JPH09504941A - ニワトリ貧血症ウイルス変異体およびワクチン、ならびにウイルスタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３またはウイルスをコードする配列に基づくそれらのための用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ニワトリ貧血症ウイルスの新規のタンパク質および該ウイルス（ＣＡＶ）、特にＣＡＶ自身より病原性が少ないにも拘わらず、免疫化された動物で中和抗体を導くワクチンで感染を予防または治療するための組成物が記載される。さらに、ＣＡＶおよびアンチイディオタイプの抗体で感染を防ぐための、ＣＡＶの部分に対する抗体を含む組成物も記載される。本発明は、ＣＡＶを検出するための抗体および検査キットをも提供する。ＣＡＶに由来する組換えＤＮＡ分子、それでトランフフェクトされた宿主細胞およびこれらの宿主細胞に基づくワクチンも本発明に従えば可能となる。本発明は、ＤＮＡ片が宿主に対して感染性のあるウイルスに導入された生きたウイルスワクチンをもまた含む。さらに本発明は、特に腫瘍細胞でのアポトプシスの誘発におけるＣＡＶタンパク質の用途を提供する。本発明は、加えて、遺伝子治療による細胞死の誘発をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ニワトリ貧血症ウイルス変異体およびワクチン、ならびにウイルスタンパク質 ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３またはウイルスをコードする配列に基づくそれらの ための用途 本発明は、ニワトリ貧血症ウイルスの新規なタンパク質および／またはポリペ プチドに関する。さらに、本発明は家禽類におけるウイルス感染、特にニワトリ 貧血症ウイルス（ＣＡＶ）による感染を予防または治療するためのワクチンおよ び組成物に関する。 特に、本発明はＣＡＶそのものよりも病原性が低いにもかかわらず、免疫化さ れた動物で中和抗体の産生をもたらすワクチンに関する。 さらに、本発明はＣＡＶによる感染を予防するためにＣＡＶの一部に対する抗 体を含有する組成物にも関する。また、抗原に対応する抗原性を有するアンチイ ディオタイプの抗体も本発明の対象である。 本発明はまた、ＣＡＶ感染の検出または予防のための抗体にも関する。またＣ ＡＶ検出のための診断キットも記述される。 本発明は、さらにＣＡＶタンパク質の少なくとも抗原性を有する部分をコード するＣＡＶに由来する組換えＤＮＡ分子、そしてこのような組換えＤＮＡ分子で トランスフェクト（移入）された宿主細胞にも関する。これらの宿主細胞に基づ くワクチンが本発明によって可能になる。 また、ＣＡＶタンパク質の少なくとも抗原性部分をコードするＤＮＡ片が望ま れる宿主を感染するウイルスに導入された、いわゆる生きたウイルスワクチンも 本発明の対象である。 特にニワトリにおけるＣＡＶ感染の予防または治療の方法、およびＣＡＶから 成る配列の組換え部分を作る方法、ならびにワクチンの製造方法も本発明の対象 である。 さらに、本発明はＣＡＶのタンパク質をアポプトシス（プログラムさ れた細胞死滅）を誘発するのに用いることに関する。特に、タンパク質（ポリペ プチド）は腫瘍細胞のアポプトシスを誘発するのに用いることができる。 さらに、本発明に従うタンパク質は、その他の望ましくない細胞集団、たとえ ばリュウマチ性関節炎、狼瘡のような自己免疫病における自己免疫反応性Ｔ細胞 等を除去するのに用いることができる。 本発明はさらに遺伝子治療による細胞死の誘発をも提供する。これらの治療薬 を製造する方法および治療薬による治療法もまた本発明の対象である。 ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）は最近同定されたＤＮＡウイルス（ノテボ ーンおよびデ ボア、１９９０年）である。それは新しいウイルス科に属する。 若いニワトリで、ＣＡＶは赤芽球の前躯体細胞を破壊し、そして胸線細胞を消耗 させ免疫不全によって貧血をもたらす。患部は脾臓および肝臓に生じる（ジュリ セン等、１９８９年）。最近の研究によると胸腺細胞の消耗はＣＡＶによって誘 発されるアポプトシスによって起こることが示された（ジュリセン等、１９９２ 年ｂ）。 ゲルダーブロム等、（１９８９年）およびトッド等（１９９０年）は、電子顕 微鏡を用いる研究によってＣＡＶ粒子がＴ３ ２０面体対称および２３〜２５ｎ ｍの直径を有することを示した。ＣＡＶ粒子は、平衡沈降の後、ＣｓＣｌ中１． ３３〜１．３４ｇ／ｍｌの密度で濃縮する。 トッド等（１９９０年）は単離されたウイルス粒子が５０ ｋＤａの分子量を 有するただ１つのタンパク質を含むことを示した。ＣＡＶ粒子中の１本鎖ＤＮＡ は円形マイナス鎖の形状である（ゲルダーブロム等；トッド等、１９９０年；ノ テボーン等、１９９１年）。複製ＤＮＡ中間体がクローンされ、そして完全に配 列が決定された。ＣＡＶゲノムは２３１９ヌクレオチド長である。ゲノム構造お よびＤＮＡ配列を基にして、このウイルスは既知のウイルス科には位置づけるこ とはできない（ノテボーン等、１９９１年；トッド等、１９９１年）。ＣＡＶゲ ノムは、分 子量５１．６、２４．０および１３．３ｋＤａを有する可能なタンパク質をコー ドする部分的にまたは完全に重なり合う３つの大きなリーディングフレーム（読 み枠）を含む。ＣＡＶゲノムは、さらに１つの明らかなプロモータ／エンハンサ 領域およびただ１つのポリアデニル化シグナルを含む。複製ＤＮＡ中間体の転写 は、約２１００ヌクレオチドから成るポリアデニル化されたポリシストロン性Ｒ ＮＡ分子を産生する（ノテボーン等、１９９２年ｂ）。 生後１日目のヒナ（ヒヨコ）がＣＡＶ感染に最もかかりやすい。これらの動物 では、ＣＡＶを接種後、１０日目から傾眠、食欲減退および貧血が観察される。 感染後、死亡率は最大５０％にも上る。日数を経るにつれて抵抗もまた増加する 。ジュリセン等（１９９２年）は、ＣＡＶで感染された生後１〜３日目のヒナの ヘマクリット値のみが減少することを報告している。生後１〜２１日目のヒナの ＣＡＶ感染は結果として特に、胸腺皮質の消耗をもたらす。しかしながら、より 老いたニワトリではＣＡＶは無症状的に増殖することができる。より老いたニワ トリのＣＡＶ感染は血清変換が起こることにより決定することができる（マクロ イ等、１９９２年）。 一群のニワトリ内でのＣＡＶの広がりは実質的に接触感染によって起こる。最 も可能性が高いのは、ＣＡＶ感染された動物からの排泄物によって汚染された排 泄物またはその他のものを摂取することである。空気を経由しての感染も、しか しながら除外することはできない。卵を通してのヒナへのウイルスの媒介がユア サ等（１９７９年）によって提唱されたが、実験をとおしては、母体動物からヒ ナへのＣＡＶの媒介は本発明者等によって立証することができなかった。 ＣＡＶにより誘発された胸腺皮質の消耗に由来する免疫不全が通常非病原性因 子による２次感染の後、現れる症状の起因であると考えられている（デ ボア等 、１９９２年；エングストローム、１９８８年；ローゼンバーガーおよびクラウ ド、１９８９年；ウォン ビュロウ等、１９ ８６年；ユアサ等、１９８０年）。このようにＣＡＶはニューキャッスル病、マ レック病、感染性滑液包炎（Ｇｕｍｂｏｒｏ）にかかった動物およびレオウイル スに関係のあるブルーウイング病にかかった動物から単離される。ＣＡＶ感染は 、たとえばニューキャッスル病ウイルスに対して増加されたウイルス感染反応を もたらす。 母性の抗体がＣＡＶ感染に対して重要な保護を与えることが知られている。実 験室条件での最近の研究によれば、母性免疫の生後１日目のヒナはＣＡＶ感染に かからないことが示された。生後１日目のヒナは、母体動物の卵黄から得られる 抗体を静脈注射することによってある程度保護されることができる（デ ボア等 、発行日不詳）。 ＣＡＶは細胞培養物中で増殖することができる。そのようにして得られるウイ ルス力値は一般的に低い。現在ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞（ユアサ、１９８３年； ユアサ等、１９８３年）がそのために用いられており、その中でＣＡＶは感染４ ８〜７２時間後、細胞変性効果を誘発する。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞は中和抗体 およびＣＡＶに対する抗体を免疫蛍光法によって決定するのに用いられる（ウォ ン ビュロウ等、１９８５年；チェトル等、１９９１年）。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１ 細胞中連続継代培養によって、ＣＡＶの毒性を弱毒化することはいままでのとこ ろ可能であるということが知られていない。 ＣＡＶ感染の後、より年老いた動物は病気の症状を現さない。そして母性抗体 を有するヒナは感染から保護されている。これらのデータは、ドイツ国において 生後１４〜１６週間の母性動物を制御されたＣＡＶ感染にさらすことに基づくワ クチンプログラムにおいて用いられた。オランダ国においては、このワクチン法 は、看護者の危険のために実験的レベル以外は許可されていない。前述のとおり 、ＣＡＶが受精卵を経由してヒナに媒介されることは全く可能である。マクナル ティ等（１９９１年）は最近ＣＡＶに対して血清陽性である群がＣＡＶに対して 血清陰性の群と比べて産卵数が劣ることを示した。さらに、アディア（私信）は 無症状のＣＡＶ感染を有するニワトリにおいて免疫不全がみられることを示した 。可能な母体からのウイルスの広がり、およびＣＡＶの無症状感染によって引き 起こされる免疫不全から無毒化ワクチンに基づくコントロールプログラムが非常 に望ましいものとなる。 一般的に、不活性化ワクチンおよびサブユニットワクチンが最も安全なワクチ ンである。組織培養条件下、ＣＡＶは低い力値にしか増殖しないという事実から 不活性化ワクチンの製造は比較的高価でそして労働集約的となる。ＣＡＶ感染に 対するサブユニットワクチンの製造のためには、ワクチン接種されたニワトリで 保護的免疫応答を誘発するＣＡＶタンパク質が必要である。現在のところ、ただ １つのタンパク質（ＶＰ１と呼ばれる）が精製されたＣＡＶ粒子中に見いだされ ている。 驚くべきことに、さらに本発明の実施の形態で示されるように、このタンパク 質だけではＣＡＶ感染に対して保護的免疫応答を与えることができないというこ とが見いだされた。ＶＰ１がウイルス粒子中に存在するただ１つのタンパク質の ように見える事実にも拘わらず、本発明者等によって今回初めて発現されたＶＰ ２タンパク質がウイルス中和抗体を産生するのに不可欠であるということが見い だされた。そこで、今になって初めてウイルス部分に基づく有効なワクチンを開 発することが可能となった。 本発明者等は、ＣＡＶゲノム上に存在する３つのオープンリーディングフレー ムをバキュロウイルス ベクタにクローンした。３種のＣＡＶタンパク質ＶＰＩ 、ＶＰ２およびＶＰ３が組換えＣＡＶバキュロウイルスによる共感染法によって Ｓｆ９細胞中、単独で、または他のＣＡＶタンパク質の１つとともに、あるいは ３種すべてが同時に発現された。母性動物にＣＡＶタンパク質の１種またはそれ 以上を含む粗製細胞溶解物を注射した。３種すべてのＣＡＶタンパク質の相応量 または実質的にＶＰ１およびＶＰ２、さらにＶＰ３をいくらか含む抗原調製物で ニワトリを免疫化した後に、初めて中和抗体が産生した。このような動物の卵は 、 ＣＡＶに対する母性抗体を含んでいた。ワクチン接種された母性動物のヒナにつ いての感染試験から少なくともＣＡＶタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２が保護的な 免疫応答を誘発するのに必要であることが示された。３種すべてのＣＡＶタンパ ク質を注射された母性動物のヒナはＣＡＶ感染に対してより有効に保護されてい た。Ｓｆ９細胞中、各々別々に製造された３種すべてのＣＡＶタンパク質を注射 されたニワトリは、ＣＡＶに対する中和抗体をほとんど誘発しなかった。これは ＣＡＶに対する中和抗体を最適に誘発するためには２種または３種のＣＡＶタン パク質が一緒に細胞（昆虫）中で、合成されなければならないことを意昧する。 ２種または３種のＣＡＶタンパク質の断片は、ＣＡＶ感染に対する保護的な免 疫応答を生じさせるのに充分であることが可能である。 卵を産む雌鳥のワクチン接種に用いる組換えＣＡＶ産生物、ＶＰ１＋ＶＰ２ま たはＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３はバキュロウイルス系を用いることにより合成でき る。ＣＡＶタンパク質はまた、細菌細胞または酵母細胞、レトロウイルス感染ま たは遺伝子増殖（ＣＨ〇−ｄｈｆｒ系）のような他の系を用いても合成すること ができる。 ＣＡＶゲノムのオープンリーディングフレームによってコードされる２種また は３種のタンパク質がニワトリで保護的免疫応答を誘発することができるという 事実は生きたウイルスベクタの開発にも適用ができる。ＶＰ１＋ＶＰ２またはＶ Ｐ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３のためのコード配列がそれで生きたウイルスベクタにクロ ーンされる。 ＣＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の一種が個別に、しかしながら 生きたウイルスベクタという意昧の範囲内において、ＣＡＶ感染に対する保護的 免疫応答を誘発するのに適しているということもまた可能である。 生きたウイルスベクタにより１種またはそれ以上の前記のＣＡＶタンパク質の 断片を発現することも保護的免疫応答を誘発するために充分であるかもしれない 。 家禽では、それ自身トリ系で良好な複製を示す生きたウイルスベクタのみが使 用できる。ニワトリで使用するのに適切なウイルス性ベクタは他のものを含めて 、鶏痘ウイルス、レトロウイルスベクタ、ヘルペスウイルスベクタ（マーレック ウイルスおよび七面鳥ヘルペスウイルス）、アデノウイルスおよび喉頭気管炎ウ イルスである。ＣＡＶによって誘発される細胞死は実質的にＶＰ３にそして部分 的にはＶＰ２に由来することが見いだされた。 ＶＰ３のＣ末端１１アミノ酸を削除することによって、ＶＰ３によるアポトシ スの誘発が強く減少される。その結果、ＶＰ３のＣ末端領域に終止コドンを導入 することによりＣＡＶの病原活性を著しく減少することができる。ＶＰ３のコー ド領域にある余分な終止コドンが完全なＣＡＶゲノムを含むＣＡＶクローン ｐ ＣＡＶ／ＥｃｏＲＩ（ノテボーンおよびデ ボア）に導入される。完全なＣＡＶ 変異ゲノムはベクタから切出されそしてリサイクルされる。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１ 細胞はリサイクルされたＣＡＶ変異ＤＮＡによってトランスフェクトされる、そ してより病原性の少ない子ウイルスが収穫される。ニワトリは弱毒化されたＣＡ Ｖ変異ウイルスによりワクチン接種される。ＶＰ２タンパク質もまたアポプトシ ス誘発に影響があるので、ＶＰ１，ＶＰ２および／またはＶＰ３のコード領域内 の変性を含む弱毒化されたＣＡＶを製造することもまた可能である。 前記のＶＰ２および／またはＶＰ３のコード領域に終止コドンを導入すること は、またＣＡＶ組換え生きたウイルスベクタの製造にも用いることができる。 より成長した段階でＣＡＶに感染された動物は臨床的な症状を現さない。にも 拘わらず、このような感染は、家禽の業界に対して大きな経済的損害を与えるで あろう。前記の組換えＣＡＶ産生物により動物を免疫化することにより前記の無 症状の症状に対する積極的な保護が得られるであろう。 個別的に、または１種または２種の別のＣＡＶタンパク質とともにバキュロウ イルス系で発現された３種のＣＡＶタンパク質は、ＣＡＶに対する抗体を追跡す るのに用いることができる。ＣＡＶに感染されたまたはワクチン接種されたニワ トリはこのようにして追跡できる。１種またはそれ以上のＣＡＶタンパク質はイ ムノアッセイ、たとえば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イ ムノペルオキシダーゼ染色、および免疫蛍光法等に用いることができる。中和抗 体を測定するためには２種またはそれ以上のＣＡＶタンパク質が要求される。 昆虫細胞中、ＣＡＶ組換えバキュロウイルスで合成した３種のＣＡＶ組換え産 生物によりマウスを免疫化すると、最終的にＶＰ２およびＶＰ３に特異的なモノ クロナール抗体が製造された。これらのモノクロナール抗体は、ＣＡＶに感染さ れた細胞中の特異な構造物とのみ反応して、そして非感染の細胞とは反応しなか った。 組換えＣＡＶタンパク質によって産生された抗体を用いることによってＣＡＶ に感染されたニワトリの臓器調製物中で、ＣＡＶタンパク質を追跡することがで きる。これらのデータに基づいて信頼のおける診断方法が開発される。本発明に 従うモノクロナールおよびポリクロナール抗体は、たとえばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ 、ＳＰＩＡ、免疫蛍光アッセイおよびイムノペルオキシダーゼ染色法等のその他 の診断アッセイにおいても、所望ならば１種またはそれ以上のＣＡＶタンパク質 またはそれらの断片とともに使用することができる。 原則的には、免疫学的診断方法の公知のすべての態様が、利用できるすべての ラベルについてそして実施されるべき試験法およびそれが実施される条件に従っ て可能であり、当業者は最も適した態様を選択することができる。さらに、本発 明の目的のためには、抗体および／または他のタンパク質ポリペクチドが望まし い活性を有する限りそれらの誘導体およびまたは断片であってもよい。抗体の場 合、これは少なくとも抗原を認識できねばならないということを意昧する。 本発明に従う抗体は、家禽の受動的（パッシブ）な免疫化にも用いることがで きる。本発明に従う抗体に対して、いわゆる抗原の内部イメージと呼ばれる抗体 が産生される。そして再びこのような状態で、特に受動的な免疫化および診断薬 の分野で用いることができる。 ＣＡＶは、感染された胸腺細胞でアポプトシスを誘発する。（ヒト）腫瘍のＣ ＡＶ感染は、また腫瘍細胞の細胞死をもたらすということが可能である。 試験内で、ＣＡＶタンパク質ＶＰ３はそれ自身、ニワトリ単核性腫瘍細胞にお いて、および様々なヒト腫瘍細胞においてアポプトシスを誘発することができる 。 そのため、ＣＡＶ蛋白を発現することは（ヒト）腫瘍において細胞死を誘発す るために用いることもできる。ＶＰ３タンパク質は、ＤＮＡトランスフェクショ ンによって腫瘍中一過的に発現することができる。（腫瘍）細胞中のＶＰ３の発 現は、ＶＰ３のコード配列を含む（レトロ）ウイルスベクタで細胞を感染させる ことによっても生じ得る。細胞にＶＰ３タンパク質および／またはＶＰ３のコー ド配列を含む非ウイルス性成分（たとえばリポゾームまたはトランスフェリン由 来のベクタ）を投与することも（腫瘍）細胞中にＶＰ３を発現または存在させる ためのさらなる可能性である。 前記のように使用することにより（腫瘍）細胞中ＶＰ２またはＶＰ２とともに ＶＰ３を発現することにより細胞死を誘発することも可能となる。 ＣＡＶタンパク質ＶＰ２および／またはＶＰ３は、（ヒト）腫瘍形成を減少す る治療に用いることができる。これはたとえば本発明に従うタンパク質を直接、 固形腫瘍に注射するか、あるいは腫瘍にくっついている抗リガンドに対する親和 性を有するリガンドにタンパク質をカップリングすることにより起こり得る。こ のカップリングは、化学的におよび（リガンドもまたタンパク質である場合）融 合タンパク質を組換えるこ とにより達成することができる。 化学的カップリングは、直接的にまたはスペーサグループを介して達成するこ とができる。所望ならば、スペーサグループを介するか否かに拘わらず、リガン ドおよびウイルス性タンパク質が結合される分化していない血清タンパク質のよ うな不活性な担体分子を選択することができる。 しばしば提唱されるリガンド／抗リガンド相互作用の組合わせの例は、リガン ド−リセプタ対、たとえばＥＧＦ／リセプタ、ＩＬ−２／リセプタ、／Ｔ細胞リ セプタ、抗体／腫瘍抗原等である。 細胞によって取込まれることができるリガンド−抗リガンドの組合わせが好ま しい。コンジュゲート（接合体）が選択されるとき、細胞中のウイルス性タンパ ク質が未変性の形で戻るように、ウイルス性タンパク質およびリガンド間のカッ プリングとして潜在的に不安的な基を適用することは有利であり得る。必ずしも すべての場合、取込み可能な組合わせを選択する必要はない。腫瘍細胞は代謝的 に活性であり、そして積極的にまたは消極的にファゴシトシスおよび／またはピ ノシトシスにより物質、すなわち本発明に従うタンパク質を取込むであろう。 本発明に従うタンパク質が、どのような様式であれ、カップリングされるリガ ンドは完全なリガンドである必要はない。一般的にそれは、抗リガンド結合部分 を用いれば充分である。また、問題となるリガンドの誘導体もそれらが抗リガン ド結合活性を有する限り有用であるだろう。リガンドが抗体である場合、それに 対して投与されるタイプのものより別のものに由来する抗体がほとんどの場合免 疫応答を起こすであろうという事実が考慮されるべきである。さらに、これは数 多くの他のタンパク質リガンドに対しても当てはまる。 このようにして、抗体が免疫応答を起こさずに、しかも望ましい抗原を認識す るように動作することができるということが充分に知れわたってきた。 下記に、動物抗体がどのようにして人間に対する腫瘍に適するよう（ヒューマ ナイジング）にされるか簡単に説明されるが、別のタイプを適用させることもま た可能であるということは明らかであろう。 まず第１に、ＦＡＢ、ＦＡＢ’２またはさらに小さい断片を作成するためにヒ ューマナイズされるべき抗体から一定の部分を化学的に除去することが可能であ る（ウインター等、１９９０年）。一般に、これらの断片は少なくとも抗原性が より低い。このような断片は組換えＤＮＡ法によって作成することができる。 さらに、動物抗体の一定の部分をヒト抗体の対応部分によって組換えＤＮＡ法 を用いて置換することもまた可能である（キャビリ等、１９８４年；ボス等、１ ９８４年）。 加えて、動物抗体の抗原結合領域をヒト由来の抗体に接種することもまた可能 である（ウインター等、１９８７年）。 それに対して抗体が形成された既知の腫瘍抗原はたとえば、ＣＥＡ（胎生児癌 抗原）などである。 本発明は下記の実験例によってさらに詳しく説明される。これはしかしながら 例示のためだけであり、権利範囲を限定するものと解釈すべきではない。 実験例 バキュロウイルス、昆虫細胞およびニワトリＴ細胞 組換えバキュロウイルス ｐＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ（ビショプ，１９９２年 ）はＲ．ポッセ博士（ＮＥＲＣウイルス学研究所、オックスフオード、イングラ ンド）から入手した。そしてゲノムＤＮＡはサマーおよびスミス（１９８７年） に記載されているとおり精製された。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒ ｄａ（スポドプテラ フルギペルダ、Ｓｆ９）細胞はアメリカンティッシュカル チャコレクション（ｎｏＣＲＬ １７１１）から入手した。バキュロウイルスス トックはサマーおよびスミス（１９８７年）に記載されているように１０％牛胎 児血清（Ｓ ＣＳ）を含むＴＣ１００培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中、融合性単層および懸濁 培地中増殖された。 マレック病ウイルス（ユアサ、１９８３年；ユアサ等、１９８３年）で形質転 換されたＴ細胞系ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１は１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６ ８０培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で増殖された。これらの細胞をＤＮＡトラン スセクション実験で用いた。 実施例１ １．１ ＣＡＶ ＤＮＡのクローニング 全てのＣＡＶ ＤＮＡ配列はプラスミドＤＮＡ ｐＩｃ−２０Ｈ／ＣＡＶ−Ｅ ｃｏＲＩから最初誘導された（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）。プラ スミドＤＮＡによる全てのクローニングステップは、原則的にマニアティス等（ １９８２年）により記載された方法に従って実施された。 ３種のＣＡＶタンパク質ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３のコード配列は、個別に Ｄ．Ｈ．Ｌ．ビショプ博士（ＮＥＲＣウイルス学研究所−オックスフォード、イ ギリス）から入手したバキュロウイルス転移ベクタ ｐＡｃＹＭ１（マツウラ等 、１９８７年）にクローンされた。ＣＡＶタンパク質ＶＰ３およびそれから誘導 される変異体のコード配列は、発現ベクタｐＲＳＶ−Ｈ２０（オフリンガ等）に クローンされた。 ＤＮＡ形質転換は、Ｅ．ｃｏｌｉ株 ＨＢ１０１で行った。全てのプラスミド は撹拌下、大量の培地で増殖され、ＣｓＣｌ₂グラデェントでセファアクリルＳ −５００カラムを通して濾過することにより精製された。 １．２ ＤＮＡ トランスフェクション 組換えバキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺのＤＮＡは、サマーおよびス ミス（１９８７年）によって記載された方法に従って、細胞外バキュロウイルス から単離された。ｌａｃＺ遺伝子は、制限酵素Ｂｓｕ３６１に特異な切断部位を 含む。ＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺをＢｓｕ３６ １で消化することにより直線化した。Ｓｆ９細胞は、スミス等（１９８３年）の 方法に従って直線化バキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ ＤＮＡのリン酸 カルシウム沈殿物および組換え転移ベクタによってトランスフェクトされた。こ れはＳｆ９細胞についてのグラハムおよびヴァン デル エブ（１９７３年）の トランスフェクションプロトコールの修正法である。 種々のヒトおよびニワトリ細胞系のトランスフェクションのために１０μｇの ｐＲＳＶ−ＶＰ３、ｐＣＭＶ−ＶＰ３、ｐＲＳＶ−ｔｒまたはｐＲＳＶ−ｔｒ ＤＮＡを２５μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に再懸濁し、２６０μｌのＴＢＳ緩衝液 と混合した。１０ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥデキストラン１５μｌをＤＮＡ混合物に 添加し、室温で３０分間、インキュベートした。 細胞は、テーブル遠心分離器中で１５００ｒｐｍで遠心分離された。培地を、 ５ｍｌＴＢＳ緩衝液で置換し、そして細胞を注意深く再懸濁した。細胞をペレッ ト状にし、ＴＢＳ緩衝液を除去した。細胞ペレットを注意深く３００のＤＥＡＥ デキストラン／ＤＮＡ混合物中に再懸濁し、そして室温で３０分間インキュベ ートした。２５％ＤＭＳＯ／ＴＢＳ０．５ｍｌを添加し、そして懸濁液を室温で ３分間インキュベートした。５ｍｌのＴＢＳを添加し、そして細胞をテーブル遠 心分離器中で１５００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液が除かれ、そして５ｍｌ の組織培養液が添加された。細胞を再懸濁し、遠心分離し、５ｍｌの組織培養培 地に入れて、３７℃−５％ＣＯ₂でインキュベートした。 １．３ 組換え ＣＡＶ バキュロウイルスの選択 細胞外バキュロウイルスを含む上澄み液をニュートラルレッド（ブラウンおよ びフォールカー、１９７７年）およびＸ−ｇａｌ（ブラウン等、１９９１年）を 用いてプラークアッセイで分析した。ｌａｃＺ陰性プラークを、ミクロタイタ皿 中Ｓｆ９細胞の単層に接種した。感染の５日後、上澄み液を収穫し、そして４℃ で貯蔵した。細胞溶解液を３２Ｐでラベ ルしたｐＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＬ ＤＮＡをプローブとしてドットス ロット ハイブリダイゼーションアッセイで分析した。 Ｓｆ９細胞の単層に、ラベルされたＣＡＶ ＤＮＡ プローブと強くハイブリ ダイズした細胞溶解物の上澄み液を接種した。感染の２日後、細胞を３Ｈロイシ ンでラベルした。タンパク質は、蛍光法で可視化された１４％ポリアクリルアミ ド（ＰＰＡ）ＳＤＳゲル（レムリ、１９７０年）上で分離され、そして特異組換 えＣＡＶタンパク質の存在およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質の不存在につ いて試験された。 １．４ 粗ＣＡＶタンパク質調製物の合成 感染されたＳｆ９の細胞中、期待されたＣＡＶタンパク質を発現した組換えＣ ＡＶバキュロウイルスをサマーおよびスミス（１９８３年）に記載された方法に 従って、すくい上げた。単層状のＳｆ９細胞を細胞あたり約５−プラーク形成単 位（ｐｆｕ）の感染度（ｍｏｉ）を有するバキュロウイルスの１つの型で感染し た。２種または３種の違ったＣＡＶ組換えバキュロウイルスの共感染は、細胞あ たり１０ｐｆｕの各々の組換えＣＡＶバキュロウイルスのｍｏｉを有するＳｆ９ の細胞単層の上で実施された。感染の３日後、感染されたＳｆ９細胞を収穫した 。粗細胞溶解物をＰＢＳ緩衝液に懸濁した。 実施例２ ２．１ ニワトリをＣＡＶ−特異的タンパク質により免疫化 生後６週間のニワトリのグループに、１種またはそれ以上の組換えＣＡＶバキ ュロウイルスで感染された１０⁶または１０⁸Ｓｆ９細胞の完全なフロイントアジ ュバント中で乳化された粗溶解物を腹腔内および皮下注射した。コントロールと して８匹の動物のグループに完全なフロイントアジュバントに乳化したＰＢＳ緩 衝液を注射し、免疫化実験を行った。免疫化の後、異なった日に血液を採取し、 そして血清を分析してＣＡＶに対する中和抗体を調べた。 ２．２ 母性動物のＣＡＶに対する免疫化 各々１６雌鳥からなる４つのグループに、同時にＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３ 組換えバキュロウイルスで、またはＶＰＩおよびＶＰ２組換えバキュロウイルス で、またはＶＰ１およびＶＰ２組換えバキュロウイルスで、ＶＰ１およびＶＰ３ 組換えバキュロウイルスで、またはＶＰ２およびＶＰ３組換えバキュロウイルス で感染した２×１０⁷Ｓｆ９細胞の粗溶解物を注射した。細胞溶解物は、完全な フロイントアジュバントの等体積に乳化した。コントロールとして、１６匹の雌 鳥のグループに完全なフロイントアジュバント中、ＰＢＳ緩衝液を注射した。こ れらの溶解物またはＰＢＳ緩衝液を注射した雌鳥の卵の卵黄物質をクロロホルム で抽出し、そして中和抗体の存在を分析した。 実施例３ ３．１ ＣＡＶタンパク質に特異的なモノクロナール抗体の製造と同定 モノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１は、不完全なフロイントアジュ バントを注入したＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞をマウスの腹腔内に注射することによ り得られた。最後に、免疫化したマウスの脾臓細胞をＰ３×６３−Ａｇ８．６５ ３骨髄腫細胞に融合した（ノテボーン等，１９９１年）。 ＣＡＶ抗原に対する他のモノクロナール抗体は、３種のＣＡＶ組換えバキュロ ウイルスで感染したＳｆ９細胞の粗抽出物を４ＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓に注射 することにより得られた。免疫化したマウスの血清を免疫化の後、ＣＡＶに対す る中和抗体の有無について７週間試験した。免疫化マウスの脾臓細胞をＰ３×６ ３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合した。ＣＡＶ抗原に対する抗体を次の異な った方法で試験した：血清中和試験；精製したＣＡＶおよびＣＡＶ組換えバキュ ロウイルスで感染したＳｆ９の細胞の粗溶解物に基づくＥＬＩＳＡ法；ＣＡＶ感 染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１またはＣＡＶ組換えバキュロウイルスで感染されたＳｆ９ 細胞についての免疫蛍光法；ＣＡＶ組換えバキュロウイルスで感染され たＳｆ９細胞の粗溶解物のウェスタンブロット法；およびＣＡＶ感染ニワトリの 胸腺分室（ｃｏｕｐｅ）のイムノペルオキシダーゼ染色法。 実施例４ ４．１ 試験管内中和試験 粗Ｓｆ９細胞溶解物またはＰＢＳ緩衝液を注射したニワトリおよびマウスの血 清を１：２または１：４に希釈し、そして２倍連続希釈した。希釈された血清を １時間１０⁴〜１０⁵ＴＣ１Ｄ₅₀ＣＡＶ−Ｃｕｘ−１でインキュベートした（フォ ン ビューロ等，１９８３年；フォン ビューロ等，１９８５年）。マレック病 ウイルスで形質転換されたＴ細胞系ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１の約１００，０００細胞 を希釈血清およびウイルスのこの混合物で感染させた。コントロールとして、陽 性ＣＡＶ抗血清および非病原性ニワトリに由来する陰性血清で中和されたＣＡＶ でＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を感染した。 ４．２ ＣＡＶ誘発実験 免疫化された雌鳥の５つのグループの有精卵を孵化した。１日目にヒナに１０^5.5 ＴＣ１Ｄ₅₀ＣＡＶ−Ｃｕｘ−１を筋肉注射した。感染６日後および１４日後 に、グループあたり５匹のヒナを解剖した。胸腺を肉眼でおよび免疫組織学的に 検査した。またヘパリン血を採取し、そして血液細胞をウイルス再単離アッセイ で検査した。感染１４日後にヘマトクリットを決定するために全ての動物からヘ パリン血を採取した。 実施例５ ５．１ 免疫組織および免疫蛍光 冷凍した胸腺分室と骨髄を作成し、ジュリセン等（１９８８年）に記載されて いるようにＣＡＶ−特異的モノクロナール抗体でイムノペルオキシダーゼ染色す るのに用いた。 細胞を８０％アセトンで固定し、ＣＡＶ−特異的モノクロナール抗体およびフ ルオロセインイソチオシアネートでコンジュゲートしたヤギ抗−マウスＩｇＣを 用いる免疫蛍光試験に使用した。 ５．２ 血液試料中のＣＡＶの検出 ＣＡＶ感染されたヒナの血液試料をＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｌとした。得ら れた細胞懸濁液２０μｌを１０⁵ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞に添加した。ＣＡＶ− 特異的細胞病原性効果が見られるまで、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を４〜５日毎に １０倍希釈し、新鮮な培地に移した。１０回継代培養の後、細胞病原性効果が見 られなければ、ウイルス単離は陰性とみなされた。継代培養の回数は、感染ヒナ ドリの血液中に存在する感染性ＣＡＶの量の目安である。 結果と考察 組換え転移ベクタの作製 ＣＡＶゲノムは、部分的にまたは完全に互いが重なり合う３つの大きなオープ ンリーディングフレームを含む。異なったリーディングフレームで開始コドンを 用いてＣＡＶゲノムは３つの特異なタンパク質をコードする。ＣＡＶタンパク質 のコード配列を別々にバキュロウイルス転移ベクタｐＡｃＹＭ１にクローンした （ＶＰ１，図１；ＶＰ２，図２；ＶＰ３，図３）。ＶＰ３リーディングフレーム はＶＰ２リーディングフレーム内に完全に入るので、ＶＰ２の発現の際、ＶＰが 明らかにより少ない程度であるが合成される。転移ベクタｐＡｃＹＭ１は、ポリ ヘドリンのコード配列を欠く。ポリヘドリンプロモータは、その内にポリヘドリ ン遺伝子の開始コドンのＡ−末端およびポリアデニル化シグナルを含む３′−非 コード配列を含有する。ポリヘドリン配列の両側に挟むようにウイルス配列があ る。転移ベクタは、細菌中での増殖のための原核配列を含む（マツウラ等，１９ ８７年）。 プラスミドｐＥＰ−５１．６（ノテボーン等，１９９２年ａ）は、７９１位〜 ２３１９位ＣＡＶ ＤＮＡ配列を含む。ＣＡＶ ＤＮＡ挿入部は、６２ｂｐ５′ −および１１７ｂｐ３′非コードＤＮＡ配列によって挟まれたＶＰ１タンパク質 の完全なコード領域を含む。プラスミドｐＥＰ−５１．６を部分的にＨｉｎｄII Iで切断し、それからＥｃｏＲＩで完 全に切断し、そして粘着末端をクレノウポリメラーゼを用いて平滑にした。１． ５ｋｂＣＡＶ ＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐＡｃＹＭ１をＢａｍＨＩ で直線化し、粘着末端をクレノウポリメラーゼで平滑にし、最後にアルカリホス ファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。１．５３ｋｂＣＡＶ ＤＮＡ断片を直線化さ れたｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡに結合した。ｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡ中のＶＰ１の方向 は、制限酵素分析により決定された。最終的な構築物ｐＡｃＶＰ１を図４に示す 。 プラスミドｐＥＰ−２４．０（ノテボーン等，発表日不詳）は、３５４位〜１ ５０８位（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）のＣＡＶ ＤＮＡ配列を持 つ１．１５ｋｂＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を含む。このＣＡＶ ＤＮＡ断片は、２ ６ｂｐ５′−および４８４ｂｐ３′非コードＤＮＡ配列で挟まれたＶＰ２のコー ド領域を含む。ＶＰ２の開始コドンの１０６ｂｐ下流、別のリーディングフレー ムにＶＰ３の開始コドンおよびＶＰ３のための他のコード配列が見いだされる。 プラスミドｐＥＰ−２４．０をＢａｍＨＩで処理し、１．１５ｋｂ ＤＮＡ断片 を単離し、ＢａｍＨＩで直線化しかつＣＩＰ−処理した９．３ｋｂｐＡｃＹＭ１ プラスミドに結合した。最終ＤＮＡ構築物ｐＡｃＶＰ２は、制限酵素で同定され た。これを図４に示す。 プラスミドｐＥＰ−１３．３（ノテボーン等，発表日不詳）は、４２７位〜８ ６８位ＣＡＶ ＤＮＡ配列（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）を持つ０ ．４６ＫｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を含む。ＣＡＶ ＤＮＡ断片は 、ＶＰ３のコード領域、すなわち５８ｂｐ５′−および２５ｂｐ３′非コードＤ ＮＡ配列を含む。プラスミドｐＥＰ−１３．３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏＲＩで切断し、そして０．４６ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。 転移ベクタｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡをＢａｍＨＩで直線化し、ＣＩＰで処理し、そ して９．３Ｋｂ断片を単離した。２つの合成ＤＮＡオリゴマ ５’−ＧＡＴＣＣ ＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′および５′−ＡＡＴＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧ ＴＴＧ−３′を互いに対合（ハイブリダイズ）し、そしてともにＢａｍＨＩ−Ｅ ｃｏＲＩ ＤＮＡリンカを形成した。ＤＮＡリンカを０．４６ＢａｍＨＩ−Ｅｃ ｏＲＩおよび９．３ｋｂＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に結合した。最終構築物ｐＡｃ −ＶＰ３を制限酵素消化により分析した。これを図４に示す。 組換えＣＡＶバキュロウイルスの作製 ３種の組換えＣＡＶ転移ベクタの各々をＳｆ９細胞中、組換えバキュロウイル スＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ ＤＮＡと一緒に、個別的にトランスフェクトした。 トランスフェクションは裸のバキュロウイルスＤＮＡおよび転移ベクタＤＮＡで 起こった。このバキュロウイルスゲノムは、ポリヘドリンプロモータの制御のも とポリヘドリン遺伝子の代わりにｌａｃＺ遺伝子を含む。相同（ホモロガス）組 換えの後、ｌａｃＺ遺伝子の代わりに、そしてポリヘドリン遺伝子のプロモータ の制御下、３種のＣＡＶ遺伝子のひとつを常に導入したバキュロウイルスが得ら れた。ＣＡＶ遺伝子を正しく導入したバキュロウイルスは、もはやｌａｃＺ遺伝 子を含まない。まず第１に、バキュロウイルスで感染した昆虫細胞のプラーク中 で、組換えＣＡＶウイルスにβ−ガラクトシダーゼ活性がないことを同定した。 さらに、バキュロウイルスゲノム中へのＣＡＶ ＤＮＡ配列の組み込みをハイブ リダイゼーション試験で、ＣＡＶ−特異的ＤＮＡプローブを用いて決定した。 Ｓｆ９細胞中、ＣＡＶタンパク質の発現 組換えＣＡＶで感染されたＳｆ９細胞中での特定のＣＡＶタンパク質の発現は 、３Ｈロイシンでのタンパク質ラベリングおよびＰＡＡ−ＳＤＳゲル電気泳動を 用いて分析された。 ＣＡＶタンパク質ＶＰ１は、計算分子量５１．６ｋＤａを有する（ノテボーン およびデ ボア，１９９０年）。組換えＶＰ１バキュロウイルスで感染された昆 虫細胞の溶解物は、バキュロウイルス性および細胞産生物の他に５２ｋＤａのタ ンパク質を含む。５２ｋｂａのタンパク質は、 バキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺで感染された昆虫細胞の溶解物および 非感染の細胞中には存在しない。ＶＰ１のコード配列を試験管内で発現すると、 結果として５２ｋＤａのタンパク質が得られた（ノテボーンおよびデ ボア，１ ９９２年）。ウサギ網状赤血球溶解物中で合成されたＶＰ１および昆虫細胞中で 合成されたＶＰ１が同一の分子量を有するので、ＶＰ１は、おそらくグリコシル 化されていない。 ＶＰ２をコードするが、ＶＰ３のコード配列の全ても含む遺伝子を試験管内系 で翻訳すると、３０および２８ｋＤａの特定のＣＡＶタンパク質そして少量の１ ６ｋＤａタンパク質産生物が産生された。ＶＰ３をコードするオープンリーディ ングフレームのみを試験管内系で翻訳すると、しかしながら１６ｋＤａのタンパ ク質のみが産生された。感染された昆虫細胞中で、組換えＶＰ２バキュロウイル スによりＶＰ２を発現すると、約２８ｋＤａおよび３０ｋＤａの特定の産物が産 生された。組換えｌａｃＺバキュロウイルスで感染されたＳｆ９細胞は、これら のＣＡＶ特異的タンパク質を含まない。１６ｋＤａのＣＡＶ特異的産生物は、非 常に少量でのみ例証されることができた。これらのデータは、ＶＰ２バキュロウ イルスがタンパク質ＶＰ２を強く発現するが、ＶＰ３を少程度発現することを示 す。その可能な説明は、バキュロウイルスゲノム上にある遺伝子内で閉じ込めら れた開始コドンが非常に非効率的に用いられるということである。 感染された昆虫細胞中で、合成された組換えＶＰ３バキュロウイルスは、１６ ｋＤａの主生成物と分子量約２１，０００および１２，０００〜１４，０００を 有する幾つかのタンパク質を少量、産生した。免疫蛍光アッセイで、ＣＡＶ特異 的モノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１は、ＶＰ３を発現するＳｆ９細 胞と特異的に反応する。このモノクロナール抗体は、ＶＰ３組換えバキュロウイ ルスで感染された、放射性同位体でラベルしたＳｆ９細胞の溶解物から分子量１ ６，０００を有するタンパク質のみを特異的に沈殿させた。ペプスカン（ｐｅｐ ｓｃａｎ） 分析（ガイセン等，１９８４年）において、モノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ −８５．１のエピトープはＶＰ３のＮ末端に局在化されていた。ペプスカン分析 を図５に示す。 組換えＣＡＶタンパク質で免疫化されたニワトリでの中和抗体の誘発 ニワトリ貧血症の場合、中和抗体が保護と適切に関連があることが確認されて いる。ニワトリに中和抗体を誘発するＣＡＶタンパク質または幾つかのＣＡＶタ ンパク質は、こうしてサブユニットワクチンの基礎を形成する。 まず第１に、本発明者らは、どのＣＡＶタンパク質がＣＡＶに対して抗体を誘 発し、ニワトリで中和可能か検査した。生後約６週間の８匹のニワトリを１グル ープにして、完全なフロイントアジュバントに乳化した組換えＣＡＶ感染細胞１ ０⁶または１０⁸の溶解物を注射した。コントロールとして８匹のニワトリの１グ ループに完全なフロイントアジュバントに乳化したＰＢＳ緩衝液を注射した。免 疫化前および免疫化、２、４および６週間後、血液試料を採取した。完全なフロ イントアジュバント中、ＰＢＳを注射したコントロール群の動物のどれもＣＡＶ に対する中和抗体を産生しなかった（表１）。組換えＶＰ２または組換えＶＰ３ バキュロウイルスで感染された１０⁶または１０⁸昆虫細胞の溶解物を注射したニ ワトリもＣＡＶに対して中和抗体を産生しなかった。組換えＶＰ１バキュロウイ ルス昆虫細胞で感染された溶解物を注射されたニワトリのうち３匹のニワトリが 、そして１０⁸感染細胞の投与量を注射されたニワトリのうち２匹のニワトリが １：８〜１：３２の範囲の低い力価を呈した。 ３種の組換えＣＡＶタンパク質を別々にニワトリに注射すると、全くあるいは ほんのわずかしかＣＡＶに対する中和抗体を誘発しないと結論される。 続いて、本発明者らは３種の組換えＣＡＶタンパク質の組み合わせがニワトリ で中和抗体を誘発することができるかどうか研究した。この目 的のために、Ｓｆ９細胞を３種の組換えＣＡＶバキュロウイルスで同時に感染さ せた。こうして組換えＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３を含む感染された１０⁶または１ ０⁸細胞の粗溶解物が調製された。生後６〜８週間の８匹のニワトリをグループ に分け、完全なフロイントアジュバントに乳化した溶解物を注射した。コントロ ールとして、８匹のニワトリのグループに完全なフロイントアジュバント中に乳 化したＰＢＳ緩衝液を注射した。免疫化５週間後、１０⁶感染細胞の溶解物で免 疫化した８匹のニワトリは、全て３２〜２５６の間の中和抗体力価を持つことが 見いだされた。ところが１０⁸細胞で免疫化した８匹の動物中の７匹は１６〜５ １２の間の中和抗体の力価を持っていた（表２ａ）。免疫化７週間後、両方のグ ループの全ての動物がＣＡＶに対する中和抗体力価を呈することが見いだされた 。ＰＢＳ緩衝液を注射されたニワトリのグループは、ＣＡＶに対する中和免疫応 答を示さないことが見いだされた。 ＣＡＶに対する中和抗体の誘発のためには、３種のＣＡＶタンパク質が昆虫細 胞の中で同時に合成されることが本当に必要か？ この質問に答えるために、Ｓ ｆ９細胞をＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３組換えバキュロウイルスで別々に感染さ せた。それから、粗細胞溶解物を組み合わせ、フロイントアジュバントと混合し そして８匹のニワトリのグループに注射した。コントロール調製物として、全て ３種のＣＡＶタンパク質を同時に合成したＳｆ９細胞の粗溶解物を用いた。両方 の調製物を完全なフロイントアジュバント中に乳化し、各々８匹のニワトリから なる別々のグループに注射した。 ３種のＣＡＶタンパク質が別々に合成されたＳｆ９細胞の粗溶解物を注射され たグループのニワトリの血清は、ＣＡＶに対する中和抗体を全く含まないか、ま たはほんの少しのみしか含まないことが判った。しかしながら、３種のＣＡＶタ ンパク質を一緒に合成したＳｆ９細胞の粗溶解物を注射されたコントロールグル ープの動物は、期待されたように中和免疫応答を示すことが見いだされた。ＰＢ Ｓ緩衝液を注射された動物 は、陰性であることが判った。 免疫化された母性動物の卵の中の中和抗体 上記の免疫実験から、Ｓｆ９細胞中、一緒に発現された３種の組換えＣＡＶタ ンパク質がＣＡＶに対する中和抗体を誘発したことが示された。次の実験で、２ 種のＣＡＶタンパク質の組み合わせもまた中和抗体を誘発できるかどうか調べた 。ここでは、免疫化された母性動物の卵黄中の抗体を測定した。 生後３３週間の１６匹のニワトリを４つのグループに分け、組換えＣＡＶバキ ュロウイルスの違った組み合わせで同時に感染されたＳｆ９細胞の粗溶解物を注 射した。ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３かＶＰ１＋ＶＰ２のいずれかを含む調製物は、 ほとんどの動物で、それらの卵に明らかに認識されうる中和抗体を誘発した（表 ３）。ＶＰ１＋ＶＰ３か、ＶＰ２＋ＶＰ３のいずれかを含む調製物を注射された ニワトリの卵は、卵黄に明らかな中和抗体を含まないことが判った。検査したニ ワトリの１匹の卵黄が低い力価の中和抗体を含むことが見いだされただけであっ た。ＰＢＳ緩衝液を注射された１６匹のニワトリのコントロールグループの卵に は、中和抗体が見つからなかった。組換えＣＡＶタンパク質を用いる上記の実験 のデータから、ＣＡＶ感染に対する中和抗体を誘発するにはＶＰ１＋ＶＰ２がと もに必要でありかつ充分であることが示される。しかしながら、ＶＰ１＋ＶＰ２ 訓製物中の少量のＶＰ３も除外できない。 免疫化されたニワトリのヒナでのＣＡＶ挑戦に対する保護 母体抗体がＣＡＶ感染によって引き起こされる臨床学的症状から若いヒナを保 護する。本発明者らは、特定の組換えＣＡＶタンパク質で免疫化したどのグルー プのニワトリのヒナがＣＡＶ挑戦に対して保護されるかを研究した。ここで、ウ イルスを単離し、そして胸腺の萎縮、ヘマトクリットの減少および死亡率の増大 というＣＡＶに特徴的な臨床学的症状を観察した。 生後２３日と３５日の間のヒナをグループに分け、高い投与量のＣＡ Ｖで挑戦した。感染の６日後、ＰＢＳ緩衝液を注射された母性動物を持つ解剖さ れた５匹の動物には全て肉眼で判る胸腺の減少が見いだされた。組換えＶＰ２＋ ＶＰ３を注射された母性動物のヒナの場合、５匹の動物中、４匹に小さい胸腺が あった。しかしながら、３種の組換えＣＡＶタンパク質を一緒に注射された母牲 動物の５匹のヒナは、解剖されると全て正常な胸腺を有することが判った。ＶＰ １＋ＶＰ２で処理された母性動物のヒナのグループでは、調べた５匹の動物のう ち、１匹のみが減少した胸腺を有することが見いだされた（表４）。感染の１４ 日後、グループあたり５匹の動物を解剖した。組換えＶＰ２＋ＶＰ３またはＰＢ Ｓ緩衝液で免疫化した母性動物の全てのヒナは、胸腺萎縮を患った。３種の組換 えＣＡＶタンパク質を一緒に注射した動物のグループの検査したヒナは全て正常 な胸腺を有していた。組換えＶＰ１＋ＶＰ２を注射した動物の調べたヒナのうち １匹のみが減少した胸腺を有していた（表４）。組換えＶＰ２およびＶＰ３を注 射した母性動物のヒナについて記載されているように（コシュ，未発表結果）、 組換えＶＰ１およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナが減少した胸腺を有するこ とが別の実験でも示された。感染１４日後、全てのＣＡＶ感染されたヒナのヘマ トクリットを決定した。２７％のヘマトクリットが貧血症の限度として選択され た。ＰＢＳ緩衡液を注射した母性動物のヒナは、全て７〜１９％内の値の非常に 減少したヘマトクリットを持つことが判った。組換えＶＰ２＋ＶＰ３を注射した 母性動物のヒナは、平均的にわずかばかり高いヘマトクリットを有する。これら のグループでは、１匹の動物のみが２７より大きいヘマトクリットを有していた 。別の実験から、組換えＶＰ１およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナは減少し たヘマトクリットを有していたことが示された（コシュ，未発表結果）。ＶＰＩ ，ＶＰ２およびＶＰ３を含む調製物を注射した動物のヒナで調べた３５匹のうち 、１匹の動物のみがはずれたヘマトクリットを持っていた。ところが、ＶＰ１＋ ＶＰ２グループの中では、２９匹の調べた動物のうち、２匹が２７％以下の ヘマトクリットを有した。 組換えＶＰ２およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナについて５０．９％の高 い死亡率が、そしてＰＢＳを注射したグループでは４８．３％の死亡率が観察さ れた。組換えＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３を注射した母性動物のヒナのグループでは 、死亡率は９％であり、ＶＰ１＋ＶＰ２グループでは１５．４％であった。しか し、動物のほとんどは、挑戦後５日以内に死亡した。ＣＡＶ感染による死亡は、 一般に後で起こる。この理由から、本発明者らは、表６で挑戦後、１４日目以前 と１４日目以降の死亡率を区別した。１４日目以前の死亡は、しばしば非特異的 であり、なかんずく注射の結果である。１４日目以降の死亡率は、ＶＰ１＋ＶＰ ２＋ＶＰ３に対する母体抗体のある動物のグループでは、７％であり、ＶＰ１＋ ＶＰ２に対する母体抗体のグループでは０％、ＶＰ２＋ＶＰ３に対する母体抗体 のグループでは２７．４％、そしてコントロールグループでは２０．７％である 。ＶＰ２＋ＶＰ３グループでは、８匹の動物が、おそらく貧血症によるヒナの劣 った条件の結果としてヘマトクリットを決定するために血液試料を採取した後、 死亡した。ＰＢＳグループでは、血液採取中、２匹の動物が死亡した。これらの 全ての動物は、明らかに減少した胸腺を持っていた。 ＣＡＶ感染されたヒナのウイルス血症は、血液細胞のウイルス単離を実施する ことにより検査した。グループあたり５匹の動物のヘパリン血液試料を挑戦後、 ６日および１４日目に採取した。ＶＰ２＋ＶＰ３またはＰＢＳを注射し、そして 現実的にＣＡＶ感染に対して保護されていなかった母性動物のヒナは、感染６日 後および１４日後に比較的高いウイルス力価を含有していることが判った。感染 の６日後、ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３またはＶＰ１＋ＶＰ２を注射した動物は、前 記のヒナより明らかに低いウイルス力価を含有することが判った。感染の１４日 後、ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３を注射した動物のヒナのグループのみが他の３つの グループより明らかに低いウイルス力価を持っていた。 母性動物中で中和抗体を誘発する実験結果によって、組換えＣＡＶタンパク質 ＶＰ１およびＶＰ２が中和免疫応答を誘発するのに非常に重要であることが示さ れる。感染実験は、組換えＣＡＶタンパク質ＶＰ３がＶＰ１＋ＶＰ２で得られる 効果に加えて補完的な保護を与えることを示す。 ＣＡＶに対するモノクロナール抗体の製造と同定 ＣＡＶに対するモノクロナール抗体を製造するために、ＶＰ１，ＶＰ２および ＶＰ３組換えバキュロウイルスで共感染されたＳｆ９細胞の粗溶解物をマウスに 注射した。全部でＣＡＶ抗原に対するモノクロナール抗体を産生する９の異なっ たハイブリドーマ細胞系が得られた。 バキュロウイルス発現系で製造されたＣＡＶ抗原のウエスタンブロットによっ て、モノクロナール抗体１１１．１，１１１．２，１１１．４，１１２．１，１ １２．２，１２０．１および１２０．２がＶＰ２に対して強く指向しており、そ してモノクロナール抗体１１１．３および１２０．３がＶＰ３に対して強く指向 していることが示された。ＶＰ２と強く反応するモノクロナール抗体は、全てＶ Ｐ３と弱い交差反応を示す。逆に、ＶＰ３に対するモノクロナール抗体は、ＶＰ ２と弱い交差反応を示す。 ハイブリドーマ製造のために用いた免疫化マウスの血清がＣＡＶに対する中和 活性を有するにもかかわらず、得られたモノクロナール抗体がいずれもＣＡＶに 対する中和活性を有しないことが血清中和試験によって示された。 ペプスカン分析（ゲイセン等，１９８４年）で、モノクロナール抗体１１１． ２のエピトープはＶＰ２の中央に局在化していた（図６）。モノクロナール抗体 １１１．３は、ＶＰ３のＮ末端のエピトープ（図７）、すなわちモノクロナール 抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１（図５）によって認識されるＶＰ３エピトープの 傍らに、指向することが見いだされた。 ＶＰ２およびＶＰ３に対するモノクロナール抗体がＣＡＶ感染された ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中で、特定の構造を認識することが免疫蛍光法によって 示された。ＣＡＶ抗原に対するモノクロナール抗体のいずれも非感染のＭＤＣＣ −ＭＳＢ１細胞と反応しなかった。ＣＡＶ感染細胞中で、ＶＰ２特異的モノクロ ナール抗体はＶＰ３特異的モノクロナール抗体よりも他の構造を認識する。 ニワトリ細胞でのＶＰ３の発現によるアポプトシスの誘発 ジュリセン等は、ＣＡＶが感染された胸腺細胞でアポプトシスを起こすことを 示した。本発明者らは、ＣＡＶタンパク質のうちの１つ、特にＶＰ３が単独でニ ワトリＴ細胞中、アポプトシスを起こすことが可能がどうか研究した。 ＶＰ３のコード配列を発現ベクトルｐＲＳＶ−２０Ｈにクローンした。４２７ 位−８６８位のＣＡＶ ＤＮＡ配列（ノテボーン等，１９９１年）を持つ０．４ ６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＥＰ−１３．３から単離し た。ＣＡＶ ＤＮＡ断片は、ＶＰ３のコード配列そしてさらに５８ｂｐ５′およ び２５ｂｐ３′−を挟む配列を含む。ベクタｐＲＳＶ−Ｈ２０をＢｇｌＩＩで直 線化し、ＣＩＰで処理し、そして４．３ｋｂ断片を単離した。２つの合成ＤＮＡ オリゴマ５’−ＧＡＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′および５′−ＡＡＴＴ ＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′をハイブリダイズし、そして２本鎖ＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩリンカを形成した。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡリンカおよび ０．４６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を４．３ｋｂ ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片に結合した。最終構築物ｐＲＳＶ−ＶＰ３は、ラウス肉腫ウイルス プロモータ制御のもとでのＶＰ３のコード配列を含んでいた。そして制限酵素分 析によって確認された（図８ａ，ノテボーン等，１９９３年）。 ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞をＤＥＡＥデキストラン方法を用いてｐＲＳＶ−ＶＰ ３のＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４２時間後、細胞 を固定し、そしてモノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ −８５．１で染色して、ＶＰ３の発現について分析した。細胞をさらに、無傷の 核のＤＮＡを非常に強く染色するが、アポプトシスされた核のＤＮＡを弱く染色 するヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）で染色した（テ ルフォード等，１９９２年）。トランスフェクトされた細胞の９０％以上で、ヨ ウ化プロピジウムで染色された核の中に微顆粒状のＶＰ３が分配されて含まれて いた。感染の２日後、ＶＰ３を発現する細胞の４０％は、ヨウ化プロピジウムで 弱く染色される核を含むことが見いだされ、そしてＶＰ３は集合体（団粒）とし て存在した。感染３日目およびその後で、ＶＰ３含有細胞の９０％以上は、ＶＰ ３集合体およびヨウ化プロピジウムで弱く染色されたＤＮＡを含むことが見いだ された（図９）。トランスフェクションの３日後、ＶＰ３でトランスフェクトさ れた細胞のＤＮＡは、アポプトシスに特徴的なオリゴヌクレオソマール ラダー パターン（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ｌａｄｄｅｒ ｐａｔｔｅｒ ｎ）を示した。 トランスフェクト細胞中に観察されたＶＰ３分布は、ＣＡＶ感染されたＭＤＣ Ｃ−ＭＳＢ１細胞のそれとよく対応する。感染後、初期（１〜１．５日後）には 、ＶＰ３は核に微顆粒状に分布され、細胞ＤＮＡはこの段階では無傷である。感 染の後期（約３日後）に、ＶＰ３は核中で集合体を形成する（コシュ，発表日不 詳）。ＣＡＶ感染された細胞のＤＮＡは断片化されている（ジュリセン等，１９ ９２年）。 本発明者らの結論は、ＶＰ３それ自身ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中、ＣＡＶ特異 的アポプトシスを誘発できるということである。単核細胞系ＬＳＣＣ−ＨＤ１１ 中で、ＶＰ３をコードするｐＲＳＶ−ＶＰ３を発現させても、これらの細胞でア ポプトシスを引き起こした。 ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中でのＶＰ２タンパク質の発現は、また細胞ＤＮＡに 損傷を起こす。ＶＰ２をコードするＤＮＡでＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を感染した ３日後、トランスフェクトされた細胞の２０％が、そして感染５日後、細胞の約 半分が、核がヨウ化プロピジウムで弱く染色 される。この理由から、ＶＰ２もまたＶＰ３より程度が少ないが、ＣＡＶ特異的 細胞死の誘発に関与しているようである。 ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中でのアポプトシスの誘発について末端を切り取った （トランケート）ＶＰ３の影響 ＶＰ３は、鎖長１２１アミノ酸からなるタンパク質で、２つのプロリンが豊富 な片、疎水性領域および２つの弱い正の荷電部分を含む（図８ｂ）。正の荷電領 域は、おそらく核局在化シグナルおよび／またはＤＮＡ−結合領域である（ノテ ボーン等，１９８７年，ラマクリシュナン，１９９３年）。 本発明者らは、ＶＰ３の基本Ｃ末端がＶＰ３のアポプトシス活性に関与してい るかどうか研究した。この目的のために、ＶＰ３コード配列のＣ末端で１１コド ンを取り除いて、末端が切り取られたＶＰ３生成物を製造した。プラスミドｐＥ Ｐ−ＶＰ３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、そして０．３８ ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII ＤＮＡを単離した。２つの合成ＤＮＡオリゴ マ５′−ＡＧＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧ−３′および５ ′−ＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＡ−３′をハイブリダ イズし、そして２本鎖ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ ＤＮＡリンカを形成した。プラ スミドｐＲＳＶ−Ｈ２０をＢｇｌIIおよびＳａｌＩで切断し、アルカリフォスフ ァターゼで処理し、そして４．３ｋｂ ＤＮＡ断片を単離した。ＨｉｎｄIII− ＳａｌＩ ＤＮＡリンカおよび０．３８ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片を ４．３ｋｂ ＢｇｌII−ＳａｌＩ断片の中で結合した。ＲＳＶプロモータの制御 のもと、末端の切り取られたＶＰ３タンパク質のコード配列を含む最終構築物を 制限酵素および配列分析によって分析した（図８ａ）。 ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を一過的にｐＲＳＶ−ｔ−ＤＮＡでトランスフェクト し、そしてトランスフェクションの後、異なった時期にモノクロナールＣＶＩ− ＣＡＶ−８５．１およびヨウ化プロピジウムで染色し た。トランスフェクション４２時間後、末端を切り取られたＶＰ３を発現する細 胞は、ほとんどその核に微顆粒状ＶＰ３を含んでいることを免疫蛍光が示した。 細胞ＤＮＡは、ヨウ化プロピジウムで強く染色された。トランスフェクションの ３日後でも、まだ末端を切り取られたＶＰ３を発現する細胞の８０％がヨウ化プ ロピジウムで強く染色された核を持つていた（図９）。ｐＲＳＶ−ｔｒでトラン スフェクションの３日後、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から単離されたＤＮＡは、ｐ ＲＳＶ−ＶＰ３でトランスフェクトされたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から単離され たＤＮＡより分解しないことが判った。末端を切り取られたＶＰ３を発現する細 胞のヨウ化プロピジウム陽性核の割合は、トランスフェクション後、５日目で約 ５０％にまで緩やかに滅少した。末端を切り取られたＶＰ３を含みそしてヨウ化 プロピジウムで弱く染色された細胞のほとんどは、顆粒状ＶＰ３分布を有してい た。単一の細胞のみがＶＰ３集合体を含んでいた。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中で の末端を切り取られたＶＰ３の発現では、野生型ＶＰ３の発現よりもかなり効率 悪く細胞死が誘発された。ＶＰ３変異体は、野生型ＶＰ３よりも少なくしか集合 体を形成できないことも注目できる。 ヒト腫瘍細胞中でのＶＰ３発現によるアポプトシスの誘発 ヒト細胞でＶＰ３を発現するために、発現ベクタｐＲＳＶ−ＶＰ３（図８ａ） およびｐＣＭＶ−ＶＰ３を用いた。ＶＰ３のコード配列を、シトメガロウイルス （ＣＭＶ）の強カプロモータとその近傍に初期（ｅａｒｌｙ）遺伝子を含む発現 ベクタにクローンした（ボスハート等，１９８５年）。４２７位〜８６８位のＣ ＡＶ ＤＮＡ配列を有する０．４６ＢａｍＨＩ断片（ノテボーン等，１９９１年 ）をプラスミドｐＡｃ−ＶＰ３から単離した（図４）。ベクタｐＣＭＶ−ｎｅｏ をＢａｍＨＩで直線化し、ＣＩＰで処理し、そして７．５ｋｂ断片を単離した。 ０．４６ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を７．５ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に結合した。 最終構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ３中のＣＭＶプロモータに関して、ＶＰ３コ ード配列の正しい方向は制限酵素分析を用いて決定した（図１０）。 ヒト細胞中、端を切り取ったＶＰ３を発現するために、端を切り取ったＶＰ３ をコードするプラスミドｐＲＳＶ−ｔｒの０．４６ｋｂＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片 をクレノウポリメラーゼと処理して平滑断端を与えそして単離した。ｐＣＭＶ− ｎｅoベクタをＢａｍＨＩで直線化し、平滑断端を与え、そしてＣＩＰで処理し て脱リン酸化した。０．４６ｋｂ平滑断端ＤＮＡ断片を７．５平滑断端ＤＮＡ断 片に結合した。構築物ｐＣＭＶ−ｔｒはＣＭＶプロモータの制御のもと、端の切 り取られたＶＰ３のコード配列を含む（図１０）。 まず第１に、ＶＰ３を３つのヒト造血腫瘍細胞系ＫＧ−１，ＤＯＨＨ−２およ びＫ５６２そして不死化した細胞系Ｊｏｂｏ−０中で発現した。細胞系ＫＧ−１ およびＫ５６２は、ヒト骨髄球性白血病の異なった患者に（コフラーおよびコル ディ，１９８０年）そしてＤＯＨＨ−２系は濾胞Ｂ−リンパ腫（ランデゲント等 ，未公表結果）の患者に由来する。Ｊｏｂｏ−０細胞をエプスタイン、バールウ イルス（ランデゲント，未公表結果）で不死化した。４つのヒト細胞系をｐＲＳ Ｖ−ＶＰ３（ＫＧ−１）のＤＮＡまたはｐＣＭＶ−ＶＰ３（ＤＯＨＨ−２，Ｋ５ ６２およびＪｏｂｏ−１）のＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を固定化し、 そしてモノクロナールＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１で染色することによりＶＰ３発 現を、ならびにヨウ化プロピジウムで染色することによりアポプトシスの誘発を 分析した。トランスフェクション後、すぐにＶＰ３陽性細胞でヨウ化プロピジウ ムで染色された核中に微顆粒状ＶＰ３の分布が観察され、そしてプロピジウムで 染色されなかった核中にＶＰ３集合体を含む核が観察された。ヨウ化プロピジウ ムで染色されずＶＰ３集合体を含む核を有するＶＰ３陽性細胞の割合は、４つの 異なった造血細胞系について、トランスフェクションの５日後で７５〜９５％の 間の範囲にあることが判った（図１１ａ）。続いてＫ５６２細胞を、Ｃ末端が切 り取られたＶＰ３を発現するプラスミドｐＣＭＶ−ｔｒのＤＮＡでトラン スフェクトした。Ｋ５６２細胞中で末端が切り取られたＶＰ３を発現すると、野 生型ＶＰ３より細胞死の誘発がより効率的ではなかった。 本発明者らの結論は、ヒト造血腫瘍細胞系でＶＰ３の発現は、アポプトシスの 特異的な誘発をもたらすということである。ヒト乳腫瘍細胞系ＭＣＦ−７（リッ プマン等，１９８０年）中、ＶＰ３を発現しても、アポプトシスの誘発の結果と なった（ノテボーン等，未発表結果）。 機能的ｐ５３を含まない（ヒト）腫瘍および腫瘍細胞系は化学療法剤および放 射線治療による細胞死の誘発に対して感受性がないかまたは少ないと、文献には 記載されている（ロー等，１９９３年）。特定の抗腫瘍剤によるアポプトシスの 誘発において、腫瘍サプレサー遺伝子ｐ５３が媒介体として働く。本発明者らは 、ｐ５３を持たないかまたは変位体ｐ５３を持つヒト細胞中で、ＶＰ３がアポプ トシスを誘発できるかどうか検査した。ＶＰ３をプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３を 用いるＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションによりヒト骨肉腫細胞中で 発現した。骨肉腫由来ＳａｏＳ−２細胞はｐ５３を合成できない。そしてＳａｏ Ｓ−２／Ａｌａ１４３細胞は、変異した、したがって機能的でないｐ５３を発現 する。正コントロールとして野生型ｐ５３を含むＵ２−ＯＳ細胞系を用いた（デ ィラ等，１９９０年）。ｐ５３^-（ＳａｏＳ−２およびＳａｏＳ−２／Ａｌａ１ ４３）であるかｐ５３⁺（Ｕ２−ＯＳ）である細胞中で、ＶＰ３は比較できる程 度にアポプトシスを誘発できることが図１２ａの結果から示される。トランスフ ェクションの６日後、ＶＰ３陽性細胞のほとんどは消滅している。末端の切り取 られたＶＰ３の発現は、ＳａｏＳ−２細胞で、ずっと効率悪くアポプトシスを誘 発した（図１２ｂ）。本発明者らの結論は、腫瘍サプレサー遺伝子ｐ５３を含む かまたは含まないヒト腫瘍細胞中でＶＰ３がアポプトシスを特異的に誘発できる ということである。 図面の説明 図１は、ニワトリ貧血症ウイルスのＶＰ１タンパク質のＤＮＡ配列お よびアミノ酸配列を表す。ＣＡＶ ＤＮＡ配列の順番は、オランダ国特許９００ ２００８に記載されている。 図２は、ニワトリ貧血症ウイルスのＶＰ２タンパク質のＤＮＡ配列およびアミ ノ酸配列を表す。ＣＡＶ ＤＮＡ配列の順番は、オランダ国特許９００２００８ に記載されている。 国３は、ニワトリ貧血症ウイルスのＶＰ３タンパク質のＤＮＡ配列およびアミ ノ酸配列を表す。ＣＡＶ ＤＮＡ配列の順番は、オランダ国特許９００２００８ に記載されている。 図４は、３種のＣＡＶ組換え転移ベクタｐＡｃ−ＶＰ１，ｐＡｃ−ＶＰ２およ びｐＡｃ−ＶＰ３の図式的表示である。 図５は、ＶＰ３由来のペプチド（１２−ｍｅｒｓ）を有するモノクロナール抗 体ＣＶ１−ＣＡＶ−８５．１のペプスキャン分析を表す。ＣＶ１−ＣＡＶ−８５ ．１がそれに対して指向する核配列ＰＳＴＶＦＲは、ＶＰアミノ酸配列の１２位 〜１７位である（ノテボーン等，１９９１年）。 図６は、ＶＰ２由来のペプチド（１２−ｍｅｒｓ）を有するモノクロナール抗 体１１１．２のペプスキャン分析を表す。モノクロナール１１１．２は、ＶＰ２ アミノ酸配列の1０９位〜１１６位であるエピトープＧＬＥＤＲＳＴＱを指向す る（ノテボーン等，１９９１年）。ペプチド番号１〜１４０で得られた結果のみ が示されている（ペプチド番号１４１〜２０６の吸光度≦０．１０３）。 図７は、ＶＰ３由来のペプチド（１２−ｍｅｒｓ）を有するモノクロナール抗 体１１１．３のペプスキャン分析を表す。モノクロナール１１１．３は、ＶＰ３ アミノ酸配列の１９位〜２３位であるエピトープＰＴＳＳＲを指向する。 図８パネルＡは、２種の発現ベクタｐＲＳＶ−ＶＰ３およびｐＲＳＶ−ｔｒの 図式的表示である。パネルＢは、ＣＡＶタンパク質ＶＰ３のアミノ酸配列を表す 。プロリン残基はイタリック体で印刷され、基本アミ ノ酸は太字で印刷されている。発現ベクタ中、コドンが取り除かれている１１の Ｃ末端アミノ酸には下線が施されている。 図９は、ＶＰ３または末端が切り取られたＶＰ３のアポプトシス効果の速度論 （ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を表す。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞をプラスミドｐＲＳＶ− ＶＰ３（０）またはｐＲＳＶ−ｔｒでトランスフェクトし、固定しそしてトラン スフェクション後、異なったときにモノクロナール抗体ＣＶ１−ＣＡＶ−８５． １で染色した。通常、ヨウ化プロピジウムで染色される、免疫蛍光を呈す細胞の 百分率が示されている。一試験あたり、ＶＰ３または末端の切り取られたＶＰ３ を発現した少なくとも１００細胞が数えられた。 図１０は、発現ベクタｐＣＭＶ−ＶＰ３およびｐＣＭＶ−ｔｒの図式的表示で ある。 図１１は、ヒト造血（腫瘍）細胞に対するＶＰ３のアポプトシス効果の速度論 を表す。ＫＧ１細胞系をプラスミドｐＲＳＶ−ＶＰ３でトランスフェクトし、そ して細胞系ＤＯＨＨ−２，Ｋ５６２およびＪｏｂｏ−０をプラスミドｐＣＭＶ− ＶＰ３でトランスフェクトした。ヨウ化プロピジウムで弱く染色される核を有す るＶＰ３陽性細胞、すなわち消滅細胞の百分率が示されている。一試験あたり少 なくとも２００細胞を数えた。 図１２は、ヒト骨肉腫細胞系に対するＶＰ３のアポプトシス効果の速度論を表 す。細胞系Ｓａｏｓ−２，Ｓａｏｓ−２／Ａｌａ１４３およびＵ２−ＯＳの細胞 をプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３でトランスフェクトした。ヨウ化プロピジウムで 弱く染色する核を有するＶＰ３陽性細胞、すなわち消滅細胞の百分率が示されて いる。一試験あたり少なくとも５００細胞を数えた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/01 Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 14/01 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．自然環境から遊離された、ニワトリ貧血症ウイルスに由来し、図１、図２ または図３のうちの１つの少なくとも一部分を含んで成り、かつニワトリ貧血症 ウイルスに対してアポプトシスを誘発することができるか、または直接あるいは 間接酌に抗体を産生することができることを特徴とするポリペプチド。 ２．アポプトシスを誘発する能力を減少させる変異がその中で提供されている 請求項１記載のポリペプチド。 ３．ニワトリ貧血症ウイルス感染予防用組成物であり、少なくとも請求項１ま たは２記載のポリペプチドとアジュバントとを含んで成ることを特徴とする組成 物。 ４．請求項１または２記載の１種以上のポリペプチドをコードすることを特徴 とする組換えＤＮＡ分子。 ５．図１、図２または図３の核酸配列の鎖の１本の少なくとも一部分を含んで 成るか、あるいは図１、図２または図３の核酸配列の鎖の１本の少なくとも一部 分を含んで成るＤＮＡ分子と、厳酷な条件下でハイブリダイズする請求項４記載 のＤＮＡ分子。 ６．少なくとも請求項２または５記載のＤＮＡ分子と発現のための公知の制御 因子とを含んで成ることを特徴とするベクタ。 ７．ウイルスに由来する請求項６記載のベクタ。 ８．レトロウイルスに由来する請求項７記載のベクタ。 ９．少なくとも部分的にバキュロウイルスに由来する請求項６記載のベクタ。 10．生きたウイルスベクタに由来する請求項６記載のベクタ。 11．請求項４または５記載の他のＤＮＡ分子を、第２のＤＮＡ分子として含ん で成る請求項６〜１０のいずれかに記載のベクタ。 12．キメラタンパク質をコードする請求項６〜１０のいずれかに記載のベクタ 。 13．請求項６〜１２のいずれかに記載のベクタでトランスフェクトされたこと を特徴とする宿主細胞。 14．請求項９記載のベクタでトランスフェクトされたことを特徴とする昆虫細 胞。 15．請求項１０記載のベクタとアジュバントとを含んで成ることを特徴とする 家禽類でのニワトリ貧血症予防用組成物。 16．少なくとも１つのウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ中に、アポプト シスを誘発する能力が減少されるような変異を有することを特徴とする末端が切 り取られたニワトリ貧血症ウイルス。 17．前記変異は、図８ｂのポリペプチドの１１Ｃ末端アミノ酸をウイルスが発 現しないような変異である請求項１６記載のウイルス。 18．請求項１６または１７記載のウイルスとアジュバントとを含んで成ること を特徴とする家禽類でのニワトリ貧血症感染予防用組成物。 19．請求項１または２記載のポリペプチドに対して指向することを特徴とする 抗体、その誘導体またはその断片。 20．少なくとも請求項１または２記載のポリペプチドと、検出用の試薬とを含 んで成ることを特徴とするニワトリ貧血症ウイルスに対する抗体を検出する装置 。 21．少なくとも請求項１９記載の抗体、その誘導体またはその断片と、検出用 の試薬とを含んで成ることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド検出する装 置。 22．細胞死の誘発における請求項１記載のポリペプチドの用途。 23．腫瘍の治療における請求項１記載のポリペプチドの用途。 24．請求項４または５記載のＤＮＡ分子が腫瘍細胞中で発現されることを特徴 とする腫瘍の治療法。 25．前記ＤＮＡ分子が、ウイルス性ベクタによって腫瘍細胞に導入される請求 項２４記載の治療法。 26．前記ＤＮＡ分子が、レセプタ仲介による取込みを経て腫瘍細胞に 導入される請求項２４記載の治療法。 27．前記ＤＮＡ分子がリポゾームによって腫瘍細胞に導入される請求項２４記 載の治療法。 28．請求項１記載のポリペプチドと腫瘍に関連するタンパク質、糖質またはリ ン脂質に親和性を有する物質とを少なくとも含んで成ることを特徴とする腫瘍治 療のためのコンジュゲート。 29．腫瘍に親和性のある物質が抗体、その誘導体またはその断片である請求項 ２８記載のコンジュゲート。 30．ＤＮＡが直接、腫瘍に注射される請求項２４の治療法。 31．ＤＮＡがエレクトロポレーションによって腫瘍細胞に導入される請求項２ ４記載の治療法。 32．ＤＮＡがパーティクルボンバードメント（粒子爆撃）によって腫瘍細胞に 導入される請求項２４記載の治療法。 33．少なくともポリペプチドが、パーティクルボンバートメント（粒子爆撃） によって腫瘍細胞に導入される請求項２８および２９記載の治療法。