JPH09504274A

JPH09504274A - 人工表面および血管面の血栓を予防する酸化窒素付加物の利用

Info

Publication number: JPH09504274A
Application number: JP7509234A
Authority: JP
Inventors: フォルツ，ジョン，ディー．; ステムラー，ジョナサン; ロスカルゾ，ジョゼフ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 1997-04-28
Also published as: CA2170772C; CA2170772A1; WO1995007691A1; EP0724436B1; DE69433478T2; AU7831294A; AU698748B2; EP0724436A4; EP1393723A2; EP1393723A3; EP0724436A1; DE69433478D1

Abstract

(57)【要約】この発明は、血液と接触する人工表面での血小板付着および血栓形成を妨げる酸化窒素付加物の利用に関する。適切な酸化窒素付加物は、ニトログリセリン、ニトロプルシドナトリウム、Ｓ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソチオール、長炭素鎖親脂質Ｓ−ニトロソチオール、Ｓ−ニトロソ−ジチオール、鉄ニトロシル化合物、チオニトレート、チオニトライト、シドノニマイン、フロクサン、有機ニトレートあるいはニトロソ化アミノ酸を含む。更に酸化窒素付加物は、損傷血管面を被覆するため動物あるいはひとに投与され、これにより表面での血栓形成あるいは血小板付着を妨げる。

Description

【発明の詳細な説明】人工表面および血管面の血栓を予防する酸化窒素付加物の利用この発明は血液と接触する人工表面に血小板付着および血栓形成を予防するための酸化窒素付加物の利用に関する。加えて、酸化窒素付加物は、損傷した血管表面に血小板付着あるいは血栓形成を予防するために、動物の損傷した表面に直接適用することが出来る。典型的な酸化窒素付加物は、ニトログリセリン、ニトロプルシドナトリウム、Ｓ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソチオール、長炭素鎖親脂質Ｓ−ニトロソチオール、Ｓ−ニトロソジチオール、鉄ニトロシル化合物、チオニトレート、チオニトライト、シドノニマイン、フロクサン、有機ニトレート；およびニトロソ化アミノ酸を含む。過去２０年にわたり多くの研究努力が患者の重要な生理機能を維持するために種々多様な臨床セッティングに使用される医療装置および機械の開発に向けられてきた。例えばカテーテル、人工心臓弁、動静脈短絡、血液透析膜、および心肺バイパス機は心臓およびその他の疾病の治療に広範に使用される。しかし、人工表面への血小板の付着がこのような装置の臨床的有用性を著しく制限する。フォーブス，シー．ディー．，他、英国医学公報、３４巻（２号）；２０１−２０７ページ（１９７８年）；シェペック，アール．エイ．，他、血液、７８巻（３号）；６７３−６８０ページ（１９９１年）。例えば人工表面への血液の被曝は、人工心臓弁、合成移植片およびその他の人工装置を持つ患者、および心肺バスならびに血液透析を含む外部循環を受けている患者に重大な血栓塞栓合併症をしばしばもたらす。サルズマン，イー．ダブリュ．， Phil,Trans,R.Soc.Lond.Ｂ２９４巻、３８９−３９８ページ（１９８１年）血管に接する正常な内皮は血管と独特にまた完全に適合性で拒絶反応を起こさない。内皮細胞はプロスタサイクリンおよび内皮誘導弛緩因子（ＥＤＲＦ）の分泌などのような代謝プロセスを開始し、それが血管壁の血小板付着および血栓形成を活発に邪魔する。内皮の血管適合表面に匹敵する材料はこれまでに開発されなかった。実際に、血液および血漿タンパク質の存在下で、人工表面は血小板付着に対し理想的なセッティングとなる（サルズマン、他）。人工表面に対する血液の被曝は血餅あるいは血小板付着および凝集をもたらす反応を開始する。血液接触の数秒以内に、人工表面は血漿タンパク質層でおおわれ、これは血小板がそれに付着し、活性化され、血栓形成を大いに加速する新しい表面として機能する（フォーブス、他）。これは血液量に対する血管表面積の比率の大きい微小血管レベルでの人工材料の使用に問題を提起する（シェペック，アール，エイ．，血液、７８巻（３号）：６７３−６８０ページ（１９９１年））。例えば血栓塞栓症は、使用されるデザインおよび材料に変更があるにも拘らず、人工心臓弁の移植に伴う未だにもっとも重い合併症である。実際、その弁のデザインおよび構築にもよるが、検出出来る血栓塞栓症の発生率は５０％の高い率になり得る（フォーブス、他）。更に心臓手術の間に使用される心肺支援システムは、このような外科手術の望ましくない止血結果の多くについて責任がある（ビック，アール．エル、血栓塞栓症止血セミナー、３巻；５９−８２ページ、（１９７６年））。血栓症もまた人工血管の使用、動静脈バイパス、および静脈内あるいは動脈内カテーテルで重要な問題となる。人工表面での血栓形成を予防する従来の方法は、血液と人工表面の間の相互作用に限定された効果を持つ。例えば、心肺バイパスおよび血液透析において、ヘパリンはほとんど影響を与えず、僅かに、抗凝血剤により阻害される血小板反応がトロンビンにより誘導されるものである。実際、ヘパリンは血小板の凝集を事実上高めるように見える（サルズマン、イー．ダブリュ．、他、臨床研究ジャーナル、６５巻、６４ページ（１９８０年））。事態をより複雑にするものは、ヘパリンを全身投与すると、それが心臓手術でしばしば起こる合併症である出血を加速することがある、ということである。人工表面での血小板沈着を予防する試みとして、アスピリン、ジピリダモル、およびスルフィンピラゾンの全身投与が含まれる。これらが口腔抗凝固剤と共に血栓塞栓症を予防するのに何らかの効果を持つ一方、重大な副作用が起こることがある。血液の減失がバイパスあるいは血液透析の患者でアスピリンの投与に続いて著しく増加した（トロージャン，エム．他、内科学年報、８９巻、３２５− ３２８ページ（１９７８年））。加えてアスピリンおよび同様に作用する薬剤の効果は、心肺バイパス間は本態性であり、急速に可逆的にはならない。最後にアスピリンのように、シクロオキシゲナーゼを阻害することで血小板の機能を低下させる作用薬は、血小板凝集を阻止するが、それは血小板の人工表面への付着を予防しない（サルズマン、他、（１９８１年））。非血栓形成性材料の開発にかなりの努力が払われたにも拘らず、それがこの作用をまぬがれる合成物質はまだ開発されてはいない。加えて、抗凝血剤および血小板阻害剤は、血液面と人工表面との間の相互作用から生じる薬害結果を予防するには満足とは言えないものであった。従って、人工表面での血小板付着および血栓形成を予防する新しい方法の開発が非常に必要となっている。人工表面と同じ挙動で、脈管系で損傷した動脈面もまた血栓形成を非常に受けやすい。正常で損傷のない内皮は、内皮誘導弛緩因子（ＥＤＲＦ）などの数多くの保護物質を分泌することにより血栓形成を予防し、その物質は血小板の活性を阻害することで主として血液凝固を予防する。アテローム硬化および高ホモシステイネミアなどの疾病状態は内皮内層への損傷の原因となり、血液凝固に必要な物質を減少させることになる。かくして、血栓症で生じる異常血小板付着は、内皮損傷が生じた血管内でより多く発生するように見える。全身用薬剤が凝固を妨ぎ血小板機能を阻害する一方、損傷した血管が血栓形成を予防するようそれを直接治療する方法の必要性が存在する。従って一つの見地において、この発明は人工表面を一つの酸化窒素付加物に接触させるかもしくはコーティングすることにより血小板沈着を妨げ血栓形成を予防する方法に関する。典型的な人工表面はカテーテル、人工心臓弁、人工心肺支援機械、合成血管移植片、血液透析膜、血液導管、血液貯蔵袋、動静脈バイパス、あるいは人工心臓を含む。典型的な酸化窒素付加物は、ニトログリセリン、ニトロプルシドナトリウム、Ｓ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソチオール、長炭素鎖親脂質Ｓ−ニトロソチオール、Ｓ−ニトロソジチオール、鉄ニトロシル化合物、チオニトレート、チオニトライト、シドノニマイン、フロクサン、有機ニトレート、およびニトロソ化アミノ酸を含む。特に望ましいものは血栓形成面を被覆するＳ−ニトロソタンパク質の利用である。このようなＳ−ニトロソタンパク質の利用は、カテーテル壁などのような表面に特異なＮＯ（酸化窒素）供与体を結合させるポリマーあるいは他の物質の必要性を不要にする。むしろカテーテルは誘導化されたタンパク質の溶液に含浸させるか直接被覆することが出来る。更に、Ｓ−ニトロソタンパク質を用いて被覆された装置はそれが乾燥も貯蔵も出来るというユニークな性質を持つ。この発明の更に特にユニークな見地は、前記のカテーテルや導管などの装置に適用されるコーティングを、酸化窒素供与体を前に被覆した面に温浸させることにより、「再装荷(recharging)」することを考えている。例えばＳ−ニトロソアルブミンなどのようなＳ−ニトロソタンパク質はＮＯ基が未誘導アルブミンを残して代謝するにつれて生体内でその力量を失うであろう。しかし、発明者により認識されたことは、表面コーティングがニトロプルシドのようなＮＯ供与体の温浸により「再装備」出来るということである。この原理は実施例２で報告された実験により証明され、ここでニトロプルシドはアルブミンと混合され、血小板沈着を連続して妨げる結果を生じた。この発明は更に１種もしくはそれ以上の抗血栓形成剤と併用して酸化窒素付加物で人工表面のコーティングを行うことよりなる人工表面の血小板沈着を妨げる方法に関する。そのような抗血栓形成剤は、ヘパリン、ウォーファリン、ヒルジンおよびその類似体、アスピリン、インドメタシン、ジピリダモル、プロスタサイクリン、プロスタグランジンＥ，、スルフィンピラゾン、フェノチアジン（クロールプロマジンあるいはトリフルペラジンなど）、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）ペプチドあるいはＲＧＤペブチドミメティクス（擬態体）（ニコルソン他、血栓症研究、６２巻：５６７−５７８ページ、１９９１年参照）、血小板糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ受容体（Ｃ−７Ｅ３など）をブロックする作用薬、チクロピジンあるいはクロピドグレルで知られるチエノピリジンを含む。この発明は更に酸化窒素付加物を直接損傷面に適用することを含む動物にある損傷血管面での血栓形成を妨げる方法に関する。内皮組織を保護し治療するモードとして損傷血管壁を非血栓形成にするコーティングは、合成ポリマーなどのような人工表面をＮＯ供与体でコーティングすることとは別個で独特なものであると認識されねばならない。それにも拘らずここで開示されたこの発明の全概念は、酸化窒素付加物の利用が人工表面および損傷天然血管面の両方で血小板付着および血栓形成を阻害するという発明者による発見に基づくものである。従って一つの主要な見地において、この発明は人工表面を酸化窒素付加物で処理することにより人工表面での血小板付着および血栓形成を妨げる方法よりなる。「人工表面」という用語は血液および血液産物と接触する装置あるいは器具に含まれるいずれかの合成物質を引用する。人工表面は生体外および生体内の両方で使用することが出来る。例えば人工表面は静脈内あるいは動脈内カテーテル、人工心臓弁、合成血管移植片、血液導管あるいは人工心臓などに存在する。人工表面は更に心肺バイパス機および血液透析に使用される炭素あるいはイオン交換樹脂あるいは膜などのような患者に体外循環を提供するのに使用される装置に含まれる。人工表面での血小板付着を阻害することによって、酸化窒素付加物による処理は更に血栓形成を妨げる。血栓は心臓あるいは血管内で生体内形成される病理的血液凝固である。血栓は更に導管あるいは血液貯蔵袋内でのように血小板付着および活性化の増加という条件下で生体外で形成することも出来る。血栓塞栓症は、移転する血栓あるいは血栓の一部が部分的にあるいは完全に血管を閉塞し、影響する組織に対する酸素の輸送を妨げる時に生じ、最後には組織壊死に到らしめる。「酸化窒素付加物」という用語は、ＮＯ^-（ニトロキシル）、ＮＯ⁺（ニトロソニウム）、およびＮＯ^・（非電荷ＮＯ基）などのような反応性酸化窒素種を放出出来る何らかの化合物を引用する。例えば酸化窒素付加物は低分子量のＳ−ニトロソチオール、つまりＳ−ニトロソ− Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソカプトプリル、Ｓ−ニトロソホモシステイン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、およびＳ−ニトロソ−ペニシルアミンなどを含む。Ｓ−ニトロソチオールおよびそれらの調製方法は、１９９２年９月１４日受理された、アメリカ合衆国特許出願番号０７／９４３，８３４、大江、他、Org.Prep.Proc.Int.１５巻、３号：１６５−１９８ページ（１９８３年）；ロスカルゾ、他、薬理学と実験治療、２４９巻、３号：７２６７２９ページ（１９８９年）、およびコワラック、他、薬理学と実験治療、２５６巻：１２５６−１２６４ページ（１９９０年）に記述されており、これらすべてが引用文献としてここに組込まれている。他の適切な酸化窒素付加物はＳ−ニトロソ−アンギオテンシン変換酵素阻害剤（以下、Ｓ−ニトロソ−エース阻害剤として引用される）を含み、これはロスカルゾのアメリカ合衆国特許番号５，００２，９６４（１９９１年）およびロスカルゾ、他のアメリカ合衆国特許番号５，０２５，００１（１９９１年）で記述されており、この両方とも全体として引用文献に組込まれている。このようなＳ− ニトロソ−エース阻害剤の例は下記の式を持つ化合物：を含み、ここでＲはヒドロキシ、ＮＨ₂、ＮＨＲ⁴、ＮＲ⁴Ｒ⁵あるいはＣ₁−Ｃ₇アルコキシであり、ここでＲ⁴およびＲ⁵はＣ₁−Ｃ₄アルキル、あるいはフェニル、もしくはフェニルにより置換されたＣ₁−Ｃ₄アルキルであり；Ｒ¹は水素、Ｃ₁−Ｃ₇アルキル、あるいはフェニル、アミノ、グアニジン、ＮＨＲ⁶、ＮＲ⁶Ｒ⁷で置換されたＣ₁−Ｃ₇アルキルであり、ここでＲ⁶およびＲ⁷はメチルあるいはＣ₁−Ｃ₄アルカノイルであり、Ｒ²は水素、ヒドロキシ、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、フェノキシ、あるいはＣ₁−Ｃ₇ アルキルであり、Ｒ³は水素、フェニルで置換されたＣ₁−Ｃ₄あるいはＣ₁−Ｃ₇アルキルであり、ｍは１乃至３までの整数であり、ｎは０乃至２までの整数である。他の適切なＳ−ニトロソ−エース阻害剤は、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソ−Ｄ −システイニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソ−Ｄ，Ｌ−システイニル−Ｌ−プロリン、１−（４−アミノ−２−Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチルブタノイル）−Ｌ−プロリン、１−［２−ヘキサノイル〕−Ｌ−プロリン、１ −〔５−グアニジノ−２−（Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチル−ペンタノイル〕 −Ｌ−プロリン、１−〔５−アミノ−２−（Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチル−ペンタノイル］−４−ヒドロキシ −Ｌ−プロリン、１−［５−グアニジノ−２−（Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチル−ペンタノイル〕−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、１−〔２−アミノメチル −３（Ｓ−ニトロソ）−メルカプトメチル−ペンタノイル−Ｌ−プロリン、およびＳ−ニトロソ−Ｌ−システイニル−Ｌ−プロリンを含む。追加の適切なＳ−ニトロソエース阻害剤は、以下の式を持つものを含む：ここでＸは酸素あるいは硫黄であり −Ａ₁、−Ａ₂−はＣＨ−ＮＨあるいは−Ｃ＝Ｎ−であり、Ｒは水素、下級（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ベンジル、ベンジドリル、および塩形成イオンである。Ｒ₁およびＲ₂は水素、ハロゲン、下級アルキル、下級アルコキシ、ハロ置換下級アルキル、ニトロおよびＳＯ₂ＮＨ₂である。Ｒ₃は水素、下級アルキル、ハロ置換下級アルキル、ヒドロキシ置換下級アルキル、−(ＣＨ₂)_q−Ｎ(下級アルキル)₂あるいは−(ＣＨ₂)_q−ＮＨ₂およびｑは１，２，３もしくは４である。Ｓ−ニトロソ−エース阻害剤はいくつかの合成法により調製出来る。一般にはまず前駆体が調製され、次いで酸性条件（ｐＨ＝１乃至５）の下でＮａＮＯ₂を持つチオール基のニトロソ化によりＳ−ニトロソチオール誘導体に転換され、Ｓ −ニトロソ誘導体を産出する。この目的に使用される酸は硫酸、酢酸、および塩酸水溶液である。チオール前駆体は下記に記載された通りに調製される：アメリカ合衆国（以下米国と略）特許番号４，０４６，８８９（１９７７年）；４，０５２，５１１：４，０５３，６５１；４，１１３，７５１：４，１５４，８４０；４，１２９，５７１（１９７８年），および４，１５４，９６０（１９７９年）以上オンデッティ他：米国特許番号４，６２６，５４５（１９８６年）タウブ；また米国特許番号４，６９２，４５８（１９８７年）および４，６９２，４５９（１９８７年）ライアン他、４人；米国特許番号４，４４７，４１９（１９８４年），ホーウィッツ他；米国特許番号４，６８１，８８６（１９８７年），ブッシュ他；米国特許番号４，５６８，６７５（１９８６年）ベニオン他；米国特許番号４，７４８，１６０（１９８８年）ポートロック；米国特許番号４，４６１，８９６（１９８４年）、ヘーフル他；欧州特許出願公開番号００８８３４１（１９８３年），ウアンジュ他；米国特許番号４，５８５，７５８（１９８６年）；欧州特許出願公開番号０２３７２３９，欧州特許出願公開番号０１７４１６２、１９８６年公開，欧州特許出願公開番号０２５７４８５、１９８８年公開，以上すべてが引用文献としてここにとり込まれている。他の適切な酸化窒素付加物は、下記のＳ−ニトロソチオールを含む：下記の一般式で表される長炭素鎖親脂質Ｓ−ニトロソチオール、ＣＨ₃（ＣＨ₂）ｘＳＮＯ、ここでｘは２乃至２０である；一般式ＨＳ（ＣＨ₂）ｘＳＮＯで表されるＳ−ニトロソチオールであり、ここでｘは２乃至２０である；またチオールの他に他の官能基を持つＳ−ニトロソチオールで、一般的ＯＮＳ（ＣＨ₂）ｘＹで表され、ここでｘは２乃至２０であり、Ｙは以下のものよりなるグループから選択されるもの、すなわちフルオロ、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、シアノ、カルボキシアミド、Ｃ₃−Ｃ₆シクロアルキル、アラルコキシ、Ｃ₃−Ｃ₆アルキルスルフィニル、アリルチオ、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアミノ、Ｃ₂−Ｃ₁₅ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、カルバモイル、Ｃ₁−Ｃ₆Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｃ₂− Ｃ₁₅Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、水素、ニトロおよびアリル；ここではアリルはベンジル、ナフチルおよびアントラセニル基を含む。これらのＳ−ニトロソチオールおよびそれらを調製する方法は１９９２年９月１４日に受理された米国特許出願番号０７／９４３，８３４に記述されており、それはここで引用文献として組込まれる。特に望ましい酸化窒素付加物は、Ｓ−ニトロソタンパク質を含み、それはＳ−ニトロソアルブミン、Ｓ−ニトロソ組織型プラスミノゲン活性化体、Ｓ−ニトロソヘモグロビン、Ｓ−ニトロソ低密度リポタンパク質、Ｓ−ニトロソ免疫グロブリン、およびＳ−ニトロソカテプシンなどである。また適切な関連する酸化窒素付加物は、チロシン，フェニルアラニン、トリプトファン、セリンおよびトレオニンなどのアミノ酸を含み、それらのものはアミノ酸上に存在する酸素、炭素、あるいは窒素部位でニトロソ化されている。Ｓ−ニトロソ化タンパク質およびニトロソ化アミノ酸、更にそれらを調製する方法は、１９９２年９月１４日に受理された米国特許出願番号０７／９４３，８３５およびステムラー他、全米科学アカデミー紀要、８９巻、４４４−４４８ページ（１９９２年）に開示されており、その双方とも引用文献としてここに組込まれている。他の適切な酸化窒素付加物は、一般的Ｙ_xＦｅ_y（ＮＯ）₂で表される鉄ニトロシル化合物であり、ここでＹはチオレート、ホスフェート、アスコルバートなどのアニオン種、タンパク質、ヘパリンサルフェートなどのグリコアミノグリカンであり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して１乃至２０である。これらの化合物はヴァニン他、生物理学研究、９３巻：６３−６８ページ（１９８３年）に記載されているもののような当業者により一般に利用出来る従来の方法で調製することが出来る。更に追加して適切な酸化窒素付加物はチオニトレート、チオニトライト、同じくシドノニマイン、フロクサン、ニトロプルシドナトリウムおよび、ニトログリセリンなどのような有機ニトレートを含み、これらは一般に利用出来る商業的製薬源から得ることが出来る。人工表面の酸化窒素付加物による処理は、人工表面を酸化窒素付加物に接触させ、それにより人工表面が特定の付加物で被覆されるようにすることよりなる。人工表面のコーティングは後記実施例１に記載される方法、あるいは従来の技術による当業者に周知の他の標準的な手法を使用して完成することが出来る。例えば、酸化窒素付加物のコーティングは、人工表面を酸化窒素付加物を含む溶液内にそれ自身であるいは装置内で浸すことにより達成される。加えて、合成酸化窒素付加物は従来の周知の各種の化学的手法により人工表面上に被覆することが出来る。このような方法は、求核中心、金属、エポキシド、ラクトン、アルファーもしくはベーター飽和炭素鎖、ハロゲン化アルキル、カルボニル基、あるいはシッフ塩基に遊離チオールにより付着させることを含む。コーティング法を更に最適化するために、標準的な方法が処理された人工表面のサンプルに対し血小板付着量を決定するために使用される。このような方法は⁵¹ Ｃｒ標識血小板あるいはインジウム¹¹¹標識血小板の使用を含む。人工表面への血小板付着を評価する他の周知の方法は、フォーブス他（１９７８年）およびサルズマン他（１９８１年）に記述されている。人工表面がその表面の性質、および分子バックボーンおよびポリマーの形状、結晶度、疎水性、親水性、水素結合能力、および可撓性などのような特性に依存して変化することも考慮されねばならない。従ってこれまでの方法を用いて、当業者の一人は、表面のそれぞれの特定のタイプで最適なコーティングを提供するために、付加物の量、処理の長さ、温度、希釈剤、および貯蔵時間などのパラメータを調節することでこのコーティング技法をあつらえることが出来る。装置あるいは人工材料が酸化窒素付加物で被覆した後、後は、それは意図された用途、例えば心臓弁としての移植、カテーテルとしての挿入、あるいは心肺酸素付加、もしくは血液透析などに適したものとなるであろう。被覆装置あるいは人工表面は、動物、望ましくはヒトを含む哺乳類に関連する用途に適切なものとなる。この発明の方法は、人工表面への血小板作業を減少する現在の試みに著しい利益を提供する。発明者が示したように人工表面は単純で効果的な方法を用いて酸化窒素付加物を被覆させることが出来る。被覆表面は直ちに使用することも、また貯蔵して後で使用することも出来る。更に表面自身を被覆することにより、この方法は、抗血栓剤がしばしば効力がなく、きつい副作用を有し、あるいはある種の患者に対しては使用が適切ではないが、そのような抗血栓剤の全身投与の必要性を不要にする。更にこの発明により提供される血小板付着の阻害は、心臓あるいは血管の疾患を持つ患者にとっては特に必要な完全で直ちに可逆的である。血小板付着あるいは血栓形成を妨げることにより、この発明は人工表面の使用と関連する重い血液合併症を予防するのにも有用である。これらの合併症は血小板付着の増加、活性化、および血栓形成あるいは血小板および凝固タンパク質の消費の結果として生じる。これら合併症は医学分野の人達にとっては周知のものであり、それは心筋梗塞、肺血栓塞栓症、脳血栓塞栓症、血栓性静脈炎、血小板減少症、出血性患者および前記患者の結果として直接あるいは間接的に生じる何らかの追加合併症を含む。も一つの実施例において、この発明は、少なくとも１個の追加の抗血栓剤として併用して人工表面を酸化窒素付加物に接触させることを含む人工表面への血小板付着を妨げる方法に関する。「抗血栓」剤という用語は、血小板機能を変化させ、あるいはフィブリン形成などのような血液凝固に関連する他の機制を妨げる何らかの化合物を引用する。このような化合物の例は必ずしもそれに限定されないが、ヘパリン、ウォーフェリン、アスピリン、インドメタシン、ジピリダモル、プロスタサイクリン、プロスタグランジン−Ｅ₁、あるいはスルフィンピラゾンを含む。人工表面をも一つの抗血栓剤と併用して酸化窒素付加物でコーティングするこの方法は、人工表面を酸化窒素は付加物のみを使ってコーティングする前記記載の方法を使って行われ、人工表面のすべてのタイプのものに適している。他の抗血栓化合物の最適なコーティング濃度はこれまでに記述された類似のルーチンの方法を使って決定される。被覆された人工表面は、人工表面を酸化窒素付加物のみで被覆されたものについて記述されてのと同じ方法で使用することが出来る。人工表面を少なくとも一つの他の抗血栓剤を併用して酸化窒素付加物でコーティングすることにより、血栓形成の最初の事象である血小板付着を予防するだけでなく、因子VIIIを阻害し、また血小板顆粒分泌を阻害することにより直接、また血小板からのプラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）放出を阻害することにより間接的にフィブリン形成を制約する。かくして、凝固に寄与する血小板付着を妨げ他の血小板機能にいずれも干渉する酸化窒素付加剤および抗血栓剤で人工表面をコーティングすることにより、この発明は人工表面上において血栓形成を妨げるもっと進んだ手段を提供する。更にも一つの実施例において、この発明は損傷表面に直接酸化窒素付加物を直接適用することを含む動物内での損傷血管面での血栓形成を妨げる方法に関する。「損傷血管面」という用語は、内皮の損傷、血管の狭まり、つまり狭窄アテローム硬化プラーク累積が生じた血管内部表面のいずれかの部分を引用する。この発明の冠状動脈での使用に特に適しているが、普通には慣れていない典型的により高い動脈圧から損傷を受けやすい動脈あるいは静脈バイパス取替えに特に使用されるものを含む他の損傷した動脈および静脈においても有益である。酸化窒素付加物は、付加物を望ましい場所まで運ぶために適切な動脈内あるいは静脈内カテーテルを用いて損傷血管面に直接適用される。損傷した動脈面の位置は医学分野の熟練した医師に利用出来るルーチンで周知の方法を用いて行われるＸ線血管造影などのような従来の診断法により決定される。加えて、動脈内あるいは静脈内カテーテルを用いる酸化窒素付加物の投与は、当業者に周知のルーチンの方法を使って行われる。典型的には、調製品は血管形成バルーン膨張の時点で通常頸動脈あるいは冠状動脈に導入される一次処置のために使用されるのと同じカテーテルを通じて血管形成部位に運ばれる。この発明の化合物はありきたりの賦形剤、すなわち活性化合物として有害には反応しない非経口適用に適切な調剤上、許容出来る有機あるいは無機の担体物質と併用して使用することが出来る。適切な調剤上許容出来る担体は、必ずしもそれに限定されないが、水、食塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸、マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのを含む。調剤調製品は無菌にすることが出来、望ましければ、助剤、例えば滑剤、防腐薬、安定剤、加熱剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩類、緩衝液、着色剤、着香およびもしくは芳香物質などで、活性化合物と有害に反応しないものと混合することが出来る。非経口適用のために特に適切な賦形剤は溶液よりなり望ましくは油性あるいは水性溶液、同じく懸濁液、乳濁液、あるいは移植片よりなる。水性懸濁液は懸濁液の粘度を増す物質を含有し、例えばカルボキシメチルセルロース、ナトリウム、ソルビトール、およびもしくはデキストランを含む。オプションとして、懸濁液は更に安定剤を含有出来る。「治療上有効量」という用語は、この発明の目的にとってその意図された目的を達成するのに有効である酸化窒素付加物の量を引用する。個々の必要性は一方で変化するが、各酸化窒素付加物の有効量の最適な範囲の決定は従来の技術の範囲内にある。一般に組成物の有効量を提供するのに必要な、また当業者の一人により調節出来る供与量は、年齢、物理的健康状態、性、体重、受容体の疾患の範囲、治療頻度および望まれる効果の範囲などに依存して変化する。人工表面および内皮の治療に適した調製品は、付加物の約５００−７００ｍＭの濃度で点滴静注により受渡しされ、薬液として無菌化され２−３分間で体重２５ｋｇ当り２−３ｍｌの量で使用される。発明者により示されたように、損傷血管表面に対する酸化窒素付加物の直接の適用が表面を被覆し、これにより表面の血栓形成を減少させる。更に発明者により示されたように、損傷血管面への酸化窒素付加物の局所適用は、全身効果を出すのに必要とされる場合よりもずっと低い用量で達成することが出来る。かくして、この方法は、損傷した血管で血栓形成を妨げる全身抗血栓形成剤の使用よりも重要でかつ予期しなかった利点を提供する。実施例１酸化窒素（ＮＯ）付加物は人工表面を血栓形成しにくくさせる血液に曝された人工表面が血栓形成しにくくなったことを示す最良の方法に一つは、その表面で収集する血液の血小板の数を測定し計量化することである。この方法は動物あるいはヒト被検者から血小板を除去する必要がある。その血小板はガンマ線を放射するインジウム¹¹¹などのような放射性物質で標識され、放射性血小板源から３乃至６インチ離れて置かれたガンマカウンターで検知される。標識血小板は生体内で動物あるいはヒトに再注射されるか、もしくは生体内人工表面と接触される。血小板は人工表面あるいは激しく損傷した動脈面に付着する。かくして表面に付着した正常血小板および放射性血小板の数が表面の血栓形成性の指標となる。発明者はこの方法を実験で使用し、酸化窒素付加物が人工表面あるいは損傷天然動脈面の血栓形成性を減少させることを示した。以下の実験は合成血管移植材などの人工表面を一つの酸化窒素付加物でコーティングすると、血小板付着が減少し、アルブミンだけのようなこれまでに使用された薬剤の場合よりも著しく血栓形成が減少することを示している。加えて、人工腎臓および人工心肺に広範に使用されるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）管がＳ−ニトロソ−アルブミンのような酸化窒素付加物で被覆されそれの血栓形成性をより少なく出来ることを実験は示している。合成血管移植の保護まず発明者はダクロン移植片および心臓カテーテルをＳ−ニトロソ−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆した。３種の別の実験において、同一対の６ｍｍ（内径）編ダクロン移植片、長さ５ｃｍのものが麻酔を施した３匹の犬の手術位置に用意された。ヘパリンは与えられなかった。１片の移植片はＢＳＡ５％に浸され、また他の移植片は（Ｓ−ニトロソ−ＢＳＡを作り出す）酸化窒素０．５ｍμ と組合せたＢＳＡ５％に、いずれも挿入１時間前に浸され、次いで食塩水ですすぎ洗いされた。移植片は決まった場所で連続６−Ｏプロリン縫糸で縫合された。インジウム標識血小板インジウム¹¹¹標識血小板は血管移植片上での血小板蓄積を検出するのに非常に有用である。従って、インジウム¹¹¹標識血小板が血小板動態および画像化、第II巻、エイ．ピー．ヘインズ，ピー．エヌ．ボーデンホースト，エム．ジー．ロッター編、シーアールシー・プレス刊、１９８５年、ヘインズ，エイ．ピー．「インジウム¹¹¹−オキシンによる血小板を標識する方法」およびシェツフェル，ヴイ．他、核医学ジャーナル、２０巻、５２４−５３１ページ、１９７９年に記述された標準の方法に従って調製され、移植片の挿入に先立ち注射された。移植片挿入後、犬は２時間観察され、両移植片は除去され、すすぎ洗いされ、重さが測定された。移植片は次いでＮａ１ガンマウエルカウンターに置かれ４分間計数された。ＢＳＡのみで被覆された移植片は平均４分間で６５４，０００＋／−８９，０００計数であった。対照的にＳ−ニトロソ−ＢＳＡで被覆された３個の移植片は平均４分間で２７８，０００＋／５７，０００計数であった（Ｐ＜．００５）。ＢＳＡのみで管腔表面での血栓形成に起因する３個の移植片の重量平均増加率は４１０％＋／−９７％であり、一方ニトロソ−ＢＳＡで保温した３個の移植片の重量平均増加率は１９６％＋／−７１％であった（Ｐ＜０．００５）。これらのデータは、移植片を循環血液に２時間にわたり曝すと、Ｓ−ニトロソ −ＢＳＡで処理した合成移植片で血小板付着および凝固がかなり減少したことを示している。かくして合成血管移植片のＳ−ニトロソ−ＢＳＡコーティングは初期血小板付着に対する保護を提供することをこの結果が示している。加えて、３対の５ＦＲＵＳＣ１カテーテルが研究された。１個のカテーテルはＢＳＡ５％に浸けられ、一方他のカテーテルはＳ−ニトロソ−ＢＳＡの混合物に１時間浸けられた。カテーテルは食塩水ですすぎ洗いされ、１個ずつ前記犬の右もしくは左の大腿動脈に挿入され、２時間放置された。各カテーテルは正常な食塩水で１．５時間毎に洗浄されたが、ヘパリンは与えられなかった。カテーテルは次いで除去され、食塩水ですすぎ洗いされた。等しい長さのカテーテルが遠位末端部から切断され、そのそれぞれがＮａ１ガンマカウンターに置かれ、放射能が４分間計数された。ＢＳＡのみで被覆された３個のカテーテルは９，０００±１，１００の平均計数であった。対照的にＢＳＡ５％＋酸化窒素０．５ｍＭで被覆された３個のカテーテルは僅かに２，８５０±８００計数であった。かくしてＢＳＡのみで被覆されたものに比べてＳ−ニトロソ−ＢＳＡで被覆されたカテーテルに付着した血小板は非常に少なかった。これらの実験は、Ｓ−ニトロソ−ＢＳＡで被覆され直ちに移植された合成血管移植片がＢＳＡのみで被覆された移植片に比べて血栓形成が著しく少ないことを示している。発明者は、Ｓ−ニトロソ−ＢＳＡがポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）のような表面を被覆するのに使用出来るかどうか、また加えて、そのような表面が一時に処理され、後で使用出来るかどうかを調べるために追加の実験を行った。この実験では、３個のＰＶＣ片、内径３ｍｍで長さ２ｃｍのものがＢＳＡに４時間浸けられ、乾燥され、暗所に置かれた。３個の同一のＰＶＣ管片がＳ−ニトロソ− ＢＳＡ溶液に４時間浸けられ、乾燥され、同じく暗所に置かれた。ＰＶＣ管のこの長さのもの光に曝すことにより生じる酸化窒素供与化合物の潜在的不活性化を最小にするために暗所に保存された。コーティングの３日後、片方はＢＳＡで被覆され残る方がＳ−ニトロソ−ＢＳＡで被覆された１対のＰＶＣ管片が１匹の犬の２個の大腿動脈のそれぞれにバイパス形成のために置かれた。この犬は前記のインジウム¹¹¹標識血小板が注射された。ＰＶＣバイパスが放射性血小板での循環内に置かれて２時間後にそれらは除去されＮａ１ガンマカウンターに置かれた。ＢＳＡ被覆バイパスでの計数は４分間で２００，８７０であったが、一方Ｓ− ニトロソ−ＢＳＡ被覆移植片のそれは４分間で９７，５１０のみの計数であった。かくしてＳ−ニトロソ−ＢＳＡで被覆されたバイパスはＢＳＡで被覆されたものよりも著しく少ない血小板付着がその内部表面に見られた。実施例２ニトロプルシドナトリウムで被覆した損傷動脈面は血栓形成が少ない下記の実験は、例えばニトロプルシドナトリウムおよびＳ−ニトロソ−ＢＳＡなどの酸化窒素供与化合物が血小板付着および血栓形成を阻害するために損傷動脈あるいは静脈面（血管）に直接適用出来ることを示している。発明者は、アテローム硬化により、あるいは血管形成、アテレクトミー(ather ectomy)もしくは他の処置の後に生じる冠状あるいは他の動脈の狭窄および動脈損傷などで患者を模擬することの出来る動物モデルを開発した。モデルは開胸し心臓露出の麻痺された犬を使用する。要約すると、電磁流量プローブが動脈を通じる血液量を継続して測定するために、冠状動脈が置かれる。次いで手術用締め具（クランプ）を用いて数回動脈を締めることにより、動脈壁は（内膜および中脈で）損傷される。動脈損傷の領域でプラスチック製包囲シリンダーが、管腔口径で７０％の狭窄あるいは減少をもたらすように冠状動脈の外周に置かれる。これは患者の動脈のアテローム狭窄を模擬するものである。血小板媒介血栓は、徐々に冠状血液流量を削減しながら、周期的に狭窄管腔に形成する。続いて血栓は遠位で塞栓症化し、血液流量は元に戻る。周期的に生じるこの過程は、流量の循環的減少を生み出すが、以下で「循環性流量減少」（ＣＦＲｓ）という用語で引用する。損傷動脈壁への血小板の相互作用を妨げる行為が取られない場合には、これらのＣＦＲｓは何時間となく発生し続けるであろう。発明者はＣＦＲｓが血小板および凝固システムの間の相互作用および狭められあるいは狭窄動脈壁にある損傷内皮細胞を表わすことを決定した。加えて、ＣＦＲｓにアテローム硬化により狭められるヒト動脈に発生し、生成する周期的凝血塊形成は冠状あるいは脚動脈のアテローム硬化性狭窄で患者に胸痛あるいは脚痛を起こし得る。最後に血小板媒介血液凝固は動脈壁を更に損傷させ、憎悪を起こし得る。この研究過程の間、動脈壁が最初に手術用クランプの締め付けで損傷を受けた時、血小板血栓が形成されＣＴＲｓが生産されたことが観察された。この観察の結果、次の実験がニトロプルシドナトリウムのような酸化窒素供与体の直接注入損傷動脈壁を血栓形成しにくくすることが出来るかどうかについて決定するために行われた。下記の実験は、ニトロプルシドナトリウムおよびＳ−ニトロソ−ＢＳＡのような酸化窒素供与化合物が血小板付着および血栓形成を妨げるために損傷動脈面（血管）に直接適用出来ることを示す。５匹の麻酔をかけられた犬で、頸動脈の両方が露出された。２個の３ＦＲＵＳＣ１カテーテルが動脈移植のために用意された。１個のカテーテルはＢＳＡ５％溶液に１２時間浸けられ、また他方は、ニトロプルシドナトリウム１ｍｇ／ｍｌも含むＢＳＡ５％溶液に浸けられた。２個の被覆カテーテルのそれぞれは小さな切除を通じて犬の右あるいは左頸動脈に無作為に置かれ、６−０プロリン縫糸で閉じられた。カテーテルは動脈管腔に５ｃｍ進められた。犬にヘパリンは与えられなかった。カテーテルは６−８時間後に取り除かれ、カテーテル壁および頸動脈にカテーテルが入った部位で血液凝固が検討された。ＢＳＡプラスニトロプルシドナトリウムで被覆したカテーテルに比べて、ＢＳＡ被覆カテーテルがかなり多い血液凝固があった。５匹の開胸麻酔犬で、冠状動脈が切開され、前に記載の通りＣＦＲｓを測定する器具が取付けられた、動脈へのニトロプルシドナトリウムの直接静脈注入（４乃至１０μｇ／ｋｇ／分の用量で３０分間まで）が生体内血小板活性の減少となり、ＣＦＲｓは廃止された。加えて、循環するニトロプルシドが損傷動脈壁を被覆したように見え、かくしてそれを少ない血栓形成のものにした。ＣＦＲｓはニトロプルシドナトリウムの注入が１５分与えられるまで続けて観察された。次いでＣＦＲｓは止められ、これは血小板が動脈壁にもはや付着しなくなったことを示す。ニトロプルシドナトリウム静脈内注入は次いで停止された。循環血小板の直接生体内阻害は通常１０ −１５分以内に停止する。しかし循環ニトロプルシドナトリウムの存在により、血小板の生体内阻害が去ってしまった後、ＣＦＲｓは元に戻らなかった。これは前に循環していたニトロプルシドナトリウムが前の損傷動脈面に保護コーティングを残したことを示している。発明者はこの保護コーティング工程を「パッシヴェイション」（化学的離反応表面処理）と命名した。次いでもし誰かが指と指との間で動脈をゆっくりと回転させると、ＣＦＲｓは直ちに戻ることを発明者は示した。これはニトロプルシドナトリウムで供給される保護コーティングがこれまでに損傷した動脈の内表面から取り除かれ、かくして血小板が保護されない動脈壁との相互作用を取り戻し、ＣＦＲｓの生産を可能にする。これが損傷動脈に影響を与える局所現象であり、すべての循環血小板を阻害する全身効果に起因するものではないことを示すために下記の実験が行われた。開胸麻酔犬が研究された。犬でもまたヒトでもサイズが殆ど等しい主要左方冠状動脈の２個の主要な分技は左方回旋（ｃｉｒｃ）冠状動脈および左方前部下（ＬＡＤ）冠状動脈と呼ばれる。実験において、両方の分技は流量測定装置を取り付けられ、同じ動脈壁損傷（内皮および中皮損傷）を与えられ、また等しい量のせばまりあるいは狭窄を作り出すためにプラスチック製包囲シリンダーをその上に置いた。冠状動脈分技に損傷が導入されたのに続き、ＣＦＲｓが左方冠状動脈のＬＡＤ分技およびｃｉｒｃ分技の両方で観察され、これは循環血小板が損傷ｃｉｒｃ動脈および損傷ＬＡＤ動脈の狭窄部分の両方に付着することを示した。ニトロプルシドナトリウム（１０ｍｇ／ｋｇ）が次いでｃｉｒｃ冠状動脈に３０秒間直接注入された。この注入に続き、ｃｉｒｃでのＣＦＲｓは消滅したが、一方それはＬＡＤ冠状動脈では続いていた。これはニトロプルシドナトリウムが損傷ｃｉｒｃに対し局所保護効果を持ち、またニトロプルシドナトリウムの用量が循環血小板に影響を与え、あるいは再循環希釈の後は損傷ＬＡＤ壁を保護するのには十分ではなかったことを示している。損傷動脈壁での血小板付着および凝血塊に起因するＣＦＲｓは、それぞれが独立している動脈両方で観察された。従ってニトロプルシドナトリウムをｃｉｒｃ分技に注射することによって、発明者はこの損傷動脈を直接被覆することが出来た。加えて局所注入の後残存するニトロプルシドナトリウムの循環濃度はあまりにも低いために血小板に対する全身効果を持つことが出来ない。かくしてニトロプルシドの局所適用により発揮された保護効果は局所効果であり、損傷動脈の特定部分を保護するために直接適用することが出来る。前記のものと同一の実験が酸化窒素−ウシ血清アルブミン付加物（ＢＳＡ−ＮＯ）（ＮＯ濃度約０．５ｍＭ）を用いてｃｉｒｃ冠状動脈に選択的に与えるように繰返された。ＮＯ付加物としてＢＳＡ−ＮＯの使用がパッシヴェイションをより良く提供し、その効果はより長く続くことを発明者が示す。保護的ＢＳＡ−ＮＯコーティングが損傷動脈壁に４乃至５時間行われる時、ＢＳＡはニトロプルシドナトリウムを直接静脈内に（５−１０μｇ／ｋｇで２０分間）注入し、あるいは直接冠状動脈に（１０ｍｇ／ｋｇで３０秒間）注入することにより、新しい酸化窒素分子で再充填することが出来る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/495 9454−4ＣＡ６１Ｋ 31/495 31/54 9454−4Ｃ 31/54 31/60 9454−4Ｃ 31/60 31/725 9051−4Ｃ 31/725 38/00 9284−4Ｃ 39/395 Ｄ 38/55 7019−4ＣＡ６１Ｌ 33/00 Ａ 39/395 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｌ 33/00 9051−4Ｃ 37/64 (72)発明者フォルツ，ジョン，ディー. アメリカ合衆国，53705 ウィスコンシン, マディソン，チェンバレンアヴェニュー 2537 (72)発明者ステムラー，ジョナサンアメリカ合衆国，27514 ノースカロライナ，チャペルヒル，ジュニパープレイス 3416 (72)発明者ロスカルゾ，ジョゼフアメリカ合衆国，02030―1812 マサチューセッツ，ドーバー，レッジウッドドライブ 16

Claims

【特許請求の範囲】１．人工表面を酸化窒素付加物に接触させることよりなる血液と接触する前記人工表面での血小板の付着あるいは血栓形成を妨げる一つの方法。２．請求の範囲第１項記載の方法であって、前記人工表面はカテーテル、人工心臓弁、人工心肺支援装置、合成血管移植片、血液透析膜、血液導管、血液貯蔵袋、動静脈バイパス、あるい人工心臓よりなることを特徴とする方法。３．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記酸化窒素付加物がニトログリセリン、ニトロプルシドナトリウム、Ｓ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソチオール、長炭素鎖親脂質Ｓ−ニトロソチオール、Ｓ−ニトロソ−ジチオール、鉄ニトロシル化合物、チオニトレート、チオニトライト、シドノニマイン、フロクサン、有機ニトレートあるいはニトロソ化アミノ酸を含むことを特徴とする方法。４．請求の範囲第３項記載の方法であって、前記Ｓ−ニトロソ−タンパク質がＳ −ニトロソ−アルブミン、Ｓ−ニトロソ−ＴＰＡあるいは受容体へのニトロソ化抗体であり、正常あるいは損傷動脈壁に露出されることを特徴とする方法。５．人工表面での血小板付着あるいは血栓形成を妨げる一つの方法であって、抗血栓形成化合物と併用して酸化窒素付加物で人工表面を接触させることよりなる方法。６．請求の範囲第５項記載の方法であって、前記抗血栓形成化合物がヘパリン、ヒルジンおよびその類似体、ウォーフェリン、アスピリン、インドメタシン、ジピリダモル、あるいはスルフィンピラゾン、フェノチアジン、ＲＧＤペプチドおよびＲＧＤペプチド擬態物、血小板をブロックする薬剤、糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ受容体、チクロピジンあるいはクロピドグレルを含むことを特徴とする方法。７．損傷血管面で血栓形成を妨げる一つの方法であって、酸化窒素付加物の治療上有効な量を直接損傷表面に適用することよりなることを特徴とする方法。８．請求の範囲第７項記載の方法であって、ここで前記酸化窒素付加物がニトログリセリン、ニトロプルシドナトリウム、Ｓ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソチオール、長炭素鎖親脂質Ｓ−ニトロソチオール、Ｓ−ニトロソ−ジチオール、鉄ニトロシル化合物、チオニトレート、チオニトライト、シドノニミン、フロクサン、有機ニトレートあるいはニトロソ化アミノ酸を含むことを特徴とする方法。９．請求の範囲第７項記載の方法であって、ここで前記酸化窒素付加物が動脈内あるいは静脈内カテーテルを用いて適用されることを特徴とする方法。１０．請求の範囲第９項記載の方法であって、ここで前記動物がヒトであることを特徴とする方法。