JPH09504165A - Ｇａｇｅ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現を決定する事による疾患診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍拒絶抗原前駆体の新規なファミリー及びそれらをコードする核酸分子が開示される。これら腫瘍拒絶抗原前駆体は、ＧＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体と称し、それらをコードする核酸分子はＧＡＧＥコード分子と称する。コード配列及び腫瘍拒絶抗原並びにそれらの前駆体分子の様々な診断治療用途が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体の発現を決定する事による疾患診断法 関連出願 この出願は、１９９３年７月２２日出願の特許出願番号第０８／０９６，０３ ９号の一部継続出願である。発明の分野 本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に関し、特に本発明は、 その腫瘍拒絶前駆体が、とりわけＨＬＡ−Ｃw6分子で表示される、少なくとも１ つの腫瘍拒絶抗原に変えられる遺伝子に関する。問題のこの遺伝子は、他の公知 の腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列に関連するとは思われない。背景及び従来技術 外来の、即ち異種物質を認識して反応する哺乳動物の免疫系の過程は複雑なも のである。この免疫系の重要な一面は、Ｔリンパ球又は「Ｔ細胞」応答である。 この応答は、Ｔ細胞が認識して、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、又は主たる組織 適合性複合体（ＭＨＣｓ）と称する細胞表面分子とペプチドとの複合体と相互反 応する事を必要とする。このペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子を表す細胞によっ て変化させられる巨大分子由来のものである。これに関しては、メール等(Male et al.)のAdvanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1997)、特に６〜10章 参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互反応は、ＨＬＡ分子とペプチド の特定の組合せの為の特異なＴ細胞を要求する事を制限する。特異なＴ細胞が存 在しなければ、そのパートナー複合体が存在してもＴ細胞応答は存在しない。 同様に、特異な複合体が存在せずＴ細胞が存在しても応答は存在しない。この 機構は、外来物質に対する免疫系応答、自己免疫異常及び細胞異常に対する応答 に含まれる。多くの研究が、蛋白質がＨＬＡ結合ペプチドに変えられるこの機構 について注がれてきた。これに関しては、バリナガ(Barinaga)、Science 257：8 80(1992)；フレモント等(Fremont et al.)、Science 257: 919(1992);マツ ムラ等(Matsumura et al.)、Science 257: 927(1992);ラトロン等(Latron ey al .)、Science 257: 964（1992）を参照。 Ｔ細胞が細胞異常を認識するこの機構は、又癌に係わるものであった。例えば 、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４(１９９２年５月22日出願、１９９ ２年11月26日公開(参考として組み入れられる))には、細胞表面で発現するペプ チドに変えられ、特異ＣＴＬｓ（細胞溶解性Ｔリンパ球、以下「ＣＴＬｓ」とい う）による腫瘍細胞の溶解へと導く事の出来る一連の遺伝子が開示されている。 この遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原前駆体」、即ち「ＴＲＡＰ」分子をコードすると 言われ、それから得られるペプチドは「腫瘍拒絶抗原」即ち「ＴＲＡｓ」と称さ れる。 この一連の遺伝子に関する詳しい情報については、トラバーサリ等(Traversar i et al.)、Immunogenetics 35: 145(1992); ファン デル ブルッゲン等(van der Bruggen et al.)、Science 254: 1643(1991)を参照。又、米国特許出願第8 07,043 号（１９９１年１２月１２日出願）（現在特許番号未定）を参照。 参考として組み入れられる米国特許出願第938,334 号の開示では、ＭＡＧＥ− １遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ１分子で表されるノナペプチドに変えられる腫瘍拒絶抗 原前駆体をコードすると説明されている。この引用例は、特定のＨＬＡ分子に対 する特定のペプチドの公知の特異性を与えた事を教示し、１つのＨＬＡ分子に結 合し、他には結合しない特定のペプチドを期待させる。このことは、異なる個体 は異なるＨＬＡ表現型を保有するので重要である。結果として、特異ＨＬＡ分子 のパートナーとしての特定ペプチドの同定は、診断的且つ治療的結果を持つが、 これらは、その特定のＨＬＡ表現型の個体にとって意味があるだけである。細胞 異常が１つの特定のＨＬＡ表現型に限定されるものではなく、目標とされる治療 が、組織における異常細胞の表現型の知識を要求するが故に、この分野では更に 研究の必要性が存在する。 参考として組み入れられる米国特許出願第8,446 号（１９９３年１月２２日出 願）では、ＭＡＧＥ−１発現生成物は、第２のＴＲＡに変えられると言う事実が 開示されている。この第２のＴＲＡはＨＬＡ−Ｃクローン１０分子と表される。 この開示は、与えられたＴＲＡＰは、複数のＴＲＡｓを生成する事が出来る事を 示す。 ここに参考として組み入れられる米国特許出願第994,928 号（１９９２年１２ 月２２日出願）では、チロシナーゼ、或る種の正常細胞（例えば、メラノサイト ）によって産生される分子は腫瘍細胞に変えられ、ＨＬＡ−Ａ２分子で表される ペプチドを生成する事が教示されている。 全体を参考として組み入れる米国特許出願第08/032,978号（１９９３年３月１ ８日出願）では、チロシナーゼ由来のものではない第２のＴＲＡは、ＨＬＡ−Ａ ２分子で表される事が教示されている。このＴＲＡは、ＴＲＡＰ由来のものであ るが、非−ＭＡＧＥ遺伝子によりコードされている。この開示は、特定のＨＬＡ 分子は、異なる資源由来のＴＲＡｓを表示してもよい事を示す。 ここに参考として組み入れられる１９９３年６月１７日出願の米国特許出願（ 出願番号未定）では、関連のない腫瘍拒絶抗原前駆体、所謂「ＢＡＧＥ」前駆体 が開示されている。このＢＡＧＥ前駆体はＭＡＧＥファミリーとは関連がない。 上で引用された論文、特許及び特許出願で提示される研究は、大部分はＭＡＧ Ｅファミリー遺伝子及び関係のないＢＡＧＥ遺伝子に関するものである。 ここにおいて、付加的腫瘍拒絶抗原前駆体が、細胞によって発現される事が見 出された。これらの腫瘍拒絶抗原前駆体を、「ＧＡＧＥ」腫瘍拒絶抗原前駆体と 称する。これらは、ＭＡＧＥファミリー遺伝子ともＢＡＧＥ遺伝子とも同族関係 を示さない。斯くして、本発明は、ＴＲＡＰｓをコードする遺伝子、腫瘍拒絶抗 原前駆体それ自身、及びこれらの利用に関するものである。 本発明は、更に以下の記述に従って詳述される。図面の簡単な説明 図１は、ＣＴＬクローン７６／６を用いた細胞溶解の研究を示す。 図２は、種々の形質移入体と比較対象物で得られた腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のリ リースアッセイを示す。好適な実施態様の詳細な説明 実施例１ メラノーマ細胞株、ＭＺ２−ＭＥＬを、標準の手順で、患者のＭＺ２から採取 されたメラノーマ細胞から株化した。この細胞株は、例えば、ここにその全体を 参考として組み入れるＰＣＴ出願ＰＣＴ／US９２／０４３５４（１９９２年５月 ２２日出願、１９９２年１１月２６日公開）に開示されている。この細胞株が株 化されたら、そのサンプルを放射線照射し、これを非増殖性にした。これらの照 射細胞を、それらに対して特異な細胞溶解性Ｔ細胞クローン（ＣＴＬｓ）の単離 に使用した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）のサンプルを患者のＭＺ２から採取 し、照射メラノーマ細胞に接触させた。この混合物を、メラノーマ細胞の細胞溶 解につき観察し、メラノーマ細胞によって表示されるペプチドとＨＬＡ分子の複 合体に対する特異なＣＴＬｓが、サンプル中に存在した事を示した。 使用したこの細胞溶解アッセイは、ヘリン等(Herin et al.)、Int．J．Cancer 39: 390-396（1987）に従ったクロムリリースアッセイであり、その記述は参考 として組み入れられる。このアッセイをここに記述する。目標メラノーマ細胞は 、in vitroで育成し、次いでDMEM中に10⁷ 細胞／mlで再懸濁し、10mM HEPES と3 0％FCS で補充し、Ｎa(⁵¹Cr)O₄ の200 μCi/ml で、37℃で45分間培養した。標 識化細胞をDMEMで３回洗浄し、10 mM HEPES を補充した。これを、次いで10 mM HEPES と10％FCS で補充したDMEM中に再懸濁し、その後、10³ 細胞を含む100 μ lの液を、96ウエルマイクロプレートに分散した。ＰＢＬｓのサンプルを100 μl の同じ培地に添加し、アッセイを繰り返し行った。プレートを、100gで４分間遠 心分離に掛け、８％CO₂ 雰囲気中で、37℃で４時間培養した。 プレートを再度遠心分離に掛け、上澄み液の100 μl の液を収集し、計量した 。⁵¹Crリリースの割合は、以下の様に計算した。 ％⁵¹Crリリース＝［（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）］ｘ１００ ここで、ＥＲは、観察された、実験的⁵¹Crリリース、ＳＲは、200 μl の培地単 独での10³ 標準化細胞を培養する事によって測定された自然リリース、ＭＲは、 100 μl の0.3%トリトン(Triton)X-100 を添加して得られる最大リリースである 。 高いＣＴＬ活性を示したこれらの単核血サンプルを拡張し、限界希釈を介して クローン化し、同じ方法を使用して再度スクリーニングした。ＣＴＬクローンＭ Ｚ２−ＣＴＬ７６／６はこの様にして単離した。このクローンを以後「７６／６ 」と称する。 同じ方法を、メラノーマ細胞株同様に目標Ｋ５６２細胞を試験するのに使用し た。図１は、このＣＴＬクローンが認識してメラノーマ細胞株、即ちＭＺ２−Ｍ ＥＬであってＫ５６２ではない株を溶解する事を示す。このクローンを、次いで 、上に述べたと同じ方法で、他のメラノーマ細胞株及び自己由来ＥＢＶ−形質転 換Ｂ細胞に対して試験した。図１は、エプシュタインバールウイルス(Epstein B arr Virus)(EBV)で形質転換された自己由来Ｂ細胞は溶解せず、しかもＭＺ２− ＭＥＬ３．０はＣＴＬクローン７６／６で溶解されるのに、抗原Ｆを発現しない この細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ．４Ｆ^-突然変異株は溶解しない事を示す。故に、こ のクローンは、この抗原に対して特異的である事が明らかである。 上に提示された結果は、ＨＬＡ分子がＴＲＡを表示する事とは無関係である。 溶解した細胞株、即ちＭＺ２−ＭＥＬは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２９、Ｈ ＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ６及びＨＬＡ−Ｃクローン１０を 発現する事が知られている。ここに報告されていないがこの実施例のプロトコー ルに従う実験では、ＨＬＡ分子Ａ２９、Ｂ４４及びＣクローン１０の発現を喪失 したＭＺ２−ＭＥＬの補助株(subline)を試験した。この補助株は溶解し、存在 している分子が、Ａｌ、Ｂ３７又はＣｗ６の１つである事を示した。実施例２ ７６／６が、目標細胞と接触した時に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を産生するかを 決定するために、更に検討を行った。使用した方法は、トラバーサリ等(Travers ari et al.）、Immunogenetics 35: 145-152（1992）、により開示された方法で あり、その記述は参考として組み入れられる。要するに、ＣＴＬ株のサンプルを 、培養培地で、目的とする目標細胞のサンプルと組み合わせた。２４時間後、こ の培養からの上澄み液を除去し、次いでＴＮＦ−感受性ＷＥＨＩ細胞上で試験し た。 細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ４３、即ち引用参考例におけると同様に上で検討された ＭＺ２−ＭＥＬ細胞株の補助株は、極めて強力な応答を与えた。これを次の実験 に使用した。実施例３ 実施例２の結果は、ＭＺ２．ＭＥＬ．４３が目的物の目標抗原を表示した事を 示した。そこで、これをcＤＮＡライブラリー調製の為の全ｍＲＮＡ源として使 用した。 全ＲＮＡは、この細胞株から単離した。このｍＲＮＡを、良く知られた技術に 従って、オリゴ-dT結合キット(oligo-dT binding kit)を使用して単離した。ｍ ＲＮＡを確保したら、NotI部位を含むオリゴdTプライマーを使用して、逆転写で ｃＤＮＡに転写し、次いで第２ストランド合成(second strand synthesis)を行 った。このｃＤＮＡを、次いでBstXI アダプターに結合し、NotIで消化し、セフ ァクリル(Sephacryl)S-500HRカラム上でサイズ画分化し、BstXI 及びｐｃＤＮＡ −Ｉ−ＡｍｐのNotI部位に間接的にクローン化した。この組み換えプラスミドを 、次いでＤＨ５α大腸菌バクテリアの中にエレクトロポレーションした。１００ の組み換えバクテリアの合計１５００プールをマイクロウエルに播種した。殆ど 全てのバクテリアは挿入物(insert)を含んでいたので、各々は約100のｃＤＮＡ ｓを含んでいた。 それぞれのプールを飽和するまで増殖し、プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解 及び酢酸カリウム沈殿で、フェノール抽出なしで抽出した。実施例４ 実施例３で開示したライブラリーの調製に続いて、ｃＤＮＡを、真核細胞に形 質移入した。ここで述べられる形質移入を繰り返して行った。ＣＯＳ−７細胞の サンプルを、１５，０００細胞／ウエルで、１０％ウシ胎児血清で補充したダル ベッコ変性イーグルス培地(Dulbecco's modified Eagles Medium)(DMEM)におい て、組織培養平底マイクロウエル中に播種した。この細胞を、37℃で一昼夜培養 し、培地を除去して、10％Nu血清、400 μg/ml DEAE−デキストラン及び100 μM クロロキン、更に100ng のプラスミドを含むDMEM培地の50μl/ウエルで置き換 えた。 上で示した様に、この溶解研究は、ＨＬＡ分子が抗原を表示した事を立証しな かった。結果として、抗原（Ａ１、Ｂ３７、Ｃｗ６）を表示出来たＨＬＡ分子の それぞれのｃＤＮＡを、細胞を同時形質移入する為に、別々に使用した。 具体的には、ライブラリーでの形質移入で使用したのと同じプロトコールを使 用して、ｐＣＤ−ＳＲαにクローン化されたＨＬＡ−Ａ１に対するｃＤＮＡの２ ８ng、ｐｃＤＮＡ−Ｉ−ＡｍｐでのＨＬＡ−Ｂ３７に対するｃＤＮＡの５０ng、 又はｐｃＤＮＡ−Ｉ−ＡｍｐでのＨＬＡ−Ｃｗ６に対するｃＤＮＡの７５ngを使 用した。 形質移入は、複数のウエル中で行ったが、ＨＬＡ−Ｃｗ６形質移入体の５００ プールだけは、単一ウエル中で試験出来た。37℃での４時間培養の後、培地を除 去し、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳの５０ｎlで置き換えた。この培地を２分後 に除去し、１０％ＦＣＳで補充したDMEMの２００μlで置き換えた。 培地でのこの変換の後、ＣＯＳ細胞を37℃で24-48 時間培養した。培地を、次 いで捨て、1000〜3000のＣＴＬクローン７６／６細胞を、ＩＬ−２の２０〜３０ Ｕ／ｍｌで補充した１０％プールヒト血清を含むイスコーブ(Iscove)培地の100 μl に添加した。上澄み液を24時間後に除去し、トラバーサリ等(Traversari et al.）、Immunogenetics 35: 145-152（1992）により開示された方法（その記述 は参考として組み入れられる）により、WEHI細胞上でのアッセイで、ＴＮＦ含有 量を決定した。 ＨＬＡ−Ａ１で形質移入された１５００プール、及びＨＬＡ−Ｂ３７で形質移 入された１５００プールは、１５〜２０ｐｇ／ｍｌ又は２〜６ｐｇ／ｍｌのそれ ぞれの濃度に対してＴＮＦリリースを刺激した。６０ｐｇ／ｍｌより多くを生成 した一つのプールを除いて、大部分のＨＬＡ−Ｃｗ６形質移入体は３〜２０ｐｇ ／ｍｌを生成した。このプールを次の研究の為に選択した。実施例５ 選択したプールのバクテリアをクローン化し、６００のクローンを試験した。 プラスミドＤＮＡをそれらから抽出し、上に述べたのと同じ方法でＣＯＳ細胞の 新しいサンプル中に形質移入し、この細胞を、ＣＴＬクローン７６／６の刺激の 為に再度試験した。９４の陽性クローンが見つかった。これらの内の一つで、ｃ ＤＮＡクローン２Ｄ６と称するものを更に試験した。比較試験では、ＣＯＳ細胞 は、ｃＤＮＡクローン２Ｄ６とＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ６単独又は２Ｄ６ 単独で形質移入した。対照細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ Ｆ^- とＭＺ２−ＭＥＬ Ｆ⁺ も使用した。ＣＴＬ上澄み液中へのＴＮＦリリースは、上で引用した様にＷＥＨ Ｉ細胞上でそれを試験する事によって測定した。生き残っているＷＥＨＩ細胞の 光学濃度はＭＴＴを使用して測定した。図２は、ＨＬＡ−Ｃｗ６とｃＤＮＡ−２ Ｄ６で形質移入したＣＯＳ細胞と、細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ Ｆ⁺が、ＣＴＬクロ ーン７６／６からのＴＮＦリリースを刺激した事を示した。これは、ＨＬＡ−Ｃ ｗ６が対象のＴＲＡを表示した事を示している。実施例６ ｃＤＮＡ−２Ｄ６を、公知の技術に従って配列分析した。配列調査は、プラス ミドインサートが、既知の遺伝子又は蛋白質に対して相同性を示さない事を明ら かにした。 配列番号１は、以後「ＧＡＧＥ」と称する同定された遺伝子の為のｃＤＮＡヌ クレオチド情報を表す。推定上のオープンリーディングフレームは、この分子の ５１〜４６７の塩基の所に位置している。実施例７ ｃＤＮＡの配列分析に続いて、実施例６の様に、正常組織の細胞がこの遺伝子 を発現したかを決定する為の実験を行った。これを決定する為に、以下に示す様 に、ノーザンブロッティング(Northern blotting)を、組織及び腫瘍細胞株上で 行った。このブロッティング試験は、配列番号１の完全な配列のｃＤＮＡを使用 した。次いでＰＣＲを使用して結果を確認した。 実施例８ 上に述べたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及びＧＡＧＥ遺伝子情報を利用して、 正常組織と腫瘍についての詳細な分析を行った。 先ず始め、全ＲＮＡを、慣用の方法を使用して特定のサンプルから採取した。 これを、ｃＤＮＡの調製の為に使用した。このｃＤＮＡを作製する為に使用した プロトコールは、逆転写酵素バッファ−５ｘの４μｌ、各ｄＮＴＰの１μｌ、 （１０ｍＭ）、ジチオスレイトールの２μｌ（１００ｍＭ）、ｄＴ−１５プライ マーの２μｌ（２０μｍ）、ＲＮアジン(RNasin)(40 単位／μｌ)の0.5 μl 及 びM-MLV 逆転写酵素(200単位／μl）の１μｌを一緒にする事を含む。次に、６ ．５μｌのテンプレートＲＮＡ（１μｇ／3.25μｌ水、又は合計２μｇのテンプ レートＲＮＡ）を添加した。混合物の全容量は20μｌであった。これを混合し、 42℃で60分間培養し、その後氷上で冷却した。次いで、合計80μｌの水を添加し 、合計100μｌとした。この混合物を、ＰＣＲに使用するまで−２０℃で貯蔵し た。 ＰＣＲを行う為のプライマー （センス）及び （アンチセンス） 配列番号２及び３をそれぞれ使用した。この試薬は、３０．５μｌの水、５μ lのＰＣＲバッフアー１０ｘ、１μｌの各ｄＮＴＰ（１０μＭ）、２．５μｌの 各プライマー（２０μＭ）、及び０．５μｌの重合酵素「ダイナザイム(Dynazym e)」（２単位／μｌ）を含み、全容量を４５μｌとした。ｃＤＮＡの５μｌ全部 を添加した（これは１００ｎｇの全ＲＮＡに相当した）。この混合物を組合せ、 鉱油１滴で層状にした。この混合物を熱循環系(thermocycler block)に移し、９ ４℃に予熱し、増幅を３０サイクル行った。各サイクルの内容は次の通りであっ た。 最初の変性： ９４℃、４分 変性： ９４℃、１分 アニーリング： ５５℃、２分 エクステンション： ７２℃、３分 最終エクステンション： ７２℃、１５分 このサイクルの後、１０μｌの液を、１．５％アガロースゲル上に流し、臭化 エチジウムで染色した。 上に示したプライマーを使用して増幅されたｃＤＮＡは、２３８塩基対合フラ グメント(pair fragment)を生成する。汚染ゲノムＤＮＡが存在しても、その増 幅はない。 結果を以下の表２に示す。これらの結果は、ＧＡＧＥを発現する唯一正常な組 織は睾丸であり、一方、メラノーマ、肺、乳房、喉頭、咽頭、サルコーマ、睾丸 精上皮腫、膀胱及び結腸を含む多数の腫瘍がこの遺伝子を発現する事を示してい る。 この様にして、ＧＡＧＥ遺伝子の発現を分析する事により、これらの腫瘍のど れについても分析が出来る。 前述のサンプルは、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子の単離を示す。 この「ＴＲＡＰ」をコードする分子は、然しながら、上に示した引用例に記載さ れた、以前に開示されたＭＡＧＥ及びＢＡＧＥコード配列とは相同ではない。故 に、本発明の一観点は、配列番号１で示すヌクレオチド配列を含む単離核酸分子 である。この配列は、引用例に開示されたそれら遺伝子のいずれの配列と比較し ても分かる通り、ＭＡＧＥでもなければＢＡＧＥコード配列でもない。また、本 発明の一部は、非−ＭＡＧＥ及び非−ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする が、ストリンジェント条件下において前述開示のヌクレオチド配列を含む核酸分 子に対して交雑する核酸配列でもある。ここで使用される「ストリンジェント条 件」と言う言葉は、当該分野においてはよく知られているパラメーターであり、 更に詳しくは、ここで使用される「ストリンジェント条件」とは、１ＭＮａＣｌ 、１％ＳＤＳ及び１０％デキストラン硫酸中でのハイブリダイゼーションを意味 する。この後、２ｘＳＳＣで、５分間、室温でのフィルターの２回洗浄及び、２ ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、３０分間の１回洗浄が行われる。他の条件、試薬 等が使用でき、同じか又はより高い程度のストリンジェンシーとなる。当業者は 、この様な条件についてはよく知っているであろうから、ここには開示しない。 本発明は、原核（例えば、大腸菌）、又は真核（例えは、ＣＨＯ又はＣＯＳ細 胞）である宿主細胞及び細胞株を形質移入するのと同様に、発現ベクターにおけ る配列の使用を包含する。発現ベクターは、関連配列、即ち上に開示されたそれ らがプロモーターに操作的に結合される事を要求する。ヒト白血球抗原ＨＬＡ− Ｃｗ６は、それらの遺伝子由来の腫瘍拒絶遺伝子を表示する事が見出されている ので、発現ベクターも又ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸配列を含むことが出来 る。ベクターが両方のコード配列を含む場合は、いずれか１つを正常に発現しな い細胞を形質移入するのに使用出来る。腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列は、例え ば、宿主細胞が既にＨＬＡ−Ｃｗ６を発現する時は、単独で使用出来る。勿論、 使用する事の出来る特定の宿主細胞についての制限は存在しない。２つのコード 配列を含むベクターは、所望ならばＨＬＡ−Ｃｗ６発現細胞で使用され得る如く に、腫瘍拒絶抗原前駆体の遺伝子はＨＬＡ−Ｃｗ６を発現しない宿主細胞で使用 出来る。 本発明は又、当業者が所望の発現ベクターを調製出来る様な所謂発現キットを 包含する。その様な発現キットは、前に議論したコード配列のそれぞれの少なく とも別々の部分を含む。所望により、必要とされる前述の配列が含まれる限りに おいて、他の成分を添加してもよい。 本発明の核酸分子及びＴＲＡＰｓを、前述開示のＭＡＧＥ及びＢＡＧＥと区別 する為に、本発明は、遺伝子とＴＲＡＰｓのＧＡＧＥファミリーと称する。それ 故、ここにおいて「ＧＡＧＥ」が使用される時は常に、前述開示の配列によって コードされた腫瘍拒絶抗原前駆体を意味する。「ＧＡＧＥコード分子」及び類似 の言葉は、核酸分子それ自身を述べるのに使用される。 ここにおいて開示される発明は、多数の用途を有し、その幾つかがここに開示 される。第一に、本発明は、当業者がＴＲＡＰの発現で特徴付けられる疾患を診 断する事を可能とする。これらの方法は、ＴＲＡＰ遺伝子及び／又はそれら由来 のＴＲＡｓ、例えばＨＬＡ−Ｃｗ６で表示されるＴＲＡの発現の決定を含む。前 者の場合は、その様な決定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含む任意の標準核酸決定 アッセイ又は標識ハイブリダイゼーションプローブを用いたアッセイにより行う 事が出来る。後者の場合は、ＴＲＡ及びＨＬＡの複合体の為の結合パートナー、 例えば抗体を使用したアッセイが特に好ましい。他の方法は、上に開示されたタ イプのＴＮＦリリースアッセイである。このアッセイを行う為には、睾丸細胞は 通常はＧＡＧＥを発現しないので、これらが存在しない事を確かめる事が好まし い。然しながら、このことは、睾丸と他の細胞は常法により区別する事が出来る から、必須ではない。又、非−睾丸性サンプル中に睾丸細胞を存在させる事は、 実際には不可能である。 ＴＲＡＰ遺伝子の単離は又、ＴＲＡＰ分子それ自身、特に配列番号１によりコ ードされたアミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子の単離を可能とする。ＴＲＡとして 、又はＴＲＡとＨＬＡ、例えばＨＬＡ−Ｃｗ６の複合体として存在した時のこれ ら単離分子は、アジュバントの様な物質と結合して、ＴＲＡＰ分子の発現で特徴 付けられる疾患治療に有用なワクチンを造ることが出来る。更に、ワクチンは、 それらの表面でＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を表示する細胞、例えば非−増殖性癌細胞 、非−増殖性形質移入体等から調製出来る。細胞がワクチンとして使用される全 ての場合において、これらは、ＣＴＬ応答を用意するのに必要な成分の１つ又は 両方のコード配列で形質移入された細胞、又は形質移入なしに両分子を発現する 細胞であり得る。更に、ＴＲＡＰ分子、その会合ＴＲＡｓは、ＴＲＡとＨＬＡの 複合体同様に、当該分野において公知の標準的な方法を使用して、抗体を産生す る のに使用出来る。 ここで使用される「疾患」とは、腫瘍拒絶抗原前駆体が発現するあらゆる病的 状態を意味する。その様な疾患の例には、癌、特にメラノーマがある。メラノー マは、色素産生細胞の癌として良く知られている。 この開示を基にした治療手段は、ＴＲＡ表現細胞、例えばＨＬＡ−Ｃｗ６細胞 の溶解へと導く、被験者の免疫系での応答を前提条件とする。その手段の１つは 、結果において異常細胞の表現型を持つ被験者に対する、複合体に対して特異な ＣＴＬｓの投与である。in vitroでその様なＣＴＬｓを発生させる事は当業者の 技術範囲内である。特に、血球の様な細胞のサンプルは、複合体を表示する細胞 に接触させ、増殖の為の特異ＣＴＬを誘発する事ができる。標的細胞は、例えば 上に述べたタイプのＣＯＳ細胞の様な形質移入体であり得る。これらの形質移入 体は、それらの表面において所望の複合体を表示し、目的のＣＴＬと結合した時 に、その増殖を刺激する。ここで使用した様なＣＯＳ細胞は、他の適当な宿主細 胞同様に広く利用できる。 養子免疫細胞移入と言われる治療法(Greenberg，J．Immunol．136(5): 1917(1 986)；Riddel et al.，Science 257：238(7-10-92)；Lynch et al.，Eur．J．Im munol．21: 1403-1410(1991); Kast et al.，Cell 59: 603-614(11-17-89))を詳 述する為に、所望の複合体を表示する細胞をＣＴＬｓと結合して、それらに特異 なＣＴＬｓを増殖させる。増殖したＣＴＬｓを、次いて関連ＨＬＡ分子を含む特 定の複合体を表示する或る種の異常細胞で特徴付けられる細胞異常性を持つ被験 者に投与する。このＣＴＬｓは異常細胞を溶解し、それによって所望の治療目標 を達成する。 前述の治療は、被験者の異常細胞の少なくとも幾つかは、関連ＨＬＡ／ＴＲＡ 複合体を表示する事を仮定している。これは、関連する配列、この場合はＧＡＧ Ｅ配列のＤＮＡ発現細胞の同定法及び特定のＨＬＡ分子を表示する細胞の同定法 が非常に良く知られているため、極めて容易に決定出来る。関連複合体を表示す る細胞が前述のスクリーニング法で同定されたならば、それらはＣＴＬｓを含む 患者からのサンプルと結合出来る。細胞を表示する複合体が、混合ＣＴＬサンプ ルによって溶解されれば、ＧＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原が存在しており、被験者 は、上に示した治療手段にとって適切な候補者であると推定出来る。 養子免疫細胞移入は、本発明に関して利用できる治療法の唯一の形態ではない 。ＣＴＬｓは、又多数の手段を用いてin vivo でも誘発する事が出来る。１つの 手段、即ち複合体を表示する非−増殖性細胞の使用は、上に詳しく述べられてい る。 このアプローチで使用される細胞は、複合体を正常に発現する細胞、例えば照 射メラノーマ細胞又は複合体の発現に必要な遺伝子の一方又は両方を形質移入さ れた細胞であってもよい。チェン等(Chen et al.,)、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 88: 110-114(January，1991)は、治療的養生法において、ＨＰＶ Ｅ７ペプ チドを発現する形質移入細胞の使用を示して、このアプローチを実証している。 様々な細胞のタイプが使用出来る。同様に、目的の遺伝子の一方又は両方を含 むベクターが使用出来る。ウイルス又はバクテリアベクターは特に好ましい。こ れらの系では、目的の遺伝子は、例えばワクチニアウイルス又はバクテリアＢＣ Ｇによって運ばれ、この物質は、事実上宿主細胞を「感染」させる。この細胞は 目的の複合体を表示することとなり、そして自己由来のＣＴＬｓによって認識さ れ、次いで増殖する。類似の効果は、目的のＨＬＡ／ペプチド複合体を表示する 細胞を表示するＨＬＡ−Ｃｗ６中への導入を促進するために、腫瘍拒絶抗原又は それ自身の前駆体をアジュバンドと結合する事により達成出来る。ＴＲＡＰは、 ＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生成する為に変えられ、一方ＴＲＡは更なる 変更を必要とせずに表示される。 本発明の他の特徴は、当業者にとっては明らかであり、ここに繰り返すまでも ないであろう。 使用された言葉及び表現は、記述の為の言葉として使用されるもので、限定の 為のものではなく、表示及び開示された要旨又はその一部のいかなる均等物をも 排除する為の言葉及表現の使用を意図するものではなく、様々な変更が本発明の 範囲内において可能である事が認識される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/47 14/74 9356−4Ｈ 14/74 Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 0276−2Ｊ 33/574 Ａ 33/574 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者 ボーン ファルア ティリー ベルギー国 ベー1200 ブリュッセル ユ ーセーエル 7459 アベニュー ヒポック ラテ 74

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１で示されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。 ２．配列番号：１で示されるヌクレオチド配列に対して、ストリンジェント条件 下でハイブリダイズし、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子であって 、該単離核酸分子は、ＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体又はＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前 駆体をコードしない単離核酸分子。 ３．配列番号：１のヌクレオチド５１−４６７からなる単離核酸分子。 ４．請求の範囲第１項記載の単離核酸分子に対して相補的である単離ｍＲＮＡ分 子。 ５．請求の範囲第１項記載の核酸分子で形質移入された宿主細胞。 ６．請求の範囲第２項記載の核酸分子で形質移入された宿主細胞。 ７．請求の範囲第３項記載の核酸分子で形質移入された宿主細胞。 ８．プロモーターに機能的に結合された請求の範囲第１項記載の単離核酸分子を 含む発現ベクター。 ９．プロモーターに機能的に結合された請求の範囲第２項記載の単離核酸分子を 含む発現ベクター。 １０．プロモーターに機能的に結合された請求の範囲第３項記載の単離核酸分子 を含む発現ベクター。 １１．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ６を発現する哺乳動物細胞である、請求の範囲 第５項記載の宿主細胞。 １２．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ６を発現する哺乳動物細胞である、請求の範囲 第６項記載の宿主細胞。 １３．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ６を発現する哺乳動物細胞である、請求の範囲 第７項記載の宿主細胞。 １４．ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸分子を更に含む、請求の範囲第８項記載 の発現ベクター。 １５．ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸分子を更に含む、請求の範囲第９項記載 の発現ベクター。 １６．ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸分子を更に含む、請求の範囲第１０項記 載の発現ベクター。 １７．（ｉ）請求の範囲第１項記載の単離核酸分子、及び （ii）ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸分子 それぞれの単離された部分を含む発現キット。 １８．（ｉ）請求の範囲第２項記載の単離核酸分子、及び （ii）ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸分子 それぞれの単離された部分を含む発現キット。 １９．（ｉ）請求の範囲第３項記載の単離核酸分子、及び （ii）ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする核酸分子 それぞれの単離された部分を含む発現キット。 ２０．請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の核酸分子によりコードされた 単離腫瘍拒絶抗原前駆体。 ２１．ＨＬＡ−Ｃｗ６分子で表示される腫瘍拒絶抗原に変化するＧＡＧＥ腫瘍拒 絶抗原前駆体の発現によって特徴付けられる疾患を持つ患者の治療方法であって 、該ＧＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原及びＨＬＡ−Ｃｗ６分子の複合体に対して特異 的であり且つ該複合体を表示する細胞を溶解する細胞溶解性Ｔ細胞の、該疾患回 復の為に十分な量を、該患者に投与する事を含む治療方法。 ２２．配列番号：１のヌクレオチド配列５１−４７６を含む核酸分子によりコー ドされた腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴付けられる疾患を持つ患者の治 療方法であって、ＨＬＡ分子と該腫瘍拒絶抗原前駆体由来の腫瘍拒絶抗原の複合 体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の、該疾患回復の為に十分な量を、該患者 に投与する事を含む治療方法。 ２３．ＨＬＡ−Ｃｗ６分子で表示される腫瘍拒絶抗原に変化するＧＡＧＥ腫瘍拒 絶抗原前駆体の発現によって特徴付けられる疾患を持つ患者の治療方法であって 、該ＧＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ｃｗ６分子の複合体に対して免疫応 答を誘発する薬剤の、該複合体を表示する細胞に対して該応答を誘発するに十分 な量を、該患者に投与する事を含む治療方法。 ２４．配列番号：１のヌクレオチド配列５１−４７６を含む核酸分子によりコー ドされた腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴付けられる疾患を持つ患者 の治療方法であって、ＨＬＡ分子と腫瘍拒絶抗原前駆体の複合体に対して免疫応 答を誘発する薬剤の、該複合体を表示する細胞に対する該免疫応答を誘発するの に十分な量を、該患者に投与する事を含む治療方法。 ２５．正常な睾丸細胞を含まないサンプルを、ＧＡＧＥをコードする核酸分子と ハイブリダイズするプローブ核酸分子と接触させ、疾患の決め手として該核酸分 子への該プローブのハイブリダイゼーションを決定する事を含む疾患決定方法。 ２６．配列番号：１のヌクレオチド配列５１−４７６を含む核酸分子によりコー ドされた腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴付けられる疾患診断方法であっ て、患者からのサンプルを、該配列又はその発現生成物に対して特異的な薬剤と 接触させ、疾患の決め手として該薬剤と該配列又は該発現生成物との間の相互反 応を決定する事を含む診断方法。 ２７．該疾患がメラノーマである請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８．該疾患がメラノーマである請求の範囲第２６項記載の方法。 ２９．該疾患が乳癌である請求の範囲第２５項記載の方法。 ３０．該疾患が乳癌である請求の範囲第２６項記載の方法。 ３１．該疾患が喉頭又は咽頭腫瘍である請求の範囲第２５項記載の方法。 ３２．該疾患が喉頭又は咽頭腫瘍である請求の範囲第２６項記載の方法。 ３３．該疾患がサルコーマである請求の範囲第２５項記載の方法。 ３４．該疾患がサルコーマである請求の範囲第２６項記載の方法。 ３５．該疾患が睾丸精上皮腫である請求の範囲第２５項記載の方法。 ３６．該疾患が睾丸精上皮腫である請求の範囲第２５項記載の方法。 ３７．該疾患が膀胱癌である請求の範囲第２５項記載の方法。 ３８．該疾患が膀胱癌である請求の範囲第２６項記載の方法。 ３９．該疾患が結腸癌である請求の範囲第２５項記載の方法。 ４０．該疾患が結腸癌である請求の範囲第２６項記載の方法。 ４１．配列番号：２及び配列番号：３から成る群から選ばれる単離核酸分子。