した。この断片をＨｐａＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰＩ３Ｈ中にクローン化した。配列の確認に続き、構築したプラスミドをｐＭＰＩ３ｈＩＦと命名した。ｐＭＰＩ３ｈＩＦはＩ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＩＦＮγ遺伝子を有している。Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮγカセットのＣ３座への挿入；ｐＭＰＣ３Ｉ３ｈＩＦの構築プラスミドｐＭＰＩ３ｈＩＦをＨｉｎｄIIIで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化した。ＤＮＡを続いてＢａｍＨＩで消化し、Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮγカセットを含む0.6ｋｂｐの断片を単離した。この断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断したＡＬＶＡＣＣ３ベクタープラスミドに連結し、ＡＬＶＡＣ挿入プラスミドｐＭＰＣ３Ｉ３ｈＩＦを構築した。Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮγ発現カセットの塩基配列（配列番号168）を第27図に示す。ヒトＩＦＮγ遺伝子の開始コドンは位置101にあり、終止コドンは位置599にある。供与体プラスミドｐＭＰＣ３ＩｈＩＦとレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ278を創出した。ｖＣＰ278はＩ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＩＦＮγ遺伝子をＣ３座内に有する。ＮＹＶＡＣへのヒトＩＦＮγの挿入Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮγカセットのＴＫ座への挿入；ｐＭＰＴＫＩ３ｈＩＦの構築前述のプラスミドｐＭＰＩ３ｈＩＦをＨｉｎｄIIIで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化した。ＤＮＡを続いてＢａｍＨＩで切断し、Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮγカセットを含む0.6ｋｂｐの断片を単離した。この断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化したベクタープラスミドｐＳＤ542（実施例1 8）に挿入し、ＮＹＶＡＣ挿入ベクタープラスミドｐＭＰＴＫＩ３ｈＩＦを構築した。供与体プラスミドｐＭＰＴＫＩ３ｈＩＦとレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1244を創出した。ｖＰ1244はワクシニアＩ３Ｌプロモーター支配下のヒトＩＦＮγ遺伝子をＴＫ座内に有する。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体によるヒトＩＦＮγの発現ＥＬＩＳＡアッセイＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＣＰ278およびｖＰ1244によって生産されたヒトＩＦＮγの発現のレベルを、ヒトインターフェロンγＥＬＩＳＡキット（Genzyme Corporation，Cambridge， MA，InterTest-γキット、cat＃1556-00）を用いて定量した。ヒトＨｅＬａ細胞（2×10⁶細胞／皿）の融合性単層を含む皿２つずつを、ヒトＩＦＮγを発現する組み換えウイルスｖＣＰ278またはｖＰ1244に感染させたか、あるいは親ウイルスのＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣに感染させた。37℃で一晩保温した後、上清は回収し、InterTest-γキットを製造者（Genzyme KCorporation，Cambridge，MA ）の指示通りに用いてヒトＩＦＮγの発現を測定した。InterTest-γキットは、マルチ抗体サンドイッチ原理を用いた、固相酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡプレートを490ｎｍで読んだ。ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣサンプルからのバックグラウンドを差し引いて、２つの皿の値の平均をとった。分泌されたヒトＩＮＦγの量を、ｎｇ／ｍｌで表す。これはｎｇ／10⁶細胞に相当する。（表26）実施例22−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのネズミＩＬ−２およびＩＦＮγの挿入ＡＬＶＡＣのＣ６座へのネズミＩＦＮγの挿入；ＡＬＶＡＣ−ネズミＩＬ−２組み換えウイルスの付加Ｃ６挿入ベクターの構築ＡＬＶＡＣＣ６挿入ベクターｐＣ６Ｌを以下のように構築した。Ｃ６ＯＲＦの全長を含んでいる3.0ｋｂのカナリアポックスＨｉｎｄIII断片を、ｐＢＳ−ＳＫ（Stratagene）のＨｉｎｄIIIサイト中にクローン化し、プラスミドｐＣ６ＨIII３ｋｂを形成した。ｐＣ６ＨIII３ｋｂ中のカナリアポックスインサートの塩基配列を第28図に示す（配列番号169）。第28図において、Ｃ６ＯＲＦは位置377と2254の間に位置している。ｐＣＨIII３ｋｂの右側のカナリアポックス配列の延長部分を、重なっているカナリアポックスのクローンの配列解析により得た。Ｃ６のＯＲＦが完全に取り除かれた状態でＣ６遺伝子座に外来遺伝子を挿入するための供与体プラスミドを構築するために、ＰＣＲプライマーおよびテンプレートとしてカナリアポックス染色体ＤＮＡを用いて隣接する５′側および３′側のアームを、合成した。380 ｂｐの５′側連結アームをプライマーＣ６Ａ１（配列番号170）およびＣ６Ｂ１（配列番号171）を用いて合成された。1155ｂｐの３′側連結アームを、プライマＣ６Ｃ１（配列番号172）およびＣ６ＤＩ（配列番号173）を用いて合成した。上述のように合成した右および左の連結アームを、Ｃ６Ａ１およびＣ６Ｄ１をプライマーに用いたＰＣＲにより結合し、1613ｂｐの全長の生産物を産出した。このＰＣＲ産物を両端でＳａｃＩ／ＫｐｎＩにより切断し、ＳａｃＩ／ＫｐｎＩで消化したプラスミドｐＢＳ−ＳＫ中にクローン化し、Ｃ６挿入プラスミドｐＣ６Ｌを構築した。ｐＣ６Ｌは、Ｃ６欠失座中に、翻訳終結コドンおよびＴ５ＮＴ転写終結配列（YuenおよびMoss，1986）に隣接したマルチクローニング領域を有している。ｐＣ６Ｌの塩基配列を第29図（配列番号174）に示す。第29図において、マルチクローニング領域は位置407と428の間にある。アニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＶＱＣ（配列番号175）およびＶＮ（配列番号176）をｐＢＳ−ＳＫに連結し、中間体プラスミドを生成した。プラスミドｐＭＭ117 はｐＣ６ＬのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩポリリンカーを置き換えるこの中間体プラスミドからのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩポリリンカー断片を有している。プラスミドｐＭＰ42ＧＰＴは、昆虫ポックスプロモーター（ＥＰＶ 42ＫＤａ）支配下にあるＥ．ｃｏｌｉ由来キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーセ遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ）（PrattおよびSubramani,1983）を有している。ｐＭＰ42ＧＰＴにおいて用いられた31ｂｐのＥＰＶ 42ＫＤａプロモーター配列は以下である（配列番号177）。 42ｋＤａ／ＥｃｏｇｐｔカセットのＣ６座への挿入；ｐＭＰ117ｇｐｔ−Ｂの構築プラスミドｐＭＰ42ＧＰＴをＥｃｏＲＩで切断し、42ｋＤａ／Ｅｃｏｇｐｔ発現カセットを含む0.7ｋｂｐの断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩで切断したベクタープラスミドｐＭＭ117に両方向から挿入し、ｐＭＰ117ｇｐｔ−ＡおよびｐＭＰ117ｇｐｔ−Ｂを生産した。Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットのＣ６座への挿入；ｐＭＰＣ６ｍＩＦｇｐｔの構築プラスミドｐＭＰＩ３ｍＩＦ（実施例20）をＨｉｎｄIIIで切断し、Ｅ．ｃｏｉｌポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化した。ＤＮＡを続いてＰｓｔＩで部分消化し、Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットを含む0.6ｋｂの断片単離した。ベクタープラスミドｐＭＰ117ｇｐｔ−ＢをＳｍａＩで部分消化し、全長の直線状ＤＮＡを単離した。これをＰｓｔＩで切断し、最大の断片を単離した。ベクターおよびインサート断片を連結し、挿入プラスミドｐＭＰＣ６ｍＩＦｇｐｔを生成した。Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγ発現カセットに加え、プラスミドｐＭＰＣ６ｍＩＦｇｐｔはミコフェノリン酸（mycophenolic acid）を使用することにより組み換え体の検索が可能になる42ＫＤａ／Ｅｃｏｇｐｔ発現カセットを有している（BoyleおよびCoupar，1988; FalknerおよびMoss，1988）。供与体プラスミドｐＭＰＣ６ｍＩＦｇｐｔとレスキューウイルスｖＣＰ275（実施例18）との間で組み換えを達成した。組み換えウイルスを、プラーク精製した。創出したＡＬＶＡＣをベースとした組み換えウイルスは、ワクシニアＩ３Ｌプロモーター支配下にあるネズミＩＦＮγ遺伝子と並びにＥＰＶ 42ＫＤａプロモーター支配下にあるＥｃｏｇｐｔ遺伝子をともにＣ６座内に、さらにワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるネズミＩＬ−２遺伝子をＣ３座内に有している。ネズミＩＦＮγおよびネズミＩＬ−２のＮＹＶＡＣの挿入Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットのＴＫ座への挿入；ｐＭＰＴＫｍ２ＩＦの構築プラスミドｐＭＰＩ３ｍＩＦ（実施例20）０ＨｉｎｄIIIで切断Ｄ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片により平滑末端化した。ＤＮＡを続いてＢａｍＨＩで切断し、Ｉ３Ｌ／ネズミＩＦＮγカセットを含む0.6ｋｂｐの断片を単離した。この断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断したベクタープラスミドｐＭＭ 154（実施例18）と連結し、挿入プラスミドｐＭＰＴＫｍ２ＩＦを構築した。供与体プラスミドｐＭＰＩＤｍ２ＩＦとレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1243を創出した。ｖＰ1243はワクシニアＩ３Ｌプロモーター支配下にあるネズミＩＦＮγ遺伝子はおよびワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるネズミＩＦＮγ遺伝子およびワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるネズミＩＬ−２遺伝子を、ともにＴＫ座内に有する。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体によるネズミＩＬ−２の発現：ネズミＩＬ−２およびネズミＩＦＮγを共発現する組み換え体との比較ＥＬＩＳＡアッセイＡＬＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＣＰ275およびｖＣＰ288、並びにＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＰ1239およびｖＰ124 3により生産されたネズミＩＬ−２の発現レベルをネズミインターロイキン−２ＥＬＩＳＡキット（ネズミＩＬ−2ELISAキット，cat．No．30032，Collaborativ e Biomedical Products，Inc.，Becton Dickinson，Bedford，MA）を用いて定量した。ネズミＬ929細胞（2×10⁶細胞／皿）の融合性単層を含む皿２つずつを、ネズミＩＬ−２を発現する組み換えウイルスｖＣＰ275またはｖＰ1239、またはネズミＩＬ−２を共発現する組み換えウイルスｖＣＰ288またはｖＰ1243に感染させるか、あるいは親ウイルスＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣに感染させた。37℃ で一晩保温した後、上清を回収し、ネズミインターオイキン−２ＥＬＥＳＡキットを製造者（Collaborative Biomedical Products，Inc.，Becton Dickinson，B edford，MA）の指示通りに用いて測定した。ネズミインターロイキン−２ＥＬＩＳＡは、マルチ抗体サンドイッチ原理を利用した固相酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡプレートを490ｎｍで読んだ。ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣサンプルからのバックグラウンドを差し引きし、２つずつの皿の値の平均をとった。ネズミインターロイキン−２ＥＬＩＳＡキットを用いてBiological Response Modifi ers Program（BPMP）単位でネズミＩＬ−２を定量する（Gerrard等,1993）。分泌されたネズミＩＬ−２の量をＢＲＭＰ単位／ｍｌで示す。これは、ＢＲＭＰ単位／10⁶細胞に等しい（表27）。表27に示した結果から、ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体によるネズミＩＬ−２の発現レベルは、ネズミＩＦＮγの共発現の影響を受けていないことは明白である。この測定条件においては、ＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体のネズミＩＬ−２の発現レベルはＡＬＶＡＣをベースとした組み換え体の発現レベルの約２倍である。これは、表23中に示した、別のネズミＩＬ−２ＥＬＩＳＡアッセイ（InterTest-2X,Genzyme Corporation,Cambridge，MA）の結果とよく一致していた。実施例23 −ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのヒトＩＬ−２およびＩＦＮγの挿入ＡＬＶＡＣのＣ６座へのヒトＩＦＮγの挿入；ＡＬＶＡＣ／ヒトＩＬ−２組み換えウイルスへの付加Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＬγカセットのＣ６座への挿入；ｐＭＰＣ６Ｅ３ｈＩＦの構築プラスミドｐＭＰＩ３ｈＩＦ（実施例21）をＨｉｎｄIIIで切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片で平滑末端化した。ＤＮＡを続いてＢａｍＨＩで切断し、Ｉ３Ｌ／ヒトＩＦＮカセットを含む0.6ｋｂｐの断片を単離した。ＡＬＶＡＣＣ６ベクタープラスミドｐＭＭ117（実施例22）をＢａｍＨＩで部分消化しかつＳｍａＩで完全消化し、最大の断片を単離した。これらの断片を連結し、挿入プラスミドｐＭＰＣ６Ｉ３ｈＩＦを構築した。供与体プラスミドｐＭＰＣ６Ｉ３ｈＩＦとレスキューウイルスｖＣＰ277（実施例19）との間で組み換えを行った。組み換え体をプラーク精製した。創出したＡＬＶＡＣをベースとした組み換えウイルスは、ワクシニアＩ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＩＦＮγ遺伝子をＣ６座内に有し、かつワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるヒトＩＬ−２遺伝子をＣ３座内に有している（ｖＣＰ277＋ＩＦＮγ）．ヒトＩＦＮγおよびＩＬ−２のＮＹＶＡＣへの挿入Ｈ６／ヒトＩＬ−２カセットのＴＫ座への挿入；ｐＭＰＴＫ２ｈＩＦの構築プラスミドｐＭＰＴＫＩ３ｈＩＦ（実施例21）をＰｓｔＩで切断し、エビアルカリホスファターゼで処理した。プラスミドｐＲＷ858（実施例19）をＰｓｔＩで切断し、700ｂｐの断片を単離した。ホスファターゼ処理したベクターとインサート断片を連結し、プラスミドｐＭＰＴＫ２ｈＩＦ０構築した。ｐＭＰＴＫ２ｈＩＦ中において、２つのヒトサイトカイン遺伝子カセットは、ＮＹＶＡＣのＴＫ挿入サイト内にともに存在し、尾部と尾部が結合した形で方向づけられている。ヒトＩＦＮγ遺伝子はワクシニアＩ３Ｌプロモーターの支配下にあり、ヒトＩＬ−２遺伝子はワクシニアＨ６プロモーターの支配下にある。供与体プラスミドｐＭＰＴＫｈ２ＩＦおよびレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間で組み換えを行った。組み換え体をプラーク精製する。創出したＮＹＶＡＣベースの組み換えウイルスはワクシニアＩ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＩＦＮ遺伝子およびワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるヒトＩＬ−２遺伝子を共にＩＫ座内に有していル（ＮＹＶＡＣ＋ＩＦＮγ＋ＩＬ−２）。実施例24 −ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのネズミＩＬ−４の挿入ＡＬＶＡＣへのネズミＩＬ−４の挿入プラスミドｐ２Ａ−Ｅ３はネズミＩＬ −４遺伝子を有しており、American Type Culture Collectionより得た（ATCC N o．37561）。ネズミＩＬ−４遺伝子を以下に記述するように、ＰＣＲによりワクシニアＥ３Ｌプロモーターの支配下へおいた。ワクシニアＥ３Ｌプロモーターは、強力な早期（early）プロモーターであり、ワクシニアＥ３Ｌ読み取り枠ＯＲＦの直前に位置している（Goebel等，1990）。Ｅ３Ｌ／ネズミＩＬ−４発現カセットの塩基配列を第30図に示す（配列番号17 8）。第30図においては、ネズミＩＬ−４遺伝子の開始コドンはヌクレオチド位置68にあり、終始コドンは、ヌクレオチド位置488にある。ネズミＩＬ−４遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマーＭＩＬ45（配列番号 179）およびＭＩＬ43（配列番号180）並びにテンプレートとしてプラスミドｐ２Ａ−Ｅ３（ATCC）を用いたＰＣＲにより増幅した。生産された断片は、ワクシニアＥ３Ｌプロモーターに連結したネズミＩＬ−４遺伝子、並びにそれに隣接したＸｍａＩ／ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩサイトおよびＸｈｏＩ／ＢｇｌII／ＢａｍＨＩサイトをそれぞれ５′末端および３′ 末端に有していた。増幅したＥ３Ｌ／ネズミＩＬＬ−４断片をＸｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ＸｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＶＱＣＰ３ＬＳＡ−５ベクター断片に連結した。プラスミドｐＶＱＣＰ３ＬＳＡ−５（実施例20中のＶＱＣＰ３ＬＳＡ−３と同じもの）は、ＡＬＶＡＣＣ３座挿入プラスミドである。構築シたＣ３供与体プラスミドをｐＣ３．ＭＩＬ4.2と命名した。昆虫ポック４２kDa プロモーターに連結したＥ．ｃｏｌｉｇｐｔ遺伝子を含む発現カセットを、プラスミドｐＭＰ42ＧＰＴ（実施例22）よりＳｍａＩ断片として単離し、ＳｍａＩで消化したｐＣ３．ＭＩＬ４．２ベクター断片中にクローン化した。生成したプラスミドをｐＣ３ＭＩＬ４．ｇｐｔと命名した。供与体プラスミドｐＣ３ＭＩＬ４．ｇｐｔとレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えを、ミコフェノリン酸選択システムを用いて行った（実施例22）。組み換えウイルスはプラーク精製する。生成した組み換えウイルスは、ＥＰＶ 42ｋＤａプロモーターの支配下にあるＥｃｏｇｐｔ遺伝子と同様に、ワクシニアＥ３Ｌプロモーターの支配下にあるネズミＩＬ−４遺伝子を共にＡＬＶＡＣのＣ３座内に有する。ネズミＩＬ４のＮＹＶＡＣへの挿入ネズミＩＬ−４遺伝子を、プライマーとしてＭＩＬ45（配列番号179）およびＭＩＬ43（配列番号180）を、並びにテンプレートとしてプラスミドｐ２Ａ−Ｅ３（ＡＴＣＣ）を用いたＰＣＲにより増幅した。生産した断片は５′および３′末端に、ワクシニアＥ３Ｌプロモーターの支配下にあるネズミＩＬ−４とそれに隣接したＸｍａＩ／ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ／ＢｇｌII／ＢａｍＨＩサイトをそれぞれ５′および３′末端に有していた。増幅したＥ３Ｌ／ネズミＩＬ−４断片をＸｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化した。ＮＹＶＡＣＴＫ挿入プラスミドであるｐＳＤ542（実施例18）をＸｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＸｍａＩ／ＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ断片と連結した。このように構築したＴＫ供与体プラスミドをｐＴＫ−ｍＩＬ４と命名した。供与体プラスミドｐＴＫ−ｍＩＬ４とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、ワクシニアＥ３Ｌプロモーターの支配下にあるネズミＩＬ−４遺伝子をＴＫ座内に有する組み換えウイルスｖＰ1248を創出した。実施例25 −ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへのヒトＩＬ−４の挿入ヒトＩＬ−４のＡＬＶＡＣへの挿入プラスミドｐｃＤ−ｈＩＬ−４は、ヒトＩＬ−４遺伝子を有しており、American Type Cultire Collectionより得られた（ATCC No．57593）。ＰＣＲ断片ＰＣＲｈＩＬ４−Ｉは、プラスミドｐｃＤ−ｈＩＬ−４をテンプレートとして、合成オリゴヌクレオチドＥ３ＬＩＬ４−Ｃ（配列番号181）およびＥ３ＬＩＬ４−Ｄ（配列番号182）をプライマーとして合成した。オリゴヌクレオチドＥ３ＬＩＬ４−Ａ（配列番号183）およびＥ３ＬＩＬ４−Ｂ（配列番号184）を、アニーリングし、ワクシニアＥ３Ｌプロモーター配列を含む断片IIを生成した（実施例24）。第２の融合ＰＣＲ産物（ＰＣＲｈＩＬ４−ＩＩ）は、ＰＣＲ断片ＰＣＲｈＩＬ４−Ｉ、および断片II（アニーリングシたオリゴヌクレオチド）をＤＮＡテンプレートとして、Ｅ３ＬＩＬ−４−ＤおよびＥ３ＬＩＬ４−Ｅ（配列番号185）をプライマーとして用いて得た。ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩによるＰＣＲｈＩＬ４ −IIの完全消化により、536ｂｐの断片を構築し、これを続いて単離した。ｐＢＳ−ＳＫ⁺（Stratagene）をＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで完全消化し、2.9ｋｂｐの断片を単離した。単離した断片をともに連結し、プラスミドｐＢＳｈＩＬ４を生成した。第31図は（配列番号186）Ｅ３Ｌプロモーター支配にあるヒトＩＬ−４遺伝子からなる発現カセットの塩基配列を示している。ヒトＩＬ−４遺伝子の開始コドンはヌクレオチド位置６２にあり、終止コドンはヌクレオチド位置５２１に存在する。プラスミドｐＢＳｈＩＬ４をＸｂａＩにより完全消化した。E．Coliポリメラーゼのクレノー断片を用いて末端を平滑化した。この線状化されたプラスミドを続いてＸｈｏＩにより消化し、Ｅ３ＬプロモーターおよびヒトＩＬ４遺伝子を含む536ｂｐの断片を単離した。Ｃ３挿入ベクタープラスミドＶＱＣＰ３ＬＳＡ（実施例20のｐＶＱＣＰ３ＬＳＡ−３と同一）をＸｈｏＩ／ＳｍａＩで完全消化し、6.5ｋｂの断片を分離した。単離した断片をともに連結し、挿入プラスミドｐＣ３ｈＩＬ４を構築した。供与体プラスミドｐＣ３ＩＬ４とレスキューウイルＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ290を創出した。ｖＣＰ290はＣ３座内に、ワクシニアＥ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＩＬ−４遺伝子を有している。ＮＹＶＡＣへのヒトＩＬ−４の挿入プラスミドｐＢＳｈＩＬ４（前出）はＥ３Ｌ／ヒトＩＬ−４発現カセットをｐＢＳ−ＳＫ中に含んでいる。プラスミドｐＢＳｈＩＬ４をＸｂａＩで完全消化した。E．Coliポリメラーゼのクレノー断片を用いて末端を平滑化した。この線状化されたプラスミドを続いてＸｈｏＩで切断し、Ｅ３ＬプロモーターおよびヒトＩＬ−４遺伝子を含む、５３６ｂｐの断片を単離した。ＮＹＶＡＣＴＫ挿入ベクタープラスミドｐＳＤ542（実施例18）をＸｈｏＩ／ＳｍａＩで完全消化し、3.9ｋｂｐの断片を単離した。単離した断片をともに連結し、挿入プラスミドｐＴＫｈＩＬ−４を構築した。供与体プラスミドｐＴＫｈＩＬ４とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1250を創出した。ｖＰ1250はワクシニアＥ３Ｌプロモーターの支配下にあるヒトＩＬ−４遺伝子をＴＫ座内に有している。実施例26 −ヒトＧＭＣＳＦのＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへの挿入ヒトＧＭＣＳＦのＡＬＶＡＣへの挿入プラスミドＧＭＣＳＦは、ヒト白血球 −マクロファージコロニー刺激因子（human granulocyto-macrophage colony-st imulating factor; hGMCSF）をコードしている遺伝子を含み、American Type Cu lture Collectionより得た（ATCC No．39754）。プラスミドＧＭＣＳＦをテンプレートＤＮＡとして、Ｅ３ＬＧＭＣ−Ａ（配列番号187）およびＥ３ＬＧＭＣ−Ｂ（配列番号188）をオリゴヌクレオチドプライマーとして用い、ＰＣＲ断片ＧＭＣＳＦ−１を合成した。合成オリゴヌクレオチドＥ３ＬＳＭＡ−Ｂ（配列番号189）およびＥ３ＬＩＬ４−Ｂ（配列番号184；実施例25）をアニーリングして、ワクシニアＥ３Ｌプロモーター配列を含むＧＭＣＳＦ−Ｐ断片を生成した。断片ＧＭＣＳＦ−Ｉおよび断片ＧＭＣＳＦ−ＰをＤＮＡテンプレートとして、またＥ３ＬＳＭＡ−Ａ（配列番号190）およびＥ３ＬＧＭＣ−Ｂをオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、融合ＰＣＲ生産物（ＧＭＣＳＦ−II）を合成した。ＸｈｏＩ／ＳｍａＩによりＧＭＣＳＦ−IIを完全消化して0.5kbの断片を生成した。続いてこの0.5ｋｂｐの断片を単離した。ｐＢＳ−ＳＫ⁺をＸｈｏＩ／ＳｍａＩにより完全消化し、2.9ｋｂｐの断片を単離した。単離した断片をともに連結し、ワクシニアＥ３Ｌ／ｈＧＭＣＳＦ発現カセットを含むプラスミドｐＢＳＧＭＣＳＦを構築した。ワクシニアＥ３Ｌ／ｈＧＭＣＳＦ発現カセットの塩基配列を第32図に示す（配列番号191）。第32図において、ｈＧＭＣＳＦの開始コドンはヌクレオチド位置6 2にあり、終止コドンはヌクレオチド位置494にある。ｐＢＳＧＭＣＳＦ（前出）をＸｈｏＩ／ＳｍａＩにより完全消化し、ワクシニアＥ３ＬプロモーターおよびｈＧＭＣＳＦ遺伝子を含む0.5ｋｂｐの断片を単離した。ＡＬＶＡＣＣ３挿入プラスミドＶＱＣＰ３ＬＳＡ（実施例20）をＸｈｏＩ／ＳｍａＩで完全消化し、6.5ｋｂｐの断片を単離した。単離した断片をともに連結しプラスミドｐＣ３ｈＧＭＣＳＦを得た。供与体プラスミドｐＣ３ｈＧＭＣＳＦとレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ285を創出した。ｖＣＰ285は、ワクシニアＥ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＧＭＣＳＦ遺伝子をＣ３座内に有している。ヒトＧＭＣＳＦのＮＹＶＡＣへの挿入ｐＢＳＧＭＣＳＦをＸｈｏＩ／ＳｍａＩにより完全消化し、ワクシニアＥ３ＬプロモーターおよびｈＧＭＣＳＦ遺伝子を含む0.5ｋｂｐ断片を単離した。ｐＳＤ542（実施例18）をＸｈｏＩ／ＳｍａＩで完全消化し、3.9ｋｂｐの断片を単離した。単離した断片をともに連結し、プラスミドｐＴＫｈＧＭＣＳＦを得た。供与体プラスミドｐＴＫｈＧＭＣＳＦとレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換え体ウイルスｖＰ1246を創出した。ｖＰ1246は、ワクシニアＥ３Ｌプロモーター支配下にあるヒトＧＭＣＳに遺伝子をＴＫ座内に有している。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体によるヒトＧＭＣＳＦの発現ＥＬＩＳＡアッセイＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＣＰ285およびｖＰ1246によって生産されたヒトＧＭＣＳＦの発現レベルを、G enzyme Corporation（Cambridge，MA）のＥＬＩＳＡキット（Factor-TestヒトＧＭ−ＣＳＦＥＬＩＳＡキット、Genzyme Corporation，product code GM-TE）を用いて定量Ｄた。ヒトＨｅｌａ細胞の融合性の単層を含む皿２つずつ（２×10⁶ 細胞１皿）をヒトＧＭＣＳＦを発現する組み換えウイルスｖＣＰ285またはｖＰ1 246に感染させるか、あるいは親株ウイルスのＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣに感染させた。37℃での一晩の保温後に、上清を回収し、Factor-TestヒトＧＭ−ＣＳＦＥＬＩＳＡキットを製造者（Genzyme Corporation，Cambridge，MA）の指示通りに用いて、ヒトＧＭＣＳＦの発現について測定した。Factor-TestヒトＧＭ−ＣＳＦＥＬＩＳＡキットは、マルチ抗体サンドイッチ原理を利用した固相酵素免疫アッセイである。ＥＬＩＳＡプレートを490nmで読んだ。ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣサンプルからのバックグラウンドを差し引き、２つの皿から得られた値の平均をとった。分泌されたヒトＧＭＣＳＦの量はｐｇ／ｍｌで示す。これはｐｇ／10⁶細胞と等しいものである（表28）。実施例27−ヒトＩＬ−１２のＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへの挿入ヒトＩＬ−12遺伝子の二つのサブユニットをコードしているＤＮＡの作成ＥＢＶで形質転換されたヒト細胞系統ＧＪＢＣＬを、100ｎＭフォーボール12 、13−ジブチレートで24時間刺激し、そこから全ＲＮＡを単離した。単離した全ＲＮＡに対し、最初のｃＤＮＡ鎖合成を行った。ｐ35サブユニットをコードしている遺伝子とｐ40サブユニット（後述）をコードしている遺伝子を増幅するためのＰＣＲに用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは、公表されたヒトＩＬ− 12配列（Gubler等，1991）に基づくものであった。オリゴヌクレオチドＪＰ202（配列番号192）およびＪＰ189（配列番号193）をプライマーとして、細胞系統ＧＪＢＣＬ由来の最初のｃＤＮＡ鎖をテンプレートとして用いて、ヒトＩＬ−12遺伝子のｐ40サブユニット（ｈＩＬ12ｐ40）を、ＰＣＲ断片であるＰＣＲＪ60として得た。ＰＣＲＪ60をＳａｃＩ／ＣｌａＩで切断し、1.0ｋｂｐの断片を単離し、ＳａｃＩ／ＣｌａＩで切断したｐＢＳＳＫ＋（Stratagene）と連結し、プラスミドＰＢＳＨＩＬ12ｐ40IIを生成した。プラスミドＰＢＳＨＩＬ12ｐ40II中で、ｈＩＬ12ｐ40は昆虫ポックス42ｋＤａプロモーターの支配下にある（実施例22）。ＥＰＶ 42ｋＤａ／ヒトＩＬ−12 Ｐ40発現カセットの塩基配列を第33図に示す（配列番号194）。第33図中において、ヒトＩＬ−12 Ｐ40サブユニットの開始コドンはヌクレオチド位置32、終止コドンはヌクレオチド位置1017にある。ヒトＩＬ−12の遺伝子ｐ35サブユニット（ｈＩＬ12ｐ35）を、オリゴヌクレオチドＪＰ186（配列番号195）およびＪＰ201（配列番号196）をプライマーとして、細胞系統ＧＪＢＣＬ由来の最初のｃＤＮＡ鎖をテンプレートとして用いて、ＰＣＲ断片であるＰＣＲＪ59として得た。ＰＣＲＪ59をＡｓｐ 718／ＣｌａＩにより切断し、0.7ｋｂｐの断片を単離しｐＢＳＳＫ⁺（St ratagene）と連結し、プラスミドＰＧ２を構築した。プラスミドＰＧ２をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＪＰ218（配列番号197）およびＪＰ220（配列番号198）をテンプレートとして用いたＰＣＲ反応により、ｈＩＬ12ｐ35遺伝子をワクシニアＥ３Ｌプロモーター（実施例24）の支配下においた。生じた断片ＰＣＲＪ62 をＡｓｐ718／ＣｌａＩで切断し、0.7ｋｂｐの断片を単離し、ｐＢＳＳＫ⁺（str atagene）と連結し、プラスミドＰＢＳＨＩＬ12ｐ35IIを生成した。ワクシニアＥ３Ｌ／ヒトＩＬ−12 Ｐ35発現カセットの塩基配列を第34図中に示す（配列番号199）。第34図中においては、ヒトＩＬ−12 Ｐ35サブユニットの開始コドンはヌクレオチド位置62に存在し、終止コドンはヌクレオチド位置71 9に存在する。ＰＢＳＨＩＬ12ｐ35II由来の0.7ｋｂｐのＡｓｐ178／ＣｌａＩ断片およびＰＢＳＨＩＬ12p40II由来の1.0ｋｂのＡｓｐ718／ＳａｃＩ断片を、ＳａｃＩ／ＣｌａＩで切断されたｐＢＳＳＫ⁺中に連結することにより、ヒトＩＬ−12の両方のサブユニット部分のポックスウイルスプロモーターの支配下にある遺伝子を含むカセットを、ｐＢＳＳＫ⁺内に集めた。構築したプラスミドをＰＢＳＨＩＬ12と命名した。ＰＢＳＨＩＬ12において、ＥＰＶ 42ｋＤａ／ｈＩＬ12ｐ40カセットおよびワクシニアＥ３Ｌ／ｈＩＬ12ｐ35カセットは、頭部と頭部を互いに向けあう方向で位置づけられている。ヒトＩＬ−12のＡＬＶＡＣへの挿入ポックスウイルスプロモーターに支配された、ヒトＩＬ−12の両方のサブユニットの遺伝子を含むカセットの組み合わせを、プラスミドＰＢＳＨＩＬ12より1.7ｋｂｐのＳａｃＩ／ＣｌａＩ断片として切り出した。断片をE.Coliポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑末端化し、ＳｍａＩで切断されたＡＬＶＡＣＣ６ベクタープラスミドｐＣ６Ｌ（実施例22 ）中にクローン化した。生成されたプラスミドをｐＣ６ＨＩＬ12と命名した。供与体プラスミドｐＣ６ＨＩＬ12とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間で組み換えを行った。組み換えウイルスをプラーク精製する。創出された組み換えウイルス（ＡＬＶＡＣ＋ＩＬ−12）はヒトＩＬ−12の遺伝子の両方を、ＡＬＶＡＣのＣ６座内に有している。ヒトＩｌ−12のＮＹＶＡＣへの挿入ポックスウイルスプロモーターに支配された、ヒトＩＬ−12の両方のサブユニットの遺伝子を含むカセットの組み合わせを、プラスミドＰＢＳＨＩＬ12より1.7ｋｂｐのＳａｃＩ／ＣｌａＩ断片として切り出した。断片をE.Coliポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑末端化し、ＳｍａＩで切断されたＮＹＶＡＫＴＫベクタープラスミドｐＳＤ524（実施例18）中にクローン化した。生成したプラスミドをｐＴＫＨＩＬ12と命名した。供与体プラスミドｐＴＫＨＩＬ12とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間で組み換えを行った。組み換えウイルスをプラーク精製する。創出された組み換えウイルス（ＮＹＶＡＣ＋ＩＬ−１２）はヒトＩＬ−12の遺伝子の両方を、ＮＹＶＡＣのＴＫ座内に有している。実施例28 −ネズミＢ７のＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへの挿入ネズミＢ７のＡＬＶＡＣへの挿入：ネズミＢ７のためのｃＤＮＡの調整手を加えられていないＢａｌｂ／ｃネズミすい臓由来のマクロファージをコンカナバリンＡおよびＬＰＳにより生体外で刺激した。これらの細胞からの全ＲＮＡを、オリゴｄＴをプライマーとして用いた逆転写による最初のｃＤＮＡ鎖合成にテンプレートとして用いた。調整した最初のｃＤＮＡ鎖の一部を、プライマーＬＦ32 （配列番号200）およびＬＦ33（配列番号201）を用いた特異的なネズミＢ７ＤＮＡのＰＣＲによる増幅に用いた。特異的プライマーＬＦ32およびＬＦ33をネズミＢ７の公表された配列（Freeman等，1991）に基づいて作成した。ＬＦ32のＡＴＧの５′側の部分はワクシニアＨ６プロモーターに相当している（Perkus等，1989）。増幅されたネズミＢ７遺伝子を含む951 ｂｐの増幅されたｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、続いてプラスミドｐＢＳＳＫ⁺（Stratagene）の対応するサイト内へクローン化した。生成したプラスミドｐＬＦ１をＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーターの一部とネズミＢ７遺伝子の全長を含む949ｂｐの断片を単離した。プラスミドｐＭＰＣ616 Ｅ６は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にある無関係な遺伝子（non relevant gene）をＡＬＶＡＣＣ６挿入座中に有している。プラスミドｐＭＰＣ616 Ｅ６をＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＡＬＶＡＣＣ６挿入座内にＨ６プロモーターの大部分を有する4403ｂｐの断片を単離した。このベクター断片を、ｐＬＦ１由来のＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ断片と連結した。生成したプラスミドをｐＬＦ４と命名した。ネズミＢ７遺伝子の塩基配列を第35図（配列番号202）に示す。第35図において、ネズミＢ７遺伝子の開始コドンはヌクレオチド位置１にあり、終止コドンはヌクレオチド位置919にある。供与体プラスミドｐＬＦ４とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ268を創出した。ｖＣＰ268はワクシニア16プロモーター支配下にあるネズミＢ７遺伝子をＣ６座内に有している。ネズミＢ７のＮＹＶＡＣへの挿入プラスミドｐＳＩＶ12は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にある無関係な遺伝子（non relevant gene）をＮＹＶＡＣＩ４Ｌ挿入座内に有している。プラスミドｐＳＩＶ12をＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＮＹＶＡＣＩ４Ｌ挿入座にＨ６プロモーターの大部分を含んでいる 3557ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｈｏＩ断片を単離した。この断片を内部にＨｉｎｄIII サイトを有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＬＦ57（配列番号20 3）およびＬＦ58（配列番号204）と連結した。作成したプラスミドｐＬＦ２をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、3659ｂｐのベクター断片を単離した。プラスミドｐＬＦ１（前記）をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ワクシニア配列の一部とネズミＢ７遺伝子の全長を含む951ｂｐのＮｒｕＩ／ＨｉｎｄIII断片を単離した。これらの２つの断片を連結し、プラスミドｐＬＦ３を生成した。プラスミドｐＬＦ３は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるネズミＢ７遺伝子をコードしている配列を有するＮＹＶＡＣＩ４Ｌ供与体プラスミドに相当する。供与体プラスミドｐＬＦ３とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1230を創出した。ｖＰ1230はワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるネズミＢ７遺伝子をＩ４Ｌ座内に有している。ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした、ネズミＢ７を発現する組み換え体に感染したネズミ腫瘍細胞におけるＢ７の表面発現Ｋ1735ネズミメラノーマ細胞およびＣＣ−36ネズミ結腸メラノーマ細胞に、10 ｐｆｕ／細胞のＮＹＶＡＣ−Ｂ７（ｖＰ1230）またはＡＬＶＡＣ−Ｂ７（ｖＣＰ 268）、あるいは親株ウイルスであるＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣに１時間感染させ、吸着されなかったウイルスを遠心分離によって除き、37℃で保温した。Ｂ 16ネズミメラノーマ細胞もまた、細胞を５ｐｆｕ／細胞のウイルスに感染させたことを除いて、同様に処理した。１時間（Ｋ1735）あるいは一晩（ｃｃ−36；Ｂ 16）の保温後、細胞をＰＢＳバッファー中で洗浄され、遠心分離され、1.0ｍｌのＰＢＳバッファー中に再懸濁された。各々の細胞標品に、１：５に希釈されたＦｃＢｌｏｃｋ（Pharmingen,San Diego，CA，cat．01241A; 精製された抗ネズミＦｃγII受容体）溶液を0.005ｍｌ、および１：100に希釈されたＦＩＴＣ−ラット抗ネズミＢ７モノクローナル抗体（Pharmingen，cat．91944D）溶液を0.1ｍｌ加えた。細胞を４℃で30分間保温し、冷たいＰＢＳバッファー中で遠心分離により２回洗浄し、細胞関連ＦＩＴＣ蛍光についてフロー血球計算（flow cyt ometry;Becton-Dickinson FACScan）により分析した。ＮＹＶＡＣ−Ｂ７（ｖＰ1230）またはＡＬＶＡＣ−Ｂ７（ｖＣＰ268）に一時間感染させたＫ1735細胞は、対照である、感染させてないか、またはＮＹＶＡＣもしくはＡＬＶＡＣを感染させた細胞と比較してわずかに強い蛍光を示したに、組み換え体が感染したＣＣ−36およびＢ16細胞中でのＢ７の発現は顕著であった（第３６図）。感染していない細胞によって示された通り、３種類の細胞系統はいずれも内因性のネズミＢ７を発現しない。確立されたネズミ腫瘍細胞系にＮＹＶＡＣ−Ｂ７（ｖＰ1230）またはＡＬＶＡＣ−Ｂ７を感染させると、ネズミＴリンパ球の共活性化剤分子であるＢＢ−１／Ｂ７は高レベルで発現するが、ベクターＮＹＶＡＣあるいはＡＬＶＡＣでは発現しないことが明らかとなった。実施例29 −ヒトＢ７のＮＹＶＡＣへの挿入ヒトＢ７のためのｃＤＮＡの調製ヒト末梢血由来のマクロファージを、コンカナバリンＡおよびＬＰＳにより生体外で刺激した。これらの細胞由来の全ＲＮＡを、オリゴｄＴをプライマーとして用いた逆転写による、最初のｃＤＮＡ鎖の合成に用いた。調整した最初のｃＤＮＡ鎖の一部が、ＬＦ62（配列番号205）およびＬＦ61ｂｉｓ（配列番号206）をプライマーとして用いたＰＣＲによりヒトＢ７ｃＤＮＡの特異的合成に用いた。特異的プライマーＬＦ62およびＬＦ61ｂｉｓを、公表されたヒトＢ７配列（Fr eeman等，1989）に基づいて作成した。ＬＦ61ｂｉｓ中のＡＴＧの５′側部分の塩基配列はワクシニアＨ６プロモーター（Perkus等，1989）の一部と一致している。ネズミＢ７遺伝子を含んでいる増幅された997ｂｐのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIにより消化し、続いてプラスミドｐＢＳＳＫ⁺（Stratage ne）の対応するサイトにクローン化した。このプラスミドをｐＬＦ６と命名した。ヒトＢ７遺伝子の塩基配列を第37図中に示す（配列番号207）。第37図中で、ヒトＢ７遺伝子の開始コドンはヌクレオチド位置１であり、終止コドンはヌクレオチド位置865である。ヒトＢ７のＮＹＶＡＣへの挿入プラスミドｐＬＦ３（実施例28）をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、Ｈ６プロモーターの大部分をＮＹＶＡＣＩ４Ｌ挿入座内に有している3652ｂｐのベクター断片を単離した。プラスミドｐＬＦ６（上記）をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄIIIにより消化し、ワクシニアＨ６プロモーターの一部とヒトＢ７遺伝子の全長を有する897ｂｐの断片を単離した。これら２つの断片を連結し、プラスミドｐＬＦ７を得た。プラスミｐＬＦ７はドワクシニアＨ６プロモーターの支配下にあるヒトＢ７をコードしている配列の全長を有するＩ４ＬＮＹＶＡＣ供与体プラスミドに相当する。供与体プラスミドｐＬＦ７とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換え体ウイルスｖＰ1245を創出した。ｖＰ1245はワクシニアＨ６プロモーターの支配下にあるヒトＢ７遺伝子をＩ４Ｌ座内に有している。ヒトＢ７の発現ＦＡＣスキャン（Scan）ヒトＨｅｌａ細胞をヒトＢ７ウイルスを発現する組み換えウイルスｖＰ1245または親株ウイルスに感染させた。実施例28に記述されたように、ヒトＢ７特異的モノクローナル抗体（Anti-BBl(B7)，Cat．No．55002 4，Becton Dickinson Advanced Cellular Biology，SanJose，CA）を用いてフロー血球計数（flow cytometry; Becton Dickinson FACScan）により感染した細胞の表面のヒトＢ７の発現を検出した。Ｂ７は、組み換えウイルスｖＰ1245に感染した細胞の表面に検出された。感染していない細胞および親株ウイルスＮＹＶＡＣに感染したウイルスの表面にはＢ７は検出されなかった。免疫沈降反応ＮＹＶＡＣをベースとした組み換えウイルスｖｐ1245を免疫沈降反応によりヒトＢ７遺伝子の発現について、測定した。組み換えウイルスまたは親ウイルスを放射線標識した³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で、組織培養細胞の単層に接種し、前述したように（Taylor等，1990）処理した。免疫沈降反応は、ヒトＢ７特異的モノクローナル抗体（Anti-BBl(B7)，Cat．No．550024，Becton Dickinson Advanced Cellular Biology，San Jose，CA）を用いて行った。約44 ｋＤａから約54ｋＤａのタンパク質が、組み換えウイルスｖｐ1245を感染された細胞から沈殿し、これはFreeman等，(1989)の記載と一致していた。感染していない細胞およびＮＹＶＡＣ親株ウイルスに感染したウイルスにおいてはこのようなタンパク質の沈殿は見られなかった。実施例30 −ネズミＩＦＮγおよびネズミＢ７のＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへの共挿入ＡＬＶＡＣへのネズミＩＦＮγおよびネズミＢ７の共挿入組み換えは、供与体プラスミドｐＬＦ４（実施例28）とレスキューウイルスｖＣＰ271（実施例20 ）との間で行った。組み換えウイルスはプラーク精製する。創出したＡＬＶＡＣをベースとした組み換え体（ＡＬＶＡＣ＋ＩＦＮγ＋Ｂ７）は、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターの支配下にあるネズミＩＦＮγ遺伝子をＣ３座内に、ワクシニアＨ６プロモーターの支配下にあるネズミＢ７遺伝子をＣ６座内に有している。ＮＹＶＡＣへのネズミＩＦＮγおよびネズミＢ７の共挿入組み換えは供与体プラスミドｐＭＰＴＫｍＩＦ（実施例20）およびレスキューウイルスｖＰ1230（実施例28）との間で行った。組み換えウイルスはプラーク精製する。創出したＮＹＶＡＣをベースとした組み換えウイルス（ＮＹＶＡＣ＋ＩＦＮγ＋Ｂ７）は、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターの支配下にあるネズミＩＦＮ γ遺伝子をＴＫ座内に、ワクシニアＨ６プロモーターの支配下にあるネズミＢ７遺伝子をＩ４Ｌ座内に有している。実施例31 −野生型および変異型ネズミｐ53のＡＬＶＡＣへの挿入核リン酸タンパク質ｐ53の遺伝子は、広い範囲のヒト腫瘍において、もっとも高い頻度で変位された形で発見されている遺伝子である（Hollstein等1991により総括）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとしたｐ53組み換え体ウイルスが実施例15に記述されている。野生型ネズミｐ53のＡＬＶＡＣへの挿入ネズミ野生型ｐ53を有しているプラスミドp11-４はArold Levime(Princeton University,Rriceton,New Jersey)より得た。ｐ53の配列は（Pennica等,1984）中に記述されている。ネズミ野生型遺伝子をワクシニアＨ６プロモーターの支配下におき、ＰＣＲ産物である断片を用いてｐ53の３′非コード末端（non cordingend）を除去した。ｐ53遺伝子の３′末端と融立されたＨ６プロモーターの支配下にあるｐ53の５ ′末端遺伝子を含む断片を以下に詳述した数回のＰＣＲにより得た。ＰＣＲＩ：Ｈ６プロモーターと非関連（non pertinent）遺伝子を含むプラスミドｐＲＷ825をオリコヌクレオチドＭＭ080（配列番号208）およびＭＭ081（配列番号209）とともにテンプレートとして用い、Ｈ６プロモーターとネズミｐ53遺伝子の最も５′側の塩基対を含んでいる228ｂｐの断片を生成した。ＭＭ080はＨ６プロモーターの５′末端にアニーリングし、３′末端方向に伸長する。ＭＭ081はＨ６プロモーターの３′末端へニーリングし、５′末端方向に伸長する。ＰＣＲII：プラスミドｐ11−４はテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＭＭ082（配列番号210）およびＭＭ083（配列番号211）とともに用いて、Ｈ６プロモータの３′末端、ＰＣＲ断片ＰＣＲIII（後述）と重なる15ｂｐが続いているｐ53の５′末端部分を含む129ｂｐの断片を生成した。ＭＭ082はＨ６プロモーターの３′末端を含み、ネズミｐ53遺伝子の５′末端からの伸長する。ＭＭ083はネズミ遺伝子の位置97（第38図）へアニーリングし、５′末端方向に伸長する。ＰＣＲIII：プラスミドｐ11−４をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＭＭ084（配列番号212）およびＭＭ085（配列番号213）とともに用い、301ｂｐの断片を生成した。このＰＣＲ産物の301ｂｐの断片はｐ 53遺伝子の３′末端、およびＰＣＲIIの産物断片の３′末端と重なる５′末端部分を有している。ＭＭ084（配列番号212）はネズミｐ53遺伝子の位置916から３ ′末端方向に伸長する。ＭＭ085（配列番号213）は位置1173からｐ53遺伝子の５ ′末端方向に伸長する。これら３つのＰＣＲ断片をともに保存し、ＭＭ080とＭＭ085とともに伸長させた。この結果生じた588ｂｐの断片は、ＢａｍＨＩサイト、それに続くＨ６プロモータータ支配下にある、ｐ53遺伝子の３′末端部分と融合されたｐ53遺伝子の５′末端部分、さらに続いてＳｍａＩサイトを有している。ｐ53遺伝子の５′末端部分は位置37のＸｈｏＩサイトで終わり、３′末端は位置990のＳａｃＩサイトから始まっている（第３８図）。588ｂｐのＰＣＲ産物断片をＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化し、565ｂｐの断片を生成し、この断片をＢａｍＨＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＮＣ５ＬＳＰ５（以下に記述）中に挿入した。このｐＭＭ136と命名されたプラスミドを149ｂｐの断片を除きＫｓｐＩとＸｈｏＩで消化して、ｐ11−４由来の935ｂｐのＫｓｐＩ／ＸｈｏＩで断片を挿入した。構築したプラスミドｐＭＭ148はＨ６プロモーター支配下にある野生型ネズミｐ53遺伝子をＡＬＶＡＣＣ５挿入座内に有していた。ｐＮＣ５ＬＳＰ５の構築は以下のとおりである。Ｃ５挿入ベクタープラスミドｐＣ５ＬＳＰ（実施例14）をＥｃｏＲＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理後に、自己アニーリングしているオリゴヌクレオチドＣＰ29（配列番号102）と連結し、続いてＮｏｔＩ消化し、直線状のまま精製し、自己ライゲーションさせた。この手順によりｐＣ５ＬＳＰ５にＮｏｔＩサイトを導入し、ｐＮＣ５ＬＳＰ５を構築した。第38図に、野生型ネズミｐ53遺伝子の塩基配列を示す（配列番号102）。開始コドンは位置１にあり、終止コドンは位置1171にある。供与体プラスミドｐＭＭ148とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ263を創出した。ｖＣＰ263は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にある野生型ネズミｐ53遺伝子をＣ５座内に有している。変異型ネズミｐ53のＡＬＶＡＣへの挿入変異型ネズミのｐ53遺伝子を有するプラスミドｐＳＶＫ215はArnold Levine(P rinceton University,Princeton,New Jersey)より得た。プラスミドｐＳＶＫＨ2 15の変異により、ネズミｐ53をコードしている配列（第38図）の位置643から646 までの配列ＧＴＡＣが、ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧに変化している。位置643から646 の間への挿入により予期したアミノ酸をコードしている配列がｖａｌ−ｐｒｏよりｐｒｏ−ｓｅｒ−ｌｅｕ−ａｌａへと変化する。また挿入によりＫｐｎＩサイトがＨｉｎｄIIIサイトに置き換えられる。プラスミドｐＳＶＫＨ215の構築は(T an等,1986)中に記述されている。プラスミドｐＭＭ136（前述）は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にある、ｐ513遺伝子の３′末端に融合されたｐ53遺伝子の５′末端を、ＡＬＶＡＣＣ５座挿入プラスミド中に含んでいる。ｐＭＭ136をＫｓｐＩおよびＸｈｏＩで消化し、149ｂｐを除去し、前述された変異を有するｐＳＶＫＨ215由来の960ｂｐのＫｓｐＩ／ＸｈｏＩ断片を挿入した。生成したプラスミドｐＭＭ149はＨ６プロモーター支配下にあるネズミ変異型ｐ53遺伝子をＣ５座内に有している。供与体プラスミドｐＭＭ149とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＣＰ267を創出した。ｖＣＰ267はワクシニアＨ６プロモーター支配下にある変異型ネズミｐ53遺伝子をＣ座内に有している。実施例32 −変異型ヒトｐ53のＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣへの挿入変異型ヒトｐ53のＡＬＶＡの挿入第18図（実施例15）はＡＬＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＣＰ207中のワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるヒト野生株ｐ53遺伝子カセットの塩基配列を示している。本実施例では、これから記述する異変型ヒトｐ53遺伝子の記述を容易にするため、第39図（配列番号215）はヒト野生型ｐ53遺伝子をコードしている配列のみを示している。開始コドンは位置１にあり、終始コドンは位置1180にある。変異型ヒトｐ53遺伝子を含むプラスミドＣｘ22Ａは、Arnold Levine（Prinsto n University,Prinston,New Jersey）より得た。第39図に示した野生型ｐ53配列と比較すると、Ｃｘ22Ａ中では、ヌクレオチド位置524のＧがＡに置換されており、野生型タンパク質の175番目コドンでのアミノ酸アルギニンが、ヒスチジンに置換されていた。プラスミドｐＭＭ110（実施例15，第18図）は、Ｈ６支配下にある野生型ヒトｐ53遺伝子をＡＬＶＡＣＣ５挿入サイト内に有している。ヒトｐ53遺伝子は二つのＰｆｌｍＩサイトを含んでいる。第１のＰｆｌｍＩサイトの上流域および第２のＰｆｌｍＩサイトの下流域のｐ53をコードする配列はｐＭＭ110中でもＣｘ2 2Ａ中と同じである。ｐＭＭ110をＰｆｌｍＩで消化し、ｐ53遺伝子の中央にある 853ｂｐを除去した。位置524（第３９図）が塩基置換されたＣｘ22Ａ由来の85３ｂｐのＰｆｌｍＩ断片が挿入した。こうして構築したプラスミドｐＭＭ143は、Ｈ６プロモーター支配下にある変異ｐ53遺伝子を有する。供与体プラスミドｐＭＭ143とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換え体ウイルスｖＣＰ270を創出した。ｖＣＰ270はＨ６プロモーター支配下にあるヒト変異ｐ53遺伝子Ｃ５座内に有する。変異型ヒトｐ53遺伝子を含むプラスミドｐＲ４−２はArnold Levine(Princeto n Universton,New Jersey)より得た。第39図に示した野生型ｐ53配列と比較すると、ｐＲ４−２中では、ヌクレオチド位置818のＧがＡに置換されており、野生型の273番目のコドンがルギニンからヒスチジンに置換されている。プラスミドｐＭＭ110（実施例15，第18図）は、Ｈ６支配化にある野生型ヒトｐ53遺伝子をＡＬＶＡＣＣ５挿入サイト内に有している。第１のＰｆｌｍＩサイトの上流域のｐ53をコードしている配列および第２のＰｆｌｍＩサイトの下流域のｐ53をコードしている配列はｐＭＭ110中でもｐＲ４−２中同じである。ｐＭＭ110をＰｆｌｍＩで消化し、ｐ53遺伝子の中央にある853ｂｐを除去した。ヌクレオチド位置818（第39図）が塩基置換されたｐＲ４−２由来の853ｂｐのＰｆｌｍＩ断片を挿入した。こうして構築したプラスミドｐＭＭ144は、Ｈ６プロモーター支配下にある変異ｐ53遺伝子を有する。供与体プラスミドｐＭＭ144とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換え体ウイルスｖＣＰ269を創出した。ｖＣＰ269はＨ６プロモーター支配下にあるヒト変異ｐ53遺伝子をＣ５座内に有する。変異型ヒトｐ53のＮＹＶＡＣへの挿入前述したプラスミドＣｘ22Ａは、第39図中のヌクレオチド位置524のＧがＡで置換され、175番目のアミノ酸がアルギンからヒスチジンに置換された変異型ヒトｐ53遺伝子を有している。プラスミドｐＭＭ106（実施例15）は、ワクシニアＨ６プロモータ支配下にあるヒトｐ53遺伝子をＮＹＶＡＣＩ４Ｌ挿入座内に有している。第１のＰｆｌｍＩサイトの上流域のｐ53をコードしている配列および第２のＰｆｌｍＩサイトの下流域のｐ53をコードしている配列はｐＭＭ106中でもＣｘ22Ａ中でも同じである。ｐＭＭ106をＰｆｌｍＩで消化し、ｐ53遺伝子の中央にある853ｂｐを除去した。ヌクレオチド位置524（第39図）に塩基置換されたＣｘ22Ａ由来の853ｂｐのＰｆｌｍＩ断片が挿入された。こうして構築したプラスミドｐＭＭ140は、Ｈ６プロモーター支配下にある変異ｐ53遺伝子を有する。供与体プラスミドｐＭＭ140とレスキューウイルスＡＬＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換え体ウイルスｖＰ1234を創出した。ｖＰ1234はワクシニアウイルスＨ６プロモーター支配下にあるヒト変異ｐ53遺伝子をＩ４Ｌ座内に有する。前述したプラスミドｐＲ４−２は、第39図中のヌクレオチド位置818のＧがＡへ置換され、273番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチジンに置換された変異型ヒトｐ35遺伝子を有している。プラスミドｐＭＭ106（実施例15）は、ワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるヒトｐ53遺伝子をＮＹＶＡＣＩ４Ｌ挿入サイト内に有している。第１のＰｆｌｍＩサイトの上流域のｐ53をコードしている配列および第２のＰｆｌｍＩサイトの下流域のｐ53をコードしている配列はｐＭＭ106中でもｐＲ４−２中でも同じである。ｐＭＭ106をＰｆｌｍＩで消化し、ｐ53遺伝子の中央にある853ｂｐを除去した。ヌクレオチド位置818（第39図）が塩基置換されたｐＲ４−２由来の853ｂｐのＰｆｌｍＩ断片を挿入した。こうして構築したプラスミドｐＭＭ141 は、Ｈ６プロモーター支配下にある変異ｐ53遺伝子を有する。供与体プラスミドｐＭＭ141とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間での組み換えにより、ウイルスｖＰ1233を創出した。ｖＰ1233はワクシニアＨ６プロモーター支配下にある変異型ヒトｐ53遺伝子をＩ４Ｌ座内に有する。実施例31および32で記述されたＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡ組み換え体中にある野生型並びに変異型のネズミｐ53および変異型ヒト53のリストを表29に示す。免疫沈降反応ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣをベースとした組み換え体ｖＰ11 01，ｖＰ1096，ｖＰ1098，ｖＣＰ207，ｖＣＰ193，ｖＣＰ191（すべて実施例15 ；表22において記述）、並びにｖＣＰ270，ｖＣＰ269，ｖＰ1233，ｖＰ1234（本実施例；表２９において記述）も同様に野生型あるいは変異型のヒトｐ53遺伝子を含んでいる。これらの組み換え体のすべてを、免疫沈降反応を用いてヒトｐ53 遺伝子の発現について調べた。組み換え体あるいは親ウイルスを放射線標識した³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で組識培養細胞の単層に接種し、前述したように処理した（Taylor等,1990）。免疫沈降反応はヒトｐ53特異的モノクローナル抗体1801を用いて行った。ｖＰ1101 ，ｖＰ1096，ｖＰ1098，ｖＣＰ207，ｖＣＰ193，ｖＣＰ191，ｖＣＰ270，ｖＣＰ 269，ｖＰ1233あるいはｖＰ1234のいずれの組み換え体に感染した細胞においても、47ｋＤａ−53ｋＤａのタンパク質の沈殿がみられたが、感染していない細胞および親株ウイルスＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣを感染した細胞においては沈殿がみられなかった。これまでに示されたＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣの、ポックスウイルスベクター系としての特徴に基づくと、野生型または変異型のｐ53を発現するこのようなベクターは、患者の体内のエフェクター集団（ＴＩＬｓ，ＰＢＭＣ、またはリンパ節細胞）において、内因性ＣＴＬ活性が検出可能か否かを決定する有用な試薬を提供し、またそのような活性の刺激または増大の（例えばそのような活性を試験管内または生体内でこれらの組み換えウイルスを用いて刺激することにより増大させる）ための有用な輸送手段を提供する。さらにＮＹＶＡＣのＡＬＶＡＣと両方の非常に弱毒化された性質により、本発明の組み換え体を、以前に論じられた仲介的な免疫治療の様式、例えば生体内仲介免疫治療において利用することが可能となる。実施例33 −ＥＲＢ−Ｂ−２のＣＯＰＡＫへの挿入プラスミドＥｒｂＢ２ＳｐｈＩstopはJeffrey Marks（Duke University Cente r）より得た。ＥｒｂＢ２ＳｐｈＩstopは，ｐＵＣ19中にクローン化されたヒトｅｒｂ−Ｂ−２ｃＤＮＡの3.8ｋｐのインサートを有する。インサートは位置1 50の塩基から位置3956の塩基に亘っており（Yamamoto等,1986）、ｅｒｂ− Ｂ−２をコードしている配列の全長を含んでいる。ＥｒｂＢ２ＳｐｈＩstopにおいて、位置2038にあるＳｐｈＩサイトはＸｂａＩリンカーの付与により変異され、フレーム内停止コドンが設けられた。ゆえに、残っている、切断されたＯＲＦは、2.3ｋｂｐのｍＲＮＡを翻訳した産物である、細胞外に分泌可能なｅｒｂ− Ｂ−２遺伝子産物を特徴とする。プラスミドＥｒｂＢ２ＳｐｈＩstopを、ＸｈｏＩで消化し、ｅｒｂ−Ｂ−２を含む3.8ｋｂｐの断片を単離した。この単離した断片は、ＸｈｏＩで切断したＣＯＰＡＫベクタープラスミドｐＳＤ555と連結し、プラスミドｐＭＭ113を構築した。プラスミドｐＳＤ555を以下のように構築した。プラスミドｐＳＤ553（実例17 ）はＣＯＰＡＫシリーズのワクシニア欠損／挿入プラスミドである。プラスミドｐＳＤ553は、ワクシニアＫ１Ｌ宿主範囲遺伝子（Gillard等,1986）を、隣接したコペンハーゲンワクシニアアーム中に有しており、ＡＴＩ領域（ORF A25L,A26 L;Goebel等,1990）が置換されている。プラスミドｐＳＤ553をＮｒｕＩで切断し、翻訳開始コドンの26塩基上流域にあるＮｒｕＩサイトの上流部分の合成ワクシニアＨ６プロモーター要素（Perkus 等,1989）を含むＳｍａＩ／ＮｒｕＩ断片と連結した。このように作成されたプラスミドｐＭＰ553Ｈ６は、Ａ26Ｌ挿入座内のＫＩＬ遺伝子の下流に位置したワクシニアＨ６プロモーター要素を有している。ワクシニアＨ６プロモータータを完成させ、異種ＤＮＡ挿入のためのマルチクローニング領域を付加するため、プラスミドｐＭＰ553Ｈ６０ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩで切断Ｄ、アニーリングＤたオリゴヌクレオチドＮＰＳＹＮ349 ８配列番号 216）およびＭＰＳＹＮ350（配列番号217）と連結した。このように生成したプラスミドｐＳＤ555は、Ｈ６プロモーター領域の全長と、それに続くマルチクローニング領域を有している。供与体プラスミドｐＭＭ113とレスキューウイルスＮＹＶＡＣとの間の組み換えにより、組み換えウイルスｖＰ1100を創出した。ｖＰ1100はワクシニアＨ６プロモーター支配下にあるｅｒｂ−Ｂ−２遺伝子をＩ４Ｌ座内に、ワクシニアＫ１Ｌ宿主領域遺伝子とともに有している。免疫沈降反応Ｖｅｒｏ細胞の予め形成した単層に放射線標識した³⁵Ｓメチオニンの存在下で10ｐｆｕ／細胞の量の親株ウイルスＮＹＶＡＣおよび組み換えウイルスｖＰ1100を感染させ、前述したように処理した（Taylor等,1990）。免疫沈降反応は、ヒトｅｒｂ−Ｂ−２特異的モノクローナル抗体ＴＡ１−ＩＣを用いて行った。約97ｋＤａのタンパク質がｖＰ1100に感染した細胞において沈殿したが、感染していない細胞または親株ウイルスＮＹＶＡＣに感染した細胞においては沈殿がみられなかった。本発明の好ましい実施態様を詳述してきたが、請求の範囲によって定義された本発明は、本発明の精神または範囲より逸脱することなく変更が可能であるので上述した特定の詳細な例に限定されるものではないことが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/21 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 39/00 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/52 8517−4Ｈ 14/82 48/00 ＡＤＵ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/52 9051−4Ｃ 37/66 Ｚ 14/82 9051−4Ｃ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9051−4Ｃ 37/16 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者タータグリア，ジェームズアメリカ合衆国ニューヨーク州 12303 シェネクタディクリスティーナドライヴ７ (72)発明者コックス，ウィリアムアイアメリカ合衆国ニューヨーク州 12180 トロイパインウッズアヴェニュー 519

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも一つのサイトカインおよび／または腫瘍に関連した抗原をコードしている外来ＤＮＡをゲノム中の欠失可能領域内に有する、元々コードされている遺伝子機能の不活性化により弱毒化されているが有用性は残されていることを特徴とする改変組み換えウイルス。２．前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。３．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第２項記載のウイルス。４．前記遺伝子機能が、少なくとも一つのオープンリーディングフレームの欠失により不活性化されていることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス。５．欠失されている遺伝子機能がＣ７Ｌ−Ｋ１Ｌオープンリーディングフレームまたは宿主範囲領域を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載のウイルス。６．Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、およびＩ４Ｌから成るグループより選択された少なくとも一つのオープンリーディングフレームが付加的に欠失していることを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。７．チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲領域、およびリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットから成るグループより選択された少なくとも一つのオープンリーディングフレームが付加的に欠失されたことを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。８．Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌが欠失されたことを特徴とする請求の範囲第６項記載のウイルス。９．チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲領域、およびリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットが欠失していることを特徴とする請求の範囲第７項記載のウイルス。１０．前記ウイルスがＮＹＶＡＣ組み換えウイルスであることを特徴とする請求の範囲第８項記載のウイルス。１１．前記ウイルスがＮＹＶＡＣ組み換えウイルスであることを特徴とする請求の範囲第９項記載のウイルス。１２．前記外来ＤＮＡがヒト腫瘍壊死因子、野生型あるいは変異型の核リンタンパク質ｐ５３、ヒトメラノーマ関連抗原、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１２、Ｂ７、ｅｒｂ−Ｂ−２、およびガン胎児性抗原のうちの少なくとも一つをコードしていることを特徴とする請求の範囲第１１項記載のウイルス。１３．前記ウイルスが、ｖＰ１２００、ｖＰ１１０１、ｖＰ１０９８、ｖＰ１２３９、ｖＰ１２４１、ｖＰ１２３７、ｖＰ１２４４、ｖＰ１２４３、ｖＰ１２４８、ＮＹＶＡＣ＋ＩＦＮγ＋ＩＬ−２、ｖＰ１２５０、ｖＰ１２４６、ＮＹＶＡＣ＋ＩＬ−１２、ｖＰ１２３０、ｖＰ１２４５、ＮＹＶＡＣ＋ＩＦＮγ＋Ｂ７、ｖＰ１２３４、ｖＰ１２３３、ｖＰ１１００、またはｖＰ１０９６のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のウイルス。１４．少なくとも一つのサイトカインおよび／または腫瘍に関連した抗原をコードしている外来ＤＮＡをゲノム中の欠失可能領域内に有する、宿主中での毒性を弱めるように改変されたことを特徴とする改変組み換えアビポックスウイルス。１５．前記ウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のウイルス。１６．前記ウイルスがＡＬＶＡＣ組み換えウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載のウイルス。１７．前記外来ＤＮＡがヒト腫瘍壊死因子、野生型あるいは変異型の核リンタンパク質ｐ５３、ヒトメラノーマ関連抗原、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１２、Ｂ７、ｅｒｂ−Ｂ−２、およびガン胎児性抗原のうちの少なくとも一つをコードしていることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のウイルス。１８．前記ウイルスが、ｖＣＰ２４５、ｖＣＰ２３５、ｖＣＰ２０７、ｖＣＰ１９３、ｖＣＰ２７５、ｖＣＰ２７７、ｖＣＰ２７１、ｖＣＰ２７８、ｖＣＰ２７５＋ＩＦＮγ、ｖＣＰ２７７＋ＩＦＮγ、ＡＬＶＡＣ＋ＩＬ−４、ｖＣＰ２９０、ｖＣＰ２８５、ＡＬＶＡＣ＋ＩＬ−１２、ｖＣＰ２６８、ＡＬＶＡＣ＋ＩＦＮγ＋Ｂ７、ｖＣＰ２６３、ｖＣＰ２６７、ｖＣＰ２７０、ｖＣＰ２６９、またはｖＣＰ１９１のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のウイルス。１９．請求の範囲第１項、第１２項、第１４項、または第１７項のいずれか１項に記載されたウイルスと適切な担体との混合物より成る複合体を、患者に投与することより成る、ガン治療が必要な患者の治療方法。２０．請求の範囲第１項、第１２項、第１４項、または第１７項のいずれか１項に記載されたウイルスと適切な担体との混合物より成る、抗原的または免疫的反応を誘導するための複合体。２１．請求の範囲第１項、第１２項、第１４項、または第１７項のいずれか１項に記載されたウイルスを細胞に導入することから成る、生体外で培養された細胞内に遺伝子を発現させる方法。２２．請求の範囲第１項、第１２項、第１４項、または第１７項のいずれか１項に記載されたウイルスの生体外での発現により得られたサイトカインおよび／または腫瘍関連抗原。