JPH09506172A

JPH09506172A - 汎用的な抗ハプテン抗体を使用するイムノアッセイ及び該イムノアッセイで使用される材料

Info

Publication number: JPH09506172A
Application number: JP7515661A
Authority: JP
Inventors: パーソンズ，ロバート・ジー; コーワル，ロバート
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-11-18
Publication date: 1997-06-17
Also published as: US5518887A; EP0731917A1; CA2177467A1; AU1183295A; WO1995015498A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、汎用的な抗ハプテン抗体により試料中の被分析物質を検出してその量を測定するためのイムノアッセイ法に関する。多被分析物質イムノアッセイ法も開示する。抗ハプテン抗体を用いる試薬、装置及びキットも開示する。本発明は更に、二抗体方式により試料中の被分析物質を検出してその量を測定するためのイムノアッセイ法に関する。本発明は更に、抗体で被覆し、好ましくは固着した染色赤血球に関する。試料中の被分析物質の存在を検出して測定するための凝集アッセイでの上記染色赤血球の使用も開示する。被分析物質はハプテン、抗原又は抗体であり得る。染色して被覆した上記赤血球を用いる凝集アッセイ、組成物及びキットも包含される。

Description

【発明の詳細な説明】汎用的な抗ハプテン抗体を使用するイムノアッセイ及び該イムノアッセイで使用される材料発明の分野本発明はイムノアッセイの分野に関する。発明の背景イムノアッセイによるｉｎ−ｖｉｔｒｏ診断試験は通常、問題の被分析物質に対して特異結合親和性を示す抗体を包含する。このような試験方式では、抗原性被分析物質は抗体と直接結合するか又はハプテン−ラベル接合体と競合する（競合アッセイ）。前者の場合、凝集アッセイでのように抗体抗原複合体が成長し得る。あるいは、サンドイッチアッセイでは、抗原に対して親和性を有する他の抗体をシグナルラベルと接合して、一次抗体抗原複合体に結合することができる。シグナル応答は被分析物質濃度に正比例する。競合アッセイでは、被分析物質（通常は小さな分子）とハプテン−ラベル接合体との間で競合が生ずる。シグナル応答は被分析物質濃度に反比例する。大半の標的被分析物質は一般に、競合アッセイ又はサンドイッチアッセイ方式を用いて検出することができる。上記方法が目的に十分適う実例は多数あるが、一アッセイが一種の被分析物質のみに有効であるという点でこれらのアプローチの有用性は幾分限定されていた。多被分析物質アッセイは困難である。使用可能な種々のイムノアッセイ方式を以下で説明する。Ｍｏｃｈｉｄａ等の米国特許第４，１８５，０８４号は、洗浄及び分離ステップを用いる不均一相アッセイを開示している。不溶化した抗被分析物質抗体は、ハプテンに接合した被分析物質（ハプテン−被分析物質接合体）用の一次捕捉相として作用する。洗浄後、可溶性の標識した抗ハプテン抗体を加え、（抗被分析物質抗体／ハプテン− 被分析物質接合体／抗ハプテン抗体）の複合体を検出する。Ｓａｄｅｈ等の米国特許第４，２４３，７４９号は他の同様のサンドイッチアッセイ方式を開示している。Ｓａｄｅｈ等は特に、低分子量（ハプテン）抗原の測定に着目している。未知の被分析物質及びハプテン−被分析物質接合体を、競合アッセイ方式で不溶性抗被分析物質抗体と共にインキュベートする。洗浄ステップの後に、可溶性の標識した抗ハプテン抗体を加えて系を再度洗浄し、（抗被分析物質抗体／ハプテン−被分析物質接合体／抗ハプテン抗体）の標識複合体を検出する。Ｋａｎｇ等（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３２（９）：１６８２−１６８６（１９８６））は２通りのアッセイ方式を記載している。第１のアッセイ方式は、抗ハプテン抗体で被覆した微粒子（共通の捕捉粒子）、ハプテンに接合した抗被分析物質抗体（ハプテン−抗被分析物質抗体接合体）、及び標識した抗被分析物質抗体を使用する酵素イムノアッセイを示す。試料中に被分析物質が存在すれば、（抗ハプテン抗体で被覆した微粒子／ハプテン−抗被分析物質抗体接合体／被分析物質／抗被分析物質抗体）の複合体が生成し、これを検出する。フルオレセンは捕捉ハプテンとして機能する。微粒子はラテックス粒子である。Ｋａｎｇ等の第２のアッセイ方式はＢｕｎｔｉｎｇの米国特許第４，２７１，１４０号のアッセイ方式に類似している。このアッセイ方式は、固相に結合した抗ハプテン抗体、抗被分析物質抗体に接合したハプテン（ハプテン−抗被分析物質抗体）及び標識した被分析物質からなる。３種全ての成分の複合体を検出する。凝集アッセイでは、抗体又は抗原（もしくはハプテン）が小さな分子に結合し得る。凝集性キャリヤーとして使用されていた粒子にはラテックス、木炭、カオリナイト、ベントナイト、無機コロイド状粒子、微生物細胞及び赤血球が含まれる。Ｍｏｃｈｉｄａの米国特許第４，３０８，０２６号を参照されたい。（抗体又は抗原で被覆した）これらの被覆粒子を、抗原又は抗体を含む試料と混合すると、被覆粒子が肉眼で検出可能な凝集を生ずる。凝集は、それ以外はスムースな懸濁液からのラテックポリマー粒子の固まりを特徴とする。機器を使用せずとも、単にスライド上で定量ラテックス凝集試験を実施することができる。それぞれ特異性の異なる抗体で感作し、次いで混合した着色の異なるラテックス粒子によって、２種以上の抗原を同時に検出することができる。Ｈａｄｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｇ．等，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，９７：１５３−８（１９８７）。Ｈａｄｆｉｅｌｄ等の米国特許第４，７４５，０７５号（１９８８年５月１７日）。米国特許第４，４１９，４５３号は更に、Ａｍｏｃｉｄイエロー、ブリリアントクロセイン３ＢＡ赤色色素、及びＣａｌｃｏＯｉｌＢｌｕｅＮＤｙｅで染色したラテックス粒子を開示している。米国特許第４，７４５，０７５号は、赤色又は青色に染まった死滅Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ細胞の懸濁液を固相とする試薬を含む、β−ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの分類用試験キットも市販されていることを開示している。Ｈｉｌｌｙａｒｄ等の米国特許第５，０８６，００２号は、凝集試薬が、少なくとも１個の特異被分析物質結合分子に結合した少なくとも１個の赤血球結合分子を含み、該赤血球結合分子を被分析物質（直接アッセイの場合）又は被分析物質結合試薬（間接アッセイの場合）の不在下で赤血球と共にインキュベートすると凝集を生じない赤血球凝集アッセイを開示している。赤血球は試験すべき血液試料中に内在することが好ましい。被分析物質類似体と赤血球結合分子との接合体や、接合体の混合物を凝集試薬として使用してもよい。Ｃｈａｎｇの米国特許第４，４３３，０５９号は、２個の抗体がその特異性を変えないように「尾−尾」共有結合している凝集イムノアッセイ試薬を開示している。一方の抗体が、赤血球のような指示物質によって担持された抗原に特異的である。イムノアッセイで使用される抗体又は抗血清は時折、対応する抗体が産生した抗原とは別の化合物に対して反応性を示す。交差反応性と称するこの反応性は通常、構造的に一次抗原と関連する化合物に対するものである。この交差反応性は、構造的には類似しているが関連のない分子が抗体によって認識されるため望ましくないものであり得る。このため、抗体の見掛け特異性が低下し、従ってこの抗体を使用する診断試験の特異性が低下する。診断試験では、各々が異なる交差反応性パターンを示す２種以上の抗体（抗血清）を混合して、元のいずれの抗体の交差反応性も示さない共通の抗体プールを作る方法を教示することはできない。発明の要約本発明の一態様で、被分析物質（Ａ）のイムノアッセイを提供する。このイムノアッセイは、抗ハプテン抗体（αＨ）、被分析物質に接合したハプテン（Ｈ− Ａ）、及び抗被分析物質抗体（αＡ）を使用する。試料中に被分析物質が存在しなければ、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝が生成する。試料中に被分析物質が存在すれば、被分析物質が（αＡ）に対して（Ｈ−Ａ）と競合して、複合体｛（αＡ）（Ａ）｝が生成する。適切な時間インキュベートした後に、｛（α Ｈ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝又は｛（αＡ）（Ａ）｝の存在を検出又は測定する。｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の量は試料中の被分析物質の量に反比例し、｛（αＡ）（Ａ）｝の量は試料中の被分析物質の存在に正比例する。上記アッセイを、粒子、好ましくは微粒子を抗ハプテン抗体で被覆する凝集アッセイ方式で提供することができる。この場合、分離ステップは不要である。被覆した粒子の凝集で、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の生成を肉眼で検出することができる。本発明の他の実施態様により、二抗体方式を用いる改良されたイムノアッセイ法を提供する。二抗体方式では、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる少なくとも１種の他の抗体（αＢ）を用いて、試験試料中の被分析物質（Ａ）の存在を試験する。二抗体方式では、試験試料中に妨害物質（Ｘ）が存在しても被分析物質（Ａ）の量を検出又は測定することができる。被分析物質又は被分析物質類似体（Ａ）を固相（例えば微粒子）に直接又は間接的に結合することができる。複合体｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）｝、｛（Ｐ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝、又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの量は、試験試料中の被分析物質（Ａ）の量に反比例する。本発明の他の実施態様は、微粒子に結合した抗ハプテン抗体（αＨ）、被分析物質に接合したハプテン（Ｈ−Ａ）、及び２種以上の抗被分析物質（Ａ）抗体（αＡ）、（αＢ）を使用する。複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの量は、試験試料中の被分析物質（Ａ）の量に反比例する。本発明の他の態様で、抗ハプテン抗体で被覆していない粒子を添加することを含み、被覆粒子及び非被覆粒子が凝集の有無を視認しやすい色になっている上記凝集アッセイを提供する。本発明の他の態様で、粒子であることが好ましい固相に結合した抗ハプテン抗体を使用する多被分析物質アッセイを提供する。多被分析物質アッセイは競合凝集アッセイ方式で実施することができる。本発明の他の態様で、上記アッセイを実施するための試薬及びキットを提供する。本発明の他の態様で、各々が特異被分析物質用試薬を含んでいる種々のチャンバーを備え、上記試薬が分析すべき特異被分析物質に結合したハプテンである多被分析物質アッセイ装置を提供する。本発明の他の態様で、抗ハプテン抗体で被覆し、凝集アッセイで使用することのできる染色して、好ましくは固着した赤血球を提供する。更には、染色して被覆した赤血球を含む凝集アッセイキット、及び染色して被覆した赤血球を含み凝集アッセイで使用される組成物を提供する。図面の簡単な説明図１は被分析物質の不在下での抗ハプテン微粒子の凝集を図示する。図２は被分析物質の存在下での凝集阻害を図示する。図３Ａ及び図３Ｂは多被分析物質アッセイ装置の一例を示す。図４は抗体試験用のサンドイッチアッセイ方式を図示する。図５は薬物アッセイでの陰性反応、閾値及び陽性反応の写真を示す。図６−９で二抗体方式を説明する：図６は二抗体方式で被分析物質が存在しない状況を示す。従って、二抗体方式の両抗体は凝集反応を生起する。図７は、試験試料中に存在する構造的な関連物質が二抗体方式の一方の抗体と結合して、尚凝集を生じ得る状況を示す。図８は、異なる構造的な関連物質が二抗体方式の他方の抗体と結合して、尚凝集を生じ得る状況を示す。図９は、被分析物質が試験試料中に存在する状況を示す。二抗体方式の両抗体は被分析物質と結合し、凝集は生じない。発明の詳細な説明本発明は被分析物質（Ａ）のイムノアッセイを提供する。イムノアッセイは、抗ハプテン抗体（αＨ）、被分析物質に接合したハプテン（Ｈ−Ａ）、及び抗被分析物質抗体（αＡ）を使用する。（αＡ）を標識して、検出することができる。試料中に被分析物質が存在しなければ、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝が生成する。試料中に被分析物質が存在すれば、被分析物質が（αＡ）に対して（Ｈ−Ａ）と競合して、複合体｛（αＡ）（Ａ）｝が生成する。適切な時間インキュベートした後に複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝が存在すれば、複合していない（Ｈ−Ａ）や（αＡ）又は複合体｛（αＡ）（Ａ）｝と分離する。次いで、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝又は｛（αＡ）（Ａ）｝の存在を検出又は測定する。｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の量は試料中の被分析物質の量に反比例し、｛（αＡ）（Ａ）｝の量は試料中の被分析物質の存在に正比例する。上記アッセイを、抗ハプテン抗体を固相に結合できる競合アッセイ方式で実施することができる。上記アッセイは、粒子、好ましくは微粒子上を抗ハプテン抗体で被覆する凝集アッセイ方式で実施することもできる。凝集アッセイでは、分離ステップは不要である。被覆した粒子の凝集で、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の生成を肉眼で検出することができる。本発明は更に、妨害物質（Ｘ）の存在下で、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる他の少なくとも１種の抗体（αＢ）を用いる被分析物質（Ａ）用の改良されたイムノアッセイ法を提供する。他の少なくとも１種の抗体（αＢ）を使用すると、試験試料中、妨害物質の存在下で被分析物質（Ａ）の存在を検出するか又はその量を測定する二抗体方式となる。上記妨害物質は、二抗体方式の抗体がある程度の交差反応性を示す構造的な関連物質であり得る。二抗体方式は更に、抗ハプテン抗体（αＨ）、被分析物質に接合したハプテン（Ｈ−Ａ）、及び少なくとも２種の抗被分析物質（Ａ）抗体（αＡ）、（αＢ）を使用し得る。二抗体方式の一実施態様によれば、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる少なくとも２種の抗体（αＡ及びαＢ）を用いる方法を使用する。試験試料中に被分析物質（Ａ）が存在しなければ、抗ハプテン抗体（αＨ）と、ハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）と、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる抗体（ αＡ及びαＢ）とが相互作用するために、凝集反応が生起する。被分析物質（Ａ）に特異的な抗体（αＡ及びαＢ）は接合体内の被分析物質と結合し、従って生成した複合体は、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（α Ｂ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものである。複合体の量は試験試料中の被分析物質（Ａ）の量に反比例する。二抗体方式の他の実施態様によれば、試験試料中に被分析物質（Ａ）が存在するときにこれを検出する。被分析物質（Ａ）は（αＡ）及び（αＢ）に対して（Ｈ−Ａ）と競合して、複合体｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝を生成する。｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（α Ａ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの存在を検出又は測定する。｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの量は試料中の被分析物質（Ａ）の量に反比例し、｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝の量は試料中の被分析物質（Ａ）の存在に正比例する。試料中に十分な量の被分析物質（Ａ）が存在すれば、適当な時間インキュベートした後に、被分析物質（Ａ）が抗被分析物質（Ａ）抗体と結合するよう十分に競合して複合体｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝が得られ、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝又は｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝の生成は制限される。二抗体方式の他の実施態様によれば、試験試料中に被分析物質（Ａ）は存在しない。被分析物質（Ａ）と構造的に関連し、（αＢ）は特異性を示すが（αＡ）は特異性を示さない物質（Ｘ）が存在し得る。このような方法では、構造的な関連物質（Ｘ）は（αＢ）と結合し、（αＡ）は複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（α Ａ）｝を生成する。その後、複合体を分離して検出することができる。二抗体方式の他の実施態様によれば、試験試料中に被分析物質（Ａ）は存在しない。被分析物質（Ａ）と構造的に関連し、（αＡ）は特異性を示すが（αＢ）は特異性を示さない物質（Ｘ）が存在し得る。このような方法では、構造的な関連物質（Ｘ）は（αＡ）と結合し、（αＢ）は複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（α Ｂ）｝を生成する。その後、複合体を分離して検出することができる。二抗体方式での上記アッセイは、上述したような競合アッセイ方式で実施することができる。上記アッセイは凝集アッセイ方式で実施することもできる。抗ハプテン抗体（αＨ）を粒子、好ましくは微粒子に被覆又は結合できる競合アッセイ方式及び凝集アッセイ方式の両方を行うことができる。凝集アッセイでは、分離ステップは不要である。被覆した粒子の凝集で、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの生成を肉眼で検出することができる。更には、アッセイに（αＢ）を加えて、妨害物質（Ｘ）を含み、抗被分析物質抗体（αＡ）、（αＢ）の一方がこの妨害物質（Ｘ）に対して交差反応性を示す試験試料中で被分析物質（Ａ）の量を検出又は測定し、偽陽性を排除してアッセイの完全性を保持することができる。抗ハプテン抗体で被覆した粒子（Ｐ−αＨ）、ハプテンと被分析物質に対する抗体との接合体（Ｈ−αＡ）を用いた、多重エピトープを有する被分析物質用の直接凝集アッセイも開示されており、被覆した粒子の凝集度は試料中の被分析物質の存在に正比例する。試料を、抗ハプテン抗体（αＨ）、抗体の結合する抗原に接合したハプテン（Ｈ−Ａｇ）及び標識抗体（αＡ＊）に暴露することからなる、試料中の抗体（α Ａ）の検出及び測定用イムノアッセイ法も本明細書に開示する。複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａｇ）（αＡ＊）｝が得られるとすれば、これは試料中の抗体（αＡ）の量に反比例し、残りの（αＡ＊）の量は試料中の（αＡ）の量に正比例する。試料を、抗ハプテン抗体で被覆した粒子（Ｐ−αＨ）、並びにハプテン及び抗体に対する抗原を含んでなる接合体（Ｈ−Ａｇ）に暴露することからなる試料中の抗体（αＡ）用直接凝集アッセイも本明細書に開示する。被覆した粒子の凝集は試料中の抗体量に正比例する。抗ハプテン抗体を使用する多被分析物質アッセイ及びアッセイ装置も本明細書に開示する。上記の全てのアッセイを実施するための試薬及びキット、例えば抗ハプテン抗体で被覆した染色固着赤血球も本明細書に開示する。アッセイ方式本発明は、ホモジニアス、サンドイッチ、競合及び凝集アッセイ方式のような方式で実施することができる。サンドイッチ又は競合アッセイ方式では、抗ハプテン抗体を固相に結合させて、固相を汎用的な固相とし、これを使用して種々の被分析物質を分析することができる。固相用材料はイムノアッセイに使用されるものであれば何でもよい。天然材料、合成材料又は合成的に改変される天然材料が使用され得る。材料には、多糖［紙、セルロース及びセルロース誘導体（酢酸セルロース及びニトロセルロース）を含むセルロース材料］、シリカ、ガラス繊維、無機材料［例えば失活アルミン、珪藻土又はポリマー（例えば塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー）からなる多孔質ポリマーマトリックス中に均一に分散した無機微粉材料］、天然布（例えば綿）及び合成布（ナイロン）、多孔質ゲル（例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン）、ポリマーフィルム（例えばポリアクリルアミド）、磁気粒子、マイクロタイタープレート、ポリスチレン管、タンパク質結合膜、アガロース、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（Ｐｏｉｎｔｅｔ−Ｇｉｒａｒｄ，Ｆｒａｎｃｅ）、シリコン粒子、多孔質繊維マトリックス等が含まれる。本発明の一態様により、分析すべき被分析物質を含む試料を、ハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）、及び分析すべき特異被分析物質に対する抗体（抗被分析物質抗体、αＡ）と混合する競合アッセイ方式を提供する。抗被分析物質抗体を検出のために例えば酵素、放射性ラベル、蛍光ラベル又は化学ラベルで標識する。次いで、抗ハプテン抗体が結合した固相上に混合物を通し、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝が生成するのに十分な時間インキュベートする。次いで、未結合試薬を分離し、例えば未結合試薬を水性媒質中に溶解し、洗浄して固相から除去し、標識（αＡ）を検出することによって固相上の複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の生成を検出する。被分析物質が存在しなければ、複合体が存在する。試料が被分析物質を含んでいれば、被分析物質は標識した抗被分析物質抗体と結合し、複合体は存在しないか又は複合体の量が低下する。従って、複合体の存在は試料中の被分析物質濃度に反比例する。あるいは、水性媒質中の残留未結合標識（αＡ）の存在を分析することができる。洗浄ステップを含む競合アッセイの実施方法は当業界ではよく知られ、例えばＭｏｃｈｉｄａ等の米国特許第４，１８５，０８４号を参照されたい。競合アッセイ方式の一例を以下の実施例１３に示す。本発明の他の実施態様で、被分析物質（Ａ）の存在を検出するか又はその量を測定するための二抗体方式を提供する。二抗体方式は、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる２種以上の抗体（αＡ及びαＢ）を使用する方法を包含する。この検出又は測定は妨害物質（Ｘ）の存在下で行うことができる。このような妨害物質（Ｘ）は、二抗体方式の抗体（αＡ、αＢ）の一方がある程度の交差反応性を示し得る構造的な関連物質であり得る。この実施態様では、被分析物質（Ａ）を粒子（例えば微粒子）に直接又は間接的に結合して、微粒子−被分析物質（Ｐ−Ａ）を生成する。被分析物質（Ａ）及び構造的な関連被分析物質（Ｘ）が試験試料中に存在しなければ、微粒子−被分析物質接合体（Ｐ−Ａ）と抗体（αＡ及びαＢ）との間で複合体が生成するために、凝集反応が生起する。被分析物質は微粒子に直接結合しても間接的に結合してもよい。微粒子被覆の技術及び手順は当業者には公知である。二抗体方式の他の実施態様によれば、被分析物質（Ａ）が試験試料中に存在するときにこれを検出する。被分析物質（Ａ）は（αＡ）及び（αＢ）に対して（Ｐ−Ａ）と競合して、複合体｛（αＡ）（Ａ）｝、｛（αＢ）（Ａ）｝を生成する。適当な時間インキュベートした後に、複合体｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）｝、｛（Ｐ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものが存在すれば、これを複合体｛（αＡ）（Ａ）｝、｛（αＢ）（Ａ）｝と分離する。次いで、これらの複合体のいずれかが存在すれば、これを検出又は測定することができる。｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）｝、｛（Ｐ− Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの量は試験試料中の被分析物質（Ａ）の量に反比例し、｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝の量は試験試料中の被分析物質（Ａ）の存在に正比例する。試験試料中に十分な量の被分析物質（Ａ）が存在すれば、適当な時間インキュベートした後に、被分析物質を抗被分析物質抗体（αＡ及び αＢ）と結合するよう十分に競合させて複合体｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝を生成し、複合体｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）｝、｛（Ｐ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの十分な生成が効果的に阻止される。二抗体方式の他の実施態様は、試験試料中に被分析物質（Ａ）が存在しない状況を包含する。（αＡ）は特異性を示すが（αＢ）は特異性を示さない構造的な関連物質（Ｘ）が存在し得る。このような例では、構造的な関連物質（Ｘ）が（ αＡ）と結合して複合体｛（αＡ）（Ｘ）｝を生成し、（αＢ）は複合体｛（Ｐ −Ａ）（αＢ）｝を生成する。全ての抗体（αＡ）と結合するのに十分な量の構造的な関連被分析物質（Ｘ）が存在しても、抗体（αＢ）は（Ｐ−Ａ）と複合体を生成する。その後複合体を分離して、反応を検出すると、被分析物質（Ａ）については陰性反応が得られる。二アッセイ方式の他の実施態様によれば、試料中に被分析物質（Ａ）は存在しない。（αＢ）は交差反応性を示すが（αＡ）は示さない構造的な関連物質（Ｘ）が存在し得る。抗体（αＢ）は構造的な関連物質（Ｘ）と交差反応し、（αＡ）は複合体｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）｝を生成する。本発明の他の実施態様では、被分析物質（Ａ）の存在を検出する又はその量を測定するための二抗体方式を提供する。二抗体方式は、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる２種以上の抗体（αＡ及びαＢ）を使用する方法を包含する。この検出又は測定は妨害物質（Ｘ）の存在下で行うことができる。このような妨害物質（Ｘ）は、二抗体方式の抗体（αＡ、αＢ）の一方がある程度の交差反応性を示し得る構造的な関連物質であり得る。試料中に被分析物質（Ａ）及び構造的な関連被分析物質（Ｘ）が存在しなければ、抗ハプテン抗体（αＨ）とハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）と抗体（αＡ及びαＢ）との間で複合体が生成するので凝集反応が生起する。被分析物質（Ａ）に特異的な抗体が接合体の被分析物質と結合して、複合体が凝集し得る。従って、凝集反応で生成した複合体は、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものである。抗被分析物質抗体（αＡ及びα Ｂ）の一方又は両方を検出のために酵素、放射性ラベル、蛍光ラベル又は化学ラベルで標識することができる。二抗体方式の抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。好ましい実施態様では、第２抗体がモノクローナルである。被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる３種以上の抗体が使用できることも理解されよう。例えば、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる第３抗体（αＣ）をアッセイに加えて、特異性を改善してもよい。このような一例では、抗体（αＡ及びαＢ）が交差反応性を示す２種以上の妨害物質（Ｘ）が試験試料中に存在するため、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＣ）｝を凝集させるには第３抗体（αＣ）が必要となろう。更には、妨害物質が一方又は両方の抗体（αＡ、αＢ）による複合体の凝集を妨げないとしても、第３抗体（αＣ）を加えて、妨害物質（Ｘ）と結合させてもよい。その上、二抗体方式で加える任意の付加的抗体（例えば（αＣ））はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、より好ましくはモノクローナルである。二抗体方式の他の実施態様によれば、被分析物質（Ａ）が試験試料中に存在するときにこれを検出する。被分析物質（Ａ）は（αＡ）及び（αＢ）に対して（Ｈ−Ａ）と競合して、複合体｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝を生成する。適当な時間インキュベートした後に、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものが存在すれば、これを複合体｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝と分離する。次いで、これらの複合体のいずれかが存在すれば、これを検出又は測定することができる。｛（ αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（α Ｈ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの量は試験試料中の被分析物質（Ａ）の量に反比例し、｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（αＢ）（Ａ）｝の量は試験試料中の被分析物質（Ａ）の存在に正比例する。試験試料中に十分な量の被分析物質（Ａ）が存在すれば、適当な時間インキュベートした後に、被分析物質を抗被分析物質抗体（αＡ及びαＢ）と結合するよう十分に競合させて複合体｛（αＡ）（Ａ）｝及び｛（α Ｂ）（Ａ）｝を生成し、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの十分な生成は効果的に阻止される。従って、このような例では、このアッセイで検出すると陽性結果が得られる。例えば、フェンシクリジン（ＰＣＰ）が被分析物質（Ａ）ならば、抗体（αＡ）は（α ＰＣＰ１）で、（αＢ）は（αＰＣＰ２）である。両抗体（αＰＣＰ１及びαＰＣＰ２）はＰＣＰに対する特異性が異なる。従って、両抗体はＰＣＰと結合し、複合体｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（αＰＣＰ１）｝、｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（αＰＣＰ２）｝もしくは｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（αＰＣＰ１）（αＰＣＰ２）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの存在は試料中のＰＣＰの量に反比例し、｛（αＰＣＰ１）（ＰＣＰ）｝及び／又は｛（αＰＣＰ２）（ＰＣＰ）｝の量は試験試料中のＰＣＰの量に正比例する。二抗体方式の他の実施態様は、試験試料中に被分析物質（Ａ）が存在しない状況を包含する。（αＡ）は特異性を示すが（αＢ）は特異性を示さない構造的な関連物質（Ｘ）が存在し得る。このような例では、構造的な関連物質（Ｘ）は（αＡ）と結合して複合体｛（αＡ）（Ｘ）｝を生成し、（αＢ）は複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝を生成する。全ての抗体（αＡ）と結合するのに十分な量の構造的な関連被分析物質（Ｘ）が存在しても、抗体（αＢ）は（Ｈ−Ａ）及び（αＨ）と複合体を生成する。その後複合体を分離して、反応を検出すると、被分析物質（Ａ）については陰性反応が得られる。例えば、構造的な関連物質（Ｘ）はメタドン代謝物質の２−エチリデン−１，５−ジメチル−３，３−ジフェニルピロジリン（ＥＤＤＰ）であり、被分析物質（Ａ）はＰＣＰであり得る。両抗体（αＡ抗体はαＰＣＰ１であり、αＢはαＰＣＰ２である）は被分析物質（ＰＣＰ）に対する特異性が異なり、（αＰＣＰ１）は構造的な関連物質（ＥＤＤＰ）に対し交差反応性を示す。従って、試験試料中に（ＥＤＤＰ）が存在すれば、（αＰＣＰ１）がＥＤＤＰと結合し、残りの（αＰＣＰ２）が複合体｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（αＰＣＰ２）｝を生成する。生成した複合体｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（ αＰＣＰ２）｝の量は試験試料中の被分析物質（ＰＣＰ）の量に反比例する。二アッセイ方式の他の実施態様によれば、試料中に被分析物質（Ａ）は存在しない。（αＢ）は交差反応性を示すが（αＡ）は示さない構造的な関連物質（Ｘ）が存在し得る。抗体（αＢ）は構造的な関連物質（Ｘ）と交差反応し、（αＡ）は複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝を生成する。例えば、構造的な関連物質（Ｘ）はデキストロメトルファンであり、被分析物質（Ａ）はＰＣＰであり得る。両抗体（αＡ抗体はαＰＣＰ１であり、αＢはαＰＣＰ２である）は被分析物質（ＰＣＰ）に対する特異性が異なり、（αＰＣＰ２）は構造的な関連物質（デキストロメトファン）に対し交差反応性を示す。従って、試験試料中にデキストロメトルファンが存在すれば、（αＰＣＰ２）がデキストロメトルファンと結合し、（αＰＣＰ１）が複合体｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（αＰＣＰ１）｝を生成する。生成した複合体｛（αＨ）（Ｈ−ＰＣＰ）（αＰＣＰ１）｝の量は試験試料中の被分析物質（ＰＣＰ）の量に反比例する。二抗体方式による検出及び／又は測定に適した被分析物質は、低分子量物質［例えばテストステロン、ステリオール、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロンのようなステロイド；チロキシン及びトリヨードチロニンのような甲状腺ホルモン；生理活性ペプチド（例えばブラジキニン、アンギオテンシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン及び黄体形成ホルモン放出ホルモン）；エピネフリン、ノルエピネフリン、ヒスタミン及びセロトニンのような生理活性アミン］；比較的低分子量の物質（例えばインシュリン、グルカゴン、副腎皮質刺激ホルモン及びガストリン）、並びに高分子量物質（例えばヒト絨毛膜ゴナドトロピン、成長ホルモン、ヒト胎盤ラクトゲン、免疫グロブリンＥ、α−フェトプロテイン、肝炎Ｂ抗原）である。被分析物質はハプテン、抗原又は抗体であり得る。抗原の例には、微生物抗原（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、腫瘍特異抗原、細胞又は組織抗原、及び血清抗原）が含まれる。被分析物質が、治療薬、悪用薬剤及び毒素のような小さな分子であることが好ましい。二抗体方式アッセイは上述したような競合アッセイ方式で実施することができる。二抗体方式アッセイは凝集アッセイ方式でも提供され得る。二抗体方式の一実施態様では、被分析物質又は被分析物質類似体を粒子（例えば微粒子）に直接又は間接的に結合することができる。二抗体方式の他の実施態様は競合アッセイ方式及び凝集アッセイ方式の両方で実施することができ、粒子（好ましくは微粒子）が抗ハプテン抗体で被覆される。凝集アッセイでは、分離ステップは不要である。被覆した粒子の凝集で、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（αＨ（Ｈ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種の複合体が組み合わさったものの生成を肉眼で検出することができる。更には、アッセイに（αＢ）を加えて、妨害物質（Ｘ）を含む試験試料中の被分析物質（Ａ）の量を検出又は測定することができる。上述したように、上記アプローチは凝集アッセイに適用され得る。一般に、特に凝集アッセイ方式で種々の被分析物質を試験するには、各被分析物質について別々の試薬セットを作らなければならない。これは製造コストを上昇させるだけでなく、複数の被分析物質を１回で試験することもできない。本発明では以下の利点が得られる：１）抗ハプテンで被覆した粒子（Ｐ−αＨ）は、種々の試験で使用され得る汎用的な試薬である。２）このアッセイ方式によって、多被分析物質試験を実施することができ、即ち複数の試験を１つの試料について同時に行うことができる。３）多被分析物質試験方式で、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる少なくとも２種の抗体を用いて、望ましくない交差反応性を低下させることができる。発明の背景に記載した従来技術の凝集イムノアッセイに比べて、本発明では簡易性、迅速性、明確性、経済性、感受性及び特異性の利点が得られる。本明細書に開示する凝集アッセイでは結果を肉眼で検出することができ、また洗浄ステップや分離ステップを必要としない。従来技術の凝集アッセイは、検出すべき特異被分析物質ごとに感作される粒子を必要とし、多被分析物質試験は行えないが、本発明では、異なる試験に対して汎用的な試薬を用いて、１個の試料で多被分析物質試験を実施することができる。ある方式の好ましい形態を以下に示す：系には、抗ハプテン抗体で被覆した微粒子（Ｐ−αＨ）、ハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）、抗被分析物質抗体（αＡ）及び被分析物質（Ａ）を含む試料の４つの主成分がある。被分析物質（Ａ）がなければ、複合体｛（αＨ）（Ｈ −Ａ）（αＡ）｝の凝集物が生成する。この結果、凝集が生ずる（図１を参照されたい）。しかしながら、被分析物質（Ａ）が存在すれば、全ての抗体（αＡ）が被分析物質（Ａ）に結合し、非遊離抗体（αＡ）がなくなるために、相互を架橋することがない（図２を参照されたい）。従って、凝集は生じない。従って、陰性試料では凝集を生じ、陽性試料では凝集しないか又はあっても小さい。図５は、陰性反応、閾値反応及び陽性反応の場合の凝集を示す。二抗体方式の一形態を以下に示す：系には、被分析物質又は被分析物質類似体で被覆した粒子、例えば微粒子（Ｐ −Ａ）、抗被分析物質抗体（αＡ、αＢ）及び被分析物質（Ａ）を含む試料の３つの主成分がある。被分析物質（Ａ）がなければ、複合体｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）｝、｛（Ｐ−Ａ）（αＢ）｝もしくは｛（Ｐ−Ａ）（αＡ）（αＢ）｝又はこれら３種が組み合わさったものの凝集物が生成する。これらの複合体では凝集が生ずる。更には、二抗体方式は、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる少なくとも２種の抗体を加えてアッセイの完全性を保持するという利点がある。こうすることによって、（αＡ）及び（αＢ）の一方は、ある程度の交差反応性を示す妨害物質と交差反応し得、他方の抗体は被分析物質（Ａ）が試験試料中に存在すればこの被分析物質と結合し続け、被分析物質（Ａ）が試験試料中に存在しなければ（Ｍ−Ａ）と結合し続ける。二抗体方式の他の形態を以下に示す：系には、抗ハプテン抗体で被覆した微粒子（Ｐ−αＨ）、ハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）、抗被分析物質抗体（αＡ、αＢ）及び被分析物質（Ａ）を含む試料の４つの主成分がある。被分析物質（Ａ）がなければ、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の凝集物が生成する。この結果凝集が生ずる（図１を参照されたい）。被分析物質（Ａ）が存在すれば、二抗体方式は、被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる少なくとも２種の抗体を加えてアッセイの完全性を保持するという利点がある。こうすることによって、（αＡ）及び（αＢ）の一方は、ある程度の交差反応性を示す妨害物質と交差反応することがあっても、他方の抗体は被分析物質（Ａ）が試験試料中に存在すればこの被分析物質と結合し続け、被分析物質（Ａ）が試験試料中に存在しなければ（αＨ）（Ｈ−Ａ）と結合し続ける。図５は陰性反応、閾値及び陽性反応の場合の凝集を示す。当業者には、ハプテン−抗ハプテン対の代わりに、リガンド−レセプター対、ビオチン−アビジン対、相補的核酸の対、及び凝集を可能とする任意の対を使用できることも自明であろう。多被分析物質アッセイ本発明の一態様はマルチチャンバー凝集装置で実施され得る。各チャンバーは一つの特異的被分析物質の検出専用であり、特定の被分析物質に特異的な試薬を含んでいる。この装置では好ましくは、試料／反応混合物を各チャンバー内に同時に流入させて、チャンバー内で反応させることができるが、逆向させたり又はあるチャンバーの反応混合物を他のチャンバーの混合物と混合することはできない。所定の被分析物質（Ａ_x）に対する試験では、特異接合体（Ｈ−Ａ_x）及び抗Ａ x抗体（αＡ_x）、二抗体方式を使用する場合は更に少なくとも第２の抗Ａ_x抗体（αＢ_x）が必要である。しかしながら、この試験方式では被覆した粒子（Ｐ− αＨ）は全ての被分析物質に共通であり、系では汎用的な試薬となる。多被分析物質アッセイでは、被分析物質に特異的な成分の（Ｈ−Ａ_x）及び（ αＡ_x）の一方又は両方をマニホールド−チャンバー装置の各被分析物質用チャンバー内に予め充填することができる。更には、二抗体方式で他の抗被分析物質抗体（αＢ_x）を使用する場合、被分析物質Ａ_xに対して特異性のある付加的な抗体を各チャンバーに予め充填することもできる。好ましい装置は１９８７年１２月２３日に出願された米国特許出願第１３８，２５３号「ＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎＤｅｖｉｃｅ」Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．Ｇ．等、１９９０年１１月１６日出願の米国特許出願第６１４，７６２号「ＩｍｐｒｏｖｅｄＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎＤｅｖｉｃｅＵｔｉｌｉｚｉｎｇＳｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙＩｍｐｒｅｇｎａｔｅｄＭａｔｅｒｉａｌ」Ｆｏｒｎｅｙ，Ｒ．Ｊ．等、１９９０年１１月１６日出願の米国特許出願第６１４，８９５号「ＩｍｐｒｏｖｅｄＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎＤｅｖｉｃｅＵｔｉｌｉｚｉｎｇＰｏｒｏｕｓＡｂｓｏｒｂｅｎｔＭａｔｅｒｉａｌ」Ｒｏｐｅｌｌａ，Ｐ．Ｊ．等、及び１９９０年１１月１６日出願の米国特許出願第６１４，８１７号「ＩｍｐｒｏｖｅｄＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎＤｅｖｉｃｅＨａｖｉｎｇＧｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＣｈａｍｂｅｒｓ」Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．Ｇ．等に開示されている。これらの特許明細書は参考として本明細書の一部を構成するものとする。これらのマルチチャンバー装置の一例を、多重管路装置の２つの視点を示す図３Ａ及び図３Ｂに示す。各管路内に異なるハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）を含ませることが好ましい。各チャンバー内では、接合体（Ｈ−Ａ）が特定のチャンバー内で検出すべき特異被分析物質を有する。競合アッセイでは、チャンバー底部は上述した固相材料のいずれかからなり得る。装置は、各チャンバー内に試料の一部を導入し、これを接合体と混合して混合物を生成し、混合物が他のチャンバー内に進入しないようにするための手段を含んでいる。同様に、この装置は更に、未結合試薬を、固相に結合した複合体と分離させ得る手段を含んでいる。例えば、洗浄を分離ステップとして使用する場合、この装置では同様に、未結合試薬を含む各チャンバー内に洗液を入れたりそこから出したりすることができるが、未結合試薬を含む洗液を他のチャンバーに入れることはできない。この後者の目的を達するために、あるチャンバー内の試料混合物を別のものと分離する同一手段が使用され得る。あるいは、抗ハプテン抗体がウェルに結合した単純なマイクロタイターウェルプレートを使用して、以下の実施例１３に説明するような競合アッセイ方式を実施することができた。最も好ましい実施態様では、多被分析物質アッセイに凝集方式を使用する。Ｈ −Ａ接合体を水溶液に溶解し、各管路の底部上に置き、乾燥した後に試料混合物を導入する。例えば以下の実施例１０を参照されたい。試料を含む混合物、被覆した粒子（Ｐ−αＨ）、二抗体方式を使用する場合は（αＡ_x）、（αＢ_x）を同一の充填区域に導入する。混合物の一部が個々の管路内に流入するので、特異接合体が混合して、各管路内に完全反応混合物が生成する。抗ハプテン抗体で被覆した微粒子、ハプテン−被分析物質接合体及び抗被分析物質抗体又は抗体を組み合わせて反応混合物が完成するまでは、凝集反応は開始しない。各管路内に種々のハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａｘ，Ｈ−Ａｙ，Ｈ−Ａｚ．．．）を置き、二抗体方式を使用して微粒子と混合する場合は抗被分析物質抗体（αＡｘ，α Ａｙ，αＡｚ，．．．）及び（αＢｘ，αＢｙ，αＢｚ，．．．）の混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用することによって、各管路内で被分析物質ｘ，ｙ，ｚ等に対して別個の同時アッセイを行う。種々の被分析物質の試験結果は、特異ハプテン−被分析物質接合体を含む個々の管路内で明らかとなろう。代替の試験形態を実施してもよい。あらゆる形態はパネル試験方式及び単一試験方式として実施することができる。二抗体方式を含むアッセイの成分例を以下に示す：Ａ．被分析物質被分析物質は、低分子量物質［例えばテストステロン、ステリオール、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロンのようなステロイド；チロキシン及びトリヨードチロニンのような甲状腺ホルモン；生理活性ペプチド（例えばブラジキニン、アンギオテンシン、甲状腺ホルモン放出ホルモン及び黄体形成ホルモン放出ホルモン）；エピネフリン、ノルエピネフリン、ヒスタミン及びセロトニンのような生理活性アミン］；比較的低分子量の物質（例えばインシュリン、グルカゴン、副腎皮質刺激ホルモン及びガストリン）、並びに高分子量物質（例えばヒト絨毛膜ゴナドトロピン、成長ホルモン、ヒト胎盤ラクトゲン、免疫グロブリンＥ、α−フェトプロテイン、肝炎Ｂ抗原）を含む。被分析物質はハプテン、抗原又は抗体であり得る。抗原の例には、微生物抗原（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、腫瘍特異抗原、細胞又は組織抗原、及び血清抗原）が含まれる。被分析物質が、治療薬、悪用薬剤及び毒素のような小さな分子であることが好ましい。Ｂ．粒子及び粒子の被覆方法粒子は、付加的なシグナル生成試薬を用いずとも、試験試料中の被分析物質の存在又はその濃度を直接肉眼で読み取ることのできる肉眼で検出可能な着色微粒子であることが好ましい。このような粒子として使用される材料には、米国特許第４，３１３，７３４号及び第４，３７３，９３２号に開示されている金粒子及び染色粒子のようなコロイド状金属が含まれる。コロイド状セレン粒子のような非金属コロイドの製造や使用は、１９８７年７月９日に出願された本出願人による同時係属中の米国特許出願第０７２，０８４号（参考として本明細書の一部を構成するものとする）に開示されている。有機ポリマーラテックス粒子を使用することもできる。これらの粒子は、１９８８年９月２３日に出願された本出願人による同時係属中の米国特許出願第２４８，８５８号（参考として本明細書の一部を構成するものとする）に開示されている。天然又は有機ポリマーの他の粒子を使用することもできる。他の好ましい粒子は、凝集し得る細胞、例えば赤血球、好ましくはＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞（本出願人）のような固着赤血球である。赤血球を固着（即ち安定化）させ得る方法の一例はＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１００（３）：６４１（１９８８）に示されている。粒子が凝集し得、このような凝集を肉眼で検出できる限り、特定粒子の選択は重要ではない。公知の方法を用いて、抗ハプテン抗体を共有結合及び／又は吸着で粒子に結合する。例えば、ラテックス粒子のような粒子を抗体で受動的に被覆させることができる（Ｈａｄｆｉｅｌｄ等，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，上掲）。以下の実施例に開示するセレン粒子上への抗体の被覆方法を使用して、金粒子のような他の金属粒子を被覆することもできる。代替方法については例えば、Ｓｅｎｏの米国特許第５，０７５，１００号に開示されている鉄コロイドで標識した抗体の製造法を参照されたい。Ｃ．ハプテン及び抗ハプテン抗体ハプテンは、実験動物で通常タンパク質に接合すると免疫応答を誘発し得る小さな分子であり得る。ハプテンが抗原性部位を１個のみ有することが好ましい。これらのハプテンの例はフルオレセン、ローダミン、ビオチン及びジニトロフェニル基である。抗ハプテン抗体は当業界で公知の方法で産生することができ、抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体は例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス等のような宿主動物にハプテンを注射することによって産生され得る。注射の前に、まずハプテンを、アオガイヘモシアニン又はウシ血清アルブミンのようなキャリヤーと接合することができる。モノクローナル抗体は例えばＫｏｈｌｅｒＭｕｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）に開示されている方法で産生することができる。抗体は、例えばＲｅａｄｉｎｇの米国特許第４，４７４，８９３号又はＣａｂｉｌｌｙ等の米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法で産生された組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体の範囲内には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントのような抗体フラグメントも含まれる。このようなフラグメントは公知の技術で産生され得る。Ｄ．ハプテン−被分析物質接合体フルオレセン−被分析物質接合体のようなハプテン−被分析物質接合体は慣用的なアッセイ用被分析物質として市販されており、例えばこれを、（本出願人から市販されている）ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＴＤＸＦＰＩＡのトレーサーとして使用する。ハプテン−被分析物質接合体は、Ｗａｎｇ等の米国特許第４，６６８，６４０号に開示されているような当業界で公知の方法に従って産生することもできる。被分析物質に対して使用され得るアッセイ方式の例を以下に示す：ａ．競合アッセイ（図１及び図２）。免疫反応の要素は、抗ハプテン抗体で被覆した微粒子、ハプテン−被分析物質接合体、抗被分析物質抗体又は抗体、及び試料からなる。試験では、試料中の被分析物質が抗被分析物質抗体又は抗体に対してハプテン −被分析物質接合体と競合する。試料中に存在する被分析物質が増加すれば、凝集に使用され得る抗被分析物質抗体が減少するし、被分析物質が減少すれば、抗被分析物質抗体は増加する。従って、観察される凝集は、試料中の被分析物質濃度に反比例する。ｂ．抗体用直接サンドイッチアッセイ同様に、形態を抗体（Ａｂ）試験用にアレンジすることもできる。従って、問題の抗体が被分析物質となる。試料を、抗ハプテン抗体で被覆した微粒子（Ｐ−ｖＨ）、及び問題の抗体が特異性を示す抗原とハプテンとの接合体（Ｈ−Ａｇ）と混合する。試料中の抗体濃度は、（図４に示すような）複合体｛（Ｐ−αＨ）（Ｈ−Ａｇ）（Ａｂ）｝の生成によって生ずる凝集の量に正比例する。Ｅ．染色粒子及び染色方法本発明は更に、凝集プロセスを視認しやすくするための染色赤血球、好ましくは染色固着赤血球を提供する。Ｈａｄｆｉｅｌｄ等の米国特許第４，７４５，０７５号の３欄には、凝集アッセイに使用される赤血球の染色が提案されている。同特許では、赤血球を標準的な方法で製造又は染色することができ（例えば米国特許第４，４１９，４５３号及びドイツ特許出願ＤＴ−３０００−４８３号を参照されたい）、また特に適した色は赤、黄、青、緑、黒、青緑、深紅及び白であることが指摘された。本発明は例えば赤、緑又は青に染色できる赤血球を提供する。染色赤血球、好ましくは市販のＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞のような固着赤血球を抗体で被覆することができ、抗体は尚、抗原との結合能力を維持し、染色赤血球を凝集させる。染色粒子は匹敵し得る性能を有する非染色粒子よりも低濃度で使用することができる。色素が細胞に密着して、周辺のアッセイ溶液中に浸出しないことが好ましい。固着赤血球のような細胞に好ましい色素はチバクロームブルー３ＧＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、ＲｅａｃｔｉｖｅＲｅｄ，ＲｅａｃｔｉｖｅＧｒｅｅｎ，ＲｅａｃｔｉｖｅＹｅｌｌｏｗ等のようなＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，製ＲｅａｃｔｉｖｅＣｏｌｏｒＳｅｒｉｅｓ、ジアゾニウム色素（例えばＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製ＦａｓｔＢｌａｃｋＫ，ＦａｓｔＢｌｕｅＢ）、及びヨードアセトアミド又はマレイミドカップリング法による有機色素（例えばローダミンヨードアセトアミド、ローダミンマレイミド、エオシンヨードアセトアミド、エオシンマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド及びテトラメチルローダミンヨードアセトアミド）である。固着赤血球の場合、上記色素の重要な特徴は、赤血球には色素結合に使用できる遊離アミノ基がないか又は非常に少ないために、色素が官能基を介して赤血球に結合することである。最も好ましい色素は、赤血球、好ましくは固着赤血球と共有結合するものである。種々の粒子の色の強さのバランスをとって、凝集と凝集欠如とを十分に区別することが好ましい。上記凝集反応で染色粒子を使用して、（色の異なる）２種以上の粒子集団を混合して多重アッセイを行うことができる。着色の異なる粒子がほぼ同量存在することが好ましい。いずれの粒子集団と反応しても、溶液の色が全体に変化し、この変化は容易に肉眼で認めることができる。汎用的な抗ハプテン粒子を用いる多被分析物質アッセイ方式では、他の着色粒子、例えば着色の異なるラテックスやプラスチック粒子を使用することができる。これにより、上記試験の読み取り能力が大幅に増し、複数の試験を同時に実施することができる。従って、本発明には、従来技術に比べて、個々のアッセイ及び対照が、余分の時間や労力をかけずに独立に行われるという利点がある。実施例実施例１クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０による固着ヒト赤血球の染色固着ヒト赤血球（Ｄｕｒａｃｙｔｅ^TM，本出願人，上掲）を０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．０）中に懸濁させて、最終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）とした。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０色素（ＢｉｏｒａｄＬａｂｓ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を添加して最終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）とし、細胞を室温で１．５時間インキュベートした。最後に、上清の色が殆ど残らなくなるまで、細胞に対して遠心分離（１０００×Ｇ、１分間）及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム及び０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）による洗浄を交互に行った。得られた細胞懸濁液は暗紫色であった。実施例２シバクロンブル−３ＧＡによる固着ヒト赤血球の染色１０％Ｄｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞懸濁液を５０ｍＭＮａＯＨ中に調製した。チバクロームブルー３ＧＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）を懸濁液に添加して、最終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。懸濁液を室温で１．５時間混合した。細胞を実施例１と同様に遠心分離にかけて洗浄した。得られた細胞懸濁液は暗青色であった。実施例３チバクロームレッド２による固着ヒト赤血球の染色実施例２に記載の手順及びＲｅａｃｔｉｖｅＲｅｄ２（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）を用いて１０％Ｄｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞懸濁液を染色した。得られた細胞懸濁液は赤色であった。実施例４抗フルオレセンでの固着ヒト赤血球の被覆１０％（ｖ／ｖ）Ｄｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞懸濁液を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中０．０５％（ｗ／ｖ）塩化第二クロムの存在下で、１００μｇ／ｍｌ濃度の親和性精製したウサギ抗フルオレセンで被覆した。時折反応試験管を反転させて混合しながら、懸濁液を３０℃で１時間インキュベートした。遠心分離（１０００×Ｇ、１分）の後に、細胞を８×容量のＰＢＳで２度洗浄し、次いで２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）と共に室温で３０分間インキュベートした。細胞を最後にＰＢＳ中に再度懸濁させて（実施例１参照）最終細胞濃度を１０％（ｖ／ｖ）とした。実施例５抗フルオレセンでのコロイド状セレンの被覆（米国特許出願第０７２，０８４号（上掲）に開示された方法に従って調製した）約５７ｍＬのストックセレンコロイド（ＯＤ₅₅₀：１２．３）を７５０×Ｇで２５分間遠心分離した。軟質ペレットを２０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中に懸濁させた。遠心分離及び再懸濁を２度繰り返した。４００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水のｐＨを０．２％炭酸ナトリウムにより注意しながら７．８に調整した。約８．７ｍＬ（ＯＤ₅₅ ₀ ＝６８８）の前記セレンをｐＨ７．８の溶液に加えた。次いで、０．５ｍｇのプロテイン−Ａ精製ウサギ抗フルオレセンＩｇＧをセレン懸濁液に加えた。これを２〜８℃で一晩軽く攪拌した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）を懸濁液に加えて濃度を０．５％にした。攪拌を更に２時間継続した。この混合物を上述したように遠心分離によって洗浄した。最終遠心分離の後に、ペレットを０．１％ＢＳＡ、５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｎ− ［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）（ｐＨ７．８）中に懸濁させると、１５μＬを１ｍＬの水中に希釈させたときのＯＤ₅₅₀が２．０であった。これを２〜８℃で貯蔵した。実施例６抗フルオレセンでのコロイド状ポリピロールの被覆ＯＤ₈₀₀／ｍｌが約３５０のストックポリピロール（ＰＰ）１ｍＬを水（１ｍｌ）で３度、それぞれ１０００×Ｇで５分間の遠心分離（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｑｕｉｐｍｅｎｔＣｏ．，ＮｅｅｄｈａｍＨｅｉｇｈｔ，ＭＡ）を介して洗浄した。洗浄したＰＰ約２００〜３００μｌを０．５ｍｌの２５０ｍＭＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）（ｐＨ７．０）、４．５ｍＬの水、及び１０〜２５０μｇのプロテイン−Ａ精製したウサギ抗フルオレセンＩｇＧと１０分間混合した。ＢＳＡを混合物に加えて濃度を０．０５％にした。懸濁液を更に１０分間混合した。次いで、調製物を（１ｍＬの）０．５％ＢＳＡ、３５ｍＭＭＥＳ（ｐＨ７．０）で３度洗浄した。最後に混合物を５０μｌの同一緩衝液中に懸濁させた。実施例７コカイン代謝物質（ベンゾイルエコグニン）に対する固着ヒト赤血球抗フルオレセンアッセイ抗フルオレセンで被覆したＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞１ｍＬ（実施例４参照）を、３ｍｌのＤｕｒａｃｙｔｅ緩衝液［０．０６７Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、０．７５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）、１．５％ウシ胎児血清、６％アンフォライト（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及び０．１％アジ化ナトリウム］中に再度懸濁させた。このアッセイのために、２５μｌの上記抗フルオレセンＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞、５μｌのヒツジ抗コカイン抗血清、１０μｌの尿試料及び５μｌの希釈フルオレセン−コカイン接合体（０．１５ＭＮａＣｌで２倍に希釈したＴＤｘコカイントレーサー；このトレーサーは本出願人から市販されているＴＤｘコカイン代謝物質キットから入手した）を吸引及び分配を繰り返しつつ混合し、次いで積層試験カード（係属中の米国特許出願第０７／６１４，８１７号（上掲）の実施例１に開示されているものと同様であるが、本明細書で使用する各カードは１０の反応管路を含んでいた）に加えた。５分〜１０分以内に、試験カードの視検区域で、陽性結果又は陰性結果を示す凝集パターンを肉眼で調べた。視検区域の粒状凝集パターンは、試料中にコカイン（ベンゾイルエコグニン）が存在しないことを示していた（陰性結果）。ベンゾイルエコグニンを含む試料を使用すると、凝集のないなだらかなパターンが検出された（陽性結果）。２０個の既知のベンゾイルエコグニン陽性試料及び１８個の陰性試料を試験した。全ての陽性試料で陽性結果が出、全ての陰性試料で陰性結果が出た。アヘン剤、カンナビノイド、アンフェタミン及びフェンシクリジンに対する試験を同様に実施した。各被分析物質の既知の陽性試料及び陰性試料全てで、それぞれ対応する陽性及び陰性結果が得られる。実施例８フェンシクリジンに対するコロイド状セレン抗フルオレセンアッセイフェンシクリジン−フルオレセン接合体（ＴＤｘＰＣＲ試薬キットのＰＣＰトレーサー、本出願人）を０．０４％濃度の抗フルオレセンで被覆したセレンのストック調製物（実施例５参照）と混合した。３０μｌの混合物を４個の試験管の各々に入れた。０、２５、６０及び１２０ｎｇ／ｍＬのフェンシクリジンを含む尿試料５μｌを各試験管に加えた。次いで、５μｌの抗フェンシクリジン抗体（ＴＤｘＰＣＲ試薬キットのＴＤｘＰＣＰ抗血清、本出願人）を加えた。室温で約８分の後に、各試験管に１ｍｌの水を加えた。混合物を撹拌し、５５０ｎｍで光学密度を測定した。結果は以下の通りであった：アヘン剤、カンナビノイド、コカイン及びチロキシン（Ｔ４）の試験は同様に、但しＴ４の場合は尿試料の代わりに血清を用いて実施した。全ての結果でＯＤ₅₅₀ が増加し、被分析物質濃度も増した。実施例９チロキシンのポリピロール抗フルオレセンアッセイ２つの試験管の各々で、抗フルオレセンで被覆したポリピロール（実施例６参照）７μｌ、それぞれ０μｇ／ｍＬ及び０．２４μｇ／ｍｌの血清を含むチロキシン標準２μｌ、並びにＴＤｘチロキシンキット（本出願人）のＴＤｘフルオレセン−チロキシントレーサー１．５μｌ及び抗チロキシン抗血清１０μｌを混合した。室温で１０分間インキュベートした後に、反応混合物を１ｍｌの水で反応停止させた。両方の混合物で８００ｎｍの光学密度を測定した。結果は以下の通りであった：実施例１０抗フルオレセンで被覆した固着ヒト赤血球を用いた悪用薬剤でのパネル試験コカイン代謝物質、アヘン剤及びＰＣＰ用のＴＤｘアッセイキット（本出願人）の各々から得たＴＤｘフルオレセン−薬物トレーサーの一部（１μＬ）を積層反応カード（反応カードについては実施例７で説明した）の異なる管路に入れて、乾燥した。これらの試薬スポットを反応管路の細長い部分に置いた。同じ３種のアッセイキットの各々の３種の抗血清溶液（ＴＤｘ試薬キットの抗血清溶液）の各々２０μｌを、抗フルオレセンで被覆したＢｌｕｅＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞の１０％懸濁液１６μｌ（実施例２、４）及びＤｕｒａｃｙｔｅ緩衝液６４μｌ（実施例７）と混合して抗血清混合物を調製した。この混合物（１４０ μｌ）を正常（無薬物）尿試料４０μｌと混合し、得られた溶液の一部４５μｌを積層反応カードに加え、ここから溶液を（毛管作用によって）、３つのトレーサーの各々を有する管路内に流した。５分以内に、３つの管路の各々で、強い凝集パターンが肉眼視できた。異なる濃度のベンゾイルコグニン、モルフィン又はＰＣＰを含む試料を用いてこの実験を繰り返した。結果を以下の表に示す。所定の薬物（ベンゾイルコグニン、モルフィン又はＰＣＰ）が試料中に存在する場合はいずれも、薬物に対応するトレーサーを有する反応カード管路で凝集反応が阻害された。所定の薬物が存在しても、他の薬物用のトレーサーを含む管路内の凝集反応は阻害されなかった。実施例１１肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）での固着ヒト赤血球の被覆実施例４に記載の手順を用いて、チバクロームブルー３ＧＡで染色した固着ヒト赤血球（実施例２参照）を最終濃度が１２０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＨＢｓＡｇで被覆した。被覆した細胞をＤｕｒａｃｙｔｅ緩衝液（実施例７）に懸濁させて最終濃度を１０％（ｖ／ｖ）とした。これらの細胞（２５μｌ）を、１２ｎｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを含む２５μＬの血清又はＨＢｓＡｇを含まない血清（２５μＬ）と混合して、積層反応カードの管路（実施例７）内に加えた。ＨＢｓＡｇを含む血清と混合した細胞では強い凝集が生じ、ＨＢｓＡｇを含まない血清と混合した細胞では凝集は生じなかった。実施例１２ＨＢｓＡｇに特異な色コード化アッセイ赤く染めた（被覆していない）同量のＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞（実施例３）を青く染めた（抗ＨＢｓＡｇで被覆した）Ｄｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞（実施例１１）と混合した。得られた懸濁液は暗灰色又は黒色であった。実施例１１に記載したように、この混合したＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞懸濁液を、ＨＢｓＡｇを２５ｎｇ／ｍｌ含む又はこれを含まない血清試料と混合した。ＨＢｓＡｇを含む試料では青いＤｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞が凝集し、ピンクの背景（凝集していない赤色Ｄｕｒａｃｙｔｅ^TM細胞）に対して容易に見てとれた。ＨＢｓＡｇを含まない試料では、灰色懸濁液が均一な色として保持され、凝集の兆候を示さなかった。実施例１３親和性精製した抗フルオレセンを緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）で希釈して最終濃度を５０μｇ／ｍＬにする。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルでこの材料の一部１００μＬずつを３７℃で１２時間インキュベートする。次いで、未結合抗フルオレセンをウエルから吸い出し、ウエルを、０．１％ＢＳＡを含む１００μｌの量のＰＢＳで５回洗浄する。この時点で、マイクロタイタープレートのウェルは、吸着した不溶性抗フルオレセン被膜を含んでいる（被覆したマイクロタイタープレート）。第１ウェルが遊離ＰＣＰを含まず、第２ウェルが２５ｎｇ／ｍＬのＰＣＰを含み、第３ウェルが２５０ｎｇ／ｍＬのＰＣＰを含むように、既知量のフェンシクリジン（ＰＣＰ）、ＰＣＰ−フルオレセン接合体及びアルカリ性ホスファターゼで標識した抗ＰＣＰ抗体を含む尿試料の混合物（１００μＬ）をウェルに加える。マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベートし、各ウェルの内容物を吸い出し、ウェルを０．１％ＢＳＡを含む１００μＬのＰＢＳで５回洗浄する。１００μＬの量のアルカリ性ホスファターゼ基質試薬（Ｓｉｇｍａ１０４ホスファターゼ基質，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，上掲）を各ウェルに加え、１０分間インキュベートした後に、ＰＣＰを含まないウェルで黄色の発色が観察され、ＰＣＰ濃度の増したウェルでは発色量が低下する。このアッセイでは、発色量は試料中のＰＣＰの量に反比例する。上記実施例で使用したＰＣＰ−フルオレセン及び酵素標識した抗ＰＣＰの代わりに、他の薬物（アヘン剤、アンフェタミン等）の特異フルオレセン接合体とその酵素標識した各抗体対との混合物を含む試料を加えて、被覆した同じマイクロタイタープレートの他のウェル内で上記薬物について同様のアッセイを実施する。実施例１４（本出願人から市販されている各ＴＤｘアッセイキットの）アンフェタミン、カンナビノイド、コカイン、アヘン剤及びＰＣＰ用のフルオレセン−薬物トレーサー溶液の一部（１．５μＬ）を、積層反応カード（図３Ａ及び図３Ｂにカードの２つの視点を示す）の管路２−６に入れて乾燥する。陰性対照の場合、ＰＢＳ中に希釈して０．５ｍｇ／ｍＬとしたフルオレセン標識ＢＳＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ，上掲）を更に１．５μｌ、各カードの管路１に加える。陽性対照の場合、各カードの管路７に乾燥試薬を入れないままにする。抗フルオレセンで被覆したＤｕｒａｃｙｔｅ細胞を含む抗血清混合物を実施例１０に記載の方法で調製する。但し、カンナビノイド及びアンフェタミンに対する抗血清を更に加える。この抗体混合物の試料２００μＬを正常（無薬物）ヒト尿２０μＬと混合し、次いで反応カードの中心に導入する。この液体は同時に各管路内に流入し、そこで乾燥した試薬と混合する。５分後、管路１−６で凝集細胞の外観が容易に見てとれる。管路１は陰性反応基準を示し、これは試験する試料が陰性であれ陽性であれ、陰性アッセイと同様の反応を示すであろう。管路２−６では、管路内に置かれた個々の薬物トレーサーに対応する５種の薬物（アンフェタミン、カンナビノイド、コカイン、アヘン剤及びＰＣＰ）の各々に対する個々の反応を示す。管路７内にはトレーサーも他の試薬も存在しないので、この管路内のＤｕｒａｃｙｔｅ細胞は凝集せず、従って陽性反応基準が得られる。実施例１５１６個の試験試料を試験して、交差反応を阻止する抗体の決定及び評価を行って適切な結果を得た。ＰＣＰ用ヒツジポリクローナル抗体を抗被分析物質抗体として使用した。５個の異なるモノクローナル（Ｍａｂ）で、構造的な関連物質：２−エチリデン−１，５−ジメチル−３，３−ジフェニルピロリジン（ＥＤＤＰ）との結合能力を試験した。使用した粒子はＤｕｒａｃｙｔｅ^TMであり、アッセイはＡｄｖｉｓｏｒ（Ｒ）（本出願人）試験キットで実施した。試料はＥＤＤＰを含み、ＰＣＰは存在しなかった。半定量的判定法（０．５＝凝集なし、４．０＝非常に強い凝集）を用いて、アッセイの反応強さを肉眼で調べた。中間の反応強さを示すアッセイには、反応の相対的な強さを反映する０．５〜４の数値を与えた。上記結果で、モノクローナル抗体＃２及び＃４は構造的な関連物質のＥＤＤＰとは結合せず、抗フルオレセンで被覆した粒子及びＰＣＰ−フルオレセン接合体とは複合体を生成し得る傾向が判明した。実施例１６異なる構造的な関連物質である２−エチル−５−メチル−３，３−ジフェニルピロリン（ＥＭＤＰ）を含むが、ＰＣＰは含まない以下の５つの試験試料を試験した。実施例１５と同じ抗体を使用した。半定量的判定法（０．５＝凝集なし、４．０＝非常に強い凝集）を用いて、アッセイの反応強さを肉眼で調べた。中間の反応強さを示すアッセイには、反応の相対的な強さを反映する０．５〜４の数値を与えた。異なる構造的な関連物質を使用したにもかかわらず、Ｍａｂ＃２及び＃４はこの関連物質とは結合しなかったため、複合体が生成して凝集し得た。実施例１７実施例１６の同じ抗体の幾つかで、２種の異なるレベルのＰＣＰの分析能力、及びＰＣＰの不在下でのＥＤＤＰ及びデキストロメトルファンとの特異性を試験した。次いで、モノクローナル抗体を個々にポリクローナルと５０：５０で混合し、同一の被分析物質及び妨害物質に対して試験した。半定量的判定法（０．５＝凝集なし、４．０＝非常に強い凝集）を用いて、アッセイの反応強さを肉眼で調べた。中間の反応強さを示すアッセイには、反応の相対的な強さを反映する０．５〜４の数値を与えた。上記結果から、ポリクローナルと特定のモノクローナルとをブレンドすると、妨害物質の存在下及び不在下のいずれの場合でも被分析物質の検出で最良の結果が得られることが判明した。試料のアッセイ閾値は２５ｎｇ／ｍｌのＰＣＰに設定する。従って、０．５ＰＣＰに示す試料はＰＣＰ閾値の半分であり、従って凝集を示すはずである。逆に、１．５ＰＣＰ濃度の試料では殆ど又は全く凝集を示さないはずである。本明細書に記載する全ての刊行物及び特許出願明細書は、各文献を参考として組み込むものとするとして個々に記載したのと同程度に参考として組み込むものとする。前述の発明は分かりやすくするために例によって詳細に説明したが、添付のクレームの範囲を逸脱することなく、当業者の技術の範囲内において種々の変形や変更が考えられることは明白であろう。本明細書の基本的な発明に自明な変更をもたらす将来の技術的進歩もクレームの範囲内とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/553 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/553

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）試験試料を少なくとも２種の抗体集団（αＡ、αＢ）及び被分析物質に結合した粒子（Ｐ−Ａ）に暴露して反応混合物を生成し、ここで、各抗体集団は被分析物質（Ａ）と結合し得るだけでなく、被分析物質（Ａ）と構造的に関連する他の物質と交差反応し得、その場合他方の抗体集団は交差反応し得ず、ｂ）（Ｐ−Ａ）（αＡ）、（Ｐ−Ａ）（αＢ）もしくは（Ｐ−Ａ）（αＢ）（α Ａ）又はこれら３種が組み合わさったものを含む複合体を生成し、ｃ）被分析物質（Ａ）の不在下では（Ｐ−Ａ）（αＡ）、（Ｐ−Ａ）（αＢ）もしくは（Ｐ−Ａ）（αＢ）（αＡ）又はこれら３種が組み合わさったものの存在を、又は被分析物質（Ａ）の存在下では（Ｐ−Ａ）（αＡ）、（Ｐ−Ａ）（αＢ）及び（Ｐ−Ａ）（αＢ）（αＡ）の不在を検出して測定することからなる試験試料中の被分析物質（Ａ）の存在及びその量を検出するためのイムノアッセイ法。２．前記粒子が、細胞、ラテックス微粒子、プラスチック微粒子、セレン微粒子、鉄微粒子及び金微粒子からなる群の中から選択される請求項１に記載のイムノアッセイ法。３．前記粒子が、凝集複合体検出のための色をしている請求項１に記載のイムノアッセイ。４．ａ）試験試料を少なくとも２種の抗体集団（αＡ、αＢ）、ハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）及び抗ハプテン抗体（αＨ）に暴露して反応混合物を生成し、ここで、各抗体集団は被分析物質（Ａ）と結合し得るだけでなく、被分析物質（Ａ）と構造的に関連する他の物質と交差反応し得、その場合他方の抗体集団は交差反応し得ず、ｂ）（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）、（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）もしくは（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）（αＡ）又はこれら３種が組み合わさったものを含む複合体を生成し、ｃ）被分析物質（Ａ）の不在下では（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）、（αＨ）（Ｈ −Ａ）（αＢ）もしくは（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）（αＡ）又はこれら３種が組み合わさったもののいずれかの存在を、又は被分析物質（Ａ）の存在下では（ αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）、（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）及び（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）（αＡ）の不在を検出して測定することからなる試験試料中の被分析物質（Ａ）を検出して定量するためのイムノアッセイ法。５．前記抗ハプテン抗体（αＨ）を粒子に結合し、前記粒子の凝集が、（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）、（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）もしくは（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＢ）（αＡ）又はこれら３種が組み合わさったものの存在を示す請求項４に記載のイムノアッセイ法。６．前記粒子が、凝集複合体検出のための色をしている請求項５に記載のイムノアッセイ。７．前記粒子が、細胞、ラテックス微粒子、プラスチック微粒子、セレン微粒子、鉄微粒子及び金微粒子からなる群の中から選択される請求項６に記載のイムノアッセイ法。８．前記ハプテン−被分析物質接合体（Ｈ−Ａ）及び被分析物質（Ａ）に対する特異性が異なる少なくとも２種の抗体（αＡ、αＢ）が液相中にある請求項４に記載のイムノアッセイ法。９．被分析物質（Ａ）に対して特異性を示す前記抗体の少なくとも１種がモノクローナル抗体である請求項４に記載のイムノアッセイ法。１０．前記薬物が悪用薬物又は治療薬であって、フェンシクリジン、アヘン剤、カンナビノイド、アンフェタミン、コカイン及びステロイドからなる群の中から選択される請求項４に記載のイムノアッセイ。