JPH09506764A

JPH09506764A - 修飾短縮型補体系レギュレーター

Info

Publication number: JPH09506764A
Application number: JP7509968A
Authority: JP
Inventors: ピー．アトキンソン，ジョン; アワーケイド，デニス; クリチ，マルガーザタ
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-23
Publication date: 1997-07-08
Also published as: EP0730469B1; AU7842494A; ATE265221T1; CA2171953C; EP0730469A1; DE69433745T2; WO1995008343A1; DE69433745D1; CA2171953A1; AU691525B2; EP0730469A4

Abstract

(57)【要約】標的C3bおよび／またはC4bに対する特異性および親和性を変化させる補体活性化タンパク質のレギュレーター(RCA)のアナログが記載される。これらのアナログは、これらのタンパク質の補体阻害的活性に影響を与えるアミノ酸を置換することにより、複数もしくは単数のSCR領域をタンパク質に置換、再配列、または付加することにより、アミノ酸配列を欠失させることにより、およびそれらを組み合わせることにより、得られる。

Description

【発明の詳細な説明】修飾短縮型補体系レギュレーター発明の背景本発明は、補体活性化の調節タンパク質（RCA）に由来する補体レギュレーターの修飾および/または短縮された形態に関し、特にCR1に関する。補体系は、動物宿主からの外来物質および免疫複合体の除去において援助するために作用する。この系およびその調節はHourcade，D.ら、Advances in Immuno l. （1989）45:381-416により概説される。要約すると、補体系は「古典経路」または「第二経路」のいずれかによりC3bを生成させ、このC3bは標的免疫複合体または外来物質に結合して、破壊または排除のためにそれらに目印をつける。C3b はその前駆体であるC3から「C3転換酵素」と集合的に名づけられたタンパク質分解酵素により生成される。C3転換酵素の１つの形態は、「古典経路」においてタンパク質C4bおよびC2aが会合することにより生成される。他の形態は、第二経路においてタンパク質C3bおよびBbが会合することにより生成される。両方のC3転換酵素はさらなるC3bサブユニットと会合して、C5転換酵素であるC3bBbC3bおよびC4bC2aC3bを形成し、これらの両方は細胞溶解を生じさせるC5-C9膜侵襲複合体の産生、ならびに主要な前炎症薬剤（pro-inflammatory agent）であるC5aの産生において活性である。 C3bおよび（それほど直接的ではないが）C4bのいずれもが補体系においてアゴニストである。これを図１の概略図に示す。補体系は多数の相関する機構により調節される。補体系の破壊的な構成成分の阻害のためには２つの一般的な経路が存在する。第１の機構は一般に可逆的であり、C3転換酵素の解離（すなわち、BbからC3bおよびC2aからC4b）を助長する。解離の助長はしばしば崩壊促進として知られる。解離はまた、アンタゴニストタンパク質がC3bまたはC4b成分に可逆的に結合し、それによってこれらの再会合を妨げることにも関与し得る。他の機構は（不可逆的な不活性化プロセスであるが）、セリンプロテアーゼＩ因子による、C3転換酵素の構成成分であるC3bまたはC4bの、タンパク質分解的切断から生じる。このタンパク質分解的切断はコファクターの存在下でのみ起こる。一般的な調節機構の両方、すなわちC3bおよびC 4bの解離の助長ならびにＩ因子による切断を通したC3bおよびC4bの不活性化はまた、第二経路のC5転換酵素（C3bBbC3b）および古典経路のC5転換酵素（C4bC2aC3 b）の阻害にも適用される。「補体活性化レギュレーター」（RCA）遺伝子クラスターと名づけられたゲノムの領域によってコードされるタンパク質は前記の機構の両方に関与する。現在、少なくとも６つの補体タンパク質がこの領域によってコードされることが知られている。これらを表１に要約する。これらのタンパク質はある種の構造的な類似性を共有し、それはさらに以下に記載される。 C3転換酵素を解離させるためのC4bまたはC3bへの可逆的な結合は、C4結合タンパク質（C4bp）およびＨ因子と名づけられた２つの血漿タンパク質、ならびに崩壊促進因子（DAF）および補体レセプター１（CR1）と名づけられた２つの膜タンパク質によりもたらされる。C4bへの可逆的な結合はC4bp、DAF、およびCR1によりもたらされ、一方C3bへの可逆的な結合はＨ因子、DAF、およびCR1によりもたらされる。酵素Ｉ因子による転換酵素の構成成分C3bまたはC4bのタンパク質分解的切断に起因するC3転換酵素の不可逆的不活性化は、上記の、血漿中のＨ因子およびC4 bpならびに細胞表面のCR1およびメンブランコファクタープロテイン（MCP）によりもたらされるコファクター活性のために生じ得る。C3bを切断するためのコファクター活性は、Ｈ因子、CR1、およびMCPによりもたらされ、一方C4bを切断するためのコファクター活性は、C4bp、CR1、およびMCPによりもたらされる。第６のタンパク質である補体レセプター２（CR2）がこのコファクター活性を細胞表面において有する可能性もまた存在する。要約すると、RCA遺伝子クラスターによってコードされる６つのタンパク質、Ｈ因子、C4bp、およびCR1は、可逆的な解離活性と不可逆的なコファクター活性の両方を有する；DAFは可逆的な解離活性のみを有し、MCPおよび、おそらくCR2 は不可逆的なコファクター活性のみを有する。CR1、DAF、およびMCPはC3bおよび C4bの両方と相互作用し；C4bpは主としてC4bと相互作用し、そしてＨ因子は主としてC3bと相互作用する。 CR1、CR2、DAF、MCP、C4bp、およびＨ因子に対応するcDNAはすべて得られ配列決定されている。これらの比較される配列を評価することにより、図２Ａに示すアラインメント（alignment）が導かれ、これは左のＮ末端でのショートコンセンサスリピート（short consensus repeat）（「SCR」）含有、および非-SCR含有領域へのRCAタンパク質の構成を示す。この図において、TMは膜貫通ドメインを示し、Ｃは細胞質ドメインを示し、ＯはＯ結合型グリコシル化ドメインを示し、Ｇは糖脂質アンカー（anchor）を示し、Ｕは意義が未知であるドメインを示し、そしてＤはジスルフィド架橋含有ドメインを示す。 RCAファミリータンパク質の間にはかなりの一様性が存在する。これらのすべては、通常「ショートコンセンサスリピート」（SCR）と名づけられる60〜70アミノ酸の反復ユニットで構成されている。それぞれのSCRは、多数の不変アミノ酸残基または高度に保存されたアミノ酸残基を、同一タンパク質内の他のSCRまたは他のファミリーメンバー内のSCRと共有する。膜結合型であるファミリーのそれらのメンバーはまた、それらのＣ末端に、膜貫通領域と細胞内領域、あるいは糖脂質アンカーのいずれかを有する。 SCRは、膜結合型であるファミリーのメンバーの細胞外部分、および分泌型のメンバーにおけるタンパク質構造の大部分を形成する。２つの共有的に架橋したシステイン対が各SCR内の２つのループを確立する。最小のファミリーメンバーはDAFとMCPである；各々は４つのSCRおよびそれに続くＯ結合型グリコシル化領域を含む。DAFは糖脂質アンカーで終結し、一方MCPは意義が未知である細胞質外セグメント、膜貫通領域、および細胞内ドメインで終了する。ファミリーの分泌型メンバーの中で、Ｈ因子は20のSCRを含み、一方C4bpのネイティブな形態は８つのSCRの７サブユニット（C4bpα鎖）と３つのSCRの１サブユニット（C4bpβ鎖）との会合である。C4bpの両方の鎖は、ジスルフィド結合により鎖を相互連結する非SCRドメインで終結する。CR2は16のSCR、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含む。最も一般的なCR1の多型形態は、１〜28の番号付けがなされている７つの類似SCRの４反復ユニット（ロングホモロガスリピート（long homologous r epeats）あるいはLHRS）、それに続くさらに２つの29および30と名付けられたSC R、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含む。 Klickstein，L.B.ら、J．Exp．Med.（1988）168:1699-1717は、欠失変異導入を用いたCR1における明確なC3bおよびC4b認識部位の同定について記載した。彼らは、単一の本来のC4b結合部位がSCR１-２に位置し（配列番号１および３）、一方２つの本来のC3b結合部位がSCR８-９（配列番号２および４）ならびにSCR15 -16に位置すると結論した。C3bコファクター活性はSCR８-９およびSCR15-16に位置づけられた。より最近になって、SCR８-９を含むCR1活性部位はSCR10まで広がり、（類推により）SCR15-16を含むCR1活性部位（これはSCR８-９と１アミノ酸のみの違いである）はSCR17まで広がるに相違ないことが示された。（Kalliら、J．Exp．Med. 174，1451-1460(1991); Makridesら、J．Biol．Chem. 267,24754- 24761(1992)）。SCR１-２を含むCR1活性部位がSCR３および/または４まで広がることは、Makridesら、(1992)により報告された。マウスC4bp結合部位、ならびにおそらくC4bコファクターおよびC4bC2a崩壊促進活性部位はα鎖のSCR１-３に広がることがOgataら、J．Immunology 150,2273- 2280(1993)により報告された。Ｈ因子結合部位、ならびにおそらくC3bコファクターおよびC3bBb崩壊促進活性部位は最初の５つのSCR内にある。C3bタンパク質分解産物についてのCR2結合部位は最初の２つのSCRに広がる、Kalliら、J．Immunology 147:509-594(1991); Carelら、J．Biol．Chem. 265:12293-12299(1990)。 MCP活性部位は４つすべてのSCRに広がる：SCR２-４はC3bおよびC4bコファクター活性に要求される。SCR1はC3bコファクター活性および結合に不要であるようだが、効率的なC4bコファクター活性および結合に必要であるようであることは、Adamsら、J．Immunology 147:3005-3011(1991)により報告された。DAF活性部位がSCR２-４に広がることは、Coyneら、J．Immunology 149:2906-2913(1992)により報告された。 Hourcade，D.ら、J．Exp．Med. 168:1255-1270(1988)は、CR1の最初の８つと1 /2のアミノ末端SCRをコードするCR1-4と名付けられたcDNAクローンを記載した。このcDNAはCOS細胞内にトランスフェクトされ分子量78 kdを有するCR1の分泌される短縮（truncated）形態の合成を生じた（Krych，M.ら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA 88:4353-4357(1991)）。このタンパク質の短縮形態は、本明細書中で以下に示すように、主にC4bに結合する。本明細書に記載されるように、この短縮形態がC4bコファクター活性を有することが、今や確定された。 CR1の複数の結合部位はそれらのC3b含有標的との相互作用において協同し得る。インビトロにおいて、CR1はC3bモノマーよりもC3b-C3bダイマーにはるかに強固に結合する。なぜなら、ダイマーに対する結合は、同一のCR1分子内の２つの部位に同時に起こるからであり、このことはWongおよびFarrell、J．Immunol.（ 1991）146:656; RossおよびMedof、Adv．Immunol.（1985）37:217により報告された。２つの本来のC3b結合部位の１つを欠失させることにより、CR1のC3b-C3b への結合が10倍（by a factor of ten）減少し得ることは、WongおよびFarrell 、J．Immunol.（1991）146:656により報告された。C3bとC4bCの両方を含む標的との相互作用においては本来のC4b結合部位は本来のC3b結合部位と協同することもあり得る。これらの効果はインビボにおける重要な帰結を有する：CR1は、C3b で密におおわれた標的およびC3bとC4bで密におおわれた標的に対してより高い親和性を有する。 C5転換酵素（これは炎症の刺激およびある種の標的細胞の溶解において重要である）は、複数のCR1リガンドで構成されている：古典経路のC5転換酵素はC3bおよびC4bを含み（C4bC3bC2a）、一方第二経路のC5転換酵素は２つのC3bタンパク質を含む（C3bC3bCBb）。CR1によるC5転換酵素の不活性化はまた、１つ以上のCR 1結合部位の間の協同に関与し得る。WongおよびFarrell、J．Immunol.（1991）1 46:656は、１つ以上のCR1 C3結合部位が第二経路C3およびC5転換酵素を有効に阻害するために不可欠であり得ることを示した。 RCA遺伝子クラスターにコードされるタンパク質は組換えで調製され、補体系の調節に関する診断および治療において使用され得る。異種移植物の移植の問題はPlatt，J.L.らにより、Immunology Today（1990）11:450-457で概説されている。不一致異種移植物の超急性（hyperacute）拒絶が受容者の補体活性により引き起こされるという証拠が蓄積されている。細胞表面に（DAFまたはMCPのような）ヒト補体レギュレーターを発現するトランスジェニック動物は、ヒト受容者における超急性拒絶から保護される器官の豊富な供給源となり得る。可溶性の補体インヒビターはまた、補体介在性の拒絶から異種移植物を保護する役割を担い得る。 CR1の組換え可溶性形態がラットにおける逆受身アルサス反応を阻害する能力は、Yeh，C.G.ら、J．Immunol.（1991）146:250-256に記載された。この可溶性C R1はCR1遺伝子構築物を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞から得られ、このCR1遺伝子構築物は変異を導入して膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを除去してあった。同様な可溶性CR1（CHO細胞で組換えで産生された）のラットにおける虚血性心筋炎症および壊死を阻害する能力はWeissman，H.F.ら、Sc ience （1990）249:146-151により報告された。 RCAタンパク質に関連したタンパク質がウィルスにより産生されることもまた示されており、おそらくこれによりウィルスによる感染が促進され得る機構として産生されることがKotwaal，J.ら、Noture（1988）335:176-178; McNearney，T .A.、J Exp Med（1987）166:1525-1535に報告されている。長期間原則での補体系の完全な阻害はほとんどの個人において所望されないであろう。自己免疫疾患のある種の場合では、古典経路の阻害のみで十分であり得る。しかし、異種移植物移植の場合では、両方の経路の厳密な阻害が重要であり得る。他の適用にも同様な厳密性が要求され得る。従って、調節可能な結合活性を有する補体系の別の調整因子が望まれる。そこで本発明の目的は、炎症疾患の治療のため、可溶性形態で投与し得る修飾された補体レギュレーターを提供すること、または個人の外来物質を拒絶する能力を減少させることにある。本発明のさらなる目的は、より複雑な天然に生じるタンパク質よりも、より短くて、より容易にかつより安価に産生される修飾された補体レギュレーターを提供することにある。本発明の別の目的は、古典経路と第二経路の両方において特異的かつ全身的に補体タンパク質を阻害する増強された能力を提供する異なる補体レギュレーターの活性を合わせ持った補体レギュレーターを提供することにある。発明の要旨 RCAにコードされるタンパク質のアナログ（これらの調節タンパク質の修飾された完全長の形態または短縮された形態である）が、記載され、補体を阻害することが示される。これらのアナログは、部位特異的変異を有するRCAタンパク質、１つ以上のRCAタンパク質由来の１つまたはそれ以上のSCRを含むRCAタンパク質ハイブリッド、その中でSCRが異なる順序で配置されるRCA組換え体の修飾、およびSCRを３つ以上含むRCAタンパク質の短縮バージョンを包含する。修飾されたタンパク質は補体阻害活性を保持するが、その特異性、親和性、または機構において改変され得る。修飾されたタンパク質は以下に挙げるタンパク質により示される：CR1-4(8,9) のΔSCR11，subst1変異、これは３つの完全なSCR（アミノ酸１〜194、SCR１-３）のみを含みC3b活性を有する；CR1-4(8,9)のlar,5r,8br変異、これは強調されたC3bおよびC4b活性を有する；lar,5r,8brの最初の194アミノ酸で構成される３S CR形態；10、10、10,11、11c、8a、6b、14、および15変異体、これらは増強された活性を有するCR1-4の変異である；ならびにCR1-4 stop7、CR1-4(8,9)stop7、およびlar,5r,8br stop7、これらはすべてそれら各自の親タンパク質（それぞれ CR1-4、CR1-4(8,9)、およびlar,5r,8br）のより短い（７SCR）形態である。これらのアナログは補体系を制御することにおいて有用であり、それゆえ自己免疫疾患の治療、移植物の拒絶の抑制、診断、ならびに心筋梗塞および発作（ce rebral vascular accidents）に関連する組織損傷の軽減において有用であり得る。これらはまた、補体活性化および免疫複合体形成に関連した状態を診断することにおいて役割を担い得る。図面の簡単な説明図１は、古典補体経路および第二補体経路の概略図である。図２Ａおよび２ＢはRCAにコードされるタンパク質の構造および関連を図式的に示す。図２Ａは高度に保存された残基とともに示されるショートコンセンサスリピートである。図２ＢはRCAタンパク質のSCR構成の概略図である：CR1、CR2、DAF、MCP、C4結合タンパク質、およびＨ因子。図３Ａおよび３Ｂは、完全長CR1の、SCR-1およびSCR-8（それぞれ、配列番号１および２）（図３Ａ）、ならびにSCR-2およびSCR-9（それぞれ、配列番号３および４）（図３Ｂ）のアミノ酸配列を比較する。SCR15-16のアミノ酸配列はSCR ８-９のそれと、110位のＴを除いて同一である。番号付けはHourcadeら、J．Exp .Med. （1988）168:1255-1270のそれと一致しており、成熟レセプターの第１アミノ酸（Ｑ）をアミノ酸１と名付けた。CR1 SCR-8の対応する位置を同様に名付けた。発明の詳細な説明本明細書中には、補体系を調整するために用いられ得るRCAタンパク質アナログのファミリーが記載されている。このアナログを用いて、膜結合形態と可溶性形態の両方のこのタンパク質のメンバーの結合特異性を改変し得る。本明細書で用いられる用語「RCAタンパク質」は、遺伝子領域1q32の遺伝子クラスターによりコードされるタンパク質を示し、この遺伝子クラスターは補体調節において有効な６つの既知のタンパク質をコードする：Ｈ因子、C4bp、CR1、C R2、DAF、およびMCP。さらに、CR1遺伝子およびMCP遺伝子のアミノ末端コード領域に類似した見かけ上のコード領域がこのクラスター内に位置づけられているが、これらの配列が発現されているかは不明である（Hourcade，D.ら、J．Biol．C he m. 265:974-980(1990); Hourcade，D.ら、Genomics 12:289-300(1992)）。用語「RCAタンパク質」はまたショートコンセンサスリピート（SCR）を含むタンパク質の群を示し、これらのSCRはCR1、CR2、MCP、DAF、Ｈ因子、およびC4bp内のSCR に相同である。本明細書中に記載される修飾されたタンパク質は、集合的に「修飾されたRCA タンパク質」を示す。これらは、RCAタンパク質の短縮形態、ハイブリッド形態、および再結合（recombined）形態を包含する。「短縮」タンパク質はRCAタンパク質のより短いバージョンであり、これらは典型的には膜結合または分泌をもたらすＣ末端領域を除くように修飾され、しばしば１つまたはそれ以上のSCRを欠失することにより修飾される。「ハイブリッド」タンパク質は、１つのRCAタンパク質の部分（すなわちSCR）とそれに組み合わされた１つまたはそれ以上のR CAタンパク質のSCRで構成されるRCAタンパク質である。「再結合」形態はRCAタンパク質のSCRが新たな順序で配置し直される形態である。１つまたはそれ以上のアミノ酸の部位特異的な置換および欠失を有するタンパク質もまた含まれる。「修飾されたRCAタンパク質」はこれらの変化の組み合わせから生じるタンパク質を含む。ショートコンセンサスリピートの配列を図２Ａに示す。図２Ｂに図式的に示すように、CR1は30のSCR、それに続く膜貫通領域、および細胞質領域を含む。CR2 は16のSCR、それに続く膜貫通領域、および細胞質領域を含む。DAFおよびMCPはそれぞれ４つのSCRと、それに続く糖脂質アンカー領域を含む。C4結合タンパク質はより複雑なタンパク質であり、７つのαサブユニットおよび１つのβサブユニットを有する。αサブユニットは８つのSCRからなり、βサブユニットは３つのSCRからなる。Ｈ因子は20のSCRからなる。ある実施態様では、タンパク質の対応するSCRを修飾の部位として用いることにより修飾が作製される。「対応するSCR」は、タンパク質のアミノ酸配列から判断される最も高度に相同なSCRを意味する。エキソン構造はある場合においてこの課題を容易にし得る。上記のように、CR1のSCR１-３はDAFのSCR２-４に対応する。Ｈ因子、CR1、C4bp、およびMCPのSCRはこれらのタンパク質の間で対応している。CR1は７つのSCRを含む一連のロングホモロガスリピート（long homolog ous repeat）（LHRS）にまとめられ、その結果CR1 SCR１-７はCR1 SCRの８-14； 15-21；および22-28に対応する。CR2は長さが４SCRの一連のロングホモロガスリピートにまとめられる。CR1のSCR１−２は、CR2のSCR３-４、SCR７-８、SCR1I-1 2、およびSCR15-16に対応する。これらのタンパク質は、C4b結合活性、C3b結合活性、C4bコファクター活性、およびC3bコファクター活性により特徴付けられる。一般に、各々の活性には２〜３個のSCRを要する。生物学的に重要な活性は崩壊促進または解離、C3bコファクター活性、およびC4bコファクター活性を包含する。コファクター活性には結合が要求されるが、結合のみではコファクター活性に十分ではない。 CR1のC4b結合およびコファクター活性にはSCR１、２、および３、SCR８、９、および10、またはSCR15、16、および17が要求されることが受け入れられており、これらはこのタンパク質の対応する領域である。C3b結合およびコファクター活性にはSCR８、９、および10またはSCR15、16、および17が要求され、これらはこのタンパク質の対応する領域である。MCPのC4b結合およびコファクター活性にはSCR１、２、３、および４が要求される。MCPのC3b結合にはSCR３および４が要求される；コファクター活性にはSCR２、３、および４が要求される。C4bpのC4b 結合およびコファクター活性にはSCR１、２、および３が要求される。DAFの崩壊促進活性にはSCR２、３、および４が要求される。Ｈ因子のC3b結合活性は最初の５つのSCRにより媒介される。これらの発見に基づいて、対応する領域を修飾してC4bおよびC3bに対する親和性を増加することによってより強力な可溶性補体インヒビターを設計すること、または補体系の一部分を特異的に阻害する可溶性補体インヒビターを設計することが可能である。これらの修飾は、CR1または他のRCAタンパク質の対応するSCR 内のC3bまたはC4b結合を改変するアミノ酸の特異的な置換、あるいは１つのタンパク質から他のタンパク質へのSCRの置換の形態であり得る。１つの調節タンパク質から第２の調節タンパク質へのSCR領域の置換。 C4bおよびC3bへの結合ならびにC4bおよびC3bコファクター活性に必須な（または変え難い）アミノ酸配列を同定することにより、類似の配列の同一のタンパク質の対応する領域へのまたは他のファミリーメンバーの対応する領域への配置転換、あるいはC3bおよびC4bに結合する配列のそれらの親和性を改変するための改変が可能になる。対応する領域はアミノ酸配列相同性の程度で同定されている。 CR1の場合、問題となる４つの対応する領域は、SCR１-３、SCR８-10、SCR15-1 7、およびSCR22-24である。DAFについて図２Ｂ中で２-４と表示したSCR部分は、図２Ｂ中でCR1について１-３、８-10、15-17、および22-24と表示したSCR部分に対応する。DAFの部分を相同なCR1配列に置換することにより、コファクター活性および/または結合活性（CR1が示すような）を有するDAFの形態が提供される。同様に、MCPの部分を相同な配列に置換することにより、増加した結合親和性およびコファクター活性および/または増加した解離活性を有するMCPの形態が提供される。特定アミノ酸置換結合部位の付加特定のアミノ酸が、特定の活性部位での補体調節におけるそれらの役割を解明する研究に基づいて、置換のために選択された。置換は、同一のまたは他のタンパク質内の追加されたRCA活性部位の活性を改変するために用いられ得る。この様式において、結合およびコファクター部位は普通は直接的に結合能力に寄与していないSCRに付加され得る。本明細書中ではアミノ酸の標準的な１文字略号を用いる。例えば、CR1内のC3bおよびC4b結合ならびにコファクター配列、N-A-A-H-W-S-T -K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸49〜61）、は対応する位置または別のSCR 内の保存されたアミノ酸を参考にした位置に移動され、C3b結合を与える。逆に、CR1のSCR-2内の相同配列（すなわち、D-T-V-I-W-D-N-E-T-P-I-C-D（配列番号３のアミノ酸49-61））は、C3bおよびC4b結合ならびにコファクター活性を減少させるために、C3b結合SCR内他の位置への置換により移動され得る。C4b結合領域は、アミノ酸35、64〜65、および92〜94の付近のCR1のSCR-1およびSCR-2内の３つの分離した重要な位置と会合することが示されている。CR1または追加されるRCAファミリーメンバーあるいはこれらの位置におけるこれらの短縮、ハイブリッド、または再結合形態は、C4b結合およびコファクター活性を改変し、少なくとも１つの場合ではC3b結合およびコファクター活性を改変する。類似アミノ酸の置換構造的に類似するアミノ酸をこのような移動において、いくつかの特定のアミノ酸に置換し得る。構造的に類似するアミノ酸は以下を含む：（I、L、V）；（F 、Y）；（K、R）；（Q、N）；（D、E）；および（G、A）。アミノ酸の欠失補体調節活性を改変または増強するために特定の活性部位からアミノ酸を欠失させることも有利であり得る。短縮形態の構築いくつかの実施態様において、特定の活性を有することが既知である領域を欠失させることによって特定の活性を欠失させることは有利となる。天然に生じるタンパク質を細胞表面に固定するタンパク質の領域（例えば、膜貫通および細胞質領域または糖脂質アンカー領域）を欠失させることも所望され得る。コファクター活性を増強させる修飾一般に、C3bまたはC4bコファクター活性のいずれかを、他の因子の結合活性を増加させる置換によって増強し得る。すなわち、C4bコファクター活性を増加させるために、アミノ酸を置換して修飾されたタンパク質にC3b結合を増加させる（またはその逆）。これを実施例に例示し、特に表２に示す変異体で例示する。 C4bコファクター活性およびC3bコファクター活性の両方を増強する１アミノ酸置換の例はCR1変異体6bである：79位のＧのＤへの変更はC4bコファクターならびに C3b結合およびコファクター活性を増加する。アナログの調製本明細書中に記載される修飾されたタンパク質は組換え技術を用いることにより最も便利に調製されるが、いくつかの場合では（例えば、天然に生じるタンパク質の短縮または可溶性形態）、これらは酵素的切断により調製され得る。RCA タンパク質ファミリーの種々のメンバーをコードする遺伝子は配列が既知であり発表されている。 CR1をコードするcDNAは、Klickstein，L.B.ら、J．Exp．Med.（1987）165:109 5、Klickstein，L.B.ら、J．Exp．Med.（1988）168:1699、Hourcade，D.ら、J． Exp．Med. （1988）168:1255、に記載され、これらの教示を参考として援用する。 CR2をコードするcDNAは、Moore，M.D.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987 ）84:9194、およびWeiss，J.J.ら、J．Exp．Med.（1988）167:1047、に記載され、これらの教示を参考として援用する。 DAFをコードするcDNAは、Caras，I.W.ら、Nature（1987）325:545、およびMed of，M.E.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1987）84:2007、に記載され、これらの教示を参考として援用する。 MCPをコードするcDNAは、Lublin，D.M.ら、J．Exp．Med.（1988）168:181、に記載され、これらの教示を参考として援用する：。 C4bpα鎖をコードするcDNAは、Chung，L.P.ら、Biochem．J.（1985）230:133 に記載され、C4bpβ鎖をコードするcDNAは、Hillarp，A.およびDahlback，B.、P roc．Natl．Acad．Sci．USA （1990）87:1183に記載され、これらの教示を参考として援用する。Ｈ因子をコードするcDNAは、Ripoche，J.ら、Biochem．J.（1988）249:593、に記載され、これらの教示を参考として援用する。これらのタンパク質をコードするタンパク質が既知であり、アミノ酸配列が推定されているので、メンバーファミリーの種々のタンパク質の対応する領域の比較が可能である。さらに、cDNA配列が入手可能なので、タンパク質の短縮形態および他の修飾形態をコードする遺伝子構築物を標準的な部位特異的変異導入技術を用いて調製し得る。この部位特異的変異導入技術は例えば、Kunkel，T.A.ら、Methods Enzymol. （1987）154:367-382に記載される。従って、アナログの調製における第１のステップには、配列相同性による標的タンパク質の対応する領域の同定およびC4bまたはC3b結合特性を改変するために遺伝子のこの領域での部位特異的変異導入が要求される。アナログをコードする遺伝子を調製した後、修飾した遺伝子を標準的な組換え技術を用いて発現させる。遺伝子配列を、所望の宿主に適切であることが知られている配列の制御下で、適切な発現ベクターに連結する。組換えタンパク質の、 E．coli、B．subtilis、酵母の種々の株、およびAspergillusのような他の菌類などの微生物系での産生が周知である。高等生物の細胞において所望のアナログを産生することもまた有利であり得、この細胞は、標準的なBPV/C127系、バキュロウィルス/昆虫細胞系、CHO細胞、COS細胞、および他の哺乳類細胞、またはトランスジェニック動物の細胞などである。種々の細胞系列における標準的な発現系は当該分野に周知であり標準的である。トランスジェニック動物はいくつかの種で構築され得る。遺伝子を適切なプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターまたは組織特異的プロモーター）の制御下に置き、そして遺伝子を胚にマイクロインジェクションし、これを代理母に移植する。トランスジェニック動物での産生は他の種で使用するための移植物を調製する場合において重要である。トランスジェニック動物の構築動物供給源トランスジェニック実験に適切な動物は、標準的な市販の供給源から入手し得る。これらは遺伝子操作手法を試験するためのマウスおよびラットなどの動物、ならびに当業者に公知の技術を用いて遺伝子操作されたブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギおよび他のより大型の動物である。これらの技術を、主としてマウスおよびラットの操作に基づいて以下で簡単に要約する。マイクロインジェクション手法胚の操作およびDNAのマイクロインジェクション手法は、Hoganら、Manipulati ng the mouse embryo，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor， NY(1986)、に詳細に記載され、この教示は本明細書中に援用される。これらの技術は、他の動物種の胚に容易に適用される。成功率はより低いが、当業者には日常的に実施されていると考えられる。トランスジェニック動物雌性動物に、マウスで用いられる標準的な技術から適用した方法論を用いて、過剰排卵を誘導する。すなわち、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG; Sigma）の注射と、その48時間後のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG; Sigma）の注射で誘導する。雌をhCG注射後直ちに雄とともに置く。hCGの約１日後交尾した雌を屠殺し、切開した卵管から胚を回収して0.5%ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma）を含むDulbeccoリン酸緩衝生理食塩水中に置く。周囲細胞塊（cumulus cells）をヒアルロニダーゼ（１mg/ml）で除く。次に前核胚を洗浄し、0.5%BSAを含むEarl e平衡塩溶液中（EBSS）、37.5℃インキュベーター内、加湿雰囲気下、５%CO₂、9 5%空気で注射時まで置いた。無作為に循環させた成熟した雌を精管切除した雄と交尾させて疑似妊娠を、ドナーの雌と同時に、誘導する。胚移行時に、受容体の雌を麻酔し、卵管の直接上の体壁を切開することにより、卵管を露出させる。卵巣嚢を開き、移行される胚を卵管漏斗に挿入する。移行の後、切開を縫合により閉じる。胚性幹（ES）細胞方法 ES細胞へのcDNAの導入 ES細胞の培養および続くトランスジェニック動物の作成、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム/DNA沈澱、および直接注入などの種々の方法によるDNA のES細胞への導入の方法は、Teratocarcinomas and embryonic stem cells，a p ractical approach 、E.J．Robertson編、（IRL Press 1987）に詳細に記載され、この教示は本明細書中に援用される。トランスジーン含有ES細胞の所望のクローンの選択はいくつかの方法の１つにより達成される。配列特異的遺伝子組み込みを含む場合は、目的の遺伝子との組換えのための核酸配列またはその発現を制御するための配列を、ネオマイシン耐性のようなマーカーをコードする遺伝子とともに共沈澱させる。トランスフェクションを、Lovell-Badge，Teratocarcinom as and embryonic stem cells，a practical approach 、E.J．Robertson編、（I RL Press 1987）またはPotterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:7161(1984) に詳細に記載されるいくつかの方法の１つにより実施する。リン酸カルシウム/D NA沈澱、直接注入、およびエレクトロポレーションは好ましい方法である。これらの手法において、多数のES細胞（例えば、0.5×10⁶）を組織培養皿にプレートし、最終容量100μl中の50 mgのlipofectin存在下で沈澱させた、線状化した核酸配列と１mgのpSV2neo DNA（SouthernおよびBerg、J．Mol．App1．Gen. 1:327- 341(1982)）との混合物でトランスフェクトする。細胞にG418（200と500μg/ml の間）などの抗生物質を添加したDMEM中に10%ウシ胎児血清を含む培地を与える。G418に耐性なコロニーをクローニングリング（cloning ring）を用いて単離し、広げる。DNAを薬剤耐性コロニーから抽出し、核酸配列をプローブとして用いたサザンブロッティング実験を所望の核酸配列を有するクローンを同定するために用いる。いくつかの実験において、PCR方法を目的のクローンを同定するために用いる。 ES細胞に導入されたDNA分子はまた、相同組換えのプロセスで染色体へ組み込まれ得ることが、Capecchi、(1989)により記載された。直接注入により組み込みが高効率に生じる。所望のクローンを、注入されたES細胞のプールから調製した DNAのPCRにより同定する。プール内の陽性クローンを細胞クローニング後のPCR により同定する（ZimmerおよびGruss、Nature 338:150-153(1989)）。エレクトロポレーションによるDNA導入は、より効率が低く選択工程を要する。組換え事象の陽性選択（すなわち、ネオマイシン（neo）耐性）および二重陽性−陰性選択（すなわち、ネオマイシン耐性およびガンシクロビル耐性）の方法ならびにその後のPCRによる所望のクローンの同定は、Joynerら、Nature 338:153-156(1989 )およびCapecchi、(1989)により記載され、この教示は本明細書中に援用される。胚の回収およびES細胞注入雄と交尾させた自然に循環させた雌または過剰排卵させた雌を用いて、ES細胞の注入のための胚を回収する。適切な齢の胚を交尾の成功の後に回収する。胚を交尾させた雌の子宮角から流し出し、10%仔ウシ血清を含むDulbecco改変必須培地中にES細胞による注入のために入れる。約10〜20のES細胞を、内径約20μmのガラス性顕微針を用いて胚盤胞に注入する。胚の疑似妊娠雌への移行無作為に循環させた成熟雌を精管切除した雄とつがいにする。受容体の雌を、 ES細胞を含む胚盤胞の移植に必要とされる時に、交尾後2.5〜3.5日（マウスの場合、より大型の動物の場合はより遅い）となるように交尾させる。胚移行時、受容体の雌を麻酔する。卵巣を、卵管の直接上の体壁の切開により露出させ、子宮を外に出す。子宮角に針で穴を開けそれを通して胚盤胞を移行する。移行後、卵巣および子宮を体内に押し戻し、切開を縫合により閉じる。さらなる移行を実施する場合はこの工程を反対側で繰り返す。トランスジェニック動物の同定試料（１〜２cmのマウス尾）を若齢動物から取り除く。より大型の動物については、血液または他の組織を使用し得る。相同組換え実験におけるキメラを試験する（すなわち、ターゲットしたES細胞の動物への寄与を探す）ために、毛色（ coat color）がマウスにおいて使用されているが、より大型の動物では血液を使用し得る。DNAを調製し、サザンブロットおよびPCRの両方で分析して、トランスジェニックファウンダー（founder）（F₀）動物およびその子孫（F₁およびF₂）を検出する。一旦トランスジェニック動物を同定すると、通常の飼育で系列を確立し、その系列を、組織を取り出して、ヒトへの移植のための標準的な技術を用いて移植するために使用し得る。アナログの精製培養または動物において組換えで産生されたアナログは、クロマトグラフィー（例えば、免疫アフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィー）、および電気泳動などの標準的な精製技術を用いて細胞培養から精製し得、一般には天然に生じる物質の精製に使用される公開されているのと同じ工程を使用する。アナログの組換え産生が、タンパク質を調製するにあたって最も便利で実際的な方法である一方、アナログを、タンパク質合成技術（標準的な固相ペプチド合成技術など）を用いて合成することも望まれる。このアプローチは、修飾したアミノ酸配列を有するRCAタンパク質ファミリーの短縮形態の場合において、特に適切となり得、特に３つ以上のSCRを含むタンパク質が有用な生物学的活性を有するという発見の観点において適切である。アッセイ系アナログを、RCAファミリーの特徴のなかから所望の生物学的活性について、インビトロまたはインビボアッセイを用いて試験する。WongおよびFarrell（J． Immuno. （1991）146:656）により記載されるようなインビトロ系を補体経路に対する効果を測定するために使用し得る。インビボおよび一般の生物学的効果をWe ismanら（Science（1990）249:146）；またはYehら（J．Immunol.（1991）146:2 50）に記載のとおり評価し得、この教示は参考として援用される。結合アッセイアフィニティークロマトグラフィーカラムを、Krychら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA 88:4353-4357に記載のとおり調製した。結合アッセイを、100 mlのiC3- セファロース（iC3-S）またはC4b-セファロース（C4b-S）および変異体タンパク質を含有する1.8 mlの培地を用いて実施した。培地を所望のNaCl濃度まで希釈した。回転体上での室温１時間の後、試料を遠心分離し、培地を除去して、結合したタンパク質をセファロースから１% NP-40を含む400 mM NaClを用いて溶出した。溶出したタンパク質をELISAにより定量し、これには２つの抗CR1モノクローナル抗体、3D9およびE11を用いた（Hoggら、Eur．J．Immunol. 14:236-240(1984) 、O'Sheaら、J．Immunol. 134:2580-2587(1985)）。いずれのモノクローナル抗体もCR1のSCR１、２、８、または９と反応しないので、CR1-4またはCR1-4(8,9) のいずれにか由来する全ての変異体は、このアッセイを用いて定量し得た。それぞれの変異体タンパク質について、異なるトランスフェクションに由来する少なくとも３回の結合アッセイを実施した。コファクター活性のためのアッセイ C3およびC4を、Dykmanら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:1698-1702(1983) 、Dykmanら、J．Exp．Med. 157:2160-2165(1983)の方法に従って精製するかまたは購入し（Quidel，San Diego，CA）、C3bおよびC4bに転換してIodogenコートしたビーズ（Pierce）を用いて¹²⁵Iで標識した。コファクターアッセイを、200 ng の標識したC3bまたはC4b、60 ngのＩ因子（Quidel）および変異体タンパク質を含む培地を用いて実施した。コファクタータンパク質の量を、分泌されたCR1（s CR1、Weismanら、Science 249:146-151(1990)）の標準曲線に基づいたELISAアッセイで概算した。C3bの切断を試験するために、約６pgの変異体タンパク質を含有する試料を37℃で１時間インキュベートした。C4bの切断を試験するために、試料を37℃で最高16時間までインキュベートした。インキュベーションの後、試料を0.25% TRIS，pH 6.8中に２% SDSおよび５%βメルカプトエタノールを含む緩衝液中で煮沸することにより還元し、４〜20% SDS-PAGE（Integrated Separatio ns）または自分で作成した10%のゲル中で電気泳動した。乾燥後、ゲルを-70℃で増感スクリーンを使用してオートラジオグラフした。薬学的組成物の調製および投与インビトロアッセイに基づく最も強力なアナログをインビボで試験する。一般に、インビトロアッセイは対応するインビボアッセイに高度に相関すると認められている。適切な容量を、天然に生じるタンパク質のインビトロ活性とアナログのインビトロ活性を比較し、天然に生じるタンパク質のインビトロ活性と天然に生じるタンパク質のインビボ活性を比較し、そしてアナログの予想されるインビボ活性を算出し、半減期におけるいかなる測定された差異を調製して決定する。補体活性化で、全身性エリトマトーデス、リューマチ、溶血性貧血、重症筋無力症などの多様な自己免疫/免疫複合体介在性の症候群における実質的な組織損傷を説明し得る。これらの場合において、補体系の阻害が望ましい治療的緩衝である。いくつかの場合では、RCAアナログによる古典経路のみの特異的阻害が好ましくあり得る。なぜなら長期間の第二経路の阻害は副作用を導き得るからである。補体活性化の阻害はまた、心筋梗塞、脳血管偶発症候（cerebral vascular ac cidents）または急性ショック肺症候群（acute shock lung syndrome）などの血管外傷により引き起こされる組織損傷を含む場合において望ましくあり得る。これらの場合で、補体系は、再潅流傷害におけるような部分的に損傷された組織の破壊に寄与し得る。比較的短期間の高度に厳密な補体の阻害がこれらの場合において好ましくあり得、より高い効力のために設計された可溶性RCAアナログが特に有用であると判明し得る。補体阻害はまた異種移植物拒絶の防止において重要であると判明し得る。ヒト DAFまたはMCPについてトランスジェニックな動物に由来する器官は、異種移植物の細胞表面のトランスジェニックなDAFまたはMCPの発現により、補体介在性の超急性拒絶から少なくとも部分的に保護され得る。より高い効力のために設計されたRCAアナログについてトランスジェニックな動物は、より好結果を得られる異種移植物を提供し得る。可溶性RCAアナログは受容者中の移植物を保護することにおいて有用であると判明し得る。減少した活性を有する可溶性アナログもまた天然のインヒビターの競合的インンヒビターとして有用であり得る。これは、補体介在性の応答の増加が望ましい場合または個人が天然のインヒビターの過剰産生によりその免疫性が弱められる不全を有する場合である。アナログは、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または制御放出処方物のような薬学的に受容可能なキャリアー中で局所または全身に投与され得る。アナログの用量レベルおよび投与の様式は、アナログの性質、治療される状態の特徴、および個々の患者の経歴に依存する。全身投与が一般に必要とされ、これは注射あるいは経粘膜（transmucosal）または経皮送達により行われる。注射による投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であり得る。注射のための処方物は、一般に活性成分の生体適合性溶液（ハンクス液またはリンガー液など）である。経皮または経粘膜投与のための処方物は、一般にフシジン酸または胆汁塩を界面活性剤または表面活性剤と組み合わせて含有する。そしてこの処方物は、エアロゾル、坐剤、または膏薬として製造され得る。経口投与は一般にタンパク質性またはペプチド性の活性成分のためには好まれない；しかし、消化酵素から保護されるように適切に製剤される場合は、経口投与も使用され得る。投与の望ましい様式のための適切な処方物は、Remington's Pharmaceutical S ciences 、最新版、Mack Publishing Co.，Easton，PAに見出され得る。用量レベルおよび正確な処方は当該分野に一般的に知られる慣習的な至適化手法により得ることが可能である。診断適用 C3bおよび/またはC4bに結合し得るアナログは、生物学的液体中のC3b、または C4b、またはC3b/C4bを有する免疫複合体の存在、非存在、または量を評価するための診断的道具として有用である。このようなアッセイは、C3bおよび/またはC4 bに特異的に結合するアナログの能力を利用し、一般に知られる種々の形式で実施し得る。特異的結合パートナーアッセイのための形式は、直接または競合的形式、サンドウィッチアッセイ、および凝集アッセイを含む。特異的結合対のメンバー間の複合体化は、溶液内または固相上でおこなわれ得、蛍光、放射性同位元素、発色団、および可視粒子を含む種々の標識技術を用いて検出し得る。 C3bおよび/またはC4bおよび/またはC3b/C4bを有する免疫複合体のアッセイにおいて有用な典型的な試薬キットは、検出体（analyte）に特異的に結合するアナログ（これは任意に固体支持体と結合されている）およびアッセイに有用なさらなる標識試薬を含む。例えば、アッセイの多くの形式の１つは、試験される試料を、特異的結合パートナーとしてのアナログを結合させた固体支持体で処理する工程、検出体を含有すると考えられる試料で処理された支持体を洗浄する工程、および洗浄された支持体を西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素で標識した抗C3b抗体または抗C4b抗体で処理する工程を含む。そして支持体上の標識された酵素の存在が基質溶液の添加（これは酵素の存在下での呈色を生じさせる）により検出される。本発明は、以下の限定されない実施例を参考にしてさらに理解され得る。実施例１：短縮CR1の結合特異性。成熟CR1の最初の543アミノ酸（SCR１-８およびSCR-9の1/2）をコードするcDNA をCOS細胞中にトランスフェクトしてCR1-4と名付けられた分泌タンパク質を得た。２つのマウスモノクローナル抗CR1抗体を,CR1-4の免疫反応性を決定するために、そしてこのタンパク質をアッセイする方法として用いた。抗体E11（Hogg，N .ら、Eur．J．Immunol.（1984）14:236-243）、および3D9（O'Shea，J.J.ら、J ．Immunol. （1985）134:2580-2587）はCR1を認識し、組換えで産生したCR1-4に結合した。 C4bまたはC3bへの結合を、Sepharose^TM支持体に結合したC4bまたはiC3（破壊されたチオエステル結合を含むC3で、反応性および機能においてC3bに類似している）のいずれかを用いて、Dykman，T.ら、Proc．Natl．Acad．Sci USA（1983 ）80:1698-1702、およびCole，J.L.ら、Proc．Natl．Acad．Sci USA（1985）82: 859-863に記載の通り試験した。これらの固体支持体化基質への結合を、CR1についてのELISAを用いた試験によって確かめた。 C4b誘導化支持体は、CR1-4に結合し得た。最も効率的な結合は12.5と25 mMとの間の塩で生じた。可溶化したC4bはCR1-4タンパク質のC4b誘導化支持体への結合を阻害したが、可溶性iC3はこの結合を阻害しなかった。これはCR1-4が本来C4bに結合しiC3（C3 b）には結合しないことを追認する。実施例２：CR1-4アナログの構築。 CR1-4の種々の変異形態を構築し、上の実施例１に記載のようにC4bおよびiC3 への結合活性について試験した。表２は構築したアナログならびにアナログの結合およびコファクター活性を示す。表２中で、修飾を、アミノ酸番号および生じた変換により示す。番号は、CR1におけるSCR-1（配列番号１）、SCR-2（配列番号３）、SCR-8（配列番号２）、およびSCR-9（配列番号４）のアミノ酸配列を記載する図３Ａおよび３Ｂに記載される番号に対応する。短縮形態において示された組み合わされた変化は、修飾された完全長タンパク質の活性を予言するに相違ない。CR1の主要な多型形態（30のSCR）における３つの本来の結合およびコファクター部位を確立する得られる強力な証拠が存在する。１つの部位はほぼ排他的にC4bと相互作用し（SCR１-４）、一方他の２つの部位は、アミノ酸配列においてほぼ同一であり、C4bおよびC3bの両方と相互作用する（SCR８-11およびSCR15-18）［Klickstein，L.B.ら、J．Exp．Med. 168:1699- 1717(1988); Kalliら、J．Exp．Med. 174:1451-1460(1991); Makrides，S.C.ら、J．Biol．Chem. 267:24754-24761(1992)］。 CR1の電子顕微鏡分析は、独立した球状ドメイン（SCR）で構成される厳密ではない桿状体（semi-rigid rod）であることを示唆する。それゆえ、CR1は良好に分離された活性部位を有する伸長型のタンパク質として描写される。これらの部位は共同的には作用しない。種々の多型形態（第１の部位（SCR１-４）および１、２、および３コピーの第２の部位を含む）の比較によっては、コファクターおよび崩壊促進アッセイにおけるこれらの間での差異がほとんど示されなかった。これは、Seya，T.ら、J．Immunology 135:2661(1985)により報告された。実際、本発明が優先権主張する出願の登録後、単一の活性部位のみ（SCR１-４またはSC R15-18）を有するCR1の修飾された膜形態が、CHO細胞をヒト補体介在性溶解から保護し得ることが示された（Makrides，S.C.ら、J．Biol．Chem. 267:24754-247 61(1992)）。このことは、１つの活性部位を有する単純なCR1の形態が生物学的に活性であり、構築物内のそれぞれの本来の部位の活性を改善する修飾が共に複数部位CR1形態に組み込まれ、改善されたレギュレーターを生じるという支持的な証拠を提供する。表２に示されるように、SCR-1またはSCR-2のいずれかの欠失の結果、C4b結合活性の損失が起こる；従って、どちらの領域もC4bへの結合には必要である。C3b への結合は、SCR-9配列S-T-K-P-(P-I-C)-Q（配列番号４のアミノ酸54〜61）をSC R-2（配列番号３）に挿入することによって与えられる；しかし、SCR-1（配列番号１）の欠失は、このアナログにおけるC3bへの結合を部分的に排除する。従って、C3bへの効率的な結合は、SCR-2（配列番号３）における関連した配列だけでなく、SCR-1（配列番号１）の追加部分を必要とする。SCR-2（配列番号３）内の配列を変更することによって与えられるC3bへの結合能力は、C4bへの結合に影響しない。表２にさらに示されるように、アミノ酸35、64〜65または94を変更することによりC4bへの結合を弱めるかまたは破壊することが可能である。アミノ酸92を変更することによりC4b結合を強くすることが可能である。これらの結果は、CR1中のC3bおよびC4b結合部位を操作することにより、CR1-4 の親和性および特異性を変更し得ることを示す。RCAタンパク質ファミリーの更なるメンバーにおける対応する領域に同様の変更を行い得る。実施例３：より強力な可溶性ＣＲ１アナログの構築より高い能力が必要とされる場合には補体系の厳密なインヒビターを適用する。本実施例では、sCR1配列を、古典経路および第二経路に対してより高い阻害能力を持つアナログのファミリーの出発材料として用いた。他の短縮された、全長の、再結合された、またはハイブリッド形態のCR1あるいはCR1もまた用い得る。上記のように、sCR1タンパク質は、４つの対応する領域：SCR1-2（それぞれ配列番号１および３）、SCR8-9（それぞれ配列番号２および４）、SCR15-16および SCR22-23、を含む。本来のC4b結合部位はSCR1-2（それぞれ配列番号１および３）内にあり、そして２つの本来のC3b結合部位はSCR8-9（それぞれ配列番号２および４）およびSCR15-16にある。SCR22-23には、結合活性は報告されていないが、SCR22-23は他の３つの対応する領域とアミノ酸配列に高い相同性を有する。可溶性CR1の対応する領域であるSCRの1-2、8-9、15-16、および22-23に１つ以上の置換が導入される。C3bおよびC4bコファクターの活性を増加させるように特定の置換を設計し、そして結合活性は、以下から選択される：位置置換 35 Ｇ（配列番号１のアミノ酸35） 64-65 R-N（配列番号３のアミノ酸４〜５） 94 Ｙ（配列番号３のアミノ酸34） 109-112 N-A-A-H（配列番号４のアミノ酸49〜52） 114-121 S-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸54〜61） 109-121 N-A-A-H-W-S-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸49〜61） 92 Ｔ（配列番号４のアミノ酸32） 79 Ｄ（配列番号４のアミノ酸19） 12-16 K-L-K-T-Q（配列番号２のアミノ酸12〜16） 18-21 N-A-S-D（配列番号２のアミノ酸18〜21） 12-21 K-L-K-T-Q-T-N-A-S-D（配列番号２のアミノ酸12〜21） 27-29 S-L-K（配列番号２のアミノ酸27〜29）ある場合には、これらのアミノ酸のいくつかは、対応する位置にすでに存在し得る。ある場合には、構造的に類似のアミノ酸が上記の置換の代わりに置換され得る。いくつかのまたは４つの全ての対応する位置にこれらの置換を用いることにより、より強い活性部位を有し、そしてSCR22-24にさらなる活性部位を有する完全長の可溶性CR1形態を生じる。 sCR1のC3bおよびC4b含有標的に対する親和性を増加させるために、上記の置換を目的の対応する領域に導入した。これらの修飾を設計して存在するコエンザイムの使用および解離機能を増加させ、そして新規なコエンザイムおよび解離機能を潜在的に確立した。C3b結合に重要なアミノ酸配列をC4b結合領域に導入することはおそらくC4b活性を実質的に妨害しないであろう。なぜなら、CR1-4におけるそのような置換は、CR1-4のC4b結合特性を検出可能なほどに変更しないからである。C4b結合に重要なアミノ酸をC3b結合領域に導入することは、おそらくC3b結合活性を実質的に妨害しないであろう。なぜなら、実質的なC3b結合は、CR1-4変異体11で生じ、そこでは、SCR1-2に特異的な多くのアミノ酸（C4b結合に重要なアミノ酸を含む）が既に存在するからである。 C4bに対する親和性を増加させるために設計された特別な置換を実施例３に示した：SCR1-2（配列番号１および３）はCR1の本来のC4b結合部位であり、92位のＩ（配列番号３のアミノ酸32）をＴ（配列番号４のアミノ酸32）で置換することにより修飾されている；SCR8-9（配列番号２および４）および同一のSCR15-16は、対応する位置35のＥ（配列番号２のアミノ酸35）をＧ（配列番号１のアミノ酸 35）（またはＡ）で置換することにより、対応する位置94のＨ（配列番号４のアミノ酸34）をＹ（配列番号３のアミノ酸34）（またはＦ）で置換することにより、対応する位置64のＫ（配列番号４のアミノ酸４）をＲ（配列番号３のアミノ酸４）で置換することにより、対応する位置65のＴ（配列番号４のアミノ酸５）をＮ（配列番号３のアミノ酸５）（またはＱ）で置換することにより修飾されている。SCR22-23もまた、対応する位置64のＧをＲ（配列番号３のアミノ酸４）（またはＫ（配列番号４のアミノ酸４））で置換することにより、対応する位置65のＰをＮ（配列番号３のアミノ酸５）（またはＱ）で置換することにより、対応する位置92のＥをＴ（配列番号４のアミノ酸32）で置換することにより、対応する位置94のＦをＹ（配列番号３のアミノ酸34）で置換することにより修飾されている。まとめると、これらの修飾の結果、C4bへの親和性は高くなり、そして新規なコエンザイムまたは解離機能の確立、またはsCR1出発物質に存在するコエンザイムおよび解離機能の能力の改善につながる。先の実施例で記載したように、短い長さのアミノ酸を、対応するSCR8-9のアミノ酸（配列番号２および４）によって置き換えてCR1-4のSCR-1-2へ入れることにより、CR1-4にC3b結合能力を与える。sCR1のSCR1-2の位置114-121のD-N-E-T-P-I -C-D（配列番号３のアミノ酸54-61）をS-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸 54-61）で置換することはsCR1のC3bへの親和性を増加させる。さらに、SCR22-23 の位置114-121のD-K-K-A-P-I-C-D（配列番号５）をS-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸54-61）で置換することはsCR1のC3bへの親和性を増加させる。いくつかの構造的に類似のアミノ酸もまたS-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸5 4-61）配列において置換され得る。一般に、より強力な補体インヒビターは、増加したC4b結合および増加したC3b 結合を与える。これは、上記の全ての修飾を導入することにより達成される。実施例４：増加した活性を有する短縮されたCR1変異体の構築いくつかの異なる塩濃度でのコファクター活性について25以上の変異体をアッセイした。このアッセイは、Adams,E.M.、Brown,M.C.、Nunge,M.、Krych,M.、およびAtkinson,J.P.(1991)J.Immunology、147:3005-3011に記載されたように行った。 SCR1-3の活性部位（この部位は、通常、C4bとは相互作用するがC3bとはしない）の多くの変異は、C4bおよびC3bの両方のコファクター活性に関するこの部位の元々の活性を改善する。SCR8-11の活性部位（明らかに、より強力な天然の活性部位）におけるこの部位のC3bおよびC4bのどちらに対するコファクター活性も改善する少なくとも１つの変異が検出された。まとめると、C3bおよびC4bの両方のコファクター活性を有し、そしていくつかの方法で全長の可溶性CR1に改善を加えた特異的CR1タンパク質が、今、同定された。これらの構築物は、可溶性CR1(sCR1)のサイズの1/4（７個のSCRの構築物）から1/3より少なく、そしてC4b結合およびコファクター活性、ならびにC3b結合およびコファクター活性のどちらも有する。３個のSCRしか含まない構築物は、C 3bコファクター活性を有するようであり、C3b結合活性を示す。いくつかの場合、データは修飾された活性部位が天然の活性部位より強力であるようであることをしめす。これらの形態およびその活性を表３に示す。実施例５：ＤＡＦアナログ膜結合補体レギュレーターDAFは、C3bおよびC4b含有転換酵素の解離を容易にするが、C3bまたはC4bには結合せず、またC3bまたはC4bのＩ因子介在性のタンパク分解性不活性化のためのコファクターとしても作用しない。特定の状況の下では、DAF、または短縮形態、再結合形態、もしくはハイブリッド形態のDAFの補体調節活性を増加させることが所望され得る。アミノ酸配列の相同性に基づくと、DAF SCR2-3は、CR1活性領域に対応する。D AFのSCR2-3とCR1のSCR1-2との間の相同性が40％であるのに対し、DAFのSCR2-3と CR1のSCR8-9との間の相同性は39％であった。これらアラインメントの中にはいくつかのマッチしていないアミノ酸があるので、DAFの位置番号は、CR1の位置番号と正確には一致していない。 DAFのSCR2-3に１以上の置換を導入する。C3bおよびC4bコファクター活性および結合活性を与えるために設計された特別な置換を以下から選択する： DAFの位置はLublinおよびAtkinson、Ann.Rev.Immunol.9:431(1991)のように番号付けした： DAFの位置180-187の(LubinおよびAtkinson、Ann.Rev.Immunol.(1989)7:35-58 の番号付けを用いて)S-D-P-L-P-E-C-R（配列番号６）をS-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸54-61）で置換することは、DAFのC3bへの親和性を増加させる。S-D-P-L-P-E-C（配列番号６のアミノ酸1-7）をS-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸54-61）で置換することは、このセグメントの末端にＲを残す。なぜなら、Ｒは、CR1のSCR1-2（配列番号１および３）およびCR1のSCR8-9（配列番号２および４）の対応する位置に見出されるからである。いくつかの構造的に類似したアミノ酸が、S-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸54-61）配列内で置換され得る。 DAFの位置130のＰをＲに置換することは、DAFのC4bへの親和性を増加させる。 CR1内のC4b相互作用に重要であることが見出された他の全てのアミノ酸は、DAF のSCR2-3に既に存在している。 DAFのC3b（およびおそらくC4bも）への親和性の増加により、これらの置換はD AFの補体活性化への５つそれぞれの阻害効果を高める。実施例６：Ｈ因子のアナログＨ因子は、20のSCRのみからなる血漿タンパク質である。Ｈ因子は、C3b結合、およびC3bコファクターおよび解離能力を示すが、C4bを不活性化するかまたはC4 bに結合する明らかな能力は示していない。Ｈ因子は既に血漿タンパク質として進化しているので、可溶性RCAアナログへの出発材料としてそれを用いることには利点がある。Ｈ因子の活性部位は正確には知られていないが、Ｈ因子の始めの 5.5のSCRからなるタンパク質分解性フラグメントは、C3b結合およびコファクター活性を示す（Alsenzら、Biochem.J.(1984)389）。Ｈ因子のC3b結合の親和性を増加させるために、N-A-A-H-W-S-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸49-61）をいくつかのSCR（CR1のSCR 8-9に近い類似がない）に導入する。１つの実施態様では、始めの６のSCRを修飾せずにおき、したがって、元の活性部位（１つまたは複数）を保持し、残りの14のSCRを、N-A-A-H-W -S-T-K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸49-61）でCR1に相同な位置に置換することにより修飾する。いくつかの構造的に類似したアミノ酸は、N-A-A-H-W-S-T- K-P-P-I-C-Q（配列番号４のアミノ酸49-61）配列において置換し得る。相同な位置は、容易に同定され得る。なぜなら、ＷはこのC3b結合セグメントの前にあり、ほとんどのSCR（SCR10およびSCR20以外の全てのＨ因子のSCRにおいて）で見られるからである。一方C3b結合セグメント内のＣは、全ての既知のSCRで見られる。全ての置換が必ずしも結合活性の付加を与えるわけではない。なぜなら、これらのＨ因子のSCRは、CR1のSCR 1-2およびCR1のSCR 8-9領域への相同性が低いからである。しかし、少なくともいくつかの修飾されたＨのSCRは、C3b結合能を取得し、その結果、C3bに対して非常に高い親和性を有するＨ因子アナログが得られる。上記で考察したように、高い親和性は、始めの６つのＨのSCRに既に存在している活性部位のより多くの使用につながる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＡ 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＲＡＢＧ 0276−2Ｊ 33/566 ＡＢＮ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤＡＢＳＡＢＡＡＣＤＡＢＧＡＥＤ 9051−4ＣＡＢＳＧ０１Ｎ 33/53 9051−4ＣＡＢＮ 33/566 9051−4ＣＡＣＤ (72)発明者クリチ，マルガーザタアメリカ合衆国ミズーリ 63108，セントルイス，ナンバー９，ウェストパイン 4225

Claims

【特許請求の範囲】１．補体の活性化を調節するタンパク質のアナログであって、補体レセプター２、崩壊促進因子、メンブランコファクタープロテイン、C4結合タンパク質、およびＨ因子からなる群より選択されるアミノ酸配列のショートコンセンサスリピートを有し、そしてこれら補体調節タンパク質において、カルボキシ末端が除去されて該タンパク質が分泌され、ここで、該タンパク質のアナログが第２の、異なる補体調節タンパク質に由来するショートコンセンサスリピートを含む補体調節タンパク質からなる群より選択され、補体調節タンパク質において該ショートコンセンサスリピートが再配置され、補体調節タンパク質は、結合活性、コファクター活性、および崩壊促進活性を有する反復からなる群より選択される該ショートコンセンサスリピート内に定義されたアミノ酸置換を有し、ここで、該置換は天然に生じる補体調節タンパク質の活性を変化させ、そして補体調節タンパク質は、３つ以上のショートコンセンサスリピートからなり、ここで、該タンパク質は補体調節活性を有する。２．前記補体調節活性が、C3b結合活性、C3bコファクター活性、C4b結合活性、C 4bコファクター活性、および崩壊促進活性からなる群より選択される、請求項１に記載のアナログ。３．前記タンパク質が崩壊促進因子である、請求項２に記載のアナログ。４．前記タンパク質がＨ因子である、請求項２に記載のアナログ。５．前記タンパク質のC3b結合およびコファクター活性が、該タンパク質のC4b結合を増加させる置換によって高められる、請求項２に記載のアナログ。６．前記タンパク質のC4b結合およびコファクター活性が、該タンパク質のC3b結合を増加させる置換によって高められる、請求項２に記載のアナログ。７．CR1アナログ、または前記カルボキシ末端が除去されて前記タンパク質の分泌を可能にするCR1アナログであって、該アナログが、ショートコンセンサスリピート内に、以下からなる群より選択される変化に対応する変化を有する、CR1 アナログ：最初の122アミノ酸(SCR1-2)がCR1アミノ酸497-618(SCR8-9)で置換されているCR1-4、および194-253を欠失し、アミノ酸271-543をT-R-T-T-F-H-L-G-R -K-C-S-T-A-V-S-P-A-T-T-S-E-G-L-R-L-C-A-A-H-P-R-E-T-G-A-L-Q-P-P-H-V-Kまたは構造的に類似したアミノ酸で置換したCR1-4(8,9)；および、第２の異なる補体調節タンパク質に由来するショートコンセンサスリピートを含むCR1アナログからなる群より選択されるCR1アナログ、定義されたアミノ酸置換を、CR1のC3b結合リピート以外の結合活性、コファクター活性、および崩壊促進活性を有するリピートからなる群より選択されるショートコンセンサスリピート内に有するCR1アナログ、ならびに３つ以上のショートコンセンサスリピートからなるCR1アナログ、ここで該タンパク質が補体調節活性を有する、CR1 アナログ。８．補体レセプター１のタンパク質アナログであって、該タンパク質がショートコンセンサスリピート内に、以下からなる群より選択される補体レセプター反復への変化に対応する変化を有する、アナログ：79:D；37,39:Y,D；92:T；109-112 :N-A-A-H；109-112，114-117，121:N-A-A-H，S-T-K-P...Q；114-117，121; N-A- A-H，S-T-K-P...Q；116:K；116，117:K-P；92-94:K...Y；99，103，106:S...T.. .I；109-112:P-T-V-I；110:T；111:V；112:I；114:D；115:N；121:D；117:T；1, 3:Q...N；6-9:E-W-L-P；12-16，18-21:K-L-K-T-Q...N-A-S-D；27,29:S...K；37: S；44,47,49:I...K...S；52-54,57,59:T-G-A...R...R；78-79,82:K-G...F；85,8 7:Q...K；12-16,18-21:R-P-T-N-L...D-E-R-E；27,29:Y...N；35,64-65,94:G...R -N...Y、構造的に類似したアミノ酸による置換、およびそれらの組み合わせ。９．前記補体調節タンパク質が崩壊促進因子であり、ここで、以下からなる群より選択される崩壊促進因子のショートコンセンサスリピートSCR2-3に対応するタンパク質領域に１以上の置換が導入される、請求項２に記載のアナログ：180-18 7:S-T-K-P-P-I-C-Q；175-178:N-A-A-H；175-187:S-T-K-P-P-I-C-Q-N-A-A-H；130 :R；145:D；77-84:K-L-K-T-Q-T-N-A-S-D；90-92:S-L-K、構造的に類似したアミノ酸による置換、およびそれらの組み合わせ。１０．前記補体調節タンパク質が、該タンパク質に、C3b結合活性、C3bコファクター活性、C4b結合活性、C4bコファクター活性からなる群より選択される活性を与える配列を含むＨ因子であり、該配列が補体レセプター１、メンブランコファクタープロテイン、C4結合タンパク質、およびＨ因子からなる群より選択されるタンパク質に由来する、請求項１に記載のアナログ。１１．前記タンパク質が、実質的に３つのショートコンセンサス領域からなり、そして２つの補体調節活性を有する、請求項１に記載のアナログ。１２．投与を必要とする患者に投与するために、さらに薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１に記載のアナログ。１３．補体の活性化を調節するタンパク質のアナログを作成する方法であって、補体レセプター２、崩壊促進因子、メンブランコファクタープロテイン、C4結合タンパク質、およびＨ因子からなる群より選択されるアミノ酸配列のショートコンセンサスリピートを有し、そしてこれら補体調節タンパク質において、カルボキシ末端が除去されて該タンパク質を分泌させ、ここで、該タンパク質のアナログが第２の、異なる補体調節タンパク質に由来するショートコンセンサスリピートを含む補体調節タンパク質からなる群より選択され、補体調節タンパク質において該ショートコンセンサスリピートが再配置され、補体調節タンパク質は、結合活性、コファクター活性、および崩壊促進活性を有する反復からなる群より選択される該ショートコンセンサスリピート内に定義されたアミノ酸置換を有し、ここで、該置換は天然に生じる補体調節タンパク質の活性を変化させ、そして補体調節タンパク質は、３つ以上のショートコンセンサスリピートからなり、ここで、該タンパク質は補体調節活性を有する。１４．前記補体調節活性が、C3b結合活性、C3bコファクター活性、C4b結合活性、C4bコファクター活性、および崩壊促進活性からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。１５．前記タンパク質が崩壊促進因子である、請求項１３に記載の方法。１６．前記タンパク質がＨ因子である、請求項１３に記載の方法。１７．前記タンパク質のC3b結合およびコファクター活性が、該タンパク質のC4b 結合を増加させる置換によって高められる、請求項１３に記載の方法。１８．前記タンパク質のC4b結合およびコファクター活性が、該タンパク質のC3b 結合を増加させる置換によって高められる、請求項１４に記載の方法。１９．請求項７に記載の補体レセプター１のタンパク質アナログを作成する方法であって、前記適切な変化を該アナログをコードする前記DNAに起こす工程、および該アナログを適切な発現宿主において発現させる工程を包含する方法。２０．請求項８に記載の補体レセプター１のタンパク質アナログを作成する方法であって、前記適切な変化を該アナログをコードする前記DNAに起こす工程、および該アナログを適切な発現宿主において発現させる工程を包含する方法。２１．前記補体調節タンパク質が崩壊促進因子であり、ここで、以下からなる群より選択される崩壊促進因子のショートコンセンサスリピートSCR2-3に対応するタンパク質領域に１以上の置換が誘導される、請求項１４に記載の方法：180-18 7:S-T-K-P-P-I-C-Q；175-178:N-A-A-H；175-187:S-T-K-P-P-I-C-Q-N-A-A-H；130 :R；145:D；77-84:K-L-K-T-Q-T-N-A-S-D；90-92:S-L-K、構造的に類似したアミノ酸による置換、およびそれらの組み合わせ。２２．前記補体調節タンパク質が、該タンパク質に、C3b結合活性、C3bコファクター活性、C4b結合活性、C4bコファクター活性からなる群より選択される活性を与える配列を含むＨ因子であり、該配列が補体レセプター１、メンブランコファクタープロテイン、C4結合タンパク質、およびＨ因子からなる群より選択されるタンパク質に由来する、請求項１３に記載の方法。２３．補体レセプター１、補体レセプター２、崩壊促進因子、メンブランコファクタープロテイン、C4結合タンパク質、およびＨ因子からなる群より選択される異なるタンパク質に由来する少なくとも１つのショートコンセンサスリピートを含む、請求項１３に記載の方法。２４．前記タンパク質が、C3bコファクター活性、C4bコファクター活性、および崩壊促進活性を含む、請求項１３に記載の方法。２５．前記タンパク質が、実質的に３つのショートコンセンサス領域からなり、そして２つの補体調節活性を有する、請求項１３に記載の方法。２６．投与を必要とする患者に投与するために、さらに薬学的に受容可能なキャリアを前記アナログと混合する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。２７．請求項１、７、または８のアナログをコードするＤＮＡ配列。２８．適合し得る組換え宿主細胞に形質転換された場合に、請求項１のアナログを発現し得る発現系中の請求項２７のＤＮＡ配列であって、該発現系は、該宿主と適合する制御配列に作動可能に連結された該アナログをコードするＤＮＡを含む。２９．トランスジェニック動物のゲノムに安定に組み込まれた請求項２７に記載のＤＮＡ配列。３０．前記補体調節タンパク質のC4bコファクター活性またはC3bコファクター活性を高める方法であって、該タンパク質がC4bコファクター活性またはC3bコファクターのいずれかを有し、該タンパク質に配列を付加して、他のリガンド、C4b またはC3bのいずれか、の結合を与える工程を包含する、方法。