JPH09506768A - 複製開始点複合体遺伝子、蛋白および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡ複製開始点複合体（ＯＲＣ）遺伝子、遺伝子組換えＯＲＣペプチド、並びにＤＮＡ結合蛋白の同定および本組成物の使用方法が提供される。そのようなＯＲＣ遺伝子を含むべクターおよび細胞は、遺伝子組換えＯＲＣペプチドの製造に用いられることが見出された。本ＯＲＣペプチドは、疾患、特にカビの感染および新生増殖性疾患の診断、予後または治療に有用なＯＲＣ選別物質のスクリーニングに特に有用であることが見出された。選別されるＤＮＡと直接または間接的に連繋する蛋白をコードする遺伝子を同定する方法は、ハイブリッド蛋白の発現ライブラリーでレポーター株を形質転換することを含み、このときライブラリーは構成要素として発現される転写活性化ドメインに融合された蛋白コード配列を含み、さらにレポーター株はそのプロモーター領域に少なくとも１コピーの選別ＤＮＡ配列をもつレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子の転写または翻訳生成物を発現しているクローンを検出し、さらに回収する。

Description

【発明の詳細な説明】 複製開始点複合体遺伝子、蛋白および方法技術分野 本発明の技術分野は、ＤＮＡの転写および複製で必要とされる複製開始点複合 体遺伝子(Origin of Replication Complex gene)に関する。背景 真核細胞ＤＮＡ複製の初期事象で必要とされるエレメントはビール酵母菌（Sa ccharomyces cerevisiae）で明らかになり始めた。決定的に重要な第一のステッ プは、酵母染色体に由来する自律的複製配列（ＡＲＳ）エレメントの同定で、そ の後ＡＲＳサブセットがＤＮＡ複製の染色体起点として機能することが示された （参考文献１１で概説）。数多くのＡＲＳエレメントの配列比較によって、ＡＲ Ｓのコンセンサス配列（ＡＣＳ、１２）が同定された。この配列は酵母のＤＮＡ 複製開始点としての機能のために必須である（７、１２、１３）。効率的なＡＲ Ｓ１機能に必要なさらに別の３エレメントが同定された。それぞれ別個に変異を 起こさせた場合、これらのエレメント（Ｂ１、Ｂ２およびＢ３と呼称される）は ＡＲＳ１活性の微かな低下をもたらす。しかしながら、これらＢ因子の２つまた は３つが同時に変異した場合は、ＡＲＳ１機能は顕著に下落する（１４）。 ＡＲＳ１のうちの２エレメントを認識する蛋白が同定された。酵母の転写因子 ＡＦＢ１はＢ３エレメントに結合しその機能を仲介する（１１、１４）。もっと 最近になって、本出願人らは高度保存ＡＣＳを特異的に認識する多蛋白複合体を 同定した（１５）。この活性（開始点認識複合体（ＯＲＣ）と呼称される）は、 それを酵母の複製開始点におけるイニシエーター蛋白として作用する興味深い候 補物質とする幾つかの蛋白を含む。この蛋白の結合にはＡＣＳが必要であり、さ らにコンセンサス配列における変異のＡＲＳ１機能に対する影響は、ＯＲＣのＤ ＮＡ結合に対する同じ変異の影響と一致する。ＯＲＣは、そのうちの幾つかが既 にＤＮＡ複製開始点として知られている１０個以上のＡＲＳエレメントと結合す る（１５）。ＯＲＣによる特異的なＤＮＡ結合はＡＴＰを必要とし、このこと はＯＲＣはＡＴＰと結合する（多数の既知のイニシエーター蛋白の特性である） ことを示唆している（１７）。ＯＲＣはまた、ＡＲＳ機能のために重要であるこ とが分かっているＡＣＳ以外の他の配列とも相互反応する（１８、１９）。さら に、ＯＲＣはＡＣＳの機能を仲介するという仮説は、in situデオキシヌクレア ーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）フットプリンティング実験（これによってＡＲＳ１の保 護領域が同定される）の結果がインビトロでＯＲＣで観察されたものと酷似した ことによっても支持される（２０）。関連文献 細胞のＤＮＡ複製開始点を認識する多蛋白複合体はベルとスティルマンによっ て報告された（Bell & Stillman(1992)Nature 357:128-134）。本開示の多くは 、ホスら(Fossら、1993)、ベルら（Bellら、1993）並びにリーとヘルスコビッチ （Li & Herskowicz、1993）によってそれぞれサイエンスの２６２ページ、１８ ３８ページ、１８４３ページおよび１８７０ページ（1993年12月17日発行）で発 表された。ワンとリードは、本明細書に開示するようにシングルハイブリッドふ るい分け（スクリーン）を用いて報告した（Wang & Reed(1993)Nature 364:121- 126）。 発明の要旨 ＤＮＡ複製開始点複合体（ＯＲＣ）遺伝子、組換え体ＯＲＣペプチド並びにＤ ＮＡ結合蛋白の同定および本願組成物の使用方法が提供される。 提供されるものは、固有のＯＲＣ遺伝子部分をコードする核酸分離物、特にＯ ＲＣ１−ＯＲＣ６蛋白の生物学的に活性な固有部分をコードする部分を含む組成 物である。そのようなＤＮＡ分子を含むベクターおよび細胞は、組換え体ＯＲＣ ペプチドの産生に使用できることが分かった。 本願組成物は、ヒトを含む広範囲の種からＯＲＣを分離するために用いられる 。本ＯＲＣペプチドはまた、疾患、特にカビの感染および新生増殖性疾患の診断 、予後判定または治療に有用なＯＲＣ選別物質のスクリーニングに特に利用でき ることが分かった。特に有用な物質は、感染性有機体また形質転換細胞を野性型 ヒト相同体と識別することが可能なものである。 さらに開示されるものは、選別されたＤＮＡ配列と直接または間接的に付随す る蛋白をコードする遺伝子を同定する方法である。一般に、この方法はハイブリ ッド蛋白の発現ライブラリーでレポーター株を形質転換することを含むが、この 場合該ライブラリーは構成要素として発現される転写活性化ドメインに融合させ た蛋白コード配列を含み、該レポーター株はそのプロモーター領域内に少なくと も１個の選別されたＤＮＡ配列をもつレポーター遺伝子を含む。該レポーター遺 伝子の転写または翻訳生成物を発現しているクローンを検出してこれを回収する 。好ましい方法ではＧＡＬ４およびｌａｃＺレポーター遺伝子由来の活性化ドメ インが用いられる。 配列番号の簡単な記載 配列番号：１ ＯＲＣ１のＤＮＡ配列 配列番号：２ ＯＲＣ１のアミノ酸配列 配列番号：３ ＯＲＣ２のＤＮＡ配列 配列番号：４ ＯＲＣ２のアミノ酸配列 配列番号：５ ＯＲＣ３のＤＮＡ配列 配列番号：６ ＯＲＣ３のアミノ酸配列 配列番号：７ ＯＲＣ４のＤＮＡ配列 配列番号：８ ＯＲＣ４のアミノ酸配列 配列番号：９ ＯＲＣ５のＤＮＡ配列 配列番号：１０ ＯＲＣ５のアミノ酸配列 配列番号：１１ ＯＲＣ６のＤＮＡ配列 配列番号：１２ ＯＲＣ６のアミノ酸配列 具体的な態様の記載 本発明の組換え体ポリペプチドは開示したＯＲＣ蛋白の固有部分を含み、完全 な長さの本ＯＲＣ蛋白に特異的な結合親和性を保持している。そのアミノ酸配列 が既知の蛋白では認められないということ、さらに当該ＯＲＣに特異的なペプチ ドであることを示すために少なくとも十分な長さを有しているという場合に、“ 固有部分”は本ＯＲＣに固有のアミノ酸配列を有する。固有部分は、個々のアミ ノ酸配列にしたがって長さが約５から約２５残基まで、通常５から１０残基まで 変動し、さらに当該部分配列を既知のペプチド／蛋白配列データベースと比較 することによって容易に同定される。したがって、本明細書で用いられるポリペ プチドという用語は５残基程度のアミノ酸ポリマーと定義される。本スクリーニ ングアッセーで用いられるＯＲＣは、しばしば完全な長さのＯＲＣ蛋白のより小 さな欠失変異体である。典型的には、そのような欠失変異体は通常の分子技術を 用いて容易に生成でき、さらに以下に記載する種々のアッセー（例えばフットプ リント分析、免疫共沈など）を用いてＯＲＣ特異的結合親和性についてスクリー ニングできる。 ＯＲＣ特異的保持結合親和性は、限定された配列をもつ核酸、ＯＲＣ蛋白また は選択的にＯＲＣと結合することができる抗体のような化合物に選択的に結合す る能力を含む。したがって結合特異性は、ＯＲＣ特異的免疫学的エピトープ、レ クチン結合部位などによって提供できる。選択的な結合は、本明細書に記載する ようにインビトロまたは細胞系のいずれかで組換え体ＯＲＣペプチドを用いて標 識リガンドとの競合によって簡便に示すことができる。一般に、選択的結合は、 下記の実施例のようにインビトロの条件下では１０^-6Ｍ、好ましくは１０^-8Ｍ、 より好ましくは１０^-10Ｍの結合親和性を必要とする。 本組換え体ポリペプチドは単独でも、他の原子または分子に共有結合されてい てもよい。このポリペプチドは、しばしば本ポリペプチドを含むより大きなポリ ペプチドの部分として存在することができるが、その場合このより大きなポリペ プチドの残余は必ずしもＯＲＣに由来する必要はない。本ポリペプチドは典型的 には“分離された”状態、すなわちそれらに天然の状態では付随する物質の少な くとも幾つかは付随しないことを意味する。一般に、分離されたポリペプチドは 、与えられたサンプルにおいて全ポリ／ペプチドの重量で少なくとも約１％、好 ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％を構成する。 純粋なペプチドポリペプチドとは、全ポリペプチドの重量で少なくとも約６０％ 、好ましくは少なくとも８０％および、より好ましくは少なくとも約９０％を意 味する。本ポリペプチド重量に含まれるものは、本ポリペプチドに共有結合した 一切の原子、分子、基などで例えば検出可能な標識、糖付加、燐酸塩付加などで ある。 本ポリペプチドは、サンプル中に存在する他の成分さらに何がポリペプチドに 共有結合しているかによって左右されるが、当業者に既知の種々の方法で分離ま たは精製できる。精製方法には、電気泳動的、分子的、免疫学的およびクロマト グラフィー技術（特にペプチドの場合は親和性クロマトグラフィーおよびＲＰ− ＨＰＬＣ）が含まれる。適切な精製技術の一般的説明書としては、スコープの「 蛋白の精製」(R．Scopes "Protein Purification"，Springer-Verlag，NY(1982) )を参照されたい。 ポリペプチドは、本明細書に記載されもしくは引用されているか、或いは関連 技術分野において習熟した者にとって既知の物理的、化学的および分子的技術に よって修飾し、または他の化合物と結合させ、本明細書で開示した方法或いは当 業者に既知の方法でアッセーしたとき、そのＯＲＣ／レセプター結合特異性また は他の特性（例えば溶解性、膜透過性、安定性、毒性、生物利用性、分布、被検 出性、インビボ半減期など）に影響を与えることができる。結合特異性／親和性 をさらに変化させるための他の修飾には、化学的／酵素的介入（例えば脂肪酸ア シル化、蛋白分解、糖付加）および、特にポリ／ペプチドがより大きなポリペプ チドに組み込まれている場合は発現宿主の選択などが含まれる。アミノおよび／ またはカルボキシル末端は官能基が付加されていてもよい。例えばアミノ基のた めにはアシル化またはアルキル化、カルボキシル基のためにはエステル化または アミド付加などである。 開示したポリ／ペプチドの多くは、例えばグリコシダーゼのような酵素によっ て分解されたり修飾されたりできる糖付加部位および形態を含む。例えば、本開 示ポリ／ペプチドのＮまたはＯ−連結糖付加部位は、Ｎ−連結糖付加変化のため には別の塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓまたはＨｉｓ）によって欠失させたり置 換されていてもよく、またＯ−連結糖付加の修飾のためにはＳｅｒおよびＴｈｒ 残基部位に欠失または極性置換が導入される。糖付加変形はまた適切な宿主細胞 、例えば酵母、昆虫もしくは種々の哺乳類細胞によって、またはインビトロの方 法、例えばノイラミニダーゼ消化によって生成される。開示したポリ／ペプチド のその他の共有結合修飾は、標的アミノ酸残基を選択側鎖もしくは末端と反応す ることができる有機誘導剤（例えばメチル−３−〔（ｐ−アジド−フェニル）ジ チオ〕プロピオイミデート）または架橋剤（例えば１，１−ビス（ジアゾアセチ ル）− ２−フェニルエタン）と反応させることによって導入できる。治療または診断の ための位置確認には、検出可能なシグナルを提供することができる薬剤で本ポリ ／ペプチドを直接（放射性同位元素、蛍光発色物質など）また間接的に標識して もよい。この部位は例えば心筋キナーゼ標識部位である。 ＯＲＣ結合特異性をもつＯＲＣポリペプチドは、架橋を含む様々な方法によっ て、または、好ましくはそのようなポリペプチドをＯＲＣ−ＯＲＣ複合体への結 合もしくはＯＲＣ−ＯＲＣ複合体の崩壊についてスクリーニングすることによっ て同定される。また別のＯＲＣ特異的薬剤には特異的抗体が含まれるが、これは １価の形態（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦｖ）に修飾することができ、これ らは特異的にオリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチド、最も好ましくは低分子 量有機化合物に結合する。例えば、開示したＯＲＣペプチドを免疫原として用い 、特異的な多クローン性または単クローン性抗体を生成することができる。一般 的な方法については、「抗体、実験室マニュアル」（Harlow & Lane(1988) "Ant ibodies，A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Laboratory）を参照され たい。 他の有望なＯＲＣ特異的薬剤は、合成または天然化合物の大きな収集物からス クリーニングされる。また別に、細菌、カビ、植物および動物の抽出物の形態と なっている天然化合物の収集物も入手可能であり、また容易に作成することもで きる。さらに、天然および合成収集物並びに化合物は、通常の化学的、物理的お よび生化学的手段を介して容易に修飾できる。例えば以下の文献を参照されたい （Houghtenら、Nature 354:84(1991); Lamら、Nature 354:81(1991); Blake &Li tzi-Davis，Bioconjugate Chem 3:510(1992)）。 有用な薬剤は、本ポリペプチドまたはコード核酸を含む化合物を用いるアッセ ーで同定される。多様なインビトロ細胞非含有結合アッセー、特にＯＲＣポリペ プチドを含む固定化合物への特異的結合についてのアッセーは簡便に使用できる ことが分かった。例えば、固定ＯＲＣ−ＯＲＣまたはＯＲＣ−核酸複合体は、例 えば標識した複合体の構成成分の解離によって測定されるように、崩壊のための 便利な標的を提供する。そのようなアッセーは、スケールアップ、すなわち嵩張 る薬剤のスクリーニングに適した高処理量用途にむいている。好ましさでは劣る とはいえ、細胞ベースのアッセーも有望な薬剤の特異的作用を決定するために用 いることができる。 好ましい薬剤はＯＲＣ特異的および種特異的である。有用な薬剤は多数の化学 物質類の中から見出されるであろうが、典型的にはそれらは有機化合物で、好ま しくは小さな有機化合物である。小さな有機化合物は、１５０より大きくしかも 約４５００未満、好ましくは約１５００未満、より好ましくは５００未満の分子 量を有する。代表的な種類にはステロイド、複素環物質、多環式物質、置換芳香 族化合物などが含まれる。 選択された薬剤は修飾され、有効性、安定性、医薬適合性などが強化される。 薬剤の構造識別は、別の薬剤の同定、生成またはスクリーニングのために用いる ことができる。例えば、ペプチド薬剤が同定された場合、それらは、上記のよう に例えばその蛋白分解安定性強化のために種々の方法で修飾できる。その他の安 定化方法は被包化（例えばリポゾームなど）などを含む。本結合薬剤は当業者に 既知の通常のいずれの方法によっても調製できる。 治療的に用いるためには、本明細書に開示する組成物及び薬剤はいずれの便利 な方法によっても投与できる。小さな有機物質は好ましくは経口的に投与される 。その他の組成物および薬剤は好ましくは非経口的に、便利には医薬的もしくは 生理学的に許容できる担体（例えば燐酸緩衝食塩水など）に含ませて投与される 。典型的には、該組成物は保有生理液に添加される。例として、開示する治療剤 の多くは、直接的な注射もしくは輸液、局所的、気管内／鼻腔内（例えば気体を 介して）、眼内、または埋没物内／上（例えばコラーゲン）、浸透圧ポンプ、適 切に形質転換させた細胞を含む移植物などにむいている。一般には、投与量は経 験によって決定されるが、典型的には約１０から１０００μｇ／ｋｇ被投与者の 範囲である。ペプチド薬剤については、その濃度は一般に投与量で約５０から５ ００μｇ／ｍｌの範囲でる。他の添加物、例えば安定化剤、殺菌剤なども含むこ とができる。これらの添加物は通常量で存在するであろう。 本発明は、ＯＲＣ遺伝子をコードする分離された核酸、それらの転写調節領域 、およびＯＲＣ特異的機能を保持する開示した固有のＯＲＣペプチドを提供する 。次のものは、本明細書で用いられているように以下のような意義をもつ。“分 離 された”核酸は、天然に生じる染色体またはその天然の状態の転写物以外のもの として存在し、さらに典型的には通常天然の染色体では付随していない少なくと も１つのヌクレオチドが連続している；実質的な配列類似性をもつ核酸は厳密性 の低い（low stringency）条件下、例えば５０℃、ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩水／０ ．０９Ｍクエン酸ナトリウム）でハイブリダイズし、ＳＳＣで５５℃で洗浄した とき結合を維持し、この場合、実質的に類似する核酸配列の非同一領域は好まし くは多重復コドン(redundant codon)をコードしている；部分的に純粋なヌクレ オチド配列は、与えられた分画中に存在する全核酸の重量の少なくとも約５％、 好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも９０％を構成する； 開示された核酸の固有部分は、既に知られている核酸と区別するために十分な長 さをもち、したがって固有部分は、新規なオリゴヌクレオチドを規定するために 少なくとも十分な長さ（通常長さが少なくとも約１８ｂｐ、好ましくは長さが少 なくとも約３６ｂｐ）のヌクレオチド配列を有する。 典型的には、本発明のＯＲＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 異種配列を伴う。そのような異種配列の例は調節配列（例えばプロモーター、エ ンハンサー、反応因子（response element）、シグナル配列、ポリアデニル化配 列など）、イントロン、５’および３’非コード領域などを含む。本発明の特定 の実施例にしたがえば、コード配列の部分は異種配列とともにスプライシングを 受け、適切なシグナル配列および場合によってβ−Ｇａ１のような融合パートナ ーを用いて分泌される可溶性融合蛋白を生じる。発現抑制が示唆されるアンチセ ンス応用のために特に有用なオリゴヌクレオチドは、長さが約１０から３０ヌク レオチドの間で、本開示のＡＴＧ開始部位を取り囲む配列、特に開始部位の前約 ５ヌクレオチドで始まり、本開示開始部位の後ろ約１０ヌクレオチドで終わる本 開示配列によって規定されるオリゴヌクレオチドを含む。ＯＲＣをコードする核 酸はまた別の精製、合成、修飾、配列決定、発現、核酸導入、投与または、標準 的マニュアル（例えば、「分子生物学の最新プロトコル」("Current Protocols in Molecular Biology"，Aufubel,Brent，Kingston，More，Feidman，Smith & S tuhl編、Greene Publ．Assoc.，Wiley-Interscience，NY，NY(1992))或いは当該 技術分野で既知のマニュアルに記載された方法によるその他の利用に付すこと ができる。 本発明はまた本開示ＯＲＣ核酸を含むベクターを提供する。プラスミドおよび ウイルスベクターを含む多数のベクターが種々の真核および原核宿主で発現させ るために報告されてきた。有利には、ベクターはしばしば、ＯＲＣペプチドコー ド部分に機能できるように連結されたプロモーター、クローニングおよび発現の ために１つまたは２つ以上の複製系、宿主で選別するために１つまたは２つ以上 のマーカー（例えば抗生物質耐性）を含む。挿入コード配列は合成しても、天然 の起源から分離してもよく、ハイブリッドとして調製したりなどしてもよい。適 切な宿主細胞は、適切ないずれかの方法によって形質転換／核酸導入／感染させ ることができる。適切な方法には、電気的穿孔(electroporation)、ＣａＣｌ₂仲 介ＤＮＡ取り込み、ウイルス感染、微量注入（microinjection）、微量投射(mic roprojectile)、または他の方法が含まれる。 適切な宿主細胞には、細菌、原始細菌、カビ、特に酵母並びに植物および動物 細胞、特に哺乳類細胞が含まれる。特に重要なものは、大腸菌(E．coli)、枯草 菌(B．subtilis)、ビール酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、ＳＦ９細胞、Ｃ １２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ属、およびＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細 胞、永代化哺乳類骨髄球様およびリンパ球様細胞、並びに多能性細胞、特に哺乳 類ＥＳ細胞および接合体である。好ましい発現システムには、ＣＯＳ−７、２９ ３、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ−７６、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、 ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲＩ細胞およびバ キュロウイルス系が含まれる。好ましい複製系には、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス、ＡＡＶ、ＢＰＶなどが含ま れる。数多くの転写開始および終止調節領域が分離され、種々の宿主での異種蛋 白の転写および翻訳に有効なことが示された。これらの領域の例、分離法方、操 作態様などは当該技術分野で既知である。 安定的に形質転換された細胞および遺伝子導入(transgenic)動物の作出のため に、本核酸を組み換え事象によって宿主ゲノムに組み込むことができる。例えば そのような核酸は電気的穿孔によって細胞に導入され、それによって内在性遺伝 子、その類似体または偽遺伝子またはＯＲＣコード遺伝子に対して実質的な同一 性を有する配列部位に同種組み換えを惹起させる。その他の組み換えを主体とす る方法、例えば非同種組み換え、同種組み換えによる内在性遺伝子欠失（特に多 能性細胞）などによってさらに別の応用が提供される。好ましい遺伝子導入動物 および安定な形質変換体は、開示のＯＲＣ遺伝子を過剰発現または低発現（例え ばノックアウト細胞および動物）し、薬剤の開発において、さらに疾患モデルと して使用できることが分かった。遺伝子導入動物（通常ゲッ歯類）のＥＳ細胞ま たは接合体からの作製方法は当業者に既知である。 本明細書に開示した組成物および方法は遺伝子療法を実施するために用いるこ とができる(Zhuら、Science 261:209-211(1993); Gutierrezら、Lancet 339:715 -721(1992)を参照のこと）。例えば、ＯＲＣの改変発現または調節を達成するこ とができる遺伝子調節配列に機能できるように連結したＯＲＣコード配列を細胞 に核酸導入する。ＯＲＣの翻訳を調節するために、標的細胞には相補的なアンチ センスポリヌクレオチドを核酸導入する。核酸導入細胞の移植／埋め込み／輸液 を含む遺伝子治療については、経験的に確認できる多くの変動因子によって投与 は左右される。例えば、細胞数は移入される細胞の安定性にしたがって変動する 。移入緩衝液は典型的には緩衝食塩溶液または他の薬理学的に許容できる溶液で ある。同様に、投与される他の組成物（例えば導入される核酸、蛋白など）の量 は、投与の態様、治療の目的などによって左右されるであろう。 ビール酵母菌由来の６つのＯＲＣサブユニットをコードする遺伝子を用いて他 の種のＯＲＣ蛋白の機能的同族体が得られる。例えば、ＯＲＣ１遺伝子は関連す るカビ（クリュエルマイセス・ラクチス(Klyuermyces lactis)）で保存されてい るということを我々は明らかにした。ビール酵母とＫ．ラクチスの両ＯＲＣ１遺 伝子は保存一次蛋白配列を含み、この配列は他のカビを含むその他の種およびヒ トのＯＲＣ１遺伝子を得るために利用される。ビール酵母とＫ．ラクチス間の保 存配列を基にしたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲによっていずれ の真核種のＯＲＣ１蛋白も同定される。いずれかのカビまたはヒト細胞のＯＲＣ １ ポリペプチドをコードするクローン化遺伝子を用いて細菌発現系で蛋白を発現 させ、該ポリペプチドに対する抗体を作製する。これらの抗体は関連種のＯＲＣ 複合体を免疫沈澱させるために用いられる。蛋白の配列決定のために記載された 技術を用いてＯＲＣポリペプチドの配列が得られる。本明細書で開示したビール 酵母蛋白をクローニングするための蛋白配列決定方法を用いて、他の種のカビお よびヒト細胞のＯＲＣポリペプチドをコードする他の遺伝子またはｃＤＮＡが得 られる。バキュロウイルス発現ベクターでビール酵母遺伝子の各々を発現させ、 さらにＯＲＣサブユニットの各々を発現しているウイルスでＳｆ９昆虫細胞を感 染させることによってＯＲＣ複合体を再構成する方法を本明細書で明らかにした ように、これら遺伝子は、ＯＲＣポリペプチドを発現させ活性を再構成するため に用いられる。このようにして、いずれのカビまたはヒト細胞を含む哺乳類種か らも大量のＯＲＣ蛋白が得られる。 カビのＯＲＣ蛋白の抑制物質は、ＤＮＡ複製の開始を抑制することによってカ ビの細胞分割増殖を選択的に抑制する有用な試薬を提供する。これは、ヒトおよ び他の種のカビの感染制御に有用な抗カビ剤のために強力で選択性のある標的を 提供する。例えば、本明細書で開示されているように、実際ビール酵母の変異に よるＯＲＣ機能の抑制は変異細胞の死を引き起こす。 ヒトの増殖性疾患、例えば癌では、この病巣組織の細胞は非制御細胞増殖を受 ける。この細胞増殖で重要な事象はＤＮＡ複製の開始である。ＯＲＣ機能の抑制 によるＤＮＡ複製の開始の抑制は、細胞増殖の抑制物質のための貴重な標的を提 供する。ＯＲＣ蛋白をコードするｃＤＮＡの各々を発現させることによって、Ｏ ＲＣ機能は、別個にまたは１発現系で一緒にインビトロで再構成される。この組 換え体発現蛋白を用いて、細胞周期でＤＮＡ複製の開始を阻害するＯＲＣ機能の 抑制物質が得られる。上記のように、ＯＲＣＤＮＡ結合または他の活性に対する 低分子抑制物質は抗癌剤および抗増殖薬剤として価値ある試薬を提供する。 以下の実施例は説明のために提供され、制限を意図するものではない。 実施例 実施例１ 転写サイレンシング(silencing)とＯＲＣ． 交配型サイレンサーの各々でＡＲＳコンセンサス配列（ＡＣＳ）に対する精製 ＯＲＣの結合をＤＮアーゼＩ保護アッセー（２２）を用いて調べた。ＯＲＣは、 ＡＴＰ依存性態様で４つのサイレンサーの各々でＡＣＳとの適合部分を保護した 。 さらに、各サイレンサーで特徴的なＤＮアーゼＩ切断高感受性部位がＡＣＳから １２−１３ｂｐで始まり、該コンセンサス配列から約１０ｐｂの間隔で延びてい るのが観察された。ＤＮアーゼＩ保護および強化切断のこのパターンは非サイレ ンサー配列で観察されたパターンとほぼ同一で、これらのエレメントに対するＯ ＲＣ結合は他のＡＲＳエレメントとの結合と基本的に異ならないことを示唆する 。 ＨＭＬ−Ｅ、ＨＭＬ−ＩおよびＨＭＲ−Ｅで観察される唯一の保護はＡＣＳを 含む。しかしながら、ＨＭＲＲ−Ｉで本発明者らは、ＡＣＳとの強力な適合部分 と一致しない第二の予期せぬフットプリントを認めた。のみならず、ＯＲＣが結 合したこれまでの全ての部位と異なり、この保護は、結合反応物へのＡＴＰの添 加にほとんど依存性を示さなかった。この領域ではＡＣＳに対する２つの部分的 適合が存在するが、他のＡＲＳエレメントおよびサイレンサーでは同様な配列は ＯＲＣによって認識されず、このことは、これら配列はＯＲＣのこの通常でない ＤＮＡへのＡＴＰ非依存性結合を誘導しないことを示唆している。ＡＣＳで認め られた保護と合わせて、ＨＭＲ−ＩでのＯＲＣフットプリントの境界は欠失変異 によって明らかにされたＨＭＲ−Ｉの境界と極めて類似していた（２３）。これ らの実験は、ＯＲＣは４種の全ての交配型サイレンサーと結合し、ＯＲＣはＡＣ Ｓ以外の配列と結合し、さらにそれはＨＭＬおよびＨＭＲにおいて重要な役割を 果たすことを示している。 ＯＲＣ機能と転写サイレンシングとの間の明瞭な連関は、ＯＲＣのサブユニッ トをコードする遺伝子の変異はＨＭＲの抑制（repression）が不完全であるとい う発見によって提供された（下記）。種々のＯＲＣサブユニットをコードする遺 伝子をクローニングするために、ＯＲＣサブユニットの各々に由来するペプチド の配列を決定した（２４）。候補遺伝子（ＯＲＣ２と呼ぶ）は、許容温度でサイ レンシング欠損を示す温度感受性変異の補完性によって分離された。遺伝学的実 験によって、ＯＲＣ２はＨＭＲ−ＥでＡＣＳのサイレンシング機能を仲介するこ とが提案され、これによって、ＯＲＣ２はＯＲＣのサブユニットをコードする有 力候補になった（下記）。ＯＲＣ２の予想アミノ酸配列の比較は、ＯＲＣの７２ ｋｄサブユニットに由来する全てのペプチドはＯＲＣ２遺伝子の開放読み枠内に 存在することを示し、それはＯＲＣの２番目に大きいサブユニットをコードする こと示唆した。 ＯＲＣ２変異はインビトロでＯＲＣ機能に変化を与える． インビトロでのＯＲＣ機能に対するＯＲＣ２変異の影響をみるために、ｏｒｃ ２−１ およびＯＲＣ２株の両方から抽出物を調製した（２５）。野性型細胞由来 の分画は、ＤＮアーゼＩフットプリント法でＡＲＳ１のＡＣＳおよびＢ１エレメ ントにおいて強力なＯＲＣＤＮアーゼＩ保護を示した。対照的に、ｏｒｃ２−１ 細胞はＯＲＣＤＮＡ結合活性の劇的な低下を示した。ＡＣＳおよびＢ１エレメン トはもはやＤＮアーゼＩ切断から保護されなかった。ＡＲＳ１のＢドメインの特 徴的な強化ＤＮアーゼＩ切断のみがそのまま残った。ＡＲＳ１でのＯＲＣＤＮＡ 結合を破壊する変異は、変異体分画で認められたような残余のＤＮＡの結合を防 止するが、これは、この結合にはＡＣＳが要求されることを示唆する。変異体と 野性型分画の混合によっても野性型蛋白の結合は減少しなかったので、ＤＮＡ結 合欠損はＤＮＡ結合の一般的な抑制によるものでもない。非許容温度で変異体細 胞を恒温保持することはＯＲＣＤＮＡ結合欠損を起こさせるために必要ではなか ったが、このことによって許容温度における交配型の調節で認められる欠損が説 明できる（下記）。 ｏｒｃ２−１およびＯＲＣ２細胞由来のＯＲＣのポリペプチド組成を調べるた めに、これら分画の免疫ブロットをＯＲＣに対する多クローン性抗体で調べた。 ＪＲＹ３６８８（ＯＲＣ２）またはＪＲＹ３６８７（ｏｒｃ２−１）のいずれか に由来する部分精製ＯＲＣ３０μｇを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分 離し、ニトロセルロースに移した。得られた蛋白ブロットを完全なＯＲＣ複合体 に対するマウス多クローン性血清とともに恒温保持した。この血清はＯＲＣの５ ０ｋｄサブユニット以外の全てを検出する。抗体抗原複合体は、化学発光基質と 恒温で保持した後でセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体によって検出 された。 野性型分画は、ＯＲＣの１２０、７２、６２、５６および５３ｋｄサブユニッ トをほぼ等しい量で含んでいた。しかしながら、変異体分画は明らかに異なるサ ブユニット組成を示した。１２０および５６ｋｄサブユニットの量は野性型分画 と比較して極めてわずか低下し、一方、７２、６２および５３ｋｄサブユニット の量は劇的に減少した。ＵＶ架橋実験では、同じ３つのサブユニットは、ＡＣＳ およびＡＴＰ依存態様でＤＮＡに特異的に架橋された。このことは、これらサブ ユニットの１つまたは２つ以上がＯＲＣＤＮＡ結合に重要な役割を有することを 示唆している（１５）。したがって、これらサブユニットが存在しないことによ ってインビトロで認められるＤＮＡ結合の欠如が説明でき、さらに、ｏｒｃ２− １ 変異はＯＲＣ安定性の低下をもたらすか、またはＯｒｃ２ｐの欠損は完全なＯ ＲＣ複合体のＤＮＡ結合の低下をもたらすことを示唆する。 ｏｒｃ２−１細胞はＳ期進入欠損である． 細胞周期の目印としてアルファ因子およびヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いて ＯＲＣ２の主要機能がインビボで生じる細胞周期点を調べた（２６）。得られた 結果は、後期Ｇ１とＤＮＡ合成開始との間でＯｒｃ２ｐの主要機能が生じるのと 一致した。ＨＵによる進行停止(arrest)とそれに続く非許容温度への解除によっ て８９％の細胞がさらなる細胞周期を完了したが、これは、Ｏｒｃ２ｐのための 主要機能は細胞サイクルのＨＵによる進行停止時点の前に達成されたことを示唆 している。対照的に、アルファ因子で細胞周期を阻害し続いて非許容温度で解除 すると、わずか４１％の細胞がさらなる細胞周期を終了させただけであった。こ の表現型は、Ｏｒｃ２ｐ機能はＧ１−Ｓ基の境界で、または境界近くで達成され ることを示唆する。 酵母ＤＮＡの複製におけるＯＲＣの役割をより直接的に調べるために、ｏｒｃ ２−１ または同系の野性型細胞のいずれかの非同期性培養のＤＮＡ容量を、許容 温度から非許容温度へ移してから種々の時間後に蛍光細胞測定（２７）によって 測定した。２４℃で増殖させ（０分点）または非許容温度(３７℃)に移して増殖 させた後種々の時間のＪＲＹ３６８７（ｏｒｃ２−１）もしくはＪＲＹ３６８８ (ＯＲＣ２)細胞を固定し、沃化プロピジウムで染色し、コールターモデルエピク ス−Ｃフローサイトメーター（Coulter Model Epics-C Flow Cytometer）を用い てＤＮＡ含有量を調べた。さらに、各々の時点から得た少数の細胞(約１０００) を許容温度に戻し、与えられた時点で生存している細胞の％を求めた。初めに、 野性型および変異体細胞の両細胞のＤＮＡ含有量は、ほぼ１０％のＳ期の細胞と ともに１Ｃと２Ｃの間で等しく分けられた。温度を移した後の早い時点（１５− ７０分）ではＳ期のｏｒｃ２−１細胞が劇的に消失し、このことはＳ期への進入 が停止させられたことを示唆する。この仮説と一致して、時間が経過するにつれ てｏｒｃ２−１変異体では１ＣＤＮＡ含有量をもつ細胞が急速に蓄積し、２ＣＤ ＮＡ含有量をもつ細胞が相応に減少した（５０−１００分）。１００から１２０ 分の間では、遅延Ｓ期に入るようにみえるｏｒｃ２−１細胞の新規な集団が認め られた。１５０分までに、大半の変異細胞がこの集団に存在し、１８０分後には ほんの少しの細胞のみが１ＣＤＮＡ含有量をもったままであった。 興味深いことには、ＤＮＡ合成の新規ラウンドへの進入とｏｒｃ２−１細胞の 生存力の損失との間に高い相関性が認められた。同系ＯＲＣ２細胞による同様な 実験によって、これらの作用はｏｒｃ２−１変異に特異的であることが示された 。これらの発見は、非許容温度ではｏｒｃ２−１細胞は最初Ｓ期に進入すること ができず、後で不完全なＤＮＡ複製ラウンドに進入したこと示唆する。この複製 型への進入は致死的事象のようである。全般的に、ｏｒｃ２−１変異の分析は、 ＯＲＣは一般にＳ期の初期に作用し、特に酵母の複製開始点ではイニシエーター 蛋白として作用することを示すインビボの証拠を提供する。 ＯＲＣ６遺伝子の同定． ＯＲＣサブユニットの１つをコードする強力な候補の代表である第二の遺伝子 はＡＡＰ１遺伝子であった。この遺伝子は、インビボでＡＣＳに結合する蛋白の ための新規なスクリーンを用いてクローニングされた（下記）。この遺伝子の予 想アミノ酸配列と比較したとき、本発明者らはＯＲＣの５０ｋｄサブユニット由 来ペプチドの全てはＡＡＰ１遺伝子の開放読み枠によってコードされることを発 見した（２８）。この理由から、ＡＡＰ１は６つのＯＲＣサブユニットの最小の ものをコードするので我々はここでＡＡＰ１をＯＲＣ６と呼ぶ。ＯＲＣのサブユ ニットとしてのこの遺伝子の同定によって、ＯＲＣはインビボでＡＣＳに結合す るという直接の証拠が提供される。 序文および実施例１で引用した番号付与文献 １．Callan，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．38:195-203(1973)． ２．Fangman & Brewer，Cell 71:363-366(1992)． ３．P．Laurenson & J．Rine，Micro．Rev．56:543-560(1992)． ４．D.D．Dubeyら、Mol．Cell．Biol．11:5346-5355(1991)． ５．D.H．Rivier & J．Rine，Science 256:659-663(1992)． ６．A.M．Miller & K.A．Nasmyth，Nature 312，247-251(1984)． ７．L．Pillus & J．Rine，Cell 59:637-647(1989)． ８．A．Axlerod & J Rine，Mol．Cell．Biol．11:1080-1091(1991)． ９．J.L．Campbell & C.S．Newlon，酵母サッカロミセス属の分子細胞生物学( The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces): J.R.Broa ch，J.R．Pringle，E.W．Jones編(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdS pring Harbor，NY，1991)、41-146ページ． １０．J．Broachら、CSH Symp．Quant．Biol．47:1165-1173(1983)． １１．Deshpande & Newlon，Mol．& Cell．Bio 12:4305-4313(1992)． １２．Y．Marahrens & B．Stillman，Science 255:817-823(1992)． １３．S.P．Bell & B．Stillman，Nature 357:128-134(1992)． １４．Kornberg & Baker，DNA Replicat'n(Freeman & Co，NY，1991)v2． １５．C.S．Newlon，Microbiol．Rev．52:568-601(1988)． １６．Newlon & Theis，Current Opinion in gen.and dev．3(1993)． １７．J.F.X．Diffley and J.H．Cocker，Nature 357:169-172(1992)． １８．Jacobら、CSH Symp．Quant．Biol．28:329-348(1963)． １９．ＤＮＡアーゼＩフットプリント法は以前に記載されたように実施した（ １５）。 ２０．J.B．Feldmanら、J．Mol．Biol．178:815-834(1984)． ２１．ペプチドの配列決定のために十分な蛋白を得るために、ＯＲＣのための 修正精製方法が考案された。９０％以上の破壊が達成されるまでビーズ攪拌器（ Biospec Products）を用いて４００ｇの冷凍ＢＪ９２６細胞から全細胞抽出物を 抽出した。１／１２容量の飽和（４℃）硫酸アンモニウム溶液を破壊細胞に加え ３０分攪拌した。続いてこの溶液を１３０００×ｇで２０分回転させた。得られ た上清を４５Ｔｉローター（ベックマン）で４４０００ＲＰＭで１．５時間遠心 した。得られた上清に０．２７ｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムを添加し、生じた 沈澱を４５Ｔｉローターで４００００ＲＰＭで３０分遠心して集めた。得られた 沈殿物を緩衝液Ｈ／０．０（１５）に再浮遊させ、Ｈ／０．１５ＭＫＣｌ（０． １５ＭＫＣｌ添加Ｈ）に対して透析した。この抽出物からのＯＲＣ調製は以下の 変化を除き（１５）と同様であった。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セルロースカ ラムはこの調製から省略し、１回のグリセロール勾配のみを実施した。ＯＲＣサ ブユニット由来ペプチドの配列決定は、以前に記載された“ゲル内”プロトコル （４０、４１）を修飾したものを用いて実施した。精製ＯＲＣ（〜１０μｇ／サ ブユニット）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、０，１％クーマシーブリリアントブ ルーＧ(Aldrich)で染色した。脱色後、ゲルを１時間水に浸した。蛋白バンドを 切り出し、微量遠心管に移し、２００ｎｇのアクロモバクター(Achromobacter) プロテアーゼＩ(リシレンドペプチダーゼ:Wako)で処理した。生じたペプチドを 逆相クロマトグラフィーで分離し、自動エドマンデグラデーション(Applied Bio systems mode1470)で配列決定した。 ２２．ＯＲＣ２およびｏｒｃ２−１細胞のＯＲＣを分離し分析するために、４ リットルのＪＲＹ３６８７（ｏｒｃ２−１，ＭＡＴａ，ｈｍｒＤＡ::ＴＲＰ１ ａｄｅ２ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）または同系野性株ＪＲＹ ３６８８（ＯＲＣ２ＭＡＴａ，ｈｍｒＤＡ::ＴＲＰ１ ａｄｅ２ ｈｉｓ３ ｌ ｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）を２×１０⁷細胞／ｍｌの密度まで増殖させた。 抽出物は記載（２４）にしたがって調製し、ＯＲＣ調製での最初の２本のカラム で分画した。Ｑ−セファロース（ファルマシア）から溶出した各調製物のＯＲＣ ＤＮＡ結合活性のピーク分画をその後の分析に用いた。完全なＯＲＣ複合体に対 する抗体を１匹のマウスを用いて作製した。得られた血清は５０ｋｄサブユニッ トを除いてＯＲＣの全てを認識することができた。蛋白をニトロセルロースに移 し、抗原抗体複合物をセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体および化学 発光基質を用いて検出した。 ２３．酵母細胞は１−４×１０⁷細胞／ｍｌの密度まで２４℃で増殖させ、そ の後６μＭのアルファ因子を含むＹＰＤに２−４×１０⁶細胞／ｍｌの密度に希 釈し、２−２．５時間２４℃で恒温保持した（＞９０％未発芽細胞）。ヒドロキ シウレアによるサイクル進行停止実験のために、アルファ因子を洗い流し、さら に２．５時間恒温保持した（＞９０％大きな発芽細胞）。発育抑制物質とともに 恒温保持した後、細胞を簡単に音波破砕し、２４℃または３７℃で予備保温した ＹＰＤプレートに播種し、播種後０、３および６時間してから観察した。 ２４．酵母細胞を１−４×１０⁷細胞／ｍｌの密度まで２４℃で増殖させ、３ ７℃または２４℃で２−４×１０⁶細胞／ｍｌの密度に新鮮なＹＰＤ中に希釈し た。希釈後ときどき３×１０⁶個の細胞を記載（４２）にしたがって処理した。 ２５．ＯＲＣの５０ｋｄサブユニット由来の５ペプチドのＯＲＣ６遺伝子にお ける位置は残基：５１−６５；９１−１０２；１１０−１０５；２０７−２２６ ；４２４−４３０であった。 ２６．K.M．Hennessyら、Genes Dev．4:2252-2263(1990)． ２７．H．Renauldら、Genes Dev．7:1133-1145(1993)． ２８．A.H．Brand，G．Micklem & K．Nasmyth，Cell 51:709-719(1987)． ２９．McNally & Rine，Mol．& Cell．Biol．11:5648-5659(1991)． ３０．D．D．Brown，Cell 37:359-365(1984)． ３１．A.P．Wolffe，J．Cell Sci．99:201-206(1991)． ３２．D．Kitsbergら、Nature 364:459-463(1993)． ３３．K.S．Hattonら、Mol．Cell．Biol．8:2149-2158(1988)． ３４．V．Dharら、Mol．Cell．Biol．9:3524-3532(1989)． ３５．L.G．Edgar & J.D．McGhee，Cell 53:589-599(1988)． ３６．L.P．Villarreal，Micro．Rev．55:512-542(1991)． ３７．H．Kawasakiら、Anal．Biochem．191:332-336(1990)． ３８．H．Kawasaki & K．Suzuki，Anal．Biochem．186:264-268(1990)． ３９．R．Nashら、EMBL Journal 7:4335-4346(1988)． ４０．J．Abrahamら、J．Mol．Biol．176:307-331(1984)． ４１．D.T．Stinchcombら、Nature 282:39-43(1979)． 実施例２ ＯＲＣ２、生存力およびサイレンシングに必要な遺伝子． 変異体スクリーンでｏｒｃ２−１と呼ぶ温度感受性変異を分離した。これは合 成サイレンサーが隣接するＨＭＲａを許容温度で抑制するが、野性型サイレンサ ーが隣接するＨＭＲａの抑制は生じなかった（２０）。ｏｒｃ２−１変異体は温 度感受性でサイレンシング欠損であるので、さらに分析を行う価値があった。異 型接合体ｏｒｃ２−１／ＯＲＣ２二倍体（ＪＲＹ２６４０）の温度耐性は、この 変異は劣性であることを証明した。胞子形成に必要なＭＡＴａ１機能を提供する ために、変異体サイレンサー（ｐＪＲ１２１２）が隣接するＨＭＲａを含むプラ スミドでこの二倍体を形質転換させた。温度感受性発育表現型は、２３個の四分 子の各々で温度感受性型（ｔｓ）：野性型が２：２で分離された。このことは、 単一の核変異によってこの変異が生じたことを示唆する。ＨＭＬαｍａｔａ１Ｍ Ｒαｏｒｃ２−１ 分離体(segregant)（ＪＲＹ３６３８）が胞子形成後の二倍体 から得られた。 遺伝交配を用いて、ｏｒｃ２−１による抑制について野性型サイレンサーのど の特性によって合成サイレンサーと野性型サイレンサーが区別されるのかを決定 した。ｏｒｃ２−１変異を含むｍａｔａ１ＨＭＲα株（ＪＲＹ３６３８）を、Ｈ ＭＲ−Ｅ 隣接ＨＭＲａ（ＨＭＲａ−ｅ−ｒａｐ１−１０対立遺伝子；５４０１− １ａ）のＲＡＰ１結合部位に変異を含むＭＡＴα株と交配し、機能的ＲＡＰ１結 合部位が存在しないときｏｒｃ２−１がＨＭＲａを抑制することができるか否か を決定した。９６のＭＡＴα分離体のうち殆どまたは全く接合能をもたない２９ 分離体の全てが発育について温度感受性であった。ＭＡＴα温度感受性分離体の １９分離体が接合能を有し、このことは、ｏｒｃ２−１変異はそれ自体では接合 能を破壊するに不十分であることを示唆し、α株の接合能を阻害するためにはＨ ＭＲａ−ｅ−ｒａｐ１−１０ 対立遺伝子はｏｒｃ２−１と組み合わせて必要とさ れる可能性が示唆される。この接合から得られるＭＡＴα温度感受性分離体（こ れはα（ＪＲＹ４１３３）として弱く接合した）は、ＭＡＴαＨＭＲａ−ｅ−ｒ ａｐ１−１０ｏｒｃ２−１ の遺伝子型をもつことが確認された。 ＨＭＲａ−ｅ−ｒａｐ１−１０との組合せでｏｒｃ２−１はＭＡＴα株の接合 能を阻害するというまた別の証拠として、ただ１つの相関する異型接合体マーカ ーとしてｏｒｃ２−１をもつことによって先の交配を簡略化させるために幾分通 常でない交配を行った。２つのＭＡＴαＨＭＲａ−ｅ−ｒａｐ１−１０株（ＪＲ Ｙ４１３３およびＪＲＹ４１３２）は補完的な栄養要求マーカーを有し、 これら２株間の接合によって形成される稀なＭＡＴα／ＭＡＴα二倍体の選別が 可能である。この二倍体は、ＨＭＲ−ＥサイレンサーのＲＡＰ１部位変異によっ て生じる二倍体の低いＨＭＲａ発現レベルのため胞子を形成することが可能であ った（２１）。これらの株の１つは、ｏｒｃ２−１変異（ＪＲＹ４１３３）を有 し、他はこの変異をもたなかった。予想したように、その温度感受性は３４の四 分子の各々において２：２で分離した。温度耐性分離体の全て（２分離体／四分 子）がα接合表現型を示し、温度感受性分離体の全ては非常に弱いα接合体であ るか、または全く接合できなかった。温度感受性と接合表現型との間に全く組換 え体が存在しないということによって、温度感受性と接合欠損を起こす遺伝子の 間隔は１．５センチモルガン未満となり、単一の遺伝子の欠損は両方の表現型に 対して要因となるという強力な証拠を提供する。この結果は、本明細書に記載す るｔｓと接合表現型の同時復帰変異と一致する。 ＯＲＣ２の多対立遺伝子の分離． ｏｒｃ２−１の分析から得られる情報を用いて第二のスクリーニングを実施し 、サイレンサー機能に役割を果たす必須遺伝子のまた別の変異を同定した。この 第二のスクリーンによって５０の変異体が得られた。これらは発育について温度 感受性で、ＨＭＲα（ＲＡＰ１−結合部位の変異が隣接する）が半許容温度で抑 制された。３７℃での発育と接合表現型との両方についての補完検定をｏｒｃ２ −１ と第二のスクリーンで得た温度感受性変異体収集物との間で実施した。温度 感受性変異体収集物はｍａｔａ１ ｓｔｅ１４遺伝子型を有するが、ＨＭＲαの 抑制のためα’接合体として接合することが可能であった。これらの変異体をｍ ａｔａ１ ｏｒｃ２−１株（ＪＲＹ３６８３）と接合させ、二倍体を３７℃の発 育について検査した。３つの二倍体を除き全てが制限温度で発育することができ た。この３つの温度感受性二倍体はそれぞれ、２種の変異を互いに補完すること ができないのでｏｒｃ２／ｏｒｃ２同型接合体と想定された。この二倍体の交配 型を調べ、ＨＭＲの抑制欠損が補完されるか否かを決定した。３つ全てがα’接 合体として接合した。したがって、この３変異体は、温度感受性または元のｏｒ ｃ２−１ 変異の接合表現型のどちらも補完することができなかった。（ＪＲＹ４ １３６，４１３７および４１３８株の）この新規な変異をｏｒｃ２− ２ 、ｏｒｃ２−３およびｏｒｃ２−４と呼ぶ。 この新規な変異がＯＲＣ２以外の遺伝子に存在し、しかもｏｒｃ２−１を補完 できないという可能性を調べるために、ｏｒｃ２−１とｏｒｃ２−３との間の対 立性を調べた。元のｍａｔａ１ ｏｒｃ２−３ ｓｔｅ１４変異体をそのＨＭＲ α プラスミドから取り除き、ＪＲＹ４１３７を作出し、ＭＡＴαＨＭＲａ−ｅ− ｒａｐ１−１０ｏｒｃ２−１ 株（ＪＲＹ３６８５）と接合させた。この二倍体か ら得た２４個の四分子で全ての分離体が発育について温度感受性であっが、この ことはｏｒｃ２−１とｏｒｃ２−３との間の強力な連鎖を示唆した（＜２センチ モルガン）。さらなる実験は全て、より強力な変異体表現型を提供するｏｒｃ２ −１ 対立形質を用いて実施した。 ＯＲＣ２の地図の位置． 染色体ＩＩ上のＯＲＣ２とＬＹＳ２間の連鎖は２つのｌｙｓ２株（ＪＲＹ２６ ４０とＰＳＹ１５２）と元のｏｒｃ２−１分離株（ＪＲＹ２９０３）との交配で 明らかであったが、これによって、ＯＲＣ２とＬＹＳ２との距離は約２４センチ モルガンとなった。第三の交配（ＪＲＹ４１３０×ＪＲＹ４１３４）によってｓ ｅｃ１８ （これはＬＹＳ２およびＯＲＣ２より動原体の基部に近い）との間の連 鎖を調べた。ｏｒｃ２およびｓｅｃ１８は両方とも温度感受性であるので、ＵＲ Ａ３ （ｐＪＲ１４２３由来）によって印を付されたＯＲＣ２対立遺伝子を用いて 、ＳＥＣ１８とＯＲＣ２が６．６センチモルガン離れていることを決定した（表 １）。以前に地図の位置が決定されたいずれの遺伝子もＳＥＣ１８近くのサイレ ンシングマップに含まれていなかった。 細胞の分裂周期に対するｏｒｃ２−１変異の影響をしらべた。変異体ｏｒｃ２ −１ 株を液体培地で２３℃（許容温度）で増殖させ、続いて３７℃に移して細胞 が単一の終末形態で停止するか否かを調べた。特に、ｏｒｃ２−１細胞（ＪＲＹ ３６８３）を許容温度（２３℃）で対数期まで増殖させてこの培養物を分割した 。培養の半分をさらに５時間許容温度で増殖させ、残りの半分を非許容温度（３ ７℃）に移しさらに５時間培養した。この時点で、両培養を固定しＤＡＰ１で染 色して核を可視化した。許容温度で維持された培養では、全ての細胞周期の細胞 が認められた。細胞周期の後期の細胞（大きな発芽の存在によって明瞭である） は、しばしば母細胞および娘細胞の両方で核が明らかであった。対照的に、制限 温度に移された培養では、約９０％の細胞が大型の発芽細胞として進行停止して いた。核は母細胞にのみ存在し娘細胞には存在しなかった。さらに、細胞は許容 温度で増殖したものより大きく、このことは、蛋白合成および細胞壁合成はＯＲ Ｃ２ 機能の非存在下で持続していたことを示唆する。同様な結果がさらに２つのｏｒｃ２−１ 株（ＪＲＹ３６８５およびＪＲＹ３６８７）で得られた。 許容温度で継続して増殖させた後、または非許容温度に移した後で採取したＯ ＲＣ２ 細胞を固定し、ＡＰ１で染色して蛍光顕微鏡でＤＮＡを見ることができる ようにした。許容温度で増殖させた細胞は小型の未発芽細胞から種々の大きさの 単一芽をもつ細胞まで一連の形態を示した。非許容温度に移した細胞は非常に異 なっているようであった。すなわち、大型の発芽細胞として進行停止し、殆どの 部分について母細胞−娘細胞対の各々はただ１つの明るく染色された領域（しば しばネック部またはネック近く）を含んでいた。これらのデータは、ｏｒｃ２− １ 変異はＤＮＡ複製が不完全な変異体に特徴的な細胞周期欠損を表していること を示唆した。 ＯＲＣ２遺伝子のクローニング： ＯＲＣ２遺伝子をｏｒｃ２−１温度感受性の補完性によってクローニングした （２２）。１つの補完クローン（ｐＪＲ１４１６）をさらに分析するために選ん だ。挿入物由来の種々のフラグメントを失ったサブクローンを再度ｏｒｃ２株に 形質転換し、この欠失がｏｒｃ２−１の温度感受性を補完する能力に影響を与え ているか否かを分析した。重要な発見は、２．８ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩフラ グメントの欠失は補完活性を破壊し、一方、隣接配列（ＸｂａＩおよびより大き いＳｓｔＩフラグメント）の欠失は影響を与えないということであった。２．８ ｋｂフラグメントをサブクローニング（ｐＪＲ１２６３）して補完活性を有する ことが示された。 該クローンの遺伝子が実際ＯＲＣ２変異に対立性であるか否かを決定するため に、元のクローンのフラグメントをベクターを組み込んだ酵母でサブクローニン グした。同種組み込みのためにこのプラスミド（ｐＪＲ１４２３）を挿入物内で 切断し、野性株（Ｗ３０３−１Ａ）を形質転換した。結果として、組み込み部位 はプラスミドのＵＲＡ３遺伝子によって印を付された。得られた株（ＪＲＹ４１ ３４）をｏｒｃ２−１株（ＪＲＹ３６８５）と交配した。５９の四分子の各々で 、ＵＲＡ３はｏｒｃ２−１で生じる温度感受性と反対に分離され、このことは、ＯＲＣ２ は実際にクローン化されたことを示している。 ＯＲＣ２は細胞の生存力に必須である． ＯＲＣ２をＵＲＡ３によって分断し（２３）、ｕｒａ３およびＯＲＣ２につい て同型接合二倍体（ＪＲＹ３４４４）に組み込んだ。調べた４１の四分子のうち 、４０個の四分子は２つの生存分離体と２つの死細胞分離体を含み、１個の四分 子はただ１個の生存分離体を含んでいた。増殖したコロニーは例外なくＵｒａ− であった。推論では、死んでいた分離体はＵＲＡ３を含み、したがってＯＲＣ２ 分断を含んでいたと考えられ、ＯＲＣ２機能はいずれの温度でも細胞の生存力に 必須であると示唆される。真の零表現型（null phenotype）について理解するた めに死細胞分離体を顕微鏡下で調べた。大半の胞子は発芽して細長いかまたは変 形した細胞に変化し、分裂していなかった。いずれの場合にも、細胞は２倍以上 に分裂しなかった。したがって多くの胞子で、ＯＲＣ２が存在しないことによっ て細胞分裂は阻害されるが増殖は阻害されなかった。 プラスミド複製におけるＯＲＣ２の役割． プラスミドの安定性におけるＯＲＣ２の役割を調べるために、同系株の１対（ 野性型（Ｗ３０３−１Ｂ）およびｏｒｃ２−１（ＪＲＹ４１２５））を、動原体 、サプレッサーｔＲＮＡ（ＳＵＰ１１−１）、ＵＲＡ３およびＡＲＳ１、染色体 の複製開始点を含むプラスミド（ＹＲＰ１４／ＣＥＮ４／ＡＲＳ１；（２４、 ２５））で形質転換し、ウラシル原栄養要求性で選別した。形質転換体は選択培 地で２３℃（ｏｒｃ２−１について許容温度）で増殖させた。コロニーを選択プ レートから選び段階希釈して、固形高朱養培地に播種し２３℃でコロニーを形成 させた。野性型形質転換体はコロニーを形成し、その大半は白色であるが幾つか は赤い領域を示した。赤色コロニーの１部分はプラスミドを失った、選別増殖コ ロニーの細胞に由来した。対照的に、ｏｒｃ２−１変異体に由来する大半のコロ ニーは赤く、選別増殖コロニーの細胞での高頻度のプラスミド消失を示した。さ らにまた、ｏｒｃ２−１株では、赤色領域は白色コロニーの大半に存在し、幾つ かの白色コロニーでは多数の赤色領域が認められた。 半分が赤色で半分が白色のコロニーの数からプラスミドが失われた細胞周期の 数を測定することが可能である。最初の細胞分裂でプラスミドを失ったコロニー のみが、半分が赤色で半分が白色のコロニーを形成する。野性株の場合には、０ ．９％（１０／１１６８）のコロニーが半分赤色半分白色で、このことは、プラ スミドは細胞周期の０．９％で失われることを示唆している。対照的に、許容温 度で増殖させたｏｒｃ２−１株の半分赤色半分白色コロニーの頻度は１１％（５ ８／５１２）で、これは、サンプルプラスミドは部分欠損Ｏｒｃ２ｐをもつ株で は約１２倍の頻度で失われたことを示唆している。これらのデータはｏｒｃ２− １ 株に特徴的なプラスミド安定性における重大な欠損を示唆し、ｏｒｃ２−１の 細胞周期表現型と合わせてｏｒｃ２−１株はＤＮＡ複製において不完全であると 思われた。これらの結果は、本明細書のｏｒｃ２−１株のフローサイトメトリー 実験と一致した。 ＯＲＣ２の配列． ２．８ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩｏｒｃ２−補完フラグメントの配列を決定し ジェンバンク(Genbank)に寄託した(承認番号#L23924)。顕著な長さの開放読み枠 のみでＯＲＣ２と推定されたが、約６８ｋＤの６２０残基蛋白と予想された。Ｓ ｓｔＩフラグメントは８０６ｂｐの上流配列と１４０ｂｐの下流配列を含んでい た。 推定Ｏｒｃ２ｐ蛋白は１５％が塩基性残基で１６％がセリン／スレオニンであ った。Ｎ−末端残基（残基１５−２８０）の５０％が完全にリジン、アルギニン 、 プロリン、セリンまたはスレオニンであった。キーバンク(KeyBank)モチーフプ ログラムによって、Ｏｒｃ２ｐ内のペプチドモチーフに対する幾つかの適合部分 が明らかにされた。Ｏｒｃ２ｐは、多くの潜在的な燐酸付加部位（ｃＡＭＰおよ びｃＧＭＰ依存蛋白キナーゼについて３ヵ所（残基５７、４３３および５４６で 開始）、蛋白キナーゼＣについて１２ヵ所（２４、４１、４２、８９、１０１、 １０２、１７６、３２１、３３５、４３１、５２１および５４９）およびカゼイ ンキナーゼＩＩについて１４ヵ所（６０、１４８、１４９、１８２、２３８、２ ７０、３８９、４８１、４８６、４９１、５０５、５５２、５９５および６０５ ））および核標的配列（nuclea rtargeting sequence）との適合部分（残基１０ ３−１０７）を含んでいた。ＲＡＰ１結合部位コンセンサスとの完全な適合(ヌ クレオチド５９５で開始)、およびＡＢＦ１−結合コンセンサス配列（１２およ び６０９で開始）との２つの近似適合（１２／１５）。リシルｔＲＮＡシンセタ ーゼ遺伝子は本明細書に示したＳｓｔ１フラグメントの左に（Mirande & Waller ，1988）、キナーゼ相同物は右に配置されることが配列相同性によって決定され た。 別の相同性は、他の種のトポイソメラーゼＩ蛋白間で相違するヒトトポイソメ ラーゼＩ蛋白の触媒ドメイン近くの領域に関して存在するが、不変活性部位チロ シンの周辺領域は除かれる。この領域は、チロシンの近くのセリンおよびリジン 残基から成るコンセンサス配列を含む（２５）。Ｏｒｃ２ｐ蛋白はまたそのＣ− 末端近くにそのようなコンセンサス配列を含んでいた。しかしながら、この推定 活性部位チロシンのフェニルアラニンへの変異は、ｏｒｃ２−１株の温度感受性 または接合欠損を補完するＯＲＣ２の能力に対して検出できるような影響をもた らさなかった。 実施例２で引用された番号付与文献． １．I．Herskowitzら、Cold Spring Harbor Laboratory Press 583(1992) ２．J．Abraham，J．Feldman，K.A．Nasmyth，J.N．Strathern，J.R．Broach & J．Hicks，C.C.H．Symp．Quant．Biol．47:989(1982); J.B．Feldman，J.B．H icks & J.R．Broach，J．Mol．Biol．178:815(1984)． ３．J．Rine & I．Herskowitz，Genetics 116:9(1987) ４．Kurtzら、Genes Dev．5:616(1991); Susselら、PNAS 88:7749(1991) ５．J.R．Mullenら、PMBO J．8:2067(1989) ６．P.S．Kayneら、Cell 55:27(1988); L.M．Johnsonら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA 87:6286(1990); P.D．Megeeら、Science 247:841(1990); E．Park & J .Szostak，Mol．Cell．Biol．10:4932(1990)． ７．P．Laurenson & J．Rine，Microbiol．Rev．56:543(1992)． ８．Brandら、Cell 41:41(1985); Kimmerlyら、EMBO J．7:2241(1988) ９．D．Shore & K．Nasmyth，Cell51:721(1987) １０．M.S．Longtineら、Curr．Genet．16:225(1989)． １１．A.R．Buchmanら、Mol．Cell．Biol．8:5086(1988) １２．J.F.X．Diffley & J.H．Cocker，Science 357:169(1992) １３．A.S．Buchman & R.D．Kornberg，Mol．Cell．Biol．10:887(1990) １４．J.A．Hubermanら、Nucleic Acids Res．16:6373(1988); B.J．Brewer & W.L．Fangman，Cell 51:463(1987) １５．S.P．Bell & Stillman，Nature 357:128(1992) １６．F.J．Mcnally & J．Rine，Mol．Cell．Biol．11:5648(1991) １７．A.M．Miller & K.A．Nasmyth，Nature 312:247(1984) １８．D.H．Rivier & J．Rine，Science256:659(1992) １９．サイレンシングに必要とされる必須遺伝子の温度感受性変異を同定する ために２種の遺伝子スクリーンが考案された。ｏｒｃ２−１を分離するためのこ のスクリーンはＪＲＹ２６９８（ＨＭＬα，ＭＡＴα，ＨＭＲα，ａｄｅ２，ｈ ｉｓ３ ，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−５２）から始めた。この菌株は３つの 染色体交配型遺伝子座全てにａ交配型カセットをもち、ＨＭＲ（ＪＲＹ２７００ ）にａ交配型カセットを含むプラスミド（ｐＪＲ９２４）で形質転換させた。プ ラスミド保有ＨＭＲａ遺伝子座は、Ｅサイレンサーで置換された２つの合成サイ レンサーを有し、さらに１エレメントが欠失していた。１つではなく２つのサイ レンサーを使用することによってサイレンサー内の位置変異による混乱を最小に した。ＥＭＳ変異誘発コロニーのうち１６２０００個のコロニーを補充最少培地 （ウラシル無し）で２５℃で増殖させ、ＨＭＲにあるプラスミド保有ａカセット の抑制についてスクリーニングした。変異誘発コロニーをウラシル補充または非 補充最少培地に成育させた交配検査株ＤＢＹ１０３４（ＭＡＴａ，ｈｉｓ４−５ ３９ ，ｌｙｓ２−８０１，ｕｒａ３−５２）のローン上にレプリカ播種した。レ プリカを２５℃で１時間恒温保持し、続いて３０℃で一晩置いた。プラスミド含 有ＪＲＹ２７００細胞のみが検査株と接合でき、非補充プレートで増殖できる二 倍体を生じたが、これは機能的ＵＲＡ３遺伝子のみがプラスミドに有ったからで ある。 プラスミド保有ａカセットの抑制を引き起こす変異を保有する細胞は、酵母プ ラスミドの特色を調べることによって他の種類の変異と区別することができる。 これらのコロニーの細胞の約１０％がプラスミドを欠き、したがって概ね検査株 と接合して、ウラシル補充プレートで増殖できるＵｒａ^-二倍体を形成すること ができた。コロニーが交配反応経路に変異を有する場合、これら細胞はプラスミ ドの非存在下でさえも接合できず、したがってウラシル補充培地で増殖可能な二 倍体を形成することができないであろう。増殖について温度感受性で、さらにウ ラシル補充プレートでのみ検査株と接合する２８個の株を同定した。続いて、Ｈ ＭＲａ 遺伝子座に合成サイレンサーを保有するプラスミド（ｐＪＲ９２４）およ び野性型ＨＭＲａ遺伝子座を保有するプラスミド（ｐＪＲ９１９；McNally & Rine(1991))で各株のプラスミド非含有分離株を形質転換させた。野性型ＨＭＲ 遺伝子座を持つ場合（ｐＪＲ９１９）３株が接合能力があったが、合成サイレン サー含有ＨＭＲ遺伝子座を持つ場合（ｐＪＲ９２４）は接合できなかった。この ｔｓ増殖表現型および交配表現型が同じ変異のためであるか否かを決定するため に、ｔｓ表現型の偶発復帰体を選別した。ｔｓ増殖の偶発復帰体の１株、ＪＲＹ ２９０４は野性型ＪＲＹ２７００同様に接合したが、このことは、交配表現型と 温度感受性増殖は同じ変異によることを提唱する。この変異をｏｒｃ２−１と称 した。 ２０．Y．Kassirら、Genet．109:481(1985); Foss & Rine，Genetics(1993) ２１．温度感受性ｏｒｃ２−１の補完によってＯＲＣ２遺伝子をクローニング した。ｏｒｃ２−１株（ＪＲＹ３６８３）をＣＥＮＬＥＵ２をベースにしたビー ル酵母ゲノムライブラリーで形質転換させた（２３）。約１０００から１５００ の形質転換体が２３℃でコロニーを形成した。これらコロニーのレプリカプリン トを３７℃で恒温保持し、上昇温度で増殖する能力についてスクリーニングした 。プラスミドを温度耐性株から分離し再検査した。また別の時に該欠損を補完し たプラスミドを制限消化によって分析した。ＣＥＮ−ＬＥＵ２ライブラリー（ｐ ＪＲ１４１６）由来のプラスミドを１株さらに分析するために選んだ。 ２２．ＯＲＣ２をＴｎ１０ＬＵＫトランスポゾン（３３）で分断した。このト ランスポゾンは、ＳｓｔＩｏｒｃ２−１補完フラグメントを含むプラスミド（ｐ ＪＲ１１４６）のＯＲＣ２コード配列内に挿入された。プラスミドｐＪＲ１１４ ７はＯＲＣ２コード領域内にＴｎ１０ＬＵＫをもつ。ＯＲＣ２含有ＳｓｔＩフラ グメント（トランスポゾンによって分断されている）は、ＳｓｔＩによる部分消 化によってｐＪＲ１１４７から除去された。このフラグメントで野性型二倍体Ｊ ＲＹ５４３を形質転換した。ＯＲＣ２遺伝子座へのこの分断対立遺伝子の組み込 みはＤＮＡブロットハイブリダイゼーション分析(Southern，1975)で確認した。 この二倍体をＪＲＹ３４４４と名付けた。 ２３．P．Hieter，C．Mann，M．Snyder & R.W．Davis，Cell 40:381(1985) ２４．D．Koshland，J.C．Kent & L.H．Hartwell，Cell 40:393(1985); R.M． Lynnら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:3559(1989); W.-K．Eng，S.D．Pandit & R．Sternglanz，J.Biol．Chem．264:13373(1989) ２５，２６．A.H．Brand，G．Micklem & K．Nasmyth，Cell 51:709(1987) ２７．S．Shumanら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9793(1989) ２８，２９．J．Singh & A.J.S．Klar，Genes & Dev．6:186(1992) ３０．D.D．Dubeyら、Mol．Cell．Biol．11:5346(1991) ３１．C.A．Hrycynaら、EMBO J．10:1699(1991) ３２．オリゴヌクレオチド特異性変異誘発（３５）によってＨＭＲα遺伝子座 に隣接するＨＭＲ−ＥのＲＡＰ１結合部位に変異を導入し、それによる変化を配 列決定によって確認した。ＲＡＰ１部位変異はＨＭＲ−ＥのＰＡＳ１−１変異と 同一であった。このＰＡＳ１−１変異はインビトロでＲＡＰ１蛋白の結合を阻害 する特徴を有することが以前に見出され（２１）、本明細書ではＨＭＲα−ｅ− ｒａｐ１−１０ として記載されている。ｐＲｓ３１６のＨＭＲα−ｅ−ｒａｐ１ −１０ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントから成るプラスミドをｐＪＲ１４２５と名付 けた。同じプラスミドの野性型ＨＭＲα体はｐＪＲ１４２６と称した。それぞれ 別個のＨＭＬａｍａｔａ１ＨＭＲａｓｔｅ１４株の１２の培養からＨＭＲαプラ スミド（ｐＪＲ１４２５）で得た約１０００００個の変異誘発細胞を２３℃で増 殖させてコロニーを形成し、ＭＡＴａｕｒａ３交配型検査株（ＰＳＹ１５２）の ローン上にレプリカ播種してａ交配表現型を示す変異体を同定した。この交配プ レートを３０℃で恒温保持し、ＨＭＲで抑制されるためには十分に不完全である が生存不能となるほどには不完全ではない変異体を同定した。選別した９００個 の接合能の高い二倍体コロニーのうち、５０個の変異体が３７°Ｆでの増殖につ いてある程度温度感受性であった。これらの変異体をさらなる実験に用い、残余 は廃棄した。５０個全ての変異体が野性型に対して劣性であった。本明細書ではＯＲＣ２ に関連する変異体のサブセットを提示するが、残余は別の場所で考察す ることにする。 ３３．ＯＲＣ２遺伝子をｏｒｃ２−１変異によって明らかにした。ｏｒｃ２− 補完プラスミド(ｐＪＲ１４１６)を温度感受性ｏｒｃ２−１の補完によって得た 。プラスミド中のｏｒｃ２−補完遺伝子のおよその位置を決定するために、６個 の誘導体をｐＪＲ１４１６から誘導し補完性を調べた。ＳａｌＩ−ＳａｌＩフラ グメントを該挿入物から除去しｐＪＲ１４１８を得た。３つの隣接するＸｂａＩ −ＸｂａＩフラグメントを除去してｐＪＲ１４２２を得た。ＳｐｈＩは該挿入物 をただ１度さらにベクターの内部をただ１度切断する。このＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ フラグメントを欠失させてｐＪＲ１４１７を得た。ＳｓｔＩによる切断によって 該挿入物から２つのフラグメントが遊離した。両フラグメントの欠失によってｐ ＪＲ１４１９が生成された。大きい方のＳｓｔＩフラグメントのみ（ｐＪＲ１４ ２１）または小さい方のＳｓｔＩフラグメント（ｐＪＲ１４２０）のみが欠失し ている分離株もまた回収した。２．８ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩｏｒｃ２−補完 フラグメントをＣＥＮＵＲＡ３ベクターｐＲＳ３１６（３６）のＳｓｔＩ部位で クローニングしてｐＪＲ１２６３を得た。ＯＲＣ２の一部または全部の染色体内 組み込みを可能にする２つのプラスミドを作製した。最初のもの（ｐＪＲ１４２ ３）はＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ挿入物（ｐＪＲ１４１６由来）を含み、これはＯＲＣ ２ 開始コドンの数ｋｂ上流から、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−カットｐＲＳ３０６（３ ６）（ＵＲＡ３によるマーカーをもつ酵母の組み込み用ベクター）に挿入された 終止コドンの約６０ｂｐ上流まで延びている。第二のもの（ｐＪＲ１４２４）は ｐＲＳ３０６のＳｓｔＩ部位に挿入されたＳｓｔＩｏｒｃ２−補完フラグメント を含んでいた。 ３４．F．Spencerら、Genetics 124:237(1990) ３５．O．Huismanら、Genetics 116:191(1987) ３６．E.M．Southern，J．Mol．Biol．98:503(1975) ３７．T.A．Kunkelら、Methods Enzymol．154:367(1987) ３８．R.S．Sikorski & P．Hieter，Genetics 122:19(1989) 実施例３ 我々は、潜在的酵母イニシエーターを同定するために遺伝学的手法、１ハイブ リッド系を開発し、対象の標的配列を認識する蛋白を発見した。この１ハイブリ ッド系は２つの基本的な成分を有する。すなわち、（ｉ）ハイブリッド発現ライ ブラリー（これは転写活性化ドメインを任意蛋白セグメントに融合させることに よって構築される）および（ｉｉ）そのプロモーター領域に対象の結合部位を含 むレポーター遺伝子である。ハイブリッド蛋白のプロモーター領域に結合し、転 写を活性化させるこの二重の能力のために、この部位を認識するハイブリッド蛋 白はレポーター遺伝子の発現を誘発すると期待される（８）。この結合部位を既 に占有している内因性蛋白と相互反応するハイブリッドもまた転写を活性化する であろうから、この関連は間接的かもしれない（７）。それでもやはり、この関 連が配列特異的であるかぎり、ハイブリッドに取り込まれる蛋白は機能的に関連 があるはずである。 我々はこの方法を用いて、酵母のＤＮＡ複製開始点のＡＲＳコンセンサス配列 （ＡＣＳ）を認識する蛋白をビール酵母から探した。このスクリーンの蛋白成分 は、ＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４^AD）に融合させた任意酵母蛋白セグ メントを含む３つの補完性酵母ハイブリッドライブラリーセット（ＹＬ１−３） によって提供された（９）。このスクリーンのためのレポーター遺伝子は、その プロモーター領域にＡＣＳの４つの同方向繰り返し配列を含み、酵母株ＧＧＹ１ に組み込まれＪＬＹ３６３（ＡＣＳ^WT）が作出された（１０）。ｌａｃＺ誘発が ＡＣＳに依存しているか否かを調べるために、並行してＪＬＹ３６５（ＡＣＳ^{MU TANT} ）を構築した。この株は、非機能性複合変異ＡＣＳを４コピー保有するレポ ーター遺伝子を含む（図４）（１０）。 我々は、１２０万のＹＬ１−３形質転換体のスクリーンからＪＬＹ３６５（Ａ ＣＳ^MUTANT）よりもＪＬＹ３６３（ＡＣＳ^WT）でより大きなｌａｃＺ活性を誘発 する９つのプラスミドを分離した（１１）。最初のライブラリーのスクリーニン グでＪＬＹ３６３（ＡＣＳ^WT）でｌａｃＺ活性を誘発したプラスミドの多くは、 ＪＬＹ３６５（ＡＣＳ^MUTANT）に導入したときＡＣＳへの依存性を示すことがで きなかった。これらのプラスミド制限分析によって、９つの分離株が５つのゲノ ムクローンを表示していることが分かった。これらゲノムクローンを我々は冒頭 にＡＣＳ関連蛋白としてＡＡＰ１−５と呼んだ。ＡＡＰ１は４回、ＡＡＰ５は２ 回、残りはただ１回分離された。 ｌａｃＺ誘発の配列特異性をより高い解析度で調べるために、４つのＡＣＳ点 変異体の同方向繰り返し配列を含むレポーター構築物をそれぞれＧＧＹ１に組み 込み、レポーター株のセットを作出した（１０）。５つのＡＡＰクローンをｌａ ｃ Ｚ発現を誘発する能力についてこれらの株で個々に調べた。ＡＡＰ１はレ ポーター遺伝子のこのセットの誘発とそのＡＣＳのＡＲＳ機能（１２）との間の 一致を示した。ＡＡＰ５ハイブリッドは微かに低下した相関性を示し、その他は 貧弱な相関性を示した。。これらの発見は、ＡＡＰ１は（おそらくはＡＡＰ５も ）、配列特異的態様でＡＣＳを認識する蛋白をコードすることを提唱している。 ＡＡＰ１コード配列に欠失を有する構築物はｌａｃＺ発現を誘発することができ ず、このことはＡＣＳの認識はＧＡＬ４に融合させた蛋白セグメントに存在する ことを示唆した。 ＡＡＰ１−５のＧＡＬ４^ADに融合させたゲノムセグメントの配列を決定し（１ ５）、生成されるハイブリッド蛋白の範囲を決定した。ＡＡＰ１およびＡＡＰ５ は、ＧＡＬ４^ADの枠内に融合したかなりのおおきさのそれぞれ３０１および１２ ３アミノ酸の蛋白コード配列を有していた。原則として、これらのセグメントは 、レポーター遺伝子のプロモーターにハイブリッド蛋白を誘導するために十分な 大きさである。ＡＡＰ２−４は、ＧＡＬ４^ADに融合したほんの短いペプチド伸長 （それぞれ１０、２２および３８アミノ酸）を有するハイブリッド蛋白をコード し、これらのハイブリッドはこれらのクローンの属性と考えられた転写誘発に必 要ではないことを示唆した。この発見およびＡＣＳエレメントに対する適切な配 列特異性の欠如のために、ＡＡＰ２−４をそれ以上は調べなかった。 完全な長さのＡＡＰ１遺伝子を酵母ゲノムライブラリーからクローニングし、 配列を決定した（１５）(Genbank承認番号L23323)。ＡＡＰ１は、予想分子量が ５０３０２ダルトンで長さが４３５アミノ酸の蛋白のための開放読み枠を含む。 該スクリーンから得たハイブリッドＧＡＬ４^AD−ＡＡＰ１蛋白は、完全な長さの 予想蛋白のＣ−末端２／３（残基１３５−４３５）にＧＡＬ４^ADが融合したもの であった。このことは、ＡＣＳとの連繋には該分子のこの部分で足りることを示 唆している。ＯＲＣの５０ｋｄサブユニット由来のペプチド配列とＡＡＰ１から 予想される蛋白配列との比較によって、当該遺伝子はこのサブユニットをコード することが明らかにされ、さらにＡＡＰ１蛋白とＡＣＳとの間の連繋が確認され た。この同一性のゆえに、この遺伝子をＯＲＣ６と改名した。 アミノ酸が２５０個の長さの蛋白をコードすることができる重なり合うＯＲＦ は相補鎖に存在する。このＯＲＦの予想される開始および終止コドンの位置は、 それぞれｎｔ１６１５−７およびｎｔ８６５−７にある。ｐＪＬ７６６で、１４ ７１のＣ残基をＴに変異させ、ＯＲＣ６のアミノ酸配列は保存したが、この重な り合うＯＲＦに終止コドンを導入した。ＯＲＣ６の配列は、細胞周期の進行を支 配する調節機構との関係を示唆する。Ｏｒｃ６ｐはサイクリン依存蛋白キナーゼ のための燐酸化部位（（Ｓ／Ｔ）ＰＸＫ）を含み、これらはこの分子の前半分に 集合している。よりリラックスしたコンセンサス部位（Ｓ／Ｔ）Ｐを用いること によってこの集合体にさらに２つの部位が加えられる。我々は、インビボでＯｒ ｃ６ｐがセリンおよびスレオニン残基で燐酸化されるのを観察した。しかしなが ら、酵母ＤＮＡ複製の開始はＧ１でのこの蛋白キナーゼの活性化に反応して直ち に始まるので、我々は、Ｏｒｃ６ｐおよびおそらくは他のＯＲＣサブユニットは このキナーゼの調節基質であると考えた。最後に、核内での事象に関与する蛋白 について予想されるように、Ｏｒｃ６ｐは、（Ｓ／Ｔ）ＰＸＫ集合体内およびＣ −末端ドメイン（アミノ酸残基１１７−１２２および２６３−２７９）に潜在的 核局在化シグナルを含む。Ｏｒｃ６ｐは免疫蛍光によって核内に認められる。 選定欠失(marked deletion)をもつＯＲＣ６遺伝子（ｐＪＬ７３１）（２１） （その開放読み枠から１３コドンを除き全てが除去されている）を３つの異なる 株のバックグラウンドから得られた二倍体に導入した。生じた異型接合ＯＲＣ６ 欠失株（ＪＬＹ４８１、ＪＬＹ４７５およびＪＬＹ４６９）を減数分裂を経るよ うに誘導し、各株の２０個の四分子を分析した（２１）。すべてのバックグラウ ンドで、ＯＲＣ６の分断は生存不能をともに分離し、ＯＲＣ６は細胞増殖に必須 であることが示された。顕微鏡検査によって、ＪＬＹ４８１およびＪＬＹ４７５ の変異体胞子は発芽して１−２回の細胞分裂を完了し、続いて、ＤＮＡ複製また は核分裂が不完全な細胞分裂周期変異体を連想させる均質で大型の出芽形態で進 行停止することを示した（２２）。これらの細胞のＤＮＡ容量は容易には測定で きないので、細胞周期の進行停止位置を正確に示すことはできなかった。ＪＬＹ ４６９から得られた変異体胞子は殆ど出芽しなかった。 これらＯＲＣ６欠失実験の説明は、ＯＲＣ６遺伝子のアンチセンス鎖の２５０ アミノ酸の第二の開放読み枠(ＯＲＦ２)の存在によって困難になった。ＯＲＦ２ はジェンバンク配列のヌクレオチド１６１７から８６８に広がっていて、ＯＲＣ ６コード配列のＣ−末端２／３に一致する。ＯＲＦ２に影響を与えずにＯＲＣ６ コード配列のＮ−末端の３番目を除去した選定欠失（ｐＪＬ７３３）を二倍体に 導入した（２１）。四分子分析によって、ＯＲＣ６欠失は細胞死をともに分離す ることが再度示された。最後に、ＯＲＣ６ＯＲＦのためにサイレントコドン変化 を含むが、ＯＲＦ２にＵＡＧ終止コドンを導入したＯＲＣ６遺伝子を構築した（ ２２）。この遺伝子は、ＯＲＣ６ＯＲＦの完全な欠失を含む一倍体株を救出する ことができた。我々は、ＯＲＣ６は細胞の生存に必須であると結論した。 この結果は、問題のＤＮＡ配列を認識する蛋白のための遺伝子を同定しクロー ニングする方法として１ハイブリッド系スクリーンの有効性を実証する。このス クリーンはまた、ＤＮＡ結合蛋白の同定に有効で（２３）、このスクリーンの類 型が、疑わしいＤＮＡ結合蛋白の結合部位を同定するために用いられた（２４） 。この１ハイブリッドアプローチは、生化学的に検出することが困難な蛋白、ま たは精製の出発材料を得るのが困難な蛋白について特に有用である。 ＯＲＣ６欠失をもつ発芽胞子は細胞分裂周期表現型を示しているようであった ので、我々は、樹立ｃｄｃ変異体を用いてＯＲＣ６と遺伝学的に相互反応する遺 伝子を同定した。ｐＪＬ７４９（２８）（Ｏｒｃ６ｐを数百倍過剰発現するプラ スミド）を、細胞周期の種々の点で進行停止させた実質的に同系の温度感受性ｃ ｄｃ変異体に導入した（２９）。ＯＲＣ６の過剰発現はｃｄｃ６およびｃｄｃ４ ６ 変異体に選択的に影響を与え、それらの制限温度を５−７℃下げた。その他の 検査した変異体または野性株には顕著な影響はなかった（表１）。 実施例３で引用した番号付与文献 １．Kelly，J．Biol．Chem．263:17889(1988); Marians，Annu．Rev．Biochem ．61:673(1992); Kornberg，Baker，DNA Replication(Freeman & Company，New York，1992); B．Stillman，Annu．Rev．Cell Biol．5:197(1989) ２．M.L．DePamphilis，Annu．Rev．Biochem．62:29(1993) ３．Campbell & Newlon，サッカロミセス属酵母の分子生物学(The Molecular & Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces)より、Broachら編(CSHLPress ，1991)、１巻、４１−１４６ページ ４．Fangman & Brewer，Annu．Rev．Cell Biol．7:375(1991) ５．J.R．Broachら、Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．47:1165(1983) ; Van Houton & C.S．Newlon，Mol．Cell．Biol．10:3917(1990) ６．Y．Marahrens & B．Stillman，Science 255:817(1992) ７．S．Fields & O.-K．Song，Nature 340:245(1989); C.-T．Chien，P.T.Bar tel，R．Sternglanz，S．Fields，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9578(1991) ８．R．Brent & M．Ptashne，Cell 43:729(1985) ９．３つの関連ハイブリッド発現ライブラリー，ＹＬ１−３（７）のＮ−末端 部分はＳＶ４０核局在化シグナルおよびＧＡＬ４活性化ドメイン（ＧＡＬ４^AD） のアミノ酸７６８−８８１から成る。このＣ−末端部分は酵母蛋白のランダムセ グメントに由来し、これらをＧＡＬ４^ADの末端に融合させた。これらのセグメン トは、酵母ゲノムＤＮＡのＳａｕ３ａ部分消化で得られる短い（１−３ｋｂ）フ ラグメントによってコードされる。さらに、ＹＬ１−３は、これらフラグメント の３つの読み枠全てが発現可能であることを保証する。 １０．ｐＬＲ１Ｄ１はウェストらにより報告されている(R.W．West Jr.，R.R. Rogers，M．Ptashne，Mol．Cell．Biol．4:2467(1984))。我々は、（ｉ）Ｘｈｏ ＩリンカーをＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩポリリンカーで置換し、さらに、 （ｉｉ）２ｍ配列を含むＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを正確に切り出すことによ って、ｐＬＲ１Ｄ１からｐＢｇｌ−ｌａｃＺを作出した。生じたベクターは、プ ロモーター領域内のＤＮＡの挿入のためにＴＡＴＡボックスの約１００ｂｐ上流 に固有のＢｇｌＩＩ部位を、さらにプラスミドの照準組み込み(targetedintegra tion)のためにＵＲＡ３遺伝子座に固有のＳｔｕ１部位を有する。ＡＲＳ１ドメ インＡの多重同方向繰り返し配列およびその変異体誘導物のいくつかをｐＢｇｌ −ｌａｃＺのＢｇｌＩＩ部位に挿入し、この実験で使用するレポーター遺伝子の 全てを作出した。挿入された繰り返しエレメント（相補的オリゴヌクレオチドに 由来する）の右にＴＡＴＡボックスを並べた。各レポーター遺伝子構築物は、レ ポーター株を作出するためにＧＧＹ１（ＭＡＴａ Ｄｇａｌ４Ｄｇａｌ８０ ｕ ｒａ３ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ａｄｅ２ ｔｙｒ）〔G.Gill & M．Ptashne，Cel l 51:121(1987)]のＵＲＡ３遺伝子座に組み込まれた。ＧＧＹ１へのｐＢｇｌ− ｌａｃＺの組み込みはＪＬＹ３８７を生じた。 １１．ＹＥＰＤ（富裕完全）およびＳＤ（合成脱落）培地はヒックスとヘルス コビッチによって記載された(J.B．Hicks & I．Herskowitz，Genetics 83:245(1 976))。酵母細胞操作(C．Guthrie & G.R．Fink編、酵母の遺伝学と分子生物学ガ イド(Guide to Yeast Genetics & Molecular Biology)(アカデミックプレス、サ ンディエゴ(1991))およびおよびＤＮＡ操作（F.M．Ausubelら編、分子生物学の 最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)(Wiley、ニューヨー ク(1989))には標準方法を用いた。ライブラリーＹＬ１−３でＪＬＹ３６３（１ ０）を形質転換し（R.H．Schiestl & R.D．Geitz，Current Genetics 16:339(19 89)）、さらに２−５０００コロニー／１０ｃｍプレートの密度でＳＤ−Ｌｅｕ 上に播種した。ＹＬ１およびＹＬ２について５０００００、ＹＬ３のため には２０００００個の形質転換体を得た。これらをｂ−ガラクトシダーゼの産生 について調べた（L．Breeden & K．Nasmyth，Cold Spring Harbor Symp．Quant. Biol．47:643(1985)）。コロニー精製後、４９の分離株が陽性のままで（ＹＬ１ から１５、ＹＬ２から２２、ＹＬ３から１２）、それらからライブラリープラス ミドを抽出した。これらのプラスミドの各々でＪＬＹ３６３およびその変異体対 応物ＪＬＹ３６５の両方を形質転換した（１０）。９プラスミドが、コントロー ルよりも野性型レポーター株でより強いｂ−ガラクトシダーゼ活性を誘発した。 ＨｉｎｄＩＩＩ制限パターンに基づいて、これらのプラスミドを５つのクローン (ＡＰＰ１−５)に分類した。続いて、各クローンをＪＬＹ３６０、ＪＬＹ３６１ 、ＪＬＹ３８７、ＪＬＹ４２９、ＪＬＹ４３１、ＪＬＹ４３３、ＪＬＹ４３５で 再検査した。ＡＡＰ１ハイブリッドクローンをｐＪＬ７２０と呼んだ。このＡＡ Ｐ１ 遺伝子は後にＯＲＣ６と改名された。 １２．変異体配列のＡＲＳ機能をＡＲＳ１ドメインＢ（ＢｇｌＩＩＩ−Ｈｉｎ ｆＩフラグメント、ｎｔ８５３−７３４）に関連して、次のＣＥＮベースＵＲＡ ３含有プラスミドで分析した：ｐＪＬ３４７（ｗｔ）、ｐＪＬ２４３（多重）、 ｐＪＬ３２６（Ａ８６３Ｔ）、ｐＪＬ３３８(Ｔ８６９Ａ)、ｐＪＬ３３０(Ｔ８ ６２Ｃ)およびｐＪＬ３１６(Ｔ８６７Ｇ)。これらのプラスミドでＪＬＹ１０６ （ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ｔｒｐ１ ｌｙｓ２ ａｄｅ２） およびその同型接合二倍体ＪＬＹ１６２を形質転換した。ｐＪＬ２４３、ｐＪＬ ３２６およびｐＪＬ３３８は高頻度形質転換を起こさず、ＡＲＳ機能について定 量的にアッセーすることができなかった。ｐＪＬ３４７、ｐＪＬ３３０およびｐ ＪＬ３１６は高効率で細胞を形質転換し、有糸分裂安定性についてアッセーされ た(Stinchcombら、Nature 282:39(1979))。 １３．ｐＪＬ７２０（ＹＬ３ライブラリーから最初分離されたＯＲＣ６ハイブ リッド構築物）は２つのＢａｍＨＩ部位を有する。ハイブリッド結合によって作 出された５’部位はｎｔ８４３のＳａｕ３ａに対応する。この２つの部位の間の セグメントの切り出しはｐＪＬ７２１を作出し、ＧＡＬ４^ADの枠内にアミノ酸３ ３９−４３５を残す。ｐＧＡＤ３Ｒ（１１）（ＹＬ３ライブラリーの親ベクター ）はＯＲＣ６配列を含まない。ｐＲＳ４２５（Christiansonら、Gene 110:119 (1992)）は融合蛋白の成分を含まない。 １４．全ての配列決定は崩壊二本鎖鋳型でシークェナーゼ（Sequenase(USB)） を用いて実施した。ＡＡＰ１ハイブリッドクローンの蛋白コードセグメントの配 列をその結合部からその終止コドンまで決定した。２つのＯＲＣ６配列決定用プ ライマーをコロニーハイブリダイゼーションプローブとして用いて、完全な長さ のＯＲＣ６遺伝子（ｐＪＬ７２４）クローンのために高コピー数酵母ゲノムライ ブラリー(M．Carlson & D．Botstein，Cell 28:145(1982))をスクリーニングし た。完全な長さの遺伝子は、約２００ｎｔ離れて位置するオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて両方の鎖について配列が決定された。 １５．S.P．Bell & B．Stillman，Nature 357:128(1992) １６．Hodgman，Nature 333:22(1988); Walkerら、EMBO J．1:945(1982 １７．P．Linderら、Nature 337:121(1989) １８．E.A．Nigg，細胞生物学セミナー（Seminars in Cell Biology）2:261(1 991) １９．ＯＲＣ６欠失は、ジェンバンク配列のヌクレオチド４５８−１７２１（ ｐＪＬ７３１）またはヌクレオチド４５８−８４６（ｐＪＬ７３３）をＵＲＡ３ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＯＲＣ６配列のそれと方向を反対にして入れ換え て構築した。各構築物を用いて、二倍体株で異型接合ＯＲＣ６欠失を一段階遺伝 子置換によって作出した。ＯＲＣ６欠失分析は、ＪＬＹ４６１（ＭＡＴａ／ＭＡ Ｔａ ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｌｅｕ２／ｌｅｕ２ ｈｉｓ３／ｈｉｓ３ｔｒｐ１ ／ｔｒｐ１ ａｄｅ２／ａｄｅ２〔ｃｉｒ⁰〕）、ＪＬＹ４６２（ＭＡＴａ／Ｍ ＡＴａ ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｌｅｕ２／ｌｅｕ２ ｔｒｐ１／ｔｒｐ１ ｈｉ ｓ４／ｈｉｓ４ ｃａｎ１／ｃａｎ１）、およびＪＬＹ４６３（ＭＡＴａ／ＭＡ Ｔａ ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｌｅｕ２／ｌｅｕ２ ｔｒｐ１／ｔｒｐ１ ｈｉｓ ３／ＨＩＳ３）で実施し、それらの遺伝子バックグラウンドは、それぞれＳ２８ ８ｃ、ＥＧ１２３およびＡ３６４ａである。ｐＪＬ７３１（完全な欠失）による ＪＬＹ４６１、ＪＬＹ４６２およびＪＬＹ４６３の分断によってＪＬＹ４８１、 ＪＬＹ４７５およびＪＬＹ４６９がそれぞれ作出された。ｐＪＬ７３３（Ｎ−末 端欠失）によるＪＬＹ４６１、ＪＬＹ４６２およびＪＬＹ４６３ の分断によってＪＬＹ４８５、ＪＬＹ４７９、ＪＬＹ４７３がそれぞれ作出され た。これらの異型接合選定欠失株に胞子を形成させ、それぞれ２０個の四分子を 分析し、ＹＥＰＤで増殖させ生存性を調べた。 ２０．Pringle & Hartwell，サッカロミセス属酵母の分子生物学(The Molecul ar Biology of the Yeast Saccharomyces)より、(Strathernら編、CSHL pRESS， CSH，1981)，１巻、９７−１４２ページ ２１．完全な長さのクローンのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩフラグメントをｐＪＬ７ ２０からプライマーを用いてＰＣＲによって生成したＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩフラ グメントで置き換えて点変異体（ｐＪＬ７６６）を作出した。変異によってジェ ンバンク配列のヌクレオチド１４７１がＣからＴに変化し、これは配列分析によ って確認された。 ２２．M.M．Wang & R.R．Reed，Nature 364:121(1993) ２３．T.E．Wilsonら、Science 252:1296(1991) ２４．J.F.X．Diffley & J.H．Cocker，Nature 357:169(1992) ２５．ｐＪＬ７４９は、ＯＲＣ６（ｎｔ４４３−２２９８）を発現させるＧＡ Ｌ１ プロモーター（ｎｔ１４６−８１６）を高コピー酵母シャトルベクターＲＳ ４２５（Christiansonら、Gene 110:119(1992)）中に含む。 ２６．ｃｄｃ変異体株を、Ａ３６４ａ ＲＤＹ４８７（ＭＡＴａ ｌｅｕ２ ｕｒａ３ ｔｒｐ１）およびＲＤＹ４８８（ＭＡＴａ ｌｅｕ２ ｕｒａ３ ｔ ｒｐ１）由来の２つの類遺伝子系株に４−５回戻し交配した。全てがｕｒａ３ｌ ｅｕ２ ｔｒｐ１である。ＲＤＹ５１０、ＲＤＹ６６４、ＪＬＹ３１０およびＪ ＬＹ１７９はＭＡＴａで残りはＭＡＴａである。さらに別のマーカーがＪＬＹ３ １０（ａｄｅ２）、ＲＤＹ５４３（ｈｉｓ３）およびＲＤＹ６１９（ｐｅｐ４Ｄ ::ＴＲＰ１ ｈｉｓ３ ａｄｅ２）に見出すことができる。ｐＪＬ７４９、ｐＪ Ｌ７７２およびＲＳ４２５（２８）でこれらの株を形質転換し、ＳＤ−ＬＥＵに ２２℃で播種した。各形質転換体から４つのコロニー精製分離株をＳＤ−ＬＥＵ プレートに付加し、さらにＳＧＡＬ−ＬＥＵプレートに全て２２℃でレプリカ播 種した。ＳＧＡＬ−ＬＥＵ上の小片を一連の予備保温ＳＧＡＬ−ＬＥＵプレート に２２°、２５°、２７°、３０°、３２．５°、３５°、３７° および３８°でレプリカ播種した。ｐＪＬ７４９を含むｃｄｃ変異体の生存性を ｐＪＬ７７２およびｐＲＳ４２５を含むものと比較した。 ２７．Hartwell，JMB 104:803(1976); Hennessyら、G&D 4:2252(1990) ２８．Chenら、PNAS 89:10459(1992); Hoganら、同書、89:3098 ２９．B.J．Andrews & S.W．Mason，Science 261:1543(1993) 実施例４．Ｏｒｃ蛋白の精製と遺伝子クローニング 蛋白の精製：ペプチド配列決定のために十分な蛋白を得るために、先に報告さ れた方法(Bell & Stillman，1992)を基にＯＲＣの修正精製方法を考案した。全 細胞抽出物を４００ｇの凍結ＢＪ９２６細胞（３００リットル（３００リットル につき合計１．６ｋｇ）の増殖期培養を採取後直ちに凍結）から調製した。全て の緩衝液が０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭベンザミジン、２ｍＭペプスタチンＡ 、０．１ｍｇ／ｍｌバシトラシンおよび２ｍＭのＤＴＴを含んでいた。２倍の緩 衝液Ｈ／０．１^-NP-40（１００ｍＭヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、０．２Ｍの ＫＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび２ ０％グリセロール）の４００ｍｌを細胞に加え、さらに融解後細胞をビーズ破砕 器（Biospec Products）を用いて９０％以上の細胞が破壊されるまで（３０秒パ ルス、９０秒休止を２０回）破壊した。破壊完了後、破壊細胞の容積を測定し、 硫酸アンモニウムの飽和溶液（４℃）を１／１２の容積で加え３０分攪拌した。 続いて、この溶液を１３０００×ｇで２０分遠心した。生じた上清を４５Ｔｉの ボトルアセンブリー(ベックマン)に移し、４５Ｔｉローターで４４０００ＲＰＭ で１．５時間遠心した。得られた上清の容積を測定し硫酸アンモニウムを０.２ ７ｇ／ｍｌ加えた。３０分攪拌後、沈殿物を４５Ｔｉローターで４００００ＲＰ Ｍで３０分遠心して集めた。得られたペレットをＢ−乳棒ダウンスを用いて緩衝 液Ｈ／０．０（５０ｍＭヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％ＮＰ−４０、１０％グリ セロール）中に再浮遊させ、Ｈ／０．１５ＭのＫＣｌ（０．１５ＭのＫＣｌ添加 緩衝液Ｈ）に対して透析した。典型的にはこの調製物で１２−１６ｇ（ウシ血清 アルブミンを基準としてブラッドフォード（Bradford）アッセーで決定）の可溶 性蛋白が得られた。この調製物からのＯＲＣの調製は、本質的には記載されたと おりである（Bell & Stllman，1992）が以下の変更を含む（４００ｇの細胞から ＯＲＣの調製に用いられたカラムの大きさはカッコ内に示す）。Ｓ−セファロー スカラムに樹脂（〜３００ｍｌ）１ｍｌにつき２０ｍｇの蛋白を載せた。Ｑ−セ ファロース（５０ｍｌ）および配列特異的親和性カラム（５ｍｌ）を記載のよう に流したが、二本鎖ＤＮＡセルロースカラムはこの調製では省略した。ただ１回 のグリセロール勾配をＳＷ−４１ローターで実施した（４１０００ＲＰＭ、２０ 時間）。概算では、酵母細胞４００ｇにつき１３０μｇのＯＲＣ複合体（全サブ ユニットが結合している）が得られた。 蛋白配列決定：ＯＲＣサブユニットの消化は、カワサキとスズキが記載した“ インゲル”（in gel）プロトコルをいくらか変更して実施した。簡単に記せば、 精製ＯＲＣ（サブユニットにつき〜１０μｇ）をまず１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで 分離し、０．１％クーマシーブリリアントブルーＧ(Aldrich)で１５分染色した 。脱色（１０％メタノール、１０％酢酸）した後、ゲルを１時間水に浸し、続い て蛋白バンドを切り出し、微量遠心管に移し、ぴったりと管の底に収まるように ３−５個の細片に切った。０．１％ＳＤＳを含む最少量の０．１Ｍトリス−ＨＣ ｌ（ｐＨ＝９．０）を加え、完全にゲル細片を覆った。続いて２００ｎｇのアク ロモバクター(Achromobacter)プロテアーゼＩ（リシレンドペプチダーゼ：Wako ）を加え、３０℃、２４時間恒温保持した。消化後、サンプルを遠心し、上清を ウルトラフリー−ＭＣフィルター（ミリポアー、０．２２μｍ）に通した。ゲル 薄片をその後２回０．１％ＴＦＡ中で１時間洗浄し、洗浄液を回収して上記のよ うにフィルターを通した。全ての濾液を合わせ、スピードバック(Speed-vac)を 用いてＨＰＬＣへの注入に適した容量まで減少させた。消化物を、イオン交換予 備カラム（Brownlee GAX-013，3.2x15mm）とともにビダック(Vydac)Ｃ１８カラ ム（2.1x250mm，５μm，300Å)を用いて逆相ＨＰＬＣ（ヒューレットパッカード １０９０システム）によって分離した。アセトニトリル濃度を増加させてＣ−１ ８カラムからペプチドを溶出させ、２１４、２８０、２９５および５５０ｎｍの 吸収によってモニターした。精製ペプチドのアミノ酸配列決定は自動シークェン サー（Applied Biosystems model 470)でＰＴＨ−アミノ酸のオンラインＨＰＬ Ｃ（applied Biosystems model 1020A）分析を用いて実施した。 ＯＲＣサブユニットクローニング： ＯＲＣ１：ＯＲＣの最も大きい（１２０ｋｄ）サブユニットの遺伝子をクロー ニングするために、以下の縮退オリゴヌクレオチドプライマー１２０１および１ ２０２を最初のＯＲＣ１ペプチドの配列に基づき合成した。これらのオリゴは、 標的としてＷ３０３株由来の全酵母ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を実施する ために用いられた。４８塩基対フラグメントが特異的に増幅された。このフラグ メントをサブクローニングし、配列を決定した。得られた配列は予想されたペプ チドをコードし、それが正確な増幅生成物であることを示した。続いて、放射能 で標識したＰＣＲ生成物を用いて酵母ＤＮＡのゲノムライブラリーを調べ、２つ の一致するクローンが同定された。これらのクローンの配列決定によって、予想 分子量が１２０ｋｄの蛋白をコードし、さらにＯＲＣ１ペプチドの４つの配列全 てをコードする大きな開放読み枠が同定された。 ＯＲＣ３：ＯＲＣの６２ｋｄサブユニットの遺伝子をクローニングするために 、以下の縮退オリゴヌクレオチドプライマー６２１および６２４が、第三のペプ チドの配列に基づいて合成された。これらのオリゴは、標的としてＷ３０３株由 来の全酵母ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を実施するために用いられた。５３ 塩基対フラグメントが特異的に増幅された。このフラグメントをサブクローニン グして配列を決定した。得られた配列は予想されたペプチドをコードし、それが 正確な増幅生成物であることを示した。放射能標識ＰＣＲ生成物を用いて酵母Ｄ ＮＡのゲノムライブラリーを調べ、２つの一致するクローンが同定された。これ らのクローンの配列決定によって、予想分子量が７１ｋｄの蛋白をコードし、さ らにＯＲＣ３ペプチド配列の３つ全てをコードする大きな開放読み枠が同定され た。分子量の不一致は、おそらくこの蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ時の変則的な移動 のためであろう。 ＯＲＣ４：ジェンバンクデータベースの既知の可能な蛋白コード配列の配列と ＯＲＣ４ペプチドとの配列比較によって、ＯＲＣ４コード配列の一部は、隣接遺 伝子をクローニングする過程で以前にクローニングされたことが分かった。この データベースの情報を用いて、我々は完全な適合オリゴをデザインし、これを用 いて酵母のライブラリーを直ちにスクリーニングすることができた。同じ酵母の ゲノムＤＮＡライブラリーのプローブとしてこのオリゴを用いて、完全なＯＲＣ ４ 遺伝子を含むラムダクローンを分離した。この遺伝子は予想分子量が５６ｋｄ の蛋白をコードし、さらにまた５６ｋｄサブユニットのペプチド配列決定から得 られるペプチドの全てをコードした。 ＯＲＣ５：ＯＲＣの５３ｋｄサブユニットの遺伝子をクローニングするために 、以下の縮退オリゴヌクレオチドプライマー５３５および５３６を最初のＯＲＣ ５ペプチドの配列に基づいて合成した。これらのオリゴは、標的としてＷ３０３ 株由来の全酵母ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を実施するために用いられた。 ４７塩基対フラグメントが特異的に増幅された。このフラグメントをサブクロー ニングして配列を決定した。得られた配列は予想されたペプチドをコードし、そ れが正確な増幅生成物であることを示した。続いて、放射能標識ＰＣＲ生成物を 用いて酵母ＤＮＡのゲノムライブラリーを調べ、ただ１つのラムダクローンが同 定された。このクローンの配列決定によって、ＯＲＣの５３ｋｄサブユニットに 由来するペプチド配列のいくつかをコードする大きな開放読み枠が同定され、こ れが正確な遺伝子であることが示された。しかしながら、この遺伝子の５’末端 の配列はこのラムダクローンに存在しなかった。偶然、同じ遺伝子内のこの変異 はまた、ＯＲＣ２遺伝子の同定をもたらした同じスクリーンでピックアップされ た。この変異に対する補完的クローンはラムダクローンと一致し、この遺伝子の 完全な５’末端を含むことが分かった。この補完的ＤＮＡフラグメントの配列決 定によってＯＲＣ５遺伝子の完全な配列が決定された。 本明細書に引用された全ての文献および特許出願は参照により本明細書に含ま れる。前述の発明は理解を深めるために実施例と図解によって詳述されたが、当 業者には添付の請求の範囲を逸脱することなくある種の変更および修飾が為され えることは容易に理解されるところである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ (72)発明者 スティルマン ブルース ダブリュー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11724 コールド スプリング ハーバー カー ネギー アベニュー 21 (72)発明者 ベル スティーヴン ピー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11724 −0100 コールド スプリング ハーバー （番地なし） コールド スプリング ハーバー ラボラトリー内 (72)発明者 コバヤシ リュウジ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11724 −0100 コールド スプリング ハーバー （番地なし） コールド スプリング ハーバー ラボラトリー内 (72)発明者 ライン ジャスパー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94704 バークレイ パイン アベニュー 2948 (72)発明者 フォス マーギット アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27710 ダーラム （番地なし） デュー ク ユニヴァーシティ メディカル セン ター デパートメント オブ セル バイ オロギー内 (72)発明者 マックナリー フランシス ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94127 サンフランシスコ ヴァルデス アベニュー 365 (72)発明者 ローレンソン パトリシア アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94122 サンフランシスコ テンス アベ ニュー 1235 (72)発明者 ハースコウィッツ アイラ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94143 サンフランシスコ （番地なし) ユニバーシティ オブ カリフォルニア デパートメント オブ バイオケミスト リー アンド バイオフィジックス内 (72)発明者 リー ヨアキム ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94122 サンフランシスコ パーナサス アベニュー 18−700

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＯＲＣポリペプチドの生物学的に活性な固有部分をコードする分離した核酸 を含む組成物。 ２．前記ＯＲＣ遺伝子がＯＲＣ１である請求の範囲第１項の組成物。 ３．前記ＯＲＣ遺伝子がＯＲＣ２である請求の範囲第１項の組成物。 ４．前記ＯＲＣ遺伝子がＯＲＣ３である請求の範囲第１項の組成物。 ５．前記ＯＲＣ遺伝子がＯＲＣ４である請求の範囲第１項の組成物。 ６．前記ＯＲＣ遺伝子がＯＲＣ５である請求の範囲第１項の組成物。 ７．前記ＯＲＣ遺伝子がＯＲＣ６である請求の範囲第１項の組成物。 ８．遺伝子組換えＯＲＣ蛋白の生物学的に活性な固有部分を含む組成物。 ９．請求の範囲第８項の組成物と作用物質を接触させ、少なくとも定量的関係で 前記組成物に対する前記作用物質の結合親和性を測定する工程を含む、ＯＲＣ選 別作用物質の同定方法。 10．選別されるＤＮＡ配列と直接または間接的に連繋する蛋白をコードする遺伝 子を同定する方法であって、該方法が、 ハイブリッド蛋白の発現ライブラリーでレポーター株を形質転換させ、この とき、前記ライブラリーは構成要素として発現される転写活性ドメインに融合さ れた蛋白コード配列を含み、さらに、前記レポーター株は、そのプロモーター領 域に少なくとも１コピーの選別ＤＮＡ配列をもつレポーター遺伝子を含み； 前記レポーター株のクローン中に前記レポーター遺伝子の転写または翻訳生 成物を検出し； それによって前記クローンが、前記選別ＤＮＡ配列と直接または間接的に連 繋する蛋白をコードする遺伝子を含む工程を含む前記遺伝子の同定方法。