JPH09504805A

JPH09504805A - 活性ヌクレオシドホスホラミダイト、その製法及びその使用

Info

Publication number: JPH09504805A
Application number: JP8508818A
Authority: JP
Inventors: パラメスワラレッディー、エム; ファローキ、ファーダス
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1995-08-18
Publication date: 1997-05-13
Also published as: CA2174216A1; AU688577B2; EP0725787A1; AU3369295A; US5574146A; WO1996006853A1

Abstract

(57)【要約】下記一般式（Ｉ）（式中、Ｒ^A及びＲ^Bの一方はＲ³であり、他方は−Ｐ（Ｒ₂）ＯＲ¹であって、ここでＲ¹は置換アリールカルボニル基であり、Ｒ²はＲ⁴Ｏ又はＲ⁵であり、Ｒ³はヒドロキシル保護基であり、そしてＢはプリンまたはピリミジン塩基である。）を有し、その場で形成される活性ヌクレオシド誘導体。Ｒ¹が２，４−ジニトロフェニルカルボニルである化合物が特に好適である。一般式（Ｉ）の化合物は対応のカルボン酸を用いて調製され；これらの酸は概してアセトニトリルに溶解しやすく（例えば２，４−ジニトロ安息香酸では１．５Ｍ程度）、低濃度で活性化剤として作用する。一般式（Ｉ）の化合物は従来のカップリング反応（例えば固相合成）に用いられ、従来公知のテトラゾール活性化ヌクレオシド中間体を用いて調製したものと区別できないオリゴヌクレオチドを調製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】活性ヌクレオシドホスホラミダイト、その製法及びその使用発明の背景本発明は、一般的に有機化学及び生物学の分野に関するものである。特に、本発明はオリゴヌクレオチド合成に使用する組成物及びその使用法に関係する。ホスホラミダイト化学［ビューケイジ（Beaucage,S.L.及びアイヤー（Iyer，R .P.）、テトラヘドロン（Tetrahedron）、４８巻、２２２３−２３１１ページ（１９９２）］はずっと以前からオリゴヌクレオチド合成のために最も広く利用されるカップリング化学である。熟練せる当業者に良く知られているように、オリゴヌクレオチドのホスホラミダイト合成は、ヌクレオシドホスホラミダイト単量体前駆体を活性化剤と反応させて活性中間体を形成する活性化、その後その活性中間体を成長するオリゴヌクレオチド鎖（概して適当な固体支持体の一端に固定される）に逐次的に添加して、オリゴヌクレオチド生成物を形成することを含む。テトラゾールがヌクレオシドホスホラミダイト単量体を活性化するために一般的に用いられる；その活性化はスキームＩに記載の機構によって起こる。テトラゾールは１個の酸性プロトンを有し、多分そのプロトンをジイソプロピルアミノホスフィン基の塩基性窒素に与え、それによりジイソプロピルアミノ基を脱離基とする。負に帯電したテトラゾリウムイオンはその後三価のリンを攻撃し、過渡的なテトラゾライドリン種を形成する。固体支持体に結合したヌクレオシドの５ ’−ＯＨ基はその後活性三価リン種を攻撃し、ヌクレオチド間結合を形成する。三価のリンは最後は酸化されて五価のリンになる。テトラゾールの主な欠点はその価格である。それはオリゴヌクレオチド合成において２番目に高価な試薬であり、ヌクレオシドホスホラミダイトの価格の約４０〜５０％になる。その上、この窒素を高度に含有する複素環式化合物に固有の不安定性のため、所望のカップリング収率を確実に得るためには概して精製テトラゾールが必要である。さらにテトラゾール（これは普通は、０．５Ｍという飽和溶解度付近の濃度で使用される）は冷アセトニトリル溶液から沈殿する傾向がある；このためある種の自動ＤＮＡ合成器ではバルブ閉鎖につながる恐れがある。テトラゾールとほぼ同様に作用するその他の活性化剤(activato r)も上記のようなテトラゾールに類似の欠点をもっている。これらの活性化剤としてはテトラゾール群の活性化剤の下記のようなメンバーが挙げられる：５−（ｐ−ニトロフェニル）テトラゾール［フレーラー（Froehler,B.C.）& マッテウシ（Matteucci,M.D.）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、２４巻、３１７１−３１７４ページ（１９８３）］；５−（ｐ−ニトロフェニル）テトラゾール＋ＤＭＡＰ［ポン（Pon，R．T.）、テトラヘドロン・レターズ、２８巻、３６４３−３６４６ページ（１９８７）］；及び５−（エチルチオ）− １−Ｈ−テトラゾール［ライト（Wright,P）ら、テトラヘドロン・レターズ、３４巻、３３７３−３３７６ページ（１９９３）］。テトラゾール群活性化剤の他には、次のような活性化剤が用いられている：Ｎ−メチルアニリントリフルオロアセテート［フーリー（Fourrey,J.L.）& ヴァレン（Varenne,J.）、テトラヘドロン・レターズ、２５巻、４５１１−４５１４ページ（１９８４）］；Ｎ−メチルアニリニウムトリクロロアセテート[フーリーら、テトラヘドロン・レターズ、２８巻、１７６９−１７７２ページ(１９８７)]；１−メチルイミダゾールトリフルオロメタンスルフォネート［アーノルド（Arnold,L）ら、Collect.Czech. Chem.Commun．５４巻、５２３−５３２ページ（１９８９）］；オクタン酸またはトリエチルアミン［ステック（Stec,W.J.）& ゾン（Zon,G）、テトラヘドロン・レターズ、２５巻、５２７９−５２８２ページ（１９８４）］；１−メチルイミダゾール・ＨＣｌ、５−トリフルオロメチル−１Ｈ−テトラゾール、Ｎ，Ｎ− ジメチルアニリン・ＨＣｌ及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン・ＨＣｌ［ハーリング（Hering,G）ら、ヌクレオシド及びヌクレオチド（Nucleo sides and Nucleotides）４巻、１６９−１７１ページ（１９８５）］。全体的にこれらの活性化剤はテトラゾールより性能が劣る。本発明の目的は、従来技術の組成物の欠点のすべてを示さない、固相合成に使用するための活性ヌクレオシドを提供することである。本発明のもう一つの目的は、この後に記載する活性ヌクレオシドの製法及び使用を提供することである。発明の要約本発明により、その場で形成され、下記の一般式を有する活性ヌクレオシド誘導体が提供される；式中、Ｒ^A及びＲ^Bの一方はＲ³であり、他方は −Ｐ（Ｒ₂）ＯＲ¹ であり、ここでＲ¹は置換アリールカルボニル基（以下で定義する）であり、Ｒ² はＲ⁴Ｏ及びＲ⁵（以下で定義する）からなる群から選択され、Ｒ³はヒドロキシル保護基（以下で定義する）であり、そしてＢはプリンまたはピリミジン塩基である。Ｒ¹が２，４−ジニトロフェニルカルボニルである化合物が特に好適である。本発明の別の面によると、これらの化合物は対応のカルボン酸を用いて調製される；これらの酸は概してアセトニトリルにテトラゾールよりよく溶け（例えば２，４−ジニトロ安息香酸では１．５Ｍ程度）、低濃度で活性化剤としてはたらく。これらの化合物は対応するテトラゾール化合物に比較して約１０分の１の費用で調製される。発明の詳細な説明本発明の第一の面により、一般式Ｉ（式中、Ｒ^A及びＲ^Bの一方はＲ³で、他方は −Ｐ（Ｒ₂）ＯＲ¹ であり、ここでＲ¹は置換アリールカルボニル基であり、Ｒ²はＲ⁴Ｏ及びＲ⁵からなる群から選択され、Ｒ³はヒドロキシル保護基であり、そしてＢはプリンまたはピリミジン塩基である。）の化合物が提供される。本発明の目的では、“置換アリールカルボニル基”は、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）基と結合し、オリゴヌクレオチド合成反応を妨害しない少なくとも１つの電子求引性置換基（非妨害置換基）を担うアリール基を意味する。適当なアリール基としてはフェニル、ナフチル及びアントラシルが含まれるが、これらに限定されるものではなく、；フェニルが好適である。適当な非妨害置換基としてはハロゲン（すなわちクロロ、ブロモ、フルオロ及びヨード）及びニトロが含まれるがこれらに限定されるものではない。好適なＲ¹基には下記のものが含まれる：２−ニトロフェニルカルボニル；３，５−ジニトロフェニルカルボニル；２，４，５− トリフルオロフェニルカルボニル；２，３，６−トリフルオロフェニルカルボニル；２，３，６−トリフルオロフェニルカルボニル；２，３，５，６−テトラフルオロフェニルカルボニル；ペンタフルオロフェニルカルボニル；３−ニトロフェニルカルボニル；及び２，４−ジニトロフェニルカルボニル。２，４−ジニトロフェニルカルボニルが特に好適である。本発明に従って関心とする一般式Ｉの化合物群の１つは、Ｒ²が式Ｒ⁴Ｏ-を有する化合物群である。この化合物群では、適当なＲ⁴基として下記のものを含むが、これらに限定されるものではない：低級アルキル（これは本発明の目的のためには、１〜約５個の炭素原子をもつ直鎖または分枝鎖アルキルと定義される）；ＮＣＣＨ₂ＣＨ₂−；ＮＣＣＨ₂ＣＨＭｅ−；ＣＮＣＨ₂ＣＭｅ₂−；Ｃｌ₃ＣＣＨ₂ −：Ｃｌ₃ＣＣＨＭｅ−；Ｃｌ₃ＣＣＭｅ₂−；Ｃ₆Ｈ₅ＳＯ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−；ＭｅＳＯ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−；及びＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂ＣＨ₂−［ビューケイジ＆アイヤー、同上、２２８０−２２８１ページを参照］。一般式Ｉで表わされる化合物は以下に説明する方法で一般式 II で表わされる対応の化合物から調製される；式中、Ｒ^A及びＲ^Cの一方はＲ³で、他方は −Ｐ（Ｒ²）ＮＲ₂ であり、Ｂ、Ｒ²及びＲ³は前記と同じ意味を持ち、Ｒはそれぞれ低級アルキル（好ましくはイソプロピル）であるか、または両方のＲが一緒になって基−（ＣＨ₂ ）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−を形成する。一般式IIの化合物は市販品が入手可能であり、そして／または従来公知の方法で調製される。本発明において関心とする化合物の他の群は一般式Ｉで表わされ、式中、Ｒ² がＲ⁵であり、ここでＲ⁵が低級アルキルである化合物である。この群には特に、ここでＲ⁵がメチルである（メチルホスフォネート化合物を提供するための）化合物が含まれる。これらの化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために特に有用である。アンチセンス核酸は従来の薬剤に代わる魅力的可能性を提供する［ウールマン（Uhlman,E.）& ペイマン（P eiman,A）、ケミカル・レヴュー（Chemical Reviews）、９０巻、５４３−５８４ページ（１９９０）；グッドチャイルド（Goodchild,J）、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Bioconjugate Chemistry）、１巻、１６５−１８７ページ（１９９０）］。それらは細胞またはウィルス由来の特異的標的核酸配列に結合し、遺伝子発現を調節するように設計される。オリゴヌクレオシドメチルホスフォネートは現在活発に研究されているアンチセンス核酸の重要な群の１つである。代表的な２，４−ジニトロ安息香酸を用いるこの化合物群の合成と活性化メカニズムとをスキームIIに示す。２，４−ジニトロ安息香酸またはテトラゾールを用いて合成した異種の１０量体及び２１量体は、逆相ＨＰＬＣではほとんど区別がつかなかった。いずれの場合もオリゴヌクレオチドを開裂し、エチレンジアミンを用いて脱保護した［ミラー（Miller,P.S.）ら、バイオケミストリー（Bioch emistry）、２５巻、５０９２−５０９７ページ（１９８６）］。これらの化合物は一般式IIの対応する化合物からも作られる。これらの対応の化合物は市販されており、そして／または従来公知の方法で作られる。一般式Ｉの化合物においてＲ³はヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基とは、ポリヌクレオチドの合成中、またはヌクレオチドを固体支持体に付着させている間ヒドロキシル基を保護し、ヌクレオチド合成後には容易に除去できる基を意味する。本発明の目的のためには、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基が特に好適である。３’−または５’−ヒドロキシルを保護するその他の適した基には次のものがあるが、これらに制限されるものではない：４，４’，４”−トリス−（ベンジロキシ）トリチル（ＴＢＴｒ）；４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタリミド）トリチル（ＣＰＴｒ）；４，４’，４”−トリス（レブリニロキシ）トリチル（ＴＬＴｒ）；３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル（ＩＤＴｒ）；ピキシル（９−フェニルキサンテン−９−イル）；９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）；４−デシロキシトリチル（Ｃ₁₀Ｔｒ）；４−ヘキサデシロキシトリチル（Ｃ₁₆Ｔｒ）；９−（４−オクタデシロキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｃ₁₈Ｐｘ）；１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル（ＢＭＰＭ）；ｐ−フェニルアゾフェニロキシカルボニル（ＰＡＰｏｃ）；９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）；２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル（ＤＮＰＥｏｃ）；４−（メチルチオメトキシ）ブチリル（ＭＴＭＢ）；２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル（ＭＴＭＴ）；２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル（ＰＴＭＴ）；２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニロキシメチル）ベンゾイル（ＤＮＢＳＢ）；及びレブリニル（levulinyl）基。これら及びその他の適した保護基はビューケイジ＆アイヤー、同上、に詳細に記載されており、その全開示は参照してここに取り込まれる。本発明の目的では一般式Ｉ及びIIのＢはピリミジンまたはプリン塩基を表わす。本発明にしたがう使用に好適なものはグアニン、アデニン、チミン及びシトシンを特徴とする塩基類である；しかしヌクレオチド同族体の合成に使用されるようなその他のプリンまたはピリミジン塩基類を基Ｂとして代わりに用いることができる。本発明のもう一つの面によって、一般式Ｉの化合物の製法が提供される。一般式IIで表わされる対応する化合物と、一般式Ｒ¹−ＯＨのカルボン酸との反応による一般式Ｉの化合物の製造は、熟練せる当業者には容易に理解できるように、種々の溶媒中で広い温度範囲、及び種々の長さの時間にわたって行われる。あらゆる一般式IIの化合物とカルボン酸との特定の組合わせに対して、最適条件は経験的に容易に決定される。一般的に、適当な溶媒としてはアセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン及びジメチルホルムアミドが含まれるが、これらに制限されるものではない。特に好適な溶媒はアセトニトリルである；これはこの分野の研究者にはホスホラミダイトカップリング反応に使用する最適溶媒として一般に認められている。反応は一般に約１０℃〜約６０℃の温度で、好適にはほぼ室温で行われる。反応を行う温度に依存して、反応は約２秒〜約２４時間の間に一般に完了する；室温では反応のために典型的には約５秒ないし約３時間を要する。反応は通常、一般式IIの化合物に対して少なくとも約１化学量論的等量のカルボン酸を用いて行われ；好適には、一般式IIの化合物に対して少なくとも約２倍過剰〜約１００倍過剰のカルボン酸が用いられる。本発明の特に優れた利点は、一般式Ｉの活性ヌクレオシド中間体を、オリゴヌクレオチド合成に使用する前に反応混合物から分離する必要がないことである。むしろ、その場で生成した活性中間体をカップリング反応に直接用いることができ、その結果、所望のオリゴヌクレオチド生成物が形成される。本発明のもう一つの利点は、一般式Ｉの化合物を生成するための活性化剤として本発明に従って用いられるカルボン酸が、ヌクレオシドの５’−または３’− ＯＨ基を保護するために用いるヒドロキシル保護基Ｒ³の安定性を阻害しないことである。当業者には概して公知のように、ジクロロ−またはトリクロロ酢酸（典型的には、ジクロロメタンなどの適切な溶媒中約０．２Ｍ）を用いて、酸素のプロトン付加を含むメカニズムによる各合成サイクル後に保護基Ｒ³を除去する。０．０５Ｍジクロロ酢酸も０．０５Ｍトリクロロ酢酸も活性化剤として使用できることが実験で確認されたとはいえ、さらに、この濃度のジクロロ酢酸はジメトキシトリチル保護基の０．１％を除去し、トリクロロ酢酸は保護基の０．２％を除去することが確認された。オリゴヌクレオチド合成においてはこの程度の脱保護は明らかに受け入れられない。対照的に、本発明により使用されるカルボン酸は保護基を約０．０１％しか除去しない；その上この数値は実際、何らの実用上の有意性なしに、基準線の読みを単に反映しているかも知れない。さらに、なぜオクタン酸及びトリクロロ酢酸Ｎ−メチルアニリウムが（従来技術で提言されたように）活性化剤としての使用に適さないことが見い出されたかという理由が保護基の妨害で説明できるかも知れないと推測される。本発明のさらに別の面により、次のようなオリゴヌクレオチド合成の改良法が提供される；すなわち一般式Ｉの化合物を活性中間体として用い、それを成長するオリゴヌクレオチド鎖に逐次的に加えて所望のオリゴヌクレオチド生成物を形成する。一般式Ｉの活性中間体を用いて合成したオリゴヌクレオチドは、種々の用途、例えばポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅及びジデオキシ停止法によるＤＮＡ塩基配列決定などに好都合に用いられている。それに加えて、本発明の組成物及び方法を用いて、スキームIIIに示すオリゴヌクレオシドホスホロチオエート（アンチセンス核酸のもう一つの重要な群）が作られる。ビューケイジ試薬［アイヤーら、J.Amer.Chem.Soc.１１２巻、１２５３−１２５４ページ（１９９０）］を硫化反応に用いる。逆相ＨＰＬＣ分析によって確認されるように、２，４−ジニトロ安息香酸を用いて合成したオリゴヌクレオシドホスホロチオエートはテトラゾールを用いて合成したものに匹敵する。本発明は添付の例を参照することによってより良く理解されるであろう。これらの例は説明のみを目的とするものであり、ここに添付の請求の範囲に規定される本発明の範囲を制限するものとしては決して解釈されるべきではない。例１活性ヌクレオシドのその場での合成５’−ＤＭＴ−チミジン３’−シアノエチルホスホラミダイト（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ；ベックマンインスツルメント、フラートン、ＣＡ、から入手）をＮＭＲ管中のＣＤ₃ＣＮ５００μｌ［アルドリッチ（Aldrich）、ミルウォーキー、ＷＩから入手］に溶解した。³¹ＰＮＭＲスペクトルをブルッカー（Brucker）３００ＭＨｚスペクトロメーターで記録した。試料は１５１．６４９ｐｐｍで共鳴シグナルを示した。この試料にその後２，４−ジニトロ安息香酸（７．２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ；アルドリッチ社から入手）を加え、２分後にスペクトルを記録した。³¹ Ｐシグナルは１３６．７１６ｐｐｍにシフトし、一般式Ｉの活性種の生成を示唆した。これはその後、ＮＭＲ管にチミジン３’−酢酸（５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ；シグマ社、セントルイス、ＭＯ、から入手）を加えることによって同定された。５分後に、１４３．２９８ｐｐｍに現れる³¹Ｐシグナルによって、ジヌクレオチドの生成を確認した。例２２１量体オリゴヌクレオチドの合成２１量体をホスホラミダイト化学を利用してファルマシアＤＮＡ合成器（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、ＮＪ）で合成した。その２１量体は下記の配列を有していた：５’ＣＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＴ３’ （配列番号１）上記配列のために、Ｔ−ＣＰＧ固体支持体を用いた（０．２μｍｏｌ）。総サイクル時間は９分間で、カップリング時間は４分間であった。活性化剤の濃度はテトラゾールの場合はアセトニトリル中０．５Ｍで、２，４−ジニトロ安息香酸の場合はアセトニトリル中０．０５Ｍであった。合成終了後、最後のＤＭＴ基を除去した。カップリング効率は９８〜９９％の範囲内であった。アンモニアを室温で１時間用いるか、またはメチラミン／アンモニア試薬を室温で５分間用いて、オリゴ（oligo）を固体支持体から開裂させ、そしてアンモニアにより６５℃で３時間、またはメチラミン／アンモニアにより６５℃で５分間、脱保護した［レディー（Reddy,M.P.）ら、テトラヘドロン・レターズ、３５巻、４３１１ページ（１９９４）］。その溶液を急速真空で濃縮し、ベックマン２０００Ｐ／ＡＣＥ毛細管ゲル電気泳動装置で分析した。毛細管ゲルカラムはＵ１００Ｐ尿素ゲルカラム（Cat.＃３３８４８０、ベックマンインスツルメント、フラートン、ＣＡから入手）であり、充填して３７ｃｍの長さに切断した。トリス− ボレート（Tris-Borate）、７Ｍ尿素緩衝液（これもベックマンから入手、ゲル緩衝液キット Cat．＃３３８４８１）を指示にしたがって使用した。オリゴヌクレオチドの吸光度はオリゴヌクレオチドの質及び長さに依存して０．０５〜２ＯＤ_260nm／ｍｌの範囲であった。１０ｋＶで３秒間に注入し、分離は長さに依存して１１ｋＶで３０〜９０分間であった。両方の生成物の電気泳動図は実質的に区別され得なかった。例３オリゴヌクレオシドメチルホスホネートの合成下記の１０量体及び２１量体オリゴヌクレオシドメチルホスホネート配列をファルマシアＤＮＡ合成器で合成した：１０量体：５’ＴＣＣＧＡＣＡＧＣＴ３’ （配列番号２）２１量体：５’ＴＡＣＴＧＴＡＧＧＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴ３’ （配列番号３）文献の方法を追試した［アガルワル（Agarwal,S）& グッドチャイルド、テトラヘドロンレターズ２８巻、３５３９ページ（１９８７）］。総サイクル時間は１０分間で、カップリング時間は５分間であった。Ｃ及びＧメチルホスホナミダイトを乾燥ＤＭＦまたは乾燥ＴＨＦどちらかに溶解し、一方Ａ及びＴメチルホスホナミダイトは乾燥アセトニトリルに溶解した。テトラゾール及び２，４−ジニトロ安息香酸の濃度はそれぞれ０．５Ｍ及び０．０５Ｍであった。使用した支持体はＴ−ＣＰＧ、０．２μｍｏｌであった。カップリング効率は９７〜９８％の範囲内であった。最後のＤＭＴ基はそのまま残した。オリゴヌクレオチドメチルホスホネートを開裂し、エチレンジアミン／エタノール（１：１）により室温で７時間脱保護した。その試料を逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、下記条件で分析した：Ｃ₁₈ウルトラスフェアカラム［ライニン（Rainin）］、５μ粒子、４．６ｍｍ×２５ｃｍ；ボトルＡ：０．０１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．９）；ボトルＢ：アセトニトリル；プログラム：流速１ｍｌ／ｍｉｎ、０〜２５分は５０％Ｂまでの勾配、２５〜２７分は５０％Ｂ、２７〜３０分は０％Ｂまでの勾配、３０〜３２％は０％Ｂ。例４オリゴヌクレオシドホスホロチオエートの合成下記のオリゴヌクレオシド２５量体配列をファルマシアインスツルメントのＴ−ＣＰＧ固体支持体上で合成した（０．２μｍｏｌ）：５’ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＴ３’ （配列番号４）総サイクル時間は９分間で、カップリング時間は４分間であった。テトラゾール及び２，４−ジニトロ安息香酸の濃度はそれぞれ０．５Ｍ及び０．０５Ｍであった。硫化のためには３Ｈ−１，２−ベンツジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（ビューケイジ試薬）を用いた；硫化試薬１ｇを乾燥アセトニトリル１００ｍｌに溶解した。酸化は３０秒間行った；最後のＤＭＴ基はそのまま残した。カップリング効率は９８．７５〜９９．６％の範囲内であった。オリゴヌクレオシドホスホロチオエートを例２のようにアンモニアかメチラミン／アンモニアかどちらかで開裂した。チオエートを逆相ＨＰＬＣ、及びゲル充填毛細管を用いるベックマンＰ／ＡＣＥ２０００によって既述のように分析した；ＨＰＬＣ条件は例３と同じである。両方の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムは実質的に区別され得なかった。例５種々の芳香族カルボン酸を活性化剤として用いるＣＣ二量体の合成カルボン酸の比較酸度は、０．０５Ｍ水溶液を作り、その溶液のｐＨを測定することによって測定した。これらのカルボン酸の活性は、それらを用いて５’− ジメトキシトリチル−Ｎ⁴−ベンゾイルデオキシシチジン−３’−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエチルホスホラミダイトを活性化し、活性ヌクレオチド試薬を用いて支持体結合デオキシシチジンとの反応でＣＣ二量体を形成することによって測定した。カップリング収量は、二量体のジメトキシトリチル基を放出させ、その後５００ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。比較の目的でテトラゾールを用いてＣＣ二量体を合成した；ただしカルボン酸の場合に使用した０．０５Ｍ溶液の代わりに０．５Ｍテトラゾールを用いた。結果を表１に示す。例６オリゴヌクレオシドメチルホスホネート類の融点の研究下記のメチルホスホネート配列をテトラゾールまたは２，４−ジニトロ安息香酸を用いて合成した：５’ＴＡＣＴＧＴＡＧＧＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴ３’ （配列番号３）補足的オリゴヌクレオチド配列も合成した；５’ＡＣＴＣＴＣＧＴＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡ３’ （配列番号５）オリゴヌクレオシドメチルホスホネート及びその補足体（正常オリゴヌクレオチド）各０．５ＯＤ_260nmの混合物を１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍｌ中に調製した。各試料を１０〜１５分間沸騰させた。試料を水浴中でまたはリード加熱ブロック（lead heating block）中でごくゆっくりと冷却した。試料をキュベットに入れ、２５℃から７０℃の２６０ｎｍにおける吸光度を追跡した；その際キュベットホールダー温度を一度に３°上げ、キュベットを３分間安定させてから吸光度を読み取った。テトラゾールまたは２，４−ジニトロ安息香酸で得られた融点曲線は実験誤差の範囲内で互いに一致した。上記の説明によって、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認でき、その精神及び範囲から逸脱することなく本発明を種々の用途及び条件に適応させることができる。形態の変化及び均等物の置換は、状況によって示唆されまたは好都合であるとされる場合には本発明の企図されるところである。ここに用いられた特殊な用語は説明のためのものであり、制限を目的とするものではない。

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式Ｉで表わされる化合物。（式中、Ｒ^A及びＲ^Bの一方はＲ³であり、他方は −Ｐ（Ｒ₂）ＯＲ¹ であり、ここで、Ｒ¹は置換アリールカルボニル基であり；Ｒ²はＲ⁴Ｏ及びＲ⁵からなる群から選択され；Ｒ³はヒドロキシル保護基であり；そしてＢはプリンまたはピリミジン塩基である。）２．Ｒ¹が、オリゴヌクレオチド合成を妨害しない少なくとも１つの電子求引性置換基を担うアリールカルボニル基である請求項１記載の化合物。３．アリールがフェニル、ナフチル及びアントラシルからなる群から選択される請求項２記載の化合物。４．電子求引性置換基がハロゲン及びニトロからなる群から選択される請求項２記載の化合物。５．Ｒ¹が２−ニトロフェニルカルボニル；３，５−ジニトロフェニルカルボニル；２，４，５−トリフルオロフェニルカルボニル；２，３，６−トリフルオロフェニルカルボニル；２，３，６−トリフルオロフェニルカルボニル；２，３，５，６−テトラフルオフェニルカルボニル；ペンタフルオロフェニルカルボニル；３−ニトロフェニルカルボニル；及び２，４−ジニトロフェニルカルボニルからなる群から選択される請求項１記載の化合物。６．Ｒ¹が２，４−ジニトロフェニルカルボニルである請求項５記載の化合物。７．Ｒ²がＲ⁴Ｏ−である請求項１記載の化合物。８．Ｒ⁴が低級アルキル；ＮＣＣＨ₂ＣＨ₂−；ＮＣＣＨ₂ＣＨＭｅ−；ＣＮＣＨ₂ ＣＭｅ₂−；Ｃｌ₃ＣＣＨ₂−：Ｃｌ₃ＣＣＨＭｅ−；Ｃｌ₃ＣＣＭｅ₂−；Ｃ₆Ｈ₅ ＳＯ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−；ＭｅＳＯ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−；及びＮＯ₂Ｃ₆Ｈ₄ＣＨ₂ＣＨ₂−からなる群から選択される請求項７記載の化合物。９．Ｒ²がＲ⁵である請求項１記載の化合物。１０．Ｒ⁵が低級アルキルである請求項９記載の化合物。１１．Ｒ³が、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４”−トリス−（ベンジロキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタリミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニロキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、ピキシル（９−フェニルキサンテン−９−イル）、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、４−デシロキシトリチル、４−ヘキサデシロキシトリチル、９−（４−オクタデシロキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニロキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニロキシメチル）ベンゾイル及びレブリニルからなる群から選択される請求項１記載の化合物。１２．Ｒ³がジメトキシトリチルである請求項１１記載の化合物。１３．Ｂがアデニン、グアニン、シトシン及びチミンからなる群から選択される請求項１記載の化合物。１４．一般式Ｉ（式中、Ｒ^A及びＲ^Bの一方はＲ³であり、他方は −Ｐ（Ｒ₂）ＯＲ¹ であり、ここで、Ｒ¹は置換アリールカルボニル基であり；Ｒ²はＲ⁴Ｏ及びＲ⁵からなる群から選択され；Ｒ³はヒドロキシル保護基であり；そしてＢはプリンまたはピリミジン塩基である。）で表わされる化合物の製造方法であって、一般式ＩＩ（式中、Ｒ^A及びＲ^Cの一方はＲ³であり、他方は −Ｐ（Ｒ²）ＮＲ₂ であり、ここでＢ、Ｒ²、Ｒ³は前記と同じ意味を持ち、Ｒはそれぞれ低級アルキルであるかまたは両方のＲが一緒になって基−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂ ）₂−を形成する。）で表わされる化合物を、適当な溶媒中で、一般式Ｒ¹−ＯＨで表わされる化合物と反応させる段階を含んでなる方法。１５．ヌクレオシドホスホラミダイト単量体前駆体を活性化剤との反応によって活性化して活性中間体を形成し、そして前記活性中間体を順次添加してオリゴヌクレオチド生成物を形成するオリゴヌクレオチド合成法であって、一般式Ｉ（式中、Ｒ^A及びＲ^Bの一方はＲ³であり、他方は −Ｐ（Ｒ₂）ＯＲ¹ であり、ここで、Ｒ¹は置換アリールカルボニル基であり；Ｒ²はＲ⁴Ｏ及びＲ⁵からなる群から選択され；Ｒ³はヒドロキシル保護基であり；そしてＢはプリンまたはピリミジン塩基である。）で表わされる化合物を活性中間体として用いることを含んでなる改良された方法。１６．一般式ＩＩ（式中、Ｒ^A及びＲ^Cの一方はＲ³であり、他方は −Ｐ（Ｒ²）ＮＲ₂ であり、ここで、Ｂ、Ｒ²、Ｒ³は前記と同じ意味をもち、Ｒはそれぞれ低級アルキルであるかまたは両方のＲが一緒になって基−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−を形成する。）で表わされる化合物を、適当な溶媒中で、一般式Ｒ¹−ＯＨで表わされる化合物と反応させることによって、活性中間体がその場で形成される請求項１５記載の方法。