JPH08506100A - Ｈｌａ−ａ２／チロシナーゼペプチド抗原を発現する異常細胞を有する個体の検出と治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、異常細胞上に於けるヒト白血球抗原分子とチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体の同定に関する。本発明の課題は、この知見から導かれる治療的及び診断的応用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼペプチド抗原を発現する異常細胞を有する個体の検 出と治療関連出願 本出願は、同時係属の１９９２年１２月２２に出願された米国特許出願第９９ ４，９２８号の一部継続出願であって、同時係属する１９９３年４月２８日出願 の米国特許出願第０５４，７１４号の一部継続出願である。発明の分野 本発明は、ある種の異常細胞がその表面にヒト白血球抗原とチロシナーゼ由来 のペプチドとの複合体を提示するという観察から派生する様々な治療方法に関す る。加えて本発明は、このような複合体、その提示されたペプチド、それらの派 生体（ramification）とを提示する異常細胞の細胞異常によって特徴付けられる 症状を有すると診断される個体の同定の可能性とに関する。発明の背景 ほ乳類の免疫システムが外来物質又は異物を認識しこれらに対して反応するプ ロセスは複雑なものである。このシステムの重要な側面は、Ｔ細胞反応である。 この反応の為には、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）又は主要組織適合性複 合体（ＭＨＣ）と称される細胞表面分 子とペプチドとの複合体を認識し、これらに対して反応する必要がある。これら ペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によって処理される比較的 大きな分子から由来するものである。この点に関しては、メール（Ｍａｌｅ）他 のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｃ ｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６〜１０章参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプ チド複合体との間の相互作用は、特定のＨＬＡ分子とペプチドとの複合体に対し て特定のＴ細胞が必要であるという意味において、制限されている。即ち、もし 特定のＴ細胞が存在しないならば、たとえそのパートナー複合体が存在してもＴ 細胞反応は起こらない。同様に、もし特定の複合体が存在していても、特定Ｔ細 胞が無ければ反応は起こらない。このメカニズムが、自己免疫疾患に於ける異物 に対する免疫システムの反応、及び細胞異常に対する免疫システムの反応に関係 している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドへと処理されるメカニズムに 関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇ ａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏ ｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９（１９９２）；マツムラ（Ｍａｔｓ ｕｍｕｒａ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７（１９９２）；ラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６４（１９９２）参照。 Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、癌にも関係している。例えば、こ こに参考文献として添付する、１９９２年５月２２日に出願され１９９２年１１ 月２６日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４に於て、一つの 遺伝子グループが開示されている。これらの遺伝子は、ペプチドへと処理され、 これらのペプチドが細胞表面に発現することによって、特定のＣＴＬによる腫瘍 細胞のリーシス（細胞溶解）が可能となる。これらの遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原 先駆体」、略称「ＴＲＡＰ」分子をコード化するものであると言われており、こ れらに由来するペプチドは「腫瘍拒絶抗原」即ち「ＴＲＡ」と称される。この遺 伝子グループに関する更に詳しい情報については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅ ｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５（１９９２）；フ ァン・デア・ブルッゲン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ２５４：１６４３（１９９１）参照。 ここに参考文献として添付した米国特許出願第９３８，３３４号には、前記Ｈ ＬＡ−ＡＬ分子に結合するノナペ プチドが教示されている。この文献に依れば、特定のＨＬＡ分子に対する特定の ペプチドの特異性が判っていれは、ひとつの特定のペプチドは一つのＨＬＡにし か結合しないと予測出来るとされている。これは重要である。というのは、ＨＬ Ａの表現型は個々人によって異なっているからである。その結果、特定のペプチ ドが特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであることの同定は診断的及び治療的 効果を有しており、これらは、その特定のＨＬＡ表現型を有する個体にのみ関係 する。従って、細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られておらず、また標 的療法の為には問題の異常細胞の表現型に関するなんらかの知識が必要であるた め、この領域に於て更なる研究が必要である。 酵素チロシナーゼは、チロシンをデハイドロキシフェニールアラニン即ち”Ｄ ＯＰＡ”へ変換する反応に対して触媒作用を及ぼし、これはメラニン細胞に選択 的に発現されると思われる（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）他，ＥＭＢＯＪ ７：２ ７１５（１９８８））。ヒト酵素に関するｃＤＮＡの比較的初期の報告はＫｗｏ ｎの米国特許第４，８９８，８１４号に見られる。そして、バウチャード（Ｂｏ ｕｃｈａｒｄ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：２０２９（１９８９）による より最近の報告に は、僅かに異なった配列が提示されている。この酵素に対するインヒビタに関し て非常に多くの研究が行われてきた。というのは、それが色素形成疾患に関係し ていたからである。この点に関する参考文献としては、例えば、ジンバウ（Ｊｉ ｎｂｏｗ．）ＷＯ９１１６３０２；シマ（Ｍｉｓｈｉｍａ）他，米国特許第５， ０７７，０５９号、ナザロポア（Ｎａｚｚａｒｏｐｏｒ）米国特許第４，８１８ ，７６８号が挙げられるが、類似の物質を教示する他の参考文献は当業者にとっ ては周知であろう。 しかしながら、これらの参考文献には、チロシナーゼが異物抗原又はＴＲＡＰ 分子に類似の方法によって処理可能である、ということを教示又は示唆したもの はない。即ち、今回初めて、黒色腫等のある種の細胞異常において、チロシナー ゼが処理され、それから派生するペプチドがある種の異常細胞上のＨＬＡ分子と 複合体を形成するということが判ったのである。これらの複合体は、細胞溶解Ｔ 細胞（ＣＴＬ）によって認識され、これらの細胞溶解Ｔ細胞がその表出細胞を溶 解するのである。この驚くべき、かつ意外な現象から導かれる応用が本発明の課 題である。以下の記載によって本発明を詳述する。図面の簡単な説明 図１は、すべて細胞溶解に関する研究を説明するもの であり、ここで、 図１Ａは、細胞ラインＬＢ２４の溶解を示し、 図１Ｂは、細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬの溶解を示し、 図１Ｃは、細胞ラインＬＢ４．ＭＥＬの溶解を示し、 図１Ｄは、細胞ラインＳＫ２３．ＭＥＬの溶解を示し、 図１Ｅは、細胞ラインＬＥ５１６．ＭＥＬの溶解を示し、 図１Ｆは、ＮＫ標的Ｋ５６２に関する溶解の研究を示し、 図１Ｇは、自己由来のＥＢＶ−Ｂ形質転換細胞の溶解を示し、 図１Ｈは、ＨＬＡ−Ａ２に対する遺伝子による移入後に於ける図１Ｆの喪失変 異体（ｌｏｓｓ ｖａｒｉａｎｔ）の溶解を示し、 図１Ｉは、自己由来ＩＥＢＶ−β形質転換細胞の溶解を示し、 図２は、ＣＴＬ ＩＶＳＢのＴＮＦ放出の研究を示し、 図３は、ＣＴＬ ２１０／９のＴＮＦ放出の研究を示し、 図４は、ペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶが細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ−ＩＶ ＳＢによって認識されるが細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ２／９によっては認識 されな いことを示し、 図５は、ペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶが細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ２／９ によっては認識されないことを示し、 図６は、表面にＨＬＡ−Ｂ４４を提供する細胞を含む種々の細胞に対してＴＮ Ｆ放出アセイを行うことによって得られた結果を示す。好適実施例の詳細な説明 例１ 以下の実験において、研究者にとって古くから入手可能であった黒色腫細胞ラ インＳＫ ２９−ＭＥＬ（文献においてはＳＫ ＭＥＬ−２９とも称される）と ＬＢ２４−ＭＥＬとを使用した。 患者のＡＶ及びＬＢ２４−ＭＥＬから（これらの患者から、それぞれ、ＳＫ２ ９−ＭＥＬとＬＢ２４−ＭＥＬも採取した）、単核血液細胞を採取した。これら サンプルを含む単核血液細胞に、黒色腫細胞ラインを接触させた。この混合物の 黒色腫の溶解を観察したところ、サンプル中に、黒色腫細胞によって提示された ペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的な細胞溶解Ｔ細胞（ＣＴＬ）が 存在していることが判った。 使用した溶解アセイは、その開示内容をここに参考文 献として添付するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．ＪＣａｎｃｅｒ ３９：３ ９０〜３９６（１９８７）に依るクロム放出アセイであった。しかし、このアセ イについては、ここにおいても説明する。標的黒色腫細胞を生体外で成長させ、 次に、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと３０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で １０⁷細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄ と共に３７℃で４５分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを 添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１ ０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で再懸濁させ、その後、それぞれ１０³の 細胞を含む１００μｌのアリコットを９６ウェルのマイクロプレートに分けた。 １００μｌの同じ培地にＰＢＬのサンプルを添加し、同様にアセイを行った。プ レートを１００ｇで４分間遠心分離にかけ、５．５％の二酸化炭素を含有する雰 囲気中にて３７℃で培養した。 プレートを再び遠心分離にかけ、１００μｌの上清のアリコットを収集し、計 数した。⁵¹Ｃｒ放出の割合は以下の式によって表される。 ここで、ＥＲは、観察された実験 ⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³の標識化細胞 を２００μｌの培地だけの中で培養することによって測定された自然放出量、そ してＭＲは、標的細胞に１００μｌの０．３％トリトン（Triton）Ｘ−１００を 添加することによって得られた最大放出量である。 高いＣＴＬ活性を示したこれらの単核血液サンプルを、拡張（ｅｘｐａｎｄｅ ｄ）して制限希釈によってクローン化し、前述と同じ方法によって再度スクリー ニングした。 標的Ｋ５６２細胞のテストも同じ方法で行った。ＥＶＢ−Ｂ細胞を使用した時 の唯一の相違点は、ＤＭＥＭ培養基の代わりに、５％のＦＣＳを添加したハンク （Ｈａｎｋ）培地を使用したことであった。 これらの実験によって、患者ＡＶからＣＴＬクローン”ＩＶＳＢ”と、患者Ｌ Ｂ２４からＣＴＬクローン２１０／９とがそれぞれ分離された。 図１のＡ，Ｂ，Ｇ及びＩは、それぞれ、これらの分析の結果を示している。こ れらから、両方のＣＴＬが両方の黒色腫細胞ラインを溶解したことと、Ｋ５６２ 及びＥＢＶ−Ｂ細胞ラインは溶解されなかったこと、とが判る。例２ 前述のＣＴＬを他の黒色腫細胞ラインに対してもテストし、これらのＣＴＬが 他の黒色腫細胞ラインをも標的とすることか出来るかどうかを調べた。細胞ライ ンＬＢ４．ＭＥＬ、ＳＫ２３．ＭＥＬ（ＳＫ ＭＥＬ−２３としても知られてい る）及びＬＥ５１６．ＭＥＬに対して例１に記載した溶解を研究した。図１のＣ 、Ｄ及びＥは、前記クローンがこれらの細胞ラインをも溶解したことを示してい る。 テストしたラインはＨＬＡ−Ａ２であることが知られでおり、その実験結果は 、前記ＣＴＬがペプチドとこのＨＬＡ−Ａ２との複合体に対しても特異性を有し ていることを示唆している。更に、この示唆は、ＨＬＡ−Ａ２発現を喪失したＳ Ｋ２９−ＭＥＬの変異体をテストすることによって事実であることが確かめられ た。即ち、どちらのクローンもこのＨＬＡ−喪失変異体は溶解しなかったのであ る。但し、この変異体をＳＫ２９−ＭＥＬのＨＬＡ−Ａ２遺伝子で移入し、再テ ストした場合には、溶解が観察された。従って、提示する分子はＨＬＡ−Ａ２で あると結論付けることができる。例３ 提示分子としてＨＬＡ分子が同定されたので、提示し たペプチドの源である、以下の記載において「腫瘍拒絶抗体先駆体」即ち”ＴＲ ＡＰ”分子と呼称される分子を同定するための研究を行った。 この目的のために、ＳＫ２９−ＭＥＬのサブクローンである細胞ラインＳＫ２ ９−ＭＥＬ．１からそのＲＮＡ全体を分離した。このＲＮＡの分離は、オリゴ− ｄＴ結合キットを使用し、周知の技術に従って行った。ＲＮＡ全体を得た後、こ れを、再び標準方法を使用して、ｃＤＮＡに転写した。このｃＤＮＡを、製造業 者の指示に従って、ＥｃｏＲＩアダプタに結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／ ＡｍｐのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。次に、これらの組替えプラスミドを ＪＭ１０１ Ｅ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションした（エレクトロポレーシ ョン条件：２５μファラドで１パルス、２５００Ｖ）。 移入したバクテリアをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）によって選択し、次に 、それぞれ２００のクローンを有する７００のプールに分割した。分析したとこ ろ約５０％のプラスミドが挿入体を有していたので、各プールは、約１００種類 のｃＤＮＡを示したことになる。各プールを増幅して飽和させ、プラスミドＤＮ Ａを、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）に従い、アル カリ溶解、酢酸塩カリウム沈澱、フェノール抽出によって分離した。セシウム勾 配遠心分離は使用しなかった。例４ 増幅したプラスミドを真核細胞に移入した。ＣＯＳ−７のサンプルを、１０％ の胎児ウシ血清を添加したダルベコ変成イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍ ｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中にて、組織培養 平底マイクロウェルに１５，０００細胞／ウェルの割合で播種（seed）した。こ れらの細胞を、３７℃で一晩培養し、培地を除去し、これを、１０％のＮｕ血清 、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−テキストラン、１００μＭのクロロキン、１０ ０ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２、及び前述のｃＤＮＡライブ ラリのプールの１００ｎｇのＤＮＡを含有する３０μｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地 によって置換した。プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２は、ＳＫ２９−Ｍ ＥＬからのＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含有している。３７℃にて４時間の培養後、前 記培地を除去し、１０％のＤＭＳＯを含有する５０μｌのＰＢＳによって置換し た。この培地を２分後に除去し、１０％のＦＣＳ を添加した２００μｌのＤＭＥＭによって置換した。 この培地の変更後、ＣＯＳ細胞を３７℃で４８時間培養した。次に、培地を捨 て、２０００細胞の前述のＣＴＬクローンのいずれかを、１０％のプールされた ヒト血清を含有する１００μｌのアイスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地中にて、添 加した。クローン２１０／９が使用された場合には、培地に２５Ｕ／ｍｌのＩＬ −２を添加した。２４時間後、上清を除去し、この文献の開示内容を参考文献と して添付したトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ｅｔｉｃｓ ３５：１４５〜１５２（１９９２）に記載されているように、ＷＥ ＨＩ細胞上のアセイによってＴＮＦ含有率を測定した。 ＩＶＳＢでテストされた７００のウェルの内、６９６のウェルが１ミリリット ル当り０．６ないし４ｐｇのＴＮＦを示した。残りの４つのウェルは、１ミリリ ットル当り１０ないし２０ｐｇのＴＮＦを含有していた。ＣＴＬ２１０／９でテ ストした同一のウェルも、類似の、明らかにより高い値を示した。図２及び３に これらのデータを示す。例５ 高生成プールとして同定された４つのプールの内の３つ（番号”１２３”，” １８１”及び”３８４”）を選 択して更に実験を行った。具体的には、バクテリアをクローン化し、各プールか ら５７０のバクテリアをテストした。そこからプラスミドＤＮＡを抽出し、前述 と同じ方法により、ＣＯＳ細胞の新しいサンプルに移入し、これらの細胞のＣＴ Ｌ２１０／９及びＣＴＬ ＩＶＳＢの刺激に対して再度テストした。一つの陽性 クローンがプール１２３（”ｐ１２３．Ｂ２”）に見つかり、もう一つがプール ３８４（”ｐ３８４．Ｃ６”）に見つかった。ｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ２遺伝子と で移入したＣＯＳ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２のみで移入したＣＯＳ細胞との比較テス トをすることによって、移入された細胞がＣＴＬによって認識されたという確証 が得られた。ＣＴＬ上清中のＴＮＦの放出量を、ＷＥＨＩ細胞上のテストによっ て測定した。生存ＷＥＨＩ細胞の光学濃度をＭＴＴを使用した測定した。その結 果を表１に示す。 ＷＥＨＩ ＯＤの値は、ｃＤＮＡ及びＨＬＡ−２Ａについては２４ｐｇ／ｍｌの ＴＮＦに対応し、一方、コントロールに対しては２．３ｐｇ／ｍｌであった。 前記陽性クローンからのプラスミドを取り出し、公知の技術によって配列決定 した。その配列を調べたところ、そのプラスミド挿入体は、その開示内容を参考 文献として添付するバウチャード（Ｂｏｕｃｈａｒｄ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１６９：２０２９（１９８９）に記載されているように、ヒトのチロシナーゼ のｃＤＮＡ配列とほとんど同一であることが判った。従って、正常に発生する分 子（即ち、チロシナーゼ）が、腫瘍拒絶抗原先駆体として作用し、これが処理さ れて、ＨＬＡ−２Ａとともに細胞の表面に提示されるペプチド腫瘍拒絶抗原を形 成し、これによってＣＴＬクローンによる溶解を刺激するものと推測される。同 定された分子の核配列は配列 認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１として示されている。例６ チョメス（Ｃｈｏｍｅｚ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：２４１（ １９９２）によって報告されている先行研究は、抗原的ペプチドをコード指定す る配列を含む小さな遺伝子フラグメントによって該ペプチドの発現が生じること を示した。その全部を参考文献としてここに添付するこの研究は、前述し、配列 認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１に示したヒトチロシナーゼｃＤＮＡの小部 分のクローン化を示唆している。前述の例１〜５に記載した方法を使用して、ｃ ＤＮＡの様々なフラグメントをＣＯＳ−７細胞中でＨＬＡ−Ａ２の遺伝子と共移 入し、ＴＮＦ放出アセイを行った。これらの実験によって、共移入実験に使用さ れた時に、ＨＬＡ−Ａ２表出細胞に対する特異性を有することが示された前述の 細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ ＩＶＢＳからのＴＮＦ放出を刺激する約４００ 基本対のフラグメントが同定された。使用した４００基本フラグメントは、配列 認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１のベース７１１から１１５２に対応してい た。このフラグメントがコード化するアミノ酸配列が推定され、次にこの推定配 列をハント（Ｈｕｎｔ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１（１９９２）及びフォーク（Ｆａｌｋ）他， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０（１９９１）によって提供された情報と比較し た。これらの文献の開示内容の全体を参考資料としてここに添付する。これらの 文献は、ＨＬＡ−Ａ２表出ペプチドのコンセンサス配列について記載している。 具体的には、ハント（Ｈｕｎｔ）はノナペプチドについて議論し、Ｌｅｕ又はＩ ｌｅが常に第２位置に見出され、Ｌｅｕが「優性の（dominant）残基」であると 述べている。第９の残基は、必ず脂肪族炭化水素側鎖を備えた残基であると記載 されている。、Ｖａｌは、この位置における優性な残基である。ハント（Ｈｕｎ ｔ）は、第２位置においてＶａｌに対する強力な信号とＭｅｔに対して中程度の 信号が存在し、位置６においてはＶａｌ，Ｌｅｕ，ＩｌｅまたはＴｈｒのいずれ か一つ、位置９においてはＶａｌ又はＬｅｕのいずれかか存在し、Ｖａｌが特に 強力であると述べている。前記比較のベースとして、ノナペプチドを合成し、次 に、これらがＨＬＡ−Ａ２提示細胞を抗原に対して敏感にさせることが出来るか どうかをテストした。この目的のために、チロシナーゼ喪失変異体細胞ラインＳ Ｋ２９−ＭＥＬ １．２１８及びＴ２０２ＬＢを使用した。これらの細胞ライン に対して、細胞溶解Ｔ細胞ク ローンＣＴＬ ＩＶＳＢ又は細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ２／９とともに、テ ストしたペプチドを様々な濃度で添加した。前述した従来の研究によって、前者 のクローンは、ＨＬＡ−２Ａを表出するチロシナーゼ発現細胞を溶解したが、後 者のクローンはこれを溶解しないことが示された。 上記チロシナーゼ喪失変異体を、空の（ｅｍｐｔｙ）ＨＬＡ−Ａ２分子を安定 化させるために使用する抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１を添加、又は無添加の条 件下で、３７℃にて⁵¹Ｃｒを含有する溶液中にて１時間培養した。これらのテス トにおいて、細胞は４回洗浄され、１００μＭから０．０１μＭまでの種々の希 釈度のペプチドとともに培養した。３０分後、エフェクター細胞をＥ／Ｔ比４０ ／ｌで添加し、４時間後１００λの上清を収集し、放射能計数を行った。 図４は、ノナペプチドＴｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓ ｅｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ（配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２）で得られた 結果を示している。 以下配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２と称するこのペプチドは、配列 認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１に表されたチロシナーゼに対するｃＤＮＡ 配列の残基 １１２９〜１１５５に対応している。ＨＬＡ−２Ａとこのペプチドとの複合体は ＣＴＬクローンＣＴＬ ＩＶＳＢによって認識される。 平行して行った実験において、患者ＬＢ２４からのＣＴＬクローンＣＴＬ２１ ０／９は、ＨＬＡ−２Ａとチロシナーゼ由来のペプチドとの複合体は認識するが 、ＨＬＡ−２Ａとこの配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２のペプチドとの 複合体は認識しないことが判った。従って、チロシナーゼは、ＨＬＡ−２分子に よって提示された時にＣＴＬクローンによって認識される少なくとも一つの別の ペプチドに処理される。例７ 追跡実験に於て、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２のペプチドをコー ド化しない第２の遺伝子フラグメントを使用した。このフラグメントは、配列認 識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１のベース１に始まり、ベース１１０１で終端 していた（即ち、ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメント）。前述の細胞溶解Ｔ細胞 クローンＣＴＬ２１０／９を、前述の方法で、このフラグメントと移入したＣＯ Ｓ−７細胞に対してテストした。ＣＴＬＩＶＳＢもテストした。これらの結果、 ＬＢ２４−ＣＴＬ２１０／９は、このフラグメントと移入したＨＬＡ− Ａ２細胞の表面上の抗原は認識するが、ＣＴＬ ＩＶＳＢはこれを認識しないこ とが判った。このように第２の腫瘍拒絶抗原ペプチドはチロシナーゼから導かれ る。例８ ＬＢ２４−ＣＴＬ ２１０／９によって認識される前記腫瘍拒絶抗原を更に明 確化するために、以下の実験を行った。 配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１のベース４５１〜１１５８に対応す る第２のフラグメントを、ＨＬＡ−Ａ２の遺伝子と共にＣＯＳ細胞に移入し、Ｔ ＮＦ放出アセイを行った。この配列は、クローンＳＫ２９−ＣＴＬ ＩＶＳＢ（ ２０ｐｇ／ｍｌ）からのＴＮＦの放出は刺激したが、ＬＢ２４−ＣＴＬ ２１０ ／９（３．８ｐｇ／ｍｌ）からの放出は刺激しなかった。これらの結果により、 これら二つのＣＴＬクローンはそれぞれ別のペプチドを認識し、ＬＢ２４−ＣＴ Ｌ ２１０／９によって認識されるペプチドは、領域１〜４５１によってコード 化されなければならないことが確認された。例９ ｃＤＡＮフラグメント１〜４５１によってコード化されるチロシナーゼ由来ペ プチドは、ＨＬＡ−２Ａに結合することが知られているコンセンサス配列に対し て分析 された。これらのコンセンサス配列に対応するペプチドを合成し、そのＨＬＡ− ２Ａ表出細胞を抗体に対して敏感化させる能力についてテストした。この目的の ために、サルター（Ｓａｌｔｅｒ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２１：２ ３５〜２４６（１９８５）に記載されているように、二つのチロシナーゼ陰性黒 色腫細胞ライン（即ち、ＮＡ８−ＭＥＬと、ＨＬＡ−２Ａによって移入されたＭ Ｚ２−ＭＥＬ ２．２）と、細胞ラインＴ２とを使用した。 これらの細胞を⁵¹Ｃｒと、ＨＬＡ−２Ａに対して特異的なモノクローナル抗体 ＭＡ．２．１と共に３７℃で５０分間培養し、その後、洗浄した（ボドマー（Ｂ ｏｄｍｅｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４４３〜４４６（１９８９）この文献 の開示内容全部をここに参考資料として添付する）。標的細胞は様々な濃度のペ プチド及びＬＢ ２４−ＣＴＬクローン２１０／５又は２１０／９のいずれかと ともに培養した。４時間の培養後、クロム放出率を測定した。 ペプチドＭｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ （配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３）は活性である ことが判った。 ここに要約する更に別の実験において、前の実験でＹＭＮＧＴＭＳＱＶを認識 することが示されたＣＴＬ−ＩＶＳＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のペプチドは 認識しなかった。 この結果が次の表２−４にまとめられている。 ＣＴＬ細胞は、表示の（Ｅ：Ｔ）比で添加した。 特異的Ｃｒ５１放出率は、４時間の培養後に測定した。 ＣＴＬ細胞は、表示のＥ：Ｔ比で添加した。 特異的Ｃｒ-５１放出％は、４時間の培養後に測定した。例１０ ＣＴＬクローン２２／３１を使用して更に別の実験を行った。このクローンは 、自己由来黒色腫細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬからのサブラインＭＺ２−ＭＥＬ． ４３は溶解するか、ＭＺ２２−ＭＥＬ３．０やＭＺ２−ＭＥＬ６１．２等の他の サブライン、あるいは、自己由来ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞、キラー細胞ラインＫ５ ６２は溶解しないことが、以前に示されていたものである（ファン・デン・エイ ンデ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４４：６ ３４〜６４０（１９８９）参照）。ＭＺ２２−ＭＥＬ．４３によって提示される 抗原を抗原Ｃと称する。 本出願の親出願に報告されているものを含めた過去の研究において、チロシナ ーゼ遺伝子が、大半のＨＬＡ−Ａ２黒色腫の自己由来ＣＴＬによって認識される 抗原を コード化することが判った。この遺伝子の細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬのサブライ ン上に於ける発現を、ＰＣＲ増幅によってテストした。その結果、クローンＭＺ ２２−ＭＥＬ．４３は、陽性であることが判ったが、一方、ＭＺ２−ＭＥＬ．３ ．０等の他のＭＺ２−ＭＥＬクローンは陰性であった。チロシナーゼ遺伝子の発 現と抗原ＭＺ２−Ｃとの相関関係は、ＭＺ２−Ｃがチロシナーゼ由来の腫瘍拒絶 抗原であり、ＭＺ２−Ａ２によって発現されるＨＬＡ分子によって提供されるも のであるかもしれないことを示唆した。この細胞ラインは、ＨＬＡ−Ａ２を発現 せず、これは、チロシナーゼ由来のペプチドがＴＲＡとして提示された場合には 、第２のＨＬＡ分子が関係しているということを示すものである。 どのＨＬＡ分子がＣＴＬ２２／３１に抗原Ｃを提示したかを同定する研究を行 った。これを調べるために、細胞表面上に存在することが知られているＨＬＡ分 子のｃＤＮＡクローン、即ち、ＨＬＡ−Ａ２９，ＨＬＡ−Ｂ３７，ＨＬＡ−Ｂ４ ４．０２及びＨＬＡ−Ｃクローン１０、をＭＡ２−ＭＥＬ．４３ｃＤＮＡライブ ラリから分離し、次に、これらを発現ベクトルｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン 化した。その後、受容体ＣＯＳ７細胞に、これらの構造体のひとつ又はＨＬＡ− Ａ１を含む単数の構 造体、および、チロシナーゼをコード化するｃＤＮＡ（配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１）とを移入した。この共移入は前述の方法で行った。１日間後 、ＣＴＬ ２２／６１を添加し、その２４時間後、前述のトラヴァーサリ（Ｔｒ ａｖｅｒｓａｒｉ）他に従って、ＷＥＨＩ−１６４０１３上の細胞毒性をテスト することによってＴＮＦ放出量を測定した。図６は、ＨＬＡ−Ｂ４４とチロシナ ーゼとの両方を移入した細胞が存在するときにのみＣＴＬ ２２／３１によって ＴＮＦが放出されたことを示している。このことから、ＨＬＡ−Ｂ４４がチロシ ナーゼ由来腫瘍拒絶抗原を提示するものであると結論される。 前述の諸実験は、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆物質として処理され、その 結果得られる腫瘍拒絶抗原と少なくともいくつかの異常細胞上、例えば、ＨＬＡ −Ａ２やＨＬＡ−Ｂ４４等の表現型を有する黒色腫細胞上、の分子との複合体が 形成されるものであるということを示している。そして、この複合体が、ＣＴＬ によって認識可能であり、その結果、提示細胞が溶解されるのである。この知見 を様々な形で治療的及び診断的に利用することが可能であり、これらの応用が本 発明の特徴を構成するものである。治療に関しては、上述の複合体を提示する 異常細胞に対して特異的なＣＴＬが生成されるという知見から、様々な治療のア プローチが示唆される。一つのそのようなアプローチは、問題の表現型の異常細 胞を有する患者に対して、その複合体に対して特異的なＣＴＬを投与することで ある。尚、このようなＣＴＬを生体外で開発することは当業者にとって容易であ ろう。具体的には、血液細胞等の細胞のサンプルを、前記複合体を提示し特定の ＣＴＬの増殖を刺激する細胞に接触させる。標的細胞は、前述のタイプのＣＯＳ 細胞等の移入体であってよい。これらの移入体は、その表面に所望の複合体を提 示するものであり、問題のＣＴＬと結合した時に、その増殖を刺激するものであ る。当業者のこれらのＣＴＬの製造を可能にするために、問題の遺伝子を含むベ クター、即ち、ｐｃＤＮＡ−１／Ａｍｐ１（ＨＬＡ−Ａ２）及ひｐ１２３．Ｂ２ （ヒトチロシナーゼ）を、ブタペスト条約に基づいて、パスツール研究所に寄託 し、これらは、それぞれ承認番号１１２７５及び１１２７６を与えられている。 ここに使用されているようなＣＯＳ細胞は広範囲に入手可能であり、他の適当な ホスト細胞も同様である。 アドプティブ（ａｄｏｐｔｉｖｅ）転写（グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒ ｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６（５）：１９１７（１９８６）； レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２５７：２３８（７−１０−９２）；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他，Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３〜１４１０（１９９１）；カスト（Ｋ ａｓｔ）他，Ｃｅｌｌ ５９：６０３−６１４（１１−１７−８９））と称され る治療方法について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞を、ＣＴＬと結合 させ、それに対して特異的なＣＴＬを増殖させる。次に、この増殖したＣＴＬを 、その特定の複合体を提示する異常細胞のいくつかによって特徴付けられる細胞 異常を有する患者に投与する。すると、ＣＴＬがこれらの異常細胞を溶解し、そ の結果、所望の治療目的が達成される。 上記治療方法は、被検体の異常細胞の内の少なくともいくつかの細胞が前記Ｈ ＬＡ／チロシナーゼ由来ペプチド複合体の内の一つまたはいくつかを提示するこ とを前提としている。これは容易に判定することができる。例えは、前述した移 入体を使用してＣＴＬを同定し、分離後、これらＣＴＬを被検体の異常細胞のサ ンプルとともに使用して生体外で溶解を判定することができる。溶解が観察され た場合には、そのような治療方法に特定ＣＴＬを使用することによって、その異 常細胞に関連する症状 を軽減することができる。より簡単な方法は、標準式アセイを使用して異常細胞 の表現型を調べ、ＰＣＲ等を利用した増幅によってチロシナーゼの発現を判定す る方法である。種々の複数のＨＬＡ分子がチロシナーゼ由来のＴＲＡを提示する ので、ここに記載した治療方法によって適切に治療される患者の数は多い。 アドプティブ転写のみが本発明において利用可能な治療方法ではない。多数の アプローチを使用してＣＴＬを生体内で刺激することかできる。その内の一つの アプローチ、即ち、前記複合体を表出する非増殖性細胞の使用については既に記 載した。このアプローチに使用される細胞は、放射線照射した黒色腫細胞や、前 記複合体の提示に必要な遺伝子の一つ又は両方を移入した細胞等の、該複合体を 正常時に発現する細胞であってよい。チェン（Ｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ ８８：１１０〜１１４（１９９１年１月）には、 このアプローチの一例が記載されており、ここでは、治療領域にＨＰＶＥ７ペプ チドを提示する移入細胞が使用されている。細胞のタイプも様々なものを使用す ることかできる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を有するベクターを使用 することができる。ウィスル性又はバクテリア性ベクターが特に好ましい。これ らのシステム において、問題の遺伝子は、例えばワクシニアビールスやバクテリアＢＣＧ等に よって収容され、これらの材料が、実質上ホスト細胞に「感染」する。その結果 、これらの細胞は、問題の複合体を提示し、これらが自己由来ＣＴＬによって認 識され、次に増殖するのである。チロノナーゼ自体と、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞へ の組み込みを促進するアジュバントとを結合することによっても類似の効果を達 成することができる。次に、該酵素が加工されてＨＬＡ分子のペプチドパートナ ーを作る。 以上の記載において、「異常細胞」及び「細胞異常」という表現が使用されて いる。これらの表現はここではその最も広い意味に解釈されるべきものであり、 これらは、問題の細胞が、この細胞と同じタイプの正常な細胞と異なっているこ とを示す少なくとも一つの特性を示しているようなすべての状況を指している。 異常特性の例としては、形態上の変化や、生化学的変化があり、細胞異常として は、黒色腫等の腫瘍、自己免疫障害、等が含まれる。 本発明は、更に、ＣＴＬ標的への先駆物質を同定する方法を提供する。これら の先駆物質は、標的細胞が腫瘍である場合には、腫瘍拒絶抗原と呼ばれるが、但 し、異常によって特徴付けられるその細胞が腫瘍ではなない場 合には、この分子を腫瘍拒絶抗原と呼ぶことは誤解を招くことを指摘しなければ ならない。本質的に、該方法は、前述したタイプの細胞溶解Ｔ細胞の標的である 細胞を同定することに関する。そのような細胞が同定されると、その全ＲＮＡを ｃＤＮＡライブラリに転換し、次にこれを、関連するＨＬＡ分子と複合体を形成 する抗原を提示可能な細胞サンプルに移入する。これら移入体を、前述のＣＴＬ に接触させ、再び、ＣＴＬによる標的化を観察する（溶解及び／又はＴＮＦ生成 ）。次に溶解されたこれらの移入体を、処理してｃＤＮＡを除去し、配列決定す る。このようにして、腫瘍拒絶先駆物質等の、異常状態の先駆物質を同定するこ とができる。 本発明のその他の側面は当業者にとって明白であろう。従って、ここで繰り返 すことは避ける。 尚、ここに使用した用語及び表現は記載のためのものであって限定のためのも のではなく、これらの用語及び表現の使用においてここに図示及び記載した特徴 構成の均等物を排除する意図は無く、本発明の範囲内においてその他様々な改変 が可能である。 (1) 一般情報： (i) 出願人： ブーン‐ファラー，ティエリー； ブリチャード，ヴィンセント； ファン・ペル，アリーン； デ・プラーン，エティエンヌ； クーリ，ピエール； ルノー，ジャン・クリストフ； ヴォルフェル，トーマス； レーテー，ベルナール (ii) 発明の名称：HLA-A2/チロシナーゼペプチド抗原を発現する 異常細胞を有する個体の検出と治療 (iii) 配列の数： ３ (iv) 連絡先： (A) 宛名 ： フェルフェ・アンド・リンチ (B) 通り名 ： サード・アベニュー 805 (C) 都市名 ： ニューヨーク・シティ (D) 州名 ： ニューヨーク (E) 国名 ： アメリカ合衆国 (F) 郵便番号： 10022 (v) コンピュータ読み取り可能フォーム (A) 媒体型式： 5.25 インチ フロッピーディスク， 360 kb メモリ (B) コンピュータ： IBM PS/2 (C) オペレーティング・システム： PC-DOS (D) ソフトウェア： ワードパーフェクト（Wordperfect） (vi) 先の出願データ (A) 出願番号： 08/054,714 (B) 出願日 ： 1993年４月28日 (A) 出願番号： 994,928 (B) 出願日 ： 1992年12月22日 (A) 出願番号： 08/081,673 (B) 出願日 ： 1993年6月23日 (vi) 現在の出願データ (A) 出願番号 ： PCT/US93/12200 (B) 出願日 ： 1993年12月14日 (ｖiii)弁理士／代理人情報 (A) 氏名 ： ハンソン，ノーマン，ディ (B) 登録番号： 30,946 (C) 参照／書類番号： LUD 299.2-PCT (ix) 通信情報： (A) 電話 ： (212)688-9200 (B) ファックス： (212)838-3884 (2) 配列認識番号１ の情報： (i) 配列特徴： (A) 長さ： 1906 基本ペア (B) タイプ： 核酸 (C) 鎖の数： 単一 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列の記述： 配列認識番号１： (2) 配列認識番号２の情報： (i) 配列特徴： (A) 長さ： ９アミノ酸 (B) タイプ： 核酸 (C) 鎖の数： 単一 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列の記述： 配列認識番号２： (2) 配列認識番号３の情報： (i) 配列特徴： (A) 長さ： 10アミノ酸 (B) タイプ： 核酸 (C) 鎖の数： 単一 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列の記述： 配列認識番号３：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１２月１２日 【補正内容】特許請求の範囲： １． アミノ酸配列配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３から成る分離され たペプチド。 ２． サンプルを採取した被検体中の黒色腫の診断をするために、前記サンプル 中の黒色腫細胞に特異的な細胞溶解Ｔ細胞の存在を判定する方法であって、問題 となる被検体からのサンプルを含む単核血液細胞を、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認 識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３のペプチドとの複合体をその表面に提示する 黒色腫細胞に接触させる工程、および、その存在が前記被検体中の黒色腫を示す ものである前記サンプル中の黒色腫細胞に特異的な細胞溶解Ｔ細胞の存在を判定 するものとして、（ｉ）サンプルを含む前記単核血液細胞中の細胞溶解Ｔ細胞の 増殖、又は（ｉｉ）前記黒色腫細胞の溶解、のいずれか一方を判定する工程とを 有する方法。 ３． 請求項２の方法であって、腫瘍壊死因子の放出を測定することによって細 胞溶解Ｔ細胞の増殖を判定する工程を有する。 ４． 請求項２の方法であって、放射能標識化クロムの放出を測定することによ って前記細胞の溶解を判定する工程を有する。 ５． 請求項２の方法であって、前記複合体を提示する前記細胞は、（ｉ）ＨＬ Ａ分子をコード化する核酸分子と、（ｉｉ）チロシナーゼをコード化する核酸、 の少なくとも一方によって予め移入されている。 ６． 請求項２の方法であって、前記細胞は、（ｉ）前記サンプル中において、 その存在が前記被検体中の黒色腫を示すものである特異的細胞溶解Ｔ細胞をコー ド化する核酸分子、により移入されている。 ７． 請求項５の方法であって、前記ベクターは、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコード 化する。 ８． 請求項３の方法であって、前記薬剤は、前記複合体をその表面に提示する 非増殖性細胞のサンプルである。 ９． 細胞異常を治療する方法であって、異常細胞上における、ＨＬＡ分子と、 アミノ酸配列配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３から成るチロシナーゼ由 来ペプチドとの複合体の提示によって特徴付けられる細胞異常を有する被検体に 、前記複合体に対して特異的な細胞溶解Ｔ細胞を前記異常細胞の溶解に十分な量 投与する工程を有する方法。 １０．請求項９の方法であって、前記ＨＬＡ分子はＨＬＡ−２Ａである。 １１．請求項９の方法であって、前記細胞溶解Ｔ細胞は自己由来細胞である。 １２．ＨＬＡ−Ａ２と、アミノ酸配列配列認識番号

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/06 5/10 // Ｃ１２Ｎ 15/09 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０８／０８１，６７３ (32)優先日 1993年６月23日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，Ｎ Ｏ，ＮＺ (72)発明者 ブリチャード，ヴィンセント ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 ファン・ペル，アリーン ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 デ・プラーン，エティエンヌ ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 クーリ，ピエール ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 ルノー，ジャン‐クリストフ ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 ヴォルフェル，トーマス ドイツ連邦共和国 デー‐6500 マインツ ランゲンベックシュトラーセ １ (72)発明者 レーテー，ベルナール ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＬＡ分子と、アミノ酸配列配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３か ら成るチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体に対して特異的な治療薬によって治 療対象体を同定する方法であって、以下の工程を有する方法、 （ｉ）被検体からの異常細胞サンプルを、前記複合体に対して特異的な細胞 溶解Ｔ細胞に接触させる工程、及び （ｉｉ）前記異常細胞サンプルの少なくとも一部分の溶解を、前記治療の対 象体の指示として判定する工程。 ２． 請求項１の方法であって、前記ＨＬＡ分子はＨＬＡ−Ａ２である。 ３． 細胞異常を有する被検体を治療する方法であって、前記被検体に、ＨＬＡ 分子と、配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３によって表されるアミノ酸配 列から成るチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体をその表面に提示する細胞に対 する細胞溶解Ｔ細胞反応を刺激する薬剤を、その表面に前記複合体を提示する異 常細胞に対する反応を刺激するのに十分な量投与する工程を有する方法。 ４． 請求項３の方法であって、前記ＨＬＡ分子はＨＬＡ− Ａ２である。 ５． 請求項３の方法であって、前記薬剤は、ヒトチロシナーゼをコード化する ベクターを有する。 ６． 請求項５の方法であって、前記薬剤は、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコード化す るベクターを有する。 ７． 請求項５の方法であって、前記ベクターは、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコード 化する。 ８． 請求項３の方法であって、前記薬剤は、前記複合体をその表面に提示する 非増殖性細胞のサンプルである。 ９． 細胞異常を治療する方法であって、異常細胞上における、ＨＬＡ分子と、 アミノ酸配列配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３から成るチロシナーゼ由 来ペプチドとの複合体の提示によって特徴付けられる細胞異常を有する被検体に 、前記複合体に対して特異的な細胞溶解Ｔ細胞を前記異常細胞の溶解に十分な量 投与する工程を有する方法。 １０．請求項９の方法であって、前記ＨＬＡ分子はＨＬＡ−２Ａである。 １１．請求項９の方法であって、前記細胞溶解Ｔ細胞は自己由来細胞である。 １２．ＨＬＡ−Ａ２と、アミノ酸配列配列認識番号 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３から成るチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体に対 して特異的な分離された細胞溶解Ｔ細胞。 １３．その表面に、ＨＬＡ分子と、アミノ酸配列配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３から成るチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体を提示する異常細胞を 同定する方法であって、異常細胞のサンプルを前記複合体に対して特異的な細胞 溶解Ｔ細胞に接触させる工程と、前記複合体を提示する細胞の判定として、前記 異常細胞の溶解を判定する工程を有する方法。 １４．請求項１３の方法であって、前記ＨＬＡ分子はＨＬＡ−Ａ２である。 １５．配列認識番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）３によって表されるアミノ酸配列 から成る分離されたペプチド。