JPH09506332A - ヘモグロビンの改良またはヘモグロビンに関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヘモグロビン分子の一部として存在するときに、修飾されていないβグロビンに比べて、改変された重炭酸効果を示すように修飾されたβグロビンが開示され、この修飾は、残基（29〜41）からなる群中の少なくとも２つのアミノ酸残基の改変を包含する。また、このβグロビンを含有するヘモグロビン分子が開示され、このヘモグロビン分子は、そのαグロビン成分にさらなる修飾を有するかまたは有しない。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビンの改良またはヘモグロビンに関する改良発明の分野 本発明は、ヘモグロビンの改良形態およびヘモグロビンを含有する改良された 血液代替品に関する。発明の背景 全ての脊椎動物のヘモグロビン(Ｈｂ)は、２つのアルファ(α)グロビン鎖サブ ユニットおよび２つのベータ(β)グロビン鎖サブユニットからなるテトラマーで あり、各サブユニットは鉄含有補欠分子族であるヘム(Haem)を有する。テトラマ ー中の４つのサブユニットに結合する酸素は協同的(co-operative)である（すな わち、同じグロビンテトラマーにおいて、１つのヘム基での酸素結合は他のヘム 基での酸素結合を促進し、そして逆の場合も同じである；１つのヘムユニットで の酸素の離脱は他のヘムユニットでの酸素離脱を促進する）。 脊椎動物の進化の間に、グロビンのアミノ酸配列は著しく分岐し、そして関連 の最も遠い脊椎動物種（例えば、ヒトと魚）からのＨｂの間では、配列同一性は 約50％に過ぎない。ヒトヘモグロビンとワニヘモグロビンとの間では、例えば、 配列同一性は約60％である。この配列の変化にもかかわらず、脊椎動物Ｈｂは、 一般に、それらの３次および４次構造（Camardellaら、1992 J．Mol．Biol．224 ，449〜460）およびヘム−ヘム相互作用のための主要な残基を保持してきた。 ヒトＨｂの酸素親和性は、種々の代謝物（例えば、2,3-ジホスホグリセレート (ＤＰＧ)およびＨ⁺）により調節される。これらは、活発に呼吸する組織への酸 素の離脱を促進する。この一般的現象は異所アロステリック効果(heterotropic allosteric effect)と呼ばれる。特に、Ｈｂの酸素親和性がCO₂の濃度により影 響され、例えば、高いCO₂濃度（活発に呼吸する組織に見出されるような約40mmH gの分圧「PCO₂」）は酸素親和性の低下を引き起こし、それにより、酸素の組織 への離脱を促進する。この現象はCO₂効果として知られている。ヒトＨｂでは、C O₂は、αおよびβグロビンサブユニットのα-アミノ基に直接結合してカルボア ミノ基(carbamino group)を形成し、そして低親和性(Ｔ)の４次構造を安定化さ せることによって酸素親和性を低下させる（Kilmartin & Rossi-Bernardi，1969 Nature 222，1243〜1246）。このCO₂効果は主な異所アロステリック効果の１つ である。 脊椎動物種は著しく異なる環境条件に適応してきており、そしてヘモグロビン 分子はこのような環境において広範囲の呼吸の必要性を満たすために進化してき た。例えば、ワニＨｂの酸素親和性は、CO₂の生理学的濃度(40torr)により顕著 に低下する。Bauerらは、ワニＨｂの酸素親和性の大きな低下がヒトＨｂのよう に、αアミノ基へのCO₂の結合により引き起こされないことを示した(1981，J．B iol．Chem．256，8429〜8435)。二酸化炭素(CO₂)は水溶液（例えば、血液）に溶 解してHCO₃ ^-を生じる。ワニＨｂ中の酸素親和性の顕著な低下は、重炭酸イオン( bicarbonate ion)の結合により引き起こされ、そしてこの現象は「重炭酸効果」 と呼ばれる。より大きな割合のHb結合酸素が放出されそして組織で利用され得、 それにより、ワニは水中に長期間とどまることができる。この効果はβグロビン 分子の残基Lys82およびGlu144に結合する重炭酸イオンに起因すると推定されて いる(Perutzら，1981 Nature 291，682〜684)。 「人工血液」製品の開発には興味がある。このような製品は、患者がドナーか らの感染血液を受けることに起因する感染の機会をなくし、そして一般に、輸血 プロセスを簡便化する。明らかに、天然血液の全ての機能を果たすためには、人 工血液が酸素を運搬しなければならない。 不幸にも、赤血球(ＲＢＣ)の環境外にあるヘモグロビンは親和性が高すぎて、 組織へ多くの酸素を放出できない。なぜなら、ＲＢＣは大量のＤＰＧ（これは、 上記のように、Ｈｂの酸素親和性を低下させる代謝物の１つである）を含有する からである。 従って、呼吸組織へ酸素をより効果的に送達する、改良された酸素親和性を有 する安定な人工血液製品が必要とされる。発明の要旨 第１の局面において、本発明は、ヘモグロビン分子の一部分として存在すると きに、修飾されていないβグロビンに比べて、改変された重炭酸効果を示すよう に修飾されたβグロビンを提供し、この修飾は残基29〜41からなる群中の少なく とも２つのアミノ酸残基の改変を包含する。 本発明者らは、本発明に従って、等価なワニβグロビン残基で置換することに より改変されたβグロビンサブユニットを含有し、天然のワニヘモグロビンが示 す重炭酸効果と同様の、大きく増大した重炭酸効果を示すヒトヘモグロビンを見 出した。これは驚くことである。なぜなら、ヘモグロビンは補欠分子族を有する 複合テトラマー分子であるにもかかわらず、αグロビンおよび補欠分子族が改変 されないにもかかわらず、α(ワニ)β(ヒト)ヘモグロビン中のβグロビンの１次 構造における非常に小さい変化が重炭酸効果の大きな変化を引き起こし得るから である。 さらに、βグロビンの残基29〜41の大部分はα₁/β₂グロビンサブユニットの 界面に部位し、そしてそれ故、その中の変化により、この分子の安定性を失わせ 、またはその酸素親和性を永続的に低下させると予想され得る。しかし、驚くべ きことに、本発明に従った改変はそのような有害な効果を引き起こさないことを 見出した。 第２の局面において、本発明は、βグロビンを、ヘモグロビン分子の一部分と して存在するときに、修飾されていないβグロビンに比べて、改変された重炭酸 効果を示すように修飾する方法を提供し、この修飾は残基29〜41からなる群中の 少なくとも２つのアミノ酸残基の置換を包含する。 好ましくは、βグロビンはヒトのβグロビンである。好ましくは、βグロビン は、修飾されていないβグロビンに比べて、増大した重炭酸効果（すなわち、水 に溶けた二酸化炭素の存在下で酸素親和性がより多く低下する）を示すように修 飾される。 好適には、少なくとも２つの改変されたアミノ酸残基は、残基29、31、33、38 、39および41からなる群からの少なくとも２つの残基を含有する。最も好ましく は、この修飾は残基38および41の置換を包含する。 好適な実施態様においては、ヒトのβグロビンの残基29〜41は、ワニのβグロ ビン由来の等価な残基で置換される。両方の種のＨｂでは、アミノ酸残基のいく つかが共通であることは当業者に明らかである。従って、単に両方に共通ではな い残基（すなわち、残基29、31、33、38、39および41）を改変すること以外、残 基29〜41の全てを改変する必要がない。さらに、残基Ser29βおよびMet31βはα₁ β₂接触面に存在しないので、充分な重炭酸効果を導入するためには、これらの 残基の置換を必要としない。 他の局面においては、本発明は、人工血液代替品として使用するヘモグロビン 分子を提供し、このヘモグロビン分子は、修飾されていないβグロビンを含有す るヘモグロビンに比べて、改変された重炭酸効果を示すように修飾されたβグロ ビンを含有し、この修飾は残基29〜41からなる群中の少なくとも２つのアミノ酸 残基の置換を包含する。 好都合には、このヘモグロビン分子はまた、修飾されたαグロビン鎖をも含有 する。 代表的には、αグロビン鎖は、ヒトのαグロビン配列を実質的に含有し、この ヒトαグロビン配列は、人工血液代替品として使用するヘモグロビン分子の酸素 運搬特性を最適化するように１つまたはそれ以上の残基が修飾されている。好都 合には、このαグロビン鎖は、修飾されていないαグロビンに比べて、改変され た重炭酸効果を示すように、イギリス特許出願第9414772.5号に記載の方法、ま たは類似の方法で修飾される。 好都合には、修飾されたαグロビンは、以下の残基：34、35、36、37、41、10 0および103の１つまたはそれ以上における改変を含有する。 好適には、修飾されたαグロビンは１つまたはそれ以上（好ましくは全て）の 下記の置換を含有する：Leu 34→Cys、Ser 35→Ala、Phe 36→Tyr、Thr 37→Gln 、Thr 41→Ile、Leu 100→PheおよびHis 103→Gln。 さらなる局面では、本発明は、上で定義されたヘモグロビン分子を含有する人 工血液代替品を提供する。 本発明は、例示の実施例により、および図面を参照することにより、さらに説 明される。ここで、 図１は、ナイルワニのαおよびβグロビンをコードするヌクレオチド配列（E ．coli における発現のために最適化）およびコードされるポリペプチドのアミノ 酸配列を示す； 図２は、ワニのαおよびβグロビン発現構築物pOmega-5およびpManuo-4および ハイブリッド発現構築物pSC4-11の概略図である； 図３ａは、５％のCO₂の非存在下（白）または存在下（黒）で、組換えワニヘ モグロビン（丸）および組換えヒトヘモグロビン（四角）の酸素結合曲線（log pO₂(mmHg)に対するO₂飽和度(％)）のグラフである； 図３ｂは、ハイブリッドα(ワニ)₂／β(ヒト)₂（丸）およびα(ワニ)₂／β(SC 4)₂（四角）ヘモグロビンの酸素結合曲線を比較する同様のグラフである； 図３ｃは、100αおよび103α残基における改変を有するか（丸）または有しな い（四角）組換え「Scuba」ヘモグロビンの酸素結合曲線を比較する同様のグラ フである；そして 図４は、ヒトデオキシヘモグロビンの概略図である。実施例１ 先に記載されるように、Perutzら（1981、先に引用）は、２つのβサブユニッ トの間の中央空洞に位置し、そして１つのβサブユニットのLys(82β)およびGlu (14β)への水素結合およびその相手のN-末端残基を包含する、重炭酸イオン結合 部位を提案した。ワニＨｂにおける４つの異なる点（ヒトヘモグロビンに対して ）であるHis-143β→Ala、Lys-144β→Gly、Val-1β→SerおよびHis-2β→Proは 、これらの水素結合の形成を促進するために重要であると考えられる。本発明者 らは、まず、これらの変異をヒトβグロビンに導入したが、そのCO₂効果は天然 のヒトＨｂと同じであった。これらの残基の重炭酸イオンとの相互作用に対して 適切な静電環境を作り出すために、いくつかの付加的な変異が必要であると考え られた。従って、３つの付加的な変異であるAsp-94 β-Glu、Glu-90 β→Lysお よびHis-135 β→Argをこの変異体に導入したが、それらは、ヒトＨｂで、大き な重炭酸効果を示さなかった。この段階で、この戦略を放棄し、そして、まずE ．coli においてワニＨｂを作成すること、および重炭酸効果をなくす変異を見出 すことを決めた。 第１の工程として、ナイルワニのαおよびβグロビンの配列をコードするタン パク質を、E．coliにおける発現に最適なコドンを有する14のオリゴヌクレオチ ドのアセンブリ（Ikemuraら、1982 J．Mol．Biol．158，573〜597）により、化 学的に合成した。全ての変異を、カセット変異誘発により導入した（Wellsら、1 985 Gene 34，315）。合成のαおよびβコード化配列、およびそれによりコード されるポリペプチドを、図１および配列番号１〜４として添付の配列表に示す。 これらの遺伝子を、別々に、Somatogenにより開発されたＨｂ発現ベクター（Hof fmanら、1990 Proc Nat．Acad．Sci．USA 87 8521〜8525）にクーロン化した。 このベクターはpKK223-3（Pharmaciaから入手できる）に由来した。発現構築物p Omega-5およびpManuo-4（tacプロモーターの制御下で、ナイルワニのαおよびβ グロビン遺伝子をそれぞれ発現する）を、以下で述べる同時発現構築物pSC4-11 とともに、図２に概略的に示す。これらの発現ベクターもまたpKK223-3に由来し た。これらの調製方法は、Hoffmanらの開示（先に引用）と組み合わせれば、本 明細書に開示された教示から、当業者に明らかである。 α(ワニ)およびβ(ワニ)鎖が同時発現されたとき、得られたE．coli生成物は 可溶性であったが、褐色であった。ヘム基は、インビボでいずれも酸化されたか 、または非天然ヘムがＨｂに組み込まれた。E．coliにおいて、α鎖またはβ鎖 もしくはヒトＨｂのいずれかを生成することは、これらが同時発現されなければ 、不可能である（Hoffmanら、1990、先に引用）。しかし、E．coliにおいて、ワ ニのαまたはβ遺伝子をそれら自体で発現したとき、可溶性の一本鎖Ｈｂが生成 された。Komiyamaらの方法（1991 Nature 352，349〜351）に従って、組換えヘ モグロビンの精製を行った。 E．coliにおけるヒトおよびワニのαおよびβグロビンの混合物を同時発現す ることにより、ハイブリッドヘモグロビン分子：α(ワニ)₂／β(ヒト)₂およびα (ヒト)₂／β(ワニ)₂を得ることが可能であった。これらのハイブリッドを、それ ぞれの鎖を混合することによって作られた「単一種」分子であるα(ヒト)₂／β( ヒト)₂およびα(ワニ)₂／β(ワニ)₂と比較した。 Imaiにより開示された自動記録装置（1981 Meth．Enzymol．76，438〜449）を 用いて、酸素平衡曲線を得た。全ての測定は、25℃で、５％のCO₂（これは、緩 衝液中の21mMの重炭酸イオンの平衡であった）の存在下または非存在下にて、0. 1MのClを有する50mM bis-Tris中でpH7.4にて行った。その結果を表Ｉに示し、表 Ｉは、５％の添加されたCO₂の存在下または添加のCO₂の非存在下のいずれかで、 これらの分子に対する酸素親和性（P50 mmHg、すなわち、水銀のミリメートルで 表した、ヘモグロビンが酸素で50％飽和になった酸素分圧により測定された）を 示す。この表はまた、２つの他のヘモグロビン分子であるα(ワニ)₂／β(SC4)₂ およびα(ワニ)₂／β(ワニ：82K-Q)₂についてのこれらの値を示し、その重要性 は以下で議論する。この表はまた、各ハイブリッドのヒル係数（Hill's coeffic ient）（n）（これは酸素結合の協同性(co-operativity)の尺度である）の値を 示す。 表Ｉは、野生型ヒトＨｂが小さいCO₂効果しか示さないことを示す。Kilmartin ＆ Rossi-Bernardi(1969，先に引用)は、これがαアミノ基のカルバミル化(car bamylation)に起因することを示した。Bauer ＆ Jelkman(1977 Nature 269，825 〜827)により報告されたように、α(ワニ)₂／β(ワニ)₂の酸素親和性は、５％CO₂ により10倍低下する。Bauerら(1981，先に引用)は、この酸素親和性の大きな低 下が、ワニＨｂの１分子あたり、２つの重炭酸イオンと結合するによって起こる ことを示した。Perutzのモデルでは、残基Lys-82 βが重炭酸イオンと塩橋を形 成する。本発明者らは、Lys-82 βからGlnへの変異をナイルワニＨｂ［α(ワニ)₂ ／β(ワニ：82K-Q)₂］に導入したが、重炭酸効果の大きさは、表Ｉに示される ように、少ししか下がらなかった。これは、重炭酸イオンがPerutzらにより提案 された部位に結合しないことを示す。 表Ｉは、α(ワニ)₂／β(ヒト)₂またはα(ヒト)₂／β(ワニ)₂のいずれのハイブ リッド分子も大きなCO₂効果を示さなかったことを表す。従って、このαサブユ ニットまたはβサブユニットのいずれも大きく寄与せず、重炭酸イオン結合部位 はαおよびβサブユニットの間のサブユニット界面に部位し得るようである。 ワニのヘモグロビン（カイマンワニ(caiman)、ナイルワニ(Nile crocodile)お よびアメリカワニ(Mississippi alligator)のグロビン配列を、他の脊椎動物の Ｈｂのそれらと比較した。βサブユニットの29と41との間の残基（α₁、β₂接触 面に部位する）は、これらの３つの種で全て保持され、そして特に、Arg-39 β およびTyr-41 βはワニＨｂでのみ見出された。ヒト配列のこの領域(29〜41)を 、α(ワニ)₂β(ヒト)₂中のワニの配列のそれ(表II)で置換し、得られたハイブリ ッドＨｂは、α(ワニ)₂β(SC4)₂と呼び、表Ｉに示されるように、大きなCO₂効果 を示した。このハイブリッドヘモグロビンは、図２に示されるように、構築物pS C4-11により発現された。 これらの知見をさらに調べるために、本発明者らはまた、Lys-38 β→Thr、Ar g-39 β→GlnおよびTyr-41 β→Pheの変異をβ(ワニ)₂に導入した。これらの３ つの変異は重炭酸イオン効果を完全になくしたが、Arg-39 β-Glnの変異だけが 重炭酸効果に実質的に影響しなかった。それ故、38および41の部位における２つ の改変は、ヒトのβグロビンに重炭酸イオン効果の大部分を与えるのに充分であ る。これらの結果は、重炭酸イオンの結合部位がα₁β₂界面に位置すること、お よびLys-38 βおよびTyr-41 β残基が重炭酸イオン結合に対して重要であること を明確に示す。 これらの２つの変異のヒトのβグロビンへの導入は、大きな重炭酸効果を示す 修飾されたヒトヘモグロビンを生じ、そしてそれにより、人工血液代替品として 使用されるとき、酸素の送達はより効率的になる。この方法により、同じ量の酸 素をヘモグロビンのより少ない用量で送達し、そしてそれ故、このような人工血 液キャリアの実際のコストおよび潜在的副作用を軽減することが可能である。 理想的には、このβグロビンはまた、位置108(Asn→Lys)における変異を含む べきである。これは、Presbyterian変異（ヒトヘモグロビンの自然に生じる変異 形態）として知られ、そしてBohr効果（ヘモグロビンのＯ₂親和性のｐＨ依存性 ）の増加を生じる。この変異体β鎖は、好ましくは、ヒトのジ-αグロビンダイ マーと共に同時発現されて（例えば、Lookerら、1992 Nature 356，258〜260に 記載されたように）、所望の特性を有する、安定な（実質的にヒトの）ヘモグロ ビン分子を作る。この分子は、非ヒトヘモグロビンに由来の２つのβグロビン残 基のみを含有するので、これは、事実上、免疫原性能力を有しないと推定され得 る。 ワニヘモグロビンを用いる本発明の方法で、ヒトのβグロビンを修飾する可能 性が証明されたことにより、ヒトのβグロビンに他の動物由来のCO₂効果を導入 するために、他の種のヘモグロビン由来のβグロビンの29〜41領域中の残基を使 用することが可能となるべきである。実施例２ 実施例１に示される結果は、βグロビン鎖中の特定の残基を改変することによ り、ヒトヘモグロビンに実質的な（完全ではない）重炭酸効果を導入することが 可能であったことを示し、これは、αグロビンサブユニットにおける付加の変化 もまた好ましいことを示している。 ヒトヘモグロビンにおいて重炭酸効果を作り出すために必要されるワニ残基の 最小数を見出すために、本発明者らは、キメラヘモグロビン（α(ワニ)₂α(SC4)₂ ）中のαグロビン配列を段階的にヒト化させた(humanized)。このαサブユニッ トに残留するワニの残基の数は、完全な重炭酸効果を失わずに、ちょうど７まで 減少され得た。この新たに加工されたヘモグロビンは、ヘモグロビンScubaと呼 ばれ、置換Leu-34α→Cys、Ser-35α→Ala、Phe-36α→Tyr、Thr-37α→Gln、Th r-41α→Ile、Leu-100α→Phe、His-103α→Gｌnの変異を有するヒトαサブユニ ットおよびβ(SC4)サブユニットからなる。Leu-100α→PheおよびHis-103α→Gl nの変異がなければ、この加工されたヘモグロビンは、ある程度の重炭酸効果だ けでなく、ある程度の協同的酸素結合効果も失う。 代表的な結果を図３ａ〜３ｃに示す。 図３ａは、５％CO₂の存在下（黒）または非存在下（白）で、組換えワニヘモ グロビン（丸）の酸素結合曲線と組換えヒトヘモグロビン（四角）の酸素結合曲 線とを比較する。このワニヘモグロビンは、５％CO₂の存在下で曲線が左へ著し く「シフト」する、大きな重炭酸効果を示し、これは、酸素親和性の大きな低下 を示し、それに対して、ヒトヘモグロビンの曲線のシフトは非常に小さい。 図３ｂは、ハイブリッドヘモグロビン：α(ワニ)₂／β(ヒト)₂（丸）およびα (ワニ)₂／β(SC4)₂の曲線を比較する。前者は、重炭酸効果を示さないが、後者 のハイブリッドの重炭酸効果は、組換えワニヘモグロビンが示した重炭酸効果と ほとんど同じである。 図３ｃは、５％CO₂の存在下（黒）または不存在下（白）で、Leu 100α→Phe およびHis 103α→Glnの置換を有する（丸）または有しない（四角）ヘモグロビ ンscubaの酸素結合曲線を示す。 ヘモグロビンScubaは十分な重炭酸効果を保持するが、その酸素親和性は、CO₂ の存在下および非存在下の両方で、ナイルワニヘモグロビンのそれよりも１桁の 大きさより高い(図３ｃ)。従って、酸素親和性を下げるために、付加的な変異が 好ましい。図４は、ヒトデオキシヘモグロビンの概略図であり、そこでは、ヘモ グロビンscuba中の12の変異の位置が示されている。これらの残基の大部分は、 ２つのサブユニットが互いに酸素結合に際しスライドする、α₁β₂サブユニッ ト界面に集中する。PerutzおよびFermi（私信）は、保持されたTyr-42αと共に 、Lys-38およびTyr-41 βの２つの変異体残基からなる、立体化学的に最もふさ わしい結合部位のモデルを樹立したが、正確な結合部位を決定するためには、重 炭酸イオンの存在下でＨｂ Scubaの結晶学的解析が必要である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．βグロビンであって、ヘモグロビン分子の一部分として存在するときに、修 飾されていないβグロビンに比べて、改変された重炭酸効果を示すように修飾さ れ、該修飾は残基29〜41からなる群中の少なくとも２つのアミノ酸残基の改変を 包含する、βグロビン。 ２．ヒトβグロビンのアミノ酸配列を実質的に含有する、請求項１に記載のβグ ロビン。 ３．増大した重炭酸効果を示すように修飾される、請求項１または２に記載のβ グロビン。 ４．前記βグロビン中の天然に存在するアミノ酸が、ワニβグロビン由来の等価 な残基で置換されている、請求項１、２または３に記載のβグロビン。 ５．残基38および41での置換を包含する、前記請求項のいずれかに記載のβグロ ビン。 ６．残基29、31、33、38、39および41の２つまたはそれ以上での置換を包含する 、前記請求項のいずれかに記載のβグロビン。 ７．位置108でリシン残基を含有する、前記請求項のいずれかに記載のβグロビ ン。 ８．人工血液代替品として使用するヘモグロビン分子であって、前記請求項のい ずれかに記載のβグロビンを含有する、ヘモグロビン分子。 ９．前記ヘモグロビン分子の酸素運搬特性を最適化するように、１つまたはそれ 以上の残基において修飾された実質的にヒトのαグロビンを含有する、請求項８ に記載のヘモグロビン分子。 １０．改変された重炭酸効果を示すように修飾されるαグロビンを含有する、請 求項８または９に記載のヘモグロビン分子。 １１．以下の残基：34、35、36、37、41、100および103の１つまたはそれ以上に おける改変を有するαグロビンを含有する、請求項８、９または１０に記載のヘ モグロビン分子。 １２．以下の置換：Leu 34→Cys、Ser 35→Ala、Phe 36→Tyr、Thr 37→Gln、Th r 41→Ile、Leu 100→Phe、およびHis 103→Glnの１つまたはそれ以上を有する αグロビンを含有する、請求項８〜１１のいずれかに記載のヘモグロビン分子。 １３．前記ヘモグロビン分子の酸素親和性を低下させるために１つまたはそれ以 上の改変を包含する、請求項８〜１２のいずれかに記載のヘモグロビン分子。 １４．請求項８〜１３のいずれかに記載のヘモグロビン分子を含有する、人工血 液代替品。