JPH09504603A

JPH09504603A - コレステロールの直接分析法

Info

Publication number: JPH09504603A
Application number: JP7504681A
Authority: JP
Inventors: パージー，ネイル
Original assignee: リサーチコーポレーションテクノロジーズインコーポレーテッド
Priority date: 1993-07-14
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 1997-05-06
Also published as: DE69417895T2; ATE178993T1; CA2166725A1; ES2129654T3; DE69417895D1; EP0707711B1; EP0707711A1; WO1995002826A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、コレステロールの直接定量的測定に関し、そして分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とコレステロールとを接触させることにより得られるコレステロールの分光測光的に活性な生成物の形成を含む。

Description

【発明の詳細な説明】コレステロールの直接分析法技術分野本発明は、例えば、蛍光分光測光、微分吸着分光測光、円二色性、そしてさらに特に吸着分光測光を使用してコレステロールを臨床的に検出する方法において特に有用な分光測光的に活性なコレステロール生成物を形成する方法に関する。さらに特に、本発明は、臨床サンプル中の全コレステロール及びコレステロールサブフラクションの直接且つ同時の定量測定を行うことができる。本発明は、又コレステロールのような分析物と分光測光的に活性な生成物を形成するのに有用な化学試薬システムに関し、さらに前記の吸着検出化学的方法に有用な分光測光装置に関する。背景技術コレステロールのレベルは、例えば心臓疾患になるとされる予期される健康の問題の信頼できるインディケーターとして広くみなされているが、これらのレベルは、コレステロールが着色される物質ではないので、分光測光を含む従来の分析方法により容易に測定されない。従って、コレステロール測定の従来の周知の方法は、一般に着色誘導体化段階を必要とする。これらの例は、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ−Ｂｕｒｃｈａｒｄ反応、Ｚａｋ反応及びＡｂｅｌｌ−ｋｅｎｄａｌｌ反応を含み、これらの全ては、非水性媒体で生じ、そして反応条件の特別なコントロールを要する。この点で周知の他の反応は、酸化酵素−染料反応である。しかし、従来周知の着色誘導体化は、コレステロール分子それ自体の誘導体をもたらさず、むしろ、それらは、コレステロール酸化の二次生成物をもたらし、それは、コレステロールの分光測光的測定が間接的なものであることを意味する。即ち、色の強度がコレステロールの濃度の直接的な目安ではない。前述したように、実際的な目的のための殆どの従来の分析法は、分光測光を使用する。分光測光は、テスト化合物の溶液を通る入射光の吸収又は透過の測定である。代表的には、対象の化合物は、特徴的なスペクトル、光の透過又は吸収の特定の波長を有し、それらは、これらの化合物の存在を決定し、又はテストサンプル中のそれらの濃度を測定するのに使用できる。分光測光吸収にデザインされた装置は、光源（それについて発せられた波長は、周知でありそして調節でき）、及び透過又は反射された光の所望の波長に感度の高い１種以上の検出器を有する。分光測光吸収は、テストサンプル中に存在する或る化合物の量を測定するのに使用できる。円二色性（ＣＤ）は、特別なタイプの吸収方法であり、分析物の分子状組成が、特定の波長ばかりでなく特別な偏光の状態の入射光の異なる吸収を生ずる。円二色性は、異なる鏡像異性体、即ち１個以上の不斉炭素原子（キラル）中心を有する光学異性体間を区別させるキラル光学方法である。ＣＤを利用するとき、一般にサンプルは、同時に動く光の２本の円状に偏光したビームにより照射される。両方のビームは、サンプルを同時に通過し、そして吸収される。もしサンプルが光学的に活性ならば、ビームは、異なる程度に吸収される。ビームの吸収における差は、次にＣＤスペクトルとして入射光ビームの波長の関数として示される。吸収に差がないことは、光学的に不活性な吸収物について観察されて、これらの化合物は、ＣＤ検出システムにより検出されない。キラル光学方法としてのＣＤの使用は、科学文献、例えばＬａｍｂｅｒｔ、Ｊ．Ｂ．ら「ＯｒｇａｎｉｃＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓ」ＭａｃＭｉｌｌａｎ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、１９７６に詳細に記述されている。ＣＤ方法の初期の応用は、分子構造特に天然物（絶対的な立体化学を確認又は確立できる手法が重要である）の解明を主として扱っている。しかし、ＣＤは、又血漿中の非共役ビリルビンを定量的に測定する臨床の方法に使用されることが報告されている。Ｇｒａｈｎｅｎ、Ａ．ら「ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ、５２、１８７−１９６（１９７４）。開示された方法では、コンプレックスが、ビリルビン分析のためのＣＤプローブとしてビリルビンとヒト血清アルブミンとの間に形成された。円二色性の臨床的応用は、又ＮｅｉｌＰｕｒｄｉｅ及びＫａｔｈｙＡ．Ｓｗａｌｌｏｗｓにより、ここに参考として引用されるＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、６１巻、Ｎｏ．２、ｐｐ．７７Ａ−８９Ａ（１９８９）において論じられている。ＣＤの可能な臨床的応用は、コレステロールのレベルの測定及び同化作用ステロイドの検出を含むものと開示されている。しかし、これらのテストを実施するための好適な化学的試薬は、開示されていない。コレステロールのレベルを測定するためにここに開示された分光測光吸収、蛍光、微分分光測光又はＣＤ方法の使用に関し、一般の人々は、血清コレステロールレベルを知ることが賢明であることが常に忠告され、そしてコントロールされていない食事及び運動の欠乏が、アテローム性動脈硬化及び冠心臓疾患の危険を増大させるだろう動脈のプラークの蓄積を導くことを常に記憶していることに注意する必要がある。統計的研究、例えばＫａｎｎｅｌ、Ｗ．Ｂ．らにより、「ＳｅｒｕｍＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅＲｉｓｋｏｆＣｏｒｏｎａｒｙＨｅａｒｔＤｉｓｅａｓｅ：ＴｈｅＦｒａｍｉｎｇｈａｍＳｔｕｄｙ」Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．７４：１−１１（１９７１）」において、そしてＣａｓｔｅｌｌｉ、Ｗ．Ｐ．らにより、「ＩｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＣｏｒｏｎａｒｙＨｅａｒｔＤｉｓｅａｓｅａｎｄＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＬｅｂｅｌｓ」ＪＡＭＡ、２５６：２８３５−２８３８（１９８６）において報告されたものは、他のリスクファクター例えば年齢、性、遺伝、タバコ、アルコール消費などが、又リスクについて患者をカンセリングする際に、考えるべきであることを示している。一般公衆をスクリーニングするためのプログラムの大きさは、非常に大きいので、コレステロール測定のための自動化方法が必要である。現在使用されているテストは、簡単なディップスティックのアプローチ（ペーパー支持体上の色感受性反応を使用する）から、複雑なリピドプロフィールテスト（種々の可溶性分子の中のコレステロールの分布が測定される、Ａｂｂｏｔｔ、Ｒ．Ｄ．ら「ＪｏｉｎｔＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＣｌａｓｓｅｓ，ＦｒａｍｉｎｇｈａｍＳｔｕｄｙ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、３：２６０−２７２（１９８３）へ、複雑さで異なる。ここで、ディップスティックアプローチは、さらに完全なさらに定量的な測定が基づく予備的な定量テストに過ぎない。いかに健康のリスクファクターが高レベルの血清コレステロールと関連するかの最近の広範な研究の結論として、「ＣｕｒｒｅｎｔＳｔａｔｕｓｏｆＢｌｏｏｄｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ，ＡｒｅｐｏｒｔｆｒｏｍｔｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎＰａｎｅｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４：１９３−２０１（１９８８）と題された報告は、ｔｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎＰａｎｅｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）により作成された。この報告において、リスクの目安は、全コレステロール（ＴＣ）の三つの範囲、もし２００ｍｇ／ｄＬより低ければ低リスク、２００−２３９ｍｇ／ｄＬの範囲の中程度のリスク、もし２４０ｍｇ／ｄＬより高ければ高リスクと相関した。個々のヒトをこれらのカテゴリーの一つ又は他のものにおくためには、必要なことの全ては、血清ＴＣ測定である。他のリスクファクター、例えば上記のＫａｎｎｅｌらそしてＣａｓｔｅｌｌｉらにより同定されたものは、次にさらに患者とカンセリングするための基礎として加えられる。この比較的簡単なアプローチは、上記のＫａｎｎｅｌら、並びにＳｕｐｅｒｋｏ、Ｈ．Ｒ．ら「Ｈｉｇｈ−ＤｅｎｓｉｔｙＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ−ＡＨｅｌｐｏｒＨｉｎｄｅｒａｎｃｅｉｎＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ」ＪＡＭＡ、２５６：２７１４−１７１７（１９８６）（相対的なリスクは、５に等しいＴＣ対高密度リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の比を使用して確立された）における初期の勧告を置き換える。５より低い比は、高いレベルのＨＤＬ−Ｃ並びに低い相対的リスクを意味する。この診断について、ＨＤＬ−Ｃは、第二の独立的テストで測定される。ＬＳＰによる同じ報告は、ヒトの血清参照標準品に存在するＴＣの量の測定において多数の臨床試験所によりなされた測定に重大な不正確さが存在したことをとりあえず加えた。統計的に、結果は、１５００箇所の試験所からのデータでは、４７％が、±５％の分散係数（ＣＶ）内に真の値を測定できず、そしてこれらの１８％が、±１０％のＣＶでできなかった。その結果、ＬＳＰは、ＴＣに関する±３％内へのＣＶの改善が１９９２年までに達成すべきであることを勧告した。最近の調査は、保証された試験所は、例えばＰｏｓｎｉｃｋ、Ｌ．「ＬａｂｓｎｏｗＢｅｔｔｅｒａｔＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＴｅｓｔｓＤａｔａＳｈｏｗ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｗｓ１５（９）：１４（１９８９）に報告されたような最近に臨床方法及び装置を使用して、そのチャレンジに対抗する準備を十分にしていることを示している。ＬＳＰは、種々のリピド及びリポ蛋白の中のコレステロールの分布の測定に伴う不正確さを報告していなかったが、評価は将来なされるだろうと指摘していた。血清又は血漿ＨＤＬ−Ｃの測定における信頼性の不足及び非常に低い熟練は、上記のＳｕｐｅｒｋｏ、Ｈ．Ｒ．ら、並びにＷａｒｎｉｃｋ、Ｇ．Ｒ．ら「ＨＤＬＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＩｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙＴｅｓｔ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１６９−１７０（１９８０）及びＧｒｕｎｄｙ、Ｓ．Ｍ．ら「ＴｈｅＰｌａｃｅｏｆＨＤＬｉｎＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＭａｎａｇｅｍｅｎｔ．ＡＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｆｒｏｍｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ」Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．１４９：５０５−５１０（１９８９）（試験所内のＣＶが、３８％のように高いことが報告されている）に明白に記載されている。二千箇所を越える試験所によるＨＤＬ−Ｃに関する同じサンプルの測定のＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＣＡＰ）による１９８７年の評価は、三分の一以上が、参照値から５％より大きく異なることを示した。同じ方法を使用する試験所内のＣＶ値のグループは、１６．５％に改善されたが、それはあまりに不正確なので、なお予言的な臨床値ではない。この理由のため、それは真の臨床像を規定するのに潜在的な利点をもたらすが、ＴＣ：ＨＤＬ−Ｃ比は、リスク評価にもはや使用されない。現在使用されているリピドのプロフィールの研究に関して、コレステロールは、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ−Ｃ）及び低密度リポ蛋白（ＬＤＬ−Ｃ）フラクション、並びに非常に低い密度のリポ蛋白コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）フラクションとしてのトリグリセリドと主として結合した血清中に分布していることが知られている。ＨＤＬ−Ｃの多くの割合及びＬＤＬ−Ｃの少ない割合が、低い相対的リスクを伴う、即ち簡単にいえば、ＬＤＬ−Ｃの高いレベルは可能ならばさけるべきであることを示す、多数の長期の臨床テストから多くの統計的証拠が存在する。ＨＤＬ−Ｃは、もしレベルが過剰に低くないないならば、即ち３０ｍｇ／ｄＬより少ないならば、有利である。ＶＬＤＬ−Ｃコレステロールは、全てのリスクの測定に意味があるとされていないが、多いトリグリセリドそれ自体は、重大な問題である。代表的なリピドのプロフィールの研究では、全コレステロールは、直接測定され、そしてＨＤＬ−Ｃは、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃを沈殿する試薬によるサンプルの処理後に残る上澄液中で測定される。ＶＬＤＬ−Ｃは、別のアッセイでも直接測定されるトリグリセリドの固定されたフラクション（例えば０．２）であるとされる。ＬＤＬ−Ｃは、これらの数値から計算されそして直接測定されない。３種の独立した測定のそれぞれの誤差の拡大は、ＬＤＬ−Ｃをして全体の正確さ及び精密さが最低であることを知られているフラクションにするが、それは、心血管リスクの最大の顕著な面である。このため、臨床の進展が、時間とともにＬＤＬ−Ｃ低下治療でなされることを有意にモニターしそして確立することは困難である。ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙの第４３回ミーティングで行われたワークショップ及び次のラウンドテーブルセッションにおいて、この領域の技術の現在の状態が、Ｂａｉｌｌｉｅ、Ｅ．Ｇ．ら「ＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＵｔｉｌｉｔｙｏｆＬｉｐｉｄＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ」Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、４３回ＮａｔｉｏｎａｌＭｅｅｔｉｎｇ、ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１並びにＷａｒｎｉｃｋ、Ｇ．Ｒ．「ＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＨＤＬＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ」Ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ、４３回ＮａｔｉｏｎａｌＭｅｅｔｉｎｇ、ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１に報告されているように、要約された。これらの報告から、正確さはＨＤＬ −Ｃ測定に必須であることが結論された。現在利用される沈殿方法は、満足すべき結果を与えることができるが、従来の試験所の設備におけるこれらの方法により得られた値は、現実の医学のニーズを満たしていない。ＨＤＬ−Ｃに関する１９８２年から１９９１年のＣＡＰの広範囲にわたる化学的熟練の調査は、１９９１年では約２０％の試験所内ＣＶを示し、１９８２年から改善はなかった。ＨＤＬ−Ｃ測定について使用される臨床装置によりもたらさられるＣＶは、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎについて７．６％からＥｃｋｔａｃｈｅｍについて５０％に及んだ。セッションでは、ＬＤＬコレステロールに関する直接方法が必要であることも指摘された。Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式によりＶＬＤＬ−Ｃを見積もるためのトリグリセリドの測定の使用は、現在、特別に良い方法である。ワークショップの摘要を引用すると、「全及びＨＤＬコレステロール及びトリグリセリドの測定で概して観察される変動性は、許容できる正確さの達成を排除する。事実、ＬＤＬコレステロールの見積もりにおける理想的な正確さを達成するには、成分の測定の正確さは、それらの理想的な明細より良くなければならない。」従って、これらのサブフラクションの沈殿又は分離物の測定を必要とすることなく、全コレステロール及び種々のサブフラクションの中のその分布の両者のコレステロールの量を直接且つ同時に測定する、比較的簡単な、信頼できるそして反復できる分析法について要求されていることは、確実である。発明の開示本発明は、分光測光的に活性なコレステロール生成物を形成する方法を提供し、それは、全コレステロール及びＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクションの中のその分布の直接且つ同時の定量的測定のための分析に使用できる。生成物の分光測光的活性は、従来の吸収、蛍光、第一次及び第二次の微分分光測光、並びに円二色性により測定できる。従って、一つの態様では、本発明は、コレステロールの分光測光的に活性な生成物を形成する方法を提供し、それは、コレステロールと、コレステロールと分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とを接触させることを含む。テストサンプルで形成されるとき、例えば、分光測光的活性の数値が求められて、サンプル中に存在するコレステロールの量を測定し、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクションの中のその分布を含む。この態様の方法は、沈殿又は分離したサブフラクションの測定を必要とすることなく、外界温度で、全コレステロール及びサブフラクションの分布の両者のコレステロールの直接且つ同時の定量的測定に関する迅速な且つ反復できる方法を行わせる。他の態様では、本発明は、コレステロールとの反応生成物を形成し、次に段階（ａ¹）、（ａ²）、（ａ³）又は（ａ⁴）の何れかを行い、但し段階（ａ³）及び（ａ⁴）は、分析される特別なコレステロールサブフラクションから由来する定数及びマトリックス算術を使用してコレステロール濃度の計算を伴い、段階（ａ¹）は、約１５０−７００ｎｍ（好ましくは約３６０ｎｍから７００ｎｍ）の範囲にわたってテストサンプルのＣＤ吸収スペクトルを測定し、段階（ａ²）は、約１５０ｎｍ−７００ｎｍ（好ましくは約３６０ｎｍから７００ｎｍ）の範囲内の１種以上の別々の波長でテストサンプルのＣＤ吸収を測定し、段階（ａ³）は、約１５０ｎｍ−７００ｎｍ（好ましくは約３６０ｎｍから７００ｎｍ）の範囲内の３種以上の別々の波長でテストサンプルの分光測光、蛍光又は微分分光測光吸収を測定し、段階（ａ⁴）は、約１５０ｎｍ−７００ｎｍ（好ましくは約３６０ｎｍから７００ｎｍ）の範囲にわたってテストサンプルの分光測光、蛍光又は微分分光測光吸収を測定する。本発明は、さらに本発明の方法の或るものを実施するための新規な吸収検出装置を提供し、その装置は、以下のものにより例示されるが、制限されない。テストサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及びＴＣの量を測定するための分光測光吸収装置であって、装置は、約１５０ｎｍ−７００ｎｍ（好ましくは約３６０ｎｍから７００ｎｍ）の範囲内の３種以上の異なる波長でテストサンプルの分光測光吸収スペクトルを測定するための手段、並びに例えばテストサンプル中のコレステロール反応生成物の分光測光吸収に基づいてテストサンプル中に存在するＶＬＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ及びＴＣの量を測定するための手段を含む。任意に、装置は、テストサンプルへ試薬を添加するための手段をさらに含む。本発明は、ここ及び以下に与えられる詳細な記述並びに図からさらに十分に理解されるようになり、図は、説明のみに示され、そして本発明を制限するものではない。図面の簡単な説明図１は、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬とコレステロールとの反応から得られる光学的に活性な着色生成物に関する完全なＣＤスペクトルである。曲線（ａ）は、全コレステロールを示し、一方、斜線の領域は、ＶＬＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃ沈殿剤の添加後のスペクトルであり、それ故ＨＤＬ−Ｃフラクションのみを示す。図２は、従来の技術方法を使用して２箇所の異なるラボ（ラボＡ及びＢ）により処理された血清サンプル中で測定されたＴＣ対本発明のＣＤ法（このラボ）により測定された全コレステロール間の相関を表す。ｙ＝−１０．２０９＋１．００５５ｘ、Ｒ²＝０．８３５。図３（ａ）は、本発明のＣＤ法（このラボ）を使用するＴＣ対（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃのグラフである。ｙ＝５．０５５４＋０．８４６９３ｘ、Ｒ²＝０．９３２。図３（ｂ）は、従来技術方法（ラボ−Ａ）を使用するＴＣ対（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃのグラフである。ｙ＝−４７．６７２＋０．９８７５１ｘ、Ｒ²＝０．９８７。図３（ｃ）は、従来技術方法（ラボ−Ｂ）を使用するＴＣ対（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃのグラフである。ｙ＝−４６．５２２２＋０．９８６９ｘ、Ｒ²＝０．９８。図４（ａ）は、本発明のＣＤ法（このラボ）を使用するＴＣ対ＨＤＬ−Ｃのグラフである。ｙ＝５．２８６１＋０．１４９９５ｘ、Ｒ²−０．３３５。図４（ｂ）は、従来技術方法（ラボ−Ａ）を使用するＴＣ対ＨＤＬ−Ｃのグラフである。ｙ＝４７．６４８＋０．０１２５６９ｘ、Ｒ２＝０．００１。図４（ｃ）は、従来技術方法（ラボ−Ｂ）を使用するＴＣ対ＨＤＬ−Ｃのグラフである。ｙ＝４６．５２２＋０．０１３１ｘ、Ｒ²＝０．０６。図５は、ＣＤの概略であり、ＬＳは、高強度の従来の光源又はレーザー源であり、Ｍ１及びＭ２は、全スペクトルデータに必要なモノクロメーターであり、Ｐは、線状に偏光する要素であり、Ｑは、円偏光要素であり、Ｓは、サンプルセルであり、Ｄは、検出器（３個までであろう）であり、そしてＲＥＣは、レコーダーである。図６は、４００ｎｍ−７００ｎｍの波長範囲にわたる全血清の吸収スペクトルのグラフである。図７（ａ）は、ＶＬＤＬ−Ｃサブフラクションに関する蛍光スペクトルのグラフである。図７（ｂ）は、ＬＤＬ−Ｃサブフラクションに関する蛍光スペクトルのグラフである。図７（ｃ）は、ＨＤＬ−Ｃサブフラクションに関する蛍光スペクトルのグラフである。図８（ａ）は、ＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション（シグマ）の従来の吸収スペクトルの第一（実線）及び第二（点線）の微分のグラフである。図８（ｂ）は、ＬＤＬ−Ｃサブフラクション（シグマ）の従来の吸収スペクトルの第一（実線）及び第二（点線）の微分のグラフである。図８（ｃ）は、ＨＤＬ−Ｃサブフラクション（シグマ）の従来の吸収スペクトルの第一（実線）及び第二（点線）の微分のグラフである。図９（ａ）は、血清Ａテストサンプルの第一（実線）及び第二（点線）の微分のグラフである。図９（ｂ）は、血清Ｂテストサンプルの第一（実線）及び第二（点線）の微分のグラフである。図１０は、３種のサンプルに関する吸収スペクトルのグラフであり、それぞれのサンプルに関する全コレステロールは、同様であったが、トリグリセリド（ＴＧ）レベルは、約３０ｍｇ／ｄＬ（曲線ａ）、約３０６ｍｇ／ｄＬ（曲線ｂ）及び約６３０ｍｇ／ｄＬ（曲線ｃ）から変化した。図１１ａ、１１ｂ及び１１ｃは、本発明（「ｓｐｅｃ」として示される）に従って分光測光活性な生成物により測定され、そして現在使用される手法（「ｅｎｚｙｍ」として示される）により測定される、３５種のテストサンプルにおける全コレステロール（ＴＣ）、ＶＬＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃ間の相関をそれぞれ示すグラフである。図１２ａ及び１２ｂは、本発明（「ｓｐｅｃ」として示される）に従って分光測光活性な生成物により測定され、そして現在使用される手法（「ｅｎｚｙｍ」として示される）により測定される、３５種のテストサンプルにおけるＨＤＬ間の相関を示すグラフである。図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃは、本発明（「ｓｐｅｃ」として示される）に従って分光測光活性な生成物により測定され、そして現在使用される手法（「ｅｎｚｙｍ」として示される）により測定される、数百種のテストサンプルにおけるＴＣ、ＬＤＬ及びＨＤＬ間の相関を示すグラフである。図１４ａ及び１４ｂは、本発明（「ｓｐｅｃ」として示される）に従って分光測光活性な生成物により測定され、そして現在使用される手法（「ｅｎｚｙｍ」として示される）により測定される、ＶＬＤＬ間の相関を示すグラフである。但し、サンプルはＴＧ＜４００ｍｇ／ｄＬを有し（図１４ａ）、そしてＴＧは４００−１０００ｍｇ／ｄＬであった（図１４ｂ）。図１５ａ及び１５ｂは、現在使用される手法（「ｅｎｚｙｍ」として示される）（図１５ａ）により測定され、そして本発明（「ｓｐｅｃ」として示される）（図１５ｂ）に従って分光測光活性な生成物により測定される、ＨＤＬ及びＴＧ間の逆の相関を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態本発明の以下の詳細な記述は、本発明の実施における助けとして提供される。ここに示される議論の多くは、テストサンプル中に存在するコレステロールサブフラクションの量及びＴＣを測定するための方法及び装置に関するが、しかし、本発明は、これらの議論により不当に制限されるものと考えてはならない。当業者は、ここに開示された試薬、試薬の比、反応条件及び装置が、本発明の趣旨又は範囲から離れることなく、変性できることを概して理解することから、これは真実である。以下の議論は、先ず、ここで使用される或る用語の解説を提供し、そして次にここに開示された本発明の方法を考慮し、さらにここに開示された方法を行うのに特に有用な新規な装置の議論により終わる。以下の用語の解説は、ここで使用される或る用語及び略称の使用について存在するかもしれない全ての曖昧さを除くために提供される。用語「ＣＤ装置」は、ここで使用されるとき、円二色性装置を意味する。これらの装置は、市販されているか、又は市販されているパーツから構築できる。さらに、図５は、ここに、いかにＣＤが働くかの簡単な概略図を提供するために含まれる。図５で分かるように、光源（ＬＳ）からの光は、線状偏光器（Ｐ）により線状に偏光され、次に円偏光器（Ｑ）により反対の方向に円状に偏光され、そして試料セル（Ｓ）を通って示され、吸収が検出器（Ｄ）により測定されると、反対に偏光された光ビームの吸収の差は、測定され、そして波長の関数としてプロットされて、ＣＤスペクトルを生じ、又は別に、予め選択された波長で記録される。用語「ＬＤＬコレステロール」（ＬＤＬ−Ｃと略称）は、ここで使用されるとき、低密度リポ蛋白コレステロールを意味する。用語「ＨＤＬコレステロール」（ＨＤＬ−Ｃと略称）は、ここで使用されるとき、高密度リポ蛋白コレステロールを意味する。用語「ＶＬＤＬコレステロール」（ＶＬＤＬ−Ｃと略称）は、ここで使用されるとき、非常に低い密度のリポ蛋白コレステロールを意味し、略称「（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃ」は、ここで使用されるとき、組み合わされたＶＬＤＬ−Ｃ及びLＤＬ−Ｃフラクションを意味し、そして用語「全コレステロール」（ＴＣと略称）は、ここで使用されるとき、テストサンプル中のコレステロールサブフラクションの合計、即ちＴＣ＝ＨＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃを意味する。用語「コレステロールサブフラクション」は、ここで使用されるとき、任意又は全てのＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃに関する。用語「Ｃｈｕｇａｅｖ試薬」は、ここで使用されるとき、Ｃｏｘ及びＳｐｅｎｃｅｒにより、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．２９、２１７（１９５１）に記載された試薬、又は塩化アセチル、塩化亜鉛及び酢酸の割合を変化することにより、又は塩化亜鉛／酢酸を塩化アセチル中の酢酸亜鉛で置換することにより、基本的な試薬の形態から誘導された試薬を意味する。用語「Cｈlｕｇａｅｖ反応生成物」は、ここで使用されるとき、コレステロールとＣｈｕｇａｅｖ試薬との反応生成物の１種以上の任意のものを意味する。本発明のＣｈｕｇａｅｖ反応生成物を形成するのにここで利用される「Ｃｈｕｇａｅｖ反応」は、Ｃｏｘ及びＳｐｅｎｃｅｒの上記の文献に論議され、そして光学的に活性な着色反応生成物を形成する、ステロイドの脱水及びＢ環の開裂を含むものと考えられる。用語「テストサンプル」、「臨床テストサンプル」又は「血清テストサンプル」は、ここで使用されるとき、全血テストサンプル、又は当業者に周知の手段（例えば、遠心力、濾過機構など）によりそれから除かれる細胞体を有する全血テストサンプルに関する。用語「分光測光吸収」は、ここで使用されるとき、光の偏光の状態に無関係に、特定の波長で着色された化合物により入射光の吸収（又は逆に、透過）の測定に関する。用語「分光測光吸収検出」は、ここで使用されるとき、入射又は吸収される光の偏光の状態に関することなく、種々の波長で光のそれらの吸収を測定することにより、テストサンプル中の分析物の検出及び定量を意味する。この場合の吸収は、テストサンプル中に存在する分析物の分子の数に比例する。用語「蛍光分光測光」は、ここで使用されるとき、異なる波長で入射光によるそれらの照射後の種々の波長で分析物により発せられた光の強度を測定することにより、テストサンプル中の分析物の検出及び定量を意味する。蛍光は、照射されたサンプル中の分析物の分子の数に比例する。用語「第一の微分分光測光」は、ここで使用されるとき、波長に対してプロットされた波長による吸収の変化の速度を計算することにより得られるスペクトルを記述する。用語「第二の微分分光測光］は、ここで使用されるとき、波長に対してプロットされた波長による第一の微分の変化の速度を計算することにより得られるスペクトルを記述する。用語「分光測光的に活性」又は「分光測光活性」は、ここで使用されるとき、分光測光的方法、例えば吸収分光測光、円二色性、蛍光分光測光、微分吸取分光測光などにより検出可能な性質又は特徴に関する。方法ＣＤ吸収、分光測光吸収検出、又は蛍光又は微分吸収分光測光法を使用するコレステロールフラクションの直接検出第一の態様では、本発明は、Ｃｈｕｇａｅｖ反応として、文献であるＣｏｘ及びＳｐｅｎｃｅｒ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．２９、２１７（１９５１）に記載された着色反応の導入に関する。Ｃｈｕｇａｅｖ反応を行うのに利用される試薬は、例えば氷酢酸中の２０％ｗ／ｖＺｎＣｌ₂及び９８％塩化アセチルである。これらの物質は、別々の容器に貯蔵でき、そしてたとえ約４０℃で貯蔵されても、多数の週間使用できるままであろう。その上、それらの乾燥の度合いは、注意深くコントロールされねばならないことはない。コレステロールとのＣｈｕｇａｅｖ反応の生成物は、色が赤がかったオレンジであり、そしてコレステロールの共役トリエンＣＤ活性誘導体であると考えられる。色の強度は、コレステロールの濃度の直接的な目安である。対照的に、コレステロール分析に関する周知の方法で使用される染料は、コレステロール酸化の二次的生成物であり、そしてコレステロール分子それ自体の誘導体ではない。それらは、従ってテストサンプル中に存在するコレステロール分子の数の間接的な目安である。所望ならば、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬の成分は、又約１：１−４：１のＺｎＣｌ₂ ／氷酢酸対９８％塩化アセチルの範囲に及ぶ比でともに貯蔵でき、それらの全ては、コレステロールとの満足できる反応を与えた。試薬は、褐色ガラス、テフロン又は同様な容器中で気密な条件下貯蔵されるとき、保持されねばならない。この点について、長期間の安定性は、少なくとも４週間褐色ビン中で４０℃でともに貯蔵された反応物について観察された。１：１−４：１の亜鉛試薬対塩化アセチルの比が利用されるとき、多量の沈殿物が生じ、それは、インキュベーション期間後遠心分離工程で必ずしも除去できないことが観察された。これは、光散乱からの寄与を有効に消去する２本のビームの吸収における差が測定されるので、ＣＤ検出において重大な問題ではないが、単一のビームの吸収検出方法（例えば、吸収検出、蛍光又は微分吸収分光測光）が使用されるとき、重大になりうる。この点について、本発明は、塩化アセチルが亜鉛試薬の過剰な量で使用される（例えば、氷酢酸中の２０％−２５％ｗ／ vＺｎＣｌ₂）とき、沈殿物による問題は、最低になる。最も好ましくは、塩化アセチルは、亜鉛試薬に対して多い相対的量で使用される。これらの好ましい比は、約４；１−１００；１に及ぶ。別に、酢酸亜鉛は、塩化アセチルに直接添加できる、例えば１．０ｍＬの塩化アセチル中の０．９５ｍｇの酢酸亜鉛二水和物である。第二の態様では、本発明は、コレステロールの分光測光的に活性な生成物を形成する方法に関し、それは、コレステロールと、コレステロールの分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とを接触することを含む。本発明のこの態様で特に有用な過塩素酸塩は、コレステロールと分光測光的に活性な生成物例えば着色生成物を形成するの有効であるものである。これらの過塩素酸塩は、亜鉛及び／又はバリウムを含むもの、例えば過塩素酸亜鉛又は過塩素酸バリウム、さらにこれらの水和された形を含むが、これらに限定されず、過塩素酸は、本明細書において便宜のために過塩素酸塩とされるが、又上記の混合物として使用できる。好ましい過塩素酸塩は、過塩素酸塩、例えば過塩素酸亜鉛水和物であり、最も特に過塩素酸亜鉛六水和物である。本発明のこの態様で特に有用なアシル化合物は、上記の過塩素酸塩と関連して、コレステロールと分光測光的に活性な生成物例えば着色生成物を形成するのに有効であるものである。この点について有用なアシル化合物は、式Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して低級アルキル、アリール、アルカリール、アルアルキル又はこれらの混合物である）を有する。ここで使用されるとき、低級アルキル基は、直鎖又は枝分かれ鎖の形態である６個までの炭素原子を含み、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、アミル、ペンチル、ヘキシルなどを包含する。好ましい低級アルキル基は、１−３個の炭素原子を含み、メチルが特に好ましい。アリール基は、６−１４個の炭素原子を含む芳香族環である。アリール基の例は、フェニル、ａ−ナフチル及びβ−ナフチルを含む。アルカリール基は、１６個までの炭素原子を含み、それぞれのアルキル基は、直鎮又は枝分かれ鎖の形態にある６個までの炭素原子を含み、そしてそれぞれのアリール基は、６−１０個の炭素原子を含む。好ましくは、それぞれのアルキル基は、１−３個の炭素原子を含む。アラルキル基は、１６個までの炭素原子を含み、それぞれのアリール基は、６ −１０個の炭素原子を含み、そしてそれぞれのアルキル基は、６個までの炭素原子を含み、直鎖又は枝分かれ鎖の形態にある。好ましくは、それぞれのアリール基は、６個の炭素原子を含み、それぞれのアルキル基は、１−３個の炭素原子を含む。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素及び沃素を含む。好ましいハロゲンは、塩素である。好ましい実施では、Ｒ¹は、ハロゲンであり、Ｒは、低級アルキル、アリール又はこれらの混合物である。特に好ましい実施では、Ｒ¹は、塩素であり、Ｒは、塩化アセチルを生ずるメチルであり、そして又は塩化ベンゾイルを生ずるフェニルであり、これらは、当業者が理解するように、或る毒性を生ずる。塩化アセチルは、最も好ましいアシル化合物である。過塩素酸塩及びアシル化合物の濃度は、当業者により決定できるように広い範囲内で変化できるが、もし約０．３−０．７モルの過塩素酸塩が、約９０−１００％のアシル化合物に存在するならば好ましく、さらに好ましくは、約９５−９９％のアシル化合物中の約０．５−０．６モルの過塩素酸塩、最も好ましくは、約９８％のアシル化合物中の約０．５モルである。この最後の濃度は、過塩素酸亜鉛六水和物及び塩化アセチルが使用されるとき、特に好ましい。一つの局面では、本発明は、テストサンプル中に存在するコレステロールの量を測定する方法に関する。テストサンプル中のコレステロールは、分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効な条件下コレステロールとの分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効な上記のアシル化合物及び過塩素酸塩と接触し、次に生成物の分光測光活性は、サンプル中に存在するコレステロールの量を求めて、決定される。。この点の分光測光的に活性な生成物は、従来の手法、例えば吸収分光測光、円二色性、蛍光分光測光又は微分吸収分光測光により検出できる。本発明を実施するのに、テストサンプル中のＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション中の全コレステロール及びその分布の直接且つ同時の定量測定を得ることができる。従って、本発明に従ってコレステロールとの分光測光的に活性な生成物を形成すると、生成物の分光測光的な活性が測定され、測定から、テストサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ，ＶＬＤＬ−Ｃ及び全コレステロールの量を計算する。重要なことは、方法は、短期間内に、外界条件例えばほぼ室温で約大気圧で、行うことができる。一つの態様では、生成物の分光測光的な活性が、約１５０−約７５０ｎｍの波長で分光測光的吸収により測定されるのが好ましく、さらに好ましくは、これらの測定は、コレステロールの主な部分が存在している種々のサブフラクションに対応する３種以上の異なる波長でなされる。選択された波長は、試薬及び条件例えばサンプルの容量、試薬の容量、インキュベーション温度、インキュベーション時間の選択が変わるとき、変化するだろうが、実際の値は、それらが当業者により容易に決定できるので、特定される必要はない。概して、例えば過塩素酸亜鉛六水和物及び塩化アセチルが使用されるとき、分光測光吸収の測定に関する適切な波長は、約４１０ｎｍ、約４５６ｎｍ、そして約５１８ｎｍである。これらの測定から、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃの量は、当業者に知られている算術的関係からサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃの量に吸収を相関させるアルゴリズムを解くことにより直接計算できる。それ故、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃの濃度は、以下に説明されるように、それぞれのフラクションに関する吸収の合計を与える三つの線状Ｂｅｅｒの法則の式からなるｎ・ｎマトリックス（例えば、ｎ＝３）を解くことにより計算できる。別に、アルゴリズムは、又以下に例示されそして当業者に普通に利用されるように、多変量回帰分析を利用でき、それは、特に、主成分分析、パターン認識分析又は偏最小二乗法分析の手法を含むことができる。重要なことは、本発明のこの局面では、ＴＣは、サブフラクションの合計により決められる。本発明の実施に当たって、分光測光的に活性な生成物が形成される速度は、以前に規定されたようなアシル化合物及び過塩素酸塩の組み合わせに変性剤を加えることにより、コントロールされる、即ち増大又は減少させられる。速度を減少させるのに有用な変性剤は、水、氷酢酸、クロロホルムなどの化合物並びにこれらの混合物を含む。一般に、速度を減少させるために、変性剤は、アシル化合物例えば塩化アセチルに基づいて約１０％ｖ／ｖより大きい濃度で存在する。速度を増大させるのに有用な変性剤は、ＨＣｌ、ＨＣｌＯ₄などの化合物及びこれらの混合物を含む。一般に、速度を増大させるために、変性剤は、アシル化合物例えば塩化アセチルに基づいて約１−２％ｖ／vの濃度で存在する。本発明のこの特別な態様の他の局面は化学試薬に関し、それは、分析物例えばコレステロールなどのリピド物質、例えばリポ蛋白、同化作用ステロイド又は他のステロイド生成物との分光測光的な活性な生成物を形成するのに有効な前記のアシル化合物及び過塩素酸塩を含む。Ａ．ＣＤを使用する直接法本発明でＣＤを使用するときの利点は、ＣＤが、テストサンプル中に存在する異なるコレステロールサブフラクション、即ち（ＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ）及びＨＤＬ−Ｃの量を測定するのに大きな特異性及び選択性をもたらすことである。しかし、欠点は、ＶＬＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃのレベルが、ＣＤを使用して直接分離できなかったことである。コレステロールとのＣｈｕｇａｅｖ反応からのオレンジ色の光学的に活性な生成物に関する完全なＣＤスペクトルは、図１に示される。サンプルは、ＮＢＳコレステロール標準参照物質（ＳＲＭ９１１ａ）のクロロホルム溶液である。このスペクトルは、全ての次の血清コレステロール測定に関する参照標準として使用される。ＣＤ吸収スペクトルでは、ＨＤＬ−Ｃ及び（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃフラクションは、異なるスペクトルハンドと組み合わされ、そしてＨＤＬ−Ｃを測定するための沈殿工程の必要なしに、同じ試料、図１から直接測定できる。この点について、５２５ｎｍでの測定は、組み合わされた（ＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ）フラクションについて結果を与え、そして３９０ｎｍでの測定（又は好ましくはそれぞれ３９０ｎｍ及び４７５ｎｍでの負及び正のＣＤ吸収ピークの代数合計）は、ＨＤＬ−Ｃフラクションについて結果を与える。ＨＤＬ−Ｃレベルを測定するとき、約３９０及び５７４ｎｍでＣＤ吸収ピークの高さの代数合計を決めることが好ましいと考えられる。それは、この方法が、約３９０ｎｍでのＣＤ吸収測定のみが使用される方法に対して、ＨＤＬ−Ｃについて得られる値に関して低い係数の変量を均一にもたらすからである。形成された方法による変量の減少は、基線のずれの効果が、二つのピークの代数合計が計算されるとき、少なくなる事実から生ずる。図１において、バンドの割り当ては、全コレステロールに関するＣＤスペクトル、図１の曲線（ａ）を、ホスホタングステート−Ｍｇによる低密度リピドフラクションの選択的沈殿後の同じサンプルに関する代数合計、即ち図１の斜線領域と比較することによりなされた。５２５ｎｍのバンドの最大は、ＮＢＳコレステロール（ＳＲＭ９１１ａ）を使用して較正された。３９０ｎｍの最大の較正は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙにより供給される二次ＨＤＬ− Ｃ較正物を使用してなされた。本発明の方法の一つを実施しそしてテストサンプル中のコレステロールフラクションの量を測定する例として、実施例１が提供される。実施例１（ａ）ＣＤ装置の較正：ＡＲグレードクロロホルム中の（ＳＲＭ９１１ａ）コレステロールの５×１０^-3溶液５０μＬ分を、仝量１０ｍＬのバイアルに入れる。２．００ｍＬの塩化亜鉛試薬を加え、そして混合物を注意深く振った。１．００ｍＬの塩化アセチルを注意して加え、混合物を振り、そしてバイアルに蓋をし、８分間６７℃でインキュベートした。バイアルを取り出し、水により迅速に冷却した。クロロホルム（１．００ｍＬ）を次に加えて、バイアル中の溶液の容積を増大させた。もしＣＤ分析器が２．００ｍＬのサンプルの容積を受容するか、又は別に、適切な溶媒が置換されるならば、このクロロホルムの添加は、所望ならば除く。溶液を次に１ｃｍの路長のセルに移し、ＣＤスペクトルを６２５ｎｍから３２５ｎｍに走らせる。スペクトルは、試薬混合物のみに関するスペクトルを減ずることにより、セルブランク及び装置の基線について毎日の基準で補正される。（ｂ）ＣＤスペクトルの較正：（ａ）のやり方が、テストサンプル中の血清コレステロールレベルの代表的な範囲と一致するように選ばれた多数の溶液濃度について繰り返される。得られる較正曲線から、（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃレベルに対して５２５ｎｍでの信号サイズに関する比例定数は、１００ｍｇ／ｄＬ当たり１．６２ミリ度である。３９０ｎｍにおける較正は、同じやり方でなされたが、純粋なコレステロールは、シグマＨＤＬ−Ｃ較正物により置換された。３９０ｎｍでのＨＤＬ−Ｃへの信号サイズは、１００ｍｇ／ｄＬ当たり２．０８ミリ度である。（ｃ）ＣＤによる臨床テストサンプルにおけるコレステロール測定：（ａ）におけるやり方が血清５０μＬ分について繰り返される。セルへ移される前に、試料は、２分間高速度で遠心分離される。（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃフラクションは、５２５ｎｍでの測定された信号の高さから計算され、そしてＨＤＬ−Ｃフラクションは、３９０ｎｍでの測定された信号の高さから計算される。それらの合計は、試料中の全コレステロールを与える。ＨＤＬ−Ｃフラクションを測定するために低密度フラクションの選択的沈殿は、従来の測定法で必要とされない。それ故、指のように少ない容積でコレステロール−リピドのプロフィールを行うことができ、そして低密度リピドフラクションの測定で得られる最良の正確さを得ることができる。試薬が（ａ）装置の較正に示される順序で添加できることを注意すべきである。しかし、それらは、又プレミックス溶液として同時に添加できるか、又はそれらは、逆の順序で添加できる、例えば塩化アセチルを先ず添加し、次にＺｎＣｌ₂ 試薬を添加する。試薬の添加の後者のモードは、テストサンプル中の沈殿の量を低下する予想されない効果を有し、それにより入射光の散乱を非常に低下させ、さらにそれによりＣＤ又は従来の分光測光吸収の何れかにより吸収の次の測定を単純化する。別のやり方は、酢酸亜鉛（氷酢酸中の塩化亜鉛の代わりに）及び塩化アセチルを含む試薬を使用することである。（ｄ）予備的な作業の結果：コレステロールの測定は、２箇所の異なる試験所により提供された血清サンプルについて行われ、それらは、それぞれＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ラボＡ）及びＤｕＰｏｎｔ（ラボＢ）により開発された従来の方法を使用する。全コレステロールレベルに関する相関は優秀であり、図２、そしてＬＳＰにより課された制限内に十分にある。この新しい方法が従来の方法より優れている改善であることを信じさせるための良いケースは、独立に処理された３種のデータのセットについて相関を比較することである。全コレステロール（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃのプロットは、全てのケースで線状であるが、両者の従来の方法（図３（ｂ）及び３（ｃ））についてｘ軸上の切片において約５０ｍｇ／ｄＬのバイアスが存在し、さらにこれらの同じデートのセット（図４（ｂ）及び４（ｃ））について全及びＨＤＬ−Ｃ間に零の相関が存在する。比較によるＣｈｕｇａｅｖ−ＣＤデータの相関は、低い相関の切片を有して優れており、図３（ａ）及び４（ａ）、そして相関のスロープは、これらのサンプルの集団について、ＨＤＬ−Ｃ及び（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）− Ｃフラクションに関する「平均」％は、それぞれ１５％及び８５％であり、それらは、超遠心分離データに基づくヒト血清分布について代表的であるとして通常受け入れられている値と良好な一致をすることを示している。従来知られている分光測光吸収方法に閏する相関のスロープは、統計的に可能ではなく、そして生ずるものである。それは、ＨＤＬ−Ｃに関する５０ｍｇ／ｄＬの事実上一定の測定された値が、（ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ）−Ｃに関する結果を得るために、測定されたＴＣ値から減じられるからである。（ｅ）正確さ及び分析時間：ＬＤＬ−Ｃ又はＶＬＤＬ−Ｃの何れについても市販の参照標準品が存在しないので、正確さは値を求めることができない。しかし、（ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ）−Ｃ測定における正確さ及び反復性は、±２％より良い。このレベルの正確さにより、食事及び／又は運動の変性を含んだ低下治療の研究におけるＬＤＬ−Ｃの変化と相関する一つの能力における信頼性は、意味をもって改善される。ＣＤ検出によるＣｈｕｇａｅｖ−ＣＤ法による単一の分析に関する大体の時間は、約１５分である。これは、ＴＣ測定にとってのみ使用される従来の吸収方法に長い間比較される一方、低い及び高い密度フラクションの両者に関する結果が、同時に得られる。色の安定性のために、所要時間は、一度に数種のサンプルをインキュベートすることによりかなり短縮できる。大きな入射光の強度により、サンプルの路長は、１ｃｍから減少され、そして測定は、自動化できる。上記に示されたもののようなやり方におけるＣｈｕｇａｅｖ試薬を利用することにより、数種のＮａｔｉｏｎａｌＢｕｒｅａｕｏｆＳｔａｎｄａｒｄｓＳＲＭ全コレステロール標準品も調べた。テストされた３種のサンプルは、（１９５１−１）（２１０．３６±２．４６ｍｇ／ｄＬ合計）、（１９５１−２）（２４２．２９±１．８３ｍｇ／ｄＬ合計）、及び（１９５１−３）（２８１．９７±１．８３ｍｇ／ｄＬ合計）としてＮＢＳカタログにリストされた。ＮＢＳＣｅｒｔｉｇｉｃａｔｅｏｆＡｎａｌｙｓｉｓによれば、血清は、ＣＤＣにより献血された。カッコ内の数値は、ＮＢＳにより測定されたものであり、そしてそれらは、変性されたＡｂｅｌｌ−Ｋｅｎｄａｌｌ法を使用してＣＤＣ測定と極めて良く比較される。二つのフラクション（ＨＤＬ−Ｃ及び（ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ）−Ｃ）に関するＣＤ吸収値を加えることにより、Ｃｈｕｇａｅｖ反応からわれわれが得た数値は、それぞれ２０６ｍｇ／ｄＬ、２４１．１ｍｇ／ｄＬ、及び２８６．６ｍｇ／ｄＬであった。これらの結果は、コレステロールレベルを直接且つ正確に測定するのに当たって本発明の方法の有効性を明らかに立証する。テストサンプル中のコレステロールサブフラクションのレベルを測定するのに本発明のＣＤ法の有効性をさらに立証するために、追加の実験データが表Ｉに提供される。表Ｉに示された実験結果について、ＨＤＬ−Ｃ（Ｃｈｕ）及びＨＤＬ−Ｃ（ｅｎＺ）法のそれぞれに関する２０個の値の内１２個が、１０ｍｇ／ｄＬ内に一致していることに注目すべきである。これらの結果は、本発明の方法の正確さを立証するのに明らかに助けとなる。Ｂ．分光測光吸収検出を使用する直接検出コレステロール又は血清コレステロールとのＣｈｕｇａｅｖ反応の着色生成物に関する可視の吸収スペクトルは、約５１８ｎｍの強い最大、約４６０ｎｍの最小を示し、４６０ｎｍ−３６５ｎｍの波長におけるショルダーは、かなり弱い吸収最大を示す（図６）。さらに、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬それ自体は、可視範囲で吸収し、そして３５０−３７０ｎｍ領域で弱い最大を有する。本発明の分光測光吸収検出法の有効性を確かめるために、別々のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、及びＬＤＬ−Ｃリポ蛋白フラクションのサンプルは、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｉｇｍａ；超濾過により分離されたフラクション）から、そしてＯｋｌａｈｏｍａＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＯＭＲＦ；超遠心分離により分離されたサブフラクション）から得られた。３種のサブフラクションは、別々にＣｈｕｇａｅｖ試薬と反応して、可視範囲において異なる吸収スペクトルを有する着色生成物を与えた。２種の異なる源からのフラクション間の特別な対応は、ＨＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃサンプルについて優れていた。ＶＬＤＬ−Ｃに関する対応も良好であった。サブフラクションのそれぞれの間のスペクトルの差は、３種のコレステロールサブフラクションをして選択性沈殿工程に頼ることなく、単一の実験で同時に定量的に測定させるのに十分である。この実験のために、吸収測定は、５１８、４５０及び４２０ｎｍでなされる。全てのテストサンプルの血清スペクトルは、それぞれのサブフラクションからのウエイトをつけられた寄与の集まりである。テストサンプル中に存在するそれぞれのコレステロールサブフラクションの量を計算する能力は、全ての３種のサブフラクションが分析された全ての波長で吸収されて、血清テストサンプルの全吸収Ａ_Tに関する一般式は、式Ｅ_HDL［ＨＤＬ］＋Ｅ_VLDL［ＶＬＤＬ］＋Ｅ_LDL［ＬＤＬ］＝Ａ_T により与えられる本発明者の最初の仮定による。上記の式で、Ｅ係数は、吸収／（ｍｇ／ｄＬ）の適切な単位で正規化された下付けのフラクションのそれぞれに関する吸収を示し、濃度［］は、ｍｇ／ｄＬである。上記の式を利用して、そしてそれぞれのサブフラクションが５１８ｎｍでの同じ又は実質的に同様な吸収係数を有するが、異なるスペクトルにより例示されるように、他の波長（この場合、４２０及び４５０ｎｍ）での異なる吸収係数を有するという他の仮定をして、スペクトル中の三つの異なる波長でＡ_T測定を採りそして得られる３・３マトリックス式を解くことにより、テストサンプル中に存在するそれぞれのサブフラクションの量を計算することができる。これを行うために、下付きのＥ係数に関する個々の値は、選択された３種の波長について測定されねばならない。異なる波長でのＥ係数に関する相対的値は、サブフラクションの任意の一つのスペクトル内で容易に得られた。これらを他のフラクションに関する相当する波長の値に関連することは、さらに困難であるが、達成されそしてここに開示される。この点において、約９０個の血清サンプルのスペクトル分析は、直接的な線状の相関が、５１８ｎｍで測定されたＡ_T値と、従来の方法（ＲｏｃｈｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌからのデータ）を利用した完全に独立した研究で測定された全コレステロール（ＴＣ）に関する値との間に存在することを示した。この線状の相関に基づいて、本発明者は、Ａ_T／ＴＣとして表される正規化した値が、サンプル間で一定でなければならないことを前提とした。Ｅ値を異なるサブフラクションに関するスペクトル間に相関するために、本発明者は、５１８ｎｍでのＡ_T／ＴＣ（又はＥ）値が、上記のように、全ての３種のサブフラクションについて同じであり、さらに３種のサブフラクションに関する残りの６種のＥ係数が、簡単な割合（例えば、Ｅ_LDL(420)＝Ａ_T(420)／Ａ_T(51 ₈₎ ×Ｅ_LDL(518)を使用して残りの二つの波長について計算できることを仮定する。上記の手法及び３・３マトリックスを利用して６０個の血清サンプルから計算された上記の３種のリポフラクションの量は、従来の反応のやり方を利用して同じテストサンプルについて得られる数と良く一致した結果をもたらした。優れた一致を与える６０個のサンプルを利用した特定のテストのやり方は、以下の通りであった。試薬が添加された後、混合物を６７℃で８分間インキュベートされ、その後水浴中で冷却され、遠心分離され、１ｃｍのセルに移され、そして７００ｎｍ−４００ｎｍの従来の吸収スペクトルをとった。吸収測定は、セルのブランク及び装置の基線に関する適切な補正をした後、５１８、４５０及び４２０ｎｍでとられた。吸収測定は予定された波長でのみ必要とされるので、全部のスペクトルを採る必要はない。吸収の単位、ｄＬ／ｇの上記の特別な実験条件下で得られた、それぞれ波長５１８、４５０及び４２０ｎｍにおける９個のＥ値は、以下の通りであった。ＨＤＬ−Ｃに関して３．０５、１．９７及び２．５２；ＶＬＤＬ−Ｃに関して３．０５、１．３５及び２．４１；そしてＬＤＬ−Ｃに関して３．０５、１．３１及び１．３４。Ｃｈｕｇａｅｖ試薬について、ＣＤ法が使用されるとき、存在しない吸収分光測光の使用に問題が生ずるかもしれない。特に、吸収検出分光測光方法がＣｈｕｇａｅｖ試薬沈殿とともに利用されるときは何時でも、問題を生ずる。これらの問題を完全に最低にするために、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬は、塩化アセチル対亜鉛試薬の比が、１００：１＝４：１であるか、又は酢酸亜鉛が塩化亜鉛／酢酸と置換されるかの何れかで、変性されるべきである。最終の亜鉛濃度は、０．０３−０．２２モルの間になければならない。これは、文献に記載された試薬とは遥かに異なる組成である。優れた吸収スペクトルが、２μＬのように少ない容積の血清について得られることを注意すべきである。同様に、優れたスペクトルは、一定の亜鉛濃度で１００：１−２０：１の一般的な広い範囲にわたって種々の塩化アセチル対血清比について、そして一定の血清の量で１００：１−４；１の塩化アセチル対亜鉛試薬について得られた。測定は、又全反応容積が０．１５ｍＬと少ないテストサンプルについてなされてきており、そして１ｍｍのように短い路長を有するセルでなされてきている。その上、２分のように短いインキュベーション時間は、より少ない全容積について達成され、そして血清濃度が比較的高い条件下で、低いインキュベーション温度が利用できることが十分に想像される。その上、適切な縮小化により、遠心分離は、排除できる。上記のＣｈｕｇａｅｖ試薬系に加えて、ＡＣＳ試薬グレードの酢酸亜鉛二水和物が、氷酢酸中の塩化物として加えられるとき、最終の亜鉛イオン濃度に類似した濃度で塩化アセチル中に溶解することを注意したい。塩化アセチル中の酢酸亜鉛は、それ故、所望ならば、単一の試薬系として働くことができる。例えば、もし１ｍＬのこの試薬系が１０μＬのテスト血清に添加されるならば、通常のインキュベーション条件後に赤みがかったオレンシの生成物が得られる。スペクトルの最大及び最小は、同じ波長であるが、これらのバンドの高さの比は、塩化亜鉛試薬により見られるのとは異なり、４２０及び４５０ｎｍでの吸収間の大きな差が予想されない発見である。その結果、新しいＥ係数は、もし酢酸亜鉛が酢酸中の塩化亜鉛とは異なってしようされるならば、３・３マトリックスについて計算される必要があるだろう。これらの波長での大きな差は、サブフラクションについて得られる値がより良い正確さであることを意味する。事実、係数は、試薬の組成に非常に依存し、そしてもし試薬成分の任意のものの量が変化されるならば、再計算されねばならない。しかし、この計算は、上記のものと一致し、そして現在の記述に基づいて、明らかに当業者の技能の中にある。上記の反応条件に対する広い範囲の別の反応条件は、赤みがかった色の生成物を生成し、それは、ここで利用される（上記のような）厳密な条件下で生成される物質の吸収スペクトルと同様であるが、必ずしも等しくないスペクトルを有する。たとえそうとしても、当業者が、ここに提示した３・３マトリックス方策と組み合わされたこれらの別の反応条件を利用し、存在するそれぞれのサブフラクションの量を計算するとき、彼らは、本発明者の現在開示した方法を実施している。たとえ、利用される九つのＥ係数が、使用される厳密な反応条件に基づいてサブフラクション（例えば、Ｓｉｇｍａ又はＯＭＲＦにより提供されるサブフラクション）のそれぞれの標準品に関するスペクトルの再較正後更正されねばならないとしても、これは真実である。それ故、本発明の分光測光方法は、着色反応生成物がコレステロールサブフラクションにより形成され、そしてそれぞれのサブフラクションの量が次に上記のやり方で測定される限り、全てのこれらの可能な試薬混合物及び試薬の比を明らかにカバーしていることは、想像される。上記の分光測光吸収方法は、臨床サンプル中のコレステロール及びコレステロールサブフラクションの同時且つオンライン検出に機会を提供する。本発明による分光測光吸収法の使用は、又ここに開示されたＣＤ法より遥かに大きな感度をもたらす。それは、入射光の極めて小さい部分がＣＤ信号の発生に使用されるに過ぎないからである。それ故、ここに開示された分光測光吸収法も、小さい容積のサンプルを使用させ、それにより他の物質により生ずる可能な干渉並びに反応により形成される沈殿の量を減少させる。しかし、逆に、これらの反応は、血液サンプルの溶血により放出される顔料からの干渉にＣＤより影響されやすい。最後に、上記のＣＤの研究によるように、先ず塩化アセチルのサンプルへ添加し、次にＺｎＣｌ₂／酢酸試薬への添加は、臨床サンプルにおいて沈殿により生ずる干渉をさらに減少させることに注意することは重要である。事実、全血サンプルを使用して本発明の方法における分光測光吸収反応を実施することができる。以下の表ＩＩにおいて、ここに開示された分光測光吸収／Ｃｈｕｇａｅｖ法及び示されたコレステロールサブフラクションに関する酵素法の両者を使用してテストサンプルにより得られた比較データが提供される。表ＩＩを見て分かるように、優れた結果が、ここに開示されたＣｈｕｇａｅｖ試薬／分光測光吸収法を使用して得られた（酵素法を使用して同じテストサンプルについて得られた結果を比較することにより立証されるように）。上記の考察に基づいて、新規な分光測光吸収検出法がここに提供され、この場合、臨床サンプル中のコレステロールサブフラクションは、ここに規定したようなＣｈｕｇａｅｖ試薬又はアシル化合物の何れかと過塩素酸塩試薬との系と反応させられて、コレステロールサブフラクションの直接測定がなされる。測定は、約１５０−７００ｎｍの範囲にわたる全スペクトル又は三つの選択された波長、この場合約４２０ｎｍ、４５０ｎｍ及び５１８ｎｍですることができる。吸収法及びＣＤ法の間の主な手続き上の差は、使用される標準品に関する。コレステロールそれ自体は、ＣＤ反応のための標準として使用できるが、ＣＤＣ、ＣＡＰ又は従来の源から得られるＴＣ及びコレステロールサブフラクションに関する臨床標準品は、吸収分光計を較正するのに使用されねばならない。上記の分光測光法に加えて、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃの「純粋な」サンプルの入手可能性があるとして、数学的なアルゴリズムは、もしそう望むならば、作成でき、それは、それぞれのサブフラクションについてウエイト付けのやり方でここのサブフラクションの分光測光吸収スペクトルを加えることができる。このやり方で、テストサンプルに関する仝吸収スペクトルが得られる。この方法を利用することは、まさに上記のような３個以上の異なる点の代わりに、無限の数の点で着色反応生成物の分光測光吸収を測定することに類似している。本発明の物質を実施し、それによりテストサンプル中のコレステロールの分光測光的に活性な生成物が、以前に規定したようなアシル化合物及び過塩素酸塩と接触することにより形成される例として、実施例２が提供される。実施例２実験条件試薬は、９８％塩化アセチル中の過塩素酸亜鉛六水和物［Ｚｎ（ＣｌＯ₄）₂・６Ｈ₂Ｏ］の０．５Ｍ溶液からなった。混合後、溶液を遠心分離して、殆どは恐らく未溶解ＺｎＯ（製造者により不純物であると予想されると報告されている）である懸濁した物質を除いた。試薬は、密栓した褐色ガラス容器に貯蔵されるとき安定であった。２０μＬ分の血清をガラス又はポリプロピレンバイアルに入れ、２ｍＬの試薬を注意深く加え、混合物を十分に振った。移動蛋白は、試薬の添加で沈殿し、遠心分離又は濾過の何れかにより迅速且つ容易に除かれた。上澄み液を、シールした１ｃｍの路長の分光測光セルに移し、１５分間室温で放置し、そのとき吸収スペクトルは、７５０−３８０ｎｍから測定された。使用した装置は、ダイオード配列分光測光計であったが、リピドプロフィール分析に関する必要なデータは、４種の波長のみを使用して得られ、その一つ（７００ｎｍ）は、サンプルの基線補正に使用された。他の波長は、４１０ｎｍ、４５６ｎｍ及び５１８ｎｍであった。サンプル中の全コレステロールに関する値は、主な最大で測定された吸収から測定され、それは、上記の実験条件下では５１８ｎｍで生じた。全コレステロールをして計算させる定数は、測定された吸収Ａ_T（５１８）及び従来の酵素法により測定される全コレステロール間の線状の相関のスロープから得られた。３種の主なフラクション、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃの濃度を計算する数学的やり方は、以前記述したのと同じであり、即ち、それぞれのフラクションに関する吸収の合計により与えられる３種の線状Ｂｅｅｒの法則の式からなる３×３マトリックスを解くことによりなされる。Ａ_T(i)＝Ａ_VLDL-C(i)＋Ａ_LDL-C(i)＋Ａ_HDL-C(i)（式中、ｉ＝１−３）。フラクションに関するそれぞれの用語Ａは、フラクションの濃度と係数Ｅの積、例えば、Ａ_LDL-C(i)＝Ｅ_LDL-C(i)・［ＬＤＬ−Ｃ］からなった。Ｅ値は、通常モル吸収として規定されるが、本明細書では、単位は、リピドのデータを報告するための標準であるｍｇ／ｄＬに転換された。９個の係数（３種の波長についてそれぞれのフラクションに関する一つ）が測定されることを要求した。これは、リピドフラクションについて入手できる参照標準品の周知のサンプルが存在しないので、正確に行うことができなかった。そのため、それらは、実験的にもたらされた。これは、従来の酵素法によりそして本発明の方法により測定された血清サンプルの大きなプールについてリピドパネルを比較することによってなされた。係数は、プールのサイズが拡大されて、全てのフラクションに関するデータの中で最も良く統計的に適合するように系統的に調節された。リピドプロフィール分析に関する結果は、表ＩＩＩに以下に示される。酵素は、ＲｏｃｈｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＫａｎｓａｓＣｉｔｙにより測定される独立的な結果に関し、分光測光は、ここに記載されたＣｈｕｇａｅｖ反応からの結果に関し、そして反応速度は、過塩素酸亜鉛六水和物及び塩化アセチルに使用からの結果に関する。実施例３この実施例では、過塩素酸亜鉛六水和物及び塩化アセチルは、実施例２に記載されたやり方に実質的に従ってテストサンプル中のコレステロールと接触されたが、この実施例中のコレステロールの計算は、実施例２で使用された３×３マトリックスの代わりに、多変量回帰分析によりなされた。インキュベーションは、外界温度で１５分間行われた。２０μＬの血清への２ｍＬ分の過塩素酸亜鉛六水和物／塩化アセチル試薬の添加により沈殿した蛋白を、遠心分離又は濾過により除いた。サンプルのバッチングは、約５分へテスト当たりの時間を短縮した。吸収測定：１ｃｍの路長を有するサンプルに関する全スペクトル（３５０−７５０ｎｍ）吸収データは、ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ８４５２Ａダイオード配列分光測光計で集められ、蓄積時間は５秒であった。ダイオード配列検出技術の速度及び都合の良さについて、波長の範囲は、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬を使用する方法について使用されるのより広かった。コンピュータ化：純粋な形のコレステロールリピドフラクションが入手できないので、何れも着色反応の個々の生成物に関するスペクトルではない。そのため、数学的なモデルが開発されて、全スペクトルを部分からの寄与に分解した。（ａ）３×３マトリックス溶液：実施例２では、吸収、Ａ_(i)は、三つの主な波長で測定され、そしてリピドプロフィールは、以下の形の三つの同時の式のセットを解くことにより計算された。Ａ_(i)＝Ｅ_VEDL(i)［ＶＬＤＬ］ｄ＋Ｅ_LDL(i)［ＬＤＬ］ｄ＋Ｅ_HDL(i)［ＨＤＬ］ｄ（式中、ｄはサンプル路長であった）。９個のＥ係数は、実験上のやり方で値を求めた。（ｂ）多変量回帰分折（ＭＶＲＡ）：この実施例におけるリピドプロフィール及びＴＣの結果は、単純化する想定及び研究者のバイアスを排除する、全吸収スペクトルを解釈するためのＭＶＲＡ手法を使用して求められた。適用されるＭＶＲＡアルゴリズムは、市販のパッケージＵＮＳＣＲＡＭＢＬＥＲＩＩ（ＣＡＭＯＡ／Ｓ、Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ、Ｎｏｒｗａｙ）で利用できる分光測光分折用のソフトウエアを使用して、偏最小二乗２（ＰＬＳ２）及び三成分分析（ＰＣＡ）であった。分光測光計のスペクトル分解は、２ｎｍであり、実施例２の簡単な分析に比べて自由度の数で大きな増加をもたらした。トレーニングセット：分折モデルは、市販の酵素手法によりそのリピドプロフィールが測定された３５種の血清サンプルからなるトレーニングセットを編集することにより作成され、ＶＬＤＬ−Ｃはここでは０．２×ＴＧとしてとられ、ＬＤＬ−Ｃの数は、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式を使用して計算された。値の範囲は、アクセスが可能な限り広くし、即ちＶＬＤＬ−Ｃでは８−８０ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−Ｃでは８５−２２２ｍｇ／ｄＬ、そしてＨＤＬ−Ｃでは２０−８０ｍｇ／ｄＬであった。ＰＬＳ２及びＰＣＡの両方のアルゴリズムを使用して、これら３５種のサンプルに関するスペクトルデータに適した好適なものは、３種のファクターを使用して得られた。観察された％残留分散は、第一のファクターのみでは２５％であり、３種全てでは０．０５％より小さかった。どんな補正もノイズ又はバックグラウンドについてなされず、どんなウエイト付け補正も導入されなかった。全スペクトル分折が実際に必要かどうかを決めるためのテストとして、ＭＶＲＡサブルーチンが使用されて、最適の波長、即ちそれぞれのフラクションの量における分散に最も感度の強いものを同定した。別なモデルは、それぞれ１００、３０、１４、６及び４点の波長に制限された減少されたデータのセットを使用して作成された。６点を有するモデルにより％残留分散において殆ど差は見られず、そして４点は、適合の質において殆ど損失なしに使用できた。この実施例のために、吸収は、６点の波長で測定された。サンプル予想：上記の分折モデルは、通例のＴＧと高いＴＧレベルとの間に殆ど等しく分れた数百のサンプルについてリピドプロフィールを予想するのに使用された。方法間の比較のための全リピドプロフィールデータの主な源は、市販の酵素手法を利用したＲｏｃｈｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＫａｎｓａｓＣｉｔｙであった。ＨＴＧのための主な源は、ＳｔｉｌｌｗａｔｅｒＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒであった。後者については、ＴＣ及びＴＧレベルのみが報告された。分光測光的に活性な生成物の形成は、正確に同じやり方でＨＴＧサンプルについて行われ、同じモデルがそれらを含むために外挿できるものと考えられた。初めのトレーニング生成物の３５個の内４個が、ＨＴＧサンプルであった。これらの４個について、ＴＧレベルは、４００ｍｇ／ｄＬより僅かに上であり、ＨＤＬ値は測定され、リピドプロフィールは計算された。この処理において、フラクションに関する値は、直接求められ、そしてＴＣは、それらの合計から計算された。従って、酵素法とは異なり、ＴＣは、実験的に測定されなかった。吸収スペクトル：１個の通例及び２個のＨＴＧ血清サンプルからの着色生成物に関するスペクトルの比較は、図１０に示される。全ての３個は、酵素的に測定されたとき、約１８６ｍｇ／ｄＬのＴＣを有した。リピドフラクションの中の区別のためのスペクトルの重要な部分は、約３６０−約４８０ｎｍの範囲にあった。トレーニングセット：図１１で分かるように、方法の間のＶＬＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＴＣに関する非常に良好な線状の相関は、トレーニングセットについて得られた。図１２で分かるように、ＨＯＬ−Ｃに関する線状の相関は、殆ど良好でなかったが、それはＣｈｕｇａｅｖ試薬法よりも改善したことを示した。一対のｔ−テストからの結果は、相関が存在したことを示唆し、そしてこの相関が、図１２で示されるように６５％の信頼領域により画かれる二変数の長円の形により与えられることを支持することを立証し、それは、Ｘ及びＹの正規分布について、６５％は、長円内にあるだろうことを意味した。予想：通例のサンプル：図１３（ａ）に示されるように、ＴＣに関する方法間の線状の相関は優れていた。範囲は、約５８−約５００ｍｇ／ｄＬであり、そして図は、通例のサンプルとともにＨＴＧに関するデータを含んだ。これは、ＴＣが一つの方法で測定されそして他の方法で計算されるために、有意であり、それは、スペクトル解釈について使用されるＭＶＲＡモデルを有効にした。図１３（ｂ）に示されるように、方法間の線状の相関は、又ＬＤＬ−Ｃフラクションについて非常に強く、それは、本発明の直接的な方法によるＬＤＬ−Ｃの測定が信頼できることを示唆した。図１３（ｃ）に示されるように、ＨＤＬ−Ｃの相関は、それがトレーニングセットについてよりも僅かに悪いことであった。約４００ｍｇ／ｄＬより小さいＴＧを有するサンプルに関するＶＬＤＬ−Ｃの相関は、図１４（ａ）に示されるように、良好であった。ＨＴＧサンプル：約３６０−約４３０ｎｍの範囲の吸収は、ＴＧが増大すると劇的に増大した。３６０ｎｍでの最大の吸収の増大が、図１０に示されるようにＴＧの量とともに線状でないことは、明らかであった。線状の依存性は、もしバンドがＶＬＤＬ− Ｃへ完全に割り当てられそして近似ＶＬＤＬ−Ｃ＝０．２ＴＧがＨＴＧサンプルにとり真実であるならば（それはそうでなかった）、予想されるだろう。リピドプロフィールに関する意味のある結果は、ＴＧレベルが２０００ｍｇ／ｄＬのように高いとき、ＨＴＧサンプルについて得られた。４００−１０００ｍｇ／ｄＬでは、ＶＬＤＬ−Ｃ／ＴＧの比は、０．１から０．１２に減少することが分かり、それは、図１４（ｂ）に示されるように、ＶＬＤＬ−Ｃ（ｓｐｅｃ）対ＴＧのプロットで観察された曲線で明らかである。これは、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ式が、ＶＬＤＬ−Ｃ＝０．２×ＴＧでは、高いＴＧレベルで当てはまらない事実と一致した。ＨＤＬ−Ｃ及びＴＧ間の逆相関が、暗示されてきた。ＶＬＤＬ−Ｃの日常的な測定が０．２×ＴＧに制限され、そしてＴＧ値がＴＧ＝４００ｍｇ／ｄＬより小さい限り、補正は、明らかでなかった。図１５に示されるように、ＨＴＧサンプルに関するＶＬＤＬ−Ｃデータを加えることは、関係を強調した。Ｃ．蛍光及び微分吸収分光測光法を使用する直接検出Ｃｈｕｇａｅｖ試薬とのコレステロールの反応の生成物は、蛍光を有する。さらに、３種のリポ蛋白サブフラクションＶＬＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ− Ｃに関する蛍光スペクトルは、互いに異なり、血清サンプルに関するスペクトルから異なる（図７（ａ）、７（ｂ）及び７（ｃ）参照）。血清テストサンプル中に存在するサブフラクションのそれぞれの量を計算する、蛍光データの数学的分析は、従来の吸収検出分光測光法に関する上記のそれに完全に等しい。計算を開始するのに要求される全てのことは、どんな３種の波長が、血清に関する蛍光スペクトルで選択されても、９個の蛍光係数である。この点において、蛍光に関する最大及び最小の波長が、より長い波長で生ずるので、従来の吸収分光測光法で利用されるものとは異なる波長が必要とされる。同様に、微分吸収分光測光法も利用されて、テスト血清サンプル中に存在するコレステロールサブフラクションの量を計算できる。例えば、吸収スペクトルの第一及び第二の微分は、分析の測定に利用できる。３種のリポ蛋白サブフラクションのそれぞれに関する微分吸収スペクトルのコピーは、図８に示される。図８（ａ）は、ＶＬＤＬ−Ｃに関する第一及び第二の微分を示し、図８（ｂ）は、ＬＤＬ−Ｃに関する第一及び第二の微分を示し、そして図８（ｃ）は、ＨＤＬ−Ｃに関する第一及び第二の微分を示す。図８（ａ）−８（ｃ）のそれぞれにおいて、実線は、吸収スペクトルに対する第一の微分を示し、そして点線は、吸収スペクトルに対する第二の微分を示す。グラフ８（ａ）−８（ｃ）を得るのに利用されるサブフラクションのそれぞれは、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙから得られた。微分吸収分光測光法を利用するとき、微妙な差が、フラクションのそれぞれに関するスペクトル間に存在する。又、数学的分析は、吸収検出及び蛍光分光測光法について上記のそれと完全に類似である。しかし、３個の新しい波長を選ぶ必要があるだろう。バンドの最大での信号強度は、他の方法より遥かに良く分かれており、そして正確さは、そのため増大する。血清サンプルに関する二つの測定（図９（ａ）及び９（ｂ）参照）では、二つの主なバンドに関するピークからピークの高さは、ＴＣに直接比例していることが分かった。微分分光測光法を利用するデータ採集は、全スペクトル分析の使用を必要とする。本発明の装置：上記の方法のセクションをレビューして、本発明の方法は、テストサンプル中のコレステロールレベルを測定する現在周知の方法と比較するとき、多くの利点を有するこどが容易に確かめられる。しかし、本発明は、又新規な装置を包含し、それは、当業者をして本発明の方法を実施させる。これらの装置は、上記に概説される（「発明の開示」と題したセクション参照）。ここに包含される分光測光装置は、約３６０−７００ｎｍの範囲に及ぶか又はそこの別々な点例えば約５１８ｎｍ、４５０ｎｍ及び４２０ｎｍで、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬の着色生成物の吸収を測定できる１個以上の分光測光吸収検出器を備えなければならない。もし自動化されているならば、それは、又分析のための別のサンプル容器へ試薬を添加する能力、又は次々に試薬の成分を加えて蛋白の沈殿による問題を最小にする能力を有しなければならない。最後に、任意のこの吸収分光測光計は、手動でも自動でも、好ましくは、得られる吸収値から計算又はコンピュータにより、血清テストサンプルに存在するそれぞれのサブフラクションのレベルを測定する手段を有するべきである。特に、装置は、存在するＶＬＤＬ −Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃのレベルを確立するために、そしてこれらの値を使用してサンプルに存在するＴＣを計算するために、９個の予めプログラムされた定数により、３・３マトリックスの結果を計算する能力を有すべきであるか、又は別に、これらのレベルを確立するために多変量回帰分析を使用する能力を備えなければならない。３・３マトリックスが３種のサブフラクションを測定できる最小を表示することを注意すべきである。試薬により生成されるスペクトルの細かい分析が、他の特定の波長での定数が有用な情報、例えば種々のサブフラクション内の特定の分子物に関する情報を提供することを示すことができる。その場合、装置は、３・３より大きいマトリックスを分析するように構築されるべきである。実施例４本実施例は、アシル化合物及び過塩素酸塩を使用する反応の速度をコントロールするための変性剤の使用を記述している。反応速度をコントロールするための試薬の変性：塩化アセチル及び過塩素酸亜鉛六水和物を使用する試薬及び着色反応の速度は、以下のやり方で変性剤を使用することにより早めたり、遅らせたりできる。（ａ）２種以上のファクターによる速度の低下は、水又は氷酢酸又はクロロホルムの何れかを１０％ｖ／ｖより多いレベルで塩化アセチルに添加するとき、観察された。水は、混合熱のために非常に注意して加えるべきである。２０％より大きいレベルの水で、青色の溶液が、蛋白との反応により生成した。５０％クロロホルムで、試薬は不混和性であった。速度は、添加された溶剤について適切なモルフラクションを選択することにより、コントロールされた。任意のこれらの溶剤の添加による２５℃での反応の遅延は、もし３７℃の温度が反応に好ましいならば、有利に使用できる。（ｂ）速度の増加は、強酸（ＨＣｌ又はＨＣｌＯ₄）が１．２％ｖ／ｖの量で添加されるとき、観察された。又、水性酸を加えるとき、大きな注意をすべきである。１０分後のスペクトルは、１５分後の未変性試薬のそれと同じであったが、酸混合物に関するスペクトルは、次の５分にわたってかなり変化し、それ故条件をより注意深くコントロールすることが必要であろう。過塩素酸亜鉛六水和物は、塩化アセチルに容易に溶解し、試薬は、外界条件でシールされた容器内で比較的長い貯蔵期間を有する。貯蔵期間は、試薬が冷蔵庫中で貯蔵されたとき、延長された。或る市販生成物では、わずかな量の不溶性物質が残る。これは、遅い速度の遠心分離により容易に除かれ、この試薬に関するデータは、過塩素酸亜鉛か完全に溶解したデータと正確に比較された。２５℃の温度の測定では、やり方は、２０−５０μＬ分の血清と２ｍＬの変性された単一の試薬との十分な混合、沈殿した蛋白を除くための混合物の遠心分離(又は波過) 、並びに測定を必要とした。生成物の可視スペクトルは、時間とともに変化し、そして反応は、１５分後約９５−９８％完了し、そのとき、吸収スペクトルは、試薬ブランクに対して７００−４００ｎｍで測定された。１５分後の着色生成物に関するスペクトルは、塩化亜鉛（変性されたＣｈｕｇａｅｖ）試薬について観察されたのと類似であり、最小及び第二の最大の波長に僅かな青のシフトが存在する。３種の主なリポ蛋白中のＴＣ及びその分布の計算は、前記と全く同じやり方でなされ、例えば、線状のＢｅｅｒの法則式の３×３マトリックスは、３個の異なる波長、５１８、４５６及び４１０ｎｍについてなされる。試薬のブランク及び装置の基線は、７００ｎｍで測定された。吸収係数は、前記のように実験的に決められ、先ず全ての３種のフラクションが５１８ｎｍで同じモル吸収を有するものとし、次に５１８ｎｍでそれぞれの吸収の比を求める。ＶＬＤＬ−Ｃについて、現在調節された係数は、２．７０、２．９０であり、ＬＤＬ−Ｃでは、それらは２．７０、１．１５及び１．２０であり、ＨＤＬ−Ｃでは、それらは、２．７０、１．２５及び２．３０である。本発明は以上のように記述されたが、それは、多くのやり方で変化できることは明白であろう。これらの変化は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱するものとみなしてはならず、そして当業者に明らかなような全てのこれらの変性は、請求の範囲内に含まれることを目的とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/52 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/52 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．コレステロールの分光測光的に活性な生成物を形成する方法において、コレステロールと、該コレステロールの分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とを接触させることを含む方法。２．該コレステロールは、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション中に分布している請求項１の方法。３．該過塩素酸塩は、亜鉛、バリウム、過塩素酸又はこれらの混合物を含む請求項１の方法。４．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛六水和物である請求項３の方法。５．該アシル化合物は、式Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して低級アルキル、アリール、アルカリール、アルアルキル又はこれらの混合物である）を有する請求項１の方法。６．Ｒ¹は、ハロゲンであり、Ｒは、低級アルキル、アリール又はこれらの混合物である請求項５の方法。７．Ｒ¹は、塩素であり、Ｒは、メチルである請求項６の方法。８．該過塩素酸塩が、約９０−１００％のアシル化合物中約０．３−０．７モルの濃度で存在する請求項３の方法。９．該過塩素酸塩が、約９５−９９％のアシル化合物中約０．４−０．６モルの濃度で存在する請求項８の方法。１０．該過塩素酸塩が、約９８％のアシル化合物中約０．５モルの濃度で存在する請求項８の方法。１１．該過塩素酸塩が、過塩素酸亜鉛六水和物であり、該アシル化合物が塩化アセチルである請求項１０の方法。１２．前記の分光測光的に活性な生成物が着色生成物である請求項１の方法。１３．テストサンプル中に存在するコレステロールの量を求める方法において、コレステロールが存在するテストサンプルと、該コレステロールと分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とを接触させ、そして該分光測光活性を測定して該サンプル中に存在する該コレステロールの量を求めることを含む方法。１４．該コレステロールは、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション中に分布している請求項１３の方法。１５．該過塩素酸塩は、亜鉛、バリウム、過塩素酸又はこれらの混合物を含み、該アシル化合物は、式Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して低級アルキル、アリール、アルカリール、アルアルキル又はこれらの混合物である）を有する請求項１４の方法。１６．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛水和物であり、Ｒ¹は、ハロゲンであり、Ｒは、低級アルキル、アリール又はこれらの混合物である請求項１５の方法。１７．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛六水和物であり、該アシル化合物は、塩化アセチルである請求項１６の方法。１８．該過塩素酸塩が、約９０−１００％のアシル化合物中約０．３−０．７モルの濃度で存在する請求項１５の方法。１９．該過塩素酸塩が、約９５−９９％のアシル化合物中約０．４−０．６モルの濃度で存在する請求項１８の方法。２０．該過塩素酸塩が、約９８％のアシル化合物中約０．５モルの濃度で存在する請求項１９の方法。２１．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛六水和杓であり、該アシル化合物は、塩化アセチルである請求項２０の方法。２２．分光測光的に活性な生成物は、円二色性、吸収分光測光、蛍光分光測光、又は微分吸収分光測光による検出が可能である請求項１３の方法。２３．該分光測光活性は、約１５０−約７５０ｎｍの間の波長で該生成物の吸収スペクトルを測定することにより値を求められる請求項１３の方法。２４．テストサンプル中の全コレステロール並びにＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション中のその分布の直接且つ同時の定量測定方法において、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション中に分布するコレステロールを含むテストサンプルと、該コレステロールとの分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とを接触させ、該生成物の分光測光吸収を測定し、そして該吸収測定から、テストサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及び全コレステロールの量を計算することを含む方法。２５．該過塩素酸塩は、亜鉛、バリウム、過塩素酸又はこれらの混合物を含み、該アシル化合物は、式Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して低級アルキル、アリール、アルカリール、アルアルキル又はこれらの混合物である）を有する請求項２４の方法。２６．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛水和物であり、Ｒ¹は、ハロケンであり、Ｒは、低級アルキル、アリール又はこれらの混合物である請求項２５の方法。２７．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛六水和物であり、該アシル化合物は、塩化アセチルである請求項２６の方法。２８．該過塩素酸塩が、約９０−１００％のアシル化合物中約０．３−０．７モルの濃度で存在する請求項１５の方法。２９．該過塩素酸塩が、約９５−９９％のアシル化合物中約０．４−０．６モルの濃度で存在する請求項２８の方法。３０．該過塩素酸塩が、約９８％のアシル化合物中約０．５モルの濃度で存在する請求項２９の方法。３１．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛六水和物であり、該アシル化合物は、塩化アセチルである請求項３０の方法。３２．該生成物の該分光吸収は、約１５０−約７５０ｎｍの間の波長で測定される請求項２４の方法。３３．該生成物の該分光吸収は、約１５０−約７５０ｎｍの間の３個又はそれ以上の波長で測定される請求項３２の方法。３４．該生成物の該分光吸収は、約４１０ｎｍ、約４５６ｎｍ、及び約５１８ｎｍの波長で測定される請求項３３の方法。３５．該サンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃの量は、該テストサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃの量に該生成物の分光測光吸収を相関させるアルゴリズムを解くことにより求められる請求項３３の方法。３６．該サンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃの量は、ｎ・ｎマトリックス（但し、ｎは、該生成物の分光測光吸収が測定される異なる波長の数である）を解くことにより求められる請求項３５の方法。３７．ｎは３である請求項３６の方法。３８．該アルゴリズムは、多変量回帰分析を含む請求項３５の方法。３９．該多変量回帰分析は、主成分分析、パターン認識分析又は偏最小二乗法分析を含む請求項３８の方法。４０．前記の分光測光的に活性な生成物が形成される速度は、該アシル化合物及び該過塩素酸塩への変性剤の添加によりコントロールされる請求項２４の方法。４１．該速度が低下し、該変性削が水、氷酢酸、クロロホルム又はこれらの混合物である請求項４０の方法。４２．該速度が増加し、該変性剤がＨＣｌ、ＨＣｌＯ₄又はこれらの混合物である請求項４０の方法。４３．該変性剤が、該アシル化合物に基づいて約１０％ｖ／ｖより大きい濃度で存在する請求項４１の方法。４４．該変性剤が、該アシル化合物に基づいで約１−２％ｖ／ｖより大きい濃度で存在する請求項４２の方法。４５．分析物と分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩を含む化学試薬。４６．該分析物がコレステロールであり、前記の分光測光的に活性な生成物が、円二色性、吸収分光測光、蛍光分光測光、又は微分吸収分光測光による検出が可能である請求項４５の試薬。４７．該過塩素酸塩は、亜鉛、バリウム、過塩素酸又はこれらの混合物を含み、該アシル化合物は、式Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して低級アルキル、アリール、アルカリール、アルアルキル又はこれらの混合物である）を有する請求項４５の試薬。４８．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛水和物であり、Ｒ¹は、ハロゲンであり、Ｒは、低級アルキル、アリール又はこれらの混合物である請求項４７の試薬。４９．該過塩素酸塩は、過塩素酸亜鉛六水和物であり、該アシル化合物は、塩化アセチルである請求項４８の試薬。５０．該過塩素酸塩が、約９０−１００％のアシル化合物中約０．３−０．７モルの濃度で存在する請求項４５の試薬。５１．該過塩素酸塩が、約９５−９９％のアシル化合物中約０．４−０．６モルの濃度で存在する請求項５０の試薬。５２．該過塩素酸塩が、約９８％のアシル化合物中約０．５モルの濃度で存在する請求項５１の試薬。５３．前記の分光測光的に活性な生成物が形成される反応の速度をコントロールする変性剤をさらに含む請求項４５の試薬。５４．該速度が低下し、該変性剤が水、氷酢酸、クロロホルム又はこれらの混合物である請求項５３の試薬。５５．該変性剤が、該アシル化合物に基づいて約１０％ｖ／ｖより大きい濃度で存在する請求項５４の試薬。５６．該速度が増加し、該変性剤がＨＣｌ、ＨＣｌＯ₄又はこれらの混合物である請求項５３の試薬。５７．該変性剤が、該アシル化合物に基づいて約１−２％ｖ／ｖより大きい濃度で存在する請求項５６の試薬。５８．テストサンプル中のＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃサブフラクション中の全コレステロール及びその分布の直接且つ同時の定量測定のための分光測光計において、分光測光的に活性な生成物を形成するのに有効なアシル化合物及び過塩素酸塩とテストサンプル中のコレステロールとを接触することにより形成される該生成物の分光測光的活性を測定するための手段、並びに該分光測光的活性から該テストサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ− Ｃ及び全コレステロールの量を求めるための手段を含む分光測光計。５９．測定するための該手段は、約１５０−約７５０ｎｍの間の波長で該生成物の分光測光吸収を測定する能力を含む請求項５８の分光測光計。６０．測定するための該手段は、約１５０−約７５０ｎｍの間の３個又はそれ以上の波長で該生成物の分光測光吸収を測定する能力を含む請求項５９の分光測光計。６１．該吸収は、約４１０ｎｍ、約４５６ｎｍ、及び約５１８ｎｍの波長で測定される請求項６０の分光測光計。６２．該テストサンプル中に存在する全コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ− Ｃ、及びＶＬＤＬ−Ｃの量を求める該手段は、該サンプル中に存在する全コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、及びＶＬＤＬ−Ｃの量に該生成物の分光測光話性を相関させるアルゴリズムを解く請求項５８の分光測光計。６３．測定するための該手段は、ｎ・ｎマトリックス（但し、ｎは、該生成物の分光測光活性が測定される異なる波長の数である）を解く請求項６２の分光測光計。６４．ｎが３である請求項６３の分光測光計。６５．該アルゴリズムは、多変量回帰分析を含む請求項６２の分光測光計。６６．該多変量回帰分折は、主成分分析、パターン認識分析又は偏最小二乗法分析を含む請求項６５の分光測光計。６７．該テストサンプルへ該アシル化合物及び該過塩素酸塩を添加する手段をさらに含む請求項５８の分光測光計。６８．テストサンプル中に存在するコレステロールレベルを測定する検出装置において、第一の波長又は別に第一及び第二の波長でＣＤ吸収によりテストサンプル中に存在するＨＤＬコレステロールの量を測定する手段、第三の波長でＣＤ吸収により該サンプル中に存在するＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロールの量を測定する手段、及びテストサンプル中に存在する全コレステロールの量を測定する手段からなる検出装置。６９．テストサンプル中の全コレステロールの量が、計算又はコンピュータ処理により求められる請求項６８の検出装置。７０．テストサンプル中の全コレステロールの量が、第三の波長での分光測光吸収により求められる請求項６８の検出装置。７１．テストサンプル中のコレステロールレベルを測定するための検出装置において、或る波長での分光測光吸収によりテストサンプル中に存在する全コレステロールの量を測定するための手段、同じ波長でのＣＤ吸収サンプルによりテスト中に存在するＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃの量を測定するための手段、及びテストサンプル中に存在するＨＤＬコレステロールの量を測定するための手段からなる検出装置。７２．サンプル中のＨＤＬコレステロールの量が、計算又はコンピュータ処理により求められる請求項７１の検出装置。７３．サンプル中のＨＤＬコレステロールの量が、ＣＤ吸収により求められる請求項７１の検出装置。７４．テストサンプル中のコレステロールレベルを測定するための分光測光検出装置において、第一の波長でテストサンプル中のＴＣの量を直接測定するための分光測光吸収手段、第二の波長でテストサンプル中のＨＤＬ−Ｃの量を直接測定するための分光測光吸収手段、及びテストサンプル中のＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃの合わせた量を計算又はコンピュータ処理するための手段からなる装置。７５．第三の波長でテストサンプル中のＶＬＤＬ−Ｃの量を直接測定するための分光測光吸収手段、及びテストサンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を計算又はコンピュータ処理するための手段をさらに含む請求項７４の分光測光装置。７６．塩化アセチル、塩化亜鉛及び酢酸を含む化学試薬において、試薬がＣＤ、吸収分光測光、又は蛍光分析により検出できる分析物の着色誘導体を形成するのに有用である試薬。７７．亜鉛が、０．０３−０．２２モルの最終濃度で試薬中に存在する請求項７６の試薬。７８．塩化アセチル及び酢酸亜鉛を含む化学試薬において、試薬がＣＤ、吸収分光測光、又は蛍光分析により検出できる分析物の着色誘導体を形成するのに有用である試薬。７９．亜鉛が、０．０３−０．２２モルの最終濃度で試薬中に存在する請求項７８の試薬。８０．テストサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及び全コレステロールのレベルを求めるための分光測光計において、約１５０−７００ｎｍの範囲内の３個又はそれ以上の異なる波長で、Ｃｈｕｇａｅｖ試薬とテストサンプル中のコレステロールとの反応により形成される着色反応生成物の分光測光吸収を測定するための手段、及び３桐又はそれ以上の波長で該反応生成物の分光測光吸収に基づいて、テストサンプル中に存在する該ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及び全コレステロールのレベルを求めるための手段からなる分光測光計。８１．分光測光計がＣｈｕｇａｅｖ試薬をテストサンプルに加えるための手段をさらに含む請求項８０の分光測光計。８２．テストサンプル中に存在する該ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及び全コレステロールのレベルを求めるための手段が、３偏又はそれ以上の波長で該反応生成物の分光測光吸収の第一の微分をコンピュータ処理することを含む請求項８０の分光測光計。８３．テストサンプル中に存在する該ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及び全コレステロールのレベルを求めるための手段が、３個又はそれ以上の波長で該反応生成物の分光測光吸収の第二の微分をコンピュータ処理することを含む請求項８０の分光測光計。