JPH09504428A - 流体サンプルの移送装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸を増幅及び検出する方法、デバイス、装置及びキットが提供される。装置は、反応／検出ユニット（２０）と協働する１又は２段式熱サイクリングデバイス（１６）である。デバイスの反応チャンバー（３０）にサンプル（３８）を加えた後、反応チャンバーを検出チャンバー（３２）と結合して反応／検出ユニットを形成する。熱サイクリング装置の第１の加熱エレメント（９０）は反応／検出デバイスに所望の温度を加えてサンプル中の標的核酸を増幅する。次に、反応混合物は第２の加熱エレメント（９２）によって検出チャンバーに移送され、増幅標的核酸は検出チャンバー内で担体上に固定される。マイクロプロセッサ制御が第１のエレメントによって加えられる熱から独立して第２のエレメントによって加えられる熱を制御する。装置に連結した検出システムが固定増幅核酸標的を検出及び分析する。画像を読取り、ディジタル化し、統計分析して方法の精度を改善する。

Description

【発明の詳細な説明】 流体サンプルの移送装置及び方法発明の分野 本発明は一般には流体移送方法に関し、特に密閉及び密封容器の内側で反応チ ャンバーから検出チャンバーに増幅核酸を移送する方法に関する。発明の背景 核酸の増幅は種々の用途で有用である。例えば、核酸増幅法はクローニング及 び配列決定の目的で臨床診断やＤＮＡ及びＲＮＡの型別及び定量に用いられてい る。 核酸増幅反応を実施するための装置は一般に熱サイクリングデバイス又はサー マルサイクラーとして知られている。このようなデバイスの１例は公開ＰＣＴ出 願ＷＯ９２／２０７７８に記載されている。このＰＣＴ出願のサイクリングデバ イスは種々の方法でＤＮＡ増幅を実施するのに有用である。ＷＯ９２／ ２０７７８に記載されているデバイスはサンプルを収容するピペット先端を受容 するための複数のウェルを備えるリング形ホルダーを含む。サンプルは各先端の 開放端をヒートシールすることにより先端の内側に収容される。リングを加熱及 び冷却する手段を設け、デバイスがピペット先端に収容されたサンプルを周期的 に加熱及び冷却できるようにする。リングを冷却する手段は、リングに冷風を吹 き付けるファンと、リングから内側径方向に配置され、リングに冷風を吹き付け るのを助長する冷却フィンを含む。ＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７７８の開示内容 全体は参考資料として本発明の一部とする。 核酸配列増幅法は当業者に公知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）法は「プライマー」と呼ばれる１対のオリゴヌクレオチド配列と熱サイクリ ング法を使用し、変性、アニーリング及びプライマー伸長の１ サイクルで対象の標的核酸を倍増する。ＰＣＲ増幅は米国特許第４，６８３，１ ９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号に詳細に記載されている。これらの ２件の特許の開示内容全体は参考資料として本発明の一部とする。 核酸配列を増幅する別の公知方法はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。ＬＣ Ｒでは、ＰＣＲで使用するプライマーの代わりに２個の一次プローブと２個の二 次プローブを使用する。ハイブリダイゼーションと連結のサイクルを繰り返すこ とにより、標的の増幅が達せられる。連結増幅産物は対象の標的核酸又はその相 補体と機能的に等価である。この方法はＥＰ−Ａ−３２０３０８に記載され、次 いで、ＥＰ−Ａ−３３６−７３１、ＷＯ８９／０９８３５、ＷＯ８９／１２６９ ６及びＢａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１８９ −１９３（１９９ １）に記載された。ＬＣＲの変法はＥＰ−Ａ−４３９−１８２及びＷＯ９０／０ １０６９に記載されている。 等温反応を利用した核酸増幅法も知られている。このような反応の例としては 、３ＳＲ（自己持続配列複製）［Ｅ．Ｆａｈｙ，Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈ ＆ Ｔ．Ｒ ．Ｇｉｎｇｅｒａｓ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ １：２５（１９９１）］や、ＳＤＡ（鎖置換増幅）［Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅ ｒ，Ｍ．Ｃ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｇ．Ｎａｄｅａｕ ＆ Ｄ．Ｄ．Ｓｈａｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ，８９：３９２（１９９２ ）］がある。 このような方法を使用する核酸増幅は通常は、ＷＯ９２／２０７７８に開示さ れているようなスナップトップバイアルやシーラブルピペットなどの密閉反応容 器内で実施される。 増幅反応の完了後、反応容器を開き、標準検出法を用いる検出装置に増幅産物を 移す。 典型的には、２本鎖増幅産物を変性させ、検出可能な標識と結合した１個以上 のハイダリダイジングプローブで変性鎖を処理することにより増幅産物を検出す る。通常は、ハイブリダイズしなかった標識プローブをハイブリダイズした標識 プローブから分離しなければならず、このためには付加的分離段階が必要である 。他の検出法では、臭化エチジウムで染色したゲルによって増幅産物を検出する ことができる。例えば、³²Ｐ追跡、エンザイムイムノアッセイ［Ｋｅｌｌｅｒら ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２８：１４１１−６（１９９０） ］、蛍光［Ｕｒｄｅａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１ ６ ：４９３７−５６（１９８８）；Ｓｍｉｔｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１３：２３ ９９−４１２（１９８５）］、及び化学発光アッセイなどを不均一系［Ｂｏｒｎ ｓｔｅｉｎとＶｏｙｔａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８５６−５７（１９ ８９）；Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８０：９５− ９８（１９８９）；Ｔｉｚａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ，７８：４５１５−１８（１９９０）］又は均一系［Ａｒｎｏｌｄら，米国特許 第４，９５０，６１３号；Ａｒｎｏｌｄら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１５ ８８−１５８９（１９８９）；ＮｅｌｓｏｎとＫａｃｉａｎ，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ，１９４：７３−９０（１９９０）］で実施すること ができる。 しかしながら、これらの検出法には重大な欠点がある。比較的高濃度の増幅産 物を収容する反応容器を開くと、通常は飛沫やエアゾールが形成される。このよ うな飛沫やエアゾ ールは潜在的汚染源となる恐れがあり、陰性核酸やまだ増幅されていない核酸が 汚染され、誤まった結果を生じる恐れがある。 サンプル調製、反応試薬調製、増幅及び反応産物の分析に使用する作業場所及 び装置にも汚染に関する同様の問題が生じ得る。接触伝達（運搬）やエアゾール 生成によってこのような汚染が生じる場合もある。 更に、これらの公知検出法は時間消費的且つ労働集約的である。プローブハイ ブリダイゼーション法は典型的には伸長産物を変性させる段階と、プローブをア ニールする段階と、場合によって反応混合物から過剰のプローブを分離する段階 が必要である。迅速な結果が所望される場合にはゲル電気泳動も非実用的な検出 法であるので不利である。 米国特許第５，２２９，２９７号及び対応ＥＰ０３８１５０１Ａ２（Ｋｏｄａ ｋ）は、汚染の危険を減らすために密閉環境内で核酸 材料の増幅及び検出を実施するキュベットを開示している。該キュベットは一連 の通路により相互に連結された区画をもつ密閉デバイスである。区画はＤＮＡ鎖 を増幅するための反応区画と、増幅したＤＮＡを検出するための検出部位をもつ 検出区画に分けられる。試薬を収容する貯蔵区画も備え得る。核酸材料のサンプ ルは貯蔵区画からの試薬と共に通路を通って反応区画に送られる。貯蔵区画の出 口通路は増幅産物が貯蔵区画に逆流しないように逆止め弁を備える。サンプルを 反応区画で増幅し、弾性区画壁に外圧を加えて増幅産物を反応区画から通路を介 して検出区画内に吸引することにより、相互連結通路を通って検出区画の検出部 位まで増幅産物を移送する。あるいは、ピストン装置をキュベットに備え、試薬 及び／又は増幅産物を反応区画から検出区画にポンプ輸送してもよい。 ＥＰ０３８１５０１Ａ２（Ｋｏｄａｋ）に 開示されているキュベットは密閉反応及び検出環境を提供するが、いくつかの重 大な欠点がある。例えば、同出願の図１〜１８に示されるように、多重区画、多 重通路、逆止め弁及びポンプ輸送機構は比較的複雑な構造であり、簡単には製造 できない。また、ＥＰ０３８１５０１Ａ２に開示されているキュベットの形状と 構造は慣用的熱サイクリングデバイスに容易に挿入できない。更に、キュベット により使用される流体移送法は、弾性側壁に押し付けるローラー装置や小ピスト ンの排気など機械的外圧源が必要である。このような外圧源を備えるように慣用 的熱サイクリングデバイスを改造するのは容易ではない。最後に、この文献に記 載されている装置は、開示デバイスの処理量が非常に制限されている。システム は製造に所望される柔軟性を欠いている。 仏国特許公開第２６７２３０１号（Ｌａｒ ｚｕｌ）は類似のＤＮＡ増幅用気密試験デバイスを開示している。このデバイス も多重区画とサンプル及び／又は試薬の移送用通路を備える。流体輸送用動力源 は液圧、磁気移動、受動的毛細管現象、熱勾配、蠕動ポンプ及び機械的に誘導さ れる差圧（例えば圧搾）であると記載されている。 均一増幅及び検出を実施する方法は制限的に記載されている。Ｈｉｇｕｃｈｉ ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−４１７（１９９２）は、密 閉反応容器で増幅核酸のＰＣＲ増幅及び検出を実施する方法を記載している。Ｈ ｉｇｕｃｈｉらは、反応容器及び反応試薬に臭化エチジウムを加えて増幅と検出 を同時に実施することを教示している。増幅反応で生成された増幅核酸をその後 、ｄｓ−ＤＮＡと結合する臭化エチジウムによって生じた蛍光の増加により検出 する。著者らは、熱サイクリングの前、後又はその間に 増幅反応容器の壁を通して励起させることにより蛍光を測定すると報告している 。 米国特許第５，２１０，０１５号もＰＣＲ増幅反応中に標的の検出を行う標的 核酸の増幅及び検出方法を開示している。この文献は、標的にアニールすること が可能な標識オリゴヌクレオチドプローブと非標識オリゴヌクレオチドプライマ ー配列を反応混合物に加えることを教示している。増幅中に標識オリゴヌクレオ チドフラグメントはポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって反応混 合物中に放出される。こうして、ハイブリダイズしたデュプレクスから放出され る標識フラグメントによってサンプル中の標的の存在を検出する。 １９９２年４月６日付けで出願された本願と同一名義の同時係属出願第０７／ ８６３，５５３号、発明の名称「内部全反射による核酸又は分析物の検出方法及 び装置（Ｍｅｔｈ ｏｄ ａｎｄ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄ ｏｒ Ａｎａｌｙｔｅ ｂｙ Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）」も、増幅と検出を同一容器内で実施する反応容器 を開示している。増幅産物は固定捕獲試薬との特異結合によって光学素子上で捕 獲される。増幅産物と捕獲試薬が結合すると、光学素子内に生じるエバネッセン ト波の侵入深さの内側に蛍光標識が生成される。蛍光標識の結合の結果として蛍 光が変化し、この変化を検出する。 これらの開示にも拘わらず、密閉反応容器も均一アッセイも未だ商業的に広く 利用されていない。従って、従来技術の欠点を解消すると共に、容易に製造され る構成で効率的で高信頼性の無菌試験環境を提供する増幅検出システムが必要と されている。発明の要約 一般に、本発明は流体サンプルを反応領域から検出領域に移送する方法に関す る。好適方法では、反応領域は核酸増幅分析用熱サイクリングチャンバーである が、本発明は多くの他の標的リガンド、アッセイ構成及び／又はチャンバー型に 広く適用されることが理解されよう。 １態様において、本発明はデバイスの内側で反応チャンバーと検出チャンバー の間で流体サンプルを移送する方法に関し、該方法は、 ａ）反応チャンバーと検出チャンバーをもつデバイスを準備し、反応チャンバー と検出チャンバーをこれらのチャンバーの間の流体流通手段によって相互に連結 し、前記反応チャンバー内に反応サンプルを配置し、推進剤とサンプルが混合す るように又はサンプルが推進剤と流体流通手段の間に位置するように前記反応チ ャンバー内に推進剤も配置し、更に前記推進剤を膨張するように誘導可能にする 段階と、 ｂ）推進剤を膨張するように誘導し、より大きい容積を占有させ、流体流通手段 を通ってサンプルを検出チャンバーに圧入する段階とを含む。 好ましくは、反応チャンバーは細長形又は管状構造であり、少なくとも１又は ２個の長手方向セグメントをもち、一端が閉じ且つ他端に検出チャンバーと連通 する開口をもつ。膨張するように誘導可能な任意の物質であり得る推進剤は、反 応サンプル自体でもよいし、反応チャンバーの閉鎖端又はその近傍に配置された 別の物質でもよい。理想的には、推進剤は光又は熱などの非機械的刺激によって 膨張するように誘導し得る。推進剤の膨張は、液圧や変形可能な膜壁などの膨張 以外の原因によって生じる機械的昇圧から区別すべきである。 本発明に必須ではないが、推進剤の膨張は 液体から気体への蒸発などの相変化を包含し得る。このような場合には、反応チ ャンバー内で核形成部位を使用することにより蒸発を局在化すると好都合である 。このような核形成部位は、沸騰チップ即ち直径約１．０〜０．１ｍｍのガラス 又はプラスチックマイクロビーズなどの不活性粒状物質でもよいし、反応チャン バーの内面に溝や稜を形成したり、粗面化してもよい。好ましくは、核形成部位 はサンプルを反応チャンバーからより効率的に押し出すように反応サンプルの底 部又はその近傍に局在する。 本発明の方法の好適用途は、リガーゼ連鎖反応やポリメラーゼ連鎖反応などの 熱サイクリング法によって増幅された核酸を含む反応サンプルを、密封反応／検 出ユニットを開かずに検出チャンバーまで移送し、こうして作業場所が増幅核酸 によって汚染される可能性をなくすか又は有意に減らすことである。例 えば第１の長手方向セグメントを断続的に加熱することによってサイクリング反 応を実施することができ、閉鎖端に近い側の第２の長手方向セグメントを加熱す ることによって移送を実施することができる。２つのセグメントを加熱する手段 は同一でも異なってもよい。あるいは、単一長手方向セグメントと単一加熱手段 の場合には、第１の最大量の熱を断続的に加えることによってサイクリングを実 施することができ、前記第１の最大量を上回る熱を加えて推進剤を「過熱」する ことによって移送を実施することができる。図面の簡単な説明 図１はブロック図により本発明のシステムの一般要素を示す。 図２Ａ〜２Ｈは組み立て前の反応／検出ユニットの１例の数種の図を示す。図 ２Ａは図２Ｃのａ−ａ線における部分横断面図であり、上部即ち検出チャンバー を示す。図２Ｂは検 出ユニットに挿入するために整列した下部即ち反応チャンバーを示す。図２Ｃは 図２Ａのｃ−ｃ線における横断面図である。図２Ｄ及び２Ｅは図２Ｃの夫々ｄ− ｄ及びｅ−ｅ線における横断面図である。図２Ｄは正面向きを示し、図２Ａ及び ２Ｅは側面向きを示すことが理解されよう。図２Ｆ、２Ｇ及び２Ｈは反応チャン バーを検出チャンバーに密封可能に係合し、サーマルサイクラーホルダーに挿入 した後の反応／検出ユニットを示す。図２Ｆは図２Ａと同様に側面横断面図であ り、図２Ｇは正面横断面図であり、キー締め手段の例を示す。図２Ｈは図２Ｆの ｈ−ｈ線における横断面図である。 図３Ａ〜３Ｄは本発明による反応／検出ユニットの数種の態様及び変形例を示 す。図３Ａ及び３Ｂは反応チャンバーを検出チャンバーに密封可能に係合後の反 応／検出ユニットのスナップ嵌め態様を示す。図３Ｃ及び３Ｄ は反応／検出ユニットの変形例の横断面図であり、係合手段と検出構成が図３Ａ 及び３Ｂと異なる。 図４Ａ〜４Ｄは組立後の反応／検出ユニットの密封可能な係合手段の拡大図を 示す。図４Ａは標準摩擦即ちルアー嵌めの横断面図、図４Ｂは爪即ちスナップ嵌 めの横断面図、図４Ｃは爪即ちスナップ嵌めの変形例の概略図、図４Ｄはねじ型 密封の横断面図を示す。 図５Ａ〜５Ｄは本発明の方法によるユニットの反応チャンバーから検出チャン バーへの増幅反応サンプルの移送を示す。検出チャンバーの各側面図の上に該チ ャンバーの正面図を示す。 図６は各段を環状リングとして構成した、本発明で用いる２段加熱エレメント の好適態様を示す。 図７は本発明の好適サーマルサイクラーデバイスの部分横断面図を示す。 図８Ａ〜８Ｄは本発明の好適検出システムの択一的態様を示す。図８Ａは電動 リングを備える態様を示し、図８Ｂは電動ミラー及びランプを備える固定リング を示し、図８Ｃは反射検出構成を示し、図８Ｄは透過検出構成を示す。 図９Ａ〜９Ｋは本発明により２部分型サーマルサイクラーの加熱エレメントを 制御する制御プログラムを示すフローチャートである。 図１０は図１のシステムの種々の相の温度及び時間分布を示す。 図１１Ａ〜１１Ｄは本発明によりビデオ画像を処理するコンピュータプログラ ムを示すフローチャートである。 図１２Ａ及び１２Ｂは夫々図２Ａ及び３Ａに示すストリップ担体の読取ゾーン 部分６８の拡大図である。 図１３及び１４は夫々実施例６及び１２に記載するような６個の反応サンプル の結果の ディジタル化写真画像である。各図中、左側の３個のサンプルは標的ＤＮＡを含 み、スポット又はバンドが見えるが、右側の３個は標的ＤＮＡを含んでいなかっ た。本発明の態様の詳細な説明 詳細な開示の概要 １．システム概説 ２．反応／検出ユニット ａ．反応チャンバー ｂ．検出チャンバー ｃ．検出担体 ｄ．密封機構 ３．熱サイクリング及び移送デバイス ａ．サイクラーデバイス ｂ．移送方法 ４．検出システム ５．コンピュータ／回路制御 ６．熱制御 ａ．ハードウェア ｂ．ソフトウェア ７．ビデオ処理 ８．核酸増幅及び検出方法 ９．本発明のキット １０．実施例 １１．配列表 １．システム概説 図１は本発明により構成した増幅検出装置の一般化概略図である。装置１０は 熱サイクリングデバイス１６を含み、該デバイスは各々下記に詳述する第１及び 第２の加熱エレメント段１７及び１８と夫々に付属する熱センサー１２２、１２ ３、ファンモーター１９並びに検出システム２２を含む。装置１０は更に、熱サ イクリングデバイス１６に連結したコンピュータコントローラ２６を含む。一般 に、熱サイクリングデバイス１６は、反応サンプル中に存在する標的核酸を増幅 及び／ 又は移送するために、ヒーター段１（１７）及びヒーター段２（１８）の各々に 独立信号を送るコンピュータ２６の制御下で、サーマルサイクラーデバイス１６ の内側に収容された反応容器の局在セグメントに所定温度を独立して供給するこ とが可能である。デバイス１６のコンピュータ制御の詳細については後節に記載 する。 装置１０は更に、複数の反応／検出ユニット２０（図２〜３参照）を含む。ユ ニット２０は、図２Ａ〜２Ｈ及び３Ａ〜３Ｄに示すように、反応チャンバー３０ と検出チャンバー３２を含む２部分型密封可能構造をもつ。反応チャンバー３０ は所望の増幅反応を実施するために反応サンプルを収容する。検出チャンバー３ ２は増幅反応の結果の検出可能な指標を発生する手段を備える。これらの反応／ 検出ユニット２０の特定態様及び変形例については本開示中で追って詳述する。 増幅反応方法は、反応サンプル３８を所望の増幅試薬と共に反応チャンバー３ ０に挿入することにより開始する。次に検出チャンバー３２を反応チャンバー３ ０と結合して密封ユニット２０を形成した後、このユニットを図２Ｆ及び５Ａ〜 ５Ｄに最良に示すように熱サイクリングデバイス１６の加熱段１７，１８に配置 する。反応チャンバー３０と検出チャンバー３２の結合後、ユニット２０は密封 状態に保たれ、増幅及び検出の両者を実施するための密閉環境を提供する。 コンピュータ２６は実施する増幅反応の種類に依存して任意の温度サイクルの 温度設定及びタイミングを制御する。ＰＣＲ又はＬＣＲなどの増幅反応では、コ ンピュータ２６は加熱段が高／変性温度とこれに続く低／アニーリング温度のサ イクルを１回以上実施するようにプログラムされる。２段式の場合には、コンピ ュータ２６は上段加熱段１７の温度を 下段加熱段１８から独立して制御することができるが、同一プロトコルに従って もよい。 増幅反応が終了すると、密封反応／検出ユニットを開かずに、反応サンプルは 密封ユニット２０の反応チャンバー３０から検出チャンバー３２へと移送される 。反応サンプルは好ましくは、反応チャンバー３０内の推進剤を膨張させてサン プルと試薬を検出チャンバーに圧入することにより移送される。 検出チャンバー３２は増幅反応の結果の検出可能な指標を発生する検出手段を 含む。一般に、検出手段は反応サンプル３８中に存在する増幅標的核酸を固定及 び蓄積する１個以上の捕獲部位７４をもつ担体６０を含む。固定した増幅標的核 酸は捕獲部位７４の検出可能な指標と関連付けられ、この指標は検出システム２ ２及びコンピュータ２６により検出及び分析される。 以下、上記一般概説の複数の変形例を含め て装置１０の種々の要素を各々詳細に説明する。 ２．反応／検出ユニット ａ．反応チャンバー 本発明の反応／検出ユニット２０は図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｄ及び他の図面に 示す。各ユニット２０は反応チャンバー３０と検出チャンバー３２を含む。ユニ ット２０は使い捨て式であり得る。 核酸増幅反応は反応チャンバー３０で実施される。反応チャンバー３０は核酸 の変性に必要な温度、典型的には８０〜１１０℃に耐えられるガラス又はプラス チックなどの材料から作成される。細長形反応チャンバー３０の下端３４は閉じ ており、上端３６は反応サンプル３８と必要に応じて増幅反応試薬を受容できる ように開いている。このような反応試薬は使用者が反応チャンバー３０に加えて もよいが、好ましくは製造中に加え、除去可 能又は破壊可能なシール（図示せず）によって封入し、その場合には使用者は試 験サンプルのみを加える。試験サンプルは任意の公知手段によって反応チャンバ ー３０に挿入できる。例えば、注射器（図示せず）に入れ、シールを除去するか 又は中空腔を備える注射器先端でシールを穿孔することによって反応チャンバー に挿入することができる。こうして、反応チャンバー３０内の反応サンプルは試 験サンプルと増幅試薬の両者を含む。反応サンプルに更に推進剤４０と検出シス テムの１種以上の成分を加えてもよい。 チャンバー３０の寸法は比較的少量の反応サンプル３８をかろうじて収容でき る程度に選択すべきである。好ましくは、チャンバー３０は約１０μＬ〜約２０ ０μＬの反応サンプルを収容するような寸法である。より好ましくは、チャンバ ー３０の容積は約５０μＬ〜約１２０μＬである。反応チャンバー３０ は更に、反応チャンバー３０内の表面張力を下げ、加熱中の反応サンプルが発泡 しないように適切な寸法とすべきである。更に、反応チャンバー３０は反応サン プルへの熱伝達率を高めるように高い表面積対容積比をもつべきである。好まし くは、反応チャンバー３０は長手方向軸をもつ細長い管状である。１好適態様で は、反応チャンバー３０は下端を密封した微量注射器管又は毛細管である。 内壁が滑らかな反応チャンバーは、特に閉じた下端３４において内部に凹凸表 面をもつチャンバーよりも性能が劣ることが判明した。例えば、加熱は明らかに 内面に凹凸を生じるが、開放微量注射器又は毛細管の一端をヒートシールすると 良好に挙動し、閉端毛細管（例えばＶａｒｉｖｅｓｔ，Ｇｒａｓｓ Ｖａｌｌｅ ｙ，ＣＡの製品：実施例４参照）は予め融解しない限り性能が不良であった。凹 凸表面はサンプルの底部又はその近傍で蒸発 を開始するための核形成部位を提供すると仮定される。但し、本願出願人は特定 の理論や動作メカニズムに限定又は拘束する意図はない。 管の内部を機械的に研削又は粗面化したり内部に溝や稜を設けても性能が改善 する。反応管の底に小型の沸騰チップもしくはスティック又は微粒子ビーズを加 えても性能を改善できる。例えば、直径約１．０−０．１ｍｍの寸法のポリスチ レン、ガラス、セラミック、ステンレス鋼又は他の適切な不活性材料のビーズが 核形成部位として有用である。粒子が反応チャンバーの内側に入りさえすれば、 粒子サイズは特に限定されないと考えられる。このような粒子は反応試薬に対し て不活性であるべきであり、反応サンプルよりも稠密であるべきである。 ｂ．検出チャンバー 増幅した標的核酸は図２及び３に示すよう に検出チャンバー３２で反応サンプルから分離される。検出チャンバー３２はプ ラスチック又はガラスなどの透明材料から作成され、開放端４８と閉鎖端５４を もつ。反応サンプル３８は開放端４８を通って検出チャンバー３２に流入し、（ 下記に詳述する）検出担体６０に遭遇する。 好適態様（図２）では、検出チャンバーは反応チャンバーから供給されるサン プル流体を収容するレザーバ３７を含む。これは、サンプル流体を開放端４８に 導き、流体が検出チャンバーの側面から流入するように検出チャンバー３２の床 面よりも高位にオリフィス３９をもつ流路を通すことにより実現される。あるい は、立管入口によってレザーバを形成してもよい。レザーバ３７は、反応チャン バー３０内で流体サンプルが冷却されて減少しても、検出担体手段６０に反応サ ンプル流体を供給し続ける（図５Ｃ及び５Ｄ比較。レザ ーバ内の流体は反応管に戻らずにストリップ６１により吸収される）。レザーバ と側面入口オリフィス３９をもつ細長形検出チャンバーでは、山形フィン４３を 成形して検出チャンバー全体に強度を付加するのも有用であり得る。 別の好適態様では、検出チャンバーの横断面形状（図２Ｃ）はただ１つの可能 な向きにしか加熱段の対応する溝に嵌め込めないような多角形又は非対称である 。これは台形受座を示す図２Ｆ及び２Ｈに最良に示される。透過検出構成（下記 参照）では、チャンバーの前面と後面を実質的に平行に維持するのが好ましい。 台形は固定向きでありながらこの配置を確保する最も簡単な多角形である。他方 、他の多角形又は非対称形状も予想できる。反射検出構成（下記参照）では前面 と後面が平行である必要はなく、他の多角形が適切である。円形受座構成を使用 する場合には、単一 向きを伝えるためにカム又は平坦側面を備え得る。受座は光学面と同一構成であ る必要はない。 検出チャンバー３２（及び／又は反応チャンバー３０）は、熱サイクリングデ バイス１６の内側でチャンバーを支持し且つ取り扱いを簡単にするタブ部材５８ （図２Ｇ及び７参照）を含み得る。タブ部材５８は更に、加熱段１７に配置され たキー溝９１（図２Ｇ及び７参照）と係合する手段を含み得る。検出システムが 加熱段に対して固定されている限り、多角形に代わるこの構成でも加熱段及び検 出システム２２に対して検出チャンバー３２を規定の向きに確保できる。 図３Ａ〜３Ｄは図２の好適態様に代わる態様を示す。これらの態様は類似の要 素と特徴をもち、これらの要素には図２の態様と同一符号を付す。但し、図３の 態様はレザーバを含まない。 ユニット２０は更に、好ましくは検出チャンバー３２に配置されたバーコード （図示せず）を備え得る。バーコードを読取るために熱サイクリングデバイス１ ６に設けられたバーコードリーダー（図示せず）がコード化情報をコンピュータ ２６に送信し得る。バーコードは特定ユニット２０を識別することができ、サン プル及び実施しようとする反応に関する他の関連情報を提供することができる。 この情報は、コンピュータ２６により実施されるビデオ処理プログラムに関して 本開示中で後述するように患者識別及び／又は捕獲部位７４の構成を含み得る。 ｃ．検出担体 検出チャンバー３２は更に、反応サンプルを受容し、増幅標的ＤＮＡを分離し 、増幅反応の結果の可視指標を発生する検出担体手段６０を含む。典型的には、 検出担体手段は、不均一アッセイで周知のように、標的の存在 を表すシグナルを蓄積することが可能な固体担体を含む。 このような固体担体は、例えばプラスチック、ガラス、天然及び合成ポリマー 並びにその誘導体を含み、例えばセルロースエステル、微孔質ナイロン、ポリ二 フッ化ビニリデン、紙及び微孔質膜を含む。担体は例えば繊維、ビーズ、スライ ド、円筒ロッド又はストリップの形状であり得る。好適態様では、検出担体手段 ６０は毛細管移動を実施可能な微孔質ストリップ６１（図２、３及び５参照）で ある。より好ましくは、多孔質担体はニトロセルロースであり、例えば約２μｍ 〜約２０μｍ、通常は５又は１０μｍの気孔寸法をもつニトロセルロースである 。好ましくは、多孔質担体は不活性であるか又は、ブロッキング剤及び／又は輸 送助長剤（例えば米国特許第５，１２０，６４３号参照）を使用して不活性にし 、一般には反応サンプル中の試薬又は 標的核酸と物理的又は化学的に反応しない。輸送助長剤の使用は当該技術分野で 公知であり、実施例３に詳述する。多孔質及び微孔質担体は毛細管現象による吸 上作用とクロマトグラフィー特性を示すが、本発明は非クロマトグラフィー担体 及び非多孔質担体も包含する。 検出担体手段６０は、円形即ちディスク形状又は矩形形状を含む任意の適切な 形状であり得る。検出手段６０の寸法は、検出手段６０に固定された増幅標的核 酸により発生される可視指標を十分に解像できるように選択すべきである。検出 手段６０は好ましくは、固定された標的核酸の検出に必要な時間を短縮し且つ材 料使用を最小限にするように小さく及び／又は薄い。当業者は反応サンプル３８ の容量、増幅標的の量及び反応チャンバー３０と検出チャンバー３２の寸法を考 慮して検出手段６０の寸法を最適化することができよ う。検出手段６０を収容するように検出チャンバー３２を構成してもよい。 典型的には、例えば担体の気孔寸法及び厚さに応じて異なる速度で異なる担体 材料６０が反応サンプル３８を受容及び輸送する。担体は追って詳述するように 、増幅標的核酸と結合するために必要な時間を上回る速度で特異結合対メンバー 又は捕獲分子を通り越して反応サンプル３８を輸送しないように選択すべきであ る。 好適担体６０は、反応サンプルの輸送が開始する第１の端部６２と、反応サン プルの輸送が終了する第２の端部６４と、増幅標的核酸を検出チャンバー３２内 で単離させるメカニズムを含む１個以上の領域６６，６８，７０を含むストリッ プ６１である。 図２Ｄ及び５Ｄに示すように、ストリップ６１は少なくとも２領域を含み、ス トリップ６１の第１の端部６２又はその近傍の第１の 領域６６は反応サンプル中に存在する増幅標的核酸を標識するように機能し、第 ２の領域６８は標識した増幅標的核酸をストリップ６１に固定することにより反 応サンプルから分離するように機能する。第２の領域６８は１個以上のゾーンを 含んでもよく、各ゾーンは標的核酸を固定し、標的核酸が捕獲部位に固定される と可視指標を提供する少なくとも１個の捕獲部位７４を含む。捕獲部位７４は図 ２Ｄ及び３Ｃに示すように連続バンドとして配置してもよいし、図２Ｇに示すよ うに不連続バンドとして配置してもよいし、図３Ａ及び５Ａ〜５Ｄに示すように 独立スポットとして配置してもよい。捕獲領域内の多重捕獲部位及び複製物部位 の意義については後述する。 標識機能はスポット自体で行う必要はなく、反応サンプルの内側を含めて反応 サンプルと捕獲部位の間の任意の点で行い得ることが理解されよう。例えば、複 合パッドを検出担体 の下端に付着し得る。このようなパッドは反応チャンバーの開放端３６、検出チ ャンバーの開放端４８、又は図２に示す態様のオリフィス３９もしくはレザーバ ３７に配置してもよい。複合パッドをストリップに付着しないとしても、少なく ともストリップと接触させると好ましいと思われる。 ストリップ６１は、検出システム２２の対照ゾーン又は参照標準として機能す る第３の領域７０を含み得る。好ましくは、このような全領域６６，６８，７０ は担体６１の空間的に別個の領域である。領域６６，６８，７０の機能について は、増幅標的核酸の検出方法に関連して追って詳述する。 担体６１は必要に応じて不活性基板に固定してもよく、このような基板は好ま しくは構造支持体を提供するに十分に強固なガラス、プラスチック又はナイロン などの透明材料から作成される。図２及び５に示す態様では、 検出チャンバーはストリップを強固に保持するピン又はフィンガー４１を備える 。このようなピン又はフィンガー４１は製造中にチャンバーハウジングに成形で きる。担体及び基板は好ましくは検出チャンバー３２の内側に固定位置又は角度 に配置されるので、担体６１に固定された増幅標的核酸の検出は、本発明の方法 に関連して後述するように、検出システム２２に対して所定位置又は角度で実施 することができる。 ｄ．密封機構 検出チャンバー３２は、増幅反応が一旦実施されたら増幅核酸が漏れないよう に反応チャンバー３０と密封結合するように設計される。このために、反応／検 出ユニット２０はチャンバー３０，３２を相互に密封可能に係合する係合手段を 含む。係合手段は数種の公知手段の任意のものによって達せられる。係合手段は 、チャンバー３０，３２から潜在的 に汚染している流体が漏出しないように確実な密封を形成すべきであり、換言す るならば温度もしくは圧力上昇条件下又は通常操作及び／又は廃棄条件下で開い たり、分離すべきでない。 図４Ａ〜４Ｄはユニット２０の２個のチャンバー３０，３２を密封可能に係合 又は結合する数種の機構を示す。恐らく、最も簡単な機構は標準ルアー即ち摩擦 嵌めである。これは図４Ａ、図２などに拡大して詳細に示す。反応チャンバー３ ０の開放上端３６はその外周面にベベル面４４を含み、検出チャンバー３２の開 放端４８はその内周面にベベル面５０を含む。２面４４，５０のベベル角は、図 ２Ｅ、２Ｆ、３Ｃ、３Ｄ及び４Ａに示すように２個のチャンバーを相互に圧着し たときに緊密な摩擦嵌めが達せられるように組み合わせる。図示しないが、この 密封機構の変形例はルアーロックシステムと差込み固定システ ムを含む。 図４Ｂは第２の密封機構を詳細に示す。これは標準ルアー嵌めのスナップ嵌め 又は爪変形例である。上端３６はその外周面にベベル面４４と環状ショルダー又 は爪４６を含む。検出チャンバー３２はベベル面５０と環状爪又はショルダー５ ２を含む。この場合もベベル角は緊密な密封を形成するように組合わせ、環状シ ョルダー４６，５２はこれらの２部分が分離しないように相互に締め付け合う。 スナップ嵌めの別の変形例を図４Ｃに示す。形状は多少異なるが、要素はすべて 同様であり、同一符号を付した。スナップ嵌めはショルダー５２が面４４を越え てショルダー４６と係合するように両端を係合させることにより達せられる。 図４Ｄに示す最後の密封機構では、反応チャンバー３０の開放端３６は雄ねじ ４７を備える。検出チャンバー３２の開放端４８は内 側に同様に対応する雌ねじ４９を備える。反応チャンバーを検出チャンバーにね じ込むことにより、密封反応／検出ユニットが得られる。本発明の範囲内で多数 の他の等価密封変形例が可能である。理想的には、密封機構は通常操作条件下で 実質的に不可逆的である。 本発明の反応／検出ユニット２０は後述するように１又は２段熱サイクリング デバイスと併用できる。 ３．熱サイクリング及び移送デバイス ａ．サイクラーデバイス 図６及び７は、図１に略示した熱サイクリング及び移送デバイス１６の好適態 様の詳細を示す。もっとも、単段及び多段加熱／伝達ユニットのいずれも本発明 のデバイス及び方法で使用するのに適していることを理解されたい。即ち、サイ クラー１６はコンピュータ２６の制御下で所望の温度を反応チャンバー３０に供 給するために少なくとも１個の加熱 段１７、場合によっては２個の加熱段１７及び１８を含む。１好適態様では、加 熱段は環状下段加熱リング９２から空間的に分離された環状上段加熱リング９０ を構成する。加熱リング９０，９２間の空間は絶縁体として機能するが、他の絶 縁材料も使用し得る。加熱段は直線、平面又は楔（図示せず）など種々の他の形 状でもよい。冷却期間中にリング９０，９２の温度低下を助長するために、典型 的には径方向に内側に向かって、離間した１個以上のフィン９３がリング９０， ９２上に配置される。冷却フィン９３の下にはファン９４が配置され、冷却期間 中にリング９０，９２の温度低下を更に助長する。 加熱リング９０，９２はアルミニウム、銅又は金などの熱伝導材料から作成さ れる。熱は図６に示すように好ましくはリング９０，９２の外周面に沿ってリン グに付着された慣用抵抗熱ストリップ９５，９６を介して、又 はマニホールドなどの他の公知手段により、又は伝導によってリング９０，９２ に供給され得る。多段システムでは、コンピュータ２６は熱ストリップ９５，９ ６の各々に独立して電力を供給することにより各加熱リング９０，９２の温度を 独立して制御することができる。コンピュータは２段を１段であるかのように連 動させることもできる。 図７に示すように、ユニット２０は、反応チャンバー３０の第１の長手方向セ グメント３３が上段リング９０にさらされ且つ反応チャンバー３０の第２の長手 方向セグメント３５が下段リング９２にさらされるように、加熱リング９０，９ ２の数個のアパーチャ又はウェル９７の内側に配置される。図６及び７に示すよ うに、ウェル９７は各々上段リング９０のアパーチャ９８と下段リング９２のア パーチャ９９の組合わせによって構成される。上段リングアパーチャ９８は上段 リング９０ を貫通する。ウェル９７に反応／検出ユニット２０を支持する何らかの手段（例 えば上記タブ部材５８）が存在するならば、下段リングアパーチャ９９は、図２ Ｇ及び７に示すように下段リング９２を貫通し得る。あるいは、下段リング９２ の一部のみにアパーチャ９９を形成し、反応チャンバー３０の密閉底３４を下段 リング９２に支承させてもよい。 コンピュータ２６（図１参照）は、反応チャンバー３０内の反応サンプル３８ を所定の温度にするように上段加熱リング９０、任意下段加熱リング９２及びフ ァン９４を制御する。熱サイクリングデバイス１６の加熱及び冷却サイクルとコ ンピュータ２６によるその制御については、コンピュータ／回路制御に関する開 示中で追って詳述する。増幅反応が完了すると、コンピュータ２６は推進剤４０ にその閾値膨張温度以上の温度の熱を供給するように加熱エレメントに指令する 。閾値温 度に達すると、推進剤４０は膨張して反応サンプル３８を上方の検出チャンバー ３２に圧入する。１態様では、下段リング９２を上段リング９０よりも過剰に加 熱して推進剤を膨張させる。 ｂ．移送方法 図５Ａ〜５Ｄは単段装置で反応サンプル３８を反応チャンバー３０から検出チ ャンバー３２へ移送する経緯を示す。ユニット２０は加熱エレメント１６のアパ ーチャ９７の内側に配置されている。代替２段システムでは、反応チャンバー３ ０の第１の長手方向セグメント３３（図２Ｂ及び３Ａ）が上段リング９０にさら され且つ反応チャンバー３０の第２の長手方向セグメント３５（図２Ａ及び３Ａ ）が下段リング９２にさらされるように反応チャンバー３０をアパーチャに配置 する。 図５Ａでは増幅反応が完了し、加熱エレメント１６は推進剤４０の閾値温度ま で上昇し つつある。２段システムでは、増幅反応の完了後に反応サンプル３８を蒸発しに くくするために、上段リング９０を最初に閾値温度よりも低い温度に維持し得る 。推進剤４０が増幅反応中に膨張しないように推進剤閾値を最高増幅反応温度よ りも高くすると好適である。 本発明で使用する「推進剤」とは、刺激、好ましくは非機械的刺激に応答して 膨張する任意物質を意味する。例えば、推進剤４０は気体（例えば空気）、液体 又は固体化合物であり得る。液体及び固体推進剤の場合には、一般に蒸発して膨 張する。推進剤４０を膨張させる刺激は例えば熱、光、又はその組み合わせであ るが、本発明では熱が好ましい。反応サンプル３８自体を推進剤４０として用い てもよい。液圧又は膜壁変形などの機械的圧力では推進剤は膨張しない。 図５Ｂでは加熱エレメント１６は推進剤４０をその閾値温度まで加熱し、推進 剤４０は 膨張して反応サンプル３８を検出チャンバー３２に向かって上昇させている。こ の時点で２段システムでは上段加熱リング９０を閾値温度にし、推進剤４０が第 １の長手方向セグメント３３を通って上昇しながら膨張するのを助長し得る。図 １０に関して後述するように、コンピュータ２６は、下段加熱リング９２の後で 上段加熱リング９０を閾値温度まで過熱できるようにプログラム可能な時間遅れ を備える。 加熱エレメント（又は上段及び下段リング９０，９２）は、図５Ｂ及び５Ｃに 示すように、反応サンプル３８が検出チャンバー３２、好ましくは側面開口３９ を通ってそのレザーバ３７に完全に移送されるまで閾値温度を供給し続け、推進 剤４０を膨張させる。 図５Ｃでは検出ストリップ６０の第１の領域６６が湿潤し始めている。この領 域（又はサンプル経路の先端部分、上記参照）は好ま しくはこの領域を通る増幅標的核酸と結合する標識（例えばゾーン６７）を含む 。この結合を行う１方法は、核酸に結合したハプテンと抗ハプテン抗体に結合し たコロイド粒子を用いる方法である。コロイド金又はセレンや、着色ラテックス 粒子が適切な標識である。ハプテン及びハプテン化は当該技術分野において公知 であり、特に核酸のＬＣＲ及びＰＣＲ増幅との関連ではビハプテン化法が知られ ている。例えば、ＥＰ−Ａ３５７０１１及びＥＰ−Ａ−４３９１８２参照。ハプ テン化核酸がゾーン６７を通るにつれて標識複合体は反応溶液によって可溶化さ れて移動し、核酸上のハプテンと結合する。あるいは、ハイブリダイゼーション や、伸長及び連結などの必要な酵素活性を妨げないという条件で検出可能な標識 をプローブ／プライマーと直接結合してもよい。 溶液はストリップ６１を上昇するにつれ、 領域６８で捕獲部位７４に遭遇し、場合によっては領域７０で対照部位に遭遇す る。捕獲部位７４には第２のハプテンに対する第２の抗体が移動しないように固 定されている。このハプテンに結合した全核酸はこれらの部位で固定される。固 定核酸が増幅され、第１のハプテンも含むならば、複合体が捕獲部位に蓄積し、 検出可能になる（図５Ｄ）。本発明の方法によって多重増幅及び検出できるよう に、各捕獲部位７４に異なるハプテンに対する固定抗体を配置してもよい。ある いは、部位の各々の間で信号を平均できるように、同一ハプテンに対する抗体を 多重捕獲部位７４に配置してもよい。 本発明の熱膨張態様による移送は核酸アッセイ又はサーマルサイクラーに制限 されないことも理解されたい。移送態様は、反応サンプルを反応位置から検出位 置まで移動させることが所望される任意の場合に有用である。 （例えば汚染の理由で）密封又は密閉容器の内側で移送することが望ましいよう な状況で特に有用である。他方、試薬が移送を行うのに必要な熱レベルに耐え得 るという条件でイムノアッセイなどの非増幅非核酸アッセイにも使用できる。 ４．検出システム 増幅反応の結果は検出システム２２及びコンピュータコントローラ２６によっ て検出及び分析される。検出可能な標識は好ましくは可視標識であるが、ＵＶ、 ＩＲ又は蛍光標識などの他の検出可能な標識でもよい。好適検出システム２２は 担体６０のビデオ画像を生成し、ビデオカメラ１００と担体６０を照明する光源 １０４（どちらも図７及び８Ａ〜８Ｄに示す）を含む。担体６０の画像は直接又 は反射によってカメラ１００に送られ、カメラ１００はコンピュータ２６に送ら れるビデオ画像を生成する。分かりやすくするために、 可視標識については追って詳述する。 検出システム２２には種々の構成が適しており、そのいくつかの例を図８Ａ〜 ８Ｄに示す。一般に、検出システム２２は検出手段６０を照明する光源１０４と 、検出手段６０のビデオ画像を生成するカメラ１００を含むべきである。カメラ レンズを検出手段６０に直接照準してもよいし、検出手段６０の画像をカメラレ ンズに反射するようにミラーを配置してもよい。 図８Ｂに示すように、検出システム２２はカメラ１００、カメラレンズ１０２ 、光源１０４、ミラー１０６及びミラー１０６に連結したモーター１０８（好ま しくはステッパーモーター）を含む。光源１０４は、カメラレンズ１０２が担体 ６１から反射された比色信号を測定するように配置される。カメラ１００とミラ ー１０６は加熱リング９０，９２と同軸に配置され、ミラー１０６は多孔質担体 ６１の画像をカメラレンズ１０２に反射するような角度で配置される。カメラ１ ００は固定しており、ミラー１０６はコンピュータ制御下にモーター１０８によ って回転され、各検出チャンバー３２のストリップ６１の画像をカメラレンズ１ ０２に順次送る。カメラ１００は各検出チャンバー３２のストリップ６１のビデ オ画像を生成し、この画像をコンピュータ２６に送って分析する。この画像を分 析するためのソフトウェアについてはビデオ処理の項で後述する。 図８Ａは検出システム２２の別の構成を示す。この検出システムはカメラ１０ ０、カメラレンズ１０２、光源１０４、ミラー１０６、及び加熱リング９０，９ ２に連結したモーター１０９を含む。光源１０４は、カメラレンズ１０２が担体 ６１から反射された比色信号を測定するように配置されている。カメラ１００と ミラー１０６は加熱リング９０，９２ と同軸に配置され、ミラー１０６は担体６１の画像をカメラレンズ１０２に反射 するように選択された角度で配置されている。カメラ１００とミラー１０６は固 定され、加熱リング９０，９２はコンピュータ制御下でモーター１０９によって 回転され、各検出チャンバー３２のストリップ６１の画像をミラー１０６に送る ように各検出手段を順次移動させ、ミラーは画像をカメラレンズ１０２に反射す る。カメラ１００は各検出チャンバー３２の担体６１のビデオ画像を生成し、こ の画像をコンピュータ２６に送って分析する。 別の態様では、カメラレンズ１００を担体６１に直接照準し、ミラー１０６の 必要を省いてもよい。別の態様では、光源をリングの内側に配置し、カメラをリ ングの外側に配置してもよいし、その逆に配置してもよい。これらの態様は図８ Ｄに関して後述する透過検出を利用する。 図８Ｃの反射蛍光検出システムはカメラ１００、カメラレンズ１０２、光源１ ０４、励起フィルター１１０及び発光フィルター１１２を備える。光源１０４と カメラ１００は、カメラレンズ１０２が検出チャンバー３２で担体６１から発生 される蛍光シグナルを受け取るように配置される。励起フィルター１１０は光源 １０４と担体６１の間に配置され、発光フィルター１１２は担体６１とカメラレ ンズ１０２に間に配置される。 図８Ｄの別の蛍光検出システムはカメラ１００、カメラレンズ１０２、光源１ ０４、励起フィルター１１０及び発光フィルター１１２を備える。光源１０４と カメラ１００は担体６１が光源１０４とカメラ１００に挟まれるように配置され る。こうしてカメラレンズ１０２は担体６１を透過した蛍光シグナルを受け取る 。励起フィルター１１０は光源１０４と担体６１の間に配置され、発光フィルタ ー１１２は担体６１とカメラレンズ１０２の間に配置される。透過検出システム は、１９９３年９月２７日に出願された本願と同一名義の同時係属米国特許出願 第０８／１２７，３８７号、発明の名称「透過光測定による分析物の定量（Ｑｕ ａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）」（代理人 整理番号５４３５．ＵＳ．０１）に詳述されている。透過検出に適した回路は一 般に知られているが、特定回路は同じく１９９３年９月２７日に出願された本願 と同一名義の同時係属米国特許出願第０８／１２７，４７０号、発明の名称「光 強度検出及び測定回路（Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｉｔ）」（代理人整理番号５３６７ ．ＵＳ．０１）に記載されている。これら２件 の出願の開示内容全体は参考資料として本明細書の一部とする。 検出システムは図８Ｃ及び８Ｄに示す透過又は反射法のどちらを使用してもよ く、どちらの方法も検出手段６０の画像を連続的にカメラに供給できると考えら れる。特に、検出システムは図８Ｂに示す回転ミラー及びモーターを組み込んで もよいし、（ミラーの有無を問わず）図８Ａに示す回転加熱リング９０，９２及 びモーターを組み込んでもよい。 ５．コンピュータ／回路制御 図１に示すように、コンピュータコントローラ２６はモニター１１３、キーボ ード１１４及びデータ記憶手段をもつＩＢＭ ＡＴ互換パーソナルコンピュータ として実装し得る。コンピュータ２６は画像フレームグラバーカード１１６、１ ６ビットアナログ／ディジタルＩ／Ｏカード１１８及びカスタムプリント基板（ ＰＣＢ）１２０を含む。適切なフレー ムグラバーカード１１６は、Ｃｏｒｅｃｏ（カナダ、モントリオール）から市販 されているＣｏｒｅｃｏ（登録商標）ＯＣ−３００である。適切なアナログ／デ ィジタルＩ／Ｏカード１１８は、Ｄａｔａ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐ ａｎｙの市販品である。 図１のダイヤグラムはフレームグラバーカード１１６、Ｉ／Ｏカード１１８及 びＰＣＢ１２０に含まれる回路の簡易図である。フレームグラバーカード１１６ はカメラ１００からビデオ信号を受け取って処理及び分析する。Ｉ／Ｏカード１ １８とＰＣＢ１２０は、共同して加熱ストリップ９５，９６及びファン１９を制 御することにより加熱及び冷却サイクルを制御する。ＰＣＢ１２０は加熱ストリ ップ９５，９６とファン１９に適当な電力を送ると共に、加熱ストリップ９５， ９６の実温度をモニターするために使用される慣用回路を含む。１対のサーミス タ１２２，１２３が 加熱リング９０，９２に連結され、リング９０，９２の温度を感知する。サーミ スタ１２２，１２３はリング９０，９２の温度を表す出力信号を発生し、この信 号はＰＣＢ１２０に戻される。 コンピュータ２６は加熱ストリップ９５，９６とファン１９を制御することに より加熱リング９０，９２の温度を制御するソフトウェアプログラムを含む。コ ンピュータ２６は更に、フレームグラバーカード１１６でビデオ信号入力を獲得 及び分析するためのソフトウェアプログラムも含む。図９Ａ〜９Ｋは適切な熱制 御プログラム２００のフローチャートを示す。図１１Ａ〜１１Ｄは適切なビデオ 処理プログラム６００のフローチャートを示す。熱制御プログラム２００及びビ デオ処理プログラム６００は、ＢＡＳＩＣ又はＣなどの市販プログラミング言語 を用いて実現し得る。 ６．熱制御 ａ．ハードウェア 一般に、熱制御プログラム２００はＩ／Ｏカード１１８を介してＰＣＢ１２０ に指示を提供する。例えば、ディジタル信号で通信する熱制御プログラム２００ は上段及び下段加熱リング９０，９２に所望の「設定」温度を設定する。Ｉ／Ｏ カード１１８はＤ／Ａ変換器１２６，１２８でディジタルコンピュータ信号をア ナログ信号に変換する。各加熱ストリップ毎に１個のＤ／Ａ変換器を設け、従っ て２個の加熱ブロックを使用する場合には、各々の温度を別々に制御することが できる。Ｄ／Ａ変換器１２６からのアナログ出力は比較器１３０及びソリッドス テートリレー１３２を介して上段加熱段１７に送られ、Ｄ／Ａ変換器１２８から のアナログ出力は比較器１３４及びソリッドステートリレー１３６を介して下段 加熱段１８に送られる。 一方のリレー１３２からの出力は上段加熱リング９０と連結した上段加熱スト リップ９５に送られる。別のリレー１３６からの出力は下段加熱リング９２と連 結した下段加熱ストリップ９６に送られる。リレー１３２，１３６は加熱ストリ ップ９５，９６を駆動させ、該ストリップは加熱リング９０，９２に熱を供給す る。サーミスタ１２２，１２３は加熱リング９０，９２に連結され、加熱リング ９０，９２の温度を感知して感知温度に対応する電気信号を発生する。サーミス タ１２２からの信号は演算増幅器１３８を介して比較器１３０に送られ、他方の サーミスタ１２３からの信号は演算増幅器１４０を介して比較器１３４に送られ る。更に演算増幅器１３８，１４０からの出力はＩ／Ｏカード１１８上のＡ／Ｄ 変換器１４２，１４４に送られ、上段加熱リング９０及び下段加熱リング９２の 現在の温度を表すディジタル信号をコンピュー タ２６及び熱制御ソフトウェアに提供する。 コンピュータ２６は各段毎に所望又は「設定」温度を表すディジタル信号を発 生する。これらの信号はＤ／Ａ変換器１２６，１２８でＰＣＢ１２０によって受 け取られ、アナログ信号に変換され、設定温度に達するように加熱ストリップ９ ５，９６を制御する。比較器１３０，１３４はその２本の入力ライン上の電圧を 連続的に比較する。比較器１３０の入力電圧は、（サーミスタ１２２からの）上 段加熱リング９０の温度とＤ／Ａ変換器１２６から受け取られた設定温度に対応 する。比較器１３４の入力電圧は、（サーミスタ１２３からの）下段リング９２ の温度とＤ／Ａ変換器１２８から受信される設定温度に対応する。加熱リング９ ０，９２のいずれかの感知温度がその設定温度よりも低い場合には、対応する比 較器１３０又は１３４はリレー１３２，１３６を介して加熱ストリップ９５，９ ６に設定温度を出力し続ける。加熱リング９０，９２の感知温度が設定温度を越 えると、比較器１３０，１３４は加熱ストリップ９５，９６への出力を遮断する 。こうしてプログラムはソリッドステートリレー１３７を介してＰＣＢに指令し 、ファンモーター１９をオンにし、逆に冷却期間が完了し、即ち低設定温度に達 した場合にはファンモーターをオフにできる。 ｂ．ソフトウェア 図９Ａ〜９Ｋに示すフローチャートは慣用ブロック記号を用いて、熱制御プロ グラムにより実施される主機能を表す。熱制御プログラム２００は４つの主セク ション又はルーチンをもつ。第１のセクションは図９Ａに示す「初期化」セクシ ョン２０２であり、ソフトウェア変数及び固定ハードウェアパラメータを従来通 りに定義することにより、コンピュータハードウェアがデータを受信できる状態 にする。初期化セクション２０２はコンピュータ２６を起動すると実行される。 第２のセクションは図９Ｂ〜９Ｄに示す「編集」セクション２０４であり、この セクションにより、オペレータは必要に応じて特定変性プロトコル及び必要に応 じてサイクル／過熱プロトコルを定義する種々のパラメータ選択を設定及び／又 は変更することができる。第３のセクションは図９Ｅ〜９Ｇに示す「変性」セク ション２０６であり、加熱リング９０，９２が変性プロトコルに選択された温度 となるようにＰＣＢ１２０に指示する。第４のセクションは図９Ｈ〜９Ｋに示す 「サイクル／過熱」セクション２０８であり、加熱リング９０，９２がサイクリ ングプロトコル及び過熱、又は閾値プロトコルに選択された温度となるようにＰ ＣＢ１２０に指示する。本明細書中で上述したように、過熱プロトコルは反応チ ャンバー３０内の推進剤４０を膨張させて反応 サンプル３８を反応チャンバ３０から検出チャンバ３２に移送する。プログラム ２００は好ましくは所定サイクル数Ｘにわたって高温と低温のサイクルを繰り返 した後、過熱サイクルに移る。 図９Ａに示すように、初期化セクション２０２はブロック２１０でプログラム ２００を開始した後、ブロック２１２でソフトウェア定数及び変数を初期化する 。ブロック２１２はコンピュータハードウェア上の記憶場所を割り当て及び定義 し、プログラム変数を規定するなどの慣用ステップを実施する。これらのステッ プはコンピュータプログラムがコンピュータハードウェアと有効に通信できるよ うにするために必要である。ブロック２１４，２１６及び２１８でプログラム２ ００はオペレータに（コンピュータメモリ又はデータ記憶装置に記憶された）所 望のプロトコルファイルを指定させるか又は１組のデフォルトプ ロトコル値を受理させる。プロトコルファイルは、特定サイクリング／過熱プロ トコルの特徴を定義する１組のパラメータの値を含む。いずれにせよ、プロトコ ルパラメータは後記編集セクション２０４でオペレータによって変更できる。熱 制御プログラム２００の開示態様では、下記パラメータがプロトコルファイルに 含まれ、最右列に示す値を例示値とする。開示プログラム２００では、（オペレ ーションの終了時のみにファンをオフにするために使用される）遮断温度は編集 可能なパラメータではなく、プリセットされている。 変性プロトコル、サイクリングプロトコル及び過熱プロトコルを通して加熱リ ング（従って、反応チャンバー３０）の温度対時間のプロットを示した図１０に 基づき、パラメータを説明する。図１０は加熱段が２段存在するが、過熱サイク ルまでは同一挙動をとるか又は一方のみを使用すると仮定している。図示するよ うに、加熱リングは時刻Ｔ₀で特定温度で始動する。この温度は最後の増幅反応 の終了時から維持された温度以下の任意の値で ある。図示例では、加熱リングはＴ₀でほぼ室温である。Ｔ₀後に熱制御プログラ ム２００は、加熱リングを第１の「設定」温度にするようにＰＣＢ１２０に指示 し、該温度はこの場合には「変性温度」であり、サンプル及び／又は任意のプロ ーブ又はプライマー試薬中の核酸を変性させるために選択された値である。変性 温度は典型的には約８０〜１００℃であり、例示値は９５℃である。すぐに設定 温度に達することはできないので、温度は時間Ｔ₀→Ｔ₁の間に設定温度まで漸増 即ち上昇する（傾く）。フィードバックサーミスタを介してプログラム２００は 加熱リングが選択された設定温度に到達した時刻を感知し、この温度をＴ₁→Ｔ₂ の所定時間（「変性時間」）維持し、サンプルＤＮＡ及び存在する場合には試薬 プローブ又はプライマーを変性させる。 変性時間（Ｔ₂）が終了するとプログラムは設定温度を「低サイクリング温度 」に再設定 し、加熱リングは時間Ｔ₂→Ｔ₃の間にこの新しい設定温度まで下降し、新しい設 定温度は「低サイクリング時間」の間維持される。好ましくは、加熱リングの冷 却を助長するようにファン１９をオンにして下降勾配時間（例えばＴ₂→Ｔ₃及び Ｔ₆→Ｔ₇）を最小にする。これらのパラメータの値は、被疑標的又は標的から形 成されたアンプリコンにプライマー又はプローブを再アニールする温度及び時間 を提供するように選択される。アニール温度は当業者に公知のようにプローブ長 とグアノシン及びサイトシン残基の含量に依存し、典型的にはプローブ又はプラ イマーの予測Ｔ_mよりも数度低い値に設定される。典型的なプローブ及びプライ マー長では低サイクリング温度は約４５〜７０℃であり得、例示値は６０℃に設 定する。この時間を図１０ではＴ₃→Ｔ₄に示す。 次に、プログラムは設定温度を再設定し、 図１０でＴ₄→Ｔ₅及びＴ₅→Ｔ₆に示すように「高サイクリング温度」まで上昇し 、この温度を「高サイクリング時間」にわたって維持する。高サイクリング温度 及び高サイクリング時間の値は標的又はアンプリコンからのプローブ又はプライ マーを再び変性させるように選択される。一般に、高サイクリング温度はサンプ ル変性温度よりも僅かに低いが、アンプリコンのＴ_mよりも高くなければならな い。約７０〜９５℃の値が一般的であり、例示値は８０℃である。 高サイクル時間が経過後、プログラムは設定温度を「低サイクリング温度」に 再設定し、加熱リングはＴ₇まで下降し、プロセスが繰り返される。各サイクル は図１０に示すように高温と低温から構成される。「合計サイクル数」はサイク ル数を制御する値をもつパラメータである。サイクル数は実施するアッセイによ って大幅に変動する。ＰＣＲ及びＬＣＲ では１０〜７０サイクル、一般に２５〜５０サイクルが妥当である。 合計サイクル数に達した後、プログラムは過熱相に移り、図５Ａ〜５Ｅに関し て上述したように反応サンプル３８を反応チャンバー３０から検出チャンバー３ ２へ移送する。２段システムでは、これは一般に上述の理由で下段をまず最初に 過熱し、次に上段を過熱することにより行われる。場合によっては、図１０に示 すように上段よりも高い温度まで下段を過熱する。下段ブロック過熱温度及び上 段ブロック過熱温度はこれらの過熱段階の間、その値を維持するパラメータであ る。上述のように、これらの値は推進剤を膨張させ、反応サンプルを検出チャン バーに圧入するように選択される。この温度は一般には変性温度以上であるが、 反応チャンバー内の低部（即ち下段の内側）に推進剤を配置し、２段を連動しな いようにすれば推進剤を変性温度から 保護できるので変性温度以上にする必要がない。分かりやすくするために、水性 反応サンプルを推進剤として使用し、過熱温度は一般に約９０〜１２０℃である 。 ２段システムで「過熱先導時間」は上段加熱リング９０をその過熱温度にする 前に下段加熱リング９２をその過熱温度にする選択時間である。過熱先導時間は 図１０ではＴ_s→Ｔ_uに示す。上記例示値は１５秒である。先導時間の値及び過熱 上昇の勾配の傾きに依存して時間（Ｔ_s→Ｔ_u）は勾配時間（Ｔ_s→Ｔ_p）より長く ても等しくても短くてもよく、換言するならばＴ_uとＴ_pの相対位置は図と逆でも よい。「総過熱時間」は、上段（単段を使用する場合には単段）がその設定温度 （例えば上段ブロック過熱温度）に到達する時刻から開始する過熱段階の時間値 に相当する。この時間は図１０ではＴ_e→Ｔ_rに示し、十分な容量の反応サンプル を検出チャンバーに移送す るために十分な長さであればよい。これは当然サンプル容量及び検出手段に依存 するが、簡単な実験によって容易に決定可能である。例示値は３０秒である。但 し、全例示時間及び時間範囲は本明細書中で使用する特定態様に適用されるもの であり、当業者は他の範囲も容易に使用できることに留意されたい。 「連動」パラメータは、２段加熱エレメントの場合に上段及び下段加熱リング ９０，９２の両者が変性プロトコルとサイクリングプロトコルに関与するか否か を判定する。連動パラメータがオンの場合には、両方の加熱リング９０，９２が 変性プロトコルとサイクリングプロトコルに関与している。連動パラメータがオ フの場合には、加熱リング９０，９２の一方のみが変性プロトコルとサイクリン グプロトコルに関与している。 「反応終了時の遮断温度」はプログラム２００が試験プロトコルの終了時に加 熱リング ９０，９２を冷却するファンモーターをオフにする設定温度であり、図１０では Ｔ_hにより示す。 「画像遅延時間」は単に検出手順を開始する前に指定時間待機するようにコン ピュータに指示する。この時間は検出チャンバー内で信号を完全に発生できるよ うにするために十分な長さとすべきであり、使用する信号及び検出手段の種類に 依存して約１〜１０分間以上であり得る。 第１の低サイクル温度の前に高サイクル温度を使用する増幅プロトコルを選択 してもよいことが理解されよう。この場合には、低温まで下降し続ける前に選択 されたプロトコルによって決定される時間にわたって高サイクリング温度のプラ トーを含むように時間Ｔ₂→Ｔ₃を単に拡張する。 図１０は更に、変性及びサイクル／過熱ルーチンのプログラム状態を示す。こ れらの状 態をソフトウェアに関連して以下に説明する。 再び図９Ａに戻ると、プロトコルファイルを選択した（ブロック２１４，２１ ６及び２１８）後にプログラム２００はブロック２２０及び２２２でモニター１ １３スクリーン上にヘルプテキストと現状プロトコルパラメータを表示する。ブ ロック２２０はヘルプ情報を提供し、オペレータがプログラム２００を続行する ためにどのステップをとるべきかを決定するのを助ける。ブロック２２２のスク リーン見出しは更に、所望の結果を得るためのキーストローク入力に関するプロ ンプトを提供する。 プログラム２００はブロック２２４でサーミスタルックアップテーブルを初期 化する。サーミスタ１２２，１２３の抵抗は温度と共に変化するが、これらの温 度変化は非直線的である。従って、サーミスタ１２２，１２３のいずれかから読 取値が発生される毎にプロ グラム２００が温度を再計算する必要がないようにルックアップテーブルを提供 する。Ｉ／Ｏカード１１８はブロック２２６で初期化される。これは、プリアン プ段階での利得設定や単極（０Ｖ〜１０Ｖ）又は双極（−５Ｖ〜＋５Ｖ）信号レ ンジの使用などのようにＩ／Ｏカード１１８で使用される種々の値を設定する。 ブロック２２８でプロトコルパラメータは初期化され、Ｉ／Ｏカード１１８は温 度をディジタルに変換するように準備される。ブロック２３０でプログラム２０ ０は編集セクション２０４に移る。 プログラム２００の編集セクション２０４を図９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄに示す。一 般に、編集セクション２０４によってオペレータは初期化セクション２０２のブ ロック２１６及び２１８で選択したプロトコルパラメータの一部又は全部を変更 できる。編集セクション２０４はブロック２３６でキーボード２０４を クリアし、これはキー＝０を設定することに等しく、ブロック２３８で現在のプ ロトコルパラメータを表示する。プログラム２００は加熱リング９０，９２の現 在の温度の連続表示を提供する。これは、上段及び下段加熱リング９０，９２か らのアナログ入力を読取り、これらの入力をサーミスタルックアップテーブルで 温度値に変換し、モニター１１３に温度を表示することによりブロック２４０及 び２４２で行われる。ブロック２４４でプログラム２００は更に、プロトコルパ ラメータを編集するためのプロンプトをオペレータに提供するパラメータ編集コ マンド指示をモニター１１３上に表示する。 次に編集セクション２０４はブロック２４６でキーボード入力を受取るまで待 つ。ここでオペレータはブロック２５０，２５６，２６０，２６４，２７０，２ ８０，２８４，２８８，２９４及び２９８に示すキーのいずれ かを押すことによりプロトコルパラメータを編集することができる。ブロック２ ５０に示す「Ｕ」キーを押すとプログラム２５０はブロック２５１に進み、オペ レータは高サイクリング温度と高サイクリング温度の時間を再設定することがで きる。また、ブロック２５６に示す「Ｌ」キーを押すとプログラム２００はブロ ック２５８に進み、オペレータは低サイクリング温度と低サイクリング温度の時 間を再設定することができる。ブロック２６０に示す「Ｃ」キーを押すとプログ ラム２００はブロック２６２に進み、オペレータは最大サイクル数を設定するこ とができる。ブロック２６４に示す「Ｗ」キーを押すとプログラム２００はブロ ック２６６及び２６８に進み、オペレータはコンピュータメモリ内のファイルに 編集済みパラメータプロトコルを保存することができる。ブロック２７０に示す 「Ｆ」キーを押すとプログラム２００はブロ ック２７２に進み、オペレータはファン９４をオンにし、所望により加熱リング ９０，９２の温度を低下させることができる。ブロック２８０に示す「Ｄ」キー を押すとプログラム２００はブロック２８２に進み、オペレータは変性プロトコ ルの変性温度と時間を編集することができる。ブロック２８４に示す「Ｈ」キー を押すとプログラム２００はブロック２８６に進み、オペレータは過熱パラメー タを編集することができる。過熱パラメータは下段加熱リングの過熱温度、上段 加熱リングの過熱ラグタイム、上段加熱リングの過熱温度及び総過熱時間を含む 。ブロック２８８に示す「Ｔ」キーを押すとプログラム２００はブロック２９０ に進み、オペレータは連動パラメータを編集することができる。プログラム２０ ０がブロック２８８でＴキーをポーリング後、ブロック２９２で変性セクション ２０６を開始することを見越してタイマー がセットされる。ブロック２９４に示す「Ｅ」キーを押すとプログラム２００は ブロック２９６に進み、プログラム２００を出る。ブロック２９８に示す「Ｓ」 キーは「状態」、「サイクル数」、「Ｒ時間」及び「キー」を全て０に設定し（ ブロック３００）、プログラム２００をブロック３０４から変性セクション２０ ６に移す。Ｓキーを押さない場合には、プログラム２００は編集セクション２０ ４の始点に戻る。 変性セクション２０６（図９Ｅ、９Ｆ及び９Ｇ）はブロック３１０で開始し、 ブロック３１２で現在のプロトコルパラメータを表示する。ブロック３１４はキ ーボード入力をクリアし、ブロック３１６は変性温度（ＴＥＭＰ．ＤＥＮ）に入 力された値を試験する。変性温度が０に設定されているならば、プログラム２０ ０は変性プロトコルをスキップし、「サイクル数」フラグを１、状態フラグを０ に設定（ブロック３１８）した後、ブロック３２０を介してサイクル／過熱ルー チンに移る。ブロック４２０を介してサイクル／過熱セクション２０８に入ると 、プログラムはブロック４２２でＳＥＴＴＥＭＰ＝ＴＥＭＰＨＩに設定し、状態 フラグを０にしてサイクル／過熱ルーチン２０８に入ることにより高サイクリン グ温度の抽出を開始する。 しかし、上記例示値を使用すると、変性温度は０よりも高い値（９５℃）に設 定される ので、連動情報の獲得、変性温度の設定、ファン９４をオフにするための数種の サブルーチンを含むブロック３２２でプログラム２００は変性温度と変性時間を 初期化する。温度又は時間の「設定」は、温度にＳＥＴＴＥＭＰ、ＳＥＴＴＥＭ Ｐ０又はＳＥＴＴＥＭＰ１、時間にＲＴＩＭＥなどの変数を生成し、上記パラメ ータの１つから選択される値を変数に割り当てることであり、即ち温度変数には ＴＥＭＰ．ＤＥＮ、ＴＥＭＰＬＯ、ＴＥＭＰＨＩ、ＴＥＭＰＳＵＰＥＲ及びＴＥ ＭＰＳＵＰＥＲ２を割り当て、時間変数にはＴＩＭＥ．ＤＥＮ、ＴＩＭＥＬＯ、 ＴＩＭＥＨＩ、ＴＩＭＥＬＥＡＤ及びＴＩＭＥＳＵＰＥＲを割り当てる。従って 、ブロック３２２でＳＥＴＴＥＭＰ変数は変性温度のプロトコルに記憶された値 をとる。 ブロック３１１，３２４及び３２６は、変性セクション２０６がオペレータか らのパラ メータ編集入力のためのキーボード１１４を引き続きをポーリングすることを示 す。キーボード入力が受取られると、プログラム２００は編集セクション２０４ に移り、オペレータは現在のプロトコルパラメータの任意のものを編集すること ができる。プログラム２００はブロック３２８及び３３０で温度表示を更新する 。 ブロック３３２でプログラム２００は分岐しねプログラム状態フラグ、キーフ ラグ及びＲ時間の値に依存して温度又は時間のいずれかをポーリングする。Ｒ時 間（及び他の変数）はブロック３００で０に設定したので、プログラムはこの最 初のループ循環では温度をポーリングし、ブロック３３６に移る。ここでプログ ラム２００はＴＲＡＣＫ変数を試験し、２段システムの両方のブロックを平行に サイクリングすべきか否かを判定する。ＴＲＡＣＫ＝オンの場合にはブロック３ ３８はプ ログラムをブロック３５６に送り、両方のブロックを試験する。ＴＲＡＣＫ＝オ フの場合には、ブロック３４０はプログラムに一方のブロック（この例では上段 ブロック）のみを試験させる。以下の説明では、ＴＲＡＣＫ＝オフであると仮定 するが、当業者はフローチャートのセクションによっては鏡面様性質の場合もあ ることを容易に理解しよう。当然のことながら、単一加熱エレメントシステムで は、ＴＲＡＣＫ変数は不要であり、ただ１個のブロックのみを試験する。以下の 説明は、上段ブロックのみを変性及びサイクリングに使用する２ブロックシステ ムに関するが、このようなシステムは単なる１態様であることが理解されよう。 変性セクション２０６では、プログラム状態フラグは０〜３の４つの値をとる ことができる。一般に、プログラム状態フラグが０のとき（ブロック３４４参照 ）にはプログラム ２００は加熱リングを変性温度にするようにＰＣＢ１２０に指示しており、プロ グラム２００は（ブロック３３２で）Ｉ／Ｏカード１１８上のＡ／Ｄ変換器１４ ２，１４４をポーリングし、上段加熱リングが変性温度に到達した時刻を判定す る（ブロック３４６参照）。上段加熱リングが変性温度にまだ達していない場合 には、プログラム２００はブロック３５０，３７２及び３８２を通り、ブロック ３１１で始点の近くの主変性ループに戻る。ここからプログラムはブロック３４ ６に戻り、上段加熱リングが変性温度（９５℃）に達したか否かを再び問合せる 。 プログラム２００は上段加熱リング９０が変性温度に達するまでこのループを 続行する。今はブロック３４６の答えがイエスであり、プログラム２００はブロ ック３４８でキーフラグを１に設定する。加熱リング９０，９２が変性温度に達 すると、キーフラグはブロ ック３４８で１に設定され、プログラム状態フラグはブロック３７４で１に増分 される。更に、変数Ｒ時間はブロック３７８でパラメータＴＩＭＥ．ＤＥＮ（変 性時間）の値をとるように設定され、ブロック３８０でタイマーが始動され、プ ログラムは主変性ループに戻る（ブロック３８２及び３１１）。 Ｒ時間はここでは所定の値（例示値は１２０秒）をとるので、プログラムはブ ロック３３２でブロック３９６の「時間チェック」サブルーチンに分岐し、Ｒ時 間が時間切れしたか否かを問合せる。特定機能に設定された時間（この場合は１ ２０秒、変性時間）が経過すると、Ｒ時間は「時間切れ（タイムアウト）する」 。この問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムは変性セクション２ ０６の始点を通って帰還し、ブロック３３２及び３３４を介してブロック３９８ の時間切れ問合せに戻る。時間切れ問合せに対する答 えがイエスであるならば、プログラム２００はブロック４００でプログラム状態 フラグを（ここでは２に）増分し、ブロック４０２でキー及びＲ時間をリセット する。次にプログラム２００はＳＥＴＴＥＭＰ変数をパラメータ値ＴＥＭＰＬＯ に等しくなるように再設定し（ブロック４０６）、ファンをオンにし（ブロック ４０８）、加熱ブロック９０を低サイクリング温度まで下降させる。 プログラム状態フラグを２、Ｒ時間を０にリセットして主変性ループに戻ると （ブロック３１１）、プログラム２００は分岐し、ブロック３３６，３４０，３ ４２及び３４４を通ってブロック３５０に至り、ブロック３５２で上段加熱ブロ ック９０を再びポーリングし、ＳＥＴＴＥＭＰ（ここでは低サイクリング温度） に達したか否かを判定する。上段加熱ブロック９０がその設定温度（例示値は６ ０℃）にまだ達していない場合には、プログ ラム２００はブロック３７２，３８２，３１１，３３２，３３６，３４０，３４ ２，３４４及び３５０を通ってブロック３５２に帰還する。低サイクリングＳＥ ＴＴＥＭＰに達すると、プログラムはキーを１、状態フラグを３に増分し（ブロ ック３４８及び３７４）、ファンをオフにする（ブロック３９０）。次に、プロ グラムはキーを１、状態フラグを２に再設定してからサイクル／過熱セクション ２０８の主ループに入る（ブロック３９２及び３９４）。変性ルーチン後にサイ クル／過熱ルーチン２０８に入る場合にはサイクル／過熱ルーチンは低サイクリ ング温度で開始し、変性をスキップした場合にはプログラムは高サイクリング温 度でサイクル／過熱ルーチンに入ることを理解されたい（上記ブロック３１８， ３２０，４２０及び４２２参照）。 本例では、サイクル／過熱セクション２０８（図９Ｈ〜９Ｋ）はブロック４２ １で開始 し、ＳＥＴＴＥＭＰは既に初期化されている。変性セクション２０６の場合と同 様に、サイクル／過熱セクション２０８もパラメータ編集入力のためのキーボー ド１１４を引き続きポーリングし、適当な入力をキーボード１１４から受け取る とプログラム２００を編集セクション２０４に戻す。加熱ブロック９０，９２の 各々の現在の温度はブロック４２８及び４３０でＩ／Ｏカード１１８に供給され 、表示される。 ブロック４３２でプログラム２００はＲ時間の値に応じて時間又は温度をチェ ックすべきかを問合せる。ここではＲ時間が０である（ブロック４０２で最後に リセットされている）ので、プログラムはブロック４３６に分岐し、加熱ブロッ クの温度をチェックする。連動がオフなので、ブロック４３６の問合せに続き、 ブロック４３８の状態問合せ、次いでブロック４６２の状態問合せに進む。サイ クル／過熱セクション２０８でプログラム状態フラグは０〜１０の１１個の値を とり得るが、変性セクションを離れると２に設定され（ブロック３９２）、こう してプログラムはブロック４６４で上段加熱ブロックが６０℃の低サイクリング 温度に達したか否かを問合せる。変性セクション２０６の終点でこの温度に達し たので、（達していないとしてもブロック３９２でキー＝１にセットするので） この時点でキー＝１となる。次にプログラム２００はブロック４７６，４７８， ４８４及び４９０を通ってブロック４９６の問合せに至り、この時点「イエス」 であるのでプログラムは「状態変更」サブルーチンに入る。 このプログラム２００ではプログラム状態が０又は偶数のときに加熱ブロック は新しい設定温度まで上昇又は下降しており、プログラムはサーミスタ１２２， １２３から供給される温度情報についてＩ／Ｏカード１１８上 のＡ／Ｄ変換器１４２，１４４をポーリングすることが一般に認められる。逆に プログラム状態が奇数であるときには、設定温度に達しているのでプログラムは ヒーターブロックが適当な時間にわたって設定温度を維持しているか否かを判定 できるようにタイマーをポーリングする。これは図１０からも明らかである。 ブロック５１０の状態変更サブルーチンでは、プログラム状態フラグはブロッ ク５１２で（３まで）増分される。ブロック５１４の答えがノーで且つブロック ５１８の答えがイエスであるので、プログラム２００はブロック５２０でＴＩＭ ＥＬＯ（本例では６０秒の低サイクリング時間）の値をとるようにＲ時間を再設 定する。プログラムは更に、ブロック５２２でファンをオフにし、ブロック５３ ６でタイマーを始動させた後、ブロック４２１でサイクル／過熱セクション２０ ８の始点 に戻る。 プログラム２００はサイクル／過熱セクションの始点を通ってブロック４３２ に移る。Ｒ時間はここでは所定の値（６０秒）をとるので、プログラムはブロッ ク４３２から分岐し、ブロック５５０で開始する時間チェックサブルーチンに至 る。Ｒ時間がまだ経過していない場合には、プログラムはＲ時間の６０秒が時間 切れになるまで主ループに戻る。Ｒ時間が時間切れしている場合には、ブロック ５５２の問合せに対する答えはイエスであり、従ってプログラム２００はブロッ ク５５５で状態フラグを４に増分し、Ｒ時間及びキーを０にリセットした後、ブ ロック５５６を介してブロック５６２に入る。 プログラムが状態４及びブロック５６２に到達すると、サイクル数フラグはブ ロック５６４で増分される（サイクル数＝０に設定した本例ではブロック３９２ 及び３９４を介し てサイクル／過熱ループ２０８に入ったので１に増分される）。次にプログラム は「サイクル数」フラグについて問合せる。サイクル数フラグがプロトコルパラ メータＣＹＣＬＥＭＡＸとして記憶された最大サイクル数をまだ超えていない場 合には、プログラム２００はプログラム状態フラグを０にリセットし、変数ＳＥ ＴＴＥＭＰを高サイクル温度パラメータの値に設定し、次のサイクルを開始する ために加熱エレメントをオンにし（ブロック５６８及び５８６）、次いでブロッ ク４２１で主ループに戻る。本例では、ＣＹＣＬＥＭＡＸは８であり、ＴＥＭＰ ＨＩは８０℃である。従って、プログラムはＳＥＴＴＥＭＰ＝８０でブロック４ ２１に戻る。 今度は主ループを通ってプログラムはブロック４２４，４２８及び４３０を通 り、ブロック４３２のＲ時間試験に達する。Ｒ時間はブロック５５５で０にリセ ットされたので、 プログラムはブロック４３６に分岐し、加熱ブロックの温度をチェックする。連 動がオフなので、ブロック４３６の問合せ後にブロック４３８の状態問合せに進 み、ここではその答えはイエスである。従ってプログラムはブロック４４０に移 り、加熱ブロックが新しい設定温度に到達したか否かを判定する。到達していな いならば、プログラムはブロック４４４，４６０，４６２，４７６，４７８，４ ８４，４９０及び４９６を通って主ループに戻り、ヒーターブロック温度のポー リングを続行する。加熱ブロックが設定温度に達すると、ブロック４４０の答え はブロック４４２でキーフラグを１に増分する。ブロック４４４，４６０，４６ ２，４７６，４７８，４８４及び４９０を通ってブロック４９６に至り、キー＝ １であるのでプログラムは「状態変更」サブルーチンに分岐する。 ブロック５１０の状態変更サブルーチンで は、プログラム状態フラグはブロック５１２で（１まで）増分され、ブロック５ １４の答えはイエスなので、プログラム２００はブロック５１６でＴＴＭＥＨＩ の値（本例では６０秒の高サイクリング時間）をとるようにＲ時間を再設定する 。プログラムは更に、ブロック５３６でタイマーを始動した後、ブロック４２１ でサイクル／過熱セクション２０８の始点に戻る。プログラム２００はサイクル ／過熱セクション２０８の始点を通ってブロック４３２に移る。Ｒ時間はここで は所定の値（６０秒）をとるので、プログラムはブロック４３２から分岐し、ブ ロック５５０で開始する時間チェックサブルーチンに移る。Ｒ時間が経過してい ない場合には、プログラムはＲ時間の６０秒が時間切れするまで主ループに戻る （ブロック５５４）。Ｒ時間が時間切れすると、ブロック５５２の問合せに対す る答えはイエスになるので、プログラム２０ ０はブロック５５５で状態フラグを２まで増分し、Ｒ時間及びキーを０にリセッ トした後、ブロック５５６に移る。 ブロック５５６では答えがイエスであるので、プログラムはブロック５５８で 変数ＳＥＴＴＥＭＰを低サイクル温度パラメータ（ＴＥＭＰＬＯ）の値に再設定 し、ブロック５６０で加熱ブロックを冷却するようにファンをオンにした後、ブ ロック４２１で主ループに戻る。 再び主ループに戻り、プログラムはブロック４３２に達し、Ｒ時間は０である ので温度をポーリングするように決定する（ブロック４６４）。これは所望の（ ＴＥＭＰＬＯ）温度に達するまで続き、この温度に達すると、ブロック４６６で キーは１に設定される。こうしてプログラムは「状態変更」サブルーチン（ブロ ック５１０）に戻り、状態フラグは（３まで）増分され、Ｒ時間は加熱ブロック を所望時間にわたってＴＥＭＰＬＯに維持するようにＴＩＭＥＬＯに再設定され る。こうしてプログラムはブロック４３２で時間チェックサブルーチン（ブロッ ク５５０）に分岐し、タイマーをポーリングする。上記と同様に、Ｒ時間が時間 切れすると、状態フラグはブロック５５５で（４まで）増分され、Ｒ時間とキー は０にリセットされ、サイクル数フラグは再び評価される。プログラム２００は ＣＹＣＬＥＭＡＸに達するまで（例えばブロック５６４でサイクル数フラグが９ まで増分されるまで）プログラム状態０，１，２及び３を使用して上述のような サイクルを実行し続ける。 サイクル数フラグが最大サイクル数を越えると（ブロック５６６）、プログラ ム２００はブロック５７０でＴＥＭＰＳＵＰＥＲの値を試験する。この値が０な らば、過熱部分をスキップし、ブロック５７４でプログラム状 態フラグを８に設定する。図示例では、ＴＥＭＰＳＵＰＥＲの値は１１０℃であ り、ブロック５７２で変数ＳＥＴＴＥＭＰ１を１１０℃に設定することにより下 段リング過熱プロセスを開始した後、４２１で主ループに戻る。ＳＥＴＴＥＭＰ １は下段ブロック単独の設定温度に値をとる変数であり、ＳＥＴＴＥＭＰは連動 がオンである場合に上段ブロック又は両方のブロックに適用した。 主ループでは、Ｒ時間が０であるので、プログラムはブロック４３２でもう一 度温度をポーリングし、４３８及び４６２の問合せをスキップし、４７８の問合 せにイエスで回答する。プログラムはここで、連動がオフだったならば下段加熱 ブロックが上段ブロックよりも低温であり、下段ブロックが上段ブロックの温度 に達するまで状態４が維持されると仮定する。ブロック４８０の問合せの答えが イエスの場合には、キーフラグは１に設定さ れ、ブロック４９６，５００及び５１０を介して状態変更が行われる。こうして 状態フラグを（５まで）増分し、ブロック５２６でＴＩＭＥＬＥＡＤ値を変数Ｒ 時間にロードし、ブロック５３６でタイマーを再始動した後、主ループに戻る。 ＴＩＭＥＬＥＡＤ値は下段加熱ブロック９２の過熱から上段加熱ブロック９０の 過熱が始まるまでの時間である。この例示値は１５秒間であり、図１０にはＴ_s 〜Ｔ_uの間の時間により示す。 主ループはこうしてブロック４３２で時間チェックサブルーチンに分岐し、Ｒ 時間（＝ＴＩＭＥＬＥＡＤ）が時間切れする時刻を判定した後、プログラム２０ ０は状態フラグを（６まで）増分する。状態フラグ＝６のとき、プログラムはブ ロック５７６で分岐し、ブロック５７８でＴＥＭＰＳＵＰＥＲ２の値を変数ＳＥ ＴＴＥＭＰ０にロードし、上段ブロックの過熱を可能にする。ＳＥＴＴＥＭＰ０ は（連動がオンのときのように）下段ブロック又は両方のブロックと区別して上 段ブロック単独の設定温度の値をとる変数である。主ループに戻ると、プログラ ムはブロック４３２で分岐して温度をポーリングし、ブロック４８４及び４８６ に達し、上段ブロックがその設定温度（ＴＥＭＰＳＵＰＥＲ２）に達しているか 否かを試験する。達している場合にはキーフラグはブロック４８８で１に変更さ れ、プログラム２００はブロック５１０で状態変更サブルーチンに移る。こうし て再びプログラム状態を（７まで）増分し、ブロック５２８を通り、ブロック５ ３０で変数Ｒ時間をＴＥＭＰＳＵＰＥＲの値にし、ブロック５３６でタイムを再 始動する。本例ではＴＥＭＰＳＵＰＥＲは３０秒であり、上段ブロックが過熱温 度に維持される時間に相当する。主ループでブロック４３２は時間チェックサブ ルーチンに分岐し、Ｒ時間（＝ＴＥＭＰＳＵ ＰＥＲ）が時間切れする時刻を判定する。時間切れすると、プログラム２００は 状態フラグを（８まで）増分し、キーフラグ及びＲ時間をリセットし、ブロック ５８０に移り、プログラムはブロック５８２で上段及び下段加熱リングへの温度 出力をオフにする。冷却に備えて、ブロック５８４でプログラムはファンをオン にし、両方の加熱ブロックのＳＥＴＴＥＭＰ変数をＳＨＵＴＯＦＦの値に再設定 する。この値は本例では５０℃であり、ファンが加熱ブロックを室温よりも低温 に冷却しようとして絶えず運転しないように選択される。 プログラム状態が８でＲ時間が０にリセットされて主ループに戻ると、プログ ラムはブロック４３２で分岐し、温度をポーリングする。ブロック４９０の答え はイエスであるので、ブロック４９２でプログラムは上段ブロックの温度をポー リングし、５０℃の設定温 度まで冷却しているか否かを判定する。冷却している場合には、ブロック４９４ でキーフラグは１に設定され、ブロック４９６，５００，５１０及び５１２を介 して状態９への状態変更が行われる。ブロック５３２でプログラムは分岐し、フ ァンをオフにし（ブロック５３４）、ＴＩＭＥＩＭＡＧＥの値を変数Ｒ時間にロ ード（ブロック５３５）した後、タイマーを始動し（ブロック５３６）、主ルー プに戻る。上述のように、ＴＩＭＥＩＭＡＧＥパラメータは、ユニットが検出プ ロセスを開始する前に信号の発生を完了できるように選択される。主ループでブ ロック４３２は時間チェックサブルーチンに分岐し、時間切れ後、状態フラグを （１０まで）増分し、プログラムはブロック５８１及び５８３を介して図１１Ａ 〜１１Ｄに関して後述する検出手順を開始する。 ７．ビデオ処理 先の項に記載した検出システム２２は、図１１Ａ〜１１Ｄに示す検出プログラ ム６００などのビデオ処理プログラムを利用する。コンピュータ制御プログラム がプログラム状態＝１０に達すると、制御が検出プログラム６００に送られる。 一般に、検出プログラムはディジタルビデオ分析技術を使用して検出システム２ ２のカメラ１００により発生される検出手段６０（例えばストリップ６１）のビ デオ画像を分析する。好ましくは、ビデオ処理プログラムは下記のように増幅反 応全体の精度と信頼性を改善するために、複製物捕獲部位から獲得されるディジ タルデータを使用する。しかしながら、まず説明で使用する用語を定義するのが 重要である。各検出手段６０は図２Ａ、２Ｇ及び５Ａ〜５Ｄに示すように少なく とも１個の読取ゾーン６８を含む。図２Ａ及び５のデバイスの読取ゾーン６８を 図１２Ａ及び１２Ｂに拡大して示す。検出手 段６０は好ましくは参照バー及び／又は対照ゾーン７０も含む。 上述のように、各読取ゾーン６８は好ましくはアッセイを多重化する目的で多 重捕獲部位７４を含む。多重化とは、同時に２個以上の分析物のアッセイを実施 することを意味し、例えばクラミジア属の生物と淋菌生物の両者を試験したり、 遺伝子中の多重部位又は多重遺伝子における遺伝的突然変異を試験することであ る。多重化は、陽性及び／又は陰性対照試薬と共に１種の分析物を同時にアッセ イすることも意味し得る。これらの多重捕獲部位７４は図２Ａ及び１２Ａには連 続バンド又は線として示し、図５及び１２Ｂには「スポット」の対角線アレーと して示す。上述の通り、多重捕獲部位は図２Ｇに示すような不連続バンド又は線 でもよい。 これらの多重捕獲部位７４は複製物部位７２又は複製物ゾーンとして以下に記 載する部 位から区別しなければならない。好ましくは、各個捕獲部位７４の面積は本明細 書中に複製物部位又は複製物ゾーンと呼ぶ数個の「読取ウィンド」を含むのに十 分な広さである。これは図１２Ａには最上段捕獲部位７４上の四角で囲んだ面積 として示し、図１２Ｂにはスポット７４上の多重走査線として示す。図２Ｇでは 、不連続バンドは天然複製物ゾーンを形成するが、連続バンドは読取ソフトウェ アによって複製物ゾーンを故意に形成する（図１２Ａの四角７２）。捕獲部位７ ４の各複製物部位又はゾーンは同一分析物に複数の「複製物」アッセイが実施さ れているかのように同一分析物の付加的データを含むことを理解されたい。複製 物部位が複数であるため、統計的「外れ値」を廃棄することができ、信頼性レベ ルを増し、捕獲部位の画像が正確且つ忠実に評価される。 本発明のビデオ処理構成について説明する と、コンピュータ２６とビデオ処理プログラムは担体６１に固定された増幅標的 核酸の存在を検出する。一般に、カメラ１００は、通常は図８に示す構成の１つ に従って担体６１の画像を検出する。次いでカメラ１００はコンピュータ２６の フレームグラバーカード１１６にビデオ信号を出力する。フレームグラバーカー ド１１６はビデオフレームをディジタル化し、ディジタル値をＲＡＭ１２４に記 憶する。こうして、ディジタル値をコンピュータ２６にアクセス可能にし、ビデ オ処理プログラム６００によって操作することができる。コンピュータ２６は５ １２×４８４画素の解像度をもつ８ビットグレースケールを使用する。０が黒色 画像を表し、２５５が白色画像を表すように各画素に数値を割り当てる。０〜２ ５５の値は各々特定のグレー色相を表す。ビデオ信号のディジタル化表現はオペ レータに見えるようにコンピュータモニター １１３上に表示され得る。 ビデオ処理プログラム６００は図１１Ａ〜１１Ｄのフローチャートにより示す 。フローチャートは慣用記号を使用し、ビデオ処理プログラム６００によって実 施される主機能を表す。ビデオ処理プログラム６００は２つの主セクション又は ループをもつ。第１のセクションはブロック６０６で開始する「読取」セクショ ンであり、第２のセクションはブロック６３４で開始する「アッセイ」セクショ ンであり、読取セクション６０６のサブルーチンである。読取セクションは各反 応／検出ユニット２０毎に１回実行し、アッセイセクションは各ユニット２０の 検出手段６０から画像形成された各捕獲部位７４毎に１回実行する。 プログラム６００はブロック６０２で開始し、ブロック６０４で位置カウンタ を初期化する。位置カウンタは特定バッチにおける反 応及び検出ユニットの数を記録する。開示の２段環状リング態様では、加熱リン グ９０，９２は反応／検出ユニット２０を収容する４０個のウェル９７を含む。 ブロック６０８はモーター１０８又は１０９を次のサンプル読取位置まで前進さ せる。検出手段６０の画像をカメラレンズ１０２に反射するためにミラー１０６ を使用する検出システム２２では、モーター１０８は各検出手段６０の連続画像 をカメラ１００に送るためにミラーも回転させる。 反応／検出ユニット２０は好ましくは、反応サンプル３８とユニット２０を識 別し、この反応／検出ユニットに実施すべきアッセイに関する情報を含むバーコ ード（図示せず）を備える。バーコードは好ましくは、対照ゾーン７０、捕獲部 位７４及び複製物ゾーン７２の存在、位置及び形状（例えばバンド又はスポット ）に関する情報など検出手段６０の 構成に関する情報をコンピュータ２６に提供する。好ましくは、このような構成 の数は制限され、構成情報はコンピュータのメモリに記憶され、コンピュータは 特定構成に関連するバーコード信号を受け取ると、情報を検索できる。あるいは 、ただ１個の構成を使用する場合には、単一参照バーで画像分析用参照フレーム を提供し得る。 従って、サイクラー１６及び／又はコンピュータ２６はバーコードを読取るた めのコードリーダー（図示せず）を備える。プログラム６００はブロック６１０ でバーコード情報を読取り、バーコードの読取に成功したか否かをブロック６１ ２で判定する。読取が不成功の場合には、プログラム６００はブロック６１４で バーコードがこのユニットで読取られなかったことを指示する。捕獲部位の位置 及び数を特定するためにバーコード情報を必要とするシステムでは、コンピュー タはバー コードの読取が不成功の場合に特定ユニット２０をどのように処理するかわから ないので、結果を報告することができず、プログラム２００はブロック６１６に 移り、プログラム６００はブロック６７８のサンプル終了ルーチンに移る。読取 に成功した場合には、プログラム６００はブロック６１８に移り、ディジタル化 画像の獲得及び試験に備えてゾーン構成情報を処理する。 ビデオ画像がカメラ１００からフレームグラバーカード１１６に供給されると 、画像はブロック６２０でディジタル化され、ブロック６２２で対照ゾーン７０ を走査される。対照ゾーンは典型的には任意の反応サンプルに対して通常は陽性 である規定ゾーンである。対照ゾーンは一般に２つの機能を果たす。第１に、増 幅反応と検出チャンバーへのサンプルの移送が適正に行われたことをオペレータ に指示する。第２に、バーコード化構成情報 により規定されるような捕獲部位の位置を決定するための参照点を提供する。ブ ロック６２４でプログラムは対照ゾーンが検出されたか否かを問合せる。ブロッ ク６２４の問合せに対する答えがノーであるならば、プログラムは現在のサンプ ルのエラーコードを指示し、ブロック６１６に進み、プログラム６００はブロッ ク６７８のサンプル終了ルーチンに進む。ブロック６２４の問合せに対する答え がイエスであるならば、プログラム６００はブロック６２８に進み、プログラム ６００はブロック６３０のアッセイ読取ルーチンに送られる。 アッセイ読取ルーチンはブロック６３２に移り、ユニットバーコード又は他の 入力により提供されるゾーン構成情報を用いて、処理する最初の分析物ゾーンを 選択する。各分析物ゾーンは各走査線中に複数の画素をもつ複数の走査線に分割 される。各画素はブロック ６２０のディジタル化手順中にグレースケール数値を割り当てられている。ブロ ック６３６でプログラム６００は現在の分析物ゾーン中の走査線を試験し、現在 の分析物ゾーン中の各走査線毎に画素平均、標準偏差（ＳＤ）及び範囲値を計算 する。 次にプログラム６００はブロック６３８に移り、現在の分析物ゾーン中の走査 線の任意のものが現在の分析物ゾーン中の他の走査線と統計的に相違するか否か を問合せる。ブロック６３８の問合せに対する答えがノーであるならば、プログ ラムはブロック６４０に移り、現在の分析物ゾーンについて陰性結果を報告する 。次いでプログラム６００はブロック６４０からブロック６４２に移り、プログ ラム６００はブロック６７０の次ゾーンルーチンに送られる。ブロック６３８の 問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラムは現在の分析物ゾーンに 陽性結果を検出し ているのでブロック６４４に移る。 他の走査線と統計的に相違する走査線はシグナル領域を含む筈であり、他の走 査線は含まないことが理解されよう。従って、捕獲部位７４と複製物部位７２の 構成は部位間に所定のスペースを空けなければならないことが理解されよう。こ れは図１２Ａ及び１２Ｂではスペース７５によって示す。バンド構成では、バン ドはバンド間のスペースを数本の走査線で試験できるように十分離間して配置さ れる。スポット構成では、水平走査線を使用する場合には鉛直スペース７５によ って隣接スポットを相互に分離すべきである。このスペース７５が存在せず、全 捕獲部位７４が陽性シグナルを生じた場合には、全走査線がシグナルを含み、統 計的相違は全く存在しない。 ブロック６４４はバックグラウンド正規化手順を開始し、プログラムは現在の 分析物ゾ ーンの各走査線が何らかの信号を含むか又はバックグラウンドのみかを分類する 。プログラム６００は次にバックグラウンドのみとして分類された走査線を用い てブロック６４６で現在の分析物ゾーンのバックグラウンド勾配を設定し、この 勾配を使用して照明及び位置のばらつきを表す。バックグラウンド勾配は当業者 に公知の導関数や行列分析などの種々の公知方法で設定することができる。ブロ ック６４８でプログラムはバックグラウンド勾配情報を用いて信号走査線のバッ クグラウンド調節又は正規化を実施する。バックグラウンド正規化は信号基線を 設定してデータ翻訳を改善するために従来使用されており、同様に減算又は水平 ／鉛直平均減算などの種々の公知方法で実施することができる。プログラムは次 にブロック６４８からブロック６５０に移り、プログラム６００はブロック６５ ２に送られる。 画像処理サブルーチンはブロック６５２で開始する。ブロック６５４でプログ ラムは輪郭強調を使用して成功複製物部位７２におけるシグナル領域７７の外周 を識別する。輪郭強調は特徴抽出に公知のディジタル画像処理法であり、ここで は各複製物部位のシグナル領域の輪郭又は境界を画定するのに利用する。ブロッ ク６５６でプログラムは各複製物部位シグナル領域の外周の内側の全画素の平均 、標準偏差及び範囲値を計算する。分析はここでは複製物部位のシグナル領域に 集中する。 ブロック６５８でプログラムはある複製物部位上のシグナル領域統計の任意の ものが他の複製物部位７２からのシグナル領域統計と有意に相違するか否かを問 合せることにより異常結果の有無を識別する。この問合せに対する答えがノーで あるならば、全複製物部位７２は同一であると判断され、プログラム６ ００はブロック６６０で全複製物部位の内側のシグナル領域の平均画素値を計算 し、現在の分析物ゾーンの結果として記憶する。ブロック６６０からプログラム はブロック６６２に移り、プログラムはブロック６７０の次ゾーンルーチンに送 られる。 ブロック６５８の問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラム６０ ０はブロック６６４に移り、統計的「外れ値」と呼ばれる異常結果を除去する。 異常結果は多数の方法で統計的に定義することができ、平均から著しく離れた結 果を含み、ここで「著しく離れた」とは標準偏差の数又は予め設定した信頼性限 界内の統計的有意値によって決定される。ブロック６６６でプログラムは高信頼 性試験結果を得るために異常部位を廃棄後に十分許容可能な部位が残存するか否 かを判定する。ブロック６６６で上記判定を実施するためには数種の基準の任意 のものを使用する ことができる。例えば、プログラムは識別した複製物部位の一定百分率（例えば 少なくとも５０％）が許容可能であることを要求し得る。許容可能な複製物部位 の数が設定最小値を上回る場合には、プログラムはブロック６６０に進み、許容 可能な複製物部位内のシグナル領域の平均画素値を計算し、この値を現在の分析 物ゾーンの結果として記憶する。許容可能な捕獲部位の数が設定最小値以下の場 合には、プログラムはブロック６６８に進み、現在の分析物ゾーンの不確定結果 フラグを立てる。換言するならば、プログラムはアッセイに関して確実な結末に 達するために走査画像内に十分な信頼性をもつデータを検出することができなか った。プログラムは次にブロック６６８からブロック６６２に移り、プログラム はブロック６７０の次ゾーンサブルーチンに送られる。 プログラムは次にブロック６７２に進み、 現在のゾーンが最後のゾーンであるか否かを問合せる。ブロック６７２の問合せ に対する答えがノーであるならば、プログラムはブロック６７４で次の分析物ゾ ーンを選択した後、ブロック６７６に移り、プログラムはブロック６３４のアッ セイループに戻る。ブロック６７２の問合せに対する答えがイエスであるならば 、現在の反応／検出ユニットの決定が完了し、プログラムはブロック６７８で開 始するサンプル終了サブルーチンに移る。 ブロック６８０でプログラム６００は全サンプル結果を記憶した後、ブロック ６８２で全サンプル結果を表示及び／又は印刷する。あるいは、全データを記憶 してランの終了時に印刷するようにプログラムを構成してもよい。次にブロック ６８４で位置カウンタは増分され、プログラムはブロック６８６で最後の位置が 完了したか否かを問合せる。ブロック６８６の問合せに対する答えがノーである ならば、プログラムはブロック６９０に移り、ブロック６０６の読取ループに戻 る。ブロック６８６の問合せに対する答えがイエスであるならば、プログラムは ブロック６８８で終了する。 本発明のビデオ画像形成態様の使用は好適２段サイクリングエレメントに限定 されず、実際には核酸分析などに限定されないことを理解されたい。それどころ かビデオ画像形成態様は、カメラ手段、好ましくは何らかの形態の電磁照射を用 いてバックグラウンドから区別できるようなシグナルを発生し得る任意のアッセ イ形態（例えばイムノアッセイを含む）で利用できる。 ８．核酸増幅及び検出方法 本発明の別の態様によると、核酸増幅及び検出を実施する方法が提供される。 発明の背景の項に記載したように、種々の核酸増幅法が当業者に公知である。本 発明が意図する増 幅反応の非限定的な例はＰＣＲ、ＬＣＲ、３ＳＲ及びＳＤＡである。本発明では 増幅反応サンプルは一般に標的核酸、増幅を誘導する少なくとも１種の酵素物質 及び緩衝液を含む。本発明が意図する酵素物質の非限定的な例はリガーゼ及びポ リメラーゼ並びにその組み合わせである。反応サンプルは後述するプライマー又 はプローブを含み得る。好ましくは、プライマー又はプローブは反応サンプル中 の標的核酸の量に対してモル過剰量を加える。 当業者に自明の通り、増幅反応の種類に依存して所定の付加的試薬を使用し得 る。例えばＰＣＲ増幅反応では反応サンプルは一般にヌクレオチド三リン酸、ｄ ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰも含む。ＬＣＲ反応サンプルは通常は ＮＡＤを含む。反応サンプル中のこのような全試薬の量は当業者が経験によって 決定し得る。特定増幅反応に用いる 反応サンプルの例については本明細書の実施例４、９及び１１に更に説明する。 増幅すべき目的核酸は標的核酸と呼ばれ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリ ボ核酸（ＲＮＡ）でもよく、その天然又は合成類似体、フラグメント及び／又は 誘導体でもよい。標的核酸は好ましくは天然に存在するウイルス核酸又は原核も しくは真核起源のＤＮＡである。 本明細書中で使用する「プライマー」及び「プローブ」なる用語は一般に、標 的核酸と十分にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを意味する 。「プライマー」なる用語は典型的にはＰＣＲとの関連で使用し、「プローブ」 なる用語は典型的にはＬＣＲとの関連で使用する。「プライマー／プローブ」な る用語は本明細書中ではプライマー及びプローブ配列の両者に一般論を適用でき る場合に使用する。 本発明の方法では、プライマー／プローブは好ましくは標的核酸の種々の部分 に相補的となるように選択される。プライマー／プローブの長さは、非限定的な 例として増幅反応温度、プライマー／プローブの起源、標的核酸の複雑さ及び増 幅反応の種類を含む種々の因子に依存する。好ましくは、核プライマー／プロー ブは所望の特異性をもち且つ反応サンプル中に存在し得るランダム配列とのハイ ブリダイゼーションを避けるために十分な長さとする。より好ましくは、核プラ イマー／プローブは約１５〜約１００塩基を含み、更に好ましくは約１５〜約４ ０塩基を含む。 プライマー／プローブは当業者に公知の方法を使用して化学的に合成すること ができる。好ましくは、プライマー／プローブは当業者に公知のヌクレオチドホ スホラミダイト化学技術及び／又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉ ｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ ｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）又はＭｉｌｌｉ ｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販されている器具を用いて合成される。 プライマー／プローブはハイブリダイゼーションを妨げない検出可能な標識と 直接結合し得る。あるいは、増幅反応で使用する少なくとも１個のプライマー／ プローブに特異結合対メンバーを結合する。好ましくは、増幅反応で使用するプ ライマー対の各プライマー又は１組のプローブの少なくとも２個のプローブに特 異結合対メンバーを結合する。より好ましくは、こうしてプライマー対のプライ マー又はプローブ組の少なくとも２個のプローブに結合した特異結合対メンバー は２個の異なる特異結合対メンバーである。後述するように、検出可能な標識と 結合したリポーター分子と増幅標的を結合するために、プライマー対又はプロー ブ組に結合した第１の特異 結合対メンバーを使用することができる。その後、第２の特異結合対メンバーを 使用して担体６１に固定した捕獲分子に標識増幅標的を結合することができる。 好ましくは、２個の特異結合対メンバーは相互に交差反応せず、標識リポーター 分子又は担体６１に固定した捕獲分子と交差反応しない。 典型的には、特異結合対メンバーは抗体又は相補的ポリヌクレオチド配列など の別の分子と結合することが可能な抗原、ハプテン、化合物又はポリヌクレオチ ドを含む。特異結合対メンバーは更に磁性粒子でもよい。本発明で意図する特異 結合対メンバーの非限定的な例はビオチン、Ｔ３、オリゴヌクレオチド、ポリヌ クレオチド及び薬剤化合物（例えばテオフィリン、ジゴキシン及びサリチレート ）である。このような特異結合対メンバーは当業者に公知であり、市販されてい る。 特異結合対メンバーをプライマー／プロー ブに結合する方法も当業者に公知である。例えば、特異結合対メンバーを共有結 合又は標準βシアノエチルホスホラミダイト化学技術によってプライマー／プロ ーブと結合することができる。Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ Ｙ ｏｒｋ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）もプライマー／プ ローブ標識法について記載し、市販している。使用する方法は例えば特異結合対 メンバーの種類やプライマー／プローブ配列上の結合対メンバーの位置によって 異なる。但し、結合対メンバーは増幅反応で使用する温度サイクリングに耐える ように熱安定手段によって結合すべきである。 増幅反応を実施するためには、反応サンプル３８を反応チャンバー３０に入れ る。反応サンプルの量は一般に少量であるため、微量注射器ピペット（図示せず ）を使用して反応チャンバー３０にサンプル３８を入れるか、 又はチャンバーの底にサンプル３８を集めるようにチャンバーを短時間遠心する と好適であり得る。次に反応チャンバー３０と検出チャンバー３２を係合させて 密封ユニット２０を形成し、ユニット２０を熱サイクリングデバイス１６、好ま しくは図６〜８に示し、本明細書に記載するような熱サイクリングデバイス１６ に入れる。次に、反応サンプル中に存在する標的核酸を増幅するのに十分な温度 条件に反応サンプル３８を暴露する。ＰＣＲやＬＣＲなどの所定の増幅反応では 、反応サンプルを熱サイクリングに暴露する。他方、ＳＤＡや３ＳＲなどの他の 増幅反応は等温条件を使用できる。熱サイクリング条件下で反応サンプルを典型 的には設定時間にわたって一定範囲の温度に暴露する。ＬＣＲでは、通常は２種 の異なる温度で温度サイクリングが行われる。例えば実施例５に記載するように 、反応サンプルを８５℃と５５℃でサイクル する。当業者は増幅反応を完了するために必要な適切な温度、サイクリング時間 及びサイクル数を不当な実験なしに経験によって決定することができる。適当な 温度条件下で反応サンプル中に標的核酸が存在すると、プライマー又はプローブ は増幅反応が進行するにつれて標的核酸とハイブリダイズする。 増幅反応が完了したら、反応サンプルを反応チャンバー３０から検出チャンバ ー３２に移送し、反応サンプル３８を担体６１と接触させる（図５Ａ〜５Ｅ）。 反応サンプル３８を検出チャンバー３２に移送する間、ユニット２０は密封状態 に保たれる。サンプルの移送は蒸気相の形成や、温度上昇によって生じる流体又 は推進剤の膨張などの種々の手段によって行うことができる。 好ましくは、検出チャンバー３２への反応サンプル３８の移送は、反応チャン バー３０の下端で推進剤４０を膨張させて行われる。 好適態様では、推進剤４０の膨張はコンピュータ２６によって下段加熱エレメン ト１８（又は加熱エレメント１７単独）の温度を推進剤の閾値温度よりも上昇さ せることにより生じる。より特定的には、反応チャンバー３０の第２の長手方向 セグメント３５に熱を供給するようにコンピュータ２６から加熱エレメント１７ 又は１８に指令し、こうして推進剤４０を推進剤の閾値温度よりも高温に暴露す る。典型的には、エレメントは＞９５℃、通常は１００℃以上の温度まで過熱さ れる。こうして反応チャンバー３０に供給された熱によって推進剤は膨張し、反 応サンプルは検出チャンバー３２に向かって上昇する。推進剤４０を膨張させる ために必要な温度は推進剤４０の種類及び組成によって異なる。推進剤４０は増 幅反応の過程で推進剤４０が膨張しないように、増幅反応温度よりも高い閾値温 度をもつことが好ましい。 好適態様では、担体６１の１つの領域６６は反応サンプル中の増幅標的に結合 した第１の特異結合対メンバーと結合することが可能な多重複合体分子を含む。 複合体分子は当業者に公知の方法を用いて担体６１に堆積される。例えば、スポ ッティングと乾燥により複合体分子を担体６１に堆積することができる。好まし くは、カゼインなどの準可溶性タンパク質の存在下で複合体分子を担体６１上で 乾燥し、複合体分子の輸送及び再可溶化を助長する。複合体分子は参考資料とし て本明細書の一部とする米国特許第５，１２０，６４３号に記載されている方法 により担体に堆積することもできる。領域６６の複合体分子は担体に固定されず 、反応サンプル及び／又は水性溶媒の存在下で再可溶化することができ、毛細管 移動によって担体に沿って移動する。上記特異結合対メンバーと結合することが 可能な複合体成分の非限定的な例としては、 抗ビオチン抗体、抗テオフィリン抗体、アビジン、炭水化物、レクチン、相補的 オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列、ストレプトアビジン及びプロテ インＡが挙げられる。 こうして担体に堆積された複合体分子を標識と結合する。本明細書中で使用す る「標識」なる用語は、検出可能なシグナルを発生するために使用可能な分子を 意味する。シグナルは視覚的、光学的又は外部光源による励起によって検出でき るべきである。適切な標識は当業者に公知であり、ラテックス、着色ラテックス 粒子及びコロイド金属（例えば金又はセレン）などである。あるいは、標識はフ ルオレセイン、ローダミン、アクリジンオレンジ及びテキサスレッドなどの蛍光 分子でもよい。本発明で使用可能なその他の標識は米国特許第４，１６６，１０ ５号、米国特許第４，４５２，８８６号、米国特許第４，９５ ４，４５２号及び米国特許第５，１２０，６４３号に記載されている。このよう な標識は当業者に一般に公知の方法によりリポーター分子と結合することができ る［例えば米国特許第５，１２０，６４３号、米国特許第４，３１３，７３４号 参照］。 反応サンプルが上記のように修飾した担体６１の第１の領域６６と接触するに つれて、特異結合対メンバーと結合した増幅標的核酸は標識リポーター分子と結 合する。また、担体上のリポーター分子は再可溶化され、反応サンプル中の増幅 標的核酸と共に移動する。上述のように、複合体はストリップ上に存在する必要 はなく、検出可能な標識をプライマー／プローブに直接結合する場合には全く不 要である。 毛細管移動により、反応サンプルは標識増幅標的と共に担体６１の第２の領域 ６８に輸送される。担体６１の第２の領域６８は好ま しくは、増幅標的核酸に結合した第２の特異結合対メンバーと結合することが可 能な複数の捕獲分子（捕獲部位７４）を含む。増幅標的に結合した第２の特異結 合対メンバーが磁性粒子である場合には、捕獲分子は磁性吸引によって増幅標的 を捕獲及び固定できるように選択すべきである。このような全捕獲分子が担体６ １に固定される。捕獲分子を担体６１に固定する方法は当業者に公知であり、吸 着、吸収、共有結合及び米国特許第５，１２０，６４３号に記載されている方法 などを利用できる。担体６１に固定する捕獲分子の量は例えば特異結合対メンバ ーに対する結合親和性によって異なる。好ましくは、担体６１に固定される捕獲 分子の濃度は増幅標的に対してモル過剰である。 好ましくは、複数の捕獲分子を担体６１上の所定位置又はゾーン（捕獲部位７ ４）で担体６１に固定する。捕獲分子は対角線、鉛直 線もしくは水平線構成、円形又は棒状など任意の所望の幾何学的形状又は構成で 固定することができる。増幅反応の結果を適切に検出及び解像できるように、こ のような円又は棒を空間的に分離できることが更に好ましい。 反応サンプルと標識増幅標的が担体６１の第２の領域６８と接触するにつれて 、反応サンプル３８中の標識増幅標的核酸は担体６１上の固定捕獲分子（捕獲部 位７４）と結合し、この位置に固定される。捕獲ハプテンをもたないサンプル成 分は反応サンプル３８の毛細管移動によって第２の領域６８から担体６１の何ら かの付加的ゾーン及び／又は第２の端部６４に除去される。 更に、担体６１は本明細書中で「対照」ゾーン７０と呼ぶ第３の領域も含み得 る。対照ゾーン７０は検出方法に対照又は参照標準を提供するように修飾される 。好ましくは、対照ゾーン７０は担体６１上の所定の位置で検 出可能な標識を捕獲する所定の試薬を含む。担体６１は当然のことながら、別の 分析を実施するための付加的領域又はゾーンを含み得る。択一的又は付加的に担 体６１は、試薬に対して非反応性であるがカメラによる自動画像形成用参照フレ ームとして使用される検出可能なシグナルを提供する検出可能な染料を含む参照 スポット又はゾーンを含んでもよい。 担体６１に固定された標識増幅標的核酸は可視指標を発生し、この可視指標は 検出システム２２とコンピュータ２６により検出及び分析される。こうして発生 された可視指標は反応サンプル３８中の増幅標的核酸の存在又は量を表す。増幅 標的核酸が反応サンプル３８中に存在しない場合には、標識増幅標的は固定捕獲 分子と結合せず、可視指標は測定されない。担体６１上の指標の密度又は強度は 任意手段によって光学的に読取ることができ る。１態様について本明細書中で記載するように、シグナルは反射ミラー１０６ によってビデオカメラレンズ１０２に反射される。ミラー１０６が回転するにつ れて、検出チャンバー３２の各々における担体６１の各々を読取ることができる 。 上記好適態様以外に、本発明は標的核酸を標識及び固定する別の方法も意図す る。例えば、製造中にプライマー／プローブを検出可能な標識と結合してもよい 。あるいは、製造中にプライマー／プローブを特異結合対メンバーと結合し、相 補的特異結合対メンバーと結合した検出可能な標識と結合させてもよい。相補的 特異結合対メンバーの結合は増幅反応中に行ってもよいし、増幅反応後に行って もよい。従って、検出チャンバー３２に移送する前に反応サンプル中の増幅標的 核酸を検出可能な標識に結合できると考えられる。 別の態様では、標識増幅標的核酸を微粒子 凝集によって検出チャンバー３２内で検出する。この態様では、製造中に１対の プライマー又は１組のプローブを同一特異結合対メンバーと結合する。次に、相 補的特異結合対メンバーと結合した微粒子を検出手段６０の一部として加える。 反応サンプル３８が検出チャンバー３８に移送されて検出手段６０と接触するに つれて、反応サンプル３８中に存在する増幅標的は被覆微粒子と結合する。増幅 標的が２価であるため、微粒子は凝集する。非増幅プローブ又はプライマーはた だ１個の微粒子と結合し、凝集を開始することができない。その後、上述のよう に検出システム２２によって凝集を検出及び分析することができる。 ９．本発明のキット 本発明は核酸を増幅及び検出するキットも提供する。該キットは多重使い捨て 反応チャンバー３０と、多重使い捨て検出チャンバー ３２と、各反応チャンバー３０を検出チャンバー３２に密封可能に固定する係合 手段を含む。使い捨て検出チャンバー３２の各々は増幅標的核酸を固定するよう に修飾した担体６１を含む。キットは更に増幅反応を実施するための試薬を適切 な緩衝液中に含む１個以上の容器を備える。ＰＣＲではこのような試薬はＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及び所定の標的核酸に 特異的な少なくとも２個のプライマーを含む。ＬＣＲではこのような試薬はＤＮ Ａリガーゼ、ＮＡＤ及び所定の核酸に特異的な少なくとも４個のプローブを含む 。試薬に適切な容器はびん、バイアル、試験管などである。好適態様では、選択 した試薬をキットの使い捨て反応チャンバー３２に事前包装し、穿孔可能なシー ルで密閉する。 １０．実施例 実施例１：サーマルサイクラーの構成 Ａ．外径１０５ｍｍ、内径９５ｍｍ及び高さ１３ｍｍの寸法をもつ２つのアル ミニウムリングからデュアルリングサーマルサイクラーを構成した。リング間の ギャップは２ｍｍとした。各リングは反応／検出ユニット２０を収容するための 整列ウェルを４０個含み、各ウェルは直径約２．３ｍｍとした。図７に示すよう にリングの内面に径方向冷却フィンを設けた。粘着性加熱ストリップ（Ｍｉｎｃ ｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を上下リングの外周に 付着した。こうして付着した加熱ストリップは各リングに約３００Ｗの電力を供 給することが可能であった。リングの温度は上述のようにエレクトロニクス及び ソフトウェアにより制御した。冷却ファンの上方にリングの中心軸に沿って電荷 結合デバイス（ＣＣＤ）カメラと可動ミラーを配置した。 Ｂ．外径１０５ｍｍ、内径９４ｍｍ及び高 さ３６ｍｍの寸法をもつ単一のアルミニウム環状リングからサーマルサイクラー を構成した。リングは反応管用ウェルを３６個含み、各ウェルは直径３．５ｍｍ とした。リングの内面に径方向冷却フィンを設けた。外周に粘着性加熱ストリッ プ（Ｍｉｎｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を付着し た。リングの温度は上述のように制御エレクトロニクス及びソフトウェアによっ て制御した。リングの外部にＣＣＤカメラを配置し、中心に光源を配置した。 Ｃ．８４ｍｍ×２５ｍｍ×６ｍｍの寸法をもつ２個の矩形アルミニウムブロッ クから２段式サーマルサイクラーを構成した。各ブロックは反応／検出ユニット ２０を収容するためのウェルを１２個含み、各ウェルは直径約０．３１ｃｍとし た。ブロックの片面に冷却フィンを設けた。他方の面には粘着性加熱ストリップ （Ｍｉｎｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を付着した。ブロックの温度は上述のようにエ レクトロニクス及びソフトウェアによって制御した。 実施例２：抗体試薬の調製 Ａ．抗血清： 各ハプテンをＢＳＡに結合してビオチン、アダマンタン、キノ リン、ジベンゾフラン、チオフェンカルバゾール及びアクリジンに対する抗血清 をウサギで誘起した。アダマンタン、キノリン、ジベンゾフラン、チオフェンカ ルバゾール及びアクリジンに対する抗体の製造の詳細については、本願と同一名 義の同時係属出願第０７／８０８，５０８号、０７／８０８，８３９号、０７／ ８０８，８３９号、０７／８０８，８３９号及び０７／８５８，９２９号に夫々 記載されている。これらの出願は参考資料として本明細書の一部とするが、本発 明に必須とはみなさない。標準法を使用してマウスでフルオレセインに対するモ ノクローナル抗体を誘起し た。ダンシルに対する抗血清はペンシルバニア大学から入手したマウスモノクロ ーナルであった（Ｓ−Ｔ．ＦａｎとＦ．Ｋａｒｕｓｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉ ｍｍｏｎｏｌｏｇｙ ，２１，１０２３−１０２９（１９８４））。抗血清をプロ テインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）又はプロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に通し て精製し、０．１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）、０．９％ＮａＣｌ、０．１％Ｂ ＳＡ、１％スクロース、１％イソプロパノール及びフェノールレッド微量で希釈 した。 Ｂ．複合体： Ｄ．Ａ．Ｙｏｓｔ他（米国特許第４，９５４，４５２号（１９ ９０））の方法に従ってコロイド状セレンを調製した。５４５ｎｍで光学濃度＝ １６に達するようにコロイドを水で希釈した。この懸濁液１ｍＬに１ｍｇ／ｍＬ の抗ビオチン１μＬと１０ ０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ６０μＬを加えた。この懸濁液を渦流混合器で１分間混合 した。この混合物の０．５ｍＬ部分を、４％カゼインを含有する４０ｍＭ ＴＲ ＩＳ（ｐＨ７．８）０．５ｍＬで希釈し、１０×１．２５ｃｍガラス繊維を基材 とするパッド（Ｌｙｐｏｒｅ ９２５４，Ｌｙｄａｌｌ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅ ｓｔｅｒ，ＮＹ）に含浸させた。パッドを凍結乾燥し、６×６ｍｍ切片に切断し た。 均一に染色した青色ポリスチレンラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）にも抗ビオチン抗血清を結合した。ラテッ クス粒子（直径３８０ｎｍ）を水で１：２５に希釈し、０．４％固形分で１ｍＬ とし、１ｍｇ／ｍＬの抗ビオチン１０μＬを加えた。懸濁液を渦流混合器で４５ 秒間混合し、５％カゼインを含有する０．１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）５μＬ を加えた。この混合物の０．５ｍＬ部分を、４％カゼインを含有する４０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．８）０．５ｍＬで希釈し、１０×１．２５ｃｍパッド（Ｌｙ ｐｏｒｅ ２５４（登録商標），Ｌｙｄａｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ，ＮＹ）に含浸させた。パッドを凍結乾燥した。 Ｃ．固体担体： 電動微量注射器を用いて抗ダンシル抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を ニトロセルロースシート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋ ｅｅｎ，ＮＨのＭｙｌａｒ（登録商標）にプレキャストした気孔寸法５μｍのも の）に加えた。更に、米国特許第４，８７７，７４５号（Ａｂｂｏｔｔ）に記載 されているような試薬噴射によって抗アダマンタン、抗アクリジン、抗キノリン 、抗ベンゾフラン、抗チオフェンカルバゾール及び抗フルオレセイン抗体を０． ５〜１ｍｇ／ｍＬで別々のニトロセルロースシート（ 気孔寸法５μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎ， ＮＨ）に加え、多重捕獲担体を形成した。 実施例３：検出チャンバーの作成 Ａ．管状： 内径約３ｍｍのプレキシグラス管から管状検出チャンバーを構成 した。検出チャンバーの上端は閉じ、下端は下記実施例４Ａに記載するマイクロ チューブ反応チャンバーを螺着できるようにねじ切りした。 実施例２ＢのＬｙｄａｌｌ抗ビオチン複合体パッドを接着テープで抗ダンシル ニトロセルロース担体６１（実施例２Ｃ）の底に張り付けた。次にニトロセルロ ース−Ｌｙｄａｌｌパッド担体を３×５０ｍｍストリップ状にスライスし、内径 約３ｍｍのプレキシグラス管からなる検出チャンバーにＬｙｄａｌｌパッド部分 を下向きにして挿入した。 Ｂ．レザーバを備える矩形チャンバー： 図２Ａ〜図２Ｅに示す設計のストリ ップホル ダーをポリカーボネートから成形した。反応管からレザーバに通じる底部のオリ フィスに実施例２Ｂのセレン抗ビオチン複合体パッドの６×６ｍｍ切片を配置し た。抗体を固定した多重捕獲担体ストリップ（実施例２Ｃ）をストリップホルダ ーに入れた。超音波によってストリップホルダーの底にふたを溶着し、ストリッ プをピンで固定した。 実施例４： 反応チャンバー作成 Ａ．Ｐ．Ｃ．Ｒ．微量注射器先端をＴｒｉ−Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔ Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｇｒａｓｓ Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡから購入し、開放端（ 底部）をヒートシールした。これらの反応チャンバーはポリプロピレン製で容積 １００μＬ、内径１．８ｍｍであった。頂部は図１３に示すようにねじ切りして あった。 Ｂ．カスタム反応チャンバーはＶａｒｉｖｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｓｓ Ｖ ａｌｌｅ ｙ，ＣＡから取りよせた。これらのチャンバーは容積１００μＬ、外径３．５ｍ ｍ、内径２ｍｍ及び長さ３．５ｃｍを有するようにポリプロピレン毛細管から構 成した。奇異なことに、反応サンプルを単独で推進剤として用いた試験では、こ れらのチューブは既に密封してあった底部を予め融解し、恐らく密閉下端又はそ の近傍に表面凹凸を導入しない限り、性能が非常に劣った。 実施例５： 反応サンプル調製、Ｊ３．１１ ＡＢＩ ＤＮＡ合成器でホスホラミダイト化学によりオリゴヌクレオチドプロ ーブを合成し、指定するようにビオチン又はダンシルハプテンでハプテン化した 。配列（下記配列番号１、２、３及び４）を用いて嚢胞性繊維症に漠然と関連付 けられるＪ３．１１多型性をコードするヒト染色体７の一部を増幅した。（Ｉ． Ｂａｒｔｅｌｓ他，Ａｍ Ｊ．Ｈｕ ｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，３８：２８０−７（１９８６））。配列は下記のよ うに標的（５０塩基合成標的：配列番号５）に整列する。 Ｂａｃｋｍａｎ他のヨーロッパ特許出願第４３９１８２号に記載されているよ うな「ダブルギャップ」ＬＣＲを実施するために、反応サンプル混合物は総容量 １００μＬ中に、ｐＨ７．８に達するようにＫＯＨで滴定した５０ｍＭ ＥＰＰ Ｓ、２０ｍＭ Ｋ₊、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０μＭ ＮＡＤ、１．７μＭ ｄ ＧＴＰ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＤＮＡリガーゼ９０ ００単位、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ１単 位、ニシン精子キャリヤーＤＮＡ１μｇ、各オリゴヌクレオチドプローブ（配列 番号１、２、３及び４）４×１０₁₂コピー（６．７ｎｍｏｌ）及び標的ＤＮＡ（ 配列番号５）１０７コピーを含有するものとした。 反応サンプルを実施例４Ａの反応チャンバーにピペット注入した。次に反応チ ャンバーを短時間遠心し、反応サンプルをチャンバー の底に集めた。反応チャンバーを実施例３Ａに記載した検出チャンバーに螺着し 、密封反応／検出ユニット２０を形成した。 実施例６： ＤＮＡ増幅及び反応チャンバーから検出チャンバーへの反応サン プルの移送 実施例５の密封反応／検出チャンバーをスプリットリングサーマルサイクラー （実施例１Ａ参照）に挿入した。上段及び下段リングを８２℃５秒間及び５５℃ ６０秒間の４０サイクルの温度プロトコルにかけ、ＬＣＲ反応を実施した。各サ イクルは完了するまでに約２分間を要し、合計ＬＣＲ時間は約８０分間であった 。 温度サイクリングの完了後、下段リングを１１０℃まで加熱し、上段リングを １００℃まで加熱した。これらの温度を２５秒間維持した。反応チャンバー内の 反応サンプルの熱膨張及び蒸発により、サンプルは反応チャン バーから検出チャンバーに移送され、反応サンプルは標識抗ビオチン複合体を含 む担体６１の第１の端部と接触した。標識抗ビオチンは再可溶化し、反応サンプ ルはクロマトグラフィーによりニトロセルロース担体６１まで上昇した。増幅標 的ＤＮＡを含む反応サンプル中で増幅産物は担体６１上の抗ダンシル捕獲部位と 結合し、可視呈色が観察された。６個の反応サンプルの結果を図１３に示す。左 側の３個のサンプルは標的ＤＮＡを含み、検出スポット上に暗色スポットが見え る（矢印参照）。右側の３個のサンプルは標的ＤＮＡを含まず、スポットは見え ない。 実施例７：検出画像形成 輝度１４０及びコントラスト１５０のグレースケール設定を用いて実施例６の 検出チャンバーをフラットベッドスキャナー（ＳｃａｎＪｅｔ Ｃ，Ｈｅｗｌｅ ｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）でＴＩＦ Ｆファイルに走査した。ＴＩＦＦファイルをＩｍａｇｅ（登録商標）（Ｎａｔｉ ｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓ ｅｒｖｉｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＩＨの市販品）にインポートし、生成された バンドの画像の画素密度を分析した。結果を下表１に示し、表中、最大密度及び 最小密度はバンドのすぐ近傍の画像のグレーレベルを表す。 実施例８：ピデオ処理 実施例６に記載した呈色反応生成物の写真画像をＣＣＤカメラで撮影した。上 述のソフ トウェアを使用して画像から生成されたグレースケールデータファイルを分析し て担体６１の特定領域中の呈色反応の有無及び量を判定した。 実施例９：アルコール推進剤 １−プロパノール２μＬを反応チャンバーの下端に入れ、反応サンプルと１− プロパノールを約２．５μＬの空気で分離するように反応サンプルをチャンバー に入れた以外は実施例５と同様の反応サンプルを微量注射器筒反応容器で調製し た。次に実施例５と同様に反応チャンバーに検出チャンバー３２を密封可能に装 着し、密封反応／決定ユニット２０を形成した。上段及び下段リングの両者を１ ００℃まで加熱した以外は実施例６と同様のＤＮＡ増幅及び後加熱プロトコルを 実行した。１−プロパノールを蒸発させ、反応サンプルを上昇させて検出チャン バー内の担体６１と接触させた。その後、実施例７又は８に記 載した画像形成検出システムにより担体ストリップ６１上の呈色反応生成物を分 析することができる。 実施例１０：推進剤膨張の核形成 数個のガラスマイクロビーズ（平均直径０．２ｍｍ）（均質化ビーズ、Ｖｉｒ ｔｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）を加えた以外は実 施例５と同様の反応サンプルを調製した。次いで実施例６及び７に記載したステ ップを実施した。ガラスビーズは反応チャンバーの下端で沸騰の開始及び局在化 のための核として機能し、こうして発生した蒸気は反応サンプルを検出チャンバ ーに移送するように機能する。その後、実施例７に記載した画像形成検出システ ム及び手順により担体ストリップ６１上の呈色反応生成物を分析した。 実施例１１：反応サンプル調製、βグロビン ヒトβグロビン遺伝子（配列番号１０）とハイブリダイズするオリゴヌクレオ チドプローブ（配列番号６、７、８及び９）をＡＢＩＤＮＡ合成器でホスホラミ ダイト化学によって合成し、ビオチン又はアマダンタンでハプテン化した。 Ｂａｃｋｍａｎ他のヨーロッパ特許出願第０４３９１８２号（１９９１）に記 載されている所謂「ダブルギャップ」ＬＣＲ法を実施するために、反応サンプル 混合物は総容量１００μＬ中の最終濃度で表した場合に、５０ｍＭ ＥＰＰＳ ｐＨ７．８、ｐＨ７．８及び２０ｍＭ Ｋ₊に達するようにＫＯＨで滴定したＫ Ｃｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０μＭ ＮＡＤ、１．７μＭ ｄＧＴＰ、（Ｔ ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの）ＤＮＡリガーゼ９０００単位 、（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓからの）ＤＮＡポリメラーゼ１単位、 及び各オリゴヌクレオチド（配列番号６、７、８及び９）１×１０¹²コピー（１ ．７ｐｍｏｌ）を含有するものとした。標的はヒト胎盤ＤＮＡ２５０ｎｇ（約１ ０⁵コピー）であり、配列番号１０又は水を含む。 底部を融解して冷却しておいた実施例４Ｂ の１００μＬ容反応チャンバーに反応混合物をピペット注入した。反応チャンバ ーを短時間遠心して反応混合物を管の底部に集めた。チューブに実施例３Ｂの検 出ユニットを装着し、密封反応／検出ユニットを形成した。 実施例１２：ＤＮＡ分析及び反応チャンバーから検出チャンバーへの反応サン プルの移送 実施例１１で組立てた反応／形成ユニットを実施例１Ｂのサーマルサイクラー に挿入し、８８℃１０秒間と５３℃６０秒間の３５サイクルからなる温度シーケ ンスにかけ、ＬＣＲ反応を実施した。各サイクルを完了するには約２分間を要し 、合計ＬＣＲ時間は約８０分間であった。増幅サイクルの完了後、リングを１０ ４℃まで加熱した。この温度を２５秒間維持した。反応混合物の熱膨張と蒸発に より、液体サンプルは各反応エレメントから夫々に装着した検出エレメントに流 入し、増 幅サンプルは抗ビオチン複合体を含む乾燥パッドに侵入した。パッド中の標識抗 体は可溶化し、混合物はクロマトグラフィーによりニトロセルロースストリップ まで上昇した。試験サンプル中に適当なＤＮＡ配列が存在する場合には、増幅産 物は抗アマダンタン捕獲部位に保持され、可視呈色が観察された。他の抗体部位 は呈色しなかった。反応ユニットは図１４に示す。 実施例１３：ビデオ処理 実施例１１及び１２の反応／検出ユニットを実施例７及び８の手順に従って画 像形成及び処理した。 実施例１４：多重担体 各々異なるハプテンに対して特異的な複数の抗体結合部位をもつ担体ストリッ プ６１を実施例３Ｂに記載したように作成した。ストリップは担体上の特定位置 にビオチン標識卵アルブミンも含む。ビオチン標識タンパク質 は対照又は参照標準として用いる。 実施例１５：多重検出 実施例５又は１１に記載したようにオリゴヌクレオチドプローブを合成する。 ・ 実施例１１の４個のプローブはヒトβグロビン遺伝子とハイブリダイズする 。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチ ン部分を含み、１個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗アマダンタンと結 合できるように末端アマダンタンを含む。これは陽性対照として用いる。 ・ 他の４個のプローブは天然には知られていない配列とハイブリダイズする。 プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合できるように末端ビオチン 部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾーンで抗ジベンゾフランと結 合できるように末端ジベンゾフランを含む。これは陰性対照として用い る。 ・ 他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のΔＦ₅₀₈突然変異をコードするヒト染 色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複 合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特 異結合ゾーンで抗フルオレセインと結合できるように末端フルオレセインを含む 。 ・ 他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のＧ₅₅₁Ｄ突然変異をコードするヒト染 色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複 合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特 異結合ゾーンで抗チオフェンカルバゾールと結合できるように末端チオフェンカ ルバールを含む。 ・ 他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のＧ₅₄₂Ｘ突然変異をコードするヒト染 色体７の部 分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複合体と結合 できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特異結合ゾー ンで抗キノリンと結合できるように末端キノリンを含む。 ・ 他の４個のプローブは嚢胞性繊維症のＷ₁₂₈₂Ｘ突然変異をコードするヒト染 色体７の部分とハイブリダイズする。プローブの２個は抗ビオチンラテックス複 合体と結合できるように末端ビオチン部分を含み、２個は担体ストリップ上の特 異結合ゾーンで抗ダンシルと結合できるように末端ダンシルを含む。 これらの突然変異の各々の周囲のＤＮＡ配列は文献に記載されている。次に実 施例５〜６及び１１〜１２の条件を用いてＬＣＲ増幅を実施し、ストリップを展 開し、実施例７〜８に記載したようにスポットを視覚化する。 実施例１６：多重ビデオ処理 各抗体（又はビオチン標識タンパク質）が ストリップ上の３個以上の特異位置に結合する以外は、実施例１１と同様に担体 ストリップ６１を作成する。複数の特異捕獲部位７４又は結合領域により、ビデ オ処理プログラム６００は類似スポットからのシグナルを平均し、こうして特定 結果の付値の信頼性を増すことができる。更に、類似スポットが呈色しない場合 にはスプリアスシグナルを棄却することができる。 以上、本発明の好適態様について説明したが、当業者に自明の通り、本発明の 実際の範囲内で構造、構成、組成等の変更が可能である。本発明の保護範囲は添 付の請求の範囲により定義される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブーマ，スタンリイ・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、ハンテイントン・サークル・ 17271 (72)発明者 ゴードン，ジユリアン アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、イースト・シエリダン・ロー ド・307 (72)発明者 コツトラリク，ジヨン・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、サウス・オールド・クリー ク・261 (72)発明者 ソロモン，ナタリー・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バフ アロー・グローブ、ソーンデイル・ドライ ブ・467

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．デバイス内の反応チャンバーと検出チャンバーの間で流体サンプルを移送す る方法であって、 ａ）反応チャンバーと検出チャンバーをもつデバイスを準備し、反応チャンバー と検出チャンバーをこれらのチャンバーの間の流体連通手段によって相互に連結 し、前記反応チャンバー内に反応サンプルを配置し、推進剤とサンプルが混合す るように又はサンプルが推進剤と流体連通手段の間に位置するように前記反応チ ャンバー内に推進剤も配置され、更に前記推進剤が膨張するように誘導可能であ る段階と、 ｂ）推進剤を膨張するように誘導してより大きい容積を占有させ、サンプルを流 体連通手段を介して検出チャンバーに圧入する段階とを含む前記方法。 ２．前記反応チャンバーが細長形チャンバーであり、前記誘導する段階が前記推 進剤に熱を加える段階を含む請求項１に記載の方法。 ３．前記熱が前記細長形反応チャンバーの推進剤を含む局在領域に加えられる請 求項２に記載の方法。 ４．前記推進剤が前記反応サンプルと混合するように前記反応チャンバー内に配 置される請求項３に記載の方法。 ５．前記推進剤は該推進剤と流体連通手段の間にサンプルが位置するように前記 反応チャンバー内に配置される請求項３に記載の方法。 ６．前記反応チャンバーが核酸増幅用熱サイクリングチャンバーであり、前記誘 導する段階が熱サイクリング反応の完了後に実施される請求項１に記載の方法。 ７．前記反応チャンバーが核酸増幅用細長形熱サイクリングチャンバーであり、 前記誘導する段階が前記推進剤を加熱する段階を含む する段階が前記推進剤を加熱する段階を含む請求項１に記載の方法。 ８．前記推進剤が前記反応サンプルと混合するように前記反応チャンバー内に配 置される請求項７に記載の方法。 ９．前記推進剤は該推進剤と流体連通手段の間にサンプルが位置するように前記 反応チャンバー内に配置される請求項７に記載の方法。 １０．前記推進剤が蒸発可能な流体である請求項１に記載の方法。 １１．前記推進剤が蒸発可能な流体である請求項７に記載の方法。 １２．前記蒸発可能な流体が反応サンプル自体である請求項１に記載の方法。 １３．前記蒸発可能な流体が反応サンプル自体である請求項８に記載の方法。 １４．前記推進剤が空気である請求項１に記載の方法。 １５．前記推進剤が空気である請求項９に記載の方法。 １６．前記誘導する段階が非機械的手段によって実施される請求項１に記載の方 法。 １７．前記誘導する段階が非機械的手段によって実施される請求項６に記載の方 法。 １８．前記誘導する段階が前記推進剤を蒸発させることによって実施され、前記 蒸発が前記推進剤中で核形成部位を使用することによって局在化される請求項１ ０に記載の方法。 １９．前記核形成部位が微粒状物質を含む請求項１８に記載の方法。 ２０．前記核形成部位がガラス又はプラスチックマイクロビーズを含む請求項１ ８に記載の方法。 ２１．前記反応チャンバーが少なくとも二つの異なる長手方向セグメントをもつ 細長形チャンバーであり、更に、 ａ）第１の長手方向セグメントを断続的に加 熱して前記熱サイクリング反応を実施する段階と、 ｂ）別の長手方向セグメントを加熱して前記推進剤の膨張を誘導し、前記反応サ ンプルを前記検出チャンバーに移送する段階とを含む請求項６に記載の方法。 ２２．前記反応チャンバーが長手方向セグメントをもつ細長形チャンバーであり 、更に、 ａ）前記長手方向セグメントに第１の最大量の熱を断続的に加えて前記熱サイク リング反応を実施する段階と、 ｂ）前記長手方向セグメントに前記第１の最大量を上回る熱を加えて前記推進剤 の膨張を誘導し、前記反応サンプルを前記検出チャンバーに移送する段階とを含 む請求項６に記載の方法。 ２３．前記熱サイクリング反応がリガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応を 含む請求項６に記載の方法。 ２４．前記熱サイクリング反応がリガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応を 含む請求項７に記載の方法。 ２５．標的核酸を含む疑いのあるサンプルと複数のプライマー又はプローブを反 応チャンバー内で反応させて前記標的核酸を増幅する段階と、前記サンプルを前 記反応チャンバーと別個の検出領域に移送し、増幅標的の存在又は量を検出する 段階とを含むところの標的核酸の増幅及び検出方法において、前記サンプルを前 記反応チャンバーから前記検出領域に推進するために熱を使用することによって 前記サンプルを検出領域に移送する段階を含む改良。