JPH09506594A - プレターゲティング方法及び化合物 - Google Patents

プレターゲティング方法及び化合物

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JPH09506594A JP7516363A JP51636395A JPH09506594A JP H09506594 A JPH09506594 A JP H09506594A JP 7516363 A JP7516363 A JP 7516363A JP 51636395 A JP51636395 A JP 51636395A JP H09506594 A JPH09506594 A JP H09506594A
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ルイス ジェー セオドアー
デイマン エル メイヤー
ロバート ダブリュ マレット
サダカー カジナ
ジョン エム レノ
ドナルド ビー アクスワーシー
リンダ エム ガスタフソン
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ネオルクス コーポレーション
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Abstract

(57)【要約】 診断及び治療薬剤のターゲットデリバリーに関係する方法、化合物、組成物及びキットを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 プレターゲティング方法及び化合物技術的分野 本発明は、リガンド／アンチリガンド対の一方に結合しているターゲティング （標的指向）部分をターゲット（標的）部位にデリバリーするために有用な方法 、化合物、組成物及びキットに関する。ターゲティング部分抱合体の局在化（ロ ーカライゼーション）及びクリアランス後に、診断薬抱合体または治療薬抱合体 を直接または間接にターゲット部位に結合させる。発明の背景 従来の癌療法には解決を要する２つの問題がある。一般的に達成可能なターゲ ティング比（腫瘍に局在化する投与薬量対血液中に循環する投与薬量の比、また は腫瘍に局在化する投与薬量対骨髄に移行する投与薬量の比）は低い。また、多 くの症例では、腫瘍にデリバリーされる放射線または治療薬の絶対量は有意な腫 瘍応答を誘発するために十分でない。腫瘍に対するターゲティング比または絶対 量の向上が求められてる。発明の概要 本発明は、診断用及び治療用のプレターゲティング方法、該方法に有用な部分 (moieties)及びこれらの部分の製造方法に関する。かかるプレターゲティング方 法は、従来の癌療法と比較してターゲット細胞部位に対するターゲティング比が 向上するかまたは絶対量が増加することを特徴とする。 本発明はパリトキシンのような高毒性部分を含む、毒素、細菌毒、真菌毒のよ うな細胞障害性活性薬剤の効果的なデリバリーを提供する。ターゲッティング部 分（一般に遅い）と活性薬剤（単独で投与された場合、低分子量活性薬剤につい ては一般に速く、比較的高分子量の活性薬剤については一般に幾分遅い）の薬物 動態学の分離及びリガンド−アンチリガンド対の高親和性結合がこの改良を提供 する。投与されるべき活性薬剤または活性薬剤−リガンドまたは活性薬剤−アン チリガンド抱合体がそれ自身は一般に迅速にクリアされない場合、そのうよな活 性薬剤を含有する抱合体は、比較的速い、好ましくはそれに対する腎クリアラン スを付与するように構成され、または活性薬剤は低い治療効果的投与量で投与さ れる。従って、プロトコルレシピエントの非ターゲット組織は、活性薬剤に対す る長期間の暴露を受けない。 本発明は、以下に記載する段階を利用する２段階及び３段階プレターゲティン グ法を提供する。 交差反応性の第１のパターンを有する第１の抗体種の抗体ターゲットとリガン ド−アンチリガンド結合対の１員とを含む包合体をレシピエントに投与し、かつ このレシピエントに、１つ以上の追加のターゲッティング包合体及び第１の抱 合体に結合するリガンド−アンチリガンド結合対の１員とを投与する（但し、そ のような各包合体は、第１の抱合体の種と異なる種の抗体ターゲッティング部分 を含み、かつお互いが他の追加のターゲッティング抱合体と、及びお互いに、及 び交差反応性の第１のパターンと、実質的に重複しない交差反応性のパターンを 有する）。 抱合体のこれらの態様を実施する場合、活性薬剤抱合体レセプター（即ち、第 １の抗体種及び追加のターゲッティング抗体種に結合したリガンドまたはアンチ リガンド）のターゲット部位付着(accretion)が改良される。何故なら、各抗体 種はターゲット部位に結合した異なるエピトープを認識するからである。この代 替エピトープ法は、高親和性リガンド−アンチリガンド相互作用を介して次に投 与される活性薬剤含有抱合体が結合するアンチリガンドまたはリガンド抗原がよ り高密度で存在するターゲット部位を提供する。この増大したターゲット部位抗 原密度は、それに対する活性薬剤の付着の増大を促進する。本発明は、以下に記 載するプレターゲティング光力学的治療プロトコルも提供する。 ２段階法は ターゲット部分とリガンド−アンチリガンド結合対の１員とを含む第１の包合 体をレシピエントに投与し（但し、第１の包合体はターゲット部位に局在化する ）、 任意に、このレシピエントに循環する抱合体のレシピエントからのクリアラン スに向けられるクリアリング剤を投与するか、またはこのレシピエントをクリア リング装置若しくは代替のクリアリング手順で処置してレシピエントから循環す る抱合体を実質的に除去し、かつ このレシピエントに、感光性活性薬剤とリガンド−アンチリガンド結合対の１ 員とを含む第２の包合体に投与する（但し、この第２の包合体の結合対の一員は 第１の包合体のそれと相補的であり、かつ感光性活性薬剤または第２の包合体は それらの迅速なレシピエントからの、好ましくは腎臓クリアランスを誘発するた めに化学的に修飾されている）ことを含む。 上記任意のクリアランス段階の１つの代替法は、単に、レシピエントの本来の クリアランスを機能させるに十分な時間を経過させて循環する第１の抱合体を実 質的に除去することである。 ３段階法は ターゲット部分とリガンドとを含む第１の包合体をレシピエントに投与し（但 し、このターゲット部分−リガンド包合体はターゲット部位に局在化する）、 このレシピエントに、リガンドと感光性薬剤とを含む第２の包合体を投与する （但し、この感光性薬剤または第２の包合体はそれらの迅速なレシピエントから の、好ましくは腎臓クリアランスを誘発するために化学的に修飾されており、か つターゲット部位における第２の抱合体の局在化が第１の抱合体の前もった局在 化の結果として強化される）ことを含む。 抱合体の上記２段階及び３段階プレターゲティング法はレシピエント内因性ビ オチンの存在に係わらず行うことができるが、本発明は内因性ビオチンレベルま たはその衝撃を減少させる方法も提供する。１つの方法は、高投与量のターゲッ ティング部分−ストレプトアビジンまたはアビジン抱合体で内因性ビオチンを覆 うことである。別の方法は、レシピエントの内因性ビオチンの実質的に全てと結 合するに十分な量のアビジンで前もって処置する方法である。この方法を行う場 合、アビジンは静脈、経口または浣腸により投与できる。あるいは、レシピエン トは２段階及び３段階プレターゲティングプロトコルを行う前にビオチンを含ま ない規定食を取ることができる。内因性ビオチンに関する他の方法は、経口非吸 収性抗生物質を用いることである。 インターロイキン類（例えば、IL-2及びIL-4）、コロニー形成刺激因子（例え ば、GM-CSF）、インターフェロン類（例えば、インターフェロン−γ）及び腫瘍 壊疽因子(TNF)のようなシトキン類は、本発明の２段階又は３段階プレターゲテ ィングプロトコルの実施において抗腫瘍活性薬剤として使用できる。さらに、本 発明のプレターゲティングプロトコルは追加の条件に関して複数の応用を有する 。TGF-βのような免疫抑制シトキン類は、例えば、リュウマチ様関節炎、全身性 エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、肺繊維症等の自己 免疫疾患の治療、例えば、移植片対宿主反応の予防または防止等の肝臓及び腎臓 組織中の組織移植促進に使用できる。 図面の簡単な説明 図１はアビジンの静脈内投与後のビオチン化抗体の血中クリアランスを示す。 図２は、３段階プレターゲティングプロトコルにおける放射性レニウムの腫瘍 内取込みを、放射性標識抗体（従来から使用されているキレート化放射性レニウ ムに共有結合した抗体）投与と比較して示す。 図３は、NR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体(LU-10-StrAv)の腫瘍内取込みプ ロフィルを、対照として用いた天然型NR-LU-10完全抗体のプロフィルと比較して 示す。 図４は、NR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体の腫瘍内取込み及び血中クリア ランスプロフィルを示す。 図５は、オロソムコイドと比較して、アシアロオロソムコイドの迅速な血中ク リアランスをI-125-標識タンパク質の注入用量の%として示す。 図６は、オロソムコイドと比較して、アシアロオロソムコイドの５分間の限定 生体内分布をI-125-標識タンパク質の注入用量の%として示す。 図７は、３種類の対照(○、●、■)及びクリアリング剤の２種類の用量（□（ 小さい）、□（大きい））を投与したときの抱合体投与の25時間後のNR-LU-10- ストレプトアビジン抱合体の血中クリアランスを示す。 図８は、３種類の対照（グループ１、２及び５）及びクリアリング剤の２種類 の用量（グループ３及び４）を投与したときのクリアリング剤投与の２時間後の LU-10-StrAv抱合体の限定生体内分布データを示す。 図９は、クリアリング剤投与の２時間後のNR-LU-10-ストレプトアビジン抱合 体の血清ビオチン結合能力を示す。 図10は、対照（○）及びクリアリング剤の３種類の用量（▽、△、□）を投与 したときの抱合体投与の24時間後のNR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体の経時 的血中クリアランスを示す。 図11Aは、対照(PBS)及びクリアリング剤の３種類の用量(50、20及び10μg)を 投与したときのクリアリング剤投与の２時間後のLU-10-StrAv抱合体の血中クリ アランスを示す。 図11Bは、対照(PBS)及びクリアリング剤の３種類の用量(50、20及び10μg)を 投与したときのクリアリング剤投与の２時間後のLU-10-StrAv抱合体の血清ビオ チン結合能力を示す。発明の詳細な説明 本発明を説明する前に、本文中で使用したいくつかの用語を定義しておくのが 有用であろう。 ターゲティング部分：所定の細胞集団に結合する分子。ターゲティング部分は 、レセプター、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、またはターゲット 細胞集団上もしくは該集団内に存在する他の結合部位に結合し得る。本明細書の 記載ではターゲティング部分の典型例として抗体を使用している。抗体クラグメ ント及び発現された抗原を認識できる小さいペプチト配列も、本発明のターゲテ ィング部分に含まれる。また、本発明の説明においてターゲットの典型例として 腫瘍を使用している。 リガンド/アンチリガンド対：一般に比較的高い親和性の特異的結合を示す相 補性/アンチ相補性分子対。典型的なリガンド/アンチリガンド対としては、ジン クフィンガータンパク質/dsDNAフラグメント、酵素/阻害物質、ハプテン/抗体、 レクチン/糖質、リガンド/レセプター、及びビオチン/アビジンがある。本明細 書の記載ではリガンド/アンチリガンド対の典型例としてビオチン/アビ ジンを使用している。 アンチリガンド：本文中に定義された「アンチリガンド」は、相補性リガンド と高親和性結合、好ましくは多価結合する分子を意味する。急激な腎クリアラン スを防止するようにアンチリガンドが十分に大きく、また、ターゲティング部分 -リガンド抱合体の架橋及び凝集を得るために十分な高価数のものが好ましいが 、一価のアンチリガンドも本発明の対象となる。本発明のアンチリガンドは、例 えば肝取込みを指令するガラクトース残基のように、その取込みを指令する構造 的な特徴を示すかまたは示すように誘導体化され得る。本明細書では典型的なア ンチリガンドとしてアビジン及びストレプトアビジンを使用している。 アビジン：本文中で定義された「アビジン」なる用語は、アビジン、ストレプ トアビジン、または、ビオチンと高親和性の多価結合または一価結合を生じ得る その誘導体もしくは類似体を包含する。 リガンド：本文中で定義された「リガンド」なる用語は、動物またはヒトに静 脈内投与されたとき迅速な血清、血中及び/または全身クリアランスを示す比較 的小さい可溶性分子を意味する。典型的なリガンドとしてビオチンを使用してい る。 活性薬剤：放射性核種、薬物、抗腫瘍剤、毒素などのような診断薬または治療 薬（「ペイロード」）。典型的な活性薬剤として放射性核種治療薬を使用してい る。 NxSyキレート：本文中で定義された「NxSyキレート」なる用語は、（ｉ）金属 または放射性金属と配位結合することができ、且つ、（ii）ターゲティング部分 、リガンドまたはアンチリガンドに共有結合し得る二官能(buoy)キレート化剤を 意味する。特に好ましいNxSyキレートはN2S2及びN3Sコアを有している。代表的 なNxSyキレートは、例えばFritzberg et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 4024-29,1988;Weber et al.，Bioconj．Chem. 1:431-37,1990;及びこれらの引用 文献に記載されている。 プレターゲティング(Pretargeting)：本文中で定義されたプレターゲティング なる用語は、リガンド/アンチリガンド対の一方に結合したターゲティング部分 をターゲット部位に局在化させることを意味する。このターゲティング部分抱合 体の最適のターゲット対非ターゲット蓄積比が生じる十分な時間が経過した後、 リガンド/アンチリガンド対の他方に結合した活性薬剤を投与し、ターゲット部 位においてターゲティング部分抱合体に（直接または間接的に）結合させる（２ 段階プレターゲティング）。本文中に記載した３段階方法及び他の関連方法も本 発明に包含される。 クリアリング剤(clearing agent)：レシピエントの循環中に存在する被投与部 分（例えば、ターゲティング部分-リガンド、ターゲティング部分-アンチリガン ドまたはアンチリガンド単独）と結合、錯化または他の方法で結合することがで き、これによって、レシピエントの体内からの循環部分のクリアランス、血液循 環からの除去または循環中の部分の不活性化を容易にする物質を意味する。クリ アリング剤は、クリアリング剤と同じ処理プロトコルで使用されるターゲティン グ部分によって認識されるターゲット細胞集団へのクリアリング剤の接近を制限 する物理的特性、例えば、大きさ、電荷、立体配置またはその組合わせを特徴と することが好ましい。 ターゲット細胞滞留：放射性核種又は他の治療薬がターゲット細胞表面又はタ ーゲット細胞内に滞留する時間。抱合体又は治療薬を含む分子の分解作用はター ゲット細胞滞留の損失に主に関係があると思われる。抱合体 (Conjugate)：抱合体は、化学的抱合体（共有結合または非共有結合）、 融合タンパク質などを包含する。 造影または治療のためのターゲティング部分-放射性同位元素抱合体のin vivo 投与に関して判明した欠点は、結合させた放射性薬剤が非ターゲット部位及びタ ーゲット部位の双方に局在化することである。投与された放射性標識抱合体が循 環からクリアされるまでに、正常な器官及び組織が結合させた放射性物質によっ て一時的に被曝される。例えば、in vivoで投与された放射性標識完全抗体は、 比較的緩慢な血中クリアランスを示す。最大のターゲット部位局在化は通常は投 与の１〜３日後に生じる。概して、抱合体の血中クリアランス時間が長い程、非 ターゲット器官の放射能被曝が大きい。 これらの特性はヒトの放射線免疫療法で特に問題となる。ヒトの臨床試験では 、完全抗体に結合した放射性同位元素の循環半減期が長いと、全身にデリバリー さ れる放射線量が比較的大きくなる。特に、極めて放射線感受性の高い骨髄は非特 異的毒性の用量制限器官である。 非ターゲット組織の放射性同位元素被曝を少なくするために、可能性のあるタ ーゲティング部分を広くスクリーニングして、非ターゲット反応性が最小であり しかもターゲット特異性及び反応性を維持しているものを同定した。非ターゲッ トの被曝（及び非ターゲットへの局在化及び/または毒性などの副作用）を抑制 することによって、放射線治療用抱合体の投与量を増加し得る。さらに、放射線 診断用抱合体の非ターゲット蓄積が減少するのでバックグラウンドとターゲット とのコントラストが向上する。 単独で投与されるかまたはターゲティング部分との抱合体として投与される治 療薬も同様の欠点を有している。この場合にも目的は、（非ターゲット組織の被 曝に起因する）正常器官の毒性を許容可能限界値未満に維持しながら、（ターゲ ット組織を最大に照射する）最大可能濃度の薬剤を投与することである。しかし ながら、放射性同位元素と違って治療薬は、細胞毒性効果を発揮するためにはタ ーゲット細胞に取込まれなければならない。ターゲティング部分-治療薬抱合体 の場合、比較的ターゲット特異的なターゲティング部分と、ターゲティング部分 -薬剤抱合体のターゲット細胞内インターナリゼーションを増進させる手段とを 組み合わせるのが有利であろう。 これに対し、診断薬-ターゲティング部分抱合体を投与する場合には、ターゲ ット細胞内インターナリゼーションの増進は好ましくない。診断用抱合体のイン ターナリゼーションにより、抱合体の細胞性異化及び分解が生じる。このような 分解が生じると、診断薬の小さい付加化合物または診断薬自体が細胞から放出さ れ、従って、ターゲット特異的に抱合体を検出する能力が失われる。 非ターゲット組織の診断薬または治療薬への曝露を減少させる１つの方法は、 ターゲティング部分をターゲット部位に「プレターゲティング」し、次いで、タ ーゲット部位に「プレターゲッティングされた」ターゲティング部分に結合し得 るクリアランスの速い診断薬または治療薬抱合体を投与することである。いくつ かのプレターゲティング方法の実施態様が米国特許第4,863,713号(Goodwin et a l.)に記載されている。 代表的なプレターゲティング方法（「３段階」）を以下に概略的に示す。 要するに、この３段階プレターゲティングプロトコルは、ターゲット部位に局 在させ循環中では希釈されることが可能な抗体-リガンド抱合体を投与すること を特徴とする。その後に投与されるアンチリガンドが抗体-リガンド抱合体に結 合し、未結合の抗体-リガンド抱合体を血中からクリアする。好ましいアンチリ ガンドは、循環する抗体-リガンド抱合体の架橋及び凝集が得られるように十分 に大きくまた十分に高い価数を有する。アンチリガンドによるクリアリングはお そらく、血液中に循環する抗体-リガンド抱合体がアンチリガンドと架橋及び/ま たは凝集し、その結果としてレシピエントのRES（細網内皮系）による複合体/凝 集物クリアランスが生じるためであろう。この種のアンチリガンドクリアランス は好ましくは多価分子によって得られるが、それ自体RESによってクリアされる 十分な大きさをもつ一価の分子も使用できよう。あるいは、アシュウェル(Ashwe ll)レセプターのようなレセプターに基づくクリアランスメカニズム、またはガ ラクトースもしくはマンノース残基などのヘキソース残基認識メカニズムもアン チリガンドクリアランスを担うことができるであろう。このようなクリアランス メカニズムは、RES複合体/凝集物クリアランスメカニズムよりも、リガンドに対 するアンチリガンドの価数に対する依存性がより小さい。リガンド-アンチリガ ンド対が比較的高親和性の結合を示すことが好ましい。 次に、迅速な全身クリアランスを示す診断薬-または治療薬-リガンド抱合体を 投与する。循環によって活性薬剤-リガンド抱合体がターゲット細胞結合抗体-リ ガンド-アンチリガンド複合体の近傍に運ばれると、アンチリガンドが循環中の 活性薬剤-リガンド抱合体に結合し、ターゲット部位に抗体-リガンド：アンチリ ガンド：リガンド-活性薬剤の「サンドイッチ」を生じさせる。診断薬または治 療薬は、（抗体、抗体フラグメントまたは他の緩慢にクリアされるターゲティン グ部分よりも）迅速にクリアされるリガンドに結合しているので、この方法では 非ターゲットの活性薬剤に対する暴露が抑制される。 代替的なプレターゲティング方法では、アンチリガンドクリアリング剤の非経 口投与段階が削除される。これらの「２段階」手順は、ターゲティング部分-リ ガンドまたはターゲティング部分-アンチリガンドを投与し、次いでリガンド-ア ンチリガンド対の他方と抱合体を形成している活性薬剤を投与することを特徴と する。本発明の２段階プレターゲティング方法の任意の「1.5」段階として、（ 好ましくはリガンドまたはアンチリガンド単独でない）クリアリング剤を投与し て、循環中のターゲティング部分含有抱合体のクリアランスを容易にする。 ２段階プレターゲティング方法において、クリアリング剤は、ターゲット細胞 集団に直接結合することもなく、予め投与されターゲット細胞に結合したターゲ ティング部分-アンチリガンド抱合体またはターゲティング部分-リガンド抱合体 を介して結合することもないものであることが好ましい。２段階プレターゲティ ングの一例では、アビジン-ターゲティング部分抱合体のクリアリング剤として 、ビオチン化ヒトトランスフェリンを使用する。このクリアリング剤は、トラン スフェリン-ビオチン-循環アビジン-ターゲティング部分複合体の肝クリアラン スを生じさせる大きさを有しており、ターゲット細胞部位に結合したアビジン- ターゲティング部分抱合体との結合は実質的に阻止される(Goodwin,D.A.，Antib od. Immunoconj．Radiopharm., 4:427-34,1991参照)。 ２段階プレターゲティング方法は、３段階のプレターゲットプロトコルにおけ るクリアリング剤の使用に関連するいくつかの欠点を克服する。より具体的には 、動物モデルで得られたデータは、プレターゲットされたターゲティング部分- リガンド抱合体（即ち、細胞に結合した抱合体）に対するin vivoのアンチリガ ンド結合が、ターゲット細胞からターゲティング部分-リガンド抱合体を除去す ることを示している。この観察された現象の１つの解釈としては、多価アンチリ ガンドが細胞表面でターゲティング部分-リガンド抱合体と架橋し、これにより 生じた複合体のインターナリゼーションが開始されるかまたは容易になるためで あると説明できる。ターゲティング部分-リガンドの細胞からの明らかな損失は 、抱合体の内部分解及び/または（細胞表面または細胞内部における）活性薬剤 の抱合体からの遊離によるものであるかもしれない。観察された現象の別の解釈 としては、ターゲット細胞の膜透過率の変化がターゲット細胞内への分子の受動 拡散を増加させるためであると説明できる。同様に、ターゲティング部分-リガ ンドがある程度失われるのは、別の部分がその後にターゲティング部分-リガン ドに後で結合するので親和性が変質するためであり得る。例えば、抗-イディオ タイプモノクローナル抗体の結合は、腫瘍に結合したモノクローナル抗体の除去 を生じる。 本発明によれば、この現象（ターゲット細胞からのターゲティング部分-リガ ンドの明らかな減少）を治療薬全体のin vivoデリバリー、または特に薬剤デリ バリーに有利に使用し得ることが判明した。例えば、ターゲティング部分をリガ ンド及び治療薬の双方に共有結合させ、レシピエントに投与し得る。その後に投 与されたアンチリガンドは、表面に結合したターゲティング部分-リガンド-治療 薬の三者抱合体と架橋し、三者抱合体（従って活性薬剤）のインターナリゼーシ ョンを誘発する。あるいは、ターゲティング部分-リガンドをターゲット細胞表 面にデリバリーし、次いでアンチリガンド-治療薬を投与してもよい。 本発明の１つの形態においては、ターゲティング部分-アンチリガンド抱合体 をin vivo投与する。ターゲティング部分-アンチリガンド抱合体のターゲット局 在化（即ち、この抱合体の循環からのクリアランス）が生じたとき、活性薬剤- リガンド抱合体を非経口的に投与する。この方法は、（ターゲティング部分-リ ガンド：アンチリガンド：リガンド-活性薬剤複合体及びターゲティング部分-リ ガンド：アンチリガンド-活性薬剤複合体と比較して）ターゲティング部分-アン チリガンド：リガンド-活性薬剤複合体のターゲット細胞滞留を増進する。多様 なリガンド/アンチリガンド対が本発明の範囲内で使用するのに適当であるが、 好ましいリガンド/アンチリガンド対はビオチン/アビジンである。 本発明の第２の形態においては、放射性ヨウ素化ビオチン及び関連方法が開示 される。従来の放射性ヨウ素化ビオチン誘導体は高分子量を有しており特性化す るのが困難であった。本文中に記載の放射性ヨウ素化ビオチンは容易に且つ十分 に特性化された低分子量化合物である。 本発明の第３の形態においては、ターゲティング部分-リガンド抱合体のin vi vo 投与が開示される。ターゲティング部分-リガンド抱合体のターゲット局在化 （即ち、この抱合体の循環からのクリアランス）が生じたときに、薬剤-アンチ リガンド抱合体を非経口投与する。この２段階方法では、ターゲティング部分抱 合体をプレターゲティングするだけでなく、後のターゲティング部分-リガンド- アンチリガンド-薬剤複合体をターゲット細胞で内部にインターナリゼーション させる。あるいは、別の実施態様は、ターゲティング部分-リガンド：アンチリ ガンド；リガンド-薬剤複合体を表面に産生する３段階プロトコルを提供する。 この方法では、リガンド-薬剤抱合体をアンチリガンドと同時に投与するかまた は短時間の経過後（即ち、ターゲティング部分-リガンド-アンチリガン ド複合体がターゲット細胞表面から除去される前）に投与する。 本発明の第４の形態においては、テクネチウム-99m、レニウム-186及びレニウ ム-188によるビオチンの放射性標識方法が開示される。従来のビオチン誘導体は 、プレターゲットされたイムノシンチグラフィーで使用するためにインジウム-1 11で放射性標識されていた(例えばVirzi et al.，Nucl．Med．Biol. 18:719-26; Kalofonos et al.，J．Nucl．Med．31:1791-96,1990;Paganelli et al.，Canc．Res. 51:5960-66,1991)。しかしながら、99mTcは、（ｉ）廉価であること、（ii ）供給の便がよいこと、及び（iii）有利な核特性により特に好ましいイムノシ ンチグラフィー用放射性核種である。レニウム-186は99mTcに極めて類似したキ レート化学を示し、優れた治療用放射性核種であると考えられている（即ち、半 減期3.7日及び131Iと同様の1.07MeV最大粒子）。従って、請求の範囲に記載され たビオチンのテクネチウム及びレニウムによる放射性標識方法は多数の利点を与 えるものである。 本発明の「ターゲティング部分」は、腫瘍細胞のような所定のターゲット細胞 集団に結合する。この意味で有用な好ましいターゲティング部分としては、抗体 、抗体フラグメント、ペプチド及びホルモンがある。既知の細胞表面レセプター に対応するタンパク質（低密度リポタンパク質、トランスフェリン及びインスリ ン等）、繊維素溶解酵素、抗-HER2、アネキシンのような血小板結合タンパク質 、生物学的応答調節剤（インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチ ン及びコロニー形成刺激因子等）も好ましいターゲティング部分である。また、 レセプターに結合後にインターナリゼーションを受けある程度まで核に達する抗 -EGFレセプター抗体は、オージェ電子エミッタ及び核結合薬剤をターゲット細胞 核に容易にデリバリーするために本発明で使用される好ましいターゲティング部 分である。オリゴヌクレオチド、例えばターゲット細胞核酸(DNAまたはRNA)の部 分に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明を実施するためのターゲ ティング部分として有用である。細胞表面に結合するオリゴヌクレオチドも有用 である。所定のターゲット細胞集団に結合する能力を維持している上記に挙げた ターゲティング部分の類似体も請求の範囲に記載の発明の範囲内で使用され得る 。さらに、合成ターゲティング部分も設計できる。 上記分子の機能的等価物も本発明のターゲティング部分として有用である。タ ーゲティング部分の機能的等価物の一例は「模倣」化合物、即ちターゲティング 部分-ターゲット細胞結合のための適正な立体配置及び/または配向を模倣するよ うに設計された有機化学的構築物である。別のターゲティング部分の機能的等価 物は、コンピューター支援分子モデリング及び改変された結合親和性を有する突 然変異体を用いて構築した「最小」ポリペプチドと呼ばれる短いポリペプチドで ある。この最小ポリペプチドはターゲティング部分の結合親和性を示す。 本発明の好ましいターゲティング部分は抗体（ポリクローナルまたはモノクロ ーナル）、ペプチド、オリゴヌクレオチド等である。本発明の実施に有用なポリ クローナル抗体はポリクローナル(Vial and Callahan，Univ．Mich．Med．Bull. ，20:284-6,1956)、アフィニティ精製ポリクローナルまたはそのフラグメント（ Chao et al.，Res．Comm．in Chem．Path． & Pharm.，9:749-61,1974）である 。 本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は完全抗体及びそのフラグメントを 包含する。このようなモノクローナル抗体及びフラグメントは、ハイブリドーマ 合成、組換えDNA法及びタンパク質合成のような慣用の方法によって産生できる 。有用なモノクローナル抗体及びフラグメントは、任意の種（ヒトを含む）に由 来することができ、あるいは２以上の種からの配列を使用するキメラタンパク質 として形成されてもよい。概要に関しては、Kohler and Milstein，Nature256:4 95-97,1975; Eur．J．Immunol. 6:511-19,1976を参照。 ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」ネズミ抗体も本発明のターゲティン グ部分として有用である。例えば欧州特許出願第0,411,893A2号に開示されたも のと同様の方法を用い、例えばネズミFv領域（即ち、抗原結合部位を含有する領 域）またはその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメ イン領域及びFc領域で遺伝子組換えすることによってネズミモノクローナル抗体 を「ヒト化」する。適正なターゲット部位結合特性を確保するためにいくつかの ネズミ残基をヒト可変領域フレームワークドメインに維持してもよい。ヒト化し たターゲティング部分は、宿主レシピエント中の抗体またはポリペプチドの免疫 反応性を減少させ、半減期を延長させ、且つ、不都合な免疫反応の可能性を減少 させるものと認識される。 本発明で有用な活性薬剤（診断用または治療用）の種類には、毒素、抗腫瘍薬 、薬物及び放射性核種がある。本発明で使用できる有効な毒素のいくつかは、Ａ 鎖及びＢ鎖からなる。Ａ鎖は細胞障害性部分であり、Ｂ鎖は在来毒素分子（ホロ トキシン）のレセプター結合部分である。毒素Ｂ鎖は非ターゲット細胞結合を媒 介するので、毒素Ａ鎖だけをターゲティングタンパク質に結合させるのが有利な 場合が多い。しかし、毒素Ｂ鎖の除去は非特異的細胞毒性を減少させることはで きるが、一般的な傾向として、対応するホロトキシン-ターゲティングタンパク 質抱合体と比較して毒素Ａ鎖-ターゲティングタンパク質抱合体の効力の減少を 招く。 この点に関して好ましい毒素は、アブリン、リシン、モデシン(modeccin)、シ ュードモナス(Pseudomonas)菌体外毒素Ａ、ジフテリア(Diphtheria)毒素、百日 咳毒素及び志賀毒素のようなホロトキシン；リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシ ンＡ鎖、シュードモナス菌体外毒素Ａの酵素部分、ジフテリア毒素Ａ鎖、百日咳 毒素の酵素部分、志賀毒素の酵素部分、ゼロニン(gelonin)、アメリカヤマゴボ ウ抗ウイルスタンパク質、サポリン(saporin)、トリチン(tritin)、大麦毒素及 びヘビ毒ペプチドのようなＡ鎖または「Ａ鎖様」分子である。リボソーム不活性 化タンパク質(RIP)、転位及び細胞結合能力の欠如した天然タンパク質合成阻害 物質も本発明に適宜使用し得る。パリトキシン(palytoxin)のような極めて毒性 の高い毒素も本発明の実施に有用であると考えられる。 パリトキシン、ブロック(blocked)リシン（米国特許第5,239,062号参照）、 シュウドモナス菌体外毒素等の細菌毒素、ジフテリア毒素、トリコテセン類（例 えばロリジンＡ及びベルカリンＡ）等の真菌二次代謝産物毒素、のような特に高 毒性の毒素、及びアクチノマイシンＤ等の増強化学療法剤のような他の高毒性の 毒素も本発明の実施に使用することができる。そのような特に高毒性の分子はマ イクロモルやピコモル濃度で毒性を示す。 例えば、保護された遊離の末端アミノ基を有するパリトキシン分子は、そのよ うな遊離のアミンを有さないパリトキシン誘導体の約５００倍の毒性を有する。 猿では、約80ng/kg のLD50を有することが見いだされた。従って、アミノ誘導化 パリトキシン分子は、約40μg/kgのi.v.LD50を有すると予想される。パリトキシ ンは特に高毒性により特徴付けられる典型分子としてここに記載する。パリトキ シンは膜活性薬剤の模範例としてもここに記載する。膜活性薬剤の他の例は、ア ンホテリシンB、ポリミキシンB 等である。 従来のターゲット治療においては、活性薬剤が抗体または投与されるべき治療 抱合体に結合し、投与されるべき診断または治療抱合体を形成する。ターゲット 部位への活性薬剤の付着は、従って、ターゲット部位の薬物動態学により検出さ れる。全モノクローナル抗体は、最適ターゲット部位付着に、例えば、一般に約 20〜72時間を要するが、Fab 及びFab'フラグメントのような抗体フラグメントは 一般に約0 〜8 時間を要し、かつF(ab')2フラグメントは一般に約8 〜24時間を 要する。従って、抱合体レシピエントの正常組織は、付着時間の間、活性薬剤に 曝され、望ましくない正常組織毒性に導く。この正常組織の露出の結果、特に高 毒性部分は一般にターゲット治療に使用できない。 しかし、プレターゲティング法においては、活性薬剤の薬物動態学がターゲッ ティング部分の薬物動態学から分離している。ターゲッティング部分はリガンド −アンチリガンド対の１員に結合する一方、ターゲット部位に付着する。この付 着の後、実質的に全ての非ターゲット抱合体がレシピエントの循環からクリアさ れ、高毒性活性薬剤はリガンド−アンチリガンド対の相補的１員に対する抱合体 として投与される。好ましくは、毒素−リガンドまたは毒素−アンチリガンドは 短い半減期を有し、かつ腎臓を経て排出される。この方法では、毒性活性薬剤は その毒性能力が発揮されることが望まれるターゲット部位に付着するか、または レシピエントから迅速に除去される。この活性薬剤の生体分布は望ましくない毒 性からレシピレントの正常組織の保護を促進する。腎臓排出を強化するために、 トリコテセンに関して以下で述べるように分子を検出する生体分布を促進する腎 臆排出への包合体化を使用できる。代わりに、活性薬剤のより低い治療効果投与 量を用いることができる。 パリトキシン、特に高毒性活性薬剤の典型例、は以下によって特徴付けられる ：細胞表面レセプターに結合し、かつ細胞膜に孔を形成することにより細胞外に 活性を及ぼす２６８１ダルトン分子量を有する非タンパク質構造である。パリ トキシン構造は知られており、Bignami et al.，Cancer Research，52:5759-576 4，1992に記載されている。 パリトキシンは以下の機能的特徴を示す。リンパ球、繊維芽細胞、及び正常ま たはウイルス形質転換上皮細胞の培養に対して細胞障害性である。パリトキシン は脱分極もし、かつ哺乳類の赤血球を溶解(lyses)する。代謝活性循環細胞に対 して選択的に毒性である抗癌剤とは対照的に、Na+K+−ATPアーゼ結合毒素レセプ ターを発現する細胞を殺傷するようだ。薬理学的研究はパリトキシンが細胞中で ナトリウム、カリウム及びカルシウム束を非常に混乱させることを示す。この混 乱は、ミトコンドリアに対する損傷とプロテアーゼ及びホスホリパーゼ酵素の放 出を含む結果のカスケード（分岐）を生じ、かつ細胞膜の超微細構造に対する損 傷を引き起こす。 本発明のプレターゲティング法における使用のため、パリトキシンはリガンド またはアンチリガンドに結合（抱合）される。説明のため、パリトキシン−ビオ チン及びパリトキシン−ストレプトアビジン抱合体を以下及び実施例XVI に記載 する。 ビオチン−パリトキシン抱合体の調製のための１つの一般的な戦略は以下のと おりである。 １）パリトキシンの末端アミン窒素を保護し、かつ ２）ヨードアセチルまたはブロモアセチルビオチン誘導体のようなビオチン保 持アルキル化剤でパリトキシンのヒドロキシル基をアルキル化する。この戦略は 、しかし、パリトキシンの選択的機能化を行うものではない。即ち、その反応に おいて幾分か関係する特定のパリトキシンのヒドロキシル基は予め選択されてい ない。 ヨードアセチル−長鎖(LC)ビオチン（Piere Chemical Companyから入手可能） はDMF 及びNaH 中でアミン保護されたパリトキシンと反応させ、ビオチン−パリ トキシン抱合体を形成する。パリトキシンのビオチン誘導化の程度は、他の事の 中でも、ヨードアセチル−LC−ビオチン：パリトキシンの提供比に依存する。一 般に、１から約５ビオチン／パリトキシンの範囲のビオチン誘導化を用いる。末 端パリトキシンアミン基の脱保護はパリトキシン−ビオチン抱合体のレシピエン トへの投与の前に行われる。これらの場合、BOC や TFA等の酸又は塩基開裂性保 護基を保護段階で用いることが好ましい。in vivo 脱保護を行う場合、酵素開裂 （開裂可能リンケージ（架橋）に関して以下に記載するような）が可能な官能基 が好ましい。代わりのヨードアセチル−リンカー−ビオチン分子を用いて同様の 経路を利用できる。 代わりに、リガンドまたはアンチリガンドはパリトキシンに選択的に結合でき る。即ち、この結合はパリトキシン分子のユニークな機能性を利用して形成でき る。例えば、COOH部分はペプチダーゼで保護アミンパリトキシン誘導体を処理す ることにより遊離できる。次いで活性エステルがその遊離COOHを用いて形成され 、かつ形成された活性エステルは誘導化されたビオチンアミノ基と反応する。さ らに別の可能性はパリトキシン構造のC-55位置（ユニークアセタール機能性）で の誘導化である。遊離のパリトキシンアミンの保護の後に、環構造中の潜伏的な ケトンをNaCNBH3 の存在下でビオチンアミンを用いて誘導化できる。還元的アミ ノ化の生成物は以下のように表される。 ビオチン−リンカー−NH-CH2−パリトキシン 但し、炭素原子はパリトキシン構造のC-55であり、リンカーは少なくとも１つ のアミン基を有するホモ−またはヘテロ二官能性リンカーの非アミン部分である 。 本発明の実施に有用な他の一般的パリトキシン−ビオチン抱合体はパリトキシ ン分子の末端アミンを介して結合する。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド− ビオチンのような活性エステルビオチン誘導体、または開裂性リンカーをpH7.5 で遊離の非保護末端アミン基を有するパリトキシンと結合できる。 本発明の実施に有用な好ましい開裂性リンカーは、ターゲット部位にパリトキ シン−ビオチン抱合体が付着するに必要な時間より大きい生理的半減期により特 徴付けられる。好ましくは、このリンカーの生理的安定性半減期はビオチン化パ リトキシン抱合体の血清クリアランスの約２〜５倍である。この方法において、 ストレプトアビジンはターゲット部位にプレターゲトされ、かつレシピエントの 循環から実質的に除去される。ビオチン−開裂性リンカー−パリトキシンは投与 され、かつプレターゲトされたストレプトアビジンに局在化される。パリトキシ ンは抱合体から放出され、ターゲット部位レセプターに結合する。結果として、 ターゲット部位にデリバリーされたパリトキシンは、天然のより高い毒性のアミ ンフリーの形態である。本発明の実施に有用な開裂性リンカーの例は、ヒドラジ ドチオウレアリンカー（NH2-誘導化パリトキシンイソチオシアナート及びビオチ ンヒドラジドの反応により形成される）；ビオチニダーゼの作用を受けやすい長 鎮アミドリンカー（例えば、遊離アミンを有するパリトキシンと長鎖−ビオチン −NHS エステル、Sigma Chemlcal Co.，St．Louis，Missouri から入手可能、と から形成される）；エステラーゼの作用を受けやすいエステルリンカー（例えば 、遊離アミンを有するパリトキシンと活性エステル〔ビオチンとHO-CO-(CH2)n-B r(但し、ｎは２〜５である)との反応生成物である〕とから形成される）等であ る。 パリトキシン−ストレプトアビジン抱合体は、例えば、本発明の２段階プレタ ーゲティングプロトコルに使用できる。即ち、ビオチン化ターゲッティング部分 を投与し、かつターゲットに局在化させることができる。必要により、循環ビオ チン−ターゲット部位抱合体はクリアリング剤（例えば、ガラクトシレート化− アビジン等）を用いるか、その他のクリアランス機構によりクリアされる。次に 、パリトキシン−ストレプトアビジン抱合体は投与され、プレターゲトされたビ オチン−含有抱合体に結合する。この抱合体のストレプトアビジン成分は、パリ トキシンの遊離アミン基に結合することにより、またはパリトキシン構造に関す るストレプトアビジンの折りたたみにより、パリトキシンの全体毒性を減少させ る。パリトキシン−ストレプトアビジン抱合体化は、例えば、上記COOH- 遊離パ リトキシン誘導体を用いて行うことができる。 代わりに、Bignami el at.，Cancer Research, 52:5759-5764に記載され、ペ ニシリンＧアミダーゼ(PGA)で活性化されたN-(4'-ヒドロキシフェニルアセチル) -パリトキシンのようなパリトキシンのプロドラッグ（即ち、不活性）体も本発 明の２段階又は３段階プレターゲティングプロトコルに使用できる。 本発明の２段階プレターゲティングの実施態様は、 ターゲット部分、リガンド−アンチリガンド結合対の１員及びプロドラッグを 活性化できる酵素を含む第１の包合体をレシピエントに投与し（但し、第１の包 合体はターゲット部位に局在化する）、 任意に、このレシピエントに循環する抱合体のレシピエントからのクリアラン スに向けられるクリアリング剤を投与するか、またはこのレシピエントをクリア リング装置若しくは代替のクリアリング手順で処置してレシピエントから循環す る抱合体を実質的に除去し、かつ このレシピエントに、プロドラッグとリガンド−アンチリガンド結合対の１員 とを含む第２の包合体に投与する（但し、この第２の包合体の結合対の一員は第 １の包合体のそれと相補的であり、かつ第２の包合体は好ましくは腎臓経路を経 てレシピエントから迅速にクリアされる）ことを含む。 例えば、L6のような非インターナライジング抗癌腫IgG2a 抗体はストレプトア ビジンやPGA と本発明に記載の技術や常法により抱合体化することができる。こ のPGA-L6- ストレプトアビジン抱合体は投与され、かつターゲット部位に局在化 される。好ましくは、循環するPGA-L6- ストレプトアビジンのクリアランスを促 進するために、ガラクトース-HSA- ビオチンのようなクリアリング剤を遅い時点 で投与する。数時間後に、N-(4'-ヒドロキシフェニルアセチル)-パリトキシン- ビオチン抱合体を投与し、プレターゲトされたPGA-L6- ストレプトアビジンに付 着させるか、またはレセプターのそのための内因性機構によりレシピエントの循 環から除去される。 代替的２段階プロトコルにおいて、リガンド／アンチリガンド相互作用は酵素 と酵素阻害剤が関係する。そのような２段階プレターゲティンプロトコルは、 ターゲット部分、リガンド−アンチリガンド結合対の１員及びプロドラッグを 活性化できる酵素を含む第１の包合体をレシピエントに投与し（但し、第１の包 合体はターゲット部位に局在化する）、 任意に、このレシピエントに循環する抱合体のレシピエントからのクリアラン スに向けられる酵素を含むクリアリング剤を投与するか、またはこのレシピエン トをクリアリング装置若しくは代替のクリアリング手順で処置してレシピエント から循環する抱合体を実質的に除去し、かつ このレシピエントに、プロドラッグを投与する（但し、このプロドラッグは、 プレターゲトされた酵素の部位で活性な細胞障害性形態に変換される）ことを含 む。 例えば、L6-PGA抱合体は投与され、ターゲット部位に局在化される。好ましく は、ガラクトース-HSA-PGA不可逆阻害剤のようなクリアリング剤または可逆若し くは不可逆PGA 阻害剤と大型非血管外浸透分子とを含む抱合体を循環PGA-L6- ス トレプトアビジンのクリアランスを促進するために遅い時点で投与する。 大型非血管外浸透分子の例は、デキストランである。本明細書の他の箇所で論 述している、その他のポリマー類、高分子粒子またはリポソームも使用できる。 本発明の実施に有用な不可逆阻害剤の例は、基質に似た分子中にヨードアセチ ル基またはアミド基のような反応性基を組み込むことによって設計できる。例え ば、ヨードアセタミドはその活性部位にシステイン残基を有する多くの酵素の不 可逆阻害剤である。PGA の可逆阻害剤の例は他のアミド基質、例えば、トリグリ シンまたは4-ヒドロキシフェニルアセチルグリシン等のようなペプチド類である 。 数時間後に、活性薬剤のプロドラッグ体が投与される。例えば、N-(4'-ヒドロ キシフェニルアセチル)-パリトキシン- ビオチンを投与し、この分子は、プレタ ーゲトされたPGA-L6に付着させるか、またはレセプターのそのための内因性機構 によりレシピエントの循環から除去される。 上記任意のクリアランス段階の１つの代替法は、単に、レシピエントの本来の クリアランス機構を働かせるに十分な時間放置して循環する第１の抱合体を実質 的に除去することである。 ３段階法は ターゲット部分、酵素及びリガンドを含む第１の包合体をレシピエントに投与 し（但し、この第１の抱合体はターゲット部位に局在化する）、 このレシピエントに、アンチリガンドまたはアンチリガンド含有抱合体を投与 し、かつ このレシピエントにプロドラッグを投与する（但し、このプロドラッグはプレ ターゲトされた酵素の部位で活性な細胞障害性形態に変換される）。 上記方法はN-(4'-ヒドロキシフェニルアセチル)-パリトキシン／PGA プロドラ ッグ／酵素対に関して記載してきたが、その外の同様の対に対してもこれらの方 法は修正可能である。本発明の実施に有用なプロドラッグ／酵素対の例は、薬剤 のホスフェート体（例えば、フェノールマスタードホスフェート、エトポシド(e toposide)ホスフェート、マイトマイシンホスフェート、ドキソルビシンホスフ ェート等）及びアルカリホスファターゼ酵素である。例えば、Wallace et at.，Bioconj．Chem. ，2:349-352，1991 参照。5-フルオロシトシン(5FC)/シトシンデ アミナーゼ(CDase)の別の例は、Senter et al.，Bioconj．Chem.，2:447-451，1 991 に記載されている。追加の例は、β-ラクタマーゼによるβ-ラクタムプロド ラッグの活性化に関する。 本発明に適宜使用し得る好ましい薬物は、慣用の化学療法剤、例えば、ピンブ ラスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、メトトレキセート、5-フルオロウ ラシル、6-チオグアニン、シタラビン、シクロホスファミド、及びシスプラチナ ムのような化学療法剤、並びに、Cancer: Principles and Practice of Oncolog y， 2d ed.，V.T．DeVita，Jr.，S．Hellman，S.A．Rosenberg，J.B．Lippincott Co.，Philadelphia，PA，1985，Chapter14 に記載されたような他の慣用の化学 療法剤である。本発明の範囲内の特に好ましい薬物はトリコテセン(trichothece ne)である。 トリコテセンは、不完全菌類種(Fungi imperfecti)の土壌菌類によって産生さ れるかまたはBaccharus megapotamicaから単離された薬物である(Bamburg，J.R ．Proc．Molec．Subcell．Biol．8:41-110,1983;Jarvis & Mazzola，Acc．Chem ．Res．15 :338-395,1982)。これらは炭素と水素と酸素とだけを含有する最も毒 性の分子であると考えられる(Tamm，C．Fortschr．Chem．Org．Naturst．31:61- 117,1974)。これらはすべて、タンパク質合成を開始、延長及び終結期に阻害す る物質としてリボソームのレベルで作用すると報告されている。 トリコテセンは２つの大きなクラス、即ち中心セスキテルペノイド構造だけを 有するものと付加的な巨大環を有するものとに分類できる（それぞれ単純トリコ テセン及び巨大環状トリコテセンと呼ぶ）。単純トリコテセンは、米国特許第4, 744,981号及び第4,906,452号（引用によって本明細書に含まれるものとする）に 記載されているように３つのグループ（即ち、グループＡ，Ｂ及びＣ）に細分さ れる。グループＡの単純トリコテセンの代表例としては、シルペン(Scirpen)、 ロリジンＣ、ジヒドロトリコテセン、シルペン-4,8-ジオール、ベルカロール、 シルペントリオール、T-2テトラオール、ペンタヒドロキシシルペン、4-デアセ チルネオソラニオール、トリコデルミン、デアセチルカロネクトリン、カロネク トリン、ジアセチルベルカロール、4-モノアセトキシシルペノール、4,15-ジア セトキシシルペノール、7-ヒドロキシジアセトキシシルペノール、8-ヒドロキシ ジアセトキシシルペノール（ネオソラニオール）、7,8-ジヒドロキシジアセトキ シシルペノール、7-ヒドロキシ-8-アセチルジアセトキシシルペノール、8-アセ チルネオソラニオール、NT-1、NT-2、HT-2、T-2及びアセチルT-2毒 素がある。グループＢの単純トリコテセンの代表例としては、トリコテコロン、 トリコテシン、デオキシニバレノール、3-アセチルデオキシニバレノール、5-ア セチルデオキシニバレノール、3,15-ジアセチルデオキシニバレノール、ニバレ ノール、4-アセチルニバレノール（フサレノン-X）、4,15-ジアセチルニバレノ ール、4,7,15-トリアセチルニバレノール及びテトラ-アセチルニバレノールがあ る。グループＣの単純トリコテセンの代表例としては、クロトコール及びクロト シンがある。巨大環状トリコテセンの代表例としては、ベルカリンＡ、ベルカリ ンＢ、ベルカリンＪ（サトラトキシンＣ）、ロリジンＡ、ロリジンＤ、ロリジン Ｅ（サトラトキシンＤ）、ロリジンＨ、サトラトキシンＦ、サトラトキシンＧ、 サトラトキシンＨ、ベルチスポリン、ミトキシンＡ、ミトキシンＣ、ミトキシン Ｂ、ミロトキシンＡ、ミロトキシンＢ、ミロトキシンＣ、ミロトキシンＤ、ロリ トキシンＡ、ロリトキシンＢ及びロリトキシンＤがある。さらに、一般的な「ト リコテセン」セスキテルペノイド環構造は、高等植物Baccharis megapotamicaか ら単離された「バッカリン」と呼ばれる化合物中にも存在する。これらは文献に 記載されており、例えばJarvis et al.によって開示されている(Chemistry of A lleopathy，ACS Symposium Series No.268:ed.A.C．Thompson，1984，pp.149-15 9)。 本発明は、毒素を含む活性薬剤の効果的デリバリーを提供する。ターゲッティ ング部分（一般に遅い）と毒素（静脈投与された場合一般に速く、長命の代謝産 物を伴って約５分以下の半減期である）の薬物動態学の分離及びリガンド−アン チリガンド対の高親和性相互作用の組み合わせがこの改良に関係する。毒素活性 薬剤が、それ自身は一般に迅速にクリアーされない場合（典型的には肝臓経路を 介して）、そのうよな活性薬剤を含有する抱合体は、比較的速い、好ましくは腎 臓クリアランスを付与するように構成される。リガンドまたはアンチリガンドを 有する毒素の誘導体化は、毒素活性薬剤の生体分布を向け直すには不十分であろ う。代わりに、活性薬剤は低いが治療効果的投与量で投与される。この場合、毒 素活性薬剤のレシピエントの非ターゲット組織は毒素活性薬剤に対して長期間曝 されることがない。 シュウドモナス菌体外毒素(PE)やトリコテセンのような毒素分子は、肝臓中で 代謝される。その結果、肝臓毒性はPEの投与に関係する。また、IL-2やTNF のよ うな抗腫瘍薬剤の投与は肝臓毒性を生じることが示されている。そのような生体 分布パターンのよって特徴付けられる活性薬剤は、２つの方法で、本発明の２段 階または３段階プレターゲティングプロトコルに適応させることができる。 活性薬剤−リガンドまたは活性薬剤−アンチリガンドの低投与量を与える。相 補的アンチリガンドに対するリガンドの高親和性のため、ターゲット部位へのタ ーゲッティング部分の付着の間の活性薬剤−ターゲッティング部分結合の必要性 なしに、治療効果的投与量が腫瘍にデリバリーされる。活性薬剤−リガンドまた は活性薬剤−アンチリガンドは、一般にレシピエントの肝臓で処理される。レシ ピエントに対する活性薬剤の投与量が低いこと及びレシピエント内での活性薬剤 の循環時間が減少すること（活性薬剤循環半減期は一般にターゲッティング部分 の最大ターゲット部位付着時間より短い）により、治療効果的投与量は、非ター ゲット部位にデリバリーされる毒性レベルが収拾不可能になることなく、ターゲ ット部位にデリバリーされる。そのレシピエント（患者）の状況及び治療経過に 照らして投与量を選択する医者の付添いのもとで、ナノグラムからマイクログラ ムの範囲の活性薬剤の投与量がこの方法では投与される。 代わりに、活性薬剤は本発明の生体分布が腎臓に向けられるのに十分な大きさ の高分子分子とカップリングさせることもできる。適当な高分子分子は好ましく は約５０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。約５０００ダ ルトン未満のポリマーは、大型の活性薬剤の生体分布に向けられない。５０，０ ００ダルトンを超えるポリマーは肝臓で代謝されやすい。本発明のこの態様に有 用なポリマーの例は、デキストラン、ポリリシン、ポリグリタメート、特定の大 きさ（例えば、約５〜約５０kD）のオリゴサッカライド等を含む。例えば、デキ ストランをリガンドまたはアンチリガンドとカップリングさせる方法は以下の実 施例に記載されている。 活性薬剤−ポリマー−リガンドまたはアンチリガンド抱合体は高い活性薬剤投 与量で投与できる。何故なら、そのような抱合体は迅速な腎臓クリアランスを示 すからである。その結果、レシピエントの非ターゲット組織は、活性薬剤がター ゲット部位に結合するか、または腎臓排出により処理されるまでのほんの短い間 だけ活性薬剤に曝される。その結果、約マイクログラムから約ミリグラム(10-6 〜10-3M)の範囲の活性薬剤の投与量を本方法では投与できる。 実験的薬剤、例えばメルカプトプリン、N-メチルホルムアミド、2-アミノ-1,3 ,4-チアジアゾール、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、硝酸ガリウム、3% チミジン、ジクロロメトトレキセート、ミトグアゾン、スラミン、ブロモデオキ シウリジン、ヨードデオキシウリジン、セムスチン、1-(2-クロロエチル)-3-(2, 6-ジオキソ-3-ピペリジル)-1-ニトロソウレア、N,N'-ヘキサメチレン-ビス-アセ タミド、アザシチジン、ジブロモダルシトール、エルウィニアアスパラギナーゼ 、イホスファミド、2-メルカプトエタンスルホネート、テニポシド、タキソール 、3-デアザウリジン、可溶性ベーカーアンチフォル、ホモハリントニン、シクロ シチジン、アシビシン、ICRF-187、スピロムスチン、レバミソール、クロロゾト シン、アジリジニルベンゾキノン、スピロゲルマニウム、アクラルビシン、ペン トスタチン、PALA、カルボプラチン、アムサクリン、カラセミド、イプロプラチ ン、ミソニダゾール、ジヒドロ-5-アザシチジン、4'-デオキシ-ドキソルビシン 、メノガリル、リン酸トリシリビン、ファザラビン、チアゾフリン、テロキシロ ン、エチオホス、N-(2-ヒドロキシエチル)-2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-アセタ ミド、ミトキサントロン、アコダゾール、アモナフィド、リン酸フルダラビン、 ピベンジモール、ジデムニンＢ、メルバロン、ジヒドロレンペロン、フラボン-8 -酢酸、オキサントラゾール、イポメアノール、トリメトレキセート、デオキシ スペルグアリン、エチノマイシン及びジデオキシシチジン等も好ましい(NCI Inv estigational Drugs, Pharmaceutical Data 1987，NIH Publication No.88-2141 ,Revised November 1987 参照)。 本発明に有用な放射性核種としては、ガンマ-エミッタ、ポジトロン-エミッタ 、オージェ電子-エミッタ、X-線エミッタ及び蛍光-エミッタがあり、治療用には ベータ-エミッタ及びアルファ-エミッタが好ましい。放射性核種は当業界で公知 であり、123I、125I、130I、131I、133I、135I、47Sc、72As、72Se、90Y、88Y、97 Ru、100Pd、101mRh、119Sb、128Ba、197Hg、211At、212Bi、153Sm、169Eu、21 2 Pb、109Pd、111In、67Ga、68Ga、67Cu、75Br、76Br、77Br、99mTc、11C、13N、15 O、166Ho及び18Fがある。好ましい治療 用放射性核種としては188Re、186Re、203Pb、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu、67Cu 、90Y、125I、131I、77Br、211At、97Ru、105Rh、198Au、166Ho及び199Agまたは177 Luがある。 他の抗腫瘍剤、例えば細胞増殖の抑制活性をもつ薬剤も本発明に従って投与し 得る。抗腫瘍剤の例としては、インターロイキン類（例えば、IL-2、IL-4、IL-6 、IL-12 等）、形質転換成長因子β、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、インター フェロン類（例えば、GM-CSF、M-CSF等）、血管浸透性因子のようなシトキン類 及びその他の部分、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチンのようなレクチ ン炎症応答促進剤（セレクチン類）、CIq 及びNKのようなタンパク質性部分並び に同様の分子がある。 また、適当な抗腫瘍剤は、血管形成誘導を阻害し、その結果、腫瘍細胞の転移 を阻害する化合物を含む。そのような部分の例は、プロタミン及び血小板因子４ （米国特許第5,284,827号に記載）を含む。これらの化合物は糖尿病性網膜症、 水晶体後部線維増殖症、神経血管緑内障、乾癬、線維血管腫、免疫者及び非免疫 者炎症、毛細血管腫、カポジ肉腫のような血管形成誘導(angiogenic)機能不全に 関係する疾患の治療にも有用である。 本発明で使用される適当なリガンドとしては、ビオチン、ハプテン類、レクチ ン類、エピトープ、dsDNAフラグメント、酵素阻害物質及びその類似体及び誘導 体がある。有用な相補的アンチリガンドとしては、アビジン（対ビオチン）、糖 質（対レクチン類）、及び抗体及びそのフラグメントまたは模倣体を含むその類 似体（対ハプテン類及びエピトープ）、ジンクフィンガータンパク質（対dsDNA フラグメント）並びに酵素（対酵素阻害物質）がある。リガンドとアンチリガン ドとは少なくとも約kD≧109Mの親和性で互いに結合するのが好ましい。 好ましい２段階プレターゲティングプロトコルで投与される１つの成分は、タ ーゲティング部分-アンチリガンドまたはターゲティング部分-リガンドの抱合体 である。３段階プレターゲティングで投与される好ましい成分はターゲティング 部分-リガンド抱合体である。本発明のこれらの実施態様で有用な好ましいター ゲティング部分はモノクローナル抗体である。しかしながら、タンパク質-タン パク質結合は、高分子量の架橋種のような望ましくない副生物の形成に起因す る問題を含む。ビオチン化抗体とストレプトアビジンとの反応を含む非共有結合 的合成方法はかなりの副生物を形成することが報告されている。また、ストレプ トアビジンの４つのビオチン結合部位の少なくとも１つは抗体とストレプトアビ ジンとの結合に使用されるが、残りの結合部位はストレプトアビジン-抗体抱合 体の立体配置によって立体的に妨害されるのでビオチン結合のために使用するこ とはできない。 従って、抗体-ストレプトアビジンの共有結合により抱合することが好ましい が、高分子量の副生物がしばしば生成される。架橋及び凝塊形成の程度は、ヘテ ロ二官能架橋試薬を用いるタンパク質誘導化レベルなどの複数の要因に左右され る。Sheldon et al.，Appl．Radiat．Isot．43:1399-1402，1992は、共有結合し たチオエーテル抱合体を、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘ キサン-1-カルボキシレート(SMCC)誘導化抗体とイミノチオラン誘導化ストレプ トアビジンとの反応によって製造する方法を記載している。 ストレプトアビジン-タンパク質ターゲティング部分抱合体は、好ましくは実 施例XIに後述するように調製され、この調製は、SMCC誘導化ストレプトアビジン の調製と、DTT還元タンパク質ターゲティング部分の調製と、このように調製さ れた２つの部分の抱合と、架橋(抗体-ストレプトアビジン-抗体)及び凝集した種 からのモノ置換及び/またはジ置換(ストレプトアビジン置換)抱合体の精製とか らなる段階を含む。好ましくは精製した分画を、HPLCサイズ排除、SDS-PAGE、免 疫反応性、ビオチン結合能力及びin vivo検査等のいずれか１つ以上を用いてさ らに特性決定する。 または、本発明の実施に有用なチオエーテル抱合体は、SPDP、イミノチオラン 、SATAのような他のチオール化剤またはm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシ スクシンイミドエステル、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾ エートのような他のチオ反応性ヘテロ二官能架橋剤を用いて形成され得る。 本発明のストレプトアビジン-タンパク質ターゲティング部分抱合体はまた、 １つのタンパク質のリシンイプシロンアミノ基と他のタンパク質のマレイミド誘 導化形との抱合によって形成され得る。例えば、リシンイプシロンアミノ基は、 例えばタンパク質をSMCCによって処理することによって調製されたタンパク質マ レイミドとpH8〜10で反応し、共有結合した安定なアミン共有結合抱合体を生成 する。また、１つのタンパク質のリシンイプシロンアミノ基と他のタンパク質の アルデヒド官能基との反応によって抱合体を調製してもよい。得られたイミン結 合を還元して対応する安定なアミン結合を生成し得る。アルデヒド官能基は、例 えばタンパク質糖残基の酸化またはアルデヒド含有ヘテロ二官能架橋剤との反応 によって得られる。 ストレプトアビジン-ターゲティング部分抱合体の別の形成方法では、固定化 イミノビオチンをSMCC誘導化ストレプトアビジンと結合させる。この抱合/精製 方法では、ストレプトアビジンに対する(固定化)イミノビオチンの結合が可逆性 であることを利用して、未反応のターゲティング部分から抱合体を容易に分離し 得る。低pH及び高イオン強度の条件下、例えばNH2OAc，pH4（50mM）と0.5MのNaC lとの存在下でイミノビオチン結合を逆転させ得る。 例えば、ストレプトアビジンの場合、以下の手順で抱合/精製を行う。 −ストレプトアビジンのSMCC誘導体を好ましくはカラム形態の固定化イミノビ オチン(Pierce Chemical Co.，St．Louis，Missouri)に結合させる、 −(ストレプトアビジンに対して)モル過剰量のDTT還元抗体(好ましくは還元剤 非含有)を、窒素パージしリン酸塩緩衝したSMCC-ストレプトアビジン結合イミノ ビオチンカラムに添加する(DTT還元抗体は結合したSMCC-ストレプトアビジンを 飽和させ、カラムを通過した朱結合の還元抗体は再使用できる)、 −カラムを洗浄して余剰の抗体を除去する、 −pHを低下させイオン強度を増加させるバッファーをカラムに添加して、スト レプトアビジン-抗体抱合体を純粋な形態で溶出させる。 上述のように、ターゲティング部分が介在するリガンド-アンチリガンドプレ ターゲティングでは、ターゲティング基-リガンドまたはターゲティング基-アン チリガンドを標的組織に局在させる。血行中のターゲティング部分含有抱合体の レベルが十分に低い値になり最適なターゲット対非ターゲット抱合体比が達成さ れる前に、ターゲット組織への取込みがピークに達することがしばしば生じる。 この問題を解決するためには、２つの方法が有効である。第１の方法では、ター ゲッティング部分含有抱合体を「天然の」即ち内因性クリアランスメカニズムに よって血液からクリアする。この方法は、タンパク質の全身性クリアランスの多 様性及び内因性リガンドまたはアンチリガンドによって複雑化する。例えば、内 因性ビオチンが、ストレプトアビジン-ターゲッティング部分抱合体上のビオチ ン結合部位の保存を妨害し得る。 ターゲッティング部分-リガンド主たはターゲッティング部分-アンチリガンド の抱合体ターゲット対血液比を改善する第２の方法では、相補的アンチリガンド またはリガンドを構成または含有する分子と抱合体とのin vivo複合体形成を介 して抱合体を血行から「追放する」。例えば、ビオチン化抗体をリガンド-ター ゲッティング部分抱合体として使用する場合、アビジンは循環中のビオチン化抗 体との複合体形成によって比較的大きい凝集種を形成し、この凝集種がRES取込 みによって血液から速やかにクリアされる。例えば、米国特許第4,863,713号を 参照されたい。しかしながら、この方法に関する１つの問題は、腫瘍に結合した ビオチン化抗体がアビジンによって架橋されインターナリゼーションを受ける可 能性があることである。 アビジン-ターゲッティング部分抱合体を使用する場合、RES取込みによってク リアされる比較的大きい凝集種を形成するためにポリビオチン化トランスフェリ ンが使用される。例えば、Goodwin，J．Nucl．Med. 33(10):1816-18，1992参照 。しかしながら、ポリビオチン化トランスフェリンもまた、腫瘍に結合したアビ ジン化ターゲッティング部分を架橋させインターナリゼーションする能力を有し ている。さらに、両方の「追放」方法においても、（中程度の粒子は大粒子のよ うにRES取込みによって速やかにクリアされず)大きい凝集種よりも中間の大きさ の凝集種の存在時間が延長し、後で投与されるリガンド-活性薬剤またはアンチ リガンド-活性薬剤の血清滞留が生じる。このような血清滞留はターゲット細胞 対血液ターゲティングの比に不利な影響を与える。 本発明は、タンパク質組成及び非タンパク質組成からなるクリアリング剤を提 供する。これらは、アンチリガンド/リガンド(例えばアビジン/ビオチン)-ター ゲッティング部分(例えば抗体)抱合体のin vivo複合体形成及び血中クリアラン スのための使用を容易にするような物理的特性を有している。これらのクリアリ ング剤は、ターゲッティング部分抱合体のターゲット：血中比を改善するた めに有用である。これらのクリアリング剤の他の用途は、抗体-活性薬剤デリバ リーの方式を用いた病巣例えば凝血塊の造影または治療である。例えば、有効な 凝血防止剤は、速やかなターゲット局在化と高いターゲット：非ターゲットのタ ーゲティング比とを与える。有効なクリアリング剤を用い、本発明のプレターゲ ティングプロトコルで投与される活性薬剤は、望ましい形態でターゲット化され 、従って、肺塞栓症及び深在性静脈血栓症のような症状の造影/治療に有用であ る。 本発明の実施に有用なクリアリング剤は好ましくは、 −ターゲッティング部分-リガンド(またはアンチリガンド)抱合体との複合体 の迅速で有効なin vivo形成、 −後で投与される相補的アンチリガンドまたはリガンド含有分子と結合し得る ターゲッティング部分抱合体の速やかな血中クリアランス、 −大量のターゲッティング部分抱合体のクリアリング(または不活性化)の高い 能力、 −低い免疫原性、 の特徴のいずれか１つまたはそれ以上を有している。 好ましいクリアリング剤は、ヘキソースを主成分とするもの及びヘキソースを 主成分としないものに大別される。ヘキソースを主成分とするクリアリング剤は 、アシュウェル(Ashwell)レセプターまたは他のレセプター、例えば内皮細胞及 び/または肝臓のクッパー細胞に結合したマンノース/N-アセチルグルコサミンレ セプターもしくはマンノース6-ホスフェートレセプターによって認識される１つ またはそれ以上のヘキソース(六炭素糖部分)を含むように誘導化された分子であ る。このようなヘキソースの例としては、ガラクトース、マンノース、マンノー ス6-ホスフェート、N-アセチルグルコサミン等がある。グルコース、N-ガラクト サミン、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースのチオグリコシド並びにD-ガ ラクトシド類及びグルコシド類全般のようなアシュウェルレセプターによって認 識される他の部分も本発明の実施に使用され得る。本明細書ではガラクトースが 典型的なクリアリング剤のヘキソース誘導体である。ガラクトースチオグリコシ ドとタンパク質との抱合は、Lee et al.，“2-Imino-2-methoxyethyl 1-Thiogly cosides: New Reagents for Attaching Sugars to Proteins， “Biochemistry，15(18):3956，1976 の教示に従って行うのが好ましい。また別 の有用なガラクトースチオグリコシド抱合の方法は、Drantz et al.，“Attachm ent of Thioglycosides to Proteins: Enhancement of Liver Membrane Binding ,”Biochemistry，15(18):3963，1976 に記載されている。従って、ガラクトー スを主成分とする分子及びガラクトースを主成分としない分子について以下に記 載する。 ガラクトースを主成分とするタンパク質型クリアリング剤は、内因性露出ガラ クトース残基を有するタンパク質、またはこのようなガラクトース残基を露出さ せるかもしくは組込むように誘導化されたタンパク質を含む。露出ガラクトース 残基はそれについての特異的レセプター(アシュウェルレセプター)が媒介する肝 内細胞取り込み作用によってクリアリング剤の迅速なクリアランスを起こす。こ れらのレセプターはクリアリング剤と結合し、肝細胞内取込み作用を誘発し、リ ソソームと融合させる。レセプターは細胞表面に戻り再利用される。このクリア ランスメカニズムの特徴は、高い効率、高い能力及び速い動力学にある。 タンパク質を主成分とするガラクトース含有クリアリング剤の例は、ヒトα1 酸性糖タンパク質(オロソムコイド、分子量=41,000ダルトン、等電点=1.8〜2.7) のアシアロオロソムコイド誘導体である。アシアロオロソムコイドの迅速な血中 クリアランスはGalli et al.，J．of Nucl．Med．Allied Sci. 32(2):110-16,19 88に記載されている。 オロソムコイドをノイラミニダーゼで処理するとシアル酸残基が除去され、そ の結果としてガラクトース残基が露出する。このように誘導化された他のクリア リング剤としては、例えば、ガラクトシル化アルブミン、ガラクトシル化-IgM、 ガラクトシル化-IgG、アシアロハプトグロビン、アシアロフェツイン、アシアロ セルロプラスミン等がある。 例えばヒト血清アルブミン(HSA)は本発明のクリアリング剤中で、（ヘキソー ス）m−ヒト血清アルブミン(HSA)--（リガンド）n （nは１から約10までの範囲の整数、mは１から約25までの範囲の整数）の形態で 使用され、ヘキソースはアシュウェルレセプターによって認識される。本発明の 好ましい実施態様では、リガンドがビオチンであり、ヘキソースがガラ クトースである。より好ましくは、HSAが10〜20個のガラクトース残基及び１〜 ５個のビオチン残基によって誘導化される。さらに好ましくは、本発明のHSAク リアリング剤は、約12〜約15個のガラクトースと３個のビオチンによって誘導化 される。平均で上記整数例えばビオチン１個に対応するビオチン化レベル範囲を 各々が有するクリアリング剤分子を得るために十分な方法で、ガラクトース及び ビオチンの双方によって誘導化が行われる。例えば３個のビオチンによって誘導 化すると、実質的に全部の分子の各々が少なくとも１個のビオチン残基を有する クリアリング剤分子からなる混合物が得られる。１個のビオチンによって誘導化 すると、各分子の有意な部分がビオチン誘導化されないクリアリング剤混合物が 得られる。本明細書で使用する整数は記載したクリアリング剤の平均ビオチン化 を示す。 さらに、ヒトタンパク質、特にヒト血清タンパク質、例えばオロソムコイド及 びヒト血清アルブミン、ヒトIgG、IgG及びIgMクラスのヒト-抗抗体等を主成分と するクリアリング剤は、ヒトレシピエントの血清に投与されたときに免疫原性が 小さい。アシアロオロソムコイドを用いる別の利点は、ヒトオロソムコイドが例 えばSigma Chemical Co.，St.Louis，Missouriから市販されていることである。 ターゲットに結合した抱合体とクリアリング剤との直接的な複合体形成による 好ましくない結果を防止するために、血管外隙に拡散し難くまたターゲットに結 合した抱合体に結合し難い十分な大きさのクリアリング剤を使用する。この戦略 は単独でも有効であり、また上述のように露出ガラクトース残基が迅速な肝取込 みを起こすという認識と組合わせても有効である。このサイズ排除戦略は、ガラ クトースを主成分としない本発明のクリアリング剤の効果を高める。組合わせ（ 露出ガラクトースとサイズ）戦略は、「タンパク質型」または「ポリマー型」の ガラクトースを主成分とするクリアリング剤の効果を高める。 ガラクトースを主成分とするクリアリング剤としては、中間的な分子量(約40, 000から約200,000ダルトン)を有するガラクトシル化ビオチン化タンパク質（例 えば循環中のストレプトアビジン-ターゲティング部分抱合体を除去する）があ り、その例は、ビオチン化アシアロオロソムコイド、ガラクトシル-ビオチ ニル-ヒト血清アルブミンまたは他の免疫原性でない可溶性天然タンパク質のガ ラクトシル化ビオチン化誘導体、並びにビオチン-及びガラクトース-誘導化ポリ グルタメート、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパルテート等である。ガ ラクトシル-ビオチニル-IgMまたは-IgG(約150,000ダルトン)、並びにヒト血清ア ルブミン、IgG及びIgM分子等とガラクトース-及びビオチン-誘導化トランスフェ リンとの抱合体のようなターゲットに接近し難い特徴を有する高分子量の部分( 約200,000から約1,000,000ダルトン）も本発明のクリアリング剤として使用し得 る。中間的な分子量または高分子量(約40,000から約1,000,000ダルトンの範囲) の化学的に改変したポリマー、例えばデキストラン、ヒドロキシプロピルメタク リルアミドポリマー、ポリビニルピロリドン-ポリスチレンコポリマー、ジビニ ルエーテル-マレイン酸コポリマー、ピランコポリマーまたはPEG等のガラクトー ス-及びビオチン-誘導体も本発明の実施においてクリアリング剤として有用であ る。さらに、速やかに除去されるビオチン化リポソーム(ターゲットに接近し難 い高分子量部分をもつ)をガラクトース及びビオチンによって誘導化することに よって本発明の実施に使用されるクリアリング剤を調製してもよい。 本発明に使用し得る別のクラスのクリアリング剤は、in vivo分布量として血 管腔に閉込められる十分な極性を示す低分子(約500から約10,000ダルトンの範囲 )のガラクトース及びビオチンの誘導体である。より具体的には、この物質は高 荷電構造を示し、その結果、血管内面の脂質膜を透過して拡散し難いので血管外 隙に分布し難い。このようなクリアリング剤の例は、6,6'-[(3,3'-ジメチル[1,1 '-ビフェニル]-4,4'-ジイル)ビス(アゾ)ビス[4-アミノ-5-ヒドロキシ-1,3-ナフ タレンジスルホン酸]四ナトリウム塩のモノ-またはポリ-ビオチン-誘導体、ポリ 硫酸化デキストラン-ビオチンのモノ-またはポリ-ビオチニル-ガラクトース-誘 導体、あるいはデキストラン-ビオチンのモノ-またはポリ-ビオチニル-ガラクト ース-誘導体等である。 ガラクトース露出またはガラクトース誘導化クリアリング剤は、(1)リガンド- アンチリガンド親和性を介して対応するリガンド-またはアンチリガンド-含有抱 合体との複合体を迅速かつ有効に形成でき、(2)形成された複合体が、肺及 び脾臓等の普遍的なRES系に取込まれる凝集複合体とならずに、肝特異的分解系 であるガラクトースレセプターを介して血液からクリアされるのが好ましい。さ らに、ガラクトースに媒介される肝取込みの迅速な動力学と、リガンド-アンチ リガンド相互作用の親和性との共存によって、中間的な分子量の担体の使用が可 能であり、低分子量の担体の使用さえ可能である。 血液中に局在する(約40,000から約200,000ダルトンの範囲の)低分子量または 中間的分子量のガラクトース残基非含有部分は血管外隙と平衡し、従ってターゲ ットに結合した抱合体と直接的に結合して、ターゲットの局在化を低下させる。 さらに、RES系を介した凝集に依存するクリアランスメカニズムは大幅な化学量 論過剰量のクリアリング剤を必要とする。これに対し、本発明で使用されるガラ クトースを主成分とするクリアリング剤の場合には、血中クリアランスが速いの で平衡を防止でき、またリガンド-アンチリガンドが高親和性で結合するので少 量の化学量論量のそのようなガラクトースを主成分とするクリアリング剤を使用 するだけでよい。このようにクリアリング剤の絶対投与量を減らすことができる ので、この特徴により、ガラクトースを主成分とするクリアリング剤がターゲッ トに結合した抱合体に悪影響を及ぼす可能性も低下される。 本発明のガラクトース-またはビオチン-誘導化クリアリング剤を使用したクリ アリング剤評価実験に関しては実施例XIII及びXVIで詳述する。実施例XVIの実験 で試験した特定の本発明のクリアリング剤は、(1)アシアロオロソムコイド-ビオ チン、(2)ヒト血清アルブミンのガラクトース及びビオチン誘導体、並びに、(3) 分子量70,000ダルトンのデキストランのビオチン及びガラクトース誘導体である 。実験により、ガラクトース及びビオチンの双方を含有するようなタンパク質及 びポリマーの誘導体を合成することができ、得られた誘導体分子は循環中のスト レプトアビジン-タンパク質抱合体をレシピエントの血清から有効に除去し得る ことを示した。循環アビジン含有抱合体の血液プールのクリアと、ストレプトア ビジン含有抱合体によって認識されたターゲット部位に後で投与されたビオチン 化同位元素をデリバリーする能力とに対する効果を判定するために、ビオチン添 加量を種々に変更した。投与成分の相対用量がクリアリング剤の効果に与える効 果も試験した。 ガラクトースを主成分としないタンパク質型及びポリマー型のクリアリング剤 は、ガラクトース露出、ガラクトース誘導化等を有しない上述の物質である。こ れらのクリアリング剤は、凝集媒介RESメカニズムによって作用する。本発明の これらの実施態様において使用されるクリアリング剤は、クリアリング剤の接近 を排除すべきターゲット器官に基づいて選択される。例えば腫瘍ターゲットまた は凝血塊ターゲットが存在するときは、(約200,000ダルトンから約1,000,000ダ ルトンの範囲の)高分子量クリアリング剤を使用する。 別のクラスのクリアリング剤は、循環中のリガンドまたはアンチリガンド/タ ーゲティング部分抱合体を除去するのではなく、その代わり抱合体上の対応する アンチリガンドまたはリガンドの結合部位をブロックすることによって循環中の 抱合体を「不活性化」する物質を含む。これらの「キャップ型」クリアリング剤 は、好ましくは小さい(500〜10,000ダルトン)高電荷分子であり、血漿区画の容 積に等しい分布量(即ち、血管外隙に溢血しない量)を生じる物理的特性を示す。 代表的な「キャップ型」クリアリング剤は、6,6'-[(3,3-ジメチル[1,1'-ビフェ ニル]-4,4'-ジイル)ビス(アゾ)ビス[4-アミノ-5-ヒドロキシ-1,3-ナフタレンジ スルホン酸]四ナトリウム塩のポリ-ビオチン-誘導体、ポリ硫酸デキストラン-ビ オチンのポリ-ビオチニル-誘導体、デキストラン-ビオチンのモノ-またはポリ- ビオチニル-誘導体等である。 キャップ型クリアリング剤は、対応するアンチリガンドまたはリガンドによっ て誘導化され、次いで、リガンド/またはアンチリガンド/ターゲティング部分抱 合体を予め投与しておいたレシピエントに投与される。従って、クリアリング剤 -抱合体の結合により、循環中の抱合体が後で投与される活性薬剤-リガンド抱合 体または活性薬剤-アンチリガンド抱合体に結合する能力が低下する。循環中の 抱合体の活性薬剤に結合する能力が低下するので、ターゲットに対する活性薬剤 のデリバリー効率が増加し、長期間循環する動力学的血清タンパク質と活性薬剤 との結合が阻害されることによってターゲットに結合した活性薬剤対血行中の活 性薬剤の比が増加する。また、クリアリング剤が血漿区画に閉込められるので、 ターゲットに結合したリガンドまたはアンチリガンドに対する悪影響も防止でき る。 本発明のクリアリング剤は、一回でまたは分割して投与し得る。例えば、ビオ チン化クリアリング剤を一回で投与すると、血行中のターゲティング部分-スト レプトアビジンレベルが急激に低下し、次いで多少上昇する。その理由は、少な くともその一因として、レシピエントの生理的区画内でターゲティング部分-ス トレプトアビジンの平衡が回復するためであると推測される。従ってターゲティ ング部分-ストレプトアビジンのクリアランスを補うために２次的用量即ち追加 用量のクリアリング剤を投与してもよい。あるいは、ターゲティング部分-スト レプトアビジンを連続的にクリアするのに十分な時間にわたってクリアリング剤 を静脈内注入してもよい。 本発明の実施においては、循環中のターゲティング部分-リガンドまたは-アン チリガンド抱合体をレシピエントの循環から除去するためには、他の種類のクリ アリング剤及びクリアランスシステムも有用である。例えば、実施例IXは微粒子 を主成分とするクリアリング剤を記載している。実施例IXはまた、体外クリアラ ンスシステムも記載している。実施例IXには、動脈に挿入されたタンパク質性ま たは高分子性マルチループ装置を使用するin vivoクリアランスプロトコルも記 載している。 本発明の実施態様において、I-125、I-123、Er-165、Sb-119、Hg-197、Ru-97 、Tl-201及びI-125及びBr-77のようなオージェ電子エミッタまたは核結合薬剤を ターゲット細胞核にデリバリーする場合には即効性のクリアリング剤が有効であ る。本発明のこれらの実施態様では、ターゲット細胞表面のインターナリゼーシ ョンレセプターに局在させたターゲティング部分を利用して、ターゲティング部 分含有抱合体(即ち、好ましい２段階プロトコルではターゲティング部分-アンチ リガンド抱合体)をターゲット細胞集団にデリバリーする。このようなインター ナリゼーションレセプターとしては、EGFレセプター、トランスフェリンレセプ ター、HER2レセプター、IL-2レセプター、他のインターロイキン及びクラスター 分化抗原レセプター、ソマトスタチンレセプター、他のペプチド結合レセプター 等がある。 抱合体をターゲット細胞に局在させるために十分な時間であるが、レセプター 媒介事象(receptor-mediated event)を介した細胞によるターゲットに向けらさ れた抱合体のインターナリゼーションが誘発されるためには不十分である時間の 経過後、即効性のクリアリング剤を投与する。好ましい２段階プロトコルにおい ては、循環中のターゲティング部分含有抱合体との複合体を形成する機会がクリ アリング剤に与えられた直後に、ビオチン-オージェ電子エミッタまたはビオチ ン-核作用薬のような活性薬剤含有のリガンドまたはアンチリガンド抱合体を投 与する。クリアリング剤投与と活性薬剤投与との時間差は約24時間未満である。 このようにして、活性薬剤はターゲット細胞レセプターを介したインターナリゼ ーションによって容易にインターナリゼーションを受ける。循環中のオージェ電 子エミッタは無毒であると考えられているが、本発明のプレターゲティングプロ トコルによって実現する特異的ターゲティングは、入手し得る安定に結合できる I-123のような半減期の短いオージェ電子エミッタの効果を増強する。 治療線量または診断線量の放射線をターゲット部位に、より効率的にデリバリ ーするためには、放射性核種が腫瘍細胞表面に維持されるのが好ましい。腫瘍細 胞または肝細胞のような代謝活性型のターゲット細胞の場合には、細胞媒介代謝 性分解の結果としてターゲットに向けられた放射線の減損が生じる。 従って本発明に包含される好ましい薬剤及びプロトコルの特徴は、放射性核種 を局在させるターゲット細胞部位での放射性核種の滞留時間が延長し、このター ゲット部位に蓄積される放射線吸収線量が増加し、ターゲットされた放射能の代 謝による減損が少ないことである。本発明のこの特徴の実現に特に有効な放射性 核種は、細胞膜を通過し易く従って本質的に細胞によって保持されない化学的形 態で存在するレニウム、ヨウ素等の「+3電荷をもたない」放射性金属である。こ れに対し、+3電荷を有する放射性核種、例えばIn-111、Y-90、Lu-177及びGa-67 は高電荷密度のキレートに包囲されている結果として自然なターゲット細胞にお ける滞留を示す。 ストレプトアビジンが代謝性分解に耐性であることは証明されている。従って 放射性核種は、例えばターゲティング部分に直接結合するよりもむしろストレプ トアビジンに直接または間接に結合したほうがターゲット細胞部位に滞留する時 間が長い。ストレプトアビジンに結合した放射性核種を、プレターゲティングプ ロトコルに従って静脈内、動脈内等に投与してもよくまたは病巣に直接注入して もよい。 Abramsの米国特許第4,867,962号明細書には、活性薬剤−ターゲッティング部 分抱合体を用いて活性薬剤をターゲット部位にデリバリーする優れた方法が記載 されている。Abramsの方法は、要するにそれぞれ異なる抗体種のターゲッティン グ部分を有している２つ以上の活性薬剤−ターゲッティング部位抱合体をレシピ エントに投与しようとするものである。ここで使用する抗体種はそれぞれ異なる ターゲット部位のエピトープ（同一または異なるターゲット部位の抗原に存在す る）に対して反応性を示し、抗体種の交差反応性のパターンに重複はない。投与 する各抱合体の活性薬剤成分は、同一であっても異なっていても構わない。 このようにして、所望のターゲット部位には（抗体に結合している活性薬剤と ともに）さまざまな抗体が加算的に集積する。一方、各種の交差反応性非ターゲ ット組織には、１つの抗体種か、投与した抗体種の総数より少ない抗体種しか集 積しない。投与した活性成分は、in vivoでは非ターゲット組織よりもターゲッ ト部位により多く局在化する。診断薬としてこの方法を実施すれば、比較的少量 でターゲット部位がより明確に検出またはイメージされる（すなわち、非ターゲ ット組織の集積バックグラウンドはより拡散している）。種々の非ターゲット組 織には治療剤があまり集積しないため、望ましくない非ターゲット毒性を発現さ せることなく、投与すべき結合活性薬剤の投与量を増やすことができる。 本発明は、以下に記載する２段階または３段階のプレターゲッティング法を提 供する。 ２段階法は以下の工程を含む： 第１の交差反応性パターンを有する第１の抗体種のターゲッティング部分とリ ガンド−アンチリガンド結合対の１員を含む第１の抱合体をレシピエントに投与 する工程、 １つ以上の別のターゲッティング抱合体をレシピエントに投与する工程（ここ で用いる各抱合体は、他の抱合体や第１の抱合体の抗体種とは異なる抗体種のタ ーゲッティング部分と第１の抱合体に結合しているリガンド−アンチリガンド対 の１員を有しており、各抗体種の交差反応性パターンは他の抱合体の交差反応性 パターンや第１の交差反応性パターンと実質的に重複しない）、 レシピエントから循環する抱合体をクリアすることができるクリアリング剤を レシピエントに投与する任意の工程、あるいは、レシピエントから循環する抱合 体を実質的に除去するためのクリアリングデバイスまたはこれに代わるクリアリ ング工程を用いてレシピエントを処置する任意の工程、および、 活性薬剤と第１の抱合体のリガンド／アンチリガンド結合対の１員に相補的な １員を含む第２の抱合体をレシピエントに投与する工程を含む。 上記任意工程を行う代わりに、循環する抱合体を実質的に除去するのに十分な 時間をかけて、レシピエント生来のクリアリングメカニズムを機能させるだけで もよい。 ３段階法は以下の工程を含む： 第１の交差反応性パターンを有する第１の抗体種のターゲッティング部分とリ ガンド含む第１の抱合体をレシピエントに投与する工程、 １つ以上の別のターゲッティング抱合体をレシピエントに投与する工程（ここ で用いる各抱合体は、他の抱合体や第１の抱合体の抗体種とは異なる抗体種のタ ーゲッティング部分と第１の抱合体に結合しているリガンドを有し、各抗体種の 交差反応性パターンは他の抱合体の交差反応性パターンや第１の交差反応性パタ ーンと実質的に重複しない）、 レシピエントにアンチリガンドを投与する工程、および、 リガンドと活性薬剤を含む第２の抱合体をレシピエントに投与する工程（第１ の抱合体が先に局在化しているためターゲット部位への第２の抱合体の局在化が 増進されている） あるいは、抗体または非抗体を主成分とするターゲッティング部分を、非制御 抗原を有するターゲット部位にリガンドまたはアンチリガンドをデリバリーする ために用いてもよい。このような非制御抗原用の天然結合剤を、かかる目的に使 用するのが好ましい。例えは、肝腫瘍や骨髄腫などの疾病は、一般に非制御IL-6 レセプターによって特徴づけられる。IL-6は、このレセプターに対してこれらの ターゲット細胞型の迅速な増殖についてオートクリンまたはパラクリン部位とし て作用する。このため、これらの疾病を治療するために、本発明のプレターゲッ ティングプロトコルのターゲッティング部分としてIL-6を用いてもよい。 例えば、IL-6とストレプトアビジンを化学的手段によって抱合体にしたり、組 換え分子にしてもよい。IL-6-ストレプトアビジン抱合体をレシピエントに投与 し、抱合体のIL-6成分の働きによって抱合体をIL-6レセプターに局在化させる。 この局在化は、非制御IL-6レセプターを有する部位に特異的に起こる。ターゲッ ト部位へ局在化させた後、レシピエント内を循環する比-6−ストレプトアビジン 抱合体を実質的にクリアするために、場合によってはクリアリング剤を投与して もよい。このような目的で使用されるクリアリング剤としては、例えばIL-6レセ プター−HSA−ガラクトース、アンチ−IL-6−抗体−HSA−ガラクトースなどが適 当である。十分な時間をかけてレシピエント内を循環しているIL-6を実質的にク リアした後、活性薬剤−ビオチン抱合体を投与して、IL-6−ストレプトアビジン 抱合体によってターゲット部位に局在化させる。 本発明の上記側面の実施において、各抗体種は各々ターゲット部位に結合して いる異なるエピトープを認識するため、活性薬剤抱合体レセプターのターゲット 部位への集積（すなわち、第１の抗体種および追加のターゲッティング抗体種に 抱合しているリガンドまたはアンチリガンド）が改善される。このように異なる エピトープにアプローチするために、活性薬剤抱合体レセプターにとってより有 効なターゲット部位結合部が提供されることになる。このため、ターゲット部位 が（エピトープの飽和および／または立体障害によって）飽和するのを事実上ま たは効果的に回避してもよいし、ターゲット結合部位の障害（ターゲット部位の 表面エピトープの結合によって内部ターゲット部位エピトープの出口を狭くする ）を緩和してもよいし、活性薬剤抱合体レセプターをさらに蓄積させてもよい。 本発明のこの側面を実施する際は、活性薬剤含有抱合体が結合していてもよいア ンチリガンドまたはリガンドが高濃度で存在するターゲット部位に、リガンド− またはアンチリガンド−活性薬剤抱合体を提供する。立体条件が主として支配す るまでは、ターゲット部位の抗原濃度が高いほど、ターゲット部位への活性薬剤 量が増加する。 「交差反応性パターンが重複しない」とは、１つの抗体種が結合する非ターゲ ット組織が、他の抗体種が結合する非ターゲット組織と実質的に異なることを意 味する。交差反応性パターンは、診断目的の投与の場合はバックグランドを比例 的に減らし、治療目的の投与の場合は正常組織に対する毒性を減らすのに必要な 程度異なっていなければならない。本発明のこれらの側面を実施する際は、非タ ーゲット組織との交差反応性の重複が少ない抗体対（または多種抗体の組み合わ せ）ほど有用である。 診断または治療目的の使用のために、交差反応性が互いに重複していない２つ 以上のターゲットに特異的なモノクローナル抗体の組み合わせを選択するとき、 特定のターゲット部位に対するモノクローナル抗体の交差反応性パターンを分析 する。抗体は、さまざまな方法でスクリーンすることができる。ターゲット組織 との反応性と非ターゲット組織との交差反応性を決定するためにin vitroで行う 方法は、免疫組織化学的分析法である。抗体種が結合している組織の同定は、組 織を抗体にさらし、その組織を洗浄して非結合抗体をすべて除去し、結合抗体の 存在を検出することによって行う。この免疫組織化学的分析法には、凍結組織片 を用いるのが好ましい。それは、組織固定法を用いた場合はエピトープが破壊さ れることがあり、抗原保存性を損なうかも知れないタイミングで不定物と結合す るからである。固定後も保存できることが分かっている抗原に対しては、組織固 定法が効果的な場合もある。in vitro組織化学法は公知である（例えば、Cerian i et al.,CancerResearch,47:532-540,1987,または米国特許第4,867,962号明細 書の実施例Ｉ）。 多種のターゲッティング部分を投与する本発明のこれらの側面において、各成 分の投与量は診療する医師が自身の経験に基づいて決定するであろう。特にレシ ピエントの状態や（結合している抗原を含むターゲット部位の性質や場所が、抗 体種の選択や投与経路の決定に影響を与える）、使用する抗体種の組み合わせ（ 抗原濃度や該抗原に対する抗体の親和性によって抗体の作用が変化する）に基づ いて決定する。上記成分の有効投与量の決定法は、当業者に明らかである。 本発明は、プレターゲッティング抱合体および／または活性薬剤含有抱合体に 潜在する抗原性を低くしたり無くしたりすることによって、上述のプレターゲッ ティング法をさらに改良することをも目的とする。 この目的は、とくにプレターゲッティング抱合体または活性薬剤含有抱合体に 含まれているリガンドまたはアンチリガンド、あるいはプレターゲッティング抱 合体に含まれているターゲッティング部分を改質することによって達成される。 この改質は、グリコール部分、好ましくはポリアルキレングリコール部分、さら に好ましくはポリエチレングリコール部分を、１つ以上のアンチリガンドまたは ターゲッティング部分に結合することによって行う。 グリコール、とくにポリエチレングリコールをタンパク質などの所望の化合物 に結合させる方法は、当業界では周知である。例えば、WO94/05332号明細書には 、グリコシル化部分、好ましくは炭素数１−20のアルキレングリコールを用いて 、グリコール部分をタンパク質や核酸などの巨大分子に結合させる方法が記載さ れている。この方法は、ポリアルキレングリコールを活性化し、活性化したポリ アルキレングリコールをジアミノ化合物と反応させて、ジアミノ化合物のアミノ 基の１つを介してポリアルキレングリコールをジアミノ化合物にカップリングし 、巨大分子（例えば治療用タンパク質）を酸化して巨大分子中に存在する１つ以 上のグリコール基を活性化し、ポリアルキレングリコールをカップリングしたジ アミノ化合物を酸化されたグリコシル基と反応させ、グリコシル基を介して巨大 分子に結合しているグリコールを有するグリコール化グリコシル化巨大分子を生 成するものである。この明細書によれば、この方法によって得られる巨大分子は 、免疫反応性が低下しているが、生物活性は維持されている。この明細書には、 巨大分子としてポリペプチド、核酸、脂質などが記載され、グリコール誘導化し た巨大分子の結合力は維持されていることが記載されている。 同様に、Allen,Jr.の米国特許第5,284,934号明細書には、1,1-カルボニル−ジ イミダゾールなどのカップリング剤を用いて、ポリエチレングリコール−ヒマ(R icinius communis)凝集物Ｉ（PEG-RCAI）をポリマーに結合させることによって 、免疫調節剤または免疫抱合体として用いる糖質結合レクチン誘導体を調製する ことが記載されている。得られた抱合体は、実質的に非免疫原性であると記載さ れている。さらに、この特許明細書には、酵素やホルモンなどの巨大分子をポリ エチレングリコールに結合させて、実質的に非免疫原性の治療用抱合体を調製す ることを記載した他の文献も開示されている。これらの文献の全文を、本明細書 の一部として引用する。 PEG化することによって、免疫原性が低下して血清クリアランス性が変化した タンパク質やポリペプチドが得られることが知られている。また、PEGで修飾し たプロテクターは代謝不活性化に対して抵抗性を示すことも知られている。以下 に示す文献には、タンパク質のPEG修飾の代表例が記載されている。Wang et al. ，Cancer Res.,53、4588−4597(1993)にはキメラ毒素へのPEGの結合が記載され 、Rosenberg et al.,J.Biol.Chem.,267(32),2289-2293(1992)にはアシアロフェ ツインのPEG修飾が記載され、Somack et al.,Free Red.Res.Comms.,12-13,533-5 62(1991)には過酸ディスムターゼのPEG修飾が記載され、Malik et al.,Exp.Hema tol. ,20,1028-1035(1992)にはマクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）をPEG 修飾して生物活性を維持した誘導体を生成することが記載され、Tsutsumi et al .,Japan J.Cancer Res.,85,9-12(1994)には腫瘍壊死因子をPEG修飾することによ って抗腫瘍活性を高めた抱合体を生成することが記載されている。タンパク質を PEG修飾すると、場合によっては生物活性が低下することがある（例えば上記Wan gらの文献、上記Sumackらの文献、上記Tsutsumiらの文献の該当箇所参照）。し かしながら、結合グリコール残基の量を最適化したり、特定の結合法を採用した り、結合部位などの活性部位をPEG化の間保護しておく保護剤を使用することに よって、大抵の場合は生物活性の低下を免れたり軽減したりすることができる。 本発明では、特定のリガンド、アンチリガンド、ターゲッティング部分または活 性薬剤を、ポリエチレングリコールなどの１つ以上のグリコール残基で誘導化し てから、活性試験を行わなければならない。リガンドまたはアンチリガンドある いはターゲッティング部分の場合は、対応するアンチリガンドまたはリガンドに 対するグリコール誘導化部分の結合能をアッセイする結合アッセイ法によって活 性を決定するであろう。 典型的な実施態様では、グリコール残基で誘導化する部分はストレプトアビジ ンまたはアビジンを含むであろう。しかし、グリコールの結合、およびより詳細 にはポリエチレングリコールの結合は、プレターゲッティングプロトコルにおい て用いられる活性薬剤やターゲッティング部分と同様に、他のリガンドやアンチ リガンドの免疫原性を低下させるであろう。 この実施態様は、リガンド、アンチリガンドまたは活性薬剤が哺乳類に由来し ないものであるために、免疫反応を誘導しやすくなっていればとくに有用であろ う。しかし、PEG化は、哺乳類のタンパク質に潜在する免疫原性を低下または無 くしてしまうか、クリアランス性を変えるために行ってもよい。例えば、ポリエ チレングリコール部分をターゲッティング部分に結合することも本発明に含まれ る。その場合のターゲッティング部分として代表的なものは、哺乳類に由来する ものである。その例として、抗体、抗体フラグメントまたは誘導体、例えぱ単一 鎖抗体、Fab、(Fab)2、Fv、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体であって 、ターゲッティング部分がプレターゲット抱合体に含まれているものを挙げるこ とができる。このような誘導化によって、プレターゲティング抱合体に含まれる ターゲッティング部分に対する望ましくない免疫反応（すなわちHAMA反応）の可 能性を低下または無くせるであろう。以上の記載は診断目的で投与する場合には さほど関係がない。しかし、このような免疫反応は抱合体を所望のターゲット部 位に効率よくデリバリーするのを妨げることがあるため、治療目的でプレターゲ ティング法を実施している間に抗体反応が問題を引き起こすかも知れない。 公知のように、ポリアルキレングリコール部分などのグリコール部分を所望の 分子に共有結合させる方法が多数知られている。この方法は、タンパク質などの 巨大分子のポリアルキレン誘導化に関する上述の文献に記載されている。これら の文献は本明細書の一部として引用する。また、この方法は、Delgado et al.,B iotech Appl.Biochem ,252(11),3578-3581(1977)に記載されている。記載されて いる代表的な方法は、アミノ基が関与するアシル化反応またはアルキル化反応を 行うか、カルボニル残基か活性化（酸化）グリコシル基にこれらの部分を結合さ せるものである（WO94/05332号明細書参照）。 具体的な結合法は、特定のリガンド、アンチリガンド、ターゲッティング部分 または活性薬剤上に存在し、グリコール残基を添加して修飾する予定である官能 基の種類によって選択することになろう。グリコール残基を結合させるのに相応 しい官能基がない場合は、アミノ基、カルボキシル基、グリコシル基などの望ま しい官能基を有する化合物と反応させることによって修飾すべき特定化合物に相 応しい官能基を導入してもよい。タンパク質やポリペプチドなどの巨大分子に官 能基を導入する方法は、当業者に自明である。 本発明のこの側面の典型的な実施例は、アビジンかストレプトアビジンの一方 とポリエチレングリコール部分との抱合体に関する。ストレプトアビジンは、１ モルのタンパク質に４モルのビオチンを結合する60Kdの４価タンパク質である。 ポリエチレングリコール部分を添加しても、ストレプトアビジンまたはアビジン のビオチン結合能に実質的な影響がないのが好ましい。その影響は、採用する方 法、ポリエチレングリコール結合部位、結合したポリエチレングリコール残基の 数などの要因に依存する。 本発明の該実施態様に関係する実験例に詳述されるように、ポリエチレングリ コール部分とストレプトアビジンとの反応によって、ポリエチレングリコール部 分含有ストレプトアビジン抱合体が生成する。しかし、この抱合体の中には、ビ オチンによってストレプトアビジンを2−（4'−ヒドロキシアゾベンゼン）安息 香酸に置換するHAMAアッセイにおいて、実質的にビオチン結合能を低下させてし まうものもある。だが、この問題も、ポリエチレングリコール残基の結合前に、 ビオチン結合部位を効果的に保護しておくことによって実質的に軽減することが できる。 適当な保護剤として、特に上記の低親和性ビオチン類似体、ビオチン結合部位 に対する抗体などを例示することができる。これらの保護部分はタンパク質に悪 影響を及ぼさずに除去することができて、PEG化にも悪影響を及ぼさないもので あることが必要である。 ビオチン結合部位の保護は、低親和性ビオチン類似体などのビオチン親和性部 位に対して可逆的に結合する部分を、ストレプトアビジンやアビジンなどの特定 のタンパク質に結合することによって行うのが好ましい。 ターゲッティング部分、リガンドまたはアンチリガンド、活性薬剤がポリエチ レングリコール残基に結合しているときは、ポリエチレングリコール残基を結合 する前に、結合部位などの活性部位を保護するか、ポリエチレングリコール残基 の数を変えることが必要とされることもある。 本発明は、哺乳類レシピエント内のターゲット細胞部位における超抗原活性薬 剤の局在量を増やすことによって、炎症反応を誘導する方法も提供する。該方法 は以下の工程を含む。 ターゲット細胞部位に局在化し得るターゲッティング部分、アビジンまたはス トレプトアビジンを含む第１の抱合体をレシピエントに投与する工程、 続けて、超抗原活性薬剤とビオチンを含む第２の抱合体を投与する工程。（第 ２の抱合体の大部分は腎排出によってレシピエントから除去されるのが好ましい 。超抗原はターゲット細胞部位に局在化し、それによってレシピエントの免疫系 の炎症反応を誘導するであろう） 本発明のこの方法は、循環する第１の抱合体を肝細胞レセプターに誘導するこ とができるクリアリング剤をレシピエントに投与し、それによって循環する第１ の抱合体量を第２の抱合体投与前に減らしておく工程を含んでいてもよい。ある いは、他のクリアリングメカニズムやクリアリング剤を使用してもよい。 天然の超抗原の大部分は、実際に超抗原が誘導する炎症反応が全身を実質的に 侵さない速度で、腎経路を通して迅速に排出してもよい。天然型超抗原の大部分 が腎臓を通して排出されないか、十分な速度で排出されない場合は、超抗原また は超抗原を含む抱合体が化学的に修飾されて腎排出できるようにする。好ましく は、超抗原を１つ以上の非肝細胞レセプターを認識する糖質部分で誘導化するか 、スクシニル化してもよい。または、超抗原を１つ以上の肝細胞レセプター認識 糖質で誘導化して肝排出させるようにしてもよい。本発明を実施するために使用 する超抗原として好ましいのは、ブドウ球菌性腸毒素（staphylococcalenteroto xin）Ａである。 また、本発明は、哺乳類のレシピエント内のターゲット細胞部位に局在化する 活性薬剤量を増やす方法も提供する。この方法は以下の工程を含む。 ターゲット細胞部位に局在化し得るターゲッティング部分、アビジンまたはス トレプトアビジン、および抗原不存在下でターゲット細胞部位で炎症反応を誘導 することができる超抗原を含む第１の抱合体をレシピエントに投与する工程、 続けて、活性薬剤およびビオチンを含む第２の抱合体をレシピエントに投与す る工程。 超抗原が誘導する炎症反応によって、ターゲット細胞部位における第２の抱合 体の局在化量をより増やすか、ターゲット細胞部位において第１の抱合体または 第２の抱合体をより均一に分布させることができる。また、上述のクリアリング 工程を施してもよい。この方法は、サイトカイン、治療または診断用放射性核種 、 毒素などの適当な活性薬剤とともに実施してもよい。 あるいは、プレターゲッティングプロトコルの予備工程として、ターゲッティ ング部分−超抗原抱合体を用いるのもよい。このプレターゲッティングプロトコ ルは以下の工程を含む。 ターゲッティング部分−超抗原抱合体をレシピエントに投与する工程（抱合体 はターゲット細胞部位に結合している第１のエピトープに局在化し、超抗原はタ ーゲット細胞部位において炎症反応を誘導する）、 ターゲット細胞部位に結合した第２のエピトープに局在化し得るターゲット部 分とアビジンまたはストレプトアビジンを含む第１の抱合体をレシピエントに投 与する工程（第１のエピトープおよび第２のエピトープは同一であっても異なっ ていてもよい）、 続けて、活性薬剤とビオチンを含む第２の抱合体をレシピエントに投与する工 程（第２の抱合体の大部分はレシピエントから腎排出により除去される）。 請求の範囲に記載される発明をこの側面で実施する際に、上述のクリアリング 法のいずれかを用いて、ターゲッティング部分−超抗原、ターゲッティング部分 −アビジンまたは−ストレプトアビジン、またはその両方をクリアしてもよい。 本発明のこの実施態様において、超抗原はターゲット細胞部位で局在化した炎症 反応を誘導し、それによって、第１の抱合体と第２の抱合体のターゲット細胞部 位へのターゲッティングを強めることができる。また、本発明のこの側面は、種 々の上記活性薬剤とともに実施してもよい。 超抗原は、インターナリゼーションや抗原の存在を必要とせずに、レシピエン トにおける免疫反応を誘導し得る高免疫原性分子である。本明細書で論じる超抗 原の典型例は、ブドウ球菌性腸毒素Ａである。超抗原は異種のＴリンパ球の活性 を強く刺激することが知られている。この活性化によって、TNR、IL-1、IL-6、I FN−ガンマなどのサイトカインのウエーブが発現することもある（Miethke et a l.,Immunobiol.,189(3-4),270-284(1993)参照）。また、超抗原が、超抗原を発 現するウイルスが潜伏するＢ細胞の増殖を刺激することもある(Irwin et al.,J. Leukocyte Biol., 54(5),494-503(1993))。 インターナリゼーションや抗原の存在を必要とすることなく、レシピエント内 で免疫反応を誘導し得る高免疫原性分子（超抗原）が、本発明を実施するうえで 有用である。超抗原として、ブドウ球菌性や連鎖球菌性エキソトキシンなどのバ クテリアまたはマイコプラズマエキフプロテイン、Mycoplasma arthritidisが産 生するエキソプロテイン、乳癌ウイルスをコードしたしたMla抗原などのウィル ス性抗原などを例示することができる。この他の超抗原も、当業界で知られてい る。例えば、本明細書の一部として引用する以下の超抗原に関する論文を参照： Irwin et al.,J.Leukocyte Biol.,54(5),495-503(1993);Zumla,Clin.Infect.Dis . ,(15(2),313-320(1992)；Kotb,Current Opin.Infect.Dis.,5(3),364-374(1992) ；Johnson et al.,Proc.Soc.Biol.Med.,198(3),765-771(1991)；Webb et al.,Cu rrent Opin.Immunol., 6(3),467-475(1991)；Fleischer,Berhrin.Institute Mett eilungen., 94,104-112(1994)；Lafon,Medecine-Sciences,10(1),78-82(1994)；U chiyama et al.,Microbiol.Immunol.,38(4),245-256(1994)；Scherer et al.,An nual Rev.Cell.Blol., 9,101-128(1993)；Misfeldt,Eus-Riv Immun.Immunofarmac ol., 13(2),150-154(1993)；Licastro et al.,Int.J.Biochem.,25(6),854-852(19 93)。本発明の実施に好ましい超抗原は、ブドウ球菌性腸毒素Ａである。例えば 、本明細書の一部として引用するDohlsten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88, 9287-9291(1991)参照。 本発明の好ましい超抗原は、腎経由で大部分が排出される構造を有するか、そ のような構造を有するように分子設計されたものであるのが好ましい。または、 迅速にクリアされてターゲット細胞部位に局在化した炎症反応を行わせるもので あるのが好ましい。非末端糖質残基が存在しない天然の超抗原やこれに類する超 抗原を、本発明で用いることもできる。また、上述の原子団を有するように化学 的に修飾された超抗原を、本発明の実施に際して使用することもできる。または 、本明細書中の毒素含有活性薬剤の説明に記載されるようなスクシニル化、ポリ マー誘導化、DPTA誘導化などの上記以外の化学的修飾を超抗原に施して、超抗原 の腎排出を強めてもよい。 １つ以上の糖質残基を有するように超抗原を化学的修飾するために、ガラクト ースを用いてヒト血清アルブミンを誘導化する方法として本明細書に記載されて いるものと類似する方法を実施してもよい。 これらの分子は、レシピエント内で炎症反応を誘導する。これによって、(1) ターゲット細胞上に細胞毒性を及ぼすか、(2)ターゲット細胞部位に活性薬剤が より局在化するか（活性薬剤は超抗原自身か本明細書に記載される他の活性薬剤 の１つである）、活性薬剤のターゲット細胞部位における分布がより均一になる か、あるいはこれらの複数が誘導されることがある。 本明細書に記載されるように、毒素やその他のタンパク様部分がビオチンに抱 合するのと同様にして、ブドウ球菌性腸毒素Ａなどの超抗原をビオチンに抱合し てもよい。例えば、ビオチンの末端カルボキシ基を活性エステルに転換して、そ の活性エステルと超抗原のリジン残基のアミノ基とを反応させる。Afford et al .,Meth.Enzymol., 184:160-162(1988) に記載されるように、可逆的タンパク分 解によって好ましいモノビオチニル化を行うように設定された方法で、ビオチン を超抗原のカルボキシ末端に結合させてもよい。本明細書に記載されるように、 毒素またはその他のタンパク様部分を抱合させるのと同様にして、超抗原をアビ ジンまたはストレプトアビジンに抱合させてもよい。本発明のこの側面の態様に おいて、活性薬剤の局在化を強めるためにストレプトアビジンへ抱合させるのが 有利な場合がある。 例えば、10kDデキストラン、それよりも大きなデキストラン分子（分子量約20 −約70kD）、ポリグルタメート（分子量約５−約50kD）、スクシニル化ポリリシ ン（分子量約５−約50kD）などの親水性ポリマー、および、スクシニル化した他 の巨大修飾型ポリリシンおよび特定のオリゴ糖（すなわち、実質的に肝臓および 他の器官の取り込みに勝り、グロムラー濾過によって腎排出させるのに十分な大 きさを有し、構造が化学的に明確であるように合成したオリゴ糖）などの生体内 分布検出分子を用いて誘導化することによって、超抗原を含む抱合体を修飾して もよい。上に例示されるポリマーは腎排出によってレシピエントから除去するた め、高分子誘導化によってポリマーを含む抱合体を腎排出させることができる。 ビオチン−ポリマー−ブドウ球菌性腸毒素Ａ抱合体は、市販されているビオチ ニル化リシン誘導化デキストランポリマー（例えば、ミズリー州セントルイスの シグマケミカル社製のリシン、ビオチン−デキストランに固定しうる）を用いて 形成してもよい。リシン誘導化ビオチンの抱合は、例えば超抗原の活性化エステ ルを用いて、リシンε−アミノ基の反応によって行う。当業界で用いられている 活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロ基やフッ素含有 基などの強電子吸引基で置換されたフェノールなど）を、該目的で使用してもよ い。あるいは、例えばリシン残基と二官能性試薬であるスクシンイミジル-4-（N -マレイミドーメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）を上記ビオ チニル化条件に類する条件（例えばpH、モル比など）下で反応させることによっ て活性化した、市販ビオチニル化リシン誘導化デキストランポリマーを用いて、 ビオチン−ポリマー−ブドウ球菌性腸毒素Ａ抱合体を形成してもよい。このSMCC 誘導化デキストランポリマーには、例えば以下に示すような超抗原の遊離チオ基 と抱合し得る反応性マレイミド官能基が含まれている。 別の誘導物として（DTPA）n（ｎは約１から約２）がある。DTPAはDPTA環状無 水物などのジエチレントリアミンペンタ酢酸であって、超抗原に元来存在するカ ルボキシル基または合成により超抗原に導入したカルボキシル基を介してアミド 結合によって結合していてもよい。 本発明は、血栓症の新規治療方法と組成物を提供することをも目的とする。血 栓症は、西洋の主たる死因であり廃疾である。血栓症の主たるカテゴリーには、 急性心筋梗塞形成を引き起こす冠状動脈血栓症、発作を引き起こす脳動脈血栓症 、肺塞栓症の素因を与える深静脈血栓症がある。基礎病理学的には冠状動脈症は 血管壁のアテローム変性からなるが、臨床学的にはほとんどの心筋梗塞形成は血 栓によって引き起こされる。Collen et al,J.Pharmacol.Exp.Therapeutics,231( 1),146-152(1984)参照。 ヒト疾患の中でも血栓症は重要な疾患とされてきたために、血液の内因性フィ ブリン系を活性化する化合物を投与することによってin vivoで薬剤学的に血栓 を溶解することが40年以上行われている。血栓症の治療に用いられる化合物とし て、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化剤や、こ れらの誘導体、切断物、ハイブリッド型を例示することができる。Holvoct et a l.,Circulation,87(3),1007-1016(1993)；Holvoct et al.,Blood,81(3),696-703 (1993)；Bos et al.,Biotherapy,5(3),187-199(1992)；Verstraete,Cardiovas.D rugs.Ther., 6(2),111-124(1992)；Neblock et al.,Bioconjugate Chem.,3(2),126-131(1992)；Haber et al.,Thrombolysis:Ba sic Contrib.and Clin.Prog., XVII,357pp.(1992);DeBono et al.,Thromb.Rev.,6 1,537-545(1991)；Runge et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88(22),10337-10341( 1971)：Collen et al.,Circulation,82(5)，1744-1753(1990)；Haber et al.,Jp n.Circ.J., 54(4).345-353(1990);Dewerchin et al.,Fibrinolysis,4(1),11-18(1 990)参照。 これらの血栓治療剤の中には、血栓症治療剤として極めて有用であることが証 明されているものもある。例えば、組織プラスミノーゲン活性化剤（t-PA）は心 臓発作患者の治療のために臨床的に用いられている。t-PAは他の血栓症に対して も幾つかの利点を有する。t-PAはヒトに由来しているため、免疫反応に悪影響を 与えにくい。この点は、ストレプトキナーゼと対照的である。ストレプトキナー ゼはクロットを効率よく溶解するが、微生物に由来しているため免疫反応を仲介 することがある。また、t-PAは、ウロキナーゼやストレプトキナーゼなどの他の 血栓症治療剤に比べて作用特異性が高い。これは、ウロキナーゼ型プラスミノー ゲン活性化剤（例えばストレプトキナーゼ−ウロキナーゼ）に比べて、t-PAのフ ィブリンに対する親和性がより高いためである。Collen,Nature,301,214-221(19 83)参照。 クロット溶解剤を投与することによって心臓発作などの血栓症を治療すること は、ヒトに対して臨床的に有効であることが知られている。しかしながら、この 治療法によると望ましくない副作用が伴う。特に、クロット溶解剤はプラスミノ ーゲンの全身的活性化に関係しており、凝固蛋白質の無差別消化を招くために、 治療中に出血する危険性がかなり増す。事実、市販されているクロット溶解剤を 投与することは、たとえt-PAであっても、望ましくない副作用（例えば出血症） を伴う。 これは、t-PAなどのクロット溶解剤を投与しても、そのすべてが所望の部位（ すなわちフィブリン含有血液クロット）にデリバ−されるわけではない事実に少 なくとも一部は起因していると考えられる。したがって、循環しているプラスミ ノーゲンとフィブリンが結合しているプラスミノーゲンを無差別に活性化するこ とがある。 血栓症には、投与した治療用タンパク質の活性を中和してしまう免疫反応を仲 介することがあるという別の問題もある。上述のように、この問題は微生物に由 来するストレプトキナーゼで特に懸念される。しかしながら、t-PAなどのヒトに 由来する蛋白質であっても潜在的な懸念がある。この点について、t-PAやウロキ ナーゼの官能性誘導体やハイブリッド型が多く知られ、開発されている。これら の誘導体は、クロット溶解活性、親和性および／または安定性を増すなどの固有 の利点を有しているが、これらの誘導体は変異タンパク質であるために投与によ って望ましくない免疫反応を誘導する可能性が高くなっている。特に、特定の誘 導体を長期間使用したり、繰返し使用したりすると可能性が高くなる。 このようなクロットなどの溶解剤は、血液クロット溶解などの所望の治療効果 を仲介した後も、免疫循環系内に留まることもある。このような場合にも、投与 によって凝固タンパク質の無差別な消化を引き起こして、治療中に出血する危険 性を高めてしまう。 血栓への血栓治療剤のターゲッティングについても、文献に記載されている。 公知のターゲッティング剤として、抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体を例示する ことができる。これらは、フィブリン、架橋フィブリン、損傷内皮細胞と結合す る。また、最近、ターゲッティング剤としてアネキシンＶ（annexin-V）も開発 されている(Tait et al.,Thrombosis Rev.,75(5),491-501(1994))。 本発明は、血栓治療剤を治療目的で投与する処置を含む従来の心臓発作、発作 、再狭窄などの血栓治療が抱えている問題を軽減するものである。問題の軽減は 、血液クロットなどのターゲット部位へ効果的にデリバーされる抱合体を投与し 、場合によっては血栓治療剤の投与前後または投与中にクリアリング剤をさらに 投与して血栓治療剤を迅速にクリアすることによって達成される。特に、続いて 投与されるリガンドまたはアンチリガンド血栓治療剤抱合体を所望の部位（すな わち血液クロット）に効果的にターゲッティングさせる抱合体を、血栓治療が必 要とされる患者に投与することを含む、プレターゲッティング治療状態によって 達成される。 血栓治療剤抱合体をターゲッティングするために用いる抱合体は、ターゲット 部位（すなわち血液クロット）に結合するターゲッティング蛋白質を含むのが好 ましい。ターゲッティング蛋白質は、リガンドまたはアンチリガンドに直接また は間接的に結合している。ターゲッティング部分として、上と同じものを例示す ることができ、フィブリン、ｘ−結合フィブリン、アネキシンＶなどのアネキシ ンタンパク質を例示することができる。その他の適当なモノクローナル抗体は、 Oster et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,82,3465-3468(1985)；Peters et al.,Briti sh J.Med. ,293,1525-1527(1986)；Sum et al.,J.Nucl.Med.,27,1315-1320(1986) ；Delabrier et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,86,1036-1040(1989)に記載されてい る。適当なリガンドやアンチリガンドとして、ビオチン、ストレプトアビジン、 アビジン、S-ペプチド、S-タンパク、ヘッドアクチベーターペプチド（HAペプチ ド）、その他の上記リガンドとアンチリガンドを例示することができる。使用す る特定のリガンドまたはアンチリガンドは実質的に非毒性であって、十分な親和 性で結合対象部位に結合して、治療剤（すなわちt-PA、ウロキナーゼ、ストレプ トキナーゼ、これらの誘導体やハイブリッド型などの血栓治療剤）を含む第２の 抱合体を効果的に結合させることが唯一求められる。 アネキシンは、血栓治療剤を所望のターゲット部位（すなわち血液クロット） に誘導する典型的なターゲッティング部分である。また、アネキシンは、他の治 療または診断剤を活性化血小板を含む部位に誘導するために使用することもでき る。好ましい実施態様では、ターゲッティング部分は、活性化血小板に対するＫ ｄが10-9ＭであるアネキシンＶを含む（Thlagarajan et al.,J.Biol.Chem.,265( 29),17420-17423(1990)参照）。他の適当なターゲッティングタンパク質として 、活性化血小板に結合する抗体やその他の部分を例示することができる。 アネキシンは、一般に分子量約33-72KDの単鎖非グリコシル化タンパク質であ る。その例外として最も注目すべきものがアネキシンIIである。アネキシンは、 カルシウムイオンが介在する結合が関係する生物活性を多数有している。 研究の結果、アネキシンはミリモル濃度のカルシウム存在下でアニオン性膜脂 質と高い親和性で結合することが示されている。カルシウムの存在下では、これ らのタンパク質は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホス ファチド酸、ホスファチジリノシトールなどの負に帯電したリン脂質に対して特 に高い親和性を示す。例えば、Funakoshi et al.,Biochem.,26:5572-78(1987); Tait et al.,Biochem.,27:6268-76(1988)参照。このような負に帯電したリン脂 質は、血管の血栓（例えば、活性化ヒト血小板表面に局在化する）と結合する。 アネキシンは抗凝固作用を示す。凝固抑制は、アネキシンが負に帯電した表面 リン脂質（例えば、活性化血小板の表面に存在する）に結合することによって起 こる。この結合が、負に帯電した表面リン脂質によるクロッティング因子の活性 化を阻害すると考えられている。アネキシンは、アニオン性リン脂質を有するタ ーゲット部位に迅速に局在化する。すなわち、アネキシンは、アニオン性リン脂 質の循環量に応じて約５−30分で局在化するが、血清中にはそれよりもやや長い 時間循環し続ける（循環半減期は39分未満）。 このような性質を有するために、アネキシンや診断剤または治療剤に抱合して いるアネキシンを、ＤＶＴ（深部静脈血栓）、ＰＥ（肺塞栓症）、心筋梗塞形成 、心房細動、人工心臓血管材料に起因する問題、発作などの多くの徴候に対応し た血管血栓診断または治療用プロトコルで用いてもよい。 本発明を実施するうえで有用で好ましいアネキシンの中に、豊富なアネキシン 産生源であるヒト胎盤から1979年にBohnによって単離され、胎盤タンパク質４（ PP4）と称されたアネキシンＶがある。アネキシンＶは大腸菌内で発現する。ア ネキシンＶの全長cDNAクローンはすでに得られており、発現ベクター中でサブク ローニングされて、アネキシンＶを含む融合タンパク質の製造ができるようにな っている。アネキシンＶは４つのドメイン（アミノ酸残基約75の４つの縦列不完 全反復単位；Funakoshi et al.,Biochem.,26,8087-92,1987）からなり、各ドメ インは５つのアルファ螺旋で構成されている。アネキシンＶ分子は、側面からみ ると凸面表面に４つ以上のカルシウム結合部位を有するクラウン状をしており、 その結合部位を通してアネキシン−リン脂質相互作用が仲介される。本発明では 、この他のアネキシン分子もまた有用である。本明細書のアネキシンＶに関する 説明は、他のアネキシン分子にも一般に当てはまる。 アネキシンＶには複数のカルシウム結合部位が存在し、負に帯電したリン脂質 に結合しているアネキシンＶはカルシウムによって仲介されることから、１つ以 上の各アネキシンＶドメインを有する設計分子をプレターゲッティングイメージ ングまたは治療用プロトコルで使用してもよい。また、アネキシン分子をドメイ ン境界とは異なる位置で分配して、カルシウム介在下でアニオン性リン脂質を結 合し得る設計分子を提供してもよい。また、アニオン性リン脂質に対するアネキ シンＶの親和性を有意に害しない条件下で、アニオンＶの１つ以上のアミノ酸残 基に変化を加えてもよい。リン脂質に結合しているアネキシンの量は、Tait et al.,J.Biol.Chem.,264:7944-49(1989)に記載されるように、蛍光クエンチングに よって測定することができる。 アネキシンの中でも、アネキシンＶが、血漿および細胞外液に匹敵する条件下（ 1.2mMイオン化カルシウム、0.15Mイオン強度）で、80％のホスファチジルクロリ ンと20％のホスファチジルセリンを含有するリン脂質分泌小嚢に対して最も強い 結合親和性（Kd＜10-10M）を示す。この結合は可逆的であり、カルシウム依存性 である。 非ターゲット部位に対する結合量を減らしてクリアされる量を増すために、タ ーゲッティング部分を誘導化してクリアされるようにしてもよい。例えば、アネ キシンをヘキソースまたはヘキソースを主成分とする部分で誘導化して、クリア されるようにすることができる。例えば、アネキシンを１つ以上のヘキソース（ アシュウェル（Ashwell）レセプターまたはその他の肝臓レセプター、例えば内 皮細胞および／または肝臓のクッパー細胞に結合しているマンノース／Ｎ−アセ チルグルコサミンレセプター、もしくはマンノース−６−ホスフェートレセプタ ーによって認識される六炭素糖）を含むように誘導化してもよい。このようなヘ キソースまたはヘキソースを主成分とする部分として、ガラクトース、マンノー ス、マンノース６−ホスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、ペンタマンノシ ルホスフェートなどを例示することができる。アシュウェルレセプターによって 認識される部分として、この他にグルコース、Ｎ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチ ルガラクトサミン、ガラクトースのチオグリコシド、Ｄ−ガラクトシド類および グルコシド類全般なども、本発明を実施するうえで使用することができる。本明 細書の記載に基づいて、当業者は第１のまたは第２の抱合体のいずれかをクリア するためのクリアリング剤を設計することができる。 ガラクトースは、本明細書の目的に沿う典型的なクリアリング剤である。ガラ クトースチオグリコシドとタンパク質との抱合は、Lee et al.,“2-Imino-2-met hoxyethyl 1-Thioglycosides:New reagents for Attaching Sugars to Proteins ”,Biochemistry,15(18):3956(1976)の教示にしたがって行うのが好ましい。こ の他にも、Drantz et al.,”Attachment of Thioglycosides to Proteins:Enhan cement of Liver Membrane Binding”,Biochemistry，15(18),3963(1976)に有用 なガラクトースとチオグリコシドの抱合法が記載されている。 放射性キレートを使用するプレターゲットイメージング法にアネキシンを用い るときは、放射性核種とキレートとの複合体を形成する前か（形成前法）後に（ 形成後法）、化学的手段によってヘキソースとアネキシンとの抱合体を形成する ことができる。しかし、化学的手段によるヘキソースの抱合体形成は、キレート 抱合体形成の前に行うのが好ましい。 調製する抱合体上に存在するガラクトース残基の数は、１以上でアネキシンの ターゲットに対する結合親和性を有意に減じない数以下の範囲内にする。例えば 、ガラクトース誘導化後も、ガラクトースが元来有しているアネキシン結合活性 の20％以上を保持しているのが好ましく、50％以上を保持しているのがより好ま しい。アネキシン分子上に存在するガラクトース残基数は、理論上は最大で22で ある（アネキシン分子構造内のリシン残基の数）。放射線標識を施した本発明の アネキシン−ガラクトース抱合体は、例えば１−約５個のガラクトース残基を有 している。 本発明の実施に際して、ヘキソースクラスターを使用するのが好ましい。この とき、ｉ）クラスターのガラクトース数と、ii）ガラクトースクラスターとアネ キシン抱合体成分との距離などを考慮して検討する必要がある。ガラクトースク ラスターは、本発明の目的に沿った使用ができる典型的なヘキソースクラスター である。これについて文献には、ヒト肝細胞の表面にあるガラクトースレセプタ ーはヘテロトリマー、おそらくはビスーヘテロトリマーとして集合しており、場 合によっては各ガラクトースクラスターは３つ以上のガラクトース残基を有して いることが示唆されている。また、各トリマーのガラクトースレセプターは、互 いに15、22および25オングストローム離れている。したがって、クラスターのガ ラクトースは、25オングストローム以上離すことができる柔軟なリンカーによっ て分けられているのが好ましい。アネキシンとガラクトースクラスターとの距離 は、ガラクトースクラスターのサイズや配向に影響を与え得る、アネキシンのタ ーゲットへの結合に及ぼす立体効果を除去するのに十分であるべきである。この 距離は、約10オングストロームより大きいのが好ましい。ターゲット部分は、ビ オチンまたはその類似体に結合するのが好ましい。 プレターゲッティング剤を投与した後に、直接または間接的にリガンドまたは アンチリガンドに結合している診断剤または血栓崩壊剤（例えばt-PA、ウロキナ ーゼ、ストレプトキナーゼまたはこれらの変異体、誘導体またはハイブリッド型 ）を含む第２の抱合体を続けて投与する。該リガンドまたはアンチリガンドは、 プレターゲッティング剤に含まれるリガンドまたはアンチリガンドと結合する。 例えば、プレターゲッティング剤がビオチンを含む場合、アンチリガンドはアビ ジン、ストレプトアビジンまたはその他のビオチン結合性タンパク質であろう。 したがって、本発明のこの実施態様で使用するのに適した第２の抱合体には、t- PA−アビジン、t-PA−ストレプトアビジン、ウロキナーゼ−アビジン、ウロキナ ーゼ−ストレプトアビジンおよびストレプトキナーゼ−ストレプトアビジンなど が含まれる。 血栓崩壊剤の抱合体を投与する前にプレターゲッティング抱合体を投与すれば 、血栓崩壊剤の非特異的結合に伴う問題を実質的に軽減することができる。この ため、出血反応などの望ましくない副作用を軽減または防ぐことができる。さら に、血栓部位をターゲットするプレターゲッティング抱合体を投与することによ って、血栓のイメージング剤などの診断剤（特に放射線核種）をかなり効果的に ターゲットすることができる。 上述のように、本発明にはクリアリング剤の投与も含まれる。クリアリング剤 として、例えば上で特定したクリアリング剤であって、リガンドまたはアンチリ ガンドに直接または間接的に結合したものを例示することができる。ここにおい て、該リガンドまたはアンチリガンドは、ターゲッティング部分抱合体に含まれ るリガンドまたはアンチリガンドと結合する。例えば、血栓崩壊剤の抱合体がウ ロキナーゼ−ストレプトアビジンを含む場合は、クリアリング剤は例えばビオチ ニル化タンパク質、ビオチニル化ガラクトシル化タンパク質、１つ以上のビオチ ン残基とヘキソース残基（例えばガラクトース残基）を含む小分子のクリアリン グ剤であって、肝細胞レセプターにより特異的なクリアランスを行うものが効果 的である。 上述のプレターゲッティング剤と血栓崩壊剤の抱合体は、当業者に周知の方法 により市販されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて合成することができる。出 血などの望ましくない副作用を起こさずにクロットを効果的に溶解することがで きる、プレターゲッティング剤、血栓崩壊剤の抱合体およびクリアリング剤の投 与量は、当業者が容易に決定することができる。血栓崩壊剤の有効投与量は、血 栓崩壊剤の既知の有効投与量とほぼ同じか、それ以下であろう。本発明は血液ク ロットなどの所望の部位に血栓崩壊剤をよりよくデリバリーすることを目的とし ているため、効率を上げるために血栓崩壊剤の使用量を少なくすることもある。 クリアリング剤の投与量は、非特異的結合ターゲッティング剤の抱合体を循環 系から効果的にクリアすることができる量であるのが好ましい。 本発明は、核酸配列を所望の細胞に誘導することができないという従来法の問 題を軽減した新しい遺伝子治療法を提供することをも目的としている。とくに、 この改良法は、上述のようなターゲッティング部分（例えば抗体または抗原フラ グメント）に結合したリガンドまたはアンチリガンドを含む第１のプレターゲッ ティング抱合体を投与する工程（抱合体は処置すべき細胞上に発現する抗原に結 合する）と、それと同時かそれに続けて、第１のプレターゲッティング抱合体の リガンドまたはアンチリガンドと結合するリガンドまたはアンチリガンドに直接 または間接的に結合する核酸配列を投与する工程を含む。 遺伝子治療法には、所望の核酸配列（例えばプラスミドに含まれているもの） をターゲット細胞にデリバリーして安定に挿入する工程が含まれていなければな らない。核酸配列はターゲット細胞において安定に維持され、治療効果を奏する 。遺伝子治療法に用いる核酸配列として、治療用酵素、薬剤、サイトカイン、上 述の治療用タンパク質およびポリペプチドをコードするものを例示することがで きる。その他にも、特定の疾患条件に関与する遺伝子の発現を活性化、不活性化 または変調するために挿入する核酸配列も、遺伝子治療に使用することができる 。 例えば、特定の疾患条件下にある特定遺伝子に存在する遺伝性変異体などの遺伝 子の欠陥を正すために、遺伝子治療を利用することができる。 遺伝子治療法には、とくに癌を治療する見込みがある。そのような遺伝子治療 法は、例えばホスト免疫系を活性化する核酸配列をデリバリーして、異種細胞た る癌細胞上に発現した抗原を認識させ、それによって免疫系を活性化して腫瘍を 攻撃する工程を含む。使用する核酸配列の例として、クラス１の異色抗原をコー ドする遺伝子を挙げることができる。IL-1やIL-2などのインターロイキン、イン ターフェロン、腫瘍壊死因子などのサイトカインをコードする核酸配列を用いて 遺伝子治療を行えば、患者の癌を治療できる見込みもある。また、癌細胞に対し て細胞毒性を有する核酸配列（例えば抗腫瘍剤や細胞毒素）または必須細胞機能 を阻害する核酸配列を用いて遺伝子治療することも見込みがある。 しかし、癌を治療する見込みがあるとはいうものの、遺伝子治療には１つの重 大な欠点がある。とくに、従来の遺伝子治療法は、一般に治療すべき細胞に直接 注射することが必要とされている。癌治療の場合は、プラスミドなどの治療用核 酸配列を表面癌病巣に直接注射することを要する。 これは、表面癌に対する遺伝子治療の潜在的な効力を制限しているため不利で ある。したがって、プラスミドなどの核酸配列をターゲットして、全身注射によ って癌細胞に導入する遺伝子治療法が極めて有効である。こうすれば、遺伝子治 療を様々な癌の治療に有効に利用することができるからである。 この点を実践するために、本発明者らは、例えばプラスミドに含まれているよ うな所望の核酸配列を全身注射によって癌細胞に効果的にターゲットする方法を 開発した。この方法は、とくに以下の工程にしたがって実施することができる。 (i)ターゲットにすべき癌細胞上に発現している抗原に特異的なターゲッティン グ部分に結合しているリガンドまたはアンチリガンドを投与することを含むプレ ターゲッティング工程、および (ii)該癌細胞にデリバリーされ安定に挿入されてから核酸配列を含む活性薬剤を 投与して治療する工程（この核酸配列は、プレターゲッティング抱合体に含まれ ているリガンドまたはアンチリガンドに結合するリガンドまたはアンチリガンド とアソシエートしている）。 「アソシエート」には、核酸配列がリガンドまたはアンチリガンドに直接また は間接的に結合する場合が含まれる。または、リガンドまたはアンチリガンドに 結合するウィルス粒子やリポソームのようなデリバリー用賦形剤中に核酸配列を 被包させる間接的なアソシエートが含まれる。癌細胞へターゲットされるプラス ミドのような核酸配列は、後に特定のリガンドまたはアンチリガンドに結合して プレターゲット抱合体に特異的に結合するリポソームに被包しておくのが好まし い。 核酸配列をリポソームに被包させる方法は、当業界では周知である。この方法 は、Papahadjopoulosらが核酸やタンパク質などの生物活性材料をリポソームに 被包し、これを該生物活性材料を細胞にデリバリーするために用いることを教示 した1980年代初期に起源を有する。例えば、Papahadjopoulosらの米国特許第4,2 41,046号明細書および同第4,235,871号明細書参照。また、Szoka,Jr.らの米国特 許第4,394,448号明細書には、DNAまたはフラグメントをリポソームに被包して、 リポソームをDNAまたはフラグメントの挿入が起こるように細胞に接触させるこ とによって、該DNAまたはフラグメントを生物細胞に挿入することが教示されて いる。この方法は、所望の細胞および／または酸を細胞により効率よくターゲッ ティングするために、近年改良もされた。 例えば、ターゲットにされる細胞に選択的に結合し、それによって所望の細胞 へのデリバリー効率を上げる、リポソームとリガンドの抱合体が知られている。 特定の抗体における、リポソームと細胞ターゲッティング部分の抱合体を開示し た関連特許として、Touetらの米国特許第5,210,040号明細書、Huang,Leafの同第 4,957,735号明細書、Huang,Leafの同第4,925,661号明細書、Papahadjopoulosら の同第4,806、466号明細書、Kungらの同第4,762、915号明細書、Huangらの同4,708 ,933号明細書、Cole,Francis X.の同第4,483,921号明細書、Mylesらの同第4,480 ,041号明細書、Martinらの同第4,429,008号明細書などを挙げることができる。 ターゲットする核酸を細胞にデリバリーするのを補強するpH感受性リポソーム を調製することも知られている。例えば、Leaf,Hungらの米国特許第4,789,633号 明細書、HungらのProc.Nat'l.Acad.Scl.,USA,87,7851(1987)には、pH７未満で 細胞膜と融合して所望のDNAを導入することができるpH感受性DNA含有リポソーム が開示されている。 DNA含有リポソームをin vivoでデリバリーする方法として、さらにカチオン含 有リポソームを投与する方法もある。例えば、Sullivanの米国特許第5,227,170 号明細書には、所望のオリゴヌクレオチドを含有し、内部水相よりも容量モル濃 度が低い二価のカチオン溶液を含むリポソームにオリゴヌクレオチドを被包する ことが教示されている。また、Felgner et al.,Proc．Nat'l．Acad.Sci.，USA， 84,7413(1987)には、カチオン性リポソーム複合体が教示されている。しかし、 このカチオン性のために、リポソームは血清タンパク質と結合し、その中に含ま れているオリゴヌクレオチドを不活性化することがある。また、リポソーム−DN A複合体がオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼにさらすことになり、所望の細胞 に挿入する前に所望のオリゴヌクレオチドが劣化してしまうこともある。 近年特許になったHuang,Karl J.の米国特許第5,026,552号明細書には、肝臓の 実質細胞または非実質細胞にリポソーム被包化合物（例えばポリヌクレオチド） を選択的にデリバリーする方法が教示されている。肝臓は、とくに食作用を有し クッパー細胞によって仲介される飽和性経路と、飲作用を有し実質細胞によって 仲介される非飽和性経路の２つの既知の経路を経てリポソームを取り込む。この 方法は、直径が200nm未満で循環半減期が５時間以上であるキャリヤーリポソー ムを投与することを含む。また、例えばWeinerらの米国特許第5,049,392号明細 書に開示されるような、浸透圧依存性のリポソームが文献上で知られている。 リポソームのサイズを最適化する方法も知られている。例えば、MacDonald,Ro bert C.の米国特許第4,532,089号明細書には、巨大サイズのリポソームを調製す る方法が開示されている。また、Huntらの米国特許第4,529,561号明細書には、 所望のサイズ範囲を有するリポソームの調製法が教示されている。さらに、Host etlerらの米国特許第5,223,263号明細書には、リポ核酸含有リポソームと所望の 細胞にリポ核酸をデリバリーするためにこれを使用することが教示されている。 以上より、当業界では核酸を細胞にデリバリーする多くの方法が、 さらに、核酸配列を被包したリポソームを投与すれば、黒色腫、表面癌の治療 に有効であることが報告されている。例えば、最近のBioworld Today,Vol.4,No. 233,1および5では、クラス１移植抗原HLA-B7をコードするcDNAが修飾ラウス肉腫 ウィルスプラスミド内に挿入されると、リポソーム様の鞘に包まれ、黒色腫患者 の病巣に注入され、肺の転移を効果的に退行させ、注入部位から遠い局所皮膚小 節を溶解することが報告されている。しかし、これらの結果を考慮する限り、効 果を上げるためには癌病巣に注射することが必要である点がなお不利な点である 。 これに対して、本発明の方法はプレターゲッティング工程によって上記技術を 改良した。本発明の方法は、リガンドー（またはアンチリガンドー）ターゲッテ ィング部分抱合体を投与してターゲット部位（すなわち腫瘍細胞）にデリバリー し、核酸配列（例えばプラスミド）を含むリポソームを投与する工程を含む。こ の方法におて、リポソームは、すでにin vivo部位にプレターゲットされている 抱合体に結合するリガンドまたはアンチリガンドに結合している。 好ましい実施態様では、核酸配列を含むリポソームは、ビオチン、アビジンま たはストレプトアビジンに結合している。上述の文献に記載されているように、 当業界ではリポソームにタンパク質やその他の化合物を結合させる方法も周知で ある。最も好ましい態様は、リポソームがビオチンに結合している場合である。 これについて、プラスミドDNAを含むビオチニル化リポソームの結合はすでに報 告されており（例えばKlibanose et al.,Vetn.Akad.Med.,Nauk.SSR,8,50-54(199 0)およびKitano et al.,Biotech.Apl.Biochem.,14,192-201(1991)参照）、10-9 から10-11の範囲である。 プレターゲッティング法を用いた場合、リガンドまたはアンチリガンド（例え ばビオチン）をリポソームに結合させれば、リポソームに被包される核酸配列の 薬物速度が実質的に速くなるので好ましい。それは、ターゲット部位（すなわち 腫瘍細胞）へリポソームが効率よくデリバリーするからである。 このプレターゲッティング遺伝子治療プロトコルに用いる抱合体は、静脈注射 によって投与することができるが、全身投与であればいずれの経路でもよい。ビ オチニル化プラスミドを含むリポソーム組成物を、プレターゲットされた（リガ ンドまたはアンチリガンド）ターゲッティング部分抱合体に続けて投与するのが 好ましい。 被包したプラスミドは３キロベース以下、分子量相当で108,000以下であるの が好ましい。このサイズと分子量で、プラスミドを含むリポソームを腫瘍に効果 的に局在化し、細網組織球系（RES）に取り込ませる。このプラスミドはターゲ ット細胞にインターナリゼーションされ、そこでプラスミドに含まれている核酸 配列が発現して所望の治療効果を奏する。さらに、このプラスミドのインターナ リゼーションを補強するために、核酸を被包するリポソーム膜を、ターゲット細 胞膜と融合するように設計するか、被包されるプラスミドDNAをターゲット細胞 にインターナリザーションすることができるように浸透圧感応性にすることがで きる。 リポソームに被包された核酸配列（例えば所望の治療用ポリペプチドをコード する核酸配列を含むプラスミド）の効果的な投与量は、治療する疾患、患者の状 態、ターゲットされる特定の核酸配列および発現レベルなどのファクターに依存 する。効果投与量や投与養生法は当業者が決定しうる。 本発明は、記述した２段階または３段階プレターゲッティング治療法の効率を 、ターゲットする活性薬剤の効果を強化する「感作剤」（例えば放射性活性剤や 化学治療活性剤）を投与することによってさらに良くすることをも目的とする。 この点に関して、ある種の細胞（すなわち酸素欠乏細胞）が活性剤（例えば放 射性および化学療法活性剤）の作用に抵抗性を示すことが知られている。化学治 療養生法の中には酸素依存性のものがあるため、ある種の化学治療剤を用いた場 合にこのような抵抗性を示すものと考えられている。特に、この方法の効果を上 げるためには、活性細胞を生長させて細胞増殖させるために酸素が必要とされる ことがある。これは、用いる組成物が非活性生長細胞を効果的に殺すことができ ないためである。また、酸素欠乏細胞には蓄えられているエネルギーが少ないた め、化学治療剤を細胞膜を通して輸送する能力が低いと考える研究者もいる。当 然ではあるが、この問題が深刻であるのは、所望の細胞毒性効果を奏するために インターナリゼーションが必要とされるときだけである。 ターゲットにする部位（例えば腫瘍）に多数の酸素欠乏細胞が含まれていると きは、酸素欠乏細胞を殺すが正常細胞に悪影響を及ぼさない放射性活性剤または 化学治療活性剤を十分な量投与することが困難なことがある。この問題は、特に 形態学的に比較的多くの酸素欠乏細胞を含みやすい固体腫瘍に広く存在する問題 である。 この点について、感作剤を投与することによって、放射性または化学治療活性 剤の酸素欠乏細胞に対する効果を強化しうることが報告されている。感作剤には 、一般に特定の活性剤（例えば、酸素欠乏細胞やその他の抵抗細胞に対する放射 性材料または化学治療剤）の細胞毒性を高めることができる化合物が含まれてい る。このような感作剤は当業者に周知である。 感作剤として効果的なのは、酸素キャリアーである。しかし、それだけでは十 分な性質を有しているとはいえない。また、以下の性質の少なくとも１つを有す る化合物が好ましく、以下のすべての性質を有する化合物がさらに好ましい。 i)酸素欠乏腫瘍細胞を特徴づける密集細胞群またはその血管系に迅速に輸送さ れ得ること、 ii)哺乳動物系における滞留時間が望ましいこと（すなわち、排出による除去 、輸送または代謝による除去が速すぎず、かつ、肝臓や脾臓などの系内に過度に 蓄積しないこと）、 iii)正常細胞（euoxic cells）に対して毒性がほとんどないか全くないこと この化合物を全身投与すると、血管系を通して迅速に拡散し、肺の酸素を取り 込んで、心臓血管系内に治療に十分な時間留まり、過度に毒性を示すことなく迅 速に除去されるのが理想である。この化合物の滞留時間は、約10−12日であるの が好ましい。しかし、2−8時間といったオーダーの短い滞留時間であっても、例 えば放射性化合物をターゲット部位にデリバリーするプレターゲッティング治療 プロトコルなどの短時間治療を行う場合には十分であることもある。 本発明は、記載した治療用プレターゲッティング法の間にこれらの感作剤を投 与することを含む。また、本発明は、酸素欠乏細胞に対する細胞毒性剤の効果を 強化（感作）する化合物やその化合物を含む組成物を投与することも含む。 酸素欠乏細胞に酸素を輸送する感作物質の具体例は当業界では周知であり、例 えば1988年5月3日に特許されたYuhasらの米国特許第4,742,050号明細書に記 載されるペルフルオロ化合物やそれを含む組成物、1989年9月12日に特許されたL ong,Jr.の米国特許第4,865,836号明細書および1992年1月14日に特許されたLong, Jr.の米国特許第5,080,855号明細書に記載される臭化ペルフルオロカーボン化合 物とそれを含むエマルジョン、1989年3月2日に特許されたMcIntoshの米国特許第 4,815,446号明細書に開示されるペルフルオロカーボン化合物、1989年12月26日 に特許されたYuhasらの米国特許第4,889,525号明細書に開示されるペルフルオロ カーボン化合物およびそれを含む分散剤、Rockwell et al.,Radiotherapy and O ncology, 22,92-98(1991)およびRockwell et al.,Int.J.Radiation Oncology Bio l.Phts., 22,87-93(1992)に記載されるペルフルオロオクチルブロミドエマルジョ ンを例示することができる。このリストは、放射線治療剤および化学治療剤用の 市販感作剤の代表例である。これらの文献は本明細書の一部として引用される。 このプレターゲッティングプロトコルで使用する具体的な感作剤は、さまざま なファクターを考慮して選択する。そのようなファクターの中には、治療が放射 線療法、化学療法またはその両方のいずれを利用するか、酸素欠乏部分の性質と 位置、感作剤であるペルフルオロ化合物またはヘモグロビンの効力、正常細胞や ホスト哺乳類に対する酸素供給剤の毒性、酸素欠乏細胞域に迅速に拡散するため に十分に小さい粒径を有する分散剤と十分に安定な分散剤の形成能、哺乳類にお ける蓄積傾向を含む滞留時間、これらに類する感作技術分野で知りうる事項の検 討が含まれる。特に酸素輸送能、分散粒子のサイズや安定性、哺乳動物の滞留時 間、細胞毒性に関する感作剤選択のガイダンスは血液置換技術から得ることがで きる。 本明細書で使用する「ペルフルオロ化合物」または「ペルフルオロカーボン」 は、実質的にフッ化されているか、完全にフッ化されている材料である。これら は、周囲温度と圧力で一般に液体であるが、液体でなければならない必要はない 。本明細書において「実質的にフッ化された」とは、さらに化合物に存在する水 素原子を置換しても材料の酸素輸送能を実質的に上げることができない程度に、 化合物に存在する水素原子の大部分がフッ素原子で置換されていることを意味す る。水素原子の約80−90％以上がフッ素原子で置換されているときに、実質的に フッ化されたレベルに到達するものと考えられる。しかしながら、好ましくは約 95％以上の水素原子、さらにより好ましくは98％以上の水素原子、最も好ましく は100％の水素原子が置換されているのがよい。上述の米国特許第3,911,138号明 細書および第4,105,798号明細書によると、酸素輸送能は酸素などの気体の材料 に対する溶解性に関係している。この特許明細書によると、ペルフルオロ化材料 は、25℃、760mmHgにおいて100mlあたり酸素を10-100ml吸収する。 プレターゲッティング法に有効に用いられるペルフルオロ化合物として代表的 なものは、化学的に不活性なＣ9-18ポリサイクリック化合物（例えばビシクロ［ 3.3.1］ノナンおよびトリメチルビシクロ［3.3.1］ノナン、３−メチルビシクロ ［3.3.1］ノナンおよびトリメチルビシクロ［3.3.1］ノナン）、アダマンタンお よびアルキル（Ｃ1−Ｃ6）アダマンタン（例えば、メチルおよびジメチルアダマ ンタン、エチルおよびジエチルアダマンタン、トリメチルアダマンタン、 エチルメチルアダマンタン、エチルジメチルアダマンタンおよびトリエチルアダ マンタン、メチルジアダマンタンおよびトリメチルジアダマンタン）、メチルお よびジメチルビシクロオクタン、テトラヒドロビノール−Ｓ、ピナン、カンファ ン、デカリンおよびアルキルデカリン（例えば、１−メチルデカリン、1,4,6,9 −ジメタノデカリン、ビシクロ［4.3.2］ウンデカン、ビシクロ［5.3.0］デカン 、ビシクロ［2.2.1］オクタン、トリシクロ［5.2.1.02.6］デカン、メチルトリ シクロ［5.2.1.02.6］デカン）およびこれらの混合物のペルフルオロ化誘導体を 挙げることができる。ヘテロ原子ペルフルオロ化合物の例として、Ｆ−トリブチ ルアミン、Ｆ−トリプロピルアミンおよびＦ−Ｎ,Ｎ-ジメチルシクロヘキシルメ チルアミン、ペルフルオロエーテル（例えばＦ−２−ブチルテトラヒドロフラン 、Ｆ−２−ブチルフラン、Ｆ−ヒドロフラン、Ｆ−（2,5,8−トリメチル−3,6,9 −トリオキサ−１−ドデカノール）の1,2,2,2−テトラフルオロメチルエーテル ）、Ｆ−Ｎ−メチルデカヒドロキノリン、Ｆ−１−メチルオクタヒドロキノリジ ン、Ｆ−オクタヒドロキノリジンおよびＦＮ−シクロヘキシルピロリジンを挙げ ることができる。芳香族および脂肪族化合物の例として、Ｆ−ナフタレン、Ｆ− １−メチルナフタレン、Ｆ−ｎ−メチル−モルホリン、Ｆ−ｎ−ヘプタンおよび 1,2−ビスノニルフルオロブチルエチレンを挙げることができる。 水性媒体中にペルフルオロ化合物を均一に分散する分散剤は既知であり、例え ばノニオン性界面活性剤を含む。全身投与以外の方法（例えば局所治療）で使用 する分散剤の場合などは、フルオロ化合物を分散するためにイオン性または両性 界面活性剤を使用することができる。全身処置をする場合は化合物の生理学的受 容性（例えば等張性）に対して慎重に注意を払う必要があるため、イオン性界面 活性剤を使用するのはさほど望ましくない。もっとも、電解質またはその他の添 加剤を用いて分散剤を形成することによって、イオン性界面活性剤のイオン特性 を補ったり緩和したりすることは可能である。分散剤として適当なものは、上記 参照刊行物に記載されている。 このプレターゲッティング法において増感剤として用いる酸素輸送性ペルフル オロ化合物は、動脈、静脈、筋肉、腹腔または経口のいずれであるかに拘わらず 、哺乳類に局所投与しても全身投与してもよい。分散剤は全身投与して、ある部 位 で分散剤が肺をトラバースして酸素を取り込み、取り込んだ酸素を酸素欠乏腫瘍 細胞に輸送するのが好ましい。分散剤の投与量は、酸素欠乏部位とその性質、処 置が高圧酸素処置を補うために行うか否か、特定の組成物に対する哺乳類の全身 耐性（毒性）、セラピストに既知のその他のファクターを考慮して予め決定して おくことができる。一般に、ペルフルオロ化合物（PFC）の血中濃度（血液100ml あたりのペルフルオロ化合物のml）は約3−10％にする。場合によっては、これ より多いか少ない血中濃度で十分であったり、そのような血中濃度が必要とされ たりすることもある。高圧酸素処置やその他の一次酸素注入を補うために投与す るときは、血中濃度は3.5％未満にすることが必要である。吹き込んだ空気中の 酸素の部分圧は、100％酸素で約２気圧以下にすることができる。ほとんどの場 合は、最大限の100％酸素２気圧で30分間高圧酸素処置を行う。この条件は、耐 え得るレベル内で良好であることが知られている。しかしながら、一次酸化の時 間、内容物および圧力も、哺乳類または患者の健康状態、酸素欠乏部位、この他 の放射線または化学セラピストに自明な条件などの様々なファクターに依存する 。 ペルフルオロ化合物の分散剤を酸素欠乏細胞または血管系腫瘍細胞と接触させ て、ペルフルオロ化合物によって運搬されている酸素を腫瘍／血管系境界に輸送 することができる。換言すれば、ペルフルオロ化合物の分散剤と酸素欠乏細胞が 直接接触するのが理想ではあるが、達成するのが困難であり、現実には要求され ない。これは、腫瘍塊に常に存在する過剰な酸素が塊全体に広がって、その結果 酸素欠乏細胞に届くためである。 照射および／または化学療法を行う前に投与する増感剤の投与量も、ペルフル オロ化合物が酸素欠乏腫瘍細胞に至る速度、要求される増感の程度、心臓血管系 および酸素欠乏組織における分散剤の心臓血管内半減滞留時間などの種々の条件 によって制御される。短時間照射処置のように、心臓血管内（結成）半減期が約 2−4時間であれば受容しうる処置もある。この時間は、ペルフルオロ化合物が迅 速に酸素欠乏腫瘍細胞に移動し、その酸素を細胞に輸送する時間を示している。 これについて本発明では、粒径が極めて小さくて、その粒径をかなり長期間維持 するという優れた性質を有する分散剤を使用するのが好ましい。粒径が小さけれ ば、分散剤を血管系を迅速にトラバースして酸素欠乏部位に至らしめることがで きる。そのような例として、観察される平均粒径が0.05−0.2ミクロンであって 、数カ月から１年以上その粒径を維持するものを挙げることができる。 哺乳類の体内に吹き込む前に分散剤を酸素化しておいてもよい。酸素化してお けば、肺や動脈からの酸素輸送が予測される部位よりも、酸素欠乏部位かその近 傍に注射することができるので便利である。このような予備的酸素化は、投与前 に酸素または空気を用いて分散剤を入れた容器をフラッシュするか覆うか、ある いは投与前の分散剤に酸素または空気をバブリングするなどの方法によって行う ことができる。分散剤の投与を高圧酸素処置を補うために行う場合も、記載した 方法で予備的酸素化をすることができる。しかし、予備的酸素化を行うときには 必ず、酸素欠乏腫瘍細胞域に分散剤が至る前（分散剤を細胞に輸送する間）に酸 素をロスする可能性がある。このため、予備的酸素化は一般に好ましくない。 放射線治療の種類、適用様式および適用部位については周知であり、詳細な説 明を必要としない。しかし、生体外適用または放射線源を酸素欠乏部位かその近 傍に生体内適用することによって放射線照射を行うことができることは明らかで ある。したがって、放射線照射はＸ線、ガンマ線、中性子やそれに類するもの、 埋込型ラジウム、イリジウムまたはセシウム源を用いて行ってもよい。１日200 ラド、１週間に５日ずつ６週間行う通常の放射線治療を行うことができるが、投 与量や処置の総期間は状況の詳細に応じて調節してもよい。 本発明のプレターゲッティング法とともに増感法を行えば、細胞がサスペンジ ョン（白血病の場合など）であるか固体であるかに拘わらず、あらゆる種類の酸 素欠乏腫瘍細胞に対して効果を奏するであろう。本発明では、固体腫瘍に対して 特に効果がある。分散剤は迅速に全身に分布するため、基本的に本発明の好まし い分散剤の粒径は極めて小さくて安定であるために、本発明にしたがって実際に 酸素欠乏部位を増感してもよい。 酸素欠乏腫瘍細胞を破壊するか制御するために、化学療法を放射線療法と組み 合わせて行うことが多い。このため、本発明の増感技術を化学療法や放射線療法 と同時かあるいは後に行うことができる。二重治療を行う場合は、脳血管滞留時 間が２つの療法の実施期間を効果的にカバーするように増感剤分散剤を選択する のが一般的である。滞留時間が短い場合には、増感剤投与量を適当に増やすか調 節することができる。化学治療剤を細胞に活発に輸送し、細胞循環を制御するか 化学治療剤を増強するためには酸素が必要であるという意味で、化学治療剤は酸 素依存性であることが知られている。このため、酸素は遊離型かキャリヤーによ り供給されなければならない。ペルフルオロ化合物とその分散剤は酸素を大量に 輸送することができるため、薬物を放射線治療剤とともに形成することによるか 、あるいはその後に放射線治療剤と化学治療剤を投与することによる、酸素依存 性の薬物を用いた化学療法も有利である。メトトレキセートは化学治療薬のひと つであり、細胞に活発に輸送するためには酸素が必要であると考えられている。 ビンブラスチンとビンクリスチンは細胞循環用の酸素を必要とする薬物である。 酸素依存性ではない可能性がある化学治療薬は、本発明の増感技術と組み合わ せて投与してもよい。このような薬物の例として、アンドロゲン、エストロゲン 、アンチエストロゲン、プロゲスチン、副じんステロイド、ナイトロジェンマス タード、クロラムブシル、フェニルアラニンマスタード、シクロホスファミド、 チオ−TEPA、ブスルファン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、５−フ ルオロウラシル、シトシンアラビノシド、アドリアミシン、ダクチノムチン、ダ ウノムチン、ブレノムチン、ミトラマイシン、ミトムチン−Ｃ、BCNU、CCNU、メ チル−CCNU、DTIC、ヒドロキシウレア、シス−プラチナ（シス−プラチナ(II)ジ アミンジクロリド）、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、Ｌ−アスパラギ ナーゼなどを挙げることができる。 放射線治療剤として有用であるがラジオパクも有するこれらのフルオロ化合物 は、特に本発明にとって有用である。そのようなフルオロ化合物の例として、臭 化ペルフルオロヒドロカルボン（例えばＦ−ペルフルオロオクチルブロミド）や 臭化ペルフルオロエーテル（例えばＦ−１−ブロモブチルイソプロピルエーテル 、Ｆ−１−ブロモエチルイソプロピルエーテル、例えば米国特許第3,453,333号 明細書に記載されるその他の臭化ペルフルオロ有機エーテル）を挙げることがで きる。これらの化合物が有する放射イメージング特性によって、これらの放射線 治療剤の効果と周囲の正常細胞に対する毒性をモニタすることができる。このた め放射線治療剤として機能するのみならず、診断剤としても機能する。しかし、 ペ ルフルオロ化合物が放射性を示さない場合は、上と同様に放射線増感力をモニタ する機会を作り出すために、ペルフルオロ化合物を含有する分散剤を他の既知の ラジオパク剤を用いて形成してもよい。放射線イメージングは、通常のＸ線撮影 またはコンピューター連動断層撮影（CAT）に用いたり、より新しいNMR技術に利 用してもよい。放射線治療剤としての臭化物は、水性分散剤中かその近傍で用い ることができる。例えば、約10−90体積％の水と約0.5−10重量％の分散剤を含 む水中油または油中水エマルジョンとして用いることができる。 放射線増感と組み合わせて放射線保護を行ってもよい。放射線保護剤は、放射 線傷害から正常組織を優先的に保護するものである。放射線増感と組み合わせる 場合の目的は、放射線治療剤を放射線保護剤の非存在下で使用するときに正常組 織に生じ得る傷害を減らすことにある。スルフヒドリル含有剤は、一般に効果的 な放射線保護剤であることが知られている。その例として、Radiation-Drug Int eractions in the Treatment of Cancer（G.H.SokolとR.P.Maickel編、John Wyl ie and Sons.,Inc.),(1980)pp113-135に記載されるJ.M.Yuhas.,"On the Potenti al Application of Radioprotective Drugs in Solid Tumor Radiotherapy"で再 検討されているアミノエチルイソチウロニウムやベータメルカプトエチルアミン のホスホロチオエート誘導体を挙げることができる。この他の放射線保護剤とし て、Yuhas et al.,Cancer Clinical Trials.,(1980),3,211-216にも記載されて いるS-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチルホスホロチン酸がある。 この他の適当な増感剤の例として、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロメチ ルデカリン、ペルフルオロアルキルシクロヘキサン（アルキルの炭素数３−５） 、ペルフルオロアルキルテトラヒドロフラン（アルキルの炭素数５−７）、ペル フルオロアルキルテトラヒドロピラン（アルキルの炭素数４−６）およびペルフ ルオロアルカン（炭素数９−11）からなる群より選択される炭素数９−11の１つ 以上のペルフルオロカーボン化合物を含むフルオロカーボンエマルジョンを挙げ ることができる。これらのフルオロカーボンエマルジョンは、ペルフルオロ３級 アルキルアミン（炭素数９−11）、ペルフルオロＮ−アルキルピペリジン（アル キルの炭素数４−６）およびペルフルオロＮ−アルキルモルホリン（アルキルの 炭 素数５−７）からなる群より選択される炭素数９−11の１つ以上のペルフルオロ ３級アミンを含んでいてもよい。これらのエマルジョンは、分子量約2,000−20, 000の高分子量ノニオン性界面活性剤、リン脂質、炭素数8−22の脂肪酸からなる 群より選択される１つ以上の脂肪酸化合物、これらの生物学的に許容される塩お よびモノグリセリドをさらに含んでいてもよい。ペルフルオロ化合物と上記のペ ルフルオロ３級アミンの重量比は95−50対5−50である。 上で特定した増感剤は、腫瘍細胞などのターゲット部位に酸素をデリバーする のを補強し、それによって放射線活性化合物と化学治療剤の酸素欠乏細胞に対す る活性を強化することによって、これらの放射線活性化合物と化学治療剤の効力 を増強する。本発明は、ターゲット部位を増大した酸素濃度下にさらす別の方法 によって、プレターゲッティングプロトコルを補強することも試みている。例え ば、この方法は、細胞に酸素を直接供給することによって行うことができる。例 えば、酸素を発生する化合物（例えば過酸化水素）を投与するか、高圧酸素を導 入することによって行うことができる。この方法は、患者をプレターゲッティン グプロトコルの間に（例えば活性薬剤を含む抱合体の投与前後か投与中）高い濃 度の酸素にさらす工程を必須とする。特に、酸素欠乏細胞に酸素をデリバリーす ることができるようにプレターゲッティングする間または前後に、患者を高圧高 酸素濃度の高圧酸素チャンバーに入れる。その結果、酸素が酸素欠乏組織に拡散 し、治療用プレターゲッティングプロトコルの効果が高まる。 本発明は、光力学的治療の分野に適用することもできる。光力学的治療法は以 下の２段階からなる。 ある波長の光を吸収する光増感剤をレシピエントに局所的または全身投与し、 ターゲット部位に局在化させる工程、 ターゲット細胞を適当な波長を有する光源で照射する工程 増感剤が光を吸収すると、吸収したエネルギーを組織中に溶解している酸素分 子に移し、それによって活性酸素種を生成し、その活性酸素種が近くに存在する 生化学物質を破壊し、したがって近傍の細胞も破壊する（増感剤がターゲット細 胞に選択的に局在化しているならば、主としてターゲット細胞を破壊する）。 本発明は、以下に記載するプレターゲッティング光力学治療プロトコルを提供 する。 ２段階法は以下の工程を含む。 ターゲッティング部分とリガンド−アンチリガンド結合対の１員を含む第１の 抱合体をレシピエントに投与する工程（第１の抱合体はターゲット部位に局在化 する）、 循環する抱合体をレシピエントからクリアすることができるクリアリング剤を レシピエントに投与する任意の工程、または、循環する抱合体をレシピエントか ら実質的に除去する任意の代替的クリアランス工程、 増感剤とリガンドーアンチリガンド結合対の１員を含む第２の抱合体をレシピ エントに投与する工程（第２の抱合体の結合対の１員は第１の抱合体の結合対の １員と相補的であり、増感剤または抱合体全体はレシピエントから迅速にクリア されるように（好ましくは腎排出されるように）化学的に修飾されている）。 上記の任意のクリアリング工程の代わりに、単に十分な時間をかけてレシピエ ント生来のクリアリングメカニズムを機能させ、循環している抱合体を実質的に 除去してもよい。 ３段階法は以下の工程を含む。 ターゲッティング部分とリガンドを含む第１の抱合体をレシピエントに投与す る工程（ターゲッティング部分−リガンド抱合体はターゲット部位に局在化する ）、 レシピエントにアンチリガンドを投与する工程、 リガンドと増感剤を含む第２の抱合体をレシピエントに投与する工程（増感剤 または抱合体全体はレシピエントから迅速にクリアされるように（好ましくは腎 排出されるように）化学的に修飾されており、ターゲット部位への第２の抱合体 の局在化は第１の抱合体が先に局在化しているために増強されている） 上記の２段階および３段階光力学的治療法はともに、最終工程はレシピエント を適当な波長の光にさらす工程である。この工程は、増感剤包含抱合体を投与し た後、約２−約72時間行うのが好ましい。 あるいは、増感剤含有抱合体をクリアする追加の工程を実施してもよい。この 工程によって、増感剤の迅速なクリアランスを行ってもよい。例えば増感剤−リ ガンド抱合体を使用するときには、アンチリガンドまたはガラクトシル化アンチ リガンドを投与することによってこのクリアランス工程を行うことができる。ま た、例えば増感剤−アンチリガンド抱合体を使用するときには、リガンド−HSA −ガラクトースを投与することによってこのクリアランス工程を行うことができ る。 ターゲット細胞を破壊するためには、増感剤はターゲット細胞に選択的に取り 込まれるのが好ましい。本発明の実施において、選択的なターゲット部位への蓄 積は、プレターゲットされるアンチリガンドまたはリガンドと高い親和力で結合 するリガンドまたはアンチリガンドに増感剤抱合させることによって行う。投与 経路も、増感剤の蓄積に影響する（例えば、動脈を通して接近可能なターゲット 部位に対する動脈内投与）。 増感剤をターゲット細胞部位に一定の時間保持することも好ましい。ターゲッ ト部位での保持はターゲッティング部分により行ってもよい（ターゲッティング 部分を介して増感剤はターゲット細胞と結合している）。このとき、やがてター ゲッティング部分との結合が切れて増感剤が分離するようにすることもできる。 増感剤の分離法は、開裂しうるリンカーを用いるかこれに類する方法によるもの として、ターゲット細胞生化学によるもの（すなわち腫瘍細胞などの低pHを示す ターゲット細胞によって低pHで溶解する増感剤をより長時間保持する）、あるい は増感剤の疎水性によるものがある（疎水性が大きくなると保持が長くなる）。 レシピエントの皮膚に隣接も密接もしていないターゲット細胞を破壊すること を目的とし、本発明のプレターゲッティングプロトコルに用いる好適な増感剤も 、比較的長い波長の光を吸収する能力を有する。光の波長が長くなれば、光は組 織のより深いところまで到達することができる。このため、低波長光を吸収する 増感剤に比べて、長波長光（約600−約800nm）を吸収する増感剤は、組織のより 深いところに包埋しているターゲット部位に作用することができる。初期のころ は光力学的治療法によって皮膚癌しか治療することができなかったが、現在では 頭部、頸部、脳、肺、胃腸管および尿生殖器管の初期段階の腫瘍に適用すること ができるようになっている。 また、本発明の実施に使用する好適な増感剤は、高活性酸素種を効率よく生成 することができる。一般に、高い疎水性を示す増感剤は、疎水性の低い増感剤に 比べて、高活性酸素種をより効率よく生成することができる。このようにして効 率をよくすれば、疎水性部分の細胞膜透過性が高まる関係にあるようである。 一般的な増感剤は、600−700nm（赤色光）に強い吸収バンドを有するポルフィ リン誘導体である。ポルフィリン化合物に化学的修飾を施して、光力学的治療プ ロトコルにおけるこれらの化合物の作用を増強してもよい。アルミニウムまたは 亜鉛とキレートを形成している合成ポルフィリンであるフタロシアニン（例えば 、クロロアルミニウムスルホン化フタロシアニン）は、ターゲット細胞を効果的 に破壊する。ポルフィリンのエーテル／エステル誘導体であるフォトフリンIIは 、光力学的治療において現在最もよく使用されている増感剤である。他の増感剤 の例として、クロリン（例えばクロリンｅ６、錫クロリンｅ６、バクテリオクロ リンＡ、バクテリオクロロフィリン、モノ−およびジ−Ｌ−アスパルチルクロリ ンｅ６など）、ポルフィリンジエーテル（例えばジーイソブチルエーテルおよび ジヘキシルエーテル）、パープリン（例えばNT2）、ベンゾポルフィリン誘導体 （例えば5,10,15,20-テトラ（ヒドロキシフェニル）ポルフィリン、テトラフェ ニルポルフィンのスルホン化誘導体（例えばTPPS2（TPPS4の誘導体であってスル ホネート基を４つではなく２つ有するもの）およびTPPS4（5,10,15,20−テトラ （４−スルホナト−フェニル）−21H,23H,ポルフィン））を挙げることができる 。一般に、これらの例示増感剤は、抱合化の際に有用なカルボキシレート基を有 する。 適当なスペクトル特性を有していれば、増感剤の活性化のためにいかなる光源 を用いてもよい。種々のレーザー光が増感剤の活性化に使用される。レーザーを ファイバーオプチックスケーブルにつなげて、エネルギーをロスすることなくレ シピエントに正確に光をデリバリーすることができる。その他に、化学発光も高 強度の光を局所にデリバリーするために使用することができる。 さらに、レシピエントが通常の生活中に遭遇する光源（例えば直射日光）も、 増感剤に活性酸素分子を生成させることができる。これは、通常の光力学的治療 法のひとつの制約である。増感剤の半減期は長く、通常は約２カ月以下である。 新しいベンゾポルフィリン誘導体のクリアランス期間は、約１週間である。いず れにせよ、増感剤がクリアされる際に非ターゲット組織毒性を回避するために、 適当な時間レシピエントは直射日光を避けなければならない。 本発明の増感剤とその増感剤を使用する方法を利用することによって、増感剤 をターゲット細胞に特異的に蓄積し、レシピエントが直射日光を避ける必要を無 くすことができるようになった。逆に言えば、本発明の増感剤とプロトコルを使 用すれば、レシピエントは日光浴ができる利点を享受できる。 増感剤蓄積の動力学によってターゲッティング分子がターゲット部位にゆっく りと蓄積されて行くのを断ち、増感剤抱合体を迅速に捕獲するために高親和性の リガンド−アンチリガンド系を利用することによって、活性剤を迅速かつ特異的 にターゲット部位に蓄積することができる。増感剤の循環半減期が長いとレシピ エントにとってこの方法はいくぶん不便なものとなる。増感剤に化学的修飾を施 して、レシピエントから迅速に排出されるようにすれば、このような不便はなく なる。増感剤を含む抱合体が迅速に排出（好ましくは腎排出）されれば、増感剤 投与後数時間以内にレシピエントは通常の活動をすることができるようになる。 このとき、レシピエントの系内に留まっている増感剤は実質的にすべてのターゲ ット部位に局在化している。次に、指定の光源をターゲットに照射した後、本質 的に直ちに非ターゲット毒性の危険性を実質的に軽減しながら活性酸素を生成す るのに適した波長の周囲光源にレシピエントをさらす。 増感剤はリガンドまたはアンチリガンドと公知の技術によって結合させてもよ い。例えば、以下に記載するポルフィリンビオチニル化を行うこともできる。ポ ルフィリン誘導体のカルボン酸官能性は、ヒドロキシ−ベンズトリアゾールとの 反応によって活性化される。ビオシチンまたはビオシチン類似体をポルフィリン ベンズトリアゾール活性エステルと反応させる。このときのビオシチン：ポルフ ィリンのモル比は約２−約４にする。このようにして誘導化したポルフィリンは 、ポルフィリン１分子あたり１−３分子のビオチンを有する。ビオチン抱合体は 、プロナーセ消化ビオチニル化ポルフィリンを使用する（μ−ヒドロキシベンゼ ン）安息香酸（HABA）置換アッセイ法によって評価することができる。Journal of Biological Chemistry, 94:23C-24C,1965参照。 本発明の化学修飾を行うことによって、増感剤を含む抱合体の迅速な排出が可 能になる。このような修飾によって、増感剤を含む抱合体が腎排出されるように するのも好ましい。適当な化学修飾は、増感剤に行ってもよいし、増感剤を含む 抱合体に行ってもよい。増感剤を含む抱合体は、以下に記載されるアニオン形成 剤によって処理してもよい。 有用なアニオン形成剤の例として、無水物および／または１つ以上のCOOH基を 有する化合物、例えば無水琥珀酸、その他の環状酸無水物、フタル酸無水物、マ レイン酸無水物、カルボキシル基で置換したＮ−エチルマレイミド、脂肪族系無 水物（例えば無水酢酸）、芳香族系無水物、pH-可逆性無水物（例えばシトラコ ン酸無水物、ジメチルマレイン酸無水物）、アルファハロ酸（例えばブロモアセ テート、ヨードアセテート）、チャージ修飾する分子の官能基と反応する官能基 で置換した二酸または三酸を挙げることができる。 例えば、無水琥珀酸をDMSOまたは他の乾燥有機溶媒中に濃度40mg/200μlで溶 解し、この溶液（または2.5ml以下に無水DMSOを用いて希釈したもの，1.73x10-2 M）を例えば蛋白質（例えば抗体、抗体フラグメント、リガンド、アンチリガン ドまたはこれらの成分の１つ以上を含む抱合体）溶液（例えば炭酸塩／重炭酸塩 緩衝液中3-5mg/ml,pH8.5-9.0）に、無水琥珀酸:タンパク質のモル比1:5,1:10ま たは1:25で添加した。室温で反応を15-30分行って、反応完了後に琥珀酸を限外 濾過法またはゲル濾過法によって除去した。等電点電気泳動法によって、等電点 の移動の程度を決定した。 チャージ修飾したリガンドとチャージ修飾したアンチリガンドの、リガンド／ アンチリガンド対の相補的な１員に対する結合能は、リガンド／アンチリガンド 結合親和力を試験する既知の方法によって試験する。 例えば、増感剤を含む抱合体は、生体内分布誘導分子で誘導化することによっ て修飾してもよい。生体内分布誘導分子の例として、親水性ポリマー、例えば10 kDデキストラン、より大きなデキストラン分子（分子量約20−約70kD）、ポリグ ルタメート（分子量約５−約50kD）、スクシニル化ポリリシン（分子量約５−約 50kD）、所定のオリゴ糖（すなわち、化学構造が明確で、乾燥や他の器官による 取り込みに実質的に勝る程度の十分なサイズを有する合成オリゴ糖であって、グ ロムラー濾過によって腎排出することを可能にするもの）を挙げることができ る。上述のようなポリマーは腎排出によってレシピエントから除去されるため、 ポリマーによる誘導体によってポリマーを含む抱合体の腎排出を可能にすること ができる。 ビオチオン−ポリマーポルフィリン抱合体を、市販のビオチニル化リシン誘導 化デキストランポリマー（例えばミズリー州セントルイスのSigma Chemical Co. 製ビオチン−デキストラン、リシンに固定可能）を用いて形成してもよい。リシ ン誘導化ビオチンは、リシンのε−アミノ基と例えば上記ポルフィリンのベンズ トリアゾール活性化エステルとの反応によって抱合させる。本分野では、この目 的のために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロ基やフッ素含有基などの強 電子吸引基で置換したフェノール類などのその他の活性エステルを使用すること ができる。あるいは、ビオチン−ポリマー−ポルフィリン／クロリン抱合体は、 リシン残基と二官能性試薬であるスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）との反応によって活性化し た市販のビオチニル化リシン誘導化デキストランポリマーを使用して、上記ポル フィリンビオチニル化と同様の条件下（例えばpH、モル比などの条件）で形成す ることができる。このSMCC誘導化デキストランポリマーには、例えば5,10,15,20 -テトラー（４−ヒドロキシフェニル）ポルフィンのチオ類似体と抱合体を形成 しうる反応性マレイミド官能基が含まれている。このポルフィンは、対応するｐ −ヒドロキシフェニルポルフィンから当分野で既知の合成法を用いて調製した。 別の誘導物として（DTPA）n(nは約1から約2)がある。DTPAはDTPA環状無水物な どのジエチレントリアミンペンタ酢酸であって、増感剤に元来存在するカルボキ シル基または合成によって増感剤に導入したカルボキシル基を介してアミド結合 によって結合していてもよい。 別の誘導物として、5,10,15,20−テトラ−（4-ヒドロキシフェニル）ポルフィ ンのヒドラジン類似体がある。これは、対応するｐ−ヒドロキシフェニルポルフ ィンからｐ−クロロフェニルポルフィン中間体を介して通常の合成法を用いて調 製する。過ヨウ素酸塩で酸化しビオチニル化したデキストランには、ヒドラジン 類似体と抱合するための反応性アルデヒド官能基が存在する。 本発明の工程では持続放出性の投与形態を採用して、増感剤をプレターゲッテ ィング法によってターゲット細胞にデリバリーすることもできる。この方法によ れば、増感剤の治療効果を長期間持続させることができる。リガンドまたはアン チリガンド誘導化リポソームをこの目的で使用することもできる。例えば、Hawr otらの米国特許第4,948,590号明細書では、ストレプトアビジニル化リポソーム とその中に活性薬剤を被包することが論じられている。 あるいは、クリアリング剤の使用に関する実施例IXに記載されるように、ミク ロ微粒子またはナノ微粒子状のポリマー粒子の投与形態を採用することができる 。この微粒子投与形態は活性剤を被包し、多くのリガンドまたはアンチリガンド 分子を結合している。この方法によれば、活性薬剤はターゲット部位にリガンド −アンチリガンド結合を介してデリバリーされ、活性薬剤はその部位で長時間放 出されて治療効果を持続させる。 概して、本発明の微粒子状投与形態を調製する方法は、ポリマーをホモジネー トした炭化水素溶媒中に溶解して、活性薬剤溶液（好ましくは水溶液）をその中 に分散し、ハロゲン化炭化水素溶媒用であってポリマー用ではない溶媒として作 用する添加剤を加える工程を含む。ポリマーハロゲン化炭化水素溶液からポリマ ーが、活性薬剤含有溶液の液滴上に沈殿して、活性薬剤をエントラップする。活 性薬剤は、本発明の持続放出性投与形態内に実質的に均一に分散しているのが好 ましい。微粒子形成後、洗浄して有機溶媒を用いて硬化する。水洗して、水性ノ ニオン性界面活性剤で洗浄し、室温で減圧乾燥する。 生体適合性のため、活性薬剤がマトリックス内に分散している点に特徴がある 微粒子状投与形態は、包装、貯蔵または投与前に殺菌する。殺菌は、いずれの簡 便な方法で行ってもよい。例えば、微粒子にガンマ線を照射することができる。 ただし、ガンマ線を照射することによって治療剤−ポリマーマトリックス内に分 散した活性薬剤やそれに結合したリガンドまたはアンチリガンドの構造や機能に 悪影響が及ばないという条件を満たしていなければならない。活性薬剤、リガン ドまたはアンチリガンドに悪影響が及ぶときには、微粒子状投与形態は無菌状態 で調製することができる。 活性薬剤は、拡散と微粒子マトリックスの侵食の両方によって、本発明の特定 の投与形態から放出される。生分解速度は活性薬剤放出の動力学に直接影響を及 ぼす。組成物または持続放出性投与形態の構造を変えることによって、生分解速 度を調節することができる。例えば、Tice et al.,"Biodegradable Controlled- Release Parenteral Systems",Pharmaceutical Technology,pp26-35,1984に記載 されるように、本発明の好ましい投与形態におけるラクチド／グリコリド比を変 更すること；Kent et al.,"Microencapsulation of Water Soluble Active Poly peptides"米国特許第4,675,189号明細書に記載されるように、クエン酸や炭酸ナ トリウムのようなポリマー加水分解調節剤を含ませることによって変更すること ；ラクチド／グリコリドポリマー中の活性薬剤ロードを変更すること（生分解速 度は含まれている活性薬剤の量に反比例する）；コアロードを変更するために異 なる効力を示す一般的な活性薬剤類の適当な類似体を適切に選択すること；Beck et al.,"Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisteron Microcapsules:An In jectable Biodegradable Contraceptive"，Biol.Reprod.,28:186-195(1983)など に記載されるように粒径を変えることによって、生分解速度を調節できる。これ らの生分解速度調節方法はすべてポリマー含有マトリックスの極限粘度数に影響 を及ぼすものであり、これによってマトリックスの加水分解速度が変わる。 ラクチド／グリコリド構造は、哺乳動物の生理的環境に適合しうるものである のが好ましい。また、上記の好ましい持続放出性投与形態は、生分解して乳酸と グリコール酸を形成するが、これらは両方とも哺乳類の一般的な代謝生成物であ る。 微粒子に結合しているリガンドまたはアンチリガンドに必要とされる官能基は 、非分解性または生分解性ポリマーユニットとともに微粒子構造中に含まれてい てもよい。この目的のために利用しうる官能基として、カルボキシル基、アミノ 基、スルフヒドリル基などのリガンドまたはアンチリガンドと反応しうるものを 例示することができる。好ましい（ラクチドーグリコリド）ポリマー含有マトリ ックスなどに存在する末端カルボキシル基を、好ましい官能基の例として挙げる ことができる。 これらの持続放出性投与形態は、本発明を実施する際に有用な他の活性薬剤 （例えば毒素、化学治療剤、サイトカインなど）にとっても有用である。 光増感剤の効力を上げ、バイスタンダー細胞を処置するために利用しうる戦略 として、上記の他に、ビオチンまたはビオチン−生体内分布誘導分子と光増感剤 の間に開裂可能なリンカーを使用する方法がある。開裂可能なリンカーを使用し て不安定性を制御することによって、より疎水性の光増感剤を使用することがで きるようになるという利点がある。強い疎水性を示す光増感剤は、適当な波長の 光を照射したときに大きな細胞殺傷力を示すであろう。光増感剤を含む抱合体を 迅速にターゲッティングしてクリアするために、生理的条件下で数時間の安定な 半減期を示し（例えば約３−約12時間）、実際的な棚持ち（例えば約３カ月−約 ２年）をする開裂可能なリンカーを使用することができる。このような開裂可能 なリンカーの例として、ジスルフィド結合、カルボキシル化エステル結合、例え ばシス−アコニテート、ヒドラジド結合などを挙げることができる。例えばHerm an et al.,Bioconjugate Chemistry.,4:402-405(1993)には、チオ特異的反応基 を有する合成デキストリン誘導体が記載されている。このようなデキストリン誘 導体を、開裂可能なジスルフィド結合を有する抱合体の形成に使用することがで きる。ヒドラジン結合した抱合体は、PNAS,87:4217-4221(1990)に記載される方 法にしたがって形成することができる。 一価抗体フラグメント−アンチリガンドまたはリガンド抱合体は本発明のプレ ターゲティンプロトコルにおいて使用できる。例えば、一価抗体フラグメント- ストレプトアビジン抱合体は、ストレプトアビジンをプレターゲットするために 、好ましくは本発明の２段階法のさらに別の実施態様において、使用することが できる。これらの実施態様で使用し得る一価抗体フラグメントの例は、Fv、Fab 、Fab'等である。約25kD(Fv)から約50kD(Fab，Fab')の範囲の分子量を典型的に 示す一価抗体フラグメントは、完全抗体よりも小さく、従ってターゲット部位に 浸透する能力は概して大きい。さらに一価結合の結果としてターゲット表面にお ける結合キャリアの拘束が少ないので(二価抗体を使用した場合、二価抗体はタ ーゲット細胞部位に強力に結合し接着するので、二価抗体がさらに浸透してター ゲット組織の下層に出ることを妨害する障壁が形成される)、ターゲティングの 均質性が改善される。 さらに、分子は小さいほど速やかにレシピエントからクリアされるので、小さ い分子の抱合体は投与されたときの免疫原性が小さい。一価フラグメント抱合体 は完全抗体抱合体に比較して投与量のうちのターゲットに局在化する割合は少な い。しかしながら、一価フラグメント抱合体は免疫原性が小さいので、より多い 量を初期用量として投与し得る。 リガンドに関しては、多価部分の投与が好ましい。この基はまた、１つまたは 複数の放射性核種と結合している。その結果、多価部分は(抱合体の架橋または 凝集を介して)循環中のアンチリガンド含有抱合体のクリアリング剤として機能 し、またターゲットに結合した抱合体と結合することによって治療薬として機能 する。上述の架橋によって生じるインターナリゼーションと対照的に、腫瘍細胞 表面で生じた架橋は、一価フラグメント-アンチリガンド分子を安定させ、従っ てターゲット細胞での適正な抗原密度条件下でターゲット滞留を増強する。さら に、一価抗体フラグメントは概して、二価抗体フラグメントまたは完全抗体ほど インターナリゼーションを受けない。一価抗体はインターナリゼーションを受け 難いので、一価基による架橋が可能であり、また結合した一価抗体が多点結合に よって安定し得る。本発明のこの２段階プロトコルによれは、フラグメントの免 疫原性が小さいので、例えばストレプトアビジン含有抱合体の投与量を増加でき 、 より自在な用量決定が可能である。また、クリアランスと治療薬デリバリーとを 同時に行うので別個に制御されるクリアリング段階が不要である。 ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンリガンド−アンチリ ガンド対が関与する２段階及び３段階プレターゲティングプロトコルにおける潜 在的な困難は、内因性ビオチンの存在である。ビオチンはビタミンＨとしても知 られ、哺乳類レシピエント中に内因性レベルで存在する。例えば、マウスは内因 性ビオチンの高いレベルを有し、約マイクログラムから約ナノグラム濃度(10-6 〜10-9M)の範囲である。うさぎや犬のような大型の哺乳類、うさギの内因性ビオ チンより低いレベルを示し、約低ナノグラム〜約高ナノグラム濃度(10-9〜10-11 M)の範囲である。ヒトはより低い内因性ビオチンレベルを示し、約低ピコグラム 〜約高ピコグラム濃度（10-12〜10-14M）の範囲である。内因性ビオチンレベル が日常の飲食物のような要因や経口抗生物質による腸管壁バクテリアの抑制によ り影響され、内因性ビオチンレベルの変化は各哺乳類種内でも観察される。 本発明の２段階及び３段階プレターゲティングプロトコルは内因性ビオチンに 係わらず実施できるが、内因性ビオチンまたはその影響を減少させる方法も有用 である。内因性ビオチンの影響を減少させる１つの方法はターゲッティング部分 −ストレプトアビジンまたは−アビジン抱合体の高投与量じ内因性ビオチンを覆 うことである。より詳しくは、内因性ビオチン及び十分なターゲット部位エピト ープの両方に実質的に結合するに十分な量の抱合体を投与してレシピエントの診 断または治療の利益を得る。適切な抱合体投与量の同定において、個々のレシピ エントのそれぞれの内因性ビオチンレベルを決定し、それに応じて抱合体投与量 を選択する。代わりに、適切な抱合体投与量はレシピエント種についての平均内 因性ビオチン値に基づくこともできる。 他の方法は、レシピエントの内因性ビオチンの実質的に全てに結合するに十分 なアビジン量で前処置することを含む。この方法では、好ましくはターゲッティ ング部分−ストレプトアビジン投与の約５分〜約３０分前に、アビジンは静脈内 に丸薬として投与され、次いでゆっくり点滴をする（例えば、生理食塩水または ＰＢＳ中のアビジン）。代わりに、好ましくは静脈投与より早めにかつ高い投与 量で、アビジンは経口投与（例えば、生卵白身として）される。さらに他の代替 法は、好ましくは静脈投与より早めにかつ高い投与量で、アビジンは浣腸により （生理食塩水中のアビジン）高投与量で投与される。 静脈内投与された薬剤は経口または浣腸経路で投与された薬剤より速やかに生 体利用可能（バイオアベイラブル）になり、そのため一般に静脈内投与された薬 剤は経口または浣腸経路で投与された薬剤よりより高い毒性となる。また、経口 または浣腸経路で投与された薬剤の吸収、分配、動力学及び代謝は、一般に静脈 内投与された薬剤より遅く、それにより、一般に経口または浣腸経路については より高投与量が必要である。 また、レシピエントは２段階及び３段階プレターゲティングプロトコルを行う 前に、ビオチンを含まない規定食を取ることもできる。例えば、プレターゲティ ングプロトコルのマウスレシピエントはプレターゲティングプロトコルの始まる 前約２〜３日間ビオチンを含まない規定食を取ることができる。うさぎや犬のよ うな、より大型の哺乳類は、抱合体のプレターゲティングプロトコルの第１の抱 合体投与前約３〜７日間ビオチンを含まない規定食を取ることができる。ヒトレ シピエントはプレターゲティングプロトコルの開始前約１〜２週間ビオチンを含 まない規定食（例えば、卵、ナッツ、ピーナッツバター、チョコレート、キャン ディー、イースト、穀物食、腎臓や肝臓のような臓器肉、肉、肉製品、マッシュ ルーム、バナナ、グレープフルーツ、すいか、苺、豆及び豆果のようなビオチン の飲食源を避ける）を取ることができる。この方法で、レシピエントの内因性ビ オチンレベルは減少し、それにより、プレターゲティングプロトコルにおける内 因性ビオチンの悪影響を削減できる。 内因性ピオチンに関する代替法は、経口非吸収性抗生物質の使用である。ほと んどのヒト内因性ビオチンは、消化管フローラ(flora)（例えば、大腸菌などの ようなバクテリア）により生成される。可能性のある抗生物質は、消化管フロー ラを破壊することが知られているものである。そのうよな抗生物質は経口投与さ れ、腸管から吸収されず、そのためレシピエントに非毒性である。適当な抗生物 質のその他の特徴は以下の通りである。ビオチンを生成する微生物の１つ以上の 種の成長及び／又は生存のアンタゴニストであること、低投与量で効果的である こと等である。そのような抗生物質の例は、アンピシリン、クロラムフフェニコ ール、エリスルマイシン、オキサシリン、ナフシリン、オキシテトラサイクリン 、ペニシリン-G、ペニシリン-V、テトラサイクリン、ノボビシリン、コリスチン 、クロルテトラサイクリンなどである。消化管フローラにより生成されるビオチ ンレベルを一時的に下げるには、ゲンタマイシン、ポリミキシン-B、バンコマイ シンのような経口非吸収性抗生物質をプレターゲティングプロトコルの開始前約 ７〜10日間投与できる。 前記方法の組み合わせも本発明の実施に使用できる。上記方法の全てが２段階 プレターゲティングと組み合わせて使用できる。 本発明のプレターゲティング方法の別の実施態様では、リガンド-またはアン チリガンド-活性薬剤の投与経路が関与する。本発明のこれらの実施態様では、 ターゲット含有組織に対する供給動脈を利用して活性薬剤-リガンド(例えば放射 性標識ビオチン)または-アンチリガンドを動脈内投与する。例えば放射性標識ビ オチンの場合、アビジン-ビオチン相互作用によって高い抽出効率が得られるの で、放射能の比活性レベルが高いならば、極めて高いレベルの放射能をターゲッ ト細胞に容易にデリバリーできる。従って、デリバリーされる放射能の量の上限 は、ターゲットにおけるビオチン結合能力(即ち、ターゲットでの抗体の量及び 該抗体に結合したアビジンの当量)である。 本発明のプレターゲティング方法のこれらの実施態様においては、元素変換プ ロセスから生じる(非放射性担体形態が存在しない)治療用核種放出粒子が好まし い。放射性核種の例は、Y-90、Re-188、At-211、Bi-212等である。リアクターか ら産生される他の放射性核種も、治療有効量の放射線をターゲットにデリバリー する量を結合できるならば本発明のこれらの実施態様の実施に有用である。放射 線の治療有効量は、核医学の実務者に公知の複数の要因にもよるが、約1500〜約 10,000cGyの範囲である。 治療的プレターゲッティング法において、本発明の活性薬剤包合体を投与する 場合、該活性薬剤含有包合体は、好ましくは、必要な治療量の活性部分が提供さ れ、ターゲット部位、例えば腫瘍に到達するが、通常の組織に対して不適当な毒 性にならない量で投与される。そのような毒性は、特定の活性薬剤が細胞障害性 薬剤、例えば放射性材料または細胞毒素である場合に、起こり得る問題である。 包含体を含有する活性薬剤の好ましい投与量及び投与領域は、特に、治療を受 ける患者の状態、治療すべき特定の疾病、活性薬剤が単独で投与されるか又は他 の治療と組み合わせて行われるか、活性薬剤のin vivo での半減期、その通常の 組織、例えば腎臓及び肝臓に対する影響のようなファクターに依存するであろう 。例えば、包合体は、単一の投薬、例えばボーラス（bolus）、複数に分かれた 投薬により投与され、または連続的に、例えば静脈内輸液により投与され得る。 適する投薬及び投薬計画は、当該分野の技術者により決定され得る。しかしな がら、いくつかの投薬計画が、一定の固有の効果を与え得ることが予想される。 例えば、分割投薬(devided dosage)の投与、例えば活性薬剤包合体の有効な投与 量を２〜５に分割した投薬が有利であり得る。そのような分割投薬は、より良好 で、より効率の良い活性薬剤、例えば放射性材料または細胞毒素のターゲット部 位へのデリバリーを可能にする。これは、いくつかの場合には、１回の投薬では 、ターゲット部位にプレターゲッティングされた包合体に含有される全てのリガ ンド又はアンチリガンド結合部位、例えばビオチン結合部位の所望の飽和を提供 するのに有効でないか、または望ましくないからである。飽和を、一回のより高 い投与量の投薬により達成することもできるが、これは、活性薬剤の通常のタイ プへの非特異結合のポテンシャルを増強し得るため不利であろう。また、これに より、循環系内の活性薬剤のレベルが高くなるため、ターゲット部位に特異的に 結合せず、通常の組織に結合して通常の組織の損傷を引き起こす危険性が高くな るであろう。 これに対して、そのような毒性は、同量の活性薬剤をより長い時間をかけて投 与するシングルユニタリー(single unitary)投与よりも、分割投薬の投与により 緩和される可能性が高い。分割投薬の使用は、非ターゲット組織の細胞毒性、例 えば肝臓または心臓の損傷の可能性を減少させる。また、活性薬剤のより効率的 なデリバリー、並びにプレターゲッティングされた包合体、例えばアビジンまた はストレプトアビジン含有包合体に含まれるリガンドまたはアンチリガンド結合 部位のより良好な飽和を可能にする。 そのような分割投薬は、所望の飽和レベル及び治療効果を達成する投薬及び投 薬計画で投与されるであろう。当然ながら、これは、ターゲッティングされる治 療包合体に含まれる特定の活性薬剤に依存する。例えば、治療有効量が５００μ ｇボーラス(bolus)である場合、分割投薬計画は、代わりに、例えば２回の２５ ０μｇ投薬、３回の１６６μｇ投薬、４回の１２５μｇ投薬、５回の１００μｇ 投薬を含むであろう。そのような投薬の間隔は、上記で列挙したファクター、特 に、例えば特定の活性薬剤、そのin vivo 半減期、クリアランス速度に依存して 変化するであろう。一般的には、約２〜12時間、好ましくは２〜８時間、より好 ましくは３〜５時間の範囲であろう。 また、輸液を介しての治療用包合体の投与も、治療プレターゲッティングプロ トコルにおいて有利であると考えられる。例えば、一定の低投与量の活性薬剤の 投与が可能になり、これにより活性薬剤のターゲット部位への望ましいデリバリ ーが提供されるが、患者の循環系に含まれる特定の活性薬剤包合体の平均濃度が より低いため、非特異的結合に対する力価(potential)は減少する。一般的に、 有効な輸液速度は、約10μg/時間〜約100μg/時間であろう。 しかし、当然ながら、これは、特定の活性薬剤、治療すべき疾病、患者の状態 、治療計画（例えば、プレターゲッティングプロトコルと組み合わせて、他の治 療を用いるか否か）等に依存するであろう。最適な輸液速度の決定は、当該分野 の技術者により行われるであろう。特に、上記分割投薬及び継続的な輸液は、放 射性材料及び他の細胞毒素、例えばY-90-DOTA-ビオチン包合体の投与を含む治療 的プレターゲッティング法に有利であろう。 動脈内投与プレターゲッティングを、サプライ動脈(supply arteries)が出入 りできる器官または組織に存在するターゲットに適用することができる。本発明 のプレターゲッティングの動脈内デリバリーアスペクトについての適用例には、 肝動脈投与による肝臓癌の治療、頸動脈投与による脳の早期癌(brain primarytu mors)及び転移の治療、気管支動脈投与による肺癌の治療、及び腎動脈投与によ る腎臓癌の治療が含まれる。動脈内投与プレターゲッティングは、下記で論じる ように化学療法薬、毒素及び抗癌活性薬剤を用いて行うことができる。力価の高 い薬物、リンホカイン、例えばIL-2及び腫瘍壊死因子、γ−インターフェロン、 薬物／リンホカイン−担体−ビオチン分子、ビオチン化薬物(biotinylated drugs)／リンホカイン、及び薬物／リンホカイン／毒素を付したビオチン誘導リ ポゾーム(toxin-loaded，biotin-derivatized liposomes)は、本発明のこの実施 態様の実施において、活性薬剤及び／またはそれらのデリバリーに有用な剤形の 例である。 放射性治療薬剤を使用する本発明の実施態様においては、ターゲッティングさ れなかった(non-targeted)薬剤の急速なクリアランスは、非ターゲット器官、例 えば骨髄の治療薬剤被爆を減少させる。従って、より高い投与量の放射線を、投 与量を制限する骨髄毒性なしに投与できる。さらに、本発明のプレターゲッティ ング法は、所望により短期投与の骨髄保護剤、例えばWR2721、並びに他の保護剤 、例えばIL-3、GM-CSF、G-CSFまたはIL-3とGM-CSFとの組み合わせの投与を含む 。その結果、より高い投与量の放射線でも、投与量を制限する骨髄毒性なしに与 え得る。 また、プレターゲッティング技術は、通常、リガンド−アンチリガンド対のメ ンバー間の高い親和性結合のため、活性薬剤がIL較的速くターゲット部位へ沈着 (accretion)することを特徴とする。例えば、活性薬剤の沈着は、活性薬剤含有 包合体の投与から約１〜８時間以内に治療的または診断的に有効なレベルに達す る。従って、好適な短い半減期を有する放射性核種を本発明のプレターゲッティ ングプロトコルに使用することができる。この方法により、非ターゲット毒性は さらに減少する。短い半減期を有する放射性核種の例には、Cu-64、Cu-67、Lu-1 77、Rh-105、I-123、I-131、Sm-153、Re-186、Re-188、Bi-212、Pb-212、At-211 、Y-90、In-111、Tc-99m等が含まれる。 上記で説明したプレターゲッティングプロトコルは、まず放射性核種診断また は治療部分(moiety)と組み合わせて記載したが、該プロトコルは、他の部分、例 えば抗癌剤、化学療法薬等のデリバリーへの使用にも適する。例えば、最も自然 に生じる及び組み換えサイトカインは、短いin vivo 半減期を有する。この特徴 は、しばしば殆ど有毒な投与量が必要となるため、これらの分子の臨床的有効性 を制限する。ヒトにおいて、投与量を制限する毒性は、例えば高い投与量のIL-2 または腫瘍壊死因子、γ−インターフェロンまたはリンホトキシンの投与に見ら れてきた。 抗癌剤、例えばIL-2及びTNF を、本発明の２段階または３段階プレターゲッテ ィングプロトコルの実施における活性薬剤として使用することもできる。いくつ かの抗癌剤は、短い循環半減期（投与後約１時間未満）を示す。例えばIL-2（約 10分間の半減期）、他のインターロイキン、TNF、インターフェロン等である。 そのような短い半減期を有する活性薬剤は、本発明のプレターゲッティングプロ トコルに使用するのに適している。 より長い半減期（投与後約２〜約１２時間の範囲）を有する抗癌剤は、好まし くは低い投与量で使用されるが、そのような部分を高い投与量で組み込んだ包合 体は、包合体、活性薬剤及びそれらの代謝物の腎臓排出への生体分布を導くため に、生体分布指向部分、例えばポリマーも組み込んでいるのが好ましい。しかし ながら、長い半減期の抗癌剤のリガンドまたはアンチリガンド誘導体化により、 包合体を高い投与量で投与することを可能にするのに充分な程度に、血清半減期 を減少させてもよい。 IL-2は、15,500ダルトンの分子量を有し、133 のアミノ酸（42% の非極性及び 58% の極性）から形成される。IL-2は、リガンドまたはアンチリガンド（例えば ビオチンまたはストレプトアビジン）との、または生体分布指向部分（例えばポ リマー）の官能基との反応のための12の遊離第一アミンを特徴とする。一つのジ スルフィドCys58-Cys105が活性に必須であると考えられる。Cys125残基はいくつ かの用途においては要求されず、誘導体化のための追加の官能基を提供すると考 えられる。IL-2の三次元結晶構造は、３オングストロームの解像度で解析されて いる。二次構造の大部分は、天然にはα螺旋である。三つのα螺旋(残基11-19； 残基33-56;及び残基107-113)がIL-2の結合及び活性に重要であると考えられる。 12の遊離アミンのうち５つが、これらの螺旋内にあり、好ましくは、IL-2の誘導 体化は、これらのアミンを介しては行われない。IL-2は、通常、モノ-S及び逆相 高圧液体クロマトグラフィー(RP)により精製される。RPの溶出条件（60% アセト ニトリル，pH 2-3）は、非常に安定であるか、または少なくともエラスティック (elastic)な分子を提案する。従って、IL-2は多くの包合技術に適すると考えら れる。 IL-2−ビオチン包合体は、ビオチンアミドカプロエート N−ヒドロキシスクシ ンイミドエステル（Sigma Chemical Co.により市販されている）を用いて形成し うる。IL-2及びビオチンアミドカプロエート N-ヒドロキシスクシンイミドエス テルの反応は、IL-2を溶液中に維持するために、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム を含有する0.1Mのホウ酸ナトリウム緩衝液,pH8.0-8.5中、室温で、0.5 時間行わ れる。IL-2の濃度が反応緩衝液中、5-10mg/ml のとき、イミデートエステルが総 反応容量の5%−10% 以下の量でDMSO中に溶解され、ビオチン:IL-2 のモル比２− ４で添加されるとき、ビオチンは、75-80 % 取り込まれる。生成した包合体は、 IL-2分子当たり1.5 −３のビオチンを含む。ビオチンの導入は、2-(4- ヒドロキ シアゾベンゼン)安息香酸を用いて評価される（プロナーゼ消化ビオチン化IL-2 を用いたHABA置換アッセー）。 ポリマー−IL-2−ビオチン包合体は、リシン残基と二官能性試薬SMCCとを上記 で説明したIL-2のビオチン化と同様の条件下（例えばモル比等）で反応させるこ とにより活性化された、市販のビオチン化リシン−誘導デキストランポリマー（ Sigma Chemical Co.）を用いて形成され得る。これにより、SMCC誘導デキストラ ンポリマーは、酢酸／リン酸塩緩衝液中pH5-7 のIL-2のシステインスルフヒドリ ル部分と包合可能な反応性マレイミド官能基を含む。 IL-2レセプターを有する細胞には、活性化されたＴ細胞、通常のＴ細胞、活性 化されたＢ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞及び胸腺細胞が含まれる。高い、中程度 の、及び低い親和性のIL-2レセプターが存在する。しかしながら、IL-2レセプタ ーの約10% のみが高い親和性（Kd約10-11M）のレセプターである。 本発明の２段階プレターゲッティングアスペクトの実施において、IL-2は下記 のようにターゲット細胞にデリバリーされ得る。 ターゲッティング部分及びリガンド−アンチリガンド結合対の一員を含む第１ の包合体がレシピエントに投与される。該第１の包合体はターゲット部位に局在 する; 所望により、循環する包合体のレシピエントからのクリアランスを導くことの できるクリアリング剤をレシピエントに投与し、または所望によりレシピエント をクリアリング装置または別のクリアリング法で処置して、循環する包合体をレ シピエントから実質的に除去する; そして IL-2のような抗癌剤及びリガンド／アンチリガンド結合対の一員を含む第２の 包合体をレシピエントに投与する。該第２の包合体結合対の一員は、第１の包合 体のものと相補的である。 上記で説明した所望によるクリアランス段階の他の例は、単に、レシピエント の本来のクリアランス機構により循環する包合体が実質的に除去されるのに充分 な時間放置することである。 活性化された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を維持するのに、及び他の形態の癌治療 のために有効なIL-2の濃度は、レシピエントに有毒であることが判明している。 IL-2の腫瘍マイクロ環境への局在化は、エフェクター細胞を、免疫原性に乏しい 腫瘍抗原に対して局所的に活性化することを可能にする。細胞毒性Ｔリンパ球系 及びＴ−ヘルパー系のエフェクター細胞は、腫瘍抗原を認識するように誘導され 、他の位置への癌の転移を捜し出すようにクローン的に(clonally)広がる。 さらに、Ｂ細胞は、腫瘍抗原を特異的に認識する抗体を分泌する。これらのＢ 細胞は、ＩｇＧ分泌細胞及び記憶細胞(memory cell)に成熟し、腫瘍抗原が他の 部位で検出されるまで広がり続ける。さらに、ナチュラルキラー細胞は、IL-2に よって活性化されるため、抗癌免疫の候補となる。Ｔ細胞及びＢ細胞を有しない がＮＫコンピテントなSCID−ベージュ(beige)マウスについての研究により、そ のようなマウスがIL-2トランスフェクト腫瘍細胞系を有効に拒絶する宿主である ことが見出された。Alosco et al.，Cancer Immunol．Immunother.，36: 364-37 2，1993参照。 腫瘍壊死因子(TNFs)は、種々の哺乳類から単離されている。例えば、ヒト、マ ウス、ウサギ、モルモットは、少なくともα及びβ型のTNF を示す。ヒトにおい ては、TNF αは、分子量が45（ゲル濾過）及び17（SDS-PAGE）であり、等電点が 5.6 であり、グリコシル化がなく、プロテアーゼ感受性であり、２個のシステイ ン残基、157 個のアミノ酸及び末端バリン残基を有する。TNF βは、分子量が65 （ゲル濾過）及び25（SDS-PAGE）であり、等電点が5.8 であり、グリコシル化が あり、プロテアーゼ抵抗性であり、システイン残基がなく、171 個のアミノ酸及 び末端ロイシン残基を有する。TNF α及びTNF βの血清半減期は、約１０〜15分 間である。 TNF α及びTNF βは、リガンドビオチン、または生体分布誘導分子の官能基と の包合のための遊離の第一アミンを示す。TNF-ビオチン包合体は、下記のように 形成され得る：ビオチンアミドカプロエートN-ヒドロキシスクシンイミデート（ 少量のDMSOに溶解）をビオチン:TNFのモル比4 -8で、TNF（0.1M 硼酸塩緩衝液に 溶解，pH8.0-8.5，タンパク質濃度0.5mg/ml）について提供する。室温で２時間 経過後、TNF が、TNF １分子有り１分子のビオチンを取り込んだことがHABAアッ セーにより確認された。 ポリマー−TNF−ビオチン包合体は、市販されているビオチン化リシン誘導デ キストランポリマー（Sigma Chemical Co.により提供されている10kD-70kD グル カンポリマー）を用い、これをN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジル- ジチオ)プ ロピオネート(SPDP)と上記のTNF のビオチン化と同様の条件下で反応させ、ピリ ジルジチオ−誘導化ポリマーを得ることにより形成しうる。TNF は、そのリシン 残基により、二官能性試薬SMCCを用いて、上記で説明したTNF のビオチン化と同 様の条件下で誘導され、マレイミジル誘導化TNF を生じる。ピリジルジチオポリ マーに、酸素のない環境下で、DTT;ポリマーのモル比2:1 でジチオスレイトール (DTT)を加え、遊離のスルフヒドリル部分をポリマー上に生じさせる。酸素のな い環境下で誘導化されたポリマーを精製した後、マレイミジル誘導化TNF を添加 する。このマレイミジル基が誘導化されたポリマーのスルフヒドリル部分と反応 して、包合体生成物を生じる。 TNF レセプターを有する細胞には、脂肪細胞、管状筋細胞、子宮癌、胎児の肺 、膀胱癌、組織球性白血病、赤白血病、前骨髄球性白血病、扁平上皮癌、子宮癌 、Ｔリンパ腫、ヒトリンパ球、リンパ芽球性白血病（二つのレセプター）、単球 性白血病、包皮線維芽細胞、結合組織（二つのレセプター）、マウスマクロファ ージ及びウシ内皮が含まれる。高い、中程度の及び低い親和性のTNF レセプター が存在する。 TNF α及びTNF βが、特定のターゲット細胞に対して異なる生物学的効果を示 すこと見出された、例えば、内皮細胞（IL-1の製造）、骨髄細胞（クロノゲニッ クサバイバル(clonogenic survival))、線維芽細胞及びマクロファージ（マクロ ファージコロニー刺激因子の生産）、好中球（好中球の活性化）、骨芽細胞 (Ca+2コラーゲンデグラデーション(collagen degradation)の増殖、放出)、血管 平滑筋細胞（ヒトリンパ球抗原-DR のインターフェロン−γ−依存性発現）、Ｔ 細部ハイブリドーマ（MHC-I 細胞発現）、及びＢリンパ球（成長因子）である。 本発明の２段階プレターゲッティングアスペクトの実施において、TNF は、本 質的にIL-2について上記で説明した方法により、ターゲット細胞にデリバリーさ れる。 TNF 自体は、腫瘍細胞の狭いスペクトルで細胞毒性であるが、このサイトカイ ンは、広範囲の免疫調節作用を示す。そのような作用の一つは、腫瘍浸潤マクロ ファージまたは単球の活性化であり、これによりマクロファージを抗癌性にする 。この点におけるTNF のメカニズムに関する一つの理論は、TNF が単球を刺激し て、逆にTNF により刺激されて細胞毒性ファクター（例えば、酸化的バースト、 プロテアーゼ分泌またはサイトカイン放出）を放出するマクロファージを増強す る。TNF 放出抗癌作用は、オートクリンメカニズムを介して維持または誘導し得 る。他のサイトカイン（例えば、γ−インターフェロン）により単球またはマク ロファージをさらに活性化することにより、細胞毒性効果を増強してもよい。 例えば、γ−インターフェロン活性化単球からの膜の標本は、K562（赤白血病 細胞系）またはWEHI164（マウス線維肉腫細胞系）ターゲット細胞に対して細胞 毒性がある。単球を組み換えTNF-αで１時間前処理し、続いて培地単独でまたは γ−インターフェロンで処理すると、TNF-α／γインターフェロン処理膜標本に よる上記腫瘍細胞型の壊死率が増加する。Peck et al.，Cellular Immunol.，13 2 : 308，1991参照）。 Burrows et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90: 8996-9000，1993 では、 血管ターゲッティングの概念が論じられている。腫瘍ターゲット血管内皮は、循 環する薬剤に導入され得る。Burrows et al.は神経芽細胞系を、マウスのINF-γ 遺伝子でトランスフェクトした。これらのトランスフェクトされた細胞並びにそ れらのトランスフェクトされていないカウンターパートは、BALB/c nu/nuマウス の皮下で成長する。このトランスフェクトされた細胞は、INF-γを分泌し、これ は、腫瘍マス内での毛細血管及び細静脈の内皮細胞による、主な組織適合性複合 体のクラスII抗原の発現を誘導した。その後、そのようなMHC クラスII抗原をタ ーゲットとした免疫毒素を投与すると、腫瘍及び腫瘍退縮物(regressions)に対 する急速な沈着が観察された。処置後７〜１０日に再発が観察された。これは、 腫瘍外血液供給から栄養を誘導する生存腫瘍細胞のためである。 プレターゲッティング法は血管ターゲッティング診断または治療プロトコルの 実施に使用しうる。例えば、血管ターゲッティングの実施に有用な適する２段階 プレターゲッティング法は下記のものを含む。 腫瘍内皮細胞に特異的なターゲッティング部分及びINF-γを含む第１の包合体 をレシピエントに投与する。この第１の包合体は、ターゲット部位に局在し、IN F-γは腫瘍内皮細胞によるMHC クラスII抗原の発現を誘導する; 所望により、循環する包合体のレシピエントからのクリアランスを導くことの できるクリアリング剤をレシピエントに投与し、または所望によりレシピエント をクリアリング装置または別のクリアリング法で処置して、循環する包合体をレ シピエントから実質的に除去する; そして 抗癌剤、例えば毒素、放射性核種、抗癌剤等、並びにMHC クラスII抗原に特異 的なターゲッティング薬剤を含む第２の包合体をレシピエントに投与する。 血管ターゲッティングに有用な別の２段階プレターゲッティング法を下記に示 す: 腫瘍内皮細胞に特異的なターゲッティング部分及びリガンド−アンチリガンド 結合対を含む第１の包合体をレシピエントに投与する。この第１の包合体は、タ ーゲット部位に局在する; 所望により、循環する包合体のレシピエントからのクリアランスを導くことの できるクリアリング剤をレシピエントに投与し、または所望によりレシピエント をクリアリング装置または別のクリアリング法で処置して、循環する包合体をレ シピエントから実質的に除去する; そして 抗癌剤、例えば毒素、放射性核種、抗癌剤等、並びにリガンド／アンチリガン ド結合対の一員を含む第２の包合体をレシピエントに投与する。この第２の包合 体結合対の一員は、第１の包合体のものと相補的である。 この後者のプロトコルは、腫瘍内皮細胞に依存せずに活性薬剤を有する包合体 により認識される抗原を発現し、且つレシピエントを全身投与されたINF −γに 晒さないという利点を提供する。 上記で説明した所望によるクリアランス段階の他の例は、単に、レシピエント の本来のクリアランス機構により循環する包合体が実質的に除去されるのに充分 な時間放置することである。 さらに、所望による追加の工程は、腫瘍細胞に特異的なターゲッティング部分 及び細胞毒性活性薬剤を含む複合体の投与である。さもなければ、腫瘍細胞に特 異的なターゲッティング部分を含む複合体及び第１の包合体に取り込まれたリガ ンド／アンチリガンド結合対の一員を含む包合体の投与である。この包合体は、 ターゲット部位に局在する。この方法において、腫瘍外血管から栄養を受ける腫 瘍細胞がアドレス(addressed)される。 本発明は、ストレプトアビジンターゲッティング部分包合体の投与、及びそれ に続くビオチン化サイトカインの投与のようなプロトコルも意図している。その ようなアンチリガンドのプレターゲッティングは、ターゲット細胞に局在化する サイトカインの量を増加させることにより、サイトカイン治療の効力を改良する 。 ストレプトアビジン−抗体包合体は、通常、本来の抗体と同様の薬物動態学を 示し、それらの構造に依存して、良好にターゲット細胞に局在する。ビオチン化 サイトカインは、短いin vivo 半減期を有するが、サイトカインは、ビオチンの アビジンに対する親和性の結果としてターゲットに局在化し得る。さらに、ビオ チン−アビジンは、pH依存性解離を行う。これは、遅い速度で起こり、これによ り、サイトカインがターゲット部位において比較的継続的に時間をかけて持続的 に放出することが可能になる。また、ビオチン−アビジンアソシエーションを介 してターゲット細胞に結合したサイトカインは、抽出及び細胞媒介細胞毒性に影 響される細胞によるインターナリゼーションが可能である。 予め形成された抗体−ストレプトアビジン−ビオチン−サイトカイン製剤も、 本発明のこれらの方法の実施に使用され得る。さらに、本発明の３段階プロトコ ルも、IL-2のようなサイトカインのターゲット部位へのデリバリーに使用されう る。 本発明の別の目的は、サイトカイン（リガンドまたはアンチリガンド）包合体 のターゲット部位、例えば腫瘍における利用を増加することにある。より詳しく は、本発明の目的は、サイトカインの腫瘍細胞へのデリバリーのためのデリバリ ーシステムとしてのTNF-ビオチン／（ストレプトアビジンまたはアビジン）−抗 体包合体システムの利用を増加することにある。これは、該部位に、生物学的に 活性な、“遊離”サイトカイン、例えばTNF のターゲット部位における特定の放 出を提供することにより達成される。 これは、ターゲッティング部位−（リガンドまたはアンチリガンド）包合体、 及びサイトカイン（リガンドまたはアンチリガンド）包合体、またはそのような 複合体の形成を提供する部分の投与により行われる。典型的な態様は、予めビオ チン化TNF と複合化されたNR-LU-10/ ストレプトアビジンの複合体の投与を含む 。この“プリメード(premade)”融合構築物は、サイトカイン、例えばTNF の腫 瘍部位への部位特異的デリバリーに有効な手段である。さらに、これは、TNF に 関連する全身性毒性を減少しうると信じられている。 この点において、腫瘍壊死因子(TNF)を含むサイトカインの利用は、その全身 性毒性と作用が望まれる部位への有効なターゲッティングの欠如の両方により制 限されていた。この出願は、サイトカインのターゲット部位への部位特異的デリ バリーを有効にするプレターゲッティングを利用する方法を記載する。プレター ゲッティングされた（別々に投与された）及びプレコンプレックスされた(Ab-St rAv(Bt-サイトカイン))の両方に適用され得る別の方法は、上記の技術のいずれ によってもターゲット部位へのサイトカインの局在化に続くターゲット部位での 生物学的により有効な“遊離の”サイトカイン、例えばTNF の放出を提供するで あろう。TNF は、細菌性のエンドトキシン及び他の薬剤による刺激に応答して、 単球食細胞により合成され分泌されるタンパク質である。これは、in vivo で腫 瘍の出血性壊死を生じさせることが示されている。TNF のターゲット部位へのデ リバリーは、その短い半減期（ヒトにおいて11-30 分）及びその心血管系に対す る毒性のため困難であり、低血圧が投与量を制限する。この低血圧は、敗血性シ ョックに見られるように、血管内皮細胞による硝酸のTNF 媒介放出の結果である 可能性が高い。プレターゲッティングは、比較的短い血清半減期を有する分子を 腫瘍に“トラッピング”し、短時間で高濃度に沈着させるのに有効な方法である ことが示されている。これらの分子は、腫瘍からの抗体−ストレプトアビジン包 合体の排出速度及び／または拡散が遅いために、長期間保持される。 従って、TNF はその血管に対する作用により毒性であるため、同じ毒性が、プ レターゲッティング法におけるビオチン化TNF(TNF-Bt)にも予想される。これは 、この材料の非常に遅い浸潤によりアドレスされるが、なお、一定濃度のTNF に 血管が晒されている可能性がある。従って、本発明の目的は、TNF-Btを抗体／St rAv とプレコンプレックス化することによりこの毒性を“マスク”し、これによ り、ターゲット部位における沈着を薬物動態学的な意味で抗体依存性とすること にある。この構造が毒性がないまたは低いことを考えると、ターゲット細胞に対 する有効性がより低い可能性がある。この場合、“遊離の”生物学的に活性な包 合体をターゲット部位で放出させるためには、TN-Bt 包合体をターゲット部位で ピークレベルに沈着させ、その後、TNF-Btと入れ代わってこれをAb-StrAvから放 出させ、Ab-StrAvから放出する平衡を壊し、“遊離の”TNF-Bt の濃度を上昇さ せるように作用するビオチンまたは非毒性の小分子のビオチン化種を全身投与す ることができる。TNF は分子量約16kDのタンパク質であるため、腫瘍から急速に は拡散しない。従って、有効な局所濃度が達成される。 本発明のこの実施態様についての思想は、StrAv の非共有包合体及びビオチン 化NR-Lu-10が、高濃度の遊離のビオチンの存在下、非常に速い速度（一日未満） で解離したが、ビオチンの不存在下ではよりはるかに遅い速度で解離したことを 示すin vivo 実験データである。この結果は、１“パルス”のビオチンの投与に より、ターゲット局在化に続く治療種の“オフローディング(offloading)”が可 能になるという証拠を示す。 遊離のビオチンの投与が血清ビオチンレベルを対応して増加させ、遊離のサイ トカインの解離を促進することが信じられている。しかしながら、充分な濃度の ビオチンがビオチン投与によっては達成され得ないことを考えると（なぜならin vivo ではビオチンは厳重に調節されているからである。）、低分子、タンパク 質またはポリマーのようなビオチン化種を適当な薬物動態学により投与すること により、この潜在的な問題を未然に防ぐことができるであろう。 従って、上記に基づき、本発明のこの実施態様は、本質的に、プレターゲッテ ィングされているかプレコンプレックス化されているかにかかわらず、TNF-Btと サイトカイン−リガンドまたはアンチリガンドとの非共有性、例えばターゲット 部位における相互作用を利用し、それをリガンドまたはアンチリガンド、例えば ビオチンと競合させることにより放出を促進させることを含む。この実施態様の 別の改良は、さらに、リガンドまたはアンチリガンドビオチンの適当な低親和性 類似物を使用して遊離のサイトカイン、例えはTNF を放出させることを含む。 本発明のプレターゲッティング技術に従ってデリバリーされ得る他の抗癌剤は 、セレクチン（selectin）、例えばL-セレクチン、P-セレクチン及びE-セレクチ ンである。サイトカインの存在は、内皮細胞のような細胞を刺激し、それらの表 面にセレクチンを発現させる。セレクチンは、白血球に結合し、必要とされる場 所に白血球をデリバリーするのを助ける。従って、ストレプトアビジン−または アビジン−ターゲッティング部分包合体の投与、及びそれに続くビオチン化セレ クチンの投与のようなプロトコルも本発明により意図されている。そのようなア ンチリガンドプレターゲッティングは、ターゲット細胞に局在するセレクチンの 量を増加させることによりセレクチン治療の効力の改善に寄与する。この方法に おいて、セレクチン発現のサイトカイン誘導の必要性は、ターゲット細胞集団に おけるセレクチンの局在化及び保持により未然に解決される。 化学療法薬も、通常、治療有効量において短いin vivo 半減期を示す。従って 、本発明のプロトコルの別の実施例は、アビジンターゲッティング部分包合体の 投与と、それに続くビオチン−化学療法薬包合体または複合体、例えば薬剤−担 体−ビオチン複合体の投与を含む。本発明の３段階プロトコルは、化学療法薬、 例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、力価の高いアドリアマイシン類似 物、トリコテセン(trichothecenes)、力価の高いエネダイン(enediynes)、例え ばエスペラマイシン（esperamycins）、及びカリケアマイシン（callcheamycins ）、チトキサン(cytoxan)、ビンカアルカロイド、アクチナマイシン(actinamyci n)D、タキソール、タキソテレ（taxotere）等のターゲット部位へのデリバリー にも使用され得る。 上記で説明したプレターゲッティングプロトコルの例の大部分は、癌の治療に 関するが、プレターゲッティングプロトコルは、他の疾患の診断及び治療にも使 用され得る。他の疾患の例を以下に論じる。 例えば、活性化された細胞毒性Ｔ細胞に対する細胞毒性を有する活性薬剤、例 えばトリコテセン（例えば、ロリジンＡ(Roridin A)、ベルカリンＡ(Verrucarin A)、アングイジン(anguidine)、スチルペネトリオール(scirpenetriol)等）、 並びにヘルパーＴ細胞の活性またはヘルパーＴ細胞の数を減少させる薬剤、例え ばＴＧＦ−β、またはＴｓ活性を増加させる薬剤等は自己免疫疾患の治療及び移 植の拒絶反応の防止を促進させるであろう。自己免疫疾患の組織疾患は、活性化 された細胞毒性Ｔ細胞の直接作用により起こる。組織移植も、一部、新しい組織 の細胞に結合して、これを溶解する活性化されたＴ細胞の作用により媒介される 。活性化された細胞毒性Ｔ細胞を選択的に脱活性化するかまたは選択的に殺す活 性薬剤は、自己免疫疾患の治療または組織拒絶反応の防止において用いられる本 発明のプレターゲッティングプロトコルにおいて活性薬剤として使用しうる。そ のような活性薬剤は、抗体（ヘルパーＴ細胞及びIL-2の協力によりＢ細胞により 産生される）−移植片拒絶反応に関連する細胞溶解を媒介する補体を破壊する第 ２の活性薬剤と組み合わせて投与することもできる。 ターゲット組織へのターゲッティングは、抗−TAC、抗−IL-2レセプター抗体 （例えば抗−P-55レセプター及び抗−P-75レセプター）のようなIL-2レセプター に関する抗体を介して、またはIL-2自体により、またはそのような方法により行 われる。IL-2は、そのレセプターに結合して急速にインターナリゼートされ、さ もなければ大部分腎経路で排泄される。従って、IL-2は、ターゲット細胞の表面 に、プロトコルを完了するのに充分なだけ長くは残存しないので、プレターゲッ ティングにはあまり望ましくないターゲッティング部分である。 例えば、活性薬剤、例えばインターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−αまたはそ れらの組み合わせを、単球またはマクロファージまたは腫瘍細胞にプレターゲッ ティングプロトコルによりデリバリーすると、単球を活性化して細胞毒性マクロ ファージにするメカニズムにより癌の治療を促進させる。活性化されたマクロフ ァージは、酵素、リゾチームカテプシン及び加水分解酵素のような毒性部分を排 除する。腫瘍壊死因子αは細胞毒性マクロファージの活性化により作用し、腫瘍 細胞を直接殺すか、または腫瘍細胞をエフェクター細胞が媒介する細胞毒性に影 響されやすくする。二つの活性薬剤の組み合わせによりマクロファージの殺腫瘍 活性が最適に開始される。ターゲット組織のターゲッティングは、腫瘍特異抗原 に関連する抗体により、局在化した環境で活性薬剤が浸潤性単球集団に与えられ るように行われる。 例えば、インターロイキン−２のような活性薬剤の、プレターゲッティングプ ロトコルによる細胞毒性Ｔ細胞へのデリバリングは、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL) の活性化のメカニズムにより癌の治療を促進するであろう。細胞毒性Ｔ細胞によ るキリング(killing)は、ターゲット細胞の膜に入りターゲット細胞の溶解を促 進する孔形成部分の放出により媒介されると信じられている。ターゲット組織へ のターゲッティングは、腫瘍特異的抗原に関する抗体により行われ得る。 例えば、顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)のような活性薬剤の、マクロフ ァージ及び多核好中球へのプレターゲッティングプロトコルによるデリバリーは 、浸潤性単球及び多核白血球（PMNs）の活性化のメカニズムにより癌の治療を促 進するであろう。単球及び多核白血球によるキリング(killing)は、これらの細 胞の活性型により放出される細胞毒性酵素の結果である。ターゲット組織へのタ ーゲッティングは、腫瘍特異的抗原に関する抗体により行われ得る。 例えば、トランスフォーミング成長因子β(TGF- β)のような活性薬剤の、プ レターゲッティングプロトコルによる膵臓組織へのデリバリーは、細胞毒性Ｔ細 胞の成熟の抑制及びＴ細胞の増殖の抑制のメカニズムによりインシュリン依存型 糖尿病の治療を促進するであろう。膵臓組織へのデリバリーは、例えば島細胞に 存在する抗体または抗原を認識する他のターゲッティング部分により行われ得る 。Ｔ細胞によるキリング(killing)は、これらの細胞の活性型による孔形成部分 の放出の結果である。ターゲット組織へのターゲッティングは、膵臓に関する抗 体により行われ得る。 TGF-βは、本発明のプレターゲッティングプロトコルを用いた炎症性疾患の治 療にも使用され得る。そのように治療され得る慢性炎症性疾患の例は、慢性間接 リウマチ、橋本甲状腺炎における甲状腺疾患、類結核性肉芽腫等である。TGF-β は、線維芽細胞活性タンパク質または刺激を受けた間質性線維芽細胞上の抗原19 を認識する抗体または他のターゲッティング部分により行われ得る。例えば、Re ttig et al.，Cancer．Res.，53: 3327，1993 参照。この方法において、TGF-β は、ペプチドメディエーター及びタンパク分解酵素により活性化された間質性線 維芽細胞による慢性炎症の抑制に使用され得る。 例えば、ロリジンＡ、ベルカリンＡ、アンギジン、トリコテセン等のような活 性薬剤の、プレターゲッティングプロトコルによるＲＮＡへのデリバリーは、タ ンパク質合成抑制のメカニズムによりインシュリン依存型糖尿病または癌の治療 を促進するであろう。ターゲット組織へのターゲッティングは、腫瘍特異的抗原 又は膵臓に関する抗体により行われ得る。 本発明の付加的な形態は、NR-LU-10抗体によって認識される抗原に局在化し得 るモノクローナル抗体またはそのフラグメントのターゲティング部分を使用する ことに関する。このようなモノクローナル抗体またはフラグメントは、ネズミま たは他のヒト以外の哺乳類に由来の抗体でもよく、キメラもしくはヒト化抗体で もよくまたはヒト由来抗体でもよい。 NR-LU-10は、多くの癌腫で発現される約40キロダルトンの糖タンパク質抗原を 認識する分子量150キロダルトンのIgG2bモノクローナル抗体である。NR-LU-10抗 原に特異的な抗体を用いたマウスにおけるin vivo試験から、このような抗体が 速やかにインターナリゼーションを受けないこと、後で投与される活性薬剤含有 抱合体のターゲット部位局在化を妨害することが判明した。 NR-LU-10は、ヒト臨床試験で565人以上の患者に安全に投与された十分に特性 決定された汎癌腫抗体である。ヒト小細胞肺癌の完全形(intact)細胞で免疫した マウス脾臓細胞とP3×63/Ag8UIネズミミエローマ細胞とを融合させることによっ てNR-LU-10を分泌するハイブリドーマを得た。シードロットを樹立した後、ハイ ブリドーマをin vitro細胞培養法で増殖させ、精製し、純度及び不稔性を確認し た。 ラジオイムノアッセイ、免疫沈降反応及び蛍光活性化セルソーター(FACS)分析 を使用し、NR-LU-10の反応性プロフィルを作成した。NR-LU-10ターゲット抗原は 、固定培養細胞中または種々の癌細胞の界面活性剤抽出物中に存在した。NR-LU- 10 抗原は例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、膵 臓癌または他の癌組織中で観察される。NR-LU-10抗体の腫瘍反応性を表Ａに示し 、NR-LU-10の正常組織反応性を表Ｂに示す。表Ｂの値は後述する手順で得られた 。NR-LU-10の組織反応性が陽性であることは、このような組織によってNR-LU-10 抗原が発現されていることを示す。NR-LU-10抗原に関しては、Varkiet al.，“A ntigens Associated with a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclona l Antibodies”Cancer Research, 44:681-687,1984、及びOkabe et al.，“Mono clonal Antibodies to Surface Antigens of Small Cell Carcinoma of the Lun g,”Cancer Research, 44:5273-5278,1984 により詳細に記載されている。 ３つの反応性パラメーター、即ち、(1)反応の強さ、(2)同細胞型における反応 の均一性、及び、(3)抗体に対して反応性である細胞のパーセンテージ、に従っ て組織標本を評価した。これらの３つの値を合わせて0から500までの１つの重み 付けした比較値で表す。500は反応性が最強であることを示す。この比較値によ って種々の組織を容易に比較し得る。表Ｂは、要約した反応性の値、検査した組 織標本の数、NR-LU-10との反応が陽性を示した標本の数を示す。 NR-LU-10抗原のエピトープに結合する抗体の調製方法は米国特許第5,084,396 号に記載されている。簡単に説明すると、このような抗体は以下の手順で調製す ることができる。 −多価抗原の第１のエピトープに対する第１のモノクローナル抗体を、免疫グ ロブリンと結合し得る不活性不溶性マトリックスに吸収させて免疫吸着体を形成 し、 −免疫吸着体を多価NR-LU-10抗原含有抽出物と合わせ、第１のモノクローナル 抗体によって第１のエピトープが遮蔽された不溶化免疫複合体を形成する、 −不溶化免疫複合体によって動物を免疫し、 −免疫動物から採取した脾細胞をミエローマ細胞に融合させて、多価抗原の第 ２のエピトープに対する第２のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ を形成し、 −ハイブリドーマを培養して第２のモノクローナル抗体を産生し、 −第２のモノクローナル抗体をハイブリドーマ産物として収集する。 上記特許に記載の手順に従って調製されたモノクローナル抗体NR-LU-01、NR-L U-02及びNR-LU-03は本発明のこの形態に有用なターゲティング部分の例である。 ハイブリドーマ産生及びスクリーニングの標準的な手順によってNR-LU-10抗原 と反応性を有する別の抗体を調製することができる。このように産生され同定さ れたハイブリドーマクローンはさらに、抗原及び組織反応性を確認するために上 述のようにスクリーニングすることができる。 本発明の別の目的はリガンドと分子のキレート部分との間に準安定な結合を含 む、プレターゲッティングに使用することを目的とした新しいビオチン- キレー ト包合体を生成することである。 以前の実験は、既に放射性免疫包合体として腸からの取り込みを少なくするこ とに関して臨床試験で評価されているリガンドに対して優れた特性を示すリガン ドを同定する研究所で遂行されてきた(N2S2、N3S、MAGG-GABA)。これらの実験は 、放射性標識し、リシン残基を介して抗体またはそのフラグメントに結合した場 合、リガンドが腸への至適局在化までは示さないことを指示している。この事は 、肝臓におけるリガンド-Ab 包合体の代謝的分解を通して生産されるリガンド- リシン付加物が原因であると考えられた。腸の活性を減少させると同時に、腎臓 のクリアランスを増加する努力から、リガンドと抗体分子間にエステル結合を取 り込むことが示された。さらに、抗体包合体は腎臓から分泌されうる小分子を放 出するように代謝することが予想される（それはリシン残基を欠いているであろ うから）。この仮説を立証するために、s-エクソキシエチルメルカプトアセチル グリシルグリシルセリル-o- スクシニル- テトラフルオロフェニルエステル(1) を合成し、放射性標識し(2)、さらに、NR-LU-10 Fabに結合した(3)。 予想通り、ラットのモデルにおいて包合体(3)は、腸においては約50% 、腎臓 においては約60% の放射性の減少を示した。包合体(3)は、他の多くの包合体と 比較して腫瘍マウスにおける腫瘍取り込みおよび放射性標識クリアランスに関し て同様の生体分布を示し、このことはセリルスクシネート結合が血清的に安定で あることを示している。 対照的に、標識リガンド(2)の結合実験では、生成する包合体(3)はpH7.5（pH7 .0-7.5 が生理的である）よりも塩基性のpH（pH8.3-9.5）では不安定であること が示された。この不安定性はセリルサクシネート・エステル結合が中性付近のpH よりも塩基性pH領域で化学的に非常に不安定であることに寄因すると考えられて いる。 治療プレターケッティング法においてNR-LU-10- ストレプトアビジン包合体お よびY-DOTA- ビオチンを使用することは多くの本質的利点を提供するが、従来の RIT 法に比べて１つの重大な欠点を有する。特に、一次ターゲッティング・ベシ クルとして使用し、つぎに安定なY-DOTA- ビオチンキレートで処理される場合、 NR-LU-10- ストレプトアビジン包合体は腎臓において至適レベルの放射性標識を 与えない。この事はコレクティング・チューブにおいて発現される抗原に対する 包合体の交差反応性の結果であると考えられている。この交差反応性の結果とし てビオチン化したリガンドの導入は腫瘍同様、この部位にプレターゲットされた ストレプトアビジンへの結合を起こす。 従って、本発明の態様はリガンドのビオチン部分とキレート部分の間に準安定 結合を有するリガンドを使用することにより放射性標識したキレートからの腎臓 の被爆を減少または軽減する。例えば、正規の生理的条件下では安定であるか、 これらの条件の部位特異的変化においては不安定となる結合を組み込むこともで きる。この点において、腎臓のコレクティング・チューブが曝される尿のpHを重 炭酸塩溶液を静脈注射で投与することにより血清のpHを有意に変化させること無 しにpH8.5 に上げることが知られている。従って、尿のpHを上げるプロトコルを 施すことにより、塩基不安定性結合を有するリガンドは当初腎臓ターゲット包合 体に結合するが、包合体が塩基的尿環境に曝されたとき、（代謝的切断とは反対 に）その結合の化学的切断で放射性標識したキレート部分が放出される。このよ うなリガンドの１つを以下に示す。 このリガンドは放射性同位元素、ビオチナダーゼ安定化結合（N-メチル・アミド 結合）および塩基不安定性結合であるセリルサクシネート・エステルを安定に結 合するDOTAマクロサイクルを含んでいる。提唱されているこのリガンドの合成法 を以下に示す。 提唱されるビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル-O- スクシンアミド- ベ ンジル-DOTA(9)の合成経路 本発明の別の目的は、キレート部分とビオチン部分が切断可能なリンカーで分 離されている放射性キレートとビオチンを含む治療用包合体を生成することであ る。プレターゲットRIT に関する問題点は正常組織への放射能の蓄積である。理 想的なキャリヤーはそれ自身優れた腎臓排出能を有していなければならない。 腎臓および／または消化管にデリバリーされる吸収された投与物の量を減らせ ることから切断可能なリンカーは有利である。この事は本質的に血清中では安定 であるが、放射性代謝物の腎臓および腸における排出を増加させる包合体の選択 を含んでいる。可能性のある切断可能なリンカーを有する化合物には、例えば以 下の表に示した化合物が含まれる。 例えば、試験時にN3S-3-セリル- スクシネート(3-55)はテケニチウムNR-LU-10 Fab包合体の良好な放射能化学的収率および生体分布を提供した。 理想的には有効なリガンドは貯蔵安定性を有してなければならない。当業者は これを測定しうる。例えば、このことはin vitroで種々の試験溶液中、37℃で放 射性標識した包合体をインキュベートすることで行いうる。一般に使用される試 験溶液には新鮮な血清、50mg/ml HSA、５mg/ml ジエチレンテトラミン五酢酸( DTPA)(pH7.5)および10mM システイン(pH7.5)が含まれる。 正常な組織のプレターゲットされたAb-StAv への放射能のデリバリーを軽減す るために、放射性キレートとビオチンの間に切断可能な結合を有することが望ま しい。この事は正常な組織では選択的に切断されるが、腫瘍においては切断され ないリンカーの選択を要する。この領域では実質的な研究がなされてきた。エス テル結合は高い腫瘍/ 血液比を提供することが報告されている（Haseman,M.K.et al.，Eur.J.Nucl.Med.,Metabolizable In-III chelate conjugated anti-idiot ype monoclonal antibody for radioimmunodetection of lymphoma in mice，12 :455-60(1986); Gestin,J.F.，et al.，Nuclear Med.Biol.，Introduction of f ive Potentially Metabolizable Linking Groups Between In-III Cyclohexyl E DTA Derivatives and F(ab')2 Fragments of Anti-Carcinoambryonic Antigen A ntibody-I．A New Reproducible Method，20(6):755-62(1993); Mark Hylarides et al.，Bioconjugate Chemistry on PIP Ester-Linked Fab Conjugates; and Kasina，S.，et al.，The Third Conference on Radioimmunodetection and Rad ioimmunotherapy of Cancer,Princeton,NJ，1990）。報告によると、以下に示す エステル結合MAG3 Fab’包合体 1は、アミド結合包合体に比べ、腎臓からのクリ アランスを2 倍も向上させる（Weber,R.W.，Bioconj.Chem.，Enhanced kidney c learance with an ester-linked 99TC-radiolabeled antibody Fab'-chelator c onjugate，1，431-437(1990)）。 従って、以下に示すエステル結合したビオチンDOTA包合体は優れた正常組織排 出性を示すと考えられる。 これらのリンカーに関して、第１の「セリル スクシネート」リンカーは、比 較的短い合成手順からなることから有利である。アルキルタイプのリンカーにつ いて、ビオチノールリンカーは、このリンカーが比較的短く、かつ合成が殆どル ーチンであるので有利であることをさらに注意すべきである。当業者は、上記リ ンカーを合成し、かつ最適な特性、即ち放出速度を示すように決定することがで きる。但し、これらの構造は改良された正常組織排泄を提供するように構築でき る開裂可能リンカーの代表例に過ぎない。本発明は、in vivo 投与により、ター ゲット組織への放射性物質の満足のいくデリバリーと正常組織への毒性のかなり 良いレベルを提供する、いずれの開裂可能エステル架橋ビオチンDOTA包合体も包 含する。上記リンカーの合成は公知の合成技術を用いて当業者により行うことが できる。 以下、実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は単なる例示で あり、これによって発明を制限するものではない。 実施例Ｉ キレート-ビオチン抱合体の合成 N3Sキレート核を含むキレート化合物をアミド結合によりビオチンと結合した 。キレート-ビオチン抱合体の１例の放射性金属による標識化を下記に示す。 スペーサー基“X”は、抱合体のビオチン部分をアビジン結合に立体的に使用 可能にする。“R1”がカルボン酸置換基（例えばCH2COOH）であるとき、抱合体 は改善された水溶性を示し、さらに放射性標識ビオチン抱合体のin vivo排泄を 肝胆道性ではなく腎性のクリアランスに向かわせる。 簡単にいうと、N-α-Cbz-N-Σ-t-BOC保護リシンをNHS及びDCCでスクシンイミ ジルエステルに変換した後、アスパラギン酸β-t-ブチルエステルと縮合した。 得られたジペプチドをNHS及びDCCで活性化した後、グリシンt-ブチルエステルと 縮合した。Cbz基を水添分解により除去し、テトラヒドロピラニルメルカプト酢 酸スクシンイミジルエステルを用いてアミンをアシル化し、S-（テトラヒドロピ ラニル）メルカプトアセチルリシンを得た。N-t-BOC基とt-プチルエステルのト リフルオロ酢酸開裂後、LC-ビオチン-NHSエステルと縮合し、（Σ-カプロイ ルアミドビオチン）アスパルチルグリシンを得た。この合成方法を下記に示す。 1H NMR: （CD3OD，200 MHz Varian）：1.25-1.95(m，24H)，2.15-2.25(広幅t,4H )，2.65-3.05(m,4H)，3.30-3.45(dd，2H)，3.50-3.65(ddd，2H)，3.95(広幅s，2 H)，4.00-4.15(m，1H)，4.25-4.35(m，1H)，4.45-4.55(m，1H)，4.7-5.05(HODと オーバーラップするm)。 元素分析：C35H57N7O11S2・H2OのC，H．N 計算値: 50.41，7.13，11.76 実測値: 50.13，7.14，11.40。 実施例II テクネチウム又はレニウムで放射性標識した キレート-ビオチン抱合体の調製 実施例Ｉのキレート-ビオチン抱合体を99mTc過テクネチウム酸塩又は186Re過 レニウム酸塩で放射性標識した。簡単にいうと、99mTc過テクネチウム酸塩をグ ルコン酸ナトリウムの存在下に塩化第一錫で還元し、中間体のTc-グルコン酸錯 体を形成した。実施例Ｉのキレート-ビオチン抱合体を加え、pH約1.8〜約3.3で1 0分間で100℃まで加熱した。溶液をpH約6〜約8まで中和し、N3S配位99mTc-キレ ート-ビオチン抱合体を得た。1%酢酸中5〜60%アセトニトリルを用いるC-18 HPLC 勾配溶出の結果、δ（ガンマ線）検出により97%以上の放射化学収率で２種のア ノマーが検出された。 別法として、186Re過レニウム酸塩を冷過レニウム酸アンモニウムでスパイク し、塩化第一錫で還元し、クエン酸塩と錯化した。実施例Ｉのキレート-ビオチ ン抱合体を加え、pH約２〜３で30分間に90℃まで加熱した。溶液をpH約６〜約８ まで中和し、N3S配位186Re-キレート-ビオチン抱合体を得た。1%酢酸中５〜60% アセトニトリルを用いるC-18 HPLC勾配溶離の結果、85〜90%の放射化学収率であ った。次いでC-18逆相疎水性カラムで精製し、99%純度の物質を得た。 実施例III 放射性標識キレート-ビオチン抱合体のin vitro分析 99mTc-及び186Re-キレート-ビオチン抱合体の両者をin vitro評価した。 過剰のアビジン(約100倍モル過剰)を加えると、どちらの放射性標識ビオチン抱 合体も100%がアビジンと結合した。 99mTc-ビオチン抱合体を種々の化学的負荷条件にかけた。簡単にいうと、99mT c-キレート-ビオチン抱合体にアビジンを加え、5cmサイズ排除ゲル濾過カラムに 通した。放射性標識ビオチン-アビジン複合体を種々の化学的負荷(表１参照)に かけ、インキュベーション混合物をサイズ排除フィルターを通して遠心分離した 。保持された放射能の百分率(アビジン-ビオチンに結合した放射性標識を表す) を表１に示す。このように、化学的負荷をかけても放射性金属は高分子複合体と 結合したままであった。 さらに、各放射性標識ビオチン抱合体を約50μg/mlで血清と共にインキュベー トし、インキュベーションの完了後、サンプルを80%メタノール中で瞬時薄層ク ロマトグラフィー(ITLC)にかけた。放射能の２〜４% のみが起点に残留(即ちタ ンパク質と結合)し、この百分率は外来ビオチンの添加の影響を受けなかった。0 .2Mリン酸塩を移動相としてサイズ排除H-12 FPLCによりサンプルを分析したとこ ろ、放射能と血清高分子の結合は全く観察されなかった。 競合ビオチン結合アッセイにより各放射性標識ビオチン抱合体をさらに試験し た。簡単にいうと、種々の比のD-ビオチンと放射性標識ビオチン抱合体を含有す る溶液に一定の合計ビオチン:アビジン比で制限量のアビジンを加えた。各放射 性標識ビオチン抱合体のアビジン結合をITLCにより測定し、理論的最大化学量論 結合量(Green，Biochem.J. 94:23c-24c,1965のHABA分光光度アッセイにより測定 )と比較した。各放射性標識ビオチン抱合体とD-ビオチンの間にアビジン結合の 有意差は観察されなかった。 実施例IV 抗体プレターゲティング後に投与した 放射性標識キレート-ビオチン抱合体のin vivo分析 実施例Ｉの186Re-キレート-ビオチン抱合体を３段階抗体プレターゲティング プロトコルの動物モデルで試験した。一般にこのプロトコルは(i)ビオチン化モ ノクローナル抗体の予備的局在化、(ii)ターゲット部位における「サンドイッチ 」の形成と残留循環ビオチン化抗体のクリアランスのためのアビジンの投与、及 び(iii)ターゲット部位局在化及び迅速な血中クリアランスのための186Re-ビオ チン抱合体の投与を含む。 A.ビオチン化抗体の調製及び特性決定 ビオチン化NR-LU-10を下記手順のいずれかに従って調製した。第１の手順はリ シンε-アミノ基を介する抗体の誘導化を用いた。クロラミンTと125Ｉ又は131Ｉ ヨウ化ナトリウムのいずれかを使用してNR-LU-10をチロシンで放射性ヨウ素化し た。次に、下記式に従って5%DMSOを含有する炭酸緩衝液(pH8.5)中のビオチンア ミドカプロン酸NHSエステルを用いて放射性ヨウ素化抗体(5〜10mg/ml)をビオチ ン化した。 リシンビオチン化が抗体免疫反応性に及ぼす影響を試験した。ビオチン：抗体 の供給モル比が5:1から40:1に増加すると、ビオチン取り込みは予想通り増加し た(HABAアッセイ及びプロナーゼ消化生成物を用いて測定)(下記表２)。天然抗体 と比較したビオチン化抗体免疫反応性の百分率を制限量の抗原でのELISAアッセ イで調べた。免疫反応性百分率は11.1:1の測定誘導化で70％未満に低下したが、 この誘導化レベルで抗原陽性細胞結合(抗原過剰のLS-180腫瘍細胞で実施)の減少 は観察されなかった。その後の実験では10:1のビオチン：抗体比で誘導化した抗 体を用いた。 別法として、システインの還元により生成されたチオール基を用いてNR-LU-10 をビオチン化した。チオール基の誘導化は抗体免疫反応性をさほど悪化させない と仮定された。p-アリール錫フェニラートNHSエステル(PIP-NHS)と125Ｉまたは1 31 Ｉヨウ化ナトリウムのいずれかを用いてNR-LU-10を放射性ヨウ素化した。放射 性ヨウ素化NR-LU-10を25mMジチオトレイトールと共にインキュベートし、サイズ 排除クロマトグラフィーを用いて精製した。次に、5%DMSO(v/v)を含有するリン 酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.5)中の10〜100倍モル過剰のN-ヨードアセチル-N'- ビオチニルヘキシレンジアミンと還元抗体(遊離チオール基を含む)を反応させた 。 表３に示すように、ビオチン：抗体供給モル比が50:1以上では１抗体当たり６個 のビオチンしか取り込まれなかった。免疫反応性に対する有意影響は観察されな かった。 リシン及びチオール誘導化ビオチン化抗体（それぞれ「抗体(リシン)」及び「 抗体(チオール)」）を比較した。サイズ排除FPLCで分子サイジングの結果、どち らのビオチン化プロトコルでも単分子（モノマー）IgGを生じることが立証され た。ビオチン化抗体(リシン)は見かけの分子量が160kDであり、ビオチン化抗体( チオール)は見かけの分子量が180KDであった。内在スルフヒドリル(即ちジスル フィド)をチオール基に還元した後、ビオチンと結合すると、多少折り畳みがも とに戻った高分子が得られる。その場合には、抗体(チオール)はより大きい流体 力学的半径を示し、クロマトグラフィー分析によると分子量の見かけ上の増加を 示し得る。どちらのビオチン化抗体種も固定アビジン-アガロースと98%の特異結 合を示した。 4%スタッキングゲルと5%分解ゲルを用いて非還元性SDS-PAGEによりビオチン化 抗体種をさらに比較した。ビオチン化サンプルを放射性標識するかまたは標識せ ずに、放射性標識または未標識アビジンまたはストレプトアビジンに加えた。サ ンプルはSDS-PAGE分析前は煮沸しなかった。天然抗体とビオチン化抗体(リシン) は類似の移動を示し、ビオチン化抗体(チオール)は50〜75kD範囲で２種を生成し た。これらの種はチオールキャップをもつ２種に相当し得る。これらのSDS-PAGE 条件下で、放射性標識ストレプトアビジンは60kDテトラマーとして移動する。40 0μg/mlの放射性標識ストレプトアビジンに50μg/mlのビオチン化抗体 を加えると(in vivo「サンドイッチ」条件と同様)、どちらの抗体種も分子量の 大きい複合体を形成した。他方、ビオチン化抗体(チオール)-ストレプトアビジ ン複合体のみがスタッキングゲルから分解ゲルへと移動し、ビオチン化抗体(リ シン)-ストレプトアビジン複合体に比較して低分子量であることが判明した。 B.ビオチン化抗体種の血中クリアランス 放射性ヨウ素化ビオチン化NR-LU-10(リシンまたはチオール)を非腫瘍ヌードマ ウスに用量100μgで静脈内投与した。放射性ヨウ素化ビオチン化NR-LU-10の投与 から24時間後に、マウスに生理食塩水またはアビジン400μgを静脈内注射した。 生理食塩水を投与した場合には、両者ビオチン化抗体種の血中クリアランスは二 相性であり、天然NR-LU-10抗体のクリアランスに類似していた。 24時間後にアビジンを静脈内投与した動物では、ビオチン化抗体(リシン)はア ビジン投与(アビジン：ビオチン＝10:1)から15分以内に(注射用量の5%のレベル まで)クリアされた。ビオチン化抗体(チオール)ではアビジン投与(10:1または25 :1)の結果、２時間後に注射用量の約35%まで循環抗体レベルが低下した。アビジ ン投与後の循環中の残留放射性標識抗体活性を固定化ビオチンによりin vitro試 験した。この分析の結果、ビオチン化抗体の85%がアビジンと結合していること が判明した。これらのデータは、形成されたビオチン化抗体(チオール)-アビジ ン複合体をRESによりクリアするには架橋が不十分であることを示唆している。 アビジンまたは生理食塩水投与から２時間後のビオチン化抗体(リシン)の血中 クリアランス及び生体内分布試験を実施した。アビジン投与は血液中のビオチン 化抗体濃度を有意に低下させ(図１参照)、肝臓及び脾臓中のビオチン化抗体濃度 を増加させた。腎臓中のビオチン化抗体濃度は変わらなかった。 実施例Ｖ ３段階プレターゲティングプロトコルによる 186Re-キレート-ビオチン抱合体のin vivo特性決定 実施例Ｉの186Re-キレート-ビオチン抱合体(MW≒1000; 比活性＝１〜2mCi/mg) を動物モデルにおいて３段階プレターゲティングプロトコルで試験した。 より具体的には、18〜22gの雌ヌードマウスにLS-180ヒト結腸腫瘍異種移植片を 皮下移植し、移植から10日以内に100〜200mgの腫瘍を生成した。 (上記実施例IV.Aに記載したように)NR-LU-10(MW≒150kD)を125I/クロラミンT で放射性標識し、リシン残基を介してビオチン化した。アビジン(MW≒66kD)を（ 上記実施例IV.AでNR-LU-10の放射性ヨウ素化について記載したように）131I/PIP -NHSで放射性標識した。実験プロトコルは以下の通りであった。 グループ1:時刻０で100μgの125Ｉ標識ビオチン化NR-LU-10を注射。 24時間後に400μgの131Ｉ標識アビジンを注射。 26時間後に60μgの186Re-キレート-ビオチン抱合体を注射。 グループ2:時刻０で400μgの131Ｉ標識アビジンを注射。 （対照） ２時間後に60μgの186Re-キレート-ビオチン抱合体を注射。 グループ3:時刻０で60μgの186Re-キレート-ビオチン抱合体を注射。 （対照） このプロトコルで使用する３種の放射性標識は相互の存在下で検出ことができる 。使用する３成分の寸法が対数的に異なり、抗体≒150,000、アビジン≒66,000 、ビオチン≒1,000である点にも着目すべきである。186Re-キレート-ビオチン抱 合体の投与から２、６、24、72及び120時間後に生体内分布分析を実施した。 ３段階プレターゲティングプロトコルで186Re-キレート-ビオチン抱合体を分 析する前に動物モデルで所定の予備試験を実施した。まず最初に、アビジンの血 中クリアランスに及ぼすビオチン化抗体の効果を試験した。これらの実験の結果 、アビジンクリアランス速度及び程度はビオチン化抗体の有無に拘わらず同様で あった。２番目に、186Re-キレート-ビオチン抱合体の血中クリアランスに及ぼ すビオチン化抗体とアビジンの効果を試験した。血中クリアランスはビオチン化 抗体とアビジンの有無に拘わらず同様であった。さらに、抗体免疫反応性は試験 濃度ではビオチン化によって悪化しないことが判明した。 第３に、時刻０で投与したビオチン化抗体と24時間後に投与したアビジンの腫 瘍取り込みを試験した。この実験の結果を図１に示す。25時間で約350pmol/gの ビオチン化抗体が腫瘍に存在し、32時間で濃度は約300pmol/gであり、48時間で 約200pmol/g、120時間で約100pmol/gであった。同一時点でのアビジン取り込 みはそれぞれ約250、150、50及び0pmol/gであった。同一の実験からビオチン化 抗体とアビジンとについて腫瘍対血液比を測定した。32時間から120時間では、 腫瘍対血液比は非常によく似ていた。 アビジンとの結合によりビオチン化抗体を血液から迅速且つ効率よく除去でき ることが判明した。アビジン投与から２時間以内に血液プール抗体濃度の10分の １の低下が認められ（図１）、腫瘍対血液比は急激に増加した。アビジンは迅速 にクリアされ、投与後１時間以内に注射用量の90％を上回る量が血液からクリア された。Re-186-ビオチンキレートも非常に迅速に除去され、投与後１時間まで に注射用量の99%を上回る量が血液からクリアされた。 次に(上記グループ１について記載した)３段階プレターゲティングプロトコル を試験した。より具体的には、ビオチン化抗体とアビジンの存在下または不在下 の186Re-キレート-ビオチン抱合体の腫瘍取り込みを測定した。ビオチン化抗体 とアビジンの不在下では、186Re-キレート-ビオチン抱合体は注射から２時間後 にかすかなピークを示し、約５時間までに腫瘍から実質的にクリアされた。これ に対してビオチン化抗体とアビジン(特異的)の存在下では、注射から２時間後に186 Re-キレート-ビオチン抱合体はビオチン化抗体とアビジンの不在下で観察さ れるものの約７倍の腫瘍におけるピークに達した。さらに、特異的に結合した18 6 Re-キレート-ビオチン抱合体は50時間を上回る時間にわたって有意レベルで腫 瘍に保持された。同一の実験で腫瘍対血液比を測定したところ、経時的に有意に 増加した(即ち30時間でT:B≒8、100時間で≒15、140時間で≒35)。 186Re-キレート-ビオチン抱合体の腫瘍取り込みはさらにビオチン化抗体の投 与量に依存することが判明した。ビオチン化抗体０μgでは投与から２時間後に 腫瘍に約200pmol/gの186Re-キレート-ビオチン抱合体が存在し、抗体50μgでは 約500pmol/gの186Re-キレート-ビオチン抱合体、抗体100μgでは約1,300pmol/g の186Re-キレート-ビオチン抱合体が存在した。 ３段階プレターゲティングプロトコルによるレニウム腫瘍取り込みを、抗体に 共有結合したキレートを介して放射性標識した同一抗体の腫瘍取り込み(従来の 手順)と比較した。この比較の結果を図２に示す。キレートで直接標識したレニ ウム抗体抱合体と３段階でプレターゲティングしたサンドイッチについて血中ク リアランスと腫瘍取り込みを比較した。曲線下の面積(AUC)とAUCtumor/AUCblood の比を測定した。キレートで直接標識したレニウム抗体抱合体ではAUCtumor/AUCblood の比＝24055/10235、即ち2.35であり、３段階でプレターゲティングしたサ ンドイッチではAUCtumor/AUCbloodの比＝46764/6555、即ち7.13であった。 腫瘍取り込みの結果は血液区画の放射能被曝の観点から最もよく理解され、こ れは骨髄被曝と直接相関する。３段階プロトコルでは100倍のレニウムを動物に 投与したにも拘わらず、血液からの小分子(186Re-ビオチン)の非常に迅速なクリ アランスにより、上記のように与えられる186Re被曝を最小限にできる。同一の マッチした抗体用量のフォーマットで、直接標識した（従来手順）NR-LU-10完全 抗体は３段階プロトコルの100倍の線量のレニウム被曝をもたらした。３段階プ レターゲティング(約7:1)では直接標識抗体法(約2.4:1)と比較してターゲティン グ比(腫瘍の放射能被曝：血液の放射能被曝即ちAUCtumor:AUCblood)の明白な増 加が観察された。 実施例VI 改善された生体内分布特性をもつキレート-ビオチン抱合体の調製 111In標識ビオチン誘導体の生体内分布はキレート及び結合基の構造変化によ って大幅に変化する。このような構造変化はテクネチウム-及びレニウム-ビオチ ン抱合体の生体内分布にも影響し得る。従って、正常組織からの最適なクリアラ ンスを示すテクネチウム-及びレニウム-ビオチン抱合体を調製する方法が有利で ある。 A.中性MAMAキレート／抱合体 下記式に従って中性MAMAキレート-ビオチン抱合体を調製する。 得られたキレート-ビオチン抱合体は優れた腎臓排泄を示す。抱合体の正味総電 荷は中性であるが、分子のポリカルボキシレート性により親水性と疎水性の領域 を生じる。抱合体内のカルボキシレート基の数及び種類を変えることにより、排 泄を腎臓から胃腸経路に移すことができる。例えば、中性化合物は一般に腎臓に よりクリアされ、アニオン性化合物は一般に胃腸系を介してクリアされる。 B.ポリリシン誘導化 ポリリシンを含む抱合体も有益な生体内分布特性を示し得る。完全抗体をポリ リシンで誘導化すると、抱合体の生体内分布は肝臓取り込みに向かう傾向がある 。これに対してFabフラグメントをポリリシンで誘導化すると、肝臓及び腎臓両 者の低い取り込みレベルを生じ、これらの抱合体の血中クリアランスはキレート に共有結合したFabに類似する。ポリリシン誘導化キレート-ビオチン抱合体の例 を下記に示す。 従って、放射性金属-キレート-ビオチン抱合体にポリリシンを加えると、抱合体 の良好な肝臓及び腎臓クリアランスを維持しながらRES金属イオン封鎖を最小限 にするか消失させるために有用である。腎臓排泄特性を改善するためには、ビオ チン化後にポリリシン誘導体をスクシニル化すると好適である。ポリリシン誘導 体はさらに、(1)放射性金属-キレート-ビオチン抱合体の比活性を増加し、(2)ポ リリシンポリマーの分子量を変えることにより血中クリアランス速度及び 経路を調節することができ、(3)最適な腫瘍相互作用のために抱合体の循環半減 期を増加するといった利点も提供する。 ポリリシン誘導化は標準的な方法により達せられる。簡単にいうと、ポリ-L- リシンを標準的なアミノ基アシル化手順(pH8の水性重炭酸緩衝液にビオチン-NHS エステル、次いでキレート-NHSエステルを加える)に従ってアシル化する。別法 としては、DMSO及びトリエチルアミン中でニトロフェニルエステルを用いる無水 条件もある。得られた抱合体をUV及びNMRスペクトルにより特性決定する。 ポリリシンに結合したビオチンの数をHABAアッセイにより測定する。分光光度 滴定を用いてアミノ基誘導化の程度を評価する。放射性金属-キレート-ビオチン 抱合体をサイズ排除により特性決定する。 C.開裂可能な結合 放射性金属-キレート-ビオチン抱合体のキレート及びビオチン部分間に開裂可 能なリンカーを挿入することにより、正常組織よりも腫瘍への抱合体の保持を強 化することができる。より具体的には、正常組織中に存在するが腫瘍組織中には 不足または不在の酵素により開裂されるリンカーは腫瘍保持を増加できる。例と して、腎臓は高いγグルタミルトランスフェラーゼ濃度をもち、他の正常組織は γグルタミルプロドラッグのin vivo開裂を示す。これに対して、腫瘍は一般に 酵素ペプチダーゼを欠失している。下記に示すグルタミル結合ビオチン抱合体は 正常組織中で開裂され、腫瘍中で維持される。 D．O-極性置換基をもつセリンリンカー N3Sキレートを糖置換すると、このようなキレートは水溶性になる。生理的pH で完全にイオン化されるスルホン酸塩は下記キレート-ビオチン抱合体の水溶性 を改善する。 この化合物は標準的な反応手順に従って合成される。簡単にいうと、ビオシチン をN-t-BOC-(O-スルホン酸またはO-グルコース)セリンNHSエステルと縮合させ、N -t-BOC-(O-スルホン酸またはO-グルコース)セリンビオシチンアミドを生成する 。次いでN-t-BOC基をTFAで開裂し、トリエチルアミンを含むDMF中でリガンドNHS エステルと縮合させると、リガンドアミドセリン(O-スルホン酸またはO-グルコ ース)ビオシチンアミドが得られる。 実施例VII PIP放射性ヨウ素化ビオチンの製造及び特性決定 ポリ-L-リシンを過剰のNHS-LC-ビオチン、次いでDMSO中のボルトン−ハンター (Bolton-Hunter)N-ヒドロキシスクシンイミドエステルに曝露して調製した放射 性ヨウ素化ビオチン誘導体が報告されている。精製後、この生成物はヨウ素産生 体法により放射性標識されたものである(例えばDel Rosario et al.，J.Nucl.Me d．32 :5，1991，993(abstr.))。得られた放射性ヨウ素化ビオチン誘導体は高分 子量であるため、制限された生成物の特性決定(即ち放射性HPLC及び固定ストレ プトアビジンとの結合)しかできなかった。 本発明により放射性ヨウ素化ビオチンを調製するといくつかの利点がある。ま ず第１に、放射性ヨードビオチン誘導体は低分子量であるため、完全な化学的特 性決定が可能である。第２に、本発明の製造方法は１段階であり、精製段階が不 要である。 簡単にいうと、下記式に従ってビオシチン(R=COOH)及びビオチンアミドペンチ ルアミン(R=H)に対応するヨードベンズアミド誘導体を調製した。下記式中、“X ”は任意の放射性ハロゲンでよく、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、211At等を含む。 １の製造はトリブチル錫中間体を用いてWilbur et al.，J.Nucl.Med．30:216- 26，1989に概ね従った。NHSエステル１はDCUと共に処理しにくい混合物を形成し たので、上記反応では水溶性カルボジイミドを使用した。NHSエステルはクロマ トグラフィーに適合せず、有機溶剤及び水性溶剤に不溶性であり、DMFまたは緩 衝水性アセトニトリル中でビオシチンと反応しなかった。１とビオシチンまたは 5-(ビオチンアミド)ペンチルアミンの反応は塩基に感受性であった。１とビオシ チンまたはペンチルアミンの反応を熱DMSO中でトリエチルアミンの存在下に実施 すると、２種以上のビオチン化生成物が形成された。これに対して１とビオシチ ン(4mg/ml)またはペンチルアミン(4mg/ml)の懸濁液をDMSO中で約５〜 約10分間117℃に加熱したところ、反応は極めて清浄且つ完全であった。この結 果、125I-ビオチン誘導体が94%の放射化学収率で得られた。場合によっては、C- 18 HPLC 及び逆相疎水性カラムを使用して放射性ヨウ素化生成物を精製してもよ い。以下の文中では、得られた放射性ヨウ素化生成物２をPIP-ビオシチン(R=COO H)及びPIP-ペンチルアミン(R=H)と呼ぶ。 ヨードビオチン誘導体２の両者は固定アビジンに対して≧95%の結合を示した 。生成物２をマウス血清と共にインキュベートしたところ、２は固定アビジンと 結合する能力を失わなかった。雄性BALB/cマウスで２の生体内分布試験を行った ところ、(上記186Reキレート-ビオチン抱合体と同様に)血液からの迅速なクリア ランスが示された。放射性ヨードビオチン２は186Re-キレート-ビオチン抱合体 と比較して肝胆道性排泄が減少し、186Re-キレート-ビオチン抱合体と比較して 尿排泄が増加した。２の尿代謝物の分析によると、脱ヨウ素化及びビオチンアミ ド結合の開裂が判明し、代謝物は固定アビジンとの結合を示さなかった。これに 対して、186Re-キレート-ビオチン抱合体の代謝物は無傷のビオチン抱合体とし て尿中に排泄されると思われる。２の腸内取り込みは186Re-キレート-ビオチン 抱合体の＜50%である。２のこれらの生体内分布特性は放射性同位体の全身クリ アランスを強化し、プレターゲティングプロトコルにおける２の使用の利点を示 す。 腫瘍をもつマウスで131I-PIP-ビオシチンを２段階プレターゲティング手順で 評価した。簡単にいうと、雌性ヌードマウスにLS-180腫瘍細胞を皮下注射すると 、７日後にマウスは50〜100mgの腫瘍異種移植片を示した。t=0でPIP-NHSを使用 して125Ｉで標識(実施例IV.A.参照)したNR-LU-10-アビジン抱合体200μｇをマウ スに注射した。t＝36hでマウスに131I-PIP-ビオシチン42μgを投与した。データ はアビジン１分子当たり約（≒）1.5個の131I-PIP-ビオシチン分子に対応する即 時の特異的腫瘍局在を示した。 記載する放射性ハロゲン化ビオチン化合物は、上記実施例VIで186Re-キレート -ビオチン抱合体について記載したのと同一の種類の修飾が可能である。特に、 ポリリシンを125I-PIPで痕跡標識した後、ポリリシンを十分にビオチン化するこ とにより下記PIP-ポリリシン-ビオチン分子が製造される。 固定アビジンに対する125Ｉ結合を測定することにより、全放射性ヨウ素化種は 少なくとも１当量のビオチンも含むことが確認される。 実施例VIII 内在抗体スルフヒドリル基またはスルフヒドリル生成化合物を介する ビオチン化抗体(チオール)の調製 反応に使用可能な内在的なスルフヒドリル基をもつ抗体もある。ビオチン化し ようとする抗体が内在的なスルフヒドリル基を含む場合には、このような抗体を (上記実施例IV.Aに記載したように)N-ヨードアセチル-n'-ビオチニルヘキシレン ジアミンと反応させる。１個以上の内在的なスルフヒドリル基を使用できるので 、ビオチン化抗体に他の有害な影響を及ぼし得るDTT等の還元剤に抗体を曝す必 要がなくなる。 あるいは、末端スルフヒドリル基を含む化合物またはリンカーを使用すること により１個以上のスルフヒドリル基をターゲティング部分に結合する。この目的 の化合物の１例はイミノチオランである。こうして（上記の）内在的スルフヒド リル基によるのとと同様に、抗体に及ぼす還元剤の有害な作用が回避される。 実施例IX インターナリゼーションを誘発しない２段階プレターゲティング法 以下のようにしてNR-LU-13-アビジン抱合体を調製する。まず最初にアビジン をN-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレ ート(SMCC)で誘導化する。次にSMCC誘導アビジンをNR-LU-13と共に１：１モル比 でpH8.5において16時間インキュベートする。調製用サイズ排除HPLCを用いて未 反応NR-LU-13及びSMCC誘導アビジンを混合物から除去する。主産物として所望の 1:1 NR-LU-13-アビジン抱合体及び副次的産物として完全に特性決定されていな い成分の２種の抱合体が生成物として得られる。 上記実施例IIのように99mTc-キレート-ビオチン抱合体を調製する。NR-LU-13 −アビジン抱合体をレシピエントに投与し、循環から排出させる。放射免疫シン チグラフィー分野の通常の技術者はNR-LU-13−アビジン抱合体の腫瘍局在及び循 環からのクリアランスに最適な時間を容易に決定することかできる。そのような 時点で99mTc-キレート-ビオチン抱合体をレシピエントに投与する。99m Tc-キレート-ビオチン抱合体は≒1,000の分子量を有するので、腫瘍細胞 の表面上のNR-LU-13-アビジン分子の架橋は劇的に減少するかまたは消失する。 その結果、99mTc診断薬は腫瘍細胞表面に長時間保持される。従って、画像形成 技術による診断薬の検出が最適なものとなり、さらにより低い線量の放射性同位 体を用いて典型的な３段階プレターゲティングプロトコルで得られると同等の画 像が得られる。 場合によっては、プラズマフェレシスをビオチンアフィニティーカラムと組み 合わせて循環からのNR-LU-13-アビジンのクリアランスを促進することができる 。このようなカラムを用いることにより、循環NR-LU-13-アビジンは体外に保持 され、レシピエントの免疫系が大きいタンパク性免疫原(即ちアビジン)になるべ く曝されないようにする。 本発明の実施に有用なプラズマフェレシス／カラム精製方法の１例は、腫瘍タ ーゲット部位の画像形成及び処理における放射性標識抗体力価の低減に関連して 米国特許第5,078,673 号に記載されている。簡単にいうと、本発明の目的のため の体外クリアランス法の１例は、 リガンド-またはアンチリガンド-ターゲティング部分抱合体をレシピエントに 投与する段階と、 投与した抱合体がターゲット部位に局在するのに十分な時間後、血液を例えば プラズマフェレシスによってレシピエントから取り出す段階と、 細胞成分を前記血液から分離して血清分画を生成し、細胞成分をレシピエント に戻す段階と、 投与した抱合体の血清分画中の力価を低減させて精製血清を生成する段階と、 精製した血清をレシピエントに再び注入段階とを含み得る。 粒状型クリアリング剤（例えば複数のビオチン分子が結合したポリマー粒子） を投与してもNR-LU-13-アビジンのクリアランスは促進される。このような粒状 クリアリング剤は複数のビオチン分子が結合した生分解性ポリマーキャリアを構 成することが好ましい。本発明の粒状クリアリング剤は投与された循環抱合体と 結合し、該抱合体をレシピエントからクリアする能力を示す。本発明のこの形態 の粒状クリアリング剤はこの目的に適した任意の構成をとり得る。好適な粒状ク リアリング剤は下記特徴の１つ以上を示す。 −微粒状(例えば直径約0.5μm〜約100μm、より好ましくは約0.5〜約２μm)の さらさらした粉末構造、 −約３〜約180日間、より好ましくは約10〜約21日間で生分解するように設計 された生分解性構造、または非生分解性構造、 −クリアリング剤の分布、代謝及び排泄の過程にわたってレシピエント生理機 構と生体適合し、より好ましくは生体適合性生分解生成物を含む、 −１個以上の結合部分（好ましくはリガンド／アンチリガンド対の相補的なメ ンバー）を介してレシピエントから消失あるいは除去され易くするように１個以 上の循環抱合体と結合できる。粒状クリアリング剤の総モル結合能は、選択され た粒子径及びリガンドまたはアンチリガンド置換比に依存する。結合部分は本明 細書中に記載するように共有または非共有的な形態で粒状剤形の表面構造と結合 することができ、先に投与した循環する結合対のメンバーとの結合に使用可能な リガンドまたはアンチリガンドを提供する。 本発明の好適な粒状クリアリング剤は生分解性または非生分解性の微粒子であ る。より好ましくは、粒状クリアリング剤はランダムな非酵素的加水分解切断に より生分解するマトリックスを含むポリマーから形成される。 本発明での使用のためにはαヒドロキシカルボン酸及び関連ラクトンの縮合か ら誘導されるポリマーが好ましい。特に好適な部分は熱可塑性ポリエステル（例 えばポリラクチドまたはポリグリコリド）の混合物または、ポリ（ラクチド−コ −グリコリド）等のラクチド及びグリコリド成分のコポリマーから形成される。 構造の例としてランダムポリ(DL-ラクチド−コ−グリコリド)を下記に示す。x及 びyの値は、当業者によれば望ましい微粒子特性が得られるように操作すること が可能である。 本発明の粒状クリアリング剤を形成するのに適した他の物質としてはポリオル トエステル類とポリアセタール類(Polymer Letters, 18;293，1980)及びポリオ ルトカーボネート（米国特許第4,093,709号）等が挙げられる。 本発明のマトリックス粒子を含む好適な乳酸／グリコール酸ポリマーはエマル ジョンに基づく方法により製造され、これは溶剤抽出法の変法であり、このよう な方法は例えば、Cowsar et al.，“Poly(Lactide-Co-Glycolide)Microcapsules for Controlled Release of Steroids，”Methods Enzymology，112:101-116， 1985(微粒子中へのステロイドトラップ); Eldridge et al.，“Biodegradable a nd Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)Microspheres as an Adjuvan t for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of To xin-Neutralizing Antibodies,”Infection and Immunity，59:2978-2986，1991 (トキソイドトラップ); Cohen et al.，“Controlled Delivery Systems for Pr oteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid)Microspheres,”Pharmaceutical Research, 8(6):713-720，1991（酵素トラップ）；及びSanders et al.，“Cont rolled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide)Microspheres,”J.Pharmaceutical Science, 7 3(9): 1294-1297，1984(ペプチドトラップ)に記載されている。 一般に、本発明の粒状クリアリング剤を形成する手順は、ポリマーをハロゲン 化炭化水素溶剤に溶解する段階と、ハロゲン化炭化水素溶剤については溶剤とし て機能するがポリマーの溶剤としては機能しない付加物質を加える段階を含む。 ポリマーはポリマー-ハロゲン化炭化水素溶液から析出する。粒子形成後、洗浄 し、有機溶剤で硬化させる。次いで水洗段階と水性非イオン界面活性剤による洗 浄段階を行い、その後室温で減圧乾燥する。 生体適合性の用途のためには、粒状クリアリング剤を包装、貯蔵または投与前 に滅菌する。滅菌はこの目的に適した任意の方法で実施することができる。例え ば、γ線照射が粒子に結合している結合部分の構造または機能に悪影響を与えな い場合には、粒子にγ線を照射することができる。結合部分が悪影響を受ける場 合には、粒状クリアリング剤を滅菌条件下で製造すればよい。 好適なラクチド／グリコリド構造は哺乳動物生理環境に生体適合性を示す。ま た、これらの好適な徐放性投与形態は、その生分解によりいずれも哺乳動物の通 常の代謝産物である乳酸とグリコール酸を形成するという利点がある。 場合によっては非分解性または生分解性ポリマー単位と共に結合部分と粒子の 結合に必要な官能基を粒状構造に組み込む。この目的に使用可能な官能基として は、リガンドまたはアンチリガンドと反応性の基が挙げられ、例えばカルボキシ ル基、アミン基、スルフヒドリル基等である。好適な結合強化部分としては、好 適な（ラクチド-グリコリド）ポリマーを含むマトリックス等の末端カルボキシ ル基が挙げられる。当業者は適当な官能基を選択し、これらの官能基が関与する 抱合反応をモニターすることができる。 上記の種類の粒状クリアリング剤を使用することにより得られる利点を以下に 述べる。 −ガラクトース誘導化または電荷修飾強化法により「ミクロン」寸法範囲の粒 子がRES及び肝臓に局在し、好ましくは粒子はクリアランス機能を発揮するのに 十分な時間循環中に維持されるように設計できる。 −粒子の寸法によりその中枢血管区画における保持を促進し、末梢または血管 外区画への平衡化が実質的に阻止される。 −粒子に結合するリガンドまたはアンチリガンドに所望の置換基をポリマー構 造に導入できる。 −所望の特性をもつリガンドまたはアンチリガンド-粒子結合が得られる（例 えば血清ビオチニダーゼ耐性によって粒子-ビオチンクリアリング剤からのビオ チン代謝物の放出が減少する）。 −複数のリガンドまたはアンチリガンドを粒子に結合することができ、循環タ ーゲティング剤-リガンドまたはアンチリガンド抱合体の最適な架橋と架橋種の 有効なクリアランスを得ることができる。この利点は、貯蔵中及びin vivo投与 時に粒状の凝集が生じないように注意するともっとも良く達成される。 動脈に挿入したタンパク性またはポリマー性のマルチループ装置によりNR-LU- 13-アビジンのクリアランスを促進することもできる。ビオチンで誘導化した合 成ポリマーまたはタンパク質繊維の細いループから構成されるカテーテル様装置 を主要な動脈（例えば大腿動脈）に挿入し、NR-LU-13-アビジンを捕獲する。総 血液量は70秒毎に主要動脈を流れるので、in situクリアリング装置は短時間で 循環NR-LU-13-アビジンを低減させるのに有効である。この装置は、NR-LU-13-ア ビジンがRESを介してプロセシングされず、NR-LU-13-アビジンの除去が制御可能 で測定可能であり、結合能の低下しない新しい装置を必要に応じて挿入可能であ るという利点を提供する。この方法は本発明の動脈内投与を行う態様でも有用で ある。 インターナリゼーションを誘発せずに循環からNR-LU-13-アビジンをクリアす る別の方法としては、リポソーム、IgM及び腫瘍部位に容易に透過できない寸法 のその他の分子等のビオチン化高分子量分子を投与する方法がある。このような ビオチン化高分子量分子がNR-LU-13-アビジンと凝集すると、凝集複合体はRESを 介して循環から容易にクリアされる。 実施例Ｘ アビジン架橋による治療薬インターナリゼーションの強化 多価アビジンが２個以上のビオチン分子（またはキレート-ビオチン包合体） と架橋する能力を使用して治療薬のデリバリーを改善すると有利である。より具 体的には、アビジン架橋はターゲット細胞表面に架橋複合体のインターナリゼー ションを誘発する。 ビオチン化NR-CO-04(リシン)を上記実施例IV.Aに記載した方法に従って調製す る。ドキソルビシン-アビジン抱合体は標準的な抱合化学により調製する。ビオ チン化NR-CO-04をレシピエントに投与し、循環からクリアさせる。放射免疫療法 の通常の技術者であれば、ビオチン化NR-CO-04の腫瘍局在化及び循環からのクリ アランスに最適な時間を容易に決定することができる。そのような時点でドキソ ルビシン-アビジン抱合体をレシピエントに投与する。ドキソルビシン-アビジン 抱合体のアビジン部分は細胞表面上でビオチン化NR-CO-04と架橋し、複合体のイ ンターナリゼーションを誘発する。こうしてドキソルビシンはより有効にターゲ ット細胞にデリバリーされる。 第１の代替的なプロトコルでは、標準的な３段階プレターゲッティング方法を 使用して腫瘍ターゲット細胞への薬剤の細胞内デリバリーを強化する。前記と同 様に、ビオチン化NR-LU-05に次いで（血中クリアランスのためと、ターゲット細 胞結合ビオチン化抗体にサンドイッチの中間層を形成するために）アビジンを投 与する。その直後のビオチン化NR-LU-05-アビジン複合体のインターナリゼーシ ョン前にメトトレキセート-ビオチン抱合体を投与する。 第２の代替的なプロトコルでは、ビオチン化NR-LU-05をさらにメトトレキセー トと共有結合させる。次いでアビジンを投与して複合体のインターナリゼーショ ンを誘発し、腫瘍ターゲット細胞への薬剤の細胞内デリバリーを強化する。 第３の代替的なプロトコルでは、NR-CO-04-アビジンをレシピエントに投与し 、循環からクリアさせ、ターゲット部位に局在させる。その後、ポリビオチン化 種（例えば上記実施例IV.Bに記載したようなビオチン化ポリ-L-リシン）を投与 する。このプロトコルでは、デリバリーすべき薬剤を抗体-アビジン成分または ポリビオチン化種のどちらに共有結合してもよい。ポリビオチン化種は(薬剤)- 抗体-アビジン-ポリビオチン-(薬剤)複合体のインターナリゼーションを誘発す る。 実施例XI ２段階in vivoプレターゲッティングのための ターゲッティング部分-アンチリガンド抱合体 A．SMCC誘導化ストレプトアビジンの調製 ストレプトアビジン31mg(0.48μmol)をPBS 9.0mlに溶解し、3.5mg/mlの最終溶 液を調製した。0.5Mホウ酸バッファー(pH8.5)0.9mlを加えて溶液のpHを8.5に調 整した。SMCCのDMSO溶液(3.5mg/ml)を調製し、この溶液477μl(4.8μmol)をタン パク質溶液に攪拌しながら滴下した。30分間撹拌した後、溶液をG-25(PD-10，Ph armacia，Piscataway，New Jersey)カラムクロマトグラフィーにより精製し、未 反応または加水分解したSMCCを除去した。精製SMCC誘導化ストレプトアビジンを 単離した(28mg，1.67mg/ml)。 B．DTT還元NR-LU-10の調製 PBS 15.0ml中のNR-LU-10 77mg(0.42μmol)に0.5Mホウ酸バッファー(pH8.5)1.5 mlを加えた。400mg/ml(165μl)のDTT溶液をタンパク質溶液に加えた。室温 で30分間撹拌後、還元抗体をG-25サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した 。精製DTT還元NR-LU-10を得た(74mg，2.17mg/ml)。 C．SMCC-ストレプトアビジンとDTT還元NR-LU-10の抱合 DTT還元NR-LU-10(63mg，29ml，0.42μmol)をPBS 44.5mlで希釈した。SMCC-ス トレプトアビジンの溶液(28mg，17ml，0.42μmol)をNR-LU-10の撹拌溶液に迅速 に加えた。反応混合物中の合計タンパク質濃度は1.0mg/mlであった。反応の進 後に5mMの最終濃度まで固体四チオン酸ナトリウムを加えるこにとより反応を停 止した。 D.抱合体の精製 小規模の反応では、HPLC Zorbax(調製用)サイズ排除クロマトグラフィーを使 用して（ストレプトアビジンで）モノ置換及び／またはジ置換された抱合体を得 た。所望のモノ置換及び／またはジ置換抱合体生成物は14.0〜14.5分(流速3.0ml /min)で溶出し、未反応NR-LU-10は14.5〜15分で溶出し、未反応誘導化ストレプ トアビジンは19〜20分で溶出した。 大規模な抱合反応では、DEAEイオン交換クロマトグラフィーを使用してモノ置 換及び／またはジ置換付加物を単離することができる。粗抱合体混合物を濃縮後 、ホウ酸ナトリウムバッファー(pH8.6)中2.5%キシリトールでカラムを溶離する ことにより遊離ストレプトアビジンを除去した。その後、水酸化ナトリウムでpH 8.6に調整した20mMジエタノールアミン中の増加する塩勾配を使用して、結合し た未反応抗体と所望の抱合体をカラムから逐次溶出させた。 E.抱合体の特性決定 1.小規模精製に関して上述したようにHPLCサイズ排除を実施した。 2.非変性条件下で5%ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGE分析を実施した 。評価しようとする抱合体はSDSを含むサンブルバッファー中で煮沸せず、スト レプトアビジンが15kDサブユニットに解離しないようにした。モノ及びジ置換抱 合体に対応する２つの生成物のバンドがゲル上に観察された。 3.例えば競合結合ELISAにより遊離抗体と比較した免疫反応性を評価した。得 られた値は遊離抗体の10%以内であった。 4.例えば既知量の抱合体をp-[125I]-ヨードベンゾイルビオシチンで滴定する ことによりビオチン結合能を評価した。標識ビオシチン４当量を添加すると、ビ オチン結合部位の飽和が観察された。 5.反応生成物を特性決定するためには、例えば血清クリアランスプロフィル、 抱合体が抗原陽性腫瘍をターゲットする能力、抱合体の経時的腫瘍保持及びビオ チン化分子が腫瘍でストレプトアビジン抱合体と結合する能力等の試験を含むin vivo試験が有用である。これらのデータによると、天然NR-LU-10完全抗体と同 様の血中クリアランス特性と、天然NR-LU-10以上の腫瘍取り込み及び保持特性と を示す1:1ストレプトアビジン-NR-LU-10完全抗体が合成により形成されたことが 容易に判断される。 例えば、図３は天然NR-LU-10完全抗体の対照プロフィルと比較したNR-LU-10- ストレプトアビジン抱合体(LU-10-StrAv)の腫瘍取り込みプロフィルを示す。LU- 10-StrAvはストレプトアビジン成分のみで放射性標識され、LU-10-StrAvはNR-LU -10完全抗体自体と同程度に効果的にターゲット細胞に局在化することを明白に 示した。 実施例XII ２段階in vivoプレターゲティング 実施例Ｉの186Re-キレート-ビオチン抱合体(Re-BT)(MW≒1000; 比活性＝１〜2 mCi/mg)と上記実施例VIIに記載したようなビオチン-ヨウ素-131小分子であるPIP -ビオシチン(PIP-BT，MW＝約602;比活性＝0.5〜1.0mCi/mg)を上記実施例Ｖに記 載したように動物モデルで３段階プレターゲティングプロトコルで試験した。Re -BTと同様に、PIP-BTはアビジンと十分に結合する能力をもち、血液から迅速に クリアされ、血清半減期は約５分間である。本明細書中に記載する２段階プレタ ーゲティング実験では両者分子に等価の結果が観察された。 NR-LU-10抗体(MW≒150kD)を(上記実施例XIに記載したように)ストレプトアビ ジン(MW≒66kD)と包合し、(上記実施例IV.AにNR-LU-10の放射性ヨウ素化につい て記載したように)125I/PIP-NHSで放射性標識した。実験プロトコルは以下の通 りであった。 時刻０ NR-LU-10-StrAv抱合体200μgを(i.v.)注射。 24〜48時間後 60〜70倍モル過剰の放射性標識ビオチニル分子を(i.v.)注射。 放射性標識ビオチニル分子の注射から２、６、24、72、120時間後に生体分布試 験を実施した。 NR-LU-10-ストレプトアビジンはLS-180動物モデルで血中クリアランスと腫瘍 取り込みの非常に安定したパターンを示した。代表的プロフィルを図４に示す。 LU-10-StrAv抱合体をターゲット細胞部位に少なくとも24時間局在化させた後にP IP-BTまたはRe-BTを投与すると、治療用放射性核種の腫瘍取り込みは絶対量及び 迅速さの両者とも高い。LU-10-StrAv(I-125)投与から37時間後にPIP-BTを投与す ると、腫瘍取り込みは40時間の時点で500pMOL/Gを上回り、LU-10-StrAv投与から 45時間後に約700pMOL/Gのピークに達した。 このように抗体ターゲティング部分と同等の化学量論量の小分子治療薬が腫瘍 にほぼ瞬時に取り込まれるので、治療用放射性核種をその最高比活性で容易に利 用できる。また、LU-10-StrAv抱合体に結合していない放射性核種が迅速にクリ アされるので、直接標識した抗体抱合体で観察される緩慢な腫瘍蓄積相を排除す ることにより、ターゲティング比（腫瘍：血液）を増加することができる。放射 性核種腫瘍保持のパターンは完全抗体のパターンであり、非常に安定している。 ２段階プレターゲティング法と漸減モル用量の放射性標識ビオチニル分子を使 用する実験も実施した。キャリアを加えない（高比活性）用量の放射性標識ビオ チニル分子で約20%ID/Gの取り込み値に達した。飽和用量未満で循環LU-10-StrAv が血液区画内で有意量の投与放射性標識ビオチニル分子と結合するのが観察され た。 実施例XIII アシアロオロソムコイドクリアリング剤及び２段階プレターゲティング ターゲティング比（腫瘍：血液）を最大にするために、ターゲット部位におけ るリガンド結合能を悪化せずにターゲティング部分-アンチリガンド抱合体(例え ばLU-10-StrAv)の血液プールをクリアすることが可能なクリアリング剤を探し た。このような物質として、循環LU-10-StrAvと抱合するためにアビジン-ビオチ ン相互作用を利用するビオチン化アシアロオロソムコイドを試験した。 A.オロソムコイドの誘導化 160mM NaClを含有する0.1M酢酸ナトリウムバッファー(pH5.5)3.5mlにヒトオロ ソムコイド(Sigma N-9885)10mgを溶解した。脱イオン(D.I.)水中の2%(w/v)CaCl 溶液70μlを加え、4.6U/mlノイラミニダーゼ(Sigma N-7885)11μlを加えた。 過装置(Amicon，Danvers，Massachusetts から入手可能)でPBS 2容量と交換した 。上記実施例IVに記載したようにPIP技術を用いてアシアロオロソムコイド及び オロソムコイド出発物質をI-125 で放射性標識した。 ２種の放射性標識調製物を雌BALB/cマウス(20〜25g)にi.v.（静脈）注射し、 投与から５分、10分、15分、30分、１時間、２時間及び４時間後に各群３匹のマ ウスの眼窩後方で逐次放血させることにより血中クリアランスを評価した。この 実験の結果を図５に示すが、アシアロオロソムコイドはそのオロソムコイド対応 物よりも迅速にクリアする。 さらに、各化合物を投与した２匹の動物を投与から５分後に屠殺し、制限的に 生体分布させた。これらの結果を図６に示す。これらのデータの最も顕著な特徴 は、血中濃度の差（オロソムコイドの78%に対してアシアロオロソムコイドの0.4 %）と、他の組織に対する肝臓(86%)中のアシアロオロソムコイド取り込みの特異 性である。 B.アシアロオロソムコイドクリアリング剤及びオロソムコイド対照のビオチン 化 0.2M炭酸ナトリウムバッファー(pH9.2)100μlをPIP-125標識オロソムコイド2m g(PBS 1.00ml中)とPIP-125標識アシアロオロソムコイド2mgに加えた。次にNHS- アミノカプロン酸ビオチンの1.85mg/ml DMSO溶液60μlを各化合物に加えた。反 応混合物を攪拌し、室温で45分間放置した。反応混合物をサイズ排除カラムクロ マトグラフィー(PD-10，Pharmacia)により精製し、PBSで溶出した。1.2ml分画を 取り出したところ、分画４及び５は照射した放射能の大部分(＞95%)を含んでい た。ストレプトアビジン-アガロースビーズ(Sigma S-1638)またはペレット をPBSで洗浄し、各ビオチン化放射性標識タンパク質20μgをビーズ400μl及びPB S 400μlに加え、20秒間攪拌し、14,000rpmで５分間遠心分離した。上清を取り 出し、ペレットをPBS 400μlで洗浄した。この洗浄手順をさらに２回繰り返し、 上清をあわせて線量計に入れ、それぞれのペレットに対して定量した。値を下表 ４に示す。 C.タンパク質-ストレプトアビジンin vivo結合 ビオチン-アシアロオロソムコイドが循環LU-10-StrAv抱合体とin vivo結合し て該抱合体を血液中から除去する能力を評価した。雌BALB/cマウス(20〜25g)にL U-10-StrAv抱合体200μgをi.v.注射した。抱合体投与から25時間後にクリアリン グ剤(200μl PBS - グループ1; 400μg 非ビオチン化アシアロオロソムコイド - グループ2; 400μg ビオチン化アシアロオロソムコイド -グループ3; 200μg ビ オチン化アシアロオロソムコイド -グループ4)を投与した。第５のグループには 、ビオチンを注射する前に飽和させておいたPIP-I-131-LU-10-StrAv抱合体を投 与した(グループ５)。400μg用量はLU-10-StrAv抱合体の初期用量の10;1モル倍 のクリアリング剤に相当し、200μg用量は5:1モル倍に相当した。飽和PIP-I-131 -LU-10-StrAv抱合体は、LU-10-StrAv 2mgに10倍モル過剰のD-ビオチンを加えて 生成した後、G-25 PD-10カラムでサイズ排除精製した。 各群から３匹のマウスを0.17、１、４及び25時間後(クリアリング剤注射前)と 27、28、47、70及び90時間後に上述のように逐次放血させた。各群から別の２匹 の動物をクリアリング剤投与から２時間後に屠殺し、制限的な生体分布をさせた 。 血中クリアランスデータを図７に示す。これらのデータは、グループ３及び４ の循環LU-10-StrAv放射能が対照グループ１、２及び５で得た値に比較して迅速 且つ有意に低下したことを示す。循環抗体-ストレプトアビジン抱合体の絶対減 少率は対照に比較して約75%であった。 生体分布データを図８に表形式で示す。生体分布データは、肝臓、腎臓及び腸 を除く全組織でグループ３及び４の抱合体の濃度の低下を示し、これはビオチン 化アシアロオロソムコイドと複合体化後に抱合体に結合した放射性標識の分解及 び排泄に一致する。 さらに、(血清＋PBS中で実施したアッセイで)心臓穿刺により血清サンプルか ら残留循環抱合体を得、血清中に残存する機能的ストレプトアビジンの指標であ るビオチン（アガロースビーズに固定化したビオチン）と結合する能力を分析し た。グループ１動物血清は固定化ビオチンに約80%結合した抱合体放射性標識を 示した。(クリアリング剤投与から２時間後に)残留している注射用量百分率に固 定化ビオチンと結合することが可能な残留百分率(残留機能的抱合体の量)を乗じ ることにより残留循環放射性標識値を補正すると、図９に示すグラフが得られる 。ビオチン化アシアロオロソムコイド200μgを投与すると、血清ビオチン結合能 は50分の1に減少し、腫瘍動物での予備試験で架橋は示されず、予備局在化LU-10 -StrAv抱合体は腫瘍から除去されなかった。ターゲット細胞部位におけるビオチ ン結合能を低下させずに循環ターゲティング部分-アンチリガンドを除去すると 共に、ターゲティング部分-アンチリガンドの投与量の増加により腫瘍への放射 線量が増加することにより、従来の放射免疫療法を使用して通常達せられるより も腫瘍への絶対放射線量が増加すると同時に非腫瘍細胞への毒性が低下する。 次に低用量のアシアロオロソムコイド-ビオチンを評価する実験を実施した。 同一動物モデルにLU-10-StrAv抱合体の投与から24時間後に用量50、20及び10μg のアシアロオロソムコイド-ビオチンを注射した。順次放血させた動物からのデ ータを図10に示し、クリアリング剤投与から２時間後に屠殺した動物からのデー タをそれぞれ図11A(血中クリアランス)及び11B(血清ビオチン結合)に示す。50及 び20μgの用量のアシアロオロソムコイド-ビオチンは循環LU-10-StrAv抱 合体濃度を有効に約65%低下させ(図11A)、固定化ビオチンとの結合の補正後では 、ビオチン結合能をもつ循環中に注射用量の3%しか残存しなかったが、対照動物 では注射量の約25%が残留した(図11B)。(循環LU-10-StrAv抱合体に対して1:1の 化学量論量に達する)低用量であっても、アシアロオロソムコイド-ビオチンはビ オチン-アビジン相互作用に依存するin vivo結合により循環ストレプトアビジン 含有抱合体の血中濃度を低下させるのに非常に有効であった。 実施例XIV PIP-ビオシチンの腫瘍取り込み 上記実施例VIIに記載したように調製したPIP-ビオシチンを試験し、そのin vi vo での行方を判定した。以下のデータは、上記実施例XIに記載したようにI-125 標識NR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体200μg(950pmol)を時刻０で投与した腫 瘍ヌードマウス(試験の７日前に100mg LS-180腫瘍異種移植片を皮下移植)での実 験に基づく。24時間後にマウスにPIP-I-131-ビオシチン(40μCi)と、42μg(69,7 67pmol)、21μg(34,884pmol)、5.7μg(9468pmol)、2.85μg(4734pmol)または0.5 μg(830pmol)の用量に対応する量の冷キャリアPIP-I-127-ビオシチンをi.v.注射 した。PIP-ビオシチン注射から４時間後に腫瘍を切除し、放射能を計数した。 多いほうから３種の用量は約600pmol/gのPIP-ビオシチン腫瘍局在化を生じた 。多いほうから２種の用量を投与した組織で組織分析を行ったところ、腫瘍結合 ストレプトアビジンの飽和に達したことが判明した。5.7μgの用量で観察された 同等の腫瘍局在化もストレプトアビジン飽和を示している。他方、少ないほうか ら２種の用量ではNR-LU-10-ストレプトアビジン抱合体の局在化は同等である(全 グループの腫瘍は抱合体について平均約40%ID/Gであった)にも拘わらず、PIP-ビ オシチンの絶対腫瘍局在が低かった。 最低用量グループ(0.5μg)はPIP-I-131-ビオシチンの高効率腫瘍デリバリーを 示し、効率は経時的に増加した。120時間の時点(PIP-ビオシチン投与から96時間 後)で85.0% ID/Gのピーク取り込みが観察された。また、%IDで表したPIP-ビオシ チンの絶対量も全サンプル抽出時点にわたって腫瘍中で連続的に増加した。 168時間の時点で% ID/Gで表した取り込みが減少したのは、120時間と168時間の 時点の間で腫瘍が有意に増殖したためであった。 さらに、同一の腫瘍に時間的に間隔を置いて順次投与したNR-LU-10-ストレプ トアビジン抱合体(LU-10-StrAv)とPIP-ビオシチンの同時の局在化を試験した。P IP-ビオシチンによる腫瘍における放射能の局在化は、抗体-ストレプトアビジン 抱合体(LU-10-StrAv)と異なる取り込み及び保持パターンを示した。LU-10-StrAv は天然NR-LU-10抗体の組織試験と等価の特徴的腫瘍取り込みパターンを示し、投 与後24〜48時間で40% ID/Gのピーク値に達した。これに対して、PIP-ビオシチン は腫瘍での迅速な初期蓄積を示し、PIP-ビオシチン投与後24時間までにLU-10-St rAvの場合よりも高い濃度に達した。さらに、抱合体に結合した放射能の濃度が 減少し始めると、PIP-ビオシチンの局在化は96時間まで増加し続けた。これらの 時点で循環PIP-ビオシチンの量がLU-10-StrAvよりも僅かに多いことはこの現象 を説明するのは不十分なようであった。 腫瘍中のPIP-ビオシチン対LU-10-StrAvの比は実験の間増加し続けたが、血中 比は減少し続けた。この結果は、血液から腫瘍へのターゲティング部分含有抱合 体(とこれに結合したPIP-ビオシチン)の連続的な結合と、それに続くPIP-ビオシ チン及び抱合体の異なる分解プロセスに一致する。（ターゲティング部分に結合 した放射性標識に比較して）ストレプトアビジン抱合体成分に結合した放射性標 識は代謝分解の器官で増加した保持を示したので、ストレプトアビジンに結合し たPIP-ビオシチンは腫瘍細胞により選択的に保持されると思われる。放射性標識 はターゲット細胞部位に保持されるので、これらの部位に放射能がより多量に蓄 積する。 PIP-ビオシチンのAUCtumor/AUCbloodは抱合体の２倍を上回る(1.95に対して4. 27であり、ここでAUCは「曲線下面積」を意味する)。さらに、PIP-ビオシチンの 絶対AUCtumorは抱合体のほぼ２倍である(4629に対して9220)。この結果、腫瘍へ の放射線量の増加が達せられた。 実施例XVI クリアリング剤評価実験 下記実験中、腫瘍をもたないマウスの実験は、雌BALB/cマウス(20〜25g)を用 いて実施した。腫瘍をもつマウスの実験は、雌ヌードマウスにLS-180腫瘍細胞を 皮下注射し、７日後にマウスは50〜100mg腫瘍異種移植片を示した。これらの実 験で使用したモノクローナル抗体はNR-LU-10であった。NR-LU-10-ストレプトア ビジン抱合体を放射性標識した場合には、本明細書に記載の手順を使用してI-12 5で放射性標識した。PIP-ビオシチンを放射性標識した場合には、本明細書に記 載の手順を使用してI-131又はI-125で放射性標識した。 A.後に投与する放射性標識ビオチンリガンドからの循環放射能を低下させるこ とにおけるアシアロオロソムコイド-ビオチン(AO-Bt)の有用性 LS-180結腸腫瘍異種移植片をもつマウスにNR-LU-10抗体-ストレプトアビジン( MAb-StrAv)抱合体200μgを時刻0で注射し、腫瘍に22時間予備局在化させた。こ の時点でAO-Bt 20μgを1群の動物に投与した。2時間後に放射性同位体を有し、 リガンドを含む小分子(本実施例Bに記載するように調製したPIP-ビオチン-デキ ストラン)90μgを前記マウス群とAO-Btを投与しなかった1群に投与した。放射性 標識の腫瘍取り込みと血液からのクリアランスに関するこの実験の結果、血中ク リアランスが強化される一方で放射性標識ビオチンを含む抱合体の腫瘍ターゲテ ィングは維持され、ターゲットへのデリバリー量／血清中の局在量を全体として 改善できることが判明した。クリアリング剤を用いた場合のAUCtumor/AUCblood は6.87であったが、クリアリング剤を用いない場合のAUCtumor/AUCbloodは4.45 であった。循環MAb-StrAv抱合体の血中クリアランスはクリアリング剤を使用す ることによって強化された。別の動物群でクリアリング剤を放射性標識したとこ ろ、非常に低濃度(合計488pmolの用量で1.7pmol/g(0.35%ID/g))でしか腫瘍と直 接結合せず、腫瘍と結合したMAb-StrAvが後に投与する放射性標識リガンドと結 合する能力をさほど悪化させないことが判明した。 B.PIP-ビオチン-デキストランの調製プロトコル Wilbur et al.，J．Nucl．Med.，30:216-226，1989に従って調製したN-スク シンイミジルp-I-125-ヨードベンゾエートの乾燥残渣(1.87mCi)にPBS 0.3ml及び 1M炭酸ナトリウム(pH9.25)0.15ml中のビオチン-デキストランリシン固定剤(BDLF ，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouriより入手可能、分子量70,000ダルト ン、約18ビオチン/分子)3.0mgの溶液を加えた。 C.AO-Btの用量最適化 上記のようにStrAv-MAbを投与した腫瘍マウスに用量を増加させながらAO-Btを 注射した(0μg、20μg、50μg、100μg及び200μg)。1I-131-PIP-ビオシチン(AO -Bt投与から2時間後に5.7μg投与)の腫瘍取り込みを試験した。AO-Btの用量の増 加はMAb-StrAvの腫瘍局在化に何ら影響を与えなかった。AO-Bt投与から44時間後 に得られたデータは、効果が同様に失われたことを示した。このデータは、ビオ チン化抗体後にアビジンを投与した場合に認められたように、AO-Bt用量が腫瘍 表面でMAb-StrAvと架橋せず、インターナリゼーションを生じないことを示す。 AO-Btの用量が高いと、PIP-ビオシチン腫瘍局在化は抑制された。この効果はA O-Btを誘導化するために使用したビオチンの再分解と腫瘍への分布に起因する可 能性が最も高い。最適な腫瘍対血液比(腫瘍重量1ｇ当たりの放射性標識リガンド の注射用量％を血液重量1g当たりの放射性リガンドの注射用量%で除した値)は50 μgのAO-Bt用量で達せられた。50μg AO-Bt用量を使用するプロトコルの完了後 に実施した生体分布の結果、放射性標識は全ての非ターゲット組織中で低濃度に 保たれることが判明した（血中1.2pmol/g;尾中3.5pmol/; 肺中1.0pmol/g;肝臓中 2.2pmol/g;脾臓中1.0pmol/g;胃中7.0pmol/g;腎臓中2.7pmol/g;及び腸中7.7pmol/ g）。腫瘍中では99.3pmol/gであるので、これらの結果は腫瘍以外の全部位でPIP -ビオシチン生体分布がMAb-StrAv生体分布から有効に分離されることを示す。こ の分離は50μg過剰の全クリアリング剤投与量でも生じた。PIP-ビオシチンの腫 瘍局在化の低下は、50μg過剰のクリアリング剤投与量の投与の有意な結果であ った。さらに、投与から44時間後の非ターゲット組織中のPIP-ビオシチンの量は PIP-ビオシチン単独投与による局在化と同様であり(但し腫瘍ではPIP-ビオシチ ンを単独投与した場合には僅かな蓄積が認められた)、有効な分離を示した。 D.最適なクリアリング剤用量についての別の検討 腫瘍を有するマウスに上記のように時刻0でMAb-StrAvを投与し、22時間後にAO -Bt 50μg、25時間後にI-131-PIP-ビオシチン545μCiを投与した。全身放射能を 測定し、クリアリング剤を投与しなかった動物と比較した。AO-Bt 50μgは、循 環MAb-StrAv抱合体と結合することにより妨害されない動物から注射放射能をク リアするのに有効であった。I-131-PIP-ビオシチンの腫瘍取り込みは50μgのク リアリング剤用量で維持され、AUCtumor/AUCbloodは30:1であり、このモデルを 使用して従来の抗体-放射性同位体療法で得られるAUCtumor/AUCbloodの約15倍良 好であった。 E.ヒト血清アルブミン(HSA)のガラクトース及びビオチン誘導化 安価且つ非免疫原性であるという利点を示すことからHSAを評価した。AOに関 して上述したのと同様の化学により、ビオチン濃度を変えて(1〜約9ビオチン/分 子)HSAを誘導化した。より具体的には、Sigma Chemical Co.から入手可能なHSA の溶液(PBS中5〜10mg/ml)に10% v/v 0.5M硼酸ナトリウムバッファー(pH8.5)を加 えた後、NHS-LC-ビオチン(Sigma Chemical Co.)のDMSO溶液を所望のモル供給比( 反応体の相対モル当量)で撹拌溶液に滴下した。反応混合物中の最終DMSO百分率 は5%を越えるべきでない。室温で1時間撹拌後、反応は完了した。HSA上へのビオ チンの取り込み効率90%が一般に観察された。従って、LC-ビオチンのNHSエステ ル3モル当量を導入した場合には、約2.7ビオチン/HSA分子が得られた。G-25サイ ズ排除クロマトグラフィーを用いてビオチン誘導化HSAから未反応ビオチン試薬 を除去した。あるいは、粗生成物を直接ガラクトシル化してもよい。予めビオチ ン化されていないデキストランをビオチン化する場合にも同一の化学を適用でき る。 次に12〜15ガラクトース/分子でHSA-ビオチンを誘導化した。ビオチン化HSAの ガラクトース誘導化は、Lee，et al.，Biochemistry，15: 3956，1976の手順に 従って実施した。より具体的には、シアノメチル-2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-1 -チオ-D-ガラクトピラノシドの0.1Mメタノール溶液を調製し、メタノール中10%v /v 0.1M NaOMeと１２時間反応させ、反応性ガラクトシルチオイミデートを生成 した。ビオチン化HSAのガラクトシル化は、300倍モル過剰の反応性チオ イミデートからの無水メタノールを最初に蒸発させることにより開始した。10%v /v 0.5M硼酸ナトリウムで緩衝したPBS中のビオチン化HSAを油状残渣に加えた。 室温で2時間撹拌後、混合物を4℃で12時間保存した。次にガラクトシル化HSA-ビ オチンをG-25サイズ排除クロマトグラフィーまたはバッファー交換により精製し 、所望の生成物を得た。デキストランのガラクトシル化にも同一の化学が利用可 能である。HSA上へのガラクトースの取り込み効率は約10%である。 24時間前にStrAv-MAb 200μgまたはPBS 200μlを予め投与しておいたマウスに 12〜15のガラクトース残基と9個のビオチンを含むガラクトース-HSA-ビオチン(G -HSA-B)70μgを投与した。その結果、G-HSA-BはStrAv-MAbを循環から除去するの に有効であることが判明した。また、G-HSA-Bの薬剤動力学は循環MAb-StrAvの有 無を問わず撹乱されず且つ迅速である。 F.非タンパク性クリアリング剤 約18ビオチン/分子で予め誘導化し且つ同数の遊離１級アミンを有する分子量7 0,000ダルトンの市販される形態のデキストランを試験した。１級アミン部分は 、HSAをベースとするクリアリング剤について上述した手順に実質的に従って約9 ガラクトース/分子の濃度でガラクトシル化試薬で誘導化した。ガラクトース対H SAのモル当量供給比は約300:1であり、ガラクトースの約3分の1が活性形態に変 換された。次に、24時間前にMAb-StrAv抱合体200μgを静脈内投与しておいた1群 のマウスにガラクトース-デキストラン-ビオチン(GAL-DEX-BT)40μgをi.v.注射 し、別の同様の群のマウスにGAL-DEX-BT 80μgを注射した。GAL-DEX-BTはStrAv- MAb抱合体を迅速且つ有効にクリアし、クリアリング剤投与から4時間未満で循環 抱合体の66%を越える量を除去した。存在する循環StrAv抱合体の化学量論量の1. 6倍(40μg)及び3.2倍(80gμ)に対応するクリアリング剤用量の両方で同等の効果 が観察された。 G.G-HSA-Bクリアリング剤の用量変動 MAb-StrAv抱合体200μgを投与し、24時間後にクリアリング剤を投与し、２時 間後にPIP-ビオシチン5.7μgを投与するという基本フォーマットに従って用量変 動試験を行った。 用量変動試験はG-HSA-Bクリアリング剤を用いて実施し、9ビオチン/分子及 び12〜15ガラクトース残基／分子の負荷から開始した。MAb-StrAv抱合体200μg 用量投与から24時間後に20、40、70及び120μgの用量を投与した。クリアリング 剤投与から2時間後にI-131-PIP-ビオシチン5.7μgを投与した。PIP-ビオシチン の腫瘍取り込み及び血液保持をその投与から44時間後(クリアリング剤投与から4 6時間後)に調べた。その結果、G-HSA-Bを投与することにより40μg以上の全ての 用量でPIP-ビオシチンの血中保持の最下点が達成されることが判明した。他方、 各G-HSA-B用量が増加するにつれてPIP-ビオシチンの腫瘍結合が明らかに用量依 存的に低下した。MAb-StrAv抱合体の腫瘍局在化に影響を及ぼす用量依存性効果 は観察されなかったので、このデータは代謝されたクリアリング剤からのビオチ ンの放出により腫瘍と結合したMAb-StrAv抱合体が比較的により高度に阻止され ることを示すと解釈された。腫瘍／血液比のプロットに関してアシアロオロソム コイドクリアリング剤について上述したのと同様の結果がG-HSA-Bでも認められ 、約40μg用量で血中クリアランスと腫瘍保持の間の最適なバランスが生じた。 このクリアリング剤により放出可能なビオチンのモル量は高用量時に比較的大 きいので、クリアリング剤の有効性に及ぼすビオチン化の低レベルの効果を評価 する試験を行った。９、５または２ビオチン／分子で誘導化したG-HSA-Bはクリ アリング剤の同一のタンパク質用量でMAb-StrAv抱合体を血液からクリアするこ とができた。全レベルのビオチン化でMAb-StrAvの有効で迅速な血液からのクリ アランスが生じた。 腫瘍を有するマウスで60μg用量の各クリアリング剤を用いて、これらの９、 ５及び２ビオチンで誘導化したクリアリング剤と単一ビオチンG-HSA-Bクリアリ ング剤との比較を行った。この実験の結果、各クリアリング剤はクリアリング剤 投与から2時間後にMAb-StrAv抱合体の血中クリアランス及び腫瘍保持に実質的に 同等に有効であることが判明した。単一ビオチンを含むG-HSA-Bを、PIP-ビオシ チンの予備局在化されたMAb-StrAv抱合体との腫瘍結合を維持しなから血液中で 後で投与されるビオチン化小分子(PIP-ビオシチン)の結合を低下する能力につい て試験した。PIP-ビオシチン投与から44時間後に測定したところ、MAb-StrAv抱 合体とPIP-ビオシチンの両者の腫瘍局在化は広い用量範囲(90〜180μ g)にわたって1ビオチン/分子を含むG-HSA-Bにより良好に維持された。単一ビオ チンG-HSA-Bクリアリング剤の用量を増加することにより、腫瘍局在をほぼ一定 に維持しながらPIP-ビオシチンの血中保持の漸減が達せられ、このクリアリング 剤はビオチン化レベルが低いものが好適であることが判明した。好適であるのは 、単一ビオチンG-HSA-Bクリアリング剤が広い用量範囲にわたってMAb-StrAvをク リアするのに有効であり（患者毎に最適用量を滴定する必要を排除する可能性を 有する）、全身の循環に放出される競合ビオチンが高ビオチン負荷レベルの同じ クリアリング剤よりも少いと思われることによる。 クリアリング剤から放出されるビオチンが、活性剤-ビオチン抱合体の予備局 在化ターゲティング部分-ストレプトアビジン抱合体に対する結合に及ぼす効果 を低下させる別の方法は、保持リンカーを用いてタンパク質またはポリマーまた は他の主要クリアリング剤成分をビオチンに結合することである。保持リンカー は、ペプチド結合を開裂する物質に対して耐性を示す化学構造を有し、場合によ ってはリソソームなどの代謝空間に存在するとプロトン化される。本発明の好適 な保持リンカーは上記特徴の両者を有するD-アミノ酸の短鎖または小分子である 。本発明の保持リンカーの例は塩化シアヌルであり、これはタンパク性主要クリ アリング剤成分のリシンのεアミノ基と、（上述の）還元され化学的に修飾され たビオチンカルボキシ部分のアミン部分との間に挿入され、下記構造： の化合物を形成することができる。上記化合物が代謝空間で代謝されると、複素 環はプロトン化される。環プロトン化により代謝物はリソソームから出られなく なる。こうして複素環を含むビオチン代謝物は代謝部位に限定されるので、予備 局在化されたターゲティング部分-ストレプトアビジンターゲット部位に関して 活性剤-ビオチン抱合体と競合しない。 G-HSA-B用量変動試験で観察された放射性標識PIP-ビオシチンの腫瘍／血液局 在化を比較した結果、広い用量範囲(90〜180μg)にわたって最適な腫瘍対バック グラウンドターゲティングが達せられることが判明し、その結果、クリアリング 剤用量が多くても有効であると予想された。用量変動実験の別の重要な結果は、 1分子当たり平均1個しかビオチンをもたないG-HSA-Bがアシュウェルレセプター メカニズムを介してのみMAb-StrAv抱合体をクリアすると推測されることであり 、これはMAb-StrAv抱合体とクリアリング剤の架橋及び凝集を生じるにはビオチ ンが少なすぎることによる。このような凝集体は細網内皮系により除去される。 H.G-HSA-Bを用いた腫瘍ターゲティング評価 この実験のプロトコルは以下の通りであった。 時刻0: MAb-StrAv抱合体の400μgを投与し、 24時間後: 1ビオチン及び12〜15ガラクトースを含むG-HSA-B 240μgを投与し 、 26時間後: の6μgを投与する。Lu-177は公知の方法を用いてDOTAキレートと錯化され、かつ DOTAは以下の手順により調製される。N-メチルグリシン（慣用名サルコシン、Si gma chemical Co.から入手可能）をビオチン-NHSエステルとDMF 及びトリエチル アミン中で縮合してN-メチルグリシルビオチンを得た。N-メチルグリシルビオチ ンは次いでEDCI及びNHS で活性化した。得られたNHS エステルは単離せず、その 場で公知の方法（例えば、McMurry el at.，Bioconjugate Chem.，3: 108-117,1 992）で調製可能なDOTA- アニリン及び過剰のピリジンと縮合した。反応溶液は ６０℃１０分間加熱し、次いでエバポレートした。残渣は分取HPLCで精製して[( N-メチル-N-ビオチニル)-N-グリシル]-アミノベンジル-DOTA を得た。 1．（N-メチルグリシル）ビオチンの調製 DMF(8.0ml)及ひトリエチルアミン(0.61ml，4.35mmol)を固体のN-メチルグリシ ン(182mg，2.05mmol)及びN-ヒドロキシ−スクシンイミジルビオチン(500mg， 1.46mmol)に添加した。混合物を油浴上で85℃で1 時間加熱し、その間固体は溶 解して無色透明の溶液となった。溶媒は次いでエバポレートした。黄色油残渣は 氷酢酸で酸性化し、エバポレートしかつ30％MeOH/ETOAc 1% HOAcで溶出する50g シリカを充填した27mmカラム上でクロマトグラフィーにかけ、収率66％で白色固 体(383mg)として生成物を得た。 H-NMR(DMSO): 1.18-1.25(m，6H，(CH2)3)，2.15，2.35(2t's，2H，CH2CO)，2.75 (m，2H，SCH2)，2.80，3.00(2s's，3H，NCH3)，3.05-3.15(m，1H，SCH)，3.95， 4.05(2s's，2H，CH2N)，4.15，4.32(2m's，2H，2CHN's)，6.35(s，NH)，6.45(s ，NH) 2．[(N- メチル-N- ビオチニル)グリシル]-アミノベンジル-DOTA の調製 N-ヒドロキシスクシンイミド(10mg，0.08mmol)及びEDCI(15mg，6.08mmol)を(N - メチルグリシル)ビオチンのDMF(1.0ml)溶液に添加した。この溶液は23℃で64 時間攪拌した。ピリジン(0.8ml)とアミノベンジル-DOTA(20mg，0.04mmol)を加え た。この混合物を油浴上で63℃で10分間加熱し、次いで23℃で4 時間攪拌した。 溶液をエバポレートした。残渣は分取HPLCで精製して27％の収率で白色固体(8mg ，0.01mmol)として生成物を得た。 H-NMR(D2O): 1.30-1.80(m，6H)，2.40，2.55(2t's，2H，CH2CO)，2.70-4.2(コン プレックス多重項)，4.35(m，CHN)，4.55(m，CHN)，7.30(m，2H，ベンゼン水素) ，7.40(m，2H，ベンゼン水素) 腫瘍1g当たり20〜25%の注射用量でLu-177-DOTA-ビオチン小分子の有効なデリ バリーが観察された。これらの値はMAb-StrAv抱合体のデリバリー効率と同等で ある。この非最適化クリアリング剤用量で得られたAUCtumor/AUCbloodは匹敵す る直接のMAb-放射性標識投与で得られる値の300%であった。次の実験は、匹敵す る従来のMAb-放射性標識投与で得られる値の1000% より大きいAUCtumor/AUCbloo d を与えた。さらに、HSAをベースとするクリアリング剤はヒトにおいて低い免疫 原性の程度を示すと予想される。 実施例XVI パリトキシン含有包合体 A.パリトキシン- モノ- オキシアセチル- LC- ビオチン。 トリクロロエチル カルバメート-NH-パリトキシン(troc-NH-パリトキシン)。 パラトキシン（ハワイ・バイオテクノロジー・グループ社、アイエア、ハワイ ）のピリジン溶液にトリクロロエチル- クロロフォーメート（アルドリッチ・ケ ミカル社、ミルウォーキー、ウィスコンシン）を添加する。この溶液を23℃で6 時間攪拌した後、溶媒を減圧下でエバレートする。残査を水に溶解し、CH2Cl2で 洗浄する。水画分を凍結乾燥し、生成物をCM- セファデックスD-25クロマトグラ フィーで精製する。 (トリクロロエチル カルパメート(Troc)-NH)-パリトキシン- オキシアセチル -LC-ビオチン。troc-NH-パリトキシンのDMF 溶液に1.0 当量の水素化ナトリウム を添加し、さらに1.0 当量のヨードアセチル-LC-ビオチンを加える。この懸濁液 を23℃で24時間攪拌した後、水を加えて反応を停止する。0.1M HCl を加えてpH を7 に調節し、trocを脱保護すると（リン酸緩衝液（pH5.5）を用いた水性THF 中の亜鉛使用）最終生成物を与える。 B.パラトキシン- モノ- オキソ-N- アセトアミド- エチルジアミン-N’-（N- メ チル）- グリシル- ビオチン。 N-メチル- グリシル- ビオチン。DMFおよびトリエチルアミン中、N-メチル-グ リシン（慣用名ザルコシン、シグマ・ケミカル社）をビオチン-NHSエステルと縮 合し、N-メチル グリシル- ビオチンを得る。 より詳しく言うと、DMF(8.0ml)およびトリエチルアミン(0.61ml、4.35mmol)を 固体のN-メチル グリシン（182mg、2.05mmol）およびN-ヒドロキシ- スクシン イミジル ビオチン（500mg、1.46mmol）に添加した。この混合物を固体が溶解 し無色透明の溶液になるまで85℃のオイルバスで1 時間加熱した。その後、溶媒 をエバポレートした。黄色の油状残査を氷酢酸で酸性とし、エバポレート後、50 g のシリカを27mmの高さに充填したカラムと溶出液30% MeOH/EtOAc 1% HOAcを用 いたクロマトグラフィーで精製し、収率66%（383 mg）で白色固体の生成物を得 た。 H-NMR(DMSO): 1.18-1.25(m,6H,(CH2)3)，2.15，2.35(2 t's，2H，CH2CO)，2.7 5(m，2H，SCH2)，2.80，3.00(2 s's，3H，NCH3)，3.05-3.15(m，1H，SCH)，3.95 ，4.05(2 s's，2H，CH2N)，4.15，4.32(2 m's，2H，2CHN's)，6.35(s,NH)，6.45 (s，NH) パリトキシン- モノ- オキソ-N- アセトアミド- エチルジアミン-N'-(N- メチ ル）- グリシル- ビオチン。N-メチル- グリシル- ビオチンはガス状HCl を含む 還流メタノール中でエステル化するとメチルエステル、メチル-(N-メチル)グリ シル- ビオチンを与える。このメチルエステルをエチレン・ジアミンに溶解し、 23℃で14時間攪拌すると、ビオチニル- N-メチル- グリシル- エチレン ジアミ ン モノアミドを与える。溶媒（エチレン ジアミン）を減圧下でエバレートす る。トリエチルアミンを含むDMF 中、ビオチニル- N-メチル- グリシル- エチレ ン ジアミン モノアミドのアミノ基をN-ヒドロキシスクシンイミジル ヨード アセテート（アルドリッチ社製のヨード酢酸、N-ヒドロキシスクシンイミドおよ びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)で調製したもの）でアシル化し、アシ ル化ヨード化ビオチン誘導体を生成する。上述のように調製したTroc-NH-パリト キシンを1.0 当量の水素化ナトリウムで脱プロトン化し、ヨード- ビオチン誘導 体、N-(ヨードアセチル)- エチレン- ジアミン-N'-(N- メチル)グリシルビオチ ンでO-アルキル化してエステル、N-(トリクロロエトキシカルボニル)- パリトキ シン- モノ- オキソ- N-アセトアミド- エチレンジアミン- N'-(N-メチル)グリ シルビオチンを生成する。このエステルのトリクロロ- カルバメート基はpH5.5- 7.2 の水性THF 中の亜鉛で切断し最終生成物を与える。 C. カルボキシ- 遊離型パリトキシン-N(Me)-グリシル- ビオチン。 Troc- アミン保護型パリトキシン（troc-NH-パリトキシン）の２つのアミド結 合をpH7.1、37℃の温和な条件下でアミド結合を選択的に切断する化合物である ペプチダーゼ（シグマ・ケミカル社から入手可能）で切断し、遊離したカルボキ シ基を有するパリトキシン分子を得る。この生成物を分取型HPLC- 逆相C-18クロ マトグラフィーで精製する。遊離型のカルボキシ基をEDCIで活性化しビオチニル - N-メチル- グリシル- エチレン ジアミン モノアミドと結合し、N-(trocNH) - パリトキシンアミド- エチレンジアミン-N'-(N-メチル)- グリシル- ビオチン を得る。troc基を水性THF 中亜鉛で切断し最終生成物を得る。 D．C-55 パラトキシン- ビオチン包合体 トリクロロエチル カルバメート- NH- パラトキシン（troc-NH-パラトキシン ）。トリクロロエチル- クロロホルメート（アルドリッチ・ケミカル社から入手 可能）をパラトキシンのピリジン溶液に添加する。この溶液を23℃で6 時間攪拌 し、溶媒を減圧下でエバポレートする。残査を水に溶解し、ジクロロメタンで洗 浄した。水性画分を凍結乾燥し、生成物をCM- セファデックス D-25 クロマトグ ラフィーで精製する。 Troc-NH-パラトキシン-C55-NH-(CH2)5-NH-ビオチン。メタノール（5N HCl/メ タノールを添加してpH6 に調整したもの）中、1.0 当量のtroc-NH-パリトキシン および1 当量のビオチニルペンチルアミン（ピアス・ケミカル社、ロックフォー ド、イリノイから入手可能）を1 当量のNaCNBH3に添加する。この反応混合物を2 3℃で24時間攪拌し、ビオチン化したパリトキシン生成物を得る。 E．パリトキシン- ストレプトアビジン包合体 Troc- アミン保護型パリトキシンの炭素17のアミド結合をpH7.1 および37℃の 温和な条件でアミド結合を選択的に切断する化合物であるペプチダーゼ（シグマ ・ケミカル社から入手可能）で切断し、遊離型カルボキシ基を有するパリトキシ ン分子を得る。この生成物を分取型HPLC- 逆相C-18クロマトグラフィーで精製す る。遊離型のカルボキシ基をEDCIで活性化し、ストレプトアビジン（シグマ・ケ ミカル社から入手可能）に結合してN-troc- パリトキシンアミド- ストレプトア ビジンを得る。troc基は水性THF(>5:1 H2O：THF)中亜鉛で切断して最終生成物 が得られる。 実施例XVII ポリマー- リガンド包合体 ポリリシン（約10,000Dal 分子量、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズ リーから入手可能）およびデキストラン（リシン適合、シグマ・ケミカル社から 入手可能）をSPDPで誘導体化し、サイズ排除クロマトグラフィー（ファルマシア 社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、のPD-10 カラム使用）で未反応のSPDP から精製する。生成したSPDP誘導型付加物をpH4.7 の0.2 M NaOAcバッファ中DTT で還元して遊離型の反応性チオールを生成する。例えば、Carlson et al.，Bio chem.J. ，173 :723-737,1978、に示されているグルコン酸スズから生成したTc-9 9mを添加した。ITLC測定によると15分間でポリリシン付加物によるTc-99mの取り 込みは90% であった。サイズ排除(PD-10)クロマトグラフィーでは放射能の96% はデキストランと共溶出した。これらの結果はキレート化を示している。 実施例XVIII トキシン- ポリマー- リガンド包合体の合成トリコテセン- ポリマー- リガンド包合体 プレターゲティング法におけるビオチン- デキストラン- トリコテセン包合体の 使用を含む実験には以下のものが含まれる： - 実施例ＸＶIIで議論されている技術に従ってビオチン化された70,000ダルトン のデキストラン分子の使用可能なリシンのI-125 PIP NHS エステルを使用したト レース・ラベリングであって、放射能標識したデキストラン ビオチン（デキス トラン*- ビオチンで表される）の生成； - NHS 活性化トリコテセンを用いる残存リシンへのトリコテセン薬剤包合体化 - 固定化アビジンへの薬剤- デキストラン*- ビオチン分子の結合の証明；- マ ウスにおける血清クリアランスの評価。 共有結合した18個のビオチンおよび18個のリシンのεアミノ基を有する分子量 70,000ダルトンのビオチン化デキストランはシグマ・ケミカル社（セントルイス 、ミズーリー）から購入した。この物質を放射性標識するために、2 mlのガラス バイアル中、比活性2200mCi/mmole、4mC のI-125 PIP NHS エステル（ニュージ ャージー、ボストン、マサチューセッツ）のアセトニトリル溶液を窒素気流中で 乾燥させた。このヨウ素化化合物にpH9.0 の1.0 M硼酸ナトリウム溶液0.650 ml に溶解した10mgのビオチン化リシン誘導型デキストラン凍結乾燥物を添加し、室 温で10分間インキュベーションした。反応後放射性ヨウ素化デキストランを1 % モルキュソル（ファルマテク、アラキュア、フロリダ）を含むリン酸緩衝液（す な わち、6.2 Mリン酸ナトリウム、150 mM NaCl、pH7.2）で平衡化したPD-10 カラ ム（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を用いたサイズ排除クロマトグラ フィーで精製した。ビオチン- デキストラン*はこのカラムから比活性0.2mCi/mg および濃度3.5mg/mlで2.4-4.8 mlフラクションに溶出した。 トリコテセンでビオチン- デキストラン*を誘導体化するために0.9 mlのビオ チン- デキストラン*を1 % のモリキュソルを含むpH8.5、0.3 Mのほう酸ナトリ ウム緩衝液1.3 mlで希釈し、次いで攪拌しながら、1.2 mgの2'- デソキシ-2'- アルファ-(N-ヒドロキシスクシンイミジル-3- ジチオプロパン酸)- ロリジンA( すなわち、薬剤/使用可能リシンモル比：2:1)を含有する1.2ml のDMF を添加し た。室温、1.5 時間のインキュベーション後、反応混合物の各1 ml部分標本（ア リコート）を先に示したPBS で平衡化したPD-10 カラムで精製した。収率は85% を越えた。 ビオチン- デキストラン*- トリコテセン分子がアビジンまたはストレプトア ビジンに結合しうることを確認するために、１μgのビオチン- デキストラン*お よび1 μgのビオチン- デキストラン*- トリコテセンを、150 mMのNaClを含むpH 6.3 の0.2 M Pi バッファ0.2 ml中、アガローズ・ビーズ（シグマ・ケミカル、 セントルイス、ミズーリー）に不溶化したアビジン1 ユニットと室温で15分間イ ンキュベートした。インキュベーション後、1.4 mlバッファによる希釈、アガロ ース懸濁液の遠心および1.4 mlバッファによるペレットの洗浄後、アガロース・ ビーズに結合した放射能を測定した。ビオチン- デキストラン*およびビオチン- デキストラン*- トリコテセンのいずれも100 % の結合が観察された。 ビオチン- デキストラン*およびビオチン- デキストラン*- トリコテセンの血 清クリアランス実験もBalb Cマウスを用いて行った。連続的血液サンプリングに より、両方の分子は2 μCiの注射で実質的に同じ血清クリアランスを示した。 実施例XIX ストレプトアビジンのPEG 化 この実験の目的は種々のモル比でのストレプトアビジンのPEG化（「PEG 化」 とは特定の部分、例えばタンパク質またはポリペプチドへのポリエチレン・グリ コール残基の結合を示す）が多種のPEG 誘導体化およびストレブトアビジン・ビ オチン結合能を起こすかどうかを測定することにある。 以下の実施例において、分子量5000ダルトンのトレシルPEG（シグマ・ケミカ ル社、セントルイス、ミズーリー）はトスレプトアビジンの誘導体化に使用する 活性型PEG である。トレシルPEG はSAタンパク質のアミン基をアルキル化し、そ れによりPEG 誘導体型SAを提供する。この反応スキームおよびシグマがトレシル PEG を生成した反応を以下に示す。 スキーム１：塩化トシルによるMPEGの活性化及びタンパク質のアミノ基への活性 化ポリマーの結合に関する反応(Delgado et al)ポリエチレン・グリコールをストレプトアビジンに結合するためのプロトコル 実験プロトコルを以下に示す： 0.5 ml中各々2.96mgのストレプトアビジン(SA;49nmol)を用いる２つの反応を 行った。各溶液にpH10の1M炭酸塩50μlを添加し、さらにストレプトアビジンに 対して２つのモル比：12および40倍(X)のトレシルPEG を加えた。12X の反応で はSA溶液にdH2O中2.95mgのトレシルPEG を添加した。40X の反応では、dH2O中9. 8 mg（1.96μmol）のトレシルPEG を添加した。いずれの反応も全ての反応成分 を混合してから10分で完了した。続いて未反応のトレシルPEG およびその加水分 解物をPBS で平衡化したS-200(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)を用い て除去した。結果を以下に示す。12X 反応の濃縮後の回収物は3.51mg/mlのもの0 .5ml、即ち1.76mgであった。40X 反応の濃縮後の回収物は3.71mg/mlのもの0.5 m l、即ち1.85mgであった。 これらの反応の完了後、PEG 化の割合をプロトン核磁気共鳴（NMR）で測定し た。4 個の反復するエチレンプロトン/PEG サブユニットは約3.6 ppm にシング レットを与える。このシグナルを積分しトルエンスルホン酸(TSA)の内部標準と 比較した。3 個のメチルプロトン/TSA 分子は約2.3 ppm にシングレットを与え た。PEG 化の相対的評価もGF-250 Zorbax(ゾルバックス)（デュポン、ウィルミ ントン、デラウェア）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて行 った。これらの実験結果を以下に示す。NMR 12X: 53mg（0.15ml）の包合体をロータリーエバポレーターで乾燥し、0.5 mlのD2O に 溶解した。この最終タンパク質濃度（A280）は1.0 mg/mlであり、この試料には0 .5 mgまたは8.3 mmolのSAが含まれる。内部標準として8.76mg(45.6μmol)のTSA をD2O に溶かし、SA溶液に添加した。SAおよびTSA を含む最終試料容積は0.8 ml であった。TSA 量はSA誘導体化が100 % 効率としてPEG シグナルが占める面積を 3 倍したシグナルを提供すると計算された。NMR 40X: 0.52mg（0.14ml）の包合体をロータリーエバポレーターで乾燥し、0.5 mlのD2 Oに溶解した。この最終タンパク質濃度（A280）は1.03mg/mlであり、この試料に は0.51mgまたは8.5 mmolの包合体が含まれる。内部標準として4.92mg（25.84 μ mol）のTSA をD2O に溶かし、包合体溶液に添加した。最終試料容積は0.8 mlで あった。TSA 量はSA誘導体化が100 % 効率としてPEG シグナルが占める面積を0. 5 倍したシグナルを提供すると計算された。ビオチン結合能 PEG誘導体化ストレプトアビジン分子のビオチン結合能をビオチンによるスト レプトアビジンからの2-(4'-ヒドロキシ- アゾベンゼン)安息香酸（HABA）の置 換を用いて測定した。HABAがストレプトアビジンに結合すると結合したHABA量に 応じて500 nmにスペクトル変化を示す。HABAはビオチンによりストレプトアビジ ンから定量的に置換される。このことでビオチンによるHABA-SA 複合体のタイト レーションは500 nmの吸光度を直接モニターでき、ビオチン結合部位のモル濃度 が提供される。修飾されたストレプトアビジン濃度に対する結合部位濃度の比は その変化が如何にビオチン結合能に影響するかの指標を提供している。（未修飾 のストレプトアビジンは4 個のビオチン分子を結合する）実験プロトコルを以下 に示す：PEG 修飾および未修飾SAのHABA検定 目的のタンパク質をPBS 0.25mg/mlの濃度に希釈し、500 nmにおける分光光度 計のブランクとして使用した。10mM NaOH中10mMのHABA溶液25μlをこの溶液に 添加し、A500を測定した。500 μMのビオチン溶液の5 μl部分標本を連続的に添 加し、各々の添加後にA500を測定した。ビオチンの添加はもはやA500が変化しな くなるまで続けた。反曲点は試料溶液中に存在するビオチン結合部位の濃度に等 しい。ビオチン結合部位濃度を包合体の濃度で割った値は、結合部位/SA比に等 しい。結果 NMR およびSEC の結果 12X および40X PEG 誘導体化SA試料のプロトンNMR プロットを各々解析した。 その結果は、12X 投与比で誘導体化したストレプトアビジンはSA分子当たり平均 7.4 個のPEG で誘導体化されていることを示した。40X の投与比で誘導体化した SAは、SA分子当たり平均18.8個のPEG で誘導体化されていた。誘導体化レベルの 差はGF-250クロマトグラフィーにも反映されており、その結果を以下の表に示し た。 これらの実験の結果はPEG 誘導体化試料の溶出は、非- または低誘導体化スト レプトアビジン試料( 12X)よりも高誘導体化ストレプトアビジン( 40X)の方が早 く溶出すると言うように、そのPEG負荷レベルに応じて起こることを示している 。また、各誘導体化ストレプトアビジン試料のピーク幅は対照のストレプトアビ ジンよりも広い。この事は12X 試料の場合に最も明白である。このブロードニン グはクロマトグラフィーの挙動と不均一性の二つに寄因すると考えられており、 かつ定量的試験は分子種の平均的値を示していることの指標となる。ビオチン結合検定の結果 HABA検定を使用してSA対照およびPEG:SA包合体のビオチン結合能を測定した。 以下の表に検定結果を示す。 SA対照: - （0.32mg SA/60K g/mol) x 1000 = 5.3 nmolストレプトアビジン - 500μM のビオチン溶液50μl = 25nmolビオチン - ビオチン/SA: 25nmol ビオチン/5.3nmol SA = 4.7 ビオチン結合/ストレプト アビジン - 理論的には4.0 ビオチン/ ストレプトアビジンなのでこの値は理論よりも約15 % 大きい。12X 提供 : -(0.25mg(PEG)7.4/60K g/mol)x1000=4.2nmol PEG: ストレプトアビジン。ストレ プトアビジンへのPEG の付加は、その物質量は増加するが、BCA およびA-280に よりPEG が蛋白質の質量測定を妨害しないことが確認された。したがって、上述 の計算に使用した60KdはこれらのPEG 誘導体実験において許容しうるものである ことが分かった。 -500μM ビオチン溶液15μl = 7.5nmol ビオチン- ビオチン/PEG:SA = 7.5 nmol ビオチン/4.2nmol PEG:SA = 1.79 結合ビオチン/PEG:SA 40X 投与 : -(0.25mg(PEG)118.8SA/60K g/mol)x1000 ＝4.2 nmol PEG:SA -500μM のビオチン溶液10μl - 5.0 nmol ビオチン - ビオチン/PEG:SA = 5.0 nmol ビオチン/5.0nmol PEG:SA - 1.19結合ビオチン /PEG:SA ビオチン結合データを表7 に示した。 これらの結果は、PEG 誘導体化の増加にしたがってビオチン結合能の損失がある ことを示している。この問題を克服するために、本発明者からビオチン結合部位 はPEG 化過程の間保護されなければならないという仮説が立てられた。しかし、 まずPEG 化がビオチン結合能の損失を起こす蛋白質の構造の変化を誘導するかど うかを調べる必要がある。この事が起こるかどうかを測定するために以下の実験 を行った。ストレプトアビジンに関するPEG 誘導体化の構造的影響の評価 手順 - SAを125Ｉ（14μCi）標識N-(p- ヨードベンゾイル)ビオシチン(PIB-ビオシチ ン)と混合し、約15分間インキュベートした。ビオチン結合部位に対して5 倍モ ル過剰のビオチンをストレプトアビジン-PIB- ビオシチン複合体に添加した。も し、PIB-ビオシチンがPEG 化によって置換し、ストレプトアビジンの結合部位が 反応性のままでいるなら、ビオチン分子は結合部位を占拠しPIB-ビオシチンを溶 液中に遊離させるであろう。 - 先の実験で述べたものと同様の方法を用い、pH10.0で40X モル過剰のトレシル PEG とストレプトアビジンを反応させた。 - また、同時に調製した二つの対照反応を行った。これには、非PEG 化ストレプ トアビジン試料および125PIB-ビオシチン試料が含まれる。 -GF-250 SEC によるPEG 化反応の完了の確認後、3 個全ての試料を30Kdカットオ フの超遠心素子（アミコン社、バーバリー、MA）で遠心し、全体、濾過液および 濾過物の放射能をスクイブCRC-6A放射性同位元素キャリブレーター（スクイブ、 プリンストン、NJ）で測定した。以下の表にセントリコンの結果を示す。 PEG 化SA:125PIB- ビオシチン複合体のSEC トレースは、7.32分の保持時間を 示し、この値は初期のPEG 化実験で得られた値と同じである(表1)。125PIB-ビオ シチン対照は、90% 以上の放射能がセントリコン膜を通過したことを示しており 、このことは巨大分子SA分子と相互作用しない小分子(〈1000ダルトンMW)の場合 と一致している。SA + 125PIB ビオシチンの86% は超遠心後、濾過物中に残留し ていた。このことは、もし、125IB- ビオシチンが60MW蛋白質に結合しているな ら予想される結果である。PEG:SA + 125PIB-ビオシチン試料は、SA + 125PIB-ビ オシチン対照と同様に、放射能の89% が濾過物中に残留するような安定なビオチ ン結合特性を示した。 このように、これらの結果はPEG 化に寄因する蛋白質の構造変化が実質的にな いという事実に基づき、優れたビオチン結合能を保持するポリエチレングリコー ル誘導体化ストレプトアビジンが得られたという証拠を提供している。さらに、 これらの結果はストレプトアビジンのビオチン結合能の低下を引き起こすストレ プトアビジン分子の有意の構造変化は無いことを示している。おそらく立体障害 のためにPEG 誘導体化ストレプトアビジンがビオチンにうまく結合しないという 仮説が立てられる。従って、PEG 化以前のストレプトアビジンのビオチン結合部 位の保護は、そのような立体的制約を未然に防ぐことになる。このような保護は ビオチン結合部位に可逆的に結合する部分の結合で行いうる。それゆえPEG 化操 作の間のブロッキング剤としてイミノビオチンの可逆的ストレプトアビジン結合 特性を利用する実験を行った。この実験はPEG 化の前に、イミノビオチンにより ビオチン結合部位を占拠させ、PEG 化の後にイミノビオチンを開放することでス トレプトアビジンのビオチン結合能を保持されることを示すように行った。PEG 化前のストレプトアビジンのイミノビオチン保護 イミノビオチン(IB)はストレプトアビジンへの強力で、可逆的な結合能により ビオチン結合部位のブロッキング剤として選択された。pKa11-12に近いpHにおい て、IBのグアニジノ基は部分的乃至全体的に脱プロトン化しておりSAに対する結 合アフィニティーが増加している。さらに、PEG 化後、結合および未結合IBは低 pH（4.0）のゲル濾過で反応混合物から除去される。しかし、他の低アフィニテ ィービオチンアナログもイミノビオチンと置き換えることができる。これらの観 測は以下の実験の基礎となっている。実験プロトコル - 0.5 mlバッファ中2.0 mgのSA（48nmol）にpH10.0の1.0 M炭酸塩50μlを添加し た。 - 48nmol SA X4 結合部位/SA X5（過剰）= イミノビオチン(IB)(243.3 MW)0.96 μmol を反応混合物に添加した。 - 0.96μmol x 0.2433 = 0.23 mg IB -(1000μl/ml x 0.23mg)/1.4 mg/ml IB溶液 = 164 μl IB dH2O水溶液 - 反応、15分 トレシルPEG: 48 nmol SA x 40（過剰）トレシルPEG = 1.93μmol トレシルPEG -1.93 μmol トレシルPEG x 5K g/mol = 9.7 mg トレシルPEG - 反応はZorbax SECでモニターし、10分で完了した。 - 反応完了後、pHは1 M酢酸で3.0 まで落とし、0.1 % 酢酸で平衡化したS-200SE C カラム（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）で精製し、PEG 副産物およ び置換型IBを除去した。 - さらに最終的なPEG:SA包合体の特性決定のために限外濾過およびPBS へのバッ ファ交換を行った。 -SEC、HABAおよびNMR 検定を上述のように行った。これらの実験の結果を以下に 示す。 SA対照および上記のように調製したSA：PEG 包合体のZorbax SECの結果を重ね 合わせた。PEG 化SAの保持時間は7.37分であり、この値は以前に測定した12X お よび40X の保持時間の中間にある（表1 参照）。プロトンNMR スペルトルは10.9 2 PEG /SA分子であることを示し、この値は以前の実験の40X で観測された誘導 体レベルよりも低いが、12X 提供で観測された値よりも有意に高い。このことは SEC データと一致する。以下に示す表はPEG：SA包合体の調製に関するHABA検定 の結果をまとめたものである。 HABA検定における0.25mgのSA：PEG は4.2nmol に相当する。結合したHABAを置 換するには500 μM溶液30μl(15nmol)が必要であった。従って、ビオチン/SA比 はSA：PEG 包合体分子当たりの結合ビオチン15/4.2 すなわち3.6 である。これ らの結果は非ブロックSA：PEG 包合体で測定された結果よりも有意に優れている 。従って、これらの結果はPEG 化前にビオチン結合部位をブロックすることはビ オチン結合能の損失を緩和することを示している。他のビオチン結合部位保護物 質、例えば低アフィニティービオチンアナログ、ビオチン結合部位に結合するペ プチド類似体、ビオチン結合部位に対する抗体およびそのフラグメント、および その組み換え体を用いても同様の結果が得られることが予想される。多くの低ア フィニティービオチン・アナログが知られ、かつ入手可能であり、本出願の他所 でも同定されている。これらの結果を以下に示す。 当初、本発明者らはタンパク質のトレシルPEG 誘導体化は修飾されたアミノ基 の電荷が維持されるため、このタイプのストレプトアビジンのPEG 化はビオチン 結合能への影響は小さいという仮説を立てた。予想に反して、文献に報告されて いる操作でストレプトアビジンをトレシルPEG で直接包合体化すると小分子のビ オチンを結合する能力の実質的損失を起こすことが分かった。また、標識したビ オチンを予め結合しておいたストレプトアビジンをトレシルPEG で誘導体化して もビオチンは放出されないことが分かった。このことはPEG 化がタンパク質を破 壊せず、かつ、交換可能なビオチン・アナログでストレプトアビジンのビオチン 結合部位を予めブロックしておくことは修飾（PEG 化）後のストレプトアビジン のビオチン結合能を効果的に保護するということに関する強力な証拠を提供した 。 イミノビオチンは溶液のpHに依存してストレプトアビジンに対するアフィニテ ィーが変化するビオチン・アナログである。高pHではイミノビオチンはストレプ トアビジン分子に強く結合し、優れたブロッキング特性を提供する。このストレ プトアビジン- イミノビオチン複合体のPEG 化、反応液のpHの低下によるイミノ ビオチンの除去、および低pHで平衡化したゲル濾過カラムによる試料の精製でビ オチン結合能を保持したSA：PEG 包合体が生成する。 以下に示す実験は本方法の有効性および当所の本発明者の仮説の正当性を示し ている。in vivo およびin vitro実験は本明細書で示されている方法を用いてPE Gで修飾したストレプトアビジンの免疫原性はバックグランド・レベルまで減少 し ていることを示した。また、この様にPEG で誘導体化したストレプトアビジンは 、抗原仲介ターゲッティングを目的とした抗体に容易に結合する。従って、これ らの結果はポリエチレングリコール誘導体化リガンドおよびアンチリガンド、例 えばストレプトアビジンとアビジンはプレターゲッティング法で使用することを 目的とした包合体の調製に有用である。このようなPEG 誘導体化リガンドおよび アンチリガンドは免疫原性が潜在的な重要性を有している治療に用いるプレター ゼッティング法に対しては特に適している。 さらに、クリアリング剤の投与は、治療薬が免疫系と接触する時間を短くする であろうことから、上述の投与された治療薬包合体に対する潜在的抗原反応を緩 和することが予想される。また、これらの結果はプレターゲッティングプロトコ ルで用いられるターゲッティング部分または活性薬剤と同様に他のリガンドまた はアンチリガンドにも外挿しうることが予想される。 実施例XX 超抗原プレターゲッティング 患者は結腸ガンを示している。結腸ガン細胞抗原に対するモノクローナル抗体 (MAb)、例えば、NR-LU-10をストレプトアビジンと結合しMAb-ストレプトアビジ ン包合体を形成した。ターゲットの使用可能な抗原部位を実質的に飽和するのに 十分な量のMAb-ストレプトアビジン包合体を患者に投与する（この量は少なくと もターゲットの治療的に有効な活性薬剤を捕獲するのに十分なものであり、かつ 、モノクローナル抗体- キレート- 放射性核種包合体の投与のように、従来のタ ーゲッティド・キレート標識分子プロトコルにおいて投与可能な包合体の最高許 容投与量を越える量である）。このように投与されたMAb-ストレプトアビジンは 24-44 時間、望ましくは48-72 時間、ターゲット・ガン細胞に局在化させる。 上述のように調製された包合体であるビオチン- 活性薬剤、例えばトキシンま たはサイトカインまたは放射性核種、は医薬的に許容された希釈剤に分散され、 治療的有効量（例えば、ターゲット細胞部位で細胞毒性効果を誘導するのに十分 な量）が投与される。ビオチン化超抗原は腫瘍部分にターゲットされたMAb-スト レプトアビジンに局在化するか、または代謝されるか、または腎臓経路を介して 患者から排出される。 実施例XXI 提案されるビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル- O-スクシンアミド- ベ ンジル- DOTAの合成 ビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル- O-スクシンアミド- ベンジル-D OTAの合成は、以下に示す合成スキームで行う。 ビオチンアミド-N- メチルグリシン メチル エステル（4）の合成 無水ジメチルホルムアミド中のビオチンに1.1 当量のN-メチルグリシン メチ ル エステルおよび3 当量のトリエチルアミンを加え、さらに1.05当量のBOP(ベ ンゾトリアゾール-1- イルオキシ- トリス（ジメチルアミン）ホスホニウム ヘ キサフルオロホスフェート）を添加する。この混合物を0-25℃で2-24時間攪拌し た後、濃縮する。この残査を酢酸エチルで希釈し、溶液を1N HCl で洗浄後、炭 酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 濾過後、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。この残査を5-15% メタ ノール/酢酸エチルで溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーで分画する。産 物を含むクロマトグラフィーのフラクションを合わせ、濃縮して最終産物（4） を得る。ビオチンアミド- N-メチルグリシン（5）の合成 メタノール中のビオチンアミド-N- メチル- グリシン メチル エステル溶液 に1.5-2.0 当量の1N NaOH溶液を添加する。この混合物を15-45℃で4-24時間攪 拌後、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。残査を脱イオン水で希釈 し、溶液のpHを6N HCl でpH1-2 に調整する。再び、この溶液を減圧下のロータ リーエバポレーターで濃縮する。この残査を逆相C-18シリカゲルのクロマトグラ フィーにかけ、メタノール/水で溶出する。生成物を含むフラクションを合わせ 、濃縮して最終生成物（5）を得る。ビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリン t- ブチルエステル（6）の合成 無水ジメチルホルムアミド中のビオチンアミド- N-メチルグリシン（5）の溶 液に1.1 当量のセリン t-ブチルエステルおよび3 当量のトリエチルアミン、さ らに1.05当量のBOP を添加する。この混合物を0-25℃で2-24時間攪拌後、減圧下 のロータリーエバポレーターで濃縮する。この残査を酢酸エチルで希釈し、その 溶液を1N HCl、つづいて炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄する。有機層を 硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過して濃縮する。その残査をシリカゲルのカラム にかけ、メタノール/酢酸エチルで溶出する。生産物を含むフラクションを合わ せ、濃縮して最終産物（5）を得る。 ビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル t- ブチルエステル-O- スクシネート（7）の合成 無水ジメチルホルムアミド中のビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリン t - ブチルエステル（6）の溶液に3 当量のトリエチルアミン、0.01-0.1当量の4- ジメチルアミノピリミジンおよび1.1 当量の無水コハク酸を添加する。この混合 物を0-25℃で20-24 時間攪拌後、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する 。残査を酢酸エチルおよび1N HCl で希釈する。有機層を硫酸マグネシウムで乾 燥後、濾過して濃縮する。残査を逆相のC-18シリカゲル・カラムにかけ、メタノ ール/水で溶出する。生成物を含むフラクションを濃縮して最終生産物（7）を得 る。ビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル t- ブチルエステル-O- スクシンア ミド- ベンジル- DOTA（8）の合成 無水ジメチルホルムアミド中のビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル t -ブチルエステル-O- スクシネート（7）の溶液に10当量のトリエチルアミンおよ び0.9-1.0 当量のBOP を添加する。この混合物を15-25℃で16-24 時間攪拌後、 無水ジメチルホルムアミド中のアミノベンジル-DOTA を添加する。この混合物を 20-50℃で0.5-4 時間攪拌後、濃縮する。残査をクロマトグラフィーで生成して 最終産物（8）を得る。ビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル-O- スクシンアミド- ベンジル-DOT A（9）の合成 トリフルオロ酢酸にビオチンアミド-N- メチルグリシル- セリル t- ブチルエ ステル-O- スクシンアミド- ベンジル- DOTA（8）を添加する。この混合物を15- 25℃で15分間攪拌後、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮する。残査をイ オン交換クロマトグラフィーで精製して最終生成物（9）を得る。 この反応スキームは先に示した。 また、本発明は上述の１つ以上の成分を含むキットにも関する。例えば、放射 性ハロゲン化ビオチンがプレターゲッティング法に使用する目的で無菌的容器で 提供されうる。無菌的容器で提供されるキレート- ビオチン包合体は消費者によ るラジオメタレーションに適している。このようなキットはプレターゲッティン グ・プロトコルで使用するのに特に適している。それとは別に放射性ハロゲン化 ビオチンおよびキレート- ビオチン包合体は研究試薬として非無菌状態でビン詰 めすることもできる。 以上、本発明の特定の態様について説明の目的で記載したが、本発明の概念及 び範囲内で種々の変形が可能であることが理解されよう。従って、本発明は請求 の範囲のみにより限定されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 7433−4Ｃ Ａ６１Ｋ 47/48 Ｚ 45/00 ＡＢＣ 9051−4Ｃ 48/00 ＡＢＳ 45/05 ＡＧＢ 9454−4Ｃ 49/00 Ａ 45/08 ＡＣＢ 8415−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 495/04 １０３ 47/48 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/465 48/00 ＡＢＳ 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 49/00 0276−2Ｊ 33/15 Ｚ 51/00 ＡＤＰ 0276−2Ｊ 33/574 Ｚ Ｃ０７Ｄ 495/04 １０３ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＢＧ Ｃ０７Ｋ 14/465 9051−4Ｃ 37/66 ＡＢＡＧ Ｇ０１Ｎ 33/566 9051−4Ｃ 37/547 ＡＡＢ // Ｇ０１Ｎ 33/15 8415−4Ｃ 43/00 ＡＤＰ 33/574 9051−4Ｃ 37/24 ＡＢＬ (72)発明者 マレット ロバート ダブリュ アメリカ合衆国、ワシントン 98133、シ アトル、ストーン レイン エヌ ナンバ ーエッチ−102 15101 (72)発明者 カジナ サダカー アメリカ合衆国、ワシントン州 98034、 カークランド、エヌ イー、アハンドレッ ド フィフティーンス アベニュー 13710 (72)発明者 レノ ジョン エム アメリカ合衆国、ワシントン州 98036、 ブライアー、エルム ドライブ 2452 (72)発明者 アクスワーシー ドナルド ビー アメリカ合衆国、ワシントン州 98036、 ブライアー、エス ダブリュ、トゥーハン ドレッドトゥウェンティセブンス ストリ ート 3615 (72)発明者 ガスタフソン リンダ エム アメリカ合衆国、ワシントン州 98155、 シアトル、エヌ イー、サーティーファー スト ストリート 19809

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 哺乳類レシピエント内のターゲット細胞部位における高毒性活性薬剤の局在 化を増加させる方法であって、 ターゲット部分とリガンド−アンチリガンド結合対の１員とを含む第１の包合 体をレシピエントに投与し、 次いでこのレシピエントに、パリトキシン、トリコテセン、シュウドモナス(P seudomonas )菌体外毒素、腫瘍壊疽因子、インターロイキン２、形質転換成長因 子β、インターロイキン４、インターロイキン１０、インターフェロン−γ、イ ンターフェロン−α、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、及び顆粒球− コロニー刺激因子からなる群から選ばれる高毒性活性薬剤とリガンド−アンチリ ガンド結合対の１員とを含む第２の包合体を投与する（但し、この第２の包合体 の結合対の一員は第１の包合体のそれと相補的である）ことを含む方法。 ２ さらに前記レシピエントに、循環する第１の抱合体を肝細胞レセプターに向 かわせることができるクリアリング剤を投与し、それにより、循環する第１の抱 合体の量を第２の抱合体の投与前に減少させる請求項１の方法。 ３ 第１の抱合体がアンチリガンドを含み、かつ第２の抱合体がリガンドを含む 請求項１の方法。 ４ 第１の抱合体がストレプトアビジンを含み、かつ第２の抱合体がビオチンを 含む請求項３の方法。 ５ 第１の抱合体の投与前、投与と同時にまたは投与に次いで、レシピエントの 内因性のビオチンのレベルを減少させることをさらに含む請求項４の方法。 ６ 第１の抱合体がリガンドを含み、かつ第２の抱合体がアンチリガンドを含む 請求項１の方法。 ７ 第１の抱合体がビオチンを含み、かつ第２の抱合体がストレプトアビジンを 含む請求項６の方法。 ８ ターゲット部分がモノクローナル抗体又はその抗原認識フラグメントであっ て、前記フラグメントがNR-LU-10抗体により認識される抗原と反応性を有する請 求項１の方法。 ９ 哺乳類レシピエント内のターゲット細胞部位における活性薬剤の局在化を増 加させる方法であって、 交差反応性の第１のパターンを有する第１の抗体種とリガンド−アンチリガン ド結合対の１員とを含む第１のターゲッティング部分包合体をレシピエントに投 与し、 次いでこのレシピエントに、１つ以上の追加のターゲッティング部分包合体、 そのような追加の包合体はそれぞれ(1)第１の抗体種と異なり、かつお互いに異 なる抗体種（そのような各追加の抱合体はお互いに交差反応性の第１のパターン が実質的に重複せず、かつ第１のパターンの交差反応性とも実質的に重複しない ）と(2)第１の抱合体に含まれるリガンド−アンチリガンド結合対の１員とを含 む、を投与し、かつ 次いでこのレシピエントに、活性薬剤とリガンド−アンチリガンド結合対の１ 員とを含む活性薬剤包合体を投与する（但し、この活性薬剤包合体の結合対の一 員は第１の包合体のそれと相補的である）ことを含む方法。 10 さらに前記レシピエントに、１つ以上の第１のターゲッティング部分抱合体 を肝細胞レセプターに向かわせることができるクリアリング剤を投与し、それに より、循環するターゲッティング部分抱合体の量を活性薬剤抱合体の投与前に減 少させる請求項９の方法。 11 第１の抱合体がアンチリガンドを含み、かつ第２の抱合体がリガンドを含む 請求項９の方法。 12 第１の抱合体がストレプトアビジンを含み、かつ第２の抱合体がビオチンを 含む請求項11の方法。 13 第１ターゲッティング部分抱合体の投与前、投与と同時にまたは投与に次い で、レシピェントの内因性のビオチンのレベルを減少させることをさらに含む請 求項12の方法。 14 第１の抱合体がリガンドを含み、かつ第２の抱合体がアンチリガンドを含む 請求項９の方法。 15 第１の抱合体がビオチンを含み、かつ第２の抱合体がストレプトアビジンを 含む請求項14の方法。 16 ターゲット部分がモノクローナル抗体又はその抗原認識フラグメントであっ て、前記フラグメントがNR-LU-10抗体により認識される抗原と反応性を有する請 求項10の方法。 17 哺乳類レシピエント内のターゲット細胞部位における感光性活性薬剤の局在 化を増加させる方法であって、 ターゲット部分とリガンド−アンチリガンド結合対の１員とを含む第１の包合 体をレシピエントに投与し（但し、第１の包合体はターゲット部位に局在化する ）、かつ 次いでこのレシピエントに、感光性活性薬剤とリガンド−アンチリガンド結合 対の１員とを含む第２の包合体に投与する（但し、この第２の包合体の結合対の 一員は第１の包合体のそれと相補的であり、かつ感光性活性薬剤または第２の包 合体はそれらの迅速なレシピエントからの腎臓クリアランスを誘発するために化 学的に修飾されている）ことを含む方法。 18 感光性活性薬剤が約600 〜約800nm の範囲の波長で光を吸収する請求項17の 方法。 19 感光性活性薬剤が600 〜700nm に強い吸収帯を有するポルフィリン誘導体、 アルミニウムまたは亜鉛とキレートしたフタロシアニン、ポルフィリンのエーテ ル／エステル誘導体、クロリン類、プルプリン類、及びベンゾポルフィリン誘導 体からなる群から選ばれる請求項17の方法。 20 感光性活性薬剤がクロリンである請求項19の方法。 21 さらに前記レシピエントに、循環する第１の抱合体を肝細胞レセプターに向 かわせることができるクリアリング剤を投与し、それにより、循環する第１の抱 合体の量を第２の抱合体の投与前に減少させる請求項17の方法。 22 第１の抱合体がアンチリガンドを含み、かつ第２の抱合体がリガンドを含む 請求項17の方法。 23 第１の抱合体がストレプトアビジンを含み、かつ第２の抱合体がビオチンを 含む請求項22の方法。 24 第１ターゲッティング部分抱合体の投与前、投与と同時にまたは投与に次い で、レシピエントの内因性のビオチンのレベルを減少させることをさらに含む請 求項23の方法。 25 第１の抱合体がリガンドを含み、かつ第２の抱合体がアンチリガンドを含む 請求項17の方法。 26 第１の抱合体がビオチンを含み、かつ第２の抱合体がストレプトアビジンを 含む請求項25の方法。 27 ターゲット部分がモノクローナル抗体又はその抗原認識フラグメントであっ て、前記フラグメントがNR-LU-10抗体により認識される抗原と反応性を有する請 求項17の方法。 28 リガンドまたはアンチリガンドと結合したターゲッティング部分を含む抱合 体の投与、及び第１の抱合体に含まれるリガンドまたはアンチリガンドと結合し 、かつ活性薬剤と直接又は間接に結合するリガンドまたはアンチリガンドを含む 第２の抱合体を同時に又は次いで投与することを含む改良された治療方法であっ て、 前記改良が、第１又は第２の抱合体に含まれる少なくともリガンド、アンチリ ガンド、ターゲッティング部分または活性薬剤への１つ以上のポリアルキレング リコール残基の結合を含む方法。 29 第１又は第２の抱合体がポリアルキレングリコール誘導化ストレプトアビジ ンまたはアビジンを含む請求項28の方法。 30 前記ポリアルキレングリコールが1 〜20の炭素原子を含む請求項28の方法。 31 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールを含む請求項30の 方法。 32 前記ポリアルキレングリコール残基がアビジン又はストレプトアビジン分子 に含まれるビオチン結合部位の保護の後に結合される請求項28の方法。 33 前記保護をアビジン又はストレプトアビジン分子とビオチン結合部位に可逆 的に結合する分子との反応により行う請求項32の方法。 34 前記分子がイミノビオチンである請求項33の方法。 35 ポリアルキレングリコール誘導化ストレプトアビジン若しくはアビジン分子 または天然ストレプトアビジン若しくはアビジン分子より弱い免疫原性を示し、 かつビオチン結合能力を保持している前記誘導化アビジン若しくはストレプトア ビジン分子を含む抱合体。 36 前記ポリアルキレングリコールが1 〜20の炭素原子を含む請求項35の誘導化 ストレプトアビジンまたはアビジン。 37 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールを含む請求項35の 誘導化ストレプトアビジンまたはアビジン。 38 血栓溶解治療の改善された方法であって、 (i) 血栓に対するターゲッティングのために提供されるターゲッティング部分に 直接または間接的に結合するリガンドまたはアンチリガンドを含む第１のプレタ ーゲッティング抱合体を投与し、かつ (ii)第１の抱合体中のリガンドまたはアンチリガンドと相補的なリガンドまたは アンチリガンドと直接または間接的に結合する血栓溶解薬剤を含む第１の抱合体 と特異的に結合する第２の抱合体の治療有効量を投与する ことを含む方法。 39 前記方法が第１または第２の抱合体のいずれかと生体内(in vivo)複合化で きるクリアランス指向部分の投与も含む請求項11の方法。 40 ターゲッティング部分がアネキシン（活性化血小板と結合する抗体である） またはアンチフィブリン抗体である請求項38の方法。 41 血栓溶解薬剤がt-PAウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、またはそれらのハ イブリッド、誘導体若しくは突然変異体である請求項38の方法。 42 クリアランス指向部分がさらにヘキソース残基を含む請求項39の方法。 43 クリアランス指向部分がガラクトース残基を含む請求項42の方法。 44 ターゲット生体内(in vivo)部位でのシトキンのより効果的な利用を提供す る方法であって、 (i) ターゲット細胞に対する（ターゲッティング部分）−（リガンドまたはアン チリガンド）−（アンチリガンドまたはリガンド）−シトキン複合体の特異的結 合を生じる１つ以上の部分を投与し、かつ (ii)次いで、ターゲット部位における遊離のシトキンの解離の用意をするに十分 な量のリガンドまたはアンチリガンドを投与する方法。 45 シトキンがインターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子及び腫 瘍壊疽因子から選ばれる請求項44の方法。 46 シトキンが腫瘍壊疽因子である請求項45の方法。 47 複合体に含まれるリガンドがビオチンまたは低親和性ビオチンアナログであ り、かつアンチリガンドがアビジンまたはストレプトアビジンであり、かつ解離 がビオチンまたは低親和性ビオチンアナログの投与により行われる請求項45の方 法。 48 段階(i)がシトキン治療を必要とする患者に前記複合体を投与することによ り行われる請求項45の方法。 49 (i) （リガンドまたはアンチリガンド）−ターゲッティング部分包合体を含 む第１の包合体を投与し、かつ (ii)（リガンドまたはアンチリガンド）−放射性キレート包合体を含む第２の包 合体の治療効果量を投与する方法であって、放射性キレート及びリガンドまたは アンチリガンドが開裂可能なリンカーにより分離されている放射性免疫治療方法 。 50 リンカーが塩基性条件下で開裂可能である請求項49の方法。 51 リンカーが開裂可能エステルを含む請求項49の方法。 52 開裂可能エステルがコハク酸セリルまたはアルキルエステルである請求項49 の方法。 53 ビオチンアミド−Ｎ−メチルグリシル−セリル−Ｏ−スクシンアミド−ベン ジルＤＯＴＡ。
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