JPH11507538A

JPH11507538A - β−セクレターゼ、β−セクレターゼに対する抗体、及びβ−セクレターゼ阻害を検出するためのアッセイ

Info

Publication number: JPH11507538A
Application number: JP9502130A
Authority: JP
Inventors: エム．エス．クライスラー，スザンナ; シンハ，スカント; エス．ケイム，パメラ; ピー．アンダーソン，ジョン; エル．ヤコブソン−クローク，クリステン; タン，ヒューア; シー．マコンログ，リサ
Original assignee: アテナニューロサイエンシズインコーポレイティド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-06
Also published as: JP2006149394A; US5942400A; WO1996040885A3; AU6383396A; EP0871720A2; WO1996040885A2

Abstract

(57)【要約】 β−アミロイドペプチドのアミノ末端側上でβ−アミロイド前駆タンパク質(APP)を開裂することができる新規のプロテアーゼを含む組成物を供する。そのプロテアーゼはβ−セクレターゼと命名される。β−セクレターゼを含む反応システムは、APP のβ−セクレターゼ調節開裂をモニターするため及びβ−セクレターゼインヒビターを同定するためのスクリーニングアッセイに用いることができ、ここでβ−セクレターゼは適切なポリペプチド基質の存在下にあり、そしてその基質はテスト物質の存在及び欠如下で決定される。β−セクレターゼのペプチドに対して抗体が生ずる。医薬組成物及び方法は、スクリーニングアッセイにより同定された化合物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 β−セクレターゼ、β−セクレターゼに対する抗体、及びβ−セクレターゼ阻害を検出するためのアッセイ発明の背景１．発明の分野本発明は、広くは、β−アミロイドペプチドを生産するためのβ−アミロイド前駆体タンパク質の開裂に関する。更に詳しくは、本発明は、上記開裂の原因となる酵素（β−セクレターゼ）を含み、単離され、精製された組成物及びβ−セクレターゼのインヒビターを同定するためのアッセイに関する。アルツハイマー病は、アルツハイマー病患者の脳、特に記憶及び認識に関連する領域において存在する多数のアミロイド斑及び神経繊維のもつれ（高度に不溶性のタンパク質凝集体）の存在を特徴とする。β−アミロイドペプチドは、β− アミロイド前駆体タンパク質の開裂によって形成されるアミロイド斑の主要構成物である。β−アミロイド前駆タンパク質の通常の（非病原的な）プロセッシングは、そのタンパク質内のβ−アミロイドペプチド領域のアミノ酸16と17との間を開裂する推測上の“α−セクレターゼ(α−secretase)”による開裂によっておこることが現在確信されている。病原性のプロセッシングは、前駆タンパク質内のβ−アミロイドペプチド領域のアミノ末端において開裂する推定される“β −セクレターゼ(β−secretase)”によって部分的におこることが更に信じられている。しかしながら、これまで、β−セクレターゼの存在は確認されていない。特有の活性を有する新規の生物分子の同定、単離、及びキャラクタリゼーションは一般的に役立つ。例えば新規の酵素は、それらのクラスに関連するタイプの反応を触媒するのに用いることができる。特に、新規のプロテアーゼは、種々の目的のためにタンパク質を開裂するのに用いることができ、そしてその新しいプロテアーゼの有用性は特有の能力を供する、このような一般的な酵素に関連する使用に加えて、推定されるβ−セクレターゼの同定、単離及び精製は、アルツハイマー病の病理における重大な出来事の化学的モデリングを許容し、β−セクレターゼ活性を阻害するそれらの能力を測定するために化学物をスクリーニングすることを許容するであろう。これらの理由のために、β−アミロイドペプチド領域のアミノ末端におけるβ −アミロイド前駆タンパク質の病原的開裂の原因となる酵素を単離、精製、及びキャラクタライズすることが要求されよう。特に、試験管内システムにおてβ− セクレターゼの活性を阻害する能力について候補の薬剤をスクリーニングするための方法において（以後、β−セクレターゼと言及される）上述の酵素を利用することが要求されよう。特に、自動化された様式で多数のテスト薬剤をスクリーニングすることを許容する迅速な形態でこのようなスクリーニングアッセイを行うことができることが要求されよう。２．背景技術の記載 β−アミロイド前駆タンパク質(APP)は、695，751及び770 アミノ酸の３つの異なるスプライシングされた形態で発現され“通常の”プロセッシングはβ−アミロイドペプチドにおける残基Lys¹⁶とLeu¹⁷との間の部位でのタンパク質分解による開裂に関連する（Kangら(1987)Nature 325: 773-776）。推定されるβ−セクレターゼ部位で開裂されている可溶性のβ−アミロイドペプチドは、病気でない細胞の培養培地(Haass ら(1992)Nature 359; 322〜325)並びに健康なヒト及び動物からのCSF(Seubertら(1992)Nature 359: 325〜327)においても見い出されている。推定されるβ−セクレターゼの存在可能性は、例えばSe lkoe(“Cell Biology of the Amyloid β-Protein and the Mechanism of Alzhe imer's Disease,”Annual Review of Cell Biology)、Spudich ら(eds.，Annual Review，Inc.，Polo Alto，California，Vol.10，1994)において議論される。A PP のスウェーデンの(Swedish)変異もSelkoe（前掲）に議論されている。Eschら（1994）Science 248: 1122 も参照のこと。発明の概要本発明は、以後“β−セクレターゼ活性”と呼ばれるβ−アミロイド前駆タンパク質(APP)内のβ−アミロイドペプチド（βAP）のアミノ末端においてAPPを開裂する単離され、精製された酵素を含む新規のβ−セクレターゼ組成物を提供する。本発明の組成物は、一般に、可溶化されているが豊富でないヒト293 細胞からの膜画分のそれより少くとも５倍大きいβ−セクレターゼ活性を有し、好ましくはその膜画分のそれより少くとも10倍大きく、より好ましくはその膜画分のそれより少くとも100 倍大きい。β−セクレターゼ酵素は、（１）ゲル排除クロマトグラフィーにより測定して260KD 〜300 KDの範囲の見掛け分子量（２）電気泳動により測定して60KD〜148 KDの範囲のより正確な見掛け分子量、（３）pH５における実効負電荷及びpH7.5 における実効負電荷、並びに（４）コムギ胚芽アグルチニンへの結合を特徴とする。本発明の組成物は、一般に、タンパク質分解化学品として役立ち、特に新規の β−セクレターゼから生ずるAPP のタンパク質分解性開裂を検出すること及びこのような開裂をテスト物質が阻害するであろうか否かを決定するためのアッセイにおいて役立つ。その方法に、β−セクレターゼが開裂を阻害するテスト物質の欠如下でポリペプチドをアミノ末端フラグメント及びカルボキシ末端フラグメントに開裂するであろうと予想されるような条件下で、テスト物質の存在下で、（APP 内のβAP領域のアミノ末端に位置した）APP のβ−セクレターゼ部位を含みポリペプチドを少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼに露出することを含む。次に、このような開裂を阻害するテスト物質は、テスト物質がβ−セクレターゼ阻害活性を有することを同定するためにアッセイシステムに導入され又は露出され得る。このようなテスト方法は、好ましくは、上述のβ−セクレターゼ組成物を用いる。例えばアミノ末端フラグメントのカルボキシ末端又はカルボキシ末端フラグメントのアミノ末端に特異的な抗体により、APP 由来のポリペプチドのフラグメントの発生が検出される。β−セクレターゼのためのポリペプチド基質は、結合するエピトープを有するアミノ末端部分を含む融合ポリペプチドを含み得る。このような融合ポリペプチドのβ−セクレターゼ基質としての使用は、アミノ末端部分の捕獲による開裂の検出及びアミノ末端部分のラベリングを容易にする。本組成物は、配列番号：５、配列番号：６、及び配列番号：７のいずれか１つ又は組合せのような、β−セクレターゼの免疫原性ペプチドに対して生ずる抗体と反応する、βAP開裂部位においてAPP を開裂する酵素の闘値レベル、典型的には少くとも10重量％を更に含むであろう。本発明は、β−セクレターゼタンパク質に特異的に結合する抗体及び抗体組成物を更に提供するであろう。その抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得、そして上述の免疫原性β−セクレターゼ組成物のいずれかで適切なホストを免疫にすることによって調製され得る。その抗体に更に、組換えにより調製され得、ヒトに適応させられ得、又はさもなければ抗体生産のための慣用的方法に従って改良されもしくは生産され得る。本発明は、β−アミロイド前駆タンパク質(APP)又はその合成もしくは組み換えアナログのようなポリペプチド基質のβ−セクレターゼ開裂を検出するための方法及びアッセイを更に提供する。本方法に、開始の量中に存在するβ−セクレターゼ及びポリペプチド基質を含む反応システムを利用する。その反応システムは、β−セクレターゼがポリペプチド基質が開裂産物に開裂するのを許容する条件下に維持される。β−セクレターゼ開裂反応は、開裂産物の量が反応が進むにつれて増加するであろうβ−セクレターゼ開裂産物の少くとも１つの量を検出することによりモニターされる。このような方法は、特にβ−セクレターゼ活性を阻害する能力についてテスト化合物をスクリーニングするために役立つ。テスト化合物は反応システムに導入され、そしてテスト化合物がβ−セクレターゼ活性を阻害する能力は、通常、その反応システム内でのβ−セクレターゼが媒介スル開裂がテスト化合物の欠如下で観察され、測定される対照と比較して、生成された開裂産物の量を減少させる能力に基づいて決定される。その反応システムは、別個の源から得られたβ−セクレターゼ及びポリペプチド基質を含み得る。例えば、β−セクレターゼは、天然のソースから精製され、又は以後詳細に議論されるように、合成により又は組換えにより作られ得る。これらの場合、そのポリペプチド基質は全長のAPP であり得るが、より通常に、AP P 内にβ−セクレターゼ開裂部位を含むより短いポリペプチドであろう。より短いポリペプチドは、ラベル、結合成分、又は種々のアッセイプロトコルにおいて検出を容易にする他の構成物で作ることができる。他のアッセイ形態において、β−セクレターゼ及びポリペプチド基質の両方が、単一細胞源、例えば脳細胞からの細胞膜又は他の適切なソースから得られるだろう。細胞のソースは、APP の開裂産物への転化が長時間にわたって観察され得る適切な反応培地内に、β−セクレターゼ及び（全長のAPP であろう）ポリペプチド基質の両方を放出するよう処理されよう。テスト化合物は反応システムに導入され得、そして特定のテスト化合物がβ−セクレターゼ活性を阻害する能力は本明細書の他の場所に一般に記載されるように決定され得る。本発明は、細胞内のβ−アミロイド前駆タンパク質(APP)の開裂を阻害するための方法を更に含む。このような方法は、β−セクレターゼ活性を少くとも部分的に阻害するのに有効な量の化合物を、細胞に投与することを含む。通常、このような化合物は、上述のスクリーニング法によって選択されよう。本発明は、哺乳動物ホスト内でβ−アミロイド前駆タンパク質の開裂を阻害するための方法を更に提供する。このような方法は、ホストの細胞内、通常、ホストの脳細胞内でβ−セクレターゼ活性を阻害するのに有効な量の化合物をホストに投与することを含む。このような化合物は、通常、上述のスクリーニングアッセイによって選択されよう。このような方法は、アルツハイマー病、ダウン症候群等のようなβ−アミロイドペプチド分解に関連する条件を治療するために役立つであろう。図面の簡単な記載図１は、実験セクションに記載されるような非還元条件下での、ペプチドSeek −１（配列番号：５）、Seek−２（配列番号：６）、及びSeek−３（配列番号：７）に対して生ずる抗体の反応性を示すウエスタンブロットである。図２は、タンパク質サンプルが電気泳動前に還元されたことを除き、図８と同じウエスタンブロットである。図３は、還元及び非還元条件下で図８及び９の抗体を用いるβ−セクレターゼの免疫沈降を比較するチャートである。図４は、マルトース結合タンパク質(MBP)由来の結合エピトープを有する本発明のスクリーニングアッセイを行うことにおいて基質として役立つAPP 含有融合ペプチドの概略図である。βAPのアミノ末端においてAPP の125 アミノ酸部分(A PP Ｃ−125)を開裂スルβ−セクレターゼに、融合ポリペプチドを露出することにより、アッセイを作った。次にMBP 部分は捕獲され得、そしてβ−セクレターゼでの開裂によって露出したAPP フラグメントのカルボキシ末端は該末端に特異的な192 抗体で同定され得る。APP のSwedish 変異のカルボキシ末端を認識するレポーターに結合したSW-192抗体が利用される。図５は、βAP（A β）後に端を切り取られたAPP の組換え発現された形態でなるAPP 638 を示す。APP 638 は、βAPペプチドが開裂され、そしてAPP 638 のアミノ末端フラグメントのカルボキシ末端がウエスタンブロット又はELISA アッセイのいずれかによって192 抗体により認識されるβ−セクレターゼアッセイに用いることができる。カルボキシ末端のβAPフラグメントは、3D6/266 アッセイを用いても測定することができる。図６は、後の実験セクションにおいて利用されるマルトース結合タンパク質及びAPP フラグメントの融合ポリペプチドのSwedish 変異の完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号：１及び配列番号：17）。図７に、後の実験セクションに許容されるβ−セクレターゼELISA について形成された標準曲線である。図８は、β−セクレターゼアッセイについての標準曲線である。図９は、図８の曲線を用いるβ−セクレターゼアッセイ結果を示す。図10Ａ，10Ｂ，10Ｃ，10Ｄ及び10Ｅは、５つのβ−セクレターゼ基質ペプチドのHPLC分析である。ラベルは、示されるペプチド、例えば“Leu/Asp Ｃ−Term” は、Leu とAsp との間の開裂のＣ末端フラグメントをいう。図10Ｃ−Ｅにおいて、上記の跡は下部の跡と同じであるが、拡大されたものである。図11Ａ，11Ｂ，及び11Ｃは、ペプチド開裂及びELISA アッセイの両方によって測定されたGEC 画分のβ−セクレターゼ活性の要約である。図12は、２つのテスト化合物（コンゴーレッド及び不活性化合物）を用いるβ −セクレターゼ阻害アッセイの結果を示す。図13は、細胞膜アッセイ形態におけえる−セクレターゼ開裂産物の検出を示すオートラジオグラムである。図14は、長期にわたる成熟及び未成熟APP のβ−セクレターゼ開裂の程度を示すグラフである。図15は、より長い時間にわたる成熟及び未成熟APP のβ−セクレターゼ開裂の程度を示すチャートである。図16は、細胞膜アッセイにおけるAPP のβ−セクレターゼ開裂の推定されるβ −セクレターゼインヒヒビターの効果を示す。図17は、後の実験セクションに記載されるような、本発明の阻害アッセイによってテストされる化合物の構造式である。好ましい実施形態の記載本発明は、その中でβ−アミロイドペプチド（βAP）のアミノ末端においてβ −アミロイド前駆タンパク質(APP)を特異的に開裂する新規のプロテアーゼを提供する。このプロテアーゼに、アルツハイマー病、ダウン症候群、及びHCHWA-D 等のようなβAP関連の病状においてβAPを生産するためのAPP の病原性プロセッシングの原因とも推定されるβ−セクレターゼであると確信される。これにより、本発明の新規のプロテアーゼは、以後、“β−セクレターゼ”と言及されよう。本発明のβ−セクレターゼは、プロテアーゼが一般に用いられ得る試験管内及び生体内システムにおいてプロテアーゼとして役立つであろう。例えば、β−セクレターゼは、基質としてそのタンパク質をキャラクタライズし、処理し、修飾し、又はそれと反応するために、タンパク質を開裂する又はその開裂を試みるのに用いることができる。更に、本発明のβ−セクレターゼは、β−セクレターゼインヒビター、即ちβ−セクレターゼの存在下でAPP のタンパク質分解性開裂を阻害することができるテスト化合物を同定するスクリーニングアッセイの能力において特定の利用性を有するであろう。このようなアッセイは、以下に詳細に記載されよう。β−セクレターゼ組成物及びスクリーニングアッセイ法に加えて、本発明は、β−セクレターゼの少くとも一部をコードし、β−セクレターゼの発現及びβ−セクレターゼ遺伝子の検出等を含む種々の目的のために役立つ組換え核酸分子を更に提供するであろう。本発明は、通常β −セクレターゼ遺伝子の全て又は一部の発現により組み換え産生されたβ−セクレターゼ分子及び組成物を更に提供するであろう。本発明は、スクリーニング及び他のアッセイに役立つネイティブβ−セクレターゼ上のエピトープに対する抗体を更に提供するであろう。Ｉ．定義他に示さなければ、本明細書に用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様又はそれと等しいいずれかの方法及び材料を本発明の実施又はテストに用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。本発明の目的のために、以下の用語に次のように定義される。本明細書に用いる場合、“β−アミロイド前駆タンパク質”(APP)とは、ヒトにおいて染色体21の長いアーム上に位置した同じ前の遺伝子によりコードされ、そのカルボキシル末端内に（後に定義される）βAP領域を含むポリペプチドをいう。APP は、多くの哺乳動物組織において広範囲の種々の細胞において発現されるグリコシル化単一膜貫通タンパク質である。ヒトに存在することが現在知られえているAPP の特定のイソタイプの例は、Kangら(1989)(Nature 325: 733 〜736 )により記載される695 アミノ酸ポリペプチドである。751 アミノ酸ポリペプチドは、Ponte ら(1988)(Nature 331: 525 〜527)及びTanzi ら(1988)(Nature 331 : 528 〜530)によって記載されている。APP の770 −アミノ酸イソタイプは、Ki taguchi ら(1988)(Nature 331: 530 〜532)において記載される。APP のいくつかの特定の変異体は、位置及び表現型の両方において異なり得る点変異を有するものとしても記載されている。このような変異の一般的な報告は、Hardy(1992)( Nature Gehet，1: 233 〜234)に供される。特に関心の変異は、695 形態の位置5 95 及び596 における通常のLys-Met 残基がAsn-Leu によって置換されている“ スウェーディッシュ(Swedish)”変異である。この変異は、695 形態の残基596 と597 との間でおこるAPP の通常のβ−セクレターゼ開裂部位の直接上流に位置する。本明細書に用いる場合、“β−アミロイドペプチド（βAP）とは、APP の695 アミノ酸イソタイプの残基597 〜640 を含む共通の43アミノ酸形態を伴う。28〜 43アミノ酸の長さを有するペプチドのファミリーをいう。βAPはその領域のアミノ末端及びカルボキシ末端の両方における開裂を含むAPP のプロセッシングによって作られる。本発明のβ−セクレターゼはヒト細胞におけるAPP の通常の及び病原性のプロセッシングにおけるβAPのアミノ末端におけるAPP の開裂の原因となる。本明細書に用いる場合、“β−アミロイドペプチド開裂位置においてβ−アミロイド前駆タンパク質(APP)を特異的に開裂する”とは、β−セクレターゼが、単一位置のみ、及び695 イソタイプのアミノ酸596 と597 との間の部位においてのみ、APP を開裂することを意味する。酵素が上述の特異性を有するか否かを決定するためのテストは、精製されたβ−セクレターゼ及び組換え融合ペプチド基質を利用するβ−セクレターゼインヒビターアッセイという題のよに、後の実験セクションにおいて記載される。β−セクレターゼに、β−開裂部位においてのみでMBP-C125SW基質を開裂し、他の位置では開裂しないであろう。 “ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基のポリマーとして言及されるように本明細書で交換可能に用いられる。その用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的アノログであるアミノ酸ポリマーに、及び天然のアミノ酸ポリマーに適用される。“組換えタンパク質”及び“組換えβ−セクレターゼ”という用語は、組換え DNA 分子からのタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現により産生されるタンパク質をいう。用語“単離された”、“精製された”又は“生物学的に純粋な”とは、そのネイティブ状態において見い出される時に通常それに付随する構成物から少くとも部分的に分離されそしてしばしばそれを実質的又は本質的に含まない材料をいう。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する支配的なタンパク質又は核酸種であるタンパク質又は核酸分子が実質的に精製される。一般に、単離されたタンパク質又は核酸分子は、その調製物中に存在する全ての高分子種の 80％超を含むであろう。好ましくは、そのタンパク質は、存在する全ての高分子種の90％超を示すように精製される。より好ましくは、タンパク質は、95％超に精製され、そして最も好ましくは、タンパク質は、他の高分子種が慣用的技術によって検出されない本質的に均一に精製される。用語“抗体”とは、被検体（抗原）にと特異的に結合し、それを認識するイムノグロブリンに遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされたポリペプチドをいう。その認識されたイムノグロブリン遺伝子は、κ（カッパ）、λ（ラムダ）、α（アルファ）、γ（ガンマ）、Δ（デルタ）、ε（イプシロン）及びμ（ミュー）定常領域遺伝子、並びに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。抗体は、完全なイムノグロブリンとして、又は種々のペプチダーゼでの消化によるいくつかの十分にキヤラクタライズされたフラグメント産物として存在する。これは、例えばFab′及びF(ab)′₂フラグメントを含む。本明細書に用いる場合、用語“抗体”には、完全な抗体の修飾によって作られた抗体フラグメント又は組換えDNA 法を用いて新たに合成されたもののいずれも含み、そして新しい慣用的技術によって作られた“ヒトに適応された”抗体を更に含む。用語“イムノアッセイ”は、被検体に特異的に結合するために抗体を利用するアッセイである。イムノアッセイは、被検体を単離、標的づけ、及び／又は定量するために特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。 “ラベル（標識）”は、分光光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出することができる組成物である。例えば、有用なラベルは、³²P 蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えばELISA で一般に用いられるもの）、ビオチン、ジオキシゲニン、又はハプテンを含み、そして抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるタンパク質は、例えばそのペプチドに放射能標識を組込むことにより、検出することができ、そのペプチドに特異的に反応する抗体を検出するのに用いられ得る。ラベルは、しばしば、結合したラベルの量を定量するのに用いることができる放射能、蛍光又は酵素活性のような測定可能なシグナルを発生させる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、比較窓にわたって最大の一致となるようアラインした時に２つの配列が同じであるなら、引用配列と“同一”である。比較窓をアラインするためのヌクレオチド及びアミノ酸配列の最適なアラインメントは、Smith 及びWaterman(1981)(Adv．Appl．Math.，2: 482)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman 及びWunsch(1970)(J．Mol．Bio.，48: 443)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson 及びLipman(1988)(Proc．N atl．Acad．Sci．U.S.A．85: 2444)の類似性法についてのサーチにより、これらのアルゴリズムをコンピューターで行うこと（Wisconsin Genetics Software Pa ckage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI におけるGAP，BESFIT，FASTA、及びTFASTA）により、又は視察によって行うことができる。最良のアラインメント（即ち比較窓にわたり、即ち150 又は200 アミノ酸にわたり、相同性の最も高い割合を生ずるもの）は、選択された種々の方法によって生ずる。配列同一性の割合は、比較の窓にわたって２つの最適にアラインされた配列を比較し、両方の配列において同一のアミノ酸が生ずる位置の数を決定して適合した位置の数を算出し、その比較の窓内の位置の総数（即ち窓のサイズ）で適合した位置の数を割り、そしてその結果に100 をかけて配列同一性の割合（％）を算出することによって計算される。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が比較窓にわたって、引用配列と少くとも80％の配列同一性、少くとも85％の配列同一性、少くとも90％の配列同一性、少くとも95％の配列同一性、又は少くとも99％の配列同一性を有するなら、その引用配列と“実質的に同一”又は“実質的に類似”する。互いに同一である２つの配列ももちろん実質的に同一である。２つのペプチドが実質的に同一であるアミノ酸配列を有することは、１つのペプチドが第２のペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に反応することを示す。これにより、ポリペプチドに、例えば２つのポリペプチドが保存性の置換によってのみ異なる場合、実質的に同一である。２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であることは、第１のヌクレオチド配列がコードするコポリペプチドが第２のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することを示す。他に、２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であることに、２つの核酸分子がストリンジエント条件下で互いにハイブリダイズすることを示す。ストリンジエント条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。一般に、ストリンジエント条件は、規定されたイオン強度及びpHにおいて特定の配列についての熱融点（Tm）より約５℃〜20℃低いように選択される。Tmは標的配列の50％が完全に適合したプローブとハイブリダイズする（規定したイオン強度及びpH下の）温度である。抗体が、タンパク質の異種集団及び他の生物物質の存在下でタンパク質の存在を決定する結合反応において機能する場合、抗体は、タンパク質に“特異的に結合”し又は“特異的に免疫反応”する。これにより、デザインされた免疫反応条件下において、特定の抗体に優先的に特定のタンパク質に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には大量に結合しない。このような条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質についての特異性について選択された抗体を要求する。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために種々のイムノアッセイ形態を用いることができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために、固相ELISA イムノアッセイが慣用的に用いられる。特定の免疫反応性を決定するのに用いることができるイムノアッセイ形態及び条件の記載については、Harl ow及びLane(1988)(Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pub lications，New York)を参照のこと。本明細書に用いる場合“テスト化合物”は、いずれかの物質、分子、化合物、分子もしくは化合物の混合物、又は生体内もしくは試験管内でβ−セクレターゼが活性を阻害することができると推測されるいずれかの他の組成物であり得る。そのテスト化合物は、高分子、例えば生物学的ポリマー、例えばタンパク質、ポリサッカリド、又は核酸等であり得る。より通常は、テスト化合物は、約２KD未満、より通常は1.5 KD未満、頻繁に１KD未満、そして通常は100 〜1,000 Ｄの範囲、更により通常に200 Ｄ〜750 Ｄの範囲の分子量を有する小さな分子であろう。このようなテスト化合物は、種々の基準に基づいて予め選択され得る。例えば、適切なテスト化合物は、周知のタンパク質分解阻害活性を有するように選択され得る。あるいは、テスト化合物はランダムに選択され、本発明のスクリーニング法によってテストされ得る。このようなテスト化合物に、典型的には、約１nM 〜１mM、通常約１μM 〜１mMの反応の濃度で（以下に議論される）反応システムに投与されよう。APP のβ−セクレターゼ開裂を阻害することができるテスト化合物は、細胞及び／又は動物内でβAP産生を減少させるそれらの能力の更なるスクリーニングのための候補として考えられる。 II．β−セクレターゼ β−セクレターゼは、後の実験セクションに詳説されるように、いくつかの点においてキャラクタライズされている。β−セクレターゼは、0.2 ％水素化合物 Triton X-100におけるゲル排除クロマトグラフィーによって決定された260 KD〜 300 KDの範囲の見掛け分子量を有する。60KD〜148 KDの範囲のより正確な分子量は、電気泳動によって決定されている。β−セクレターゼは、コムギ胚芽アグルチニンに結合するが、コンカナバリンＡには結合しないであろう。それは、（陽イオン交換材料に結合しない場合）pH５の実効負電荷及び（陰イオン交換材料に結合する場合に）pH7.5 の実効負電荷を有することが見い出されている。本発明のβ−セクレターゼに、βAPフラグメントのすぐアミノ末端側上の推定されるβ −セクレターゼ開裂部位においてAPP の野生型（通常）及びSwedish 変異の両方を開裂するであろう。そしてそれは、APP のSwedish 形態に関してより高いタンパク質分解活性を有することが見い出されている。タンパク質分解活性は、５〜 5.5 のpHでそのピークがあり、pH7.5 以上で極めて低い活性であるようである。 β−セクレターゼは、多くの周知のプロテアーゼインヒビターに対して耐性である（後の実験セクションにおける表３を参照のこと）。β−セクレターは、APP の（野生型、Swedish、又は他の変異形態のいずれかからの）開裂部位から上流及び下流の実質的にいくつかの残基を保持するポリペプチド基質のみを好ましくは認識するようである。後の実験セクションで証明されるように、β−セクレターゼ開裂部位から上流のほんの５残基及び下流のほんの５残基を含むペプチドが開裂されるであろうが、その開裂部位のいずれかの側上により長い領域を含むペプチドの開裂のそれより長いインキュベーション時間及びより高い酵素レベルを要求するであろう。本発明のβ−セクレターゼは、単離され及び精製された形態で供されよう。“ 単離され及び精製され”とは、（１）β−セクレターゼが、（以下の実験セクションにおいて詳説されるような）ヒト脳組織又はヒト293 細胞のような天然のソースから単離され、少くとも部分的に精製されていることを意味する。β−セクレターゼは、周知のタンパク質精製技術を用いて細胞のソースから得ることができる。汚染するタンパク質は、特定の技術、例えばアガロース結合スクシニル化コムギ胚芽アグルチニン（SWGA）及びアガロース結合ヒラユメ（lentil）レクチン(LCA)での連続的レクチンクロマトグラフィーによってβ−セクレターゼ組成物から除去され得る。これらのレクチンは、部分的にβ−セクレターゼ結合活性を有するが、精製された画分中の他の汚染タンパク質に優先的に結合し、これによりβ−セクレターゼ活性の豊富に増加させる。β−セクレターゼは、結果として生ずる組成物中のβ−セクレターゼ活性を役立つレベルまで増加させるのに十分な程度まで単離され、精製されよう。特に、本発明のβ−セクレターゼ調製物は、以下の実験セクションに記載されるAPP 及びAPP 含有ポリペプチドを開裂するのに十分な活性を有するだろう。好ましくは、本発明のβ−セクレターゼ組成物は、ヒト293 細胞からの可溶化されているが豊富でない膜画分のそれより少くとも10倍大きい活性を有するだろう。より好ましくは、本組成物は、ヒト293 細胞からの可溶化された膜画分のそれより少くとも約100 倍大きいβ−セクレターゼ活性を有するだろう。“ngm^-1h ^-1”の単位のβ−セクレターゼ活性を決定するための特定の方法は、以下の実験セクションに詳細に記載される（表１の脚注を参照のこと）。本発明は、β−セクレターゼタンパク質アナログも提供する。本明細書に用いる場合、用語“β−セクレターゼタンパク質アナログ”とは、天然のβ−セクレターゼの配列からの少くとも10アミノ酸、少くとも15アミノ酸、少くとも20アミノ酸又は少くとも25アミノ酸の隣接配列フラグメントを含む非天然のポリペプチドをいう。一実施形態において、β−セクレターゼタンパク質アナログは、免疫原として供される場合、ネイティブβ−セクレターゼタンパク質に特異的に結合する抗体の生産を誘導する。β−セクレターゼタンパク質アナログは必要に応じて単離された形態である。本発明は、β−アミロイドペプチド開裂位置、即ちβ−アミロイドペプチドのアミノ末端に隣接した位置において、β−アミロイド前駆タンパク質を開裂する活性β−セクレターゼタンパク質を提供する。これらのアナログは、好ましくは上述の最少の活性を有するだろう。活性β−セクレターゼタンパク質アナログは、そのアミノ酸がアミノ酸置換、付加又は欠失（例えば活性フラグメント）を含むことによりネイティブβ−セクレターゼのそれから異なるβ−セクレターゼタンパク質アナログを含む。活性フラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかからそのタンパク質をタンパク質分解で縮小し又は内部配列を削除してフラグメントを形成し、そして活性についてその結果生じたフラグメントをテストすることにより、経験的に同定することができる。付加を有する活性β−セクレターゼタンパク質アナログは、他の活性フラグメントのアミノ又はカルボキシ末端へのアミノ酸伸長を有するもの、及びそのタンパク質内部に作られた付加を有するものを含む。オリゴペプチドであるタンパク質アナログは、公知の方法を用いて化学合成によって調製することができる。しかしながら、オリゴペプチド並びにより大きい β−セクレターゼタンパク質及びタンパク質アナログの両方は、好ましくは組換えにより調製される。本発明のβ−セクレターゼポリペプチドは、リン酸化、ホスホン化、ビオチン化又は他の成分の付加のような周知の技術によって化学的に修飾されているアミノ酸残基も有し得る。特定の実施形態において、その修飾は、標識試薬、精製標的、又はアフィニティーリガンド標的づけ等のために役立つだろう。 III．抗体及びハイブリドーマ本発明のβ−セクレターゼポリペプチドは、免疫原としてのβ−セクレターゼポリペプチドと共に慣用的技術を用いて、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を調製するのに用いることができる。必要に応じて担体分子に結合された、完全なβ−セクレターゼ分子、又はそのフラグメントは、小さな脊椎動物に注入することができ、ここでモノクローナル抗体は以下に詳説されるように、公知の方法によって作られる。β−セクレターゼから作られた抗体は、生物の及び他の試料中のβ−セクレターゼを検出するために慣用的なイムノアッセイを行うために役立つであろう。本発明による抗体は、少くとも10⁶μ^-1，10⁷μ^-1，10⁸ μ^-1又は10⁹μ^-1のアフィニティーでβ−セクレターゼに結合するであろう。 β−セクレターゼポリペプチドに特異的に結合する抗体を形成するために、いくつかの免疫原を用いることができる。長さ10アミノ酸又はそれ超の組換え又は合成ポリペプチドが、モノクローナル又はポリクローナル抗体の生産のための好ましいポリペプチド免疫原である。典型的なペプチドは、配列番号：５，６及び７を含む。好ましい実施形態の一クラスにおいて、免疫原として免疫源性ペプチドマンジュケントも含まれる。天然のポリペプチドも、純粋な又は純粋でない形態のいずれかで用いることもできる。組換えポリペプチドは、真核又は原核細胞において発現され、普通の技術を用いて精製される。次にポリペプチド又はその合成型は、抗体を生産することができる動物内に注入される。後にそのポリペプチドの存在及び量を測定するためにイムノアッセイに用いるためにモノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかを作ることができる。ポリクローナル抗体を生産する方法は当業者に周知である。要約すると、免疫原、好ましくは精製されたポリペプチド、適切な担体（例えば、GST、キーホールリンペット（keyhole limpet）ヘマノシマニン等）に結合したポリペプチド又は組換えワクシニアウイルスのような免疫化ベクターに組み込まれたポリペプチド（米国特許第4,722,848 号）をアジュバントと混合し、その混合物で動物を免疫化する。その免疫調製物に対する動物の免疫応答は、テスト血液をとり、関心のポリペプチドに対する反応性のタイターを測定することによってモンターされる。免疫原に対する抗体の適当に高いタイターが得られる場合、血液は動物から収集され、抗血清が調製される。ポリペプチドに反応する抗体について豊富にするための抗血清の更なる分画が必要に応じて行われる。例えばColigan（1991）C urrent Protocols in Immunology Wileyl Greene NY;並びにHar low 及びLane（ 1989）Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NYを参照のこと。 β−セクレターゼの予め決められたフラグメントに対する結合フラグメント及びその一本鎖組換え型を含む抗体は、例えば上述の担体タンパク質と共にそのフラグメントのコンジュゲートで、動物を免疫化することによって生ずる。典型的には、関心の免疫原は、少くとも３アミノ酸であり、より典型的にはそのペプチドに５アミノ酸の長さであり、好ましくはそのフラグメントは10アミノ酸の長さであり、そしてより好ましくはそのフラグメントは15アミノ酸又はそれ超の長さである。そのペプチドに、（例えば融合タンパク質のような）担体タンパク質に結合され得、又は免疫化ベクター内で組み換え発現される。抗体が結合するペプチド上の抗原決定基は典型的には３〜10 アミノ酸の長さである。モノクローナル抗体は、要求される抗体を分泌する細胞から調製され得る。特定の例において、特定の哺乳動物ホスト、例えばマウス、げつ歯動物、霊長類、ヒト等からモノクローナル抗体を調製することが要求される。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら(eds.)(Basic a nd Clinical Immunology（4th ed.）Lange Medical Publications，Los Altos， CA)及び本明細書に言及される文献；Harlow及びLane、前掲；Goding(1986)(Mono clonal Antibodies: Principles and Practice（2d ed.）Academic Press，New York，NY);並びにKohler及びMilstein(1975)(Nature 256: 495-497)、にある。要約すると、この方法は、免疫原を動物に注入することによって行われる。次に動物を殺して、その脾臓から細胞をとり、それをミエローマ細胞と融合する。その結果、試験管内で再生することができるハイブリッド細胞は“ミエローマ”となる。次にハイブリドーマの集団をスクリーニングして、その各々が免疫原に対して単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。この方法において、得られた個々の抗体種は、免疫原物質上で認識される特定の部位に応答して発生する免疫動物からの免疫化され、クローン化された単一のＢ細胞の産物である。他の不朽化の方法は、エプスタイン・バールウイルス、オンコジーン、もしくはレトロウイルス、又は当該技術で周知である他の方法での形質転換を含む。単一の不朽化された細胞から生じたコロニーは、抗原のための要求される特異性及びアフィニティーの抗体の生産のためにスクリーニングされ、このような細胞によって産生されたモノクローナル抗体は、種々の技術、例えば脊椎動物（好ましくは哺乳動物）ホストの腹膜腔内への注入によって増強される。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾のあるもの又はないものであり、ヒトに適応されたネズミ抗体のようなキメラ抗体を含む。他の適切な技術は、ファージ又は同様のベクター内の組換え抗体のライブラリーの選択に関する。Huseら(1989)(Science 246: 1275 〜1281);及びWardら(1989 )(Nature 341; 544〜596)を参照のこと。頻繁に、ポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを供する物質に共有結合又は非共有結合で結合することにより標識されよう。広範囲の種々のラベル及びコンジェゲーション技術が知られており、科学及び特許文献での両方で広く報告されている。適切なラベルは、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光成分、化学発光成分、及び磁気粒子等を含む。このようなラベルの使用を教授する特許は、米国特許第3,817,837; 3,850,752; 3,939,35 0; 3,996,345; 4,277,437; 4,272,149; 及び4,366,241 を含む。また、組換えイムノグロブリンが生産され得る。Cabilly,米国特許第4,816,569 号；及びQueen ら（1989）Proc．Natl'l Acad．Sci．USA 86: 10029 〜10033 を参照のこと。本発明の抗体は、β−セクレターゼタンパク質を単離することにおいてアフィニティークロマトグラフィーのためにも用いられる。カラムは、例えば団体支持体、例えば粒子、例えばアガロース又はSephade X 等に結合した抗体で調製され、細胞ライゼートがカラムを通過する場合に、弱い変性剤の増加濃度で洗浄、処理され、それにより精製されたβ−セクレターゼポリペプチドが遊離される。抗体は、発現遊離物、特に哺乳動物β−セクレターゼのような発現産物をスクリーニングするのに用いることができる。通常、このような手順における抗体は、抗体結合により抗原の存在の容易な検出を許容する成分で標識される。 β−セクレターゼに対して生じた抗体は、抗イディオタイプ抗体を生じさせるのにも用いることができる。これらは、各々の抗原の存在に関する種々の病理的条件を検出又は診断するのに役立つ。他の試みは、組換えDNA 技術により非ヒト抗体のCDR 領域をヒト定常領域に結合させることによるヒトに適応したイムノグロブリンの形成である。Queen ら（ Proc．Natl Acad．Sci．USA 86: 10029-10033(1989)及びWO90/07861を参照のこと。ヒトに適応したイムノグロブリンは、（アクセプターイムノグロブリンと呼ばれる）実質的にヒトイムノグロブリンからの可変領域骨格及び（ドナーイムノグロブリンとして言及される）実質的にユウスイムノグロブリンからの相補性決定領域を有する。定常領域は、存在するなら、実質的にヒトイムノグログリンからのものでもある。ヒト可変ドメインは、通常、その骨格配列がCDR がそれから得られるネズミ可変領域ドメインと高い程度の配列同一性を示すヒト抗体から選択される。重鎖及び軽鎖可変領域骨格残基は、同じ又は異なるヒト抗体配列から得ることができる。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列であり得るが、又はいくつかのヒト抗体の共通配列であり得る。Carterら（WO92/22653）を参照のこと。ヒト可変領域骨格残基からの特定のアミノ酸は、CDR コンホメーション及び／又は抗原への結合へのそれらの可能性ある影響に基づく置換について選択される。このような影響の可能性の研究は、モデリング、特定位置でのアミノ酸の特徴の検査、又は特定のアミノ酸の置換又は変異誘発の効果の経験的観察による。例えば、ネズミ可変領域骨格残基及び選択されたヒト可変領域骨格残基間でアミノ酸が異なる場合、アミノ酸が、（１）直接に、抗原に非共有結合で結合し、（２）CDR 領域に隣接し、（３）さもなければ、CDR 領域と相互作用し（例えばCDR 領域の約３Å以内である）、（４）Ｖ_L−Ｖ_Hインターフェースに関与することが合理的に予想される場合、ヒト骨格アミノ酸はマウス抗体からの等価の骨格にアミノ酸により通常、置換されるはずである。置換のための他の候補は、その位置でヒトイムノグロブリンについて異常であるアクセプターヒト骨格アミノ酸である。これらのアミノ酸は、抗体の等価の位置から又はより典型的なヒトイムノグロブリンの等価の位置からのアミノ酸で置換することができる。ヒトモノクローナル抗体又はその結合フラグメントをコードするDNA 配列を単離するための更なる試みは、Huseら(Science 246: 1275 〜1281(1989))により概説される一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのDNA ライブラリーをスクリーニングし、次に要求される特異性の抗体（又は結合フラグメント）をコードする配列をクローニング及び増幅することによる。Huseにより記載されるプロトコルは、ファージディスプレイ技術と組み合わせるとより有効である。例えばDo ner ら（WO91/17271）及びMcCaffertyら（WO92/01047）を参照のこと。ファージディスプレイ技術は、β−セクレターゼタンパク質又はそれらのリガンドについてアフィニティーを有することが以前に示されている抗体のCDR 領域を変異誘発するのにも用いることができる。改良された結合アフィニティーを有する抗体が選択される。本発明の他の実施形態において、β−セクレターゼタンパク質又はそのタンパク質アナログに対する抗体のフラグメントが供される。典型的には、これらのフラグメントは、完全なイムノグロブリンのそれに似たβ−セクレターゼタンパク質レセプターへの特異的結合を示す。抗体フラグメントは、別個の重鎖、軽鎖、 Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fabc、及びＦ_Lを含む。フラグメントは、組換えDNA 技術により、又は完全なイムノグロブリンの酵素的又は化学的分離により作られる。 IV．スクリーニングアッセイ本発明は、APP 及びβ−セクレターゼによって認識される他のポリペプチド基質のβ−セクレターゼ媒介開裂を検出するためのアッセイを提供する。本方法は、β−セクレターゼ構成物及び基質構成物の両方を含み、β−セクレターゼが長期にわたり気質を開裂して開裂産物を形成する反応システムを利用する。これにより、β−セクレターゼ活性は、開裂産物の量が増加するにつれて時間にわたって観察され、モニターされ得る。その反応システムにおける開裂産物の量は、免疫学、クロマトグラフィー、及び電気泳動等を含み種々の方法において測定することができる。このようなβ−セクレターゼ開裂法は、APP のβ−セクレターゼが媒介性開裂を阻害する能力を決定するためにテスト化合物をスクリーニングするのに特に役立つ。このような場合、テスト化合物は反応システムに加えられ、開裂産物の産生へのテスト化合物の効果が観察される。開裂産物の産生を阻害するこれらの化合物は、潜在的なβ−セクレターゼインヒビターとして与えられ、更に、βAP産生に関連する病状の治療のための潜在的治療剤として与えられる。本反応システムは、通常、２つのタイプのうち１つを含むであろう。第１に、本反応システムは、異なるソースから別個に得られ、その後反応混合物に混合されたβ−セクレターゼ及びポリペプチド物質を含むであろう。通常 β−セクレターゼは上述のように、細胞のソースが得られた精製されたもしくは部分的に精製されたβ−セクレターゼ、又は上述のような組換えβ−セクレターゼのいずれかであろう。次に、ポリペプチド基質は、通常、天然のソースから単離された全長のAPP もしくは組換え産生された全長のAPP、APP のフラグメント又はAPP の一部に擬似する他のポリペプチドのいずれかであり得るだろう。そしてそれは、（以下により詳説される）β−セクレターゼ開裂部位；又はβ−セクレターゼ開裂部位を含む合成ペプチドを含む。β−セクレターゼ及びポリペプチド基質は、時間にわたってβ−セクレターゼ開裂産物の産生の観察を許容する広範囲の種々の固相検出システムに用いることができる。あるいは、本反応システムは、通常、細胞膜から同時に抽出される単一の共通の細胞ソースから得られたネイティブβ−セクレターゼ及びネイティブAPP を含み得る。後の実験セクションにより詳説されるように、ヒト脳又は他の細胞は培養物から得られ、破砕され、そしてβ−セクレターゼによる開裂産物へのAPP の後の転化を許容する量で、β−セクレターゼ及びネイティブAPP の両方を含む、上清を得るために処理され得る。その開裂産物は、本願において他の場所に記載されるのと同じ方法で検出され得、その方法に、テスト化合物がβ−セクレターゼ媒介性開裂を阻害する能力を決定するために特に役立つだろう。上述の第１のβ−セクレターゼアッセイは、テスト基質の存在下で、少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼを、APP のβ−セクレターゼ開裂部位を含むポリペプチド基質と組み合わせることによって行われ得る。β−セクレターゼが、開裂を阻害する物質の欠如下でポリペプチド基質をアミノ末端フラグメント及びカルボキシ末端フラグメントに開裂するであろうように条件が維持される。テスト化合物の存在下でのポリペプチド基質の開裂は、テスト化合物の欠如下のそれと比較され、そして開裂活性の大きな阻害（通常、少くとも約25％阻害、より通常は少くとも約50％阻害、好ましくは少くとも約75％阻害、そしてしばしば少くとも約90％阻害又はそれ超）を供するこれらのテスト物質がβ−セクレターゼインヒビターであると考えられる。次にこのようなβ−セクレターゼインヒビターは、それらが細胞及び動物モデルにおけるβAPの生産を阻害するか否かを決定するために更なる試験管内及び／又は生体内テストにかけられ得る。適切な生体内及び試験管内テストは、その全開示が引用により本明細書に組み込まれる同時係属出願通し番号07/965 ,972及び07/831,722に記載される。適切な基質ポリペプチドは、β−セクレターゼによって認識され開裂されるAP P 分子の領域を含むであろう。通常、基質ポリペプチドは、（695 アミノ酸APP 異性体におけるアミノ酸596 と597 との間に位置した）開裂部位に対してアミノ末端側に、少くとも約５アミノ酸残基、好ましくは少くとも約17アミノ酸残基、及び開裂部位のカルボキシ末端側に、少くとも約５アミノ酸、好ましくは少くとも約16アミノ酸、最も好ましくは少くとも42アミノ酸（即ち、全βAP配列）を含むであろう。その開裂部位は、典型的にはβAPP の野生型及びSwedish 形態の特徴であるMet-Asp 又はLeu-Asp 開裂部位を含むであろう。完全なAPP 分子はAPP の野生型及び変異型の両方を含む。特にAPP のSwedish 変異を含むポリペプチドとして適するだろう。アフィニティー領域がAPP のβ−セクレターゼ開裂部位に融合され得る。その開裂が固相テストシステムにおいて便利にモニターされ得る分子を生産する融基質ポリペプチドの使用がしばしば好ましい。 β−セクレターゼ及び適切な基質ポリペプチドのスクリーニングアッセイは、便利には、開裂により作られるアミノ末端又はカルボキシ末端フラグメントが固相上に捕獲される“サンドイッチ”アッセイを用いて行われる。次にその捕獲されたフラグメントは、β−セクレターゼ開裂により露出されたフラグメントの末端に特異的な抗体を用いて検出され得る。以下の実験セクションに詳細に記載される典型的な実施形態において、ポリペプチド基質はマルトース結合タンパク質及びAPP の125 アミノ酸カルボキシ末端フラグメントを組み合わせる融合ポリペプチドである。開裂産物のカルボキシ末端がそれに特異的な抗体により検出されるアッセイは、アミノ末端開裂産物を捕獲するために抗マルトース結合タンパク質抗体を用いる。典型的な抗体は、その全開示が引用により本明細書に組み込まれる1993年10月27日に出願された同時係属出願08/143、697 により詳細に記明される192 抗体又はSw-192抗体である。開裂した融合ポリペプチドへの抗体の結合は、抗体に直接（共有結合で）結合する、又はビオチンもしくはアビジンのような中間連続物質を通して間接的に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他の検出可能な酵素標識のような慣用的なラベリングシステムを用いて検出される。Ｖ．医薬組成物及び治療方法本発明は、細胞中のAPP のAPP 開裂産物へのβ−セクレターゼ媒介性開裂を阻害するための方法であって、上述の方法により選択された化合物を細胞に投与することを含む、方法を含む。その化合物は、他の培養された細胞のβAP産生を生ずるAPP 開裂を阻害するために、細胞培養物に加えられ得る。その化合物は、アルツハイマー病及び他のβAP関連の病状に関連する病原性βAP産生及びアミロイドβ−プラークの分解を生ずるβ−セクレターゼが媒介性APP 開裂を阻害するためにも、患者に投与され得る。本発明は、上述の方法により選択された化合物を組み込み、医薬として許容される担体を含む医薬組成物を更に含む。このような医薬組成物は、本発明の方法によって同定された少くとも１の化合物の治療又は予防の量を含むべきである。医薬として許容される担体は、その化合物を意図したホストに送り出すのに適したいずれかの適合性のある非毒性の物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を担体として用いることができる。医薬として許容されるアジュバント、緩衝剤、及び分散剤、等も医薬組成物に組み込むことができる。活性剤を組み込む医薬組成物の調製は、医学及び科学文献に十分に記載されている。例えば、その開示が引用により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmacentical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania， 16th Ed.，1982を参照のこと。ここに記載される医薬組成物は、非経口及び経口投与の両方を含む宿主への全身の投与に適している。本医薬組成物は、通常、非経口的に、即ち皮下、筋内、又は静脈内に投与されよう。これにより、本発明は、ホストに投与するための組成物であって、上述のように、許容される担体内に、同定される化合物の医薬として許容される溶液を含む組成物を提供する。頻繁に、脳に直接又は間接的に本医薬組成物を導入することが要求されるか又は必要とされよう。直接的な技術に、通常、血液脳関門をバイパスするためにホストの心室系内に薬剤デリバリーカテーテルをおくことに関する。一般的に好ましい間接的な技術は、親水性薬剤の脂溶性薬剤への転化により薬剤潜在化（late ntiation）を供するために組成物を製剤化することに関する。潜在化は、一般に、薬剤をより脂溶性にし、血液脳関門を横切る輸送を容易にする薬剤上に存在するヒドロキシル、カルボキシル、及び第１アミノ基のブロッキングにより達成される。あるいは、親水性薬剤のデリバリーは、血液脳関門を一時的に開くことができる高張溶液の動脈内注入によって増強され得る。医薬的担体内の本化合物の濃度は、広範囲で種々であり、即ち医薬組成物の約 0.1 重量％未満〜約20重量％又はそれ超であり得る。筋内注射のための典型的な医薬組成物は、例えば１〜４mlの滅菌緩衝水及び１μｇ〜１mgの本発明の方法により同定された化合物を含むように作られる。静脈内注射のための典型的な組成物は、100 〜500 mgの滅菌Ringer溶液及び約１〜100 mgのその化合物を含むように作られ得るだろう。本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病、ダウン症候群、及び脳の進展した老化のようなβAPの分解に関する病気の予防的及び／又は治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、本医薬組成物は、既に病気を患うホストに投与される。本医薬組成物は、βAPプラークの更なる分解を阻害するのに十分な量で投与されよう。これを達成するのに適した量は“治療に有効な投与量”として定義される。このような有効な投与量は、病気の程度及びホストの大きさ等によるであろうが、一般には、ホストの体重のキログラム当り約0.01μｇ〜10mgの範囲、より一般的には0.1 μｇ〜１mg／kgの投与量が用いられる。予防的な適用のために、本発明の医薬組成物は、βAP関連の病気に感受性があるが、まだその病気を患っていないホストに投与される。このようなホストは、医学文献(例えばGoate（1991）Nature349: 704〜706)に記載されるような遺伝子スクリーニング及び臨床分析によって同定され得る。本医薬組成物は、症状の早期の段階におけるβAPプラークの分解を阻害又は防止することができ、好ましくはβ−アミロイド病の初期の段階さえ防ぐであろう。予防に有効な投与量として言及されるこのような予防的処置に必要とされる化合物の量は、一般に、治療的処置について上述されるのと同じである。以下の例は、詳説のために供され限定のためではない。実験 β−セクレターゼの精製及びキャラクタリゼーション凍結組織（293 細胞ペースト又はヒト脳）を断片に切断し、５容量の均質化緩衝液(20mM Hepes，pH7.5，0.25 Ｍスクロース、２mM EDTA)と組み合わせた。その懸濁液をブレンダーを用いてホモジナイズし、1000×ｇで遠心して（10分、４ ℃）、ホスト核（post-nuclear）上清を作り、それを氷上に保存した。そのペレットをもとの容量における新鮮な均質化緩衝液中に再懸濁し、そして遠心ステップをくり返した。その第２の上清を第１のものと組み合わせ、そしてその上清のプール（“PNS”）を40℃で30分、16,000×ｇで遠心した。その上清を捨てて、 “Ｐ２”と標識されたそのペレットを、酵素精製のために直ちに用いるか、又は後の使用のために−40℃で凍結させた。そのペレットをもとの容量における抽出緩衝液(20mM MES，pH6.0，0.5％ Trit on X-100，150mM NaCl，2mM EDTA，５μｇ／ｌロイペプチン、５μｇ／ml Ｅ64 ，１μｇ／mlペプスタチン、0.2 mM PMSF)中に懸濁した。ホルテックスで混合した後、その抽出を、１時間、40℃でそのチューブを撹拌することにより完了した。その混合物を16,000×ｇで上述のように遠心し、その上清をプールした。その抽出液のpHを、約１％(v/v)の１Ｍ tris ベース（中和されていないもの）を加えることによって7.5 に調節した。その中和した抽出液を４℃の10カラム溶液の20mM tris，pH7.5， 0.5 ％ Triton X-100，150mM NaCl，2mM EDTA で予め平衡化したコムギ胚芽アグルチニン−アガロース（WGA −アガロース）カラムに充填した。１ミリリッターのアガロース樹脂を、用いたもとの組織４ｇ毎に用いた。WGA カラムを10カラム容量の平衡化緩衝液で洗って、次に以下の通り溶出した。20mM Tris，pH7.5，0. 5 ％ Triton X-100，2mM EDTA 中の１ＭのＮ−アセチルグルコサミンの３分の１カラム容量をカラムに通し、その後15分にその流れを止めた。次に更なる５カラム容量の１ＭのＮ−アセチルガルコサミン溶出緩衝液を用いてカラムを溶出し、次に５カラム容量の20mM Tris，pH7.5，0.5 ％ Triton X-100，2mM EDTA 中の10 ％キチンヒドロライゼートを用いた。上述の全ての溶出液を組合わせた（プール WGA 溶出液）。そのプールされたWGA 溶出液を20mM NaOAc，pH5.0，0.5％ Triton X-100，2mM EDTA で１：４に希釈した。その希釈した溶液のpHを、pHをモニターしながら数滴の氷酢酸を加えることにより５：０に調節した。この“SPロード”を、40℃で４ml／分で、20mM NaOAc，pH5.0，0.5％ Triton X-100，2mM EDTA で平衡化された５ml Pharmacia HiTrop SP−カラムを通した。β−セクレターゼ活性は、流した画分中に存在し、それをpHを3.5 にするのに十分な１Ｍ Tris（中和されていないもの）に加えて中和した。次に、その酵素溶液を、４℃で1.5 ml／分で約10 カラム容量の20mM Tris，pH7.5，0.2 ％水素化Triton X-100，2mM EDTAで平衡化された１−ml pharmacia HiTrop Ｑ−カラムに充填した。そのカラムを、10カラム容量の20mM Tris，pH7.5，0.2 ％水素化Triton X-100，50mM NaCl，2mM EDT A で洗った。タンパク質を40℃で１ml／分の流速で30分にわたって50mM〜350 mM のNaClの直線的勾配を用いて溶出した。HiQ 画分中のタンパク質濃度を、BioRad 比色タンパク質アッセイを用いて測定し、そしてβ−セクレターゼ活性をpH5.5 のMBP-C125開裂アッセイを用いて測定した。タンパク質のピンクの上昇部分における画分は、高い特異活性を有し、それを酵素の更なる精製のためにプールした。次に、HiTrapQ からのプールされた画分を、20mM Tris，pH7.5，0.2 ％水素化Triton X-100，150mM NaCl，2mM EDTAの10カラム容量で平衡化されたコンカナバリンＡ−アガロースのカラム(プールの10％v/v)に適用した。次にCon ＡフロースルーをSuperdex 200(26/60)ゲル排除クロマトグラフィーカラムに充填し、それを１ml／分でTris緩衝塩類溶液、pH7.4，0.2％水素化Triton X-100，２mM E DTA で溶出し、３分／画分で収集した。β−シクラーゼ活性を含む画分をMBP-C1 25開裂アッセイを用いて同定した。Superdexカラムから溶出したβ−セクレターゼ活性の見掛け分子量を、（標準タンパク質のそれに対する）ピーク溶出容量から、280,000 ±9800（293細胞での２回のラン及びヒト脳での２回のランの平均）と評価した。ヒト脳組織からの酵素の大規模調製からの結果を次の表１に示す。 ¹ 精製されたβ−セクレターゼの特異活性は次の通り測定した。（以下に示す） MBP C125-SW を100 mM酢酸ナトリウム、pH5.5 中約0. 7 μｇ／mlで、0.3 ％ Triton X-100 と組み合わせた。生成された産物の量を以下に記載されるβ−セクレターゼアッセイによって測定した。次に特異活性を次のように計算した。これにより特異活性は、時間当りのβ−セクレターゼのμｇ当りに生成されたタンパク質のμｇとして表現される。 β−セクレターゼのグリコシル化を種々の固定化されたレクチンを用いて研究し、実質的に精製されたβ−セクレターゼ活性がそれらに結合する能力を測定した。表２はこのデータを要約する。記号“−”は20％未満の結合を示し、“＋” は24〜40％の結合を示し、“＋＋”は50〜75％の結合を示し、そして“＋＋＋” は75％超の結合を示す。テストした多くのものの中で、単一のレクチン(WGA)のみが量的にβ−セクレターゼ活性と結合した。いくつかの他のレクチンへの活性（25〜40％）の部分的結合は、おそらく不均一なグリコシル化を示す。記載されるように精製されたβ−セクレターゼを次のようにいくつかの一般的プロテアーゼインヒビターの存在下でアッセイした。酵素溶液を、以下のβ−セクレターゼインヒビターアッセイセクションに記載されるようにインヒビターと混合し、他は同一の条件下でインキュベートされた対照溶液の割合として、残存活性についてアッセイした。IC₅₀値は、たとえあるとしても、対照活性の５０％阻害を生じるインヒビターの濃度として決定した。その結果を表３に示す。これらの結果は、β−セクレターゼ活性がセリン、システイン、アスパルチル、及びメタロプロテアーゼの一般的なインヒビターによって阻害されないことを示す。ｏ−フェナントロリンが少し阻害し、金属キレーターでないｍ−フェナントロリンも同じであることは、この弱い阻害がｏ−フェナントロリンの金属キレート化特性とは無関係であることを示す。部分的配列決定、合成ペプチドの生産、及び抗体の生産表１に関連して上記に記載されるβ−セクレターゼ活性のピークを含むSuperd ex溶出画分をプレートし、１−mlスイシニル化コムギ麦芽アグルチニンアガロース(SWGA−アガロース、Vector Labs)カラムに通した。そのSWGAカラムを、先に５カラム容量のTris緩衝塩類溶液、pH 7.4，0.2 ％水素化Triton X-100，１mM C aCl₂，１mM MgCl₂で、次に５カラム容量の１ＭのNaClを含む同緩衝液で、そして最後に10カラム容量の最初の低（NaCl）緩衝液で洗った。酵素サンプルをSWGAカラムに通した後、その樹脂を更なる１／２カラム容量の平衡化緩衝液で洗った。これから通過したものをβ−セクレターゼ活性のバルクを含むサンプルフロースルーと共にプールした。次にSWGA−アガロースフロースルーを、SWGA樹脂について上述のように洗浄され、平衡化された１mlヒラマメレクチンアガロースカラム(LCA−アガロース、レンズ・クリナリス（lens culinaris）アグルチニンVector Labs)に適した。β− セクレターゼ活性の大部分をLCA フロースルー画分に再び回収する。次にLCA フロースルーを20mM Tris，pH 7.5，２mM EDTA，0.2％水素化Triton X-100で１：４に希釈し、その酵素溶液を４℃で一晩静かに撹拌しながら陰イオン交換樹脂と混合することにより、40μｌのDEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmac ia)に結合させた。次に遠心によりDEAE-Sepharose樹脂を回収し、希釈緩衝液で１回、洗い、そしてその結合した酵素を450mM のNaClを含む希釈緩衝液200 μｌで溶出した。その溶出された酵素溶液を２つの異なる部、20％と80 ％とに分割し、各々の部を、SDS を0.2 ％水素化Triton X-100で置きかえた他は、Laemmli の方法(Nature，227，680(1970))に従って、隣接レーンにおいて、６％分離−４％スタッキングゲルシステムに非変性条件下で電気泳動した。電気泳動の後、そのゲルを0.1Ｍ酢酸ナトリウム、pH 5.5中に約30分、浸漬した。次に電気泳動した酵素の“分析用”（20％）及び“調製用”レーン（各々７cm長×１ cm幅×１mm厚）をスタッカーの頂上から分離ゲルの下まで連続的にクリーンレーザーブレードを用いて約2.5mm 断片に切断した。分析用スライスの各々をマイクロ遠心チューブ内で60μｌの水と10μｌの１Ｍ酢酸ナトリウムと組み合わせ、次にKontes Deltawareモーター式ペレット内筒マイクロホモジナイザーを用いてホモジナイズした。MBP-C125SWを要求される濃度まで加え(0.5〜0.7 μｇ／ml)、その混合物を一晩インキュベートした。次にそのサンプルを試料希釈液で50倍に希釈し、後述されるβ−セクレターゼ活性ELISA により分析した。次にβ−セクレターゼ活性を含むこれらの分析用スライスに相当する調製用スライスを、後述のように処理して、ゲル精製された酵素からトリプシン処理フラグメントを生成し、部分的なタンパク質配列を得た。 β−セクレターゼ活性を含むゲルスライスを最初に還元及びアルキル化し、次にトリプシンで消化した。そのゲル断片からペプチドを抽出し、逆相HPLCによって分離した。収集された精製されたペプチドを自動エドマン分解により配列決定した。実験法は次の通りである。各々の調製用ゲルスライスを約１mm平方の断片に切った。取り扱いを容易にするために、各々のスライスの切った断片を個々のマイクロフュージチューブに入れた。断片をチューブ当り100 μｌの冷やした無水エタノールで２回、洗った。次にその縮んだ断片をその断片上約２mmの液体、典型的には130 〜150 μｌを有するのに十分な容量の還元緩衝液(0.1Ｍ重炭酸ナトリウム、0.2 ％水素化Triton X-100、及び0.1 Ｍ DTT)中で再び水和した。次にそのチューブを振とうしながら30分、5 0℃でインキュベートした。還元した後、その断片を25％ｖ／ｖの0.5 Ｍのヨード酢酸、通常、35μｌを加えることによってアルキル化した。次にそのチューブを45分、振とうしながら暗所で氷上でインキュベートした。過剰な試薬を除去し、その断片を、液体を80％エタノールに調節するのに十分な冷無水エタノールを加えることにより、部分的に再び収縮させた。次にゲル断片及びエタノール溶液を含むチューブを−20℃で短く冷やし、他方でトリプシンを調製した。 20μｌの修飾された配列決定グレードのトリプシン(Promega)を含む１つのバイアルに、50μｌの再構成緩衝液(Promega)を加えた。トリプシンが完全に溶けた後、12.5μｌのアリコートを除去し、37.5μｌの消化緩衝液(0.1Ｍ重炭酸アンモニウム、0.2 ％水素化Triton X-100)に加えて１μｇ／10μｌのトリプシン濃度を生成した。そのゲル断片を含むチューブを簡単に遠心し、そのエタノール溶液を除去した。各々のチューブに更に100 μｌの無水エタノールを加えてゲル断片を収縮させ脱水した。各々のチューブに、ちょうどその縮んだゲル断片を湿らすように約20μｌの消化緩衝液を加えた。直ちに、10μｌの調製されたトリプシン溶液を各々のチューブに加えた。（これは、その断片がトリプシン溶液を完全に吸収するのを許容する）。ゲル断片の頂上約２mmを残すのに十分な消化緩衝液を加えた。次にそのチューブを約２時間、静かに振とうしながら37℃でインキュベートした。その緩衝液レベルをチェックして、２mm過剰量を維持するのに必要なだけ、更に消化緩衝液を加えた。インキュベーションを一晩（約14時間）、行った。チューブをチェックして、短く遠心して凝集物を底に落とし、必要に応じて更なる消化緩衝液を加えた。約20時間後、（上述のように）新しく調製したトリプシン溶液の第２のアリコートを加え、そして37℃で全部で約36時間消化を行った。チューブを37℃シェーカーからとり、遠心した。その上清を除去し、２mlマイクロフュージチューブ内に組み合わせ、トリフルオロ酢酸(TFA、二重蒸留したもの)で酸性化した。次にまだ個々のチューブ内にあるゲル断片を100 μｌの消化緩衝液；100 μｌの30％アセトニトリル(AcN)、0.1 ％ TFA；及び２×100 μｌの60％ AcN，0.1 ％ TFAで連続的に抽出した。振とうしながら37℃で10分、各々の抽出を行った。抽出液を上述の組み合わせたプールに加えた。抽出物添加の間、そのプールされた容量をSpeed-Vac で還元した。第２の60％ AcN，0.1 ％ TFA 抽出の後、縮んだゲル断片を約20μｌの消化緩衝液で１〜２分、再び水和し、次に直ちに60％ AcN，0.1 ％ TFAで３回、抽出した。この最終抽出物を他のものと組み合わせそしてそのプールされた抽出物の容量を約350 μｌに減らした。（先と同じ）TFA を１％の最終濃度に加えた。抽出されたペプチドを0.1 ％ TFA，２％ AcNで40℃で平衡化されたVydac C18 カラム2.1 ×150mm に充填した。精製されたペプチドをAcN 勾配で溶出した。画分を手動で又は自動的に収集した。選択されたペプチド画分を、マイクロカートリッジを備えたApplied Biosyste ms Model 477を用いて配列決定した。３つの明白なペプチド配列を得た。これを以下に示す。＃１ AYLTV LGVPE KPQIS GFS（R）〔配列番号：２〕＃２ IIPST PFPQE GQPLI LTCE（R）〔配列番号：３〕＃３ GKPLP EPVL WTK 〔配列番号：４〕上述の３つの得られたペプチド配列の一部又は全てに相当する合成ペプチドを、以下に示されるそれらの２つについてのアミノ末端リンカー配列（下線）の添加と共に固相ペプチド合成を用いて作った。ペプチド名配列 Seek-1 NH₂ CGGYL TVLGV PEKPQ I CONH₂ 〔配列番号：５〕 Seek-2 AcNHIIP STPFP QEGQP LILTC CO₂H 〔配列番号：６〕 Seek-3 NH₂ CGGKP LPEPV LWTK CONH₂ 〔配列番号：７〕次にその合成ペプチドを陽イオン化ウシ血清アルブミンに接合させた後、特定の血清の形成のためにウサギに注入を行った。４及び10週目に得た抗血清を、部分的に精製されたβ−セクレターゼに対するウエスタン・ブロットにおいて１： 500 で用いた。部分的に精製されたβ−セクレターゼ（Superdex画分）を還元又は非還元条件のいずれかで10〜20％ Tricineゲルに電気泳動した。タンパク質を PVDF膜に移した後、個々のレーンを切除し、３つの別個のペプチドで免疫化されたウサギからの免疫化前血清、及び４及び10週目に得た血清で別個にプロービングした。ウエスタン・ブロットを、１：5000に希釈された２次ロバ抗ウサギIgG 、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した完全な抗体（Amersham）で展開し、次にECL(Amersham)で展開した。代表的な露出物からの結果を図１（非還元）及び図２（還元）に示す。個々のレーンは両方の図に示される。全ての３つの合成ペプチドに対する特定の抗血清は、60と148kDa分子量マーカーとの間の中間の移動度で移動する同じタンパク質バンドを認識する。全ての場合において、免疫化前の血清では免疫反応バンドは検出されない。ウエスタン・ブロットでの最も強い反応は、Seek-1(ウサギ205-A Wk 10)及びSeek-3(ウサギ211-A Wk10)に対する特定の抗血清で検出され、Seek-2(ウサギ210-A Wk 10)に対する血清はかなり弱いシグナルを作った。全ての場合、非還元条件と比較して、還元条件下でタンパク質を電気泳動した場合、かなり強い免疫反応性が証明された。これは、還元条件が他の変性タンパク質上の抗原性エピトープの露出の増加に味方することを示唆し、これは後述の免疫沈降実験のデザインに考慮に入れられた。 β−セクレターゼ活性を含むHiTrap Qクロマトグラフィー画分を２つの部分に分けた。その２つのアリコートの１つを室温で30分、５mMの還元剤ジチオトレイトール(DTT)で処理した。還元されたもの及び未処理の対照サンプルの両方を20m M Tris pH 7.5，２mM EDTA，0.2％水素化Triton X-100で10倍に希釈した。Pharm acia Protein A-Sepharose CL-4B を、75mg／mlで希釈緩衝液に乾燥した樹脂を懸濁し、それを氷上に30分、放置することにより再構成した。次に酵素アリコート(100μｌ)を20μｌの再構成されたProtein A-Sepharose、及び５μｌの免疫化前ウサギ抗血清、又はウサギ205-A Wk 10 もしくはウサギ211-A Wk 4からの抗血清のいずれかと混合し、その混合物を静かに逆さにしながら、室温で２時間、インキュベートした。Protein A-Sepharose ビーズ（＋結合した抗体及び抗原）の沈降の後、透明な懸濁液中でMBP C125Swアッセイを用いてβ−シクラーゼ活性を測定した。その結果を、グラフにして図３に示す。ペプチドSeek-1及びSeek-2の両方に対する特定の抗血清は、還元条件下でβ−セクレターゼ活性を免疫沈降させたが、非還元条件下では沈降させなかった。これらの結果は、両方の抗血清についての最適なエピトープ露出が、タンパク質の先の還元を要求するという先の観察結果と一致した。非変性ゲル精製酵素由来の合成ペプチドに対して生じた特異的抗血清での最適なエピトープ露出の条件下でのβ−セクレターゼ活性の免疫沈降は、これらの特有のペプチド配列がβ−セクレターゼポリペプチドから生ずることを確認する。アミノ末端タンパク質配列を形成するために、その調製物中の少量の不純物の分離を許容するために化学的及び酵素的修飾によりネイティブβ−セクレターゼを変えることが必要とされた。これを達成するために、弱い還元、その後のアルキル化及び部分的脱グリコシル化を以下に記載されるように行った。この処理の順序で酵素活性の損失は見られなかった。LCA −アガロースフロースルー画分を、Speed Vac 真空遠心装置内での凍結乾燥により約５倍に濃縮した。その酵素溶液に、５mMの最終濃度で還元剤ジチオトレイトール(DTT)を加え、その調製物を室温で１時間、インキュベーションした。次にカルボキシアミドメチル化試薬イオドアセトアミドを10mMの最終濃度で加え、次に室温で更に30分、インキュベートを行った。次にその処理した酵素−サンプルを、次の処理ステップのために20 mM Tris，pH 7.5, ２mM EDTA，0.2％水素化Triton X-100に緩衝液を変えるために、Pharmacia PD-10 カラムを用いて直ちに脱塩した。 Asn に結合した糖鎖の除去を行うために、25mUの脱グリコシル化酵素PNGase F (Glyko)を、β−セクレターゼ調製物に加えた。この処理ステップを、室温で一晩（16ｈ）行った。 β−セクレターゼをこれにより還元し、カルボキシアミドメチル化し、そして（少くとも部分的に）脱グリコシル化した後、その処理した酵素を上述のような１ml HiTrap Q カラム上での陰イオン交換クロマトグラフィーに再びかけた。活性のピークを含む溶出された画分を、各々の画分0.36mlを1.44mlの氷冷アセトンと組み合わせ、その混合物を−40℃で一晩保存し、そしてそのサンプルを10分間、ベンチトップエッペンドルフマイクロセントリフュージ上で最大速度でサンプルを遠心することによるアセトン沈降によって個々に濃縮した。上清液を除去した後、そのペレットをSpeed Vac 真空遠心装置内で乾燥して沈降させ、その沈殿したタンパク質ペレットを２％ β−メルカプトエタノールを含むLaemmli サンプル緩衝液中に溶かした。そのサンプルを、Novex 10 〜20％アクリルアミドTricine ゲルシステムでの電気泳動を行い、次にそのタンパク質バンドを製造元によって供給されるプロトコルを用いて、Novex コロイド状クーマシー染色を用いて視覚化した。染色されたゲルの像をMolecular Dynami cs Personal Densitometerを用いて記録した。β−セクレターゼに相当するタンパク質バンドを同定するために、平行して同様のゲルで行うがレーン当りのタンパク質がより少いウエスタンブロット分析を、PVDF膜に移した後に行った。ウエスタンブロットは、上述のウサギ211-A Wk 10 からのペプチドSeek-3に対する抗血清でプロービングした。その結果は、60kDa MWマーカーを超えたところに移動する三重のタンパク質バンドが、この先にキャラクタライズされた抗血清と強く免疫反応することを示した。 β−セクレターゼ活性を含む画分(#'s 21-25)をアセトン沈殿させた。アセトンを除去するためにSpeed-Vac でペレットを短く乾燥させて、SDS-PAGEローディング緩衝液に溶かし、10〜20％ Tris-Tricine ゲル(Novex)での電気泳動にかけた。そのゲルをCAPS緩衝液中でPro-Blott 膜（Applied Biosystems）に移した。クーマシーブルー染色後、上述の免疫反応での電気泳動移動と一致した65〜75kD a のおおよその分子量範囲の３つの近接したバンドを、Applied Biosystems Mod el 477でのタンパク質配列決定のために切除した。そのバンドのうち２つは同じ主要なアミノ酸配列を示した。第１のサイクルでは位置的に同定することはできなかったが、次の15サイクルは確実に合理的に進められた。得られた共通配列は、〔S/F/G〕KNKVK GSQGQ FPLTQ XVTVV 〔配列番号：８〕 β−セクレターゼインヒビターアッセイ１．精製されたβ−セクレターゼ及び組換え融合ペプチド基質を利用するアッセイ βAP配列のアミノ末端近くをタンパク質分解により開裂することにより覆われていない遊離…Val-Asn-Leu-COOH末端配列を認識するSW-192抗体を利用するβ− セクレターゼアッセイを行った。APP の２つの組換え発現された変異体（図５及び６）をβ−セクレターゼのための基質として用いた。両方の変異体は野生型又はSwedish 変異体として調製することができる。好ましい基質（図５）を、New England Biolabs からの市販のPMALベクターを用いて、マルトース結合タンパク質(MBP)のカルボキシ末端に融合されたAPP のカルボキシ末端125aa の融合タンパク質として大腸菌内で発現させた。これによりβ−開裂部位はAPP C-125 領域の開始から下流26アミノ酸であった。開裂部位における野生型APP 配列(MBP-C125 WT)(..Val-Lys-Met-Asp-Ala..)( 配列番号：９)又は“Swedish”二重変異体（MBP-C125 SW)(..Val-Asn-Leu-Asp-A la..)(配列番号：10)と共に、組換えタンパク質を作った。Swedish 配列での組換えタンパク質の全体の配列を図７に供する（配列番号：１）。図４に示すように、完全なMBP −融合タンパク質の開裂は、カルボキシ末端においてカバーされていない新しいSW-192 Ab-陽性エピトープと共に、端が切られたアミノ末端フラグメントを形成する。このアミノ末端フラグメントは、同じAbでのウエスタン・ブロットで、又は定量的には、図４に示すような抗−MBP 捕獲ビオチン化SW-192 レポーターサンドイッチフォーマットを用いて認識することができる。抗MBP ポリクローナル抗体は、精製された組換発現されたMBP（New England B iolabs）での免疫化によってウサギ(Josman Labs，B erkeley)において生じさせた。抗血清を、固定化されたMBP のカラムでアフィニティー精製した。 APP のSwedish 変異体及び野生型の両方のカルボキシ末端125 アミノ酸を含む融合ペプチド（各々MBP-C125 SW 及びMBP-C125 WT と命名）を、IPTGで誘導された移入された大腸菌から調製し、収集し、そして細胞を150mM 塩化ナトリウム、 50mM Tris，pH 7.5, ５mM EDTA、及び0.1 ％ Triton X-100 を含む溶解緩衝液中で音波処理することを除いて、New England Biolabs のプロトコルに記載されるように溶解した。その音波処理した細胞をペレット化して、４℃で10分間、10 ,000×ｇで遠心し、７Ｍ尿素、10mM Tris，pH 7.5，５mM EDTA、及び0.1 ％ Tri ton X-100 で一晩抽出した。その抽出液を10分間の10,000×ｇの遠心により透明にし、次に溶解緩衝液に対して一晩、透析した。その透析した抽出液を上述のように再び遠心し、アミロース樹脂のカラム(New England Biolabs)に適用した。そのカラムを溶解緩衝液で更に（少くとも10カラム容量）で洗い、次に２カラム容量の低塩緩衝液（10mM Tris，pH 7.5, ５mM EDTA，0.1％ Triton X-100)で洗い、その生成物を低塩緩衝液中10mMのマルトースで溶出した。その精製された基質を−40℃で、３Ｍグアニジン−HCl 及び0.5 〜0.7 ％ Triton X-100 で、0.5 〜1.0 mg／mlで凍結保存した。マイクロタイター96ウェルプレートを精製した抗−MBP 抗体（５〜10μｇ／ml ）でコートし、次にヒト血清アルブミンでブロックした。β−セクレターゼ溶液（１〜10μｌ）を、コートしていない96−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェル内で、20mM酢酸ナトリウム、pH 5.5，0.035 ％〜0.05％ Triton X-10 0 の最終緩衝組成物で50μｌの最終容量で、MBP-C125 SW 基質(0.5μｌ)と混合し、２時間、37℃でインキュベートした。阻害スクリーニングアッセイのために、生成物の1600〜3200mg／ml／hrを供するように、加えるβ−セクレターゼの量を調節した。次にサンプルを試料希釈液(0.2ｇ／ｌリン酸ナトリウム一塩基、2.15ｇ／ｌリン酸ナトリウム二塩基、0.5 ｇ／ｌナトリウムアジド、 8.5 ｇ／ｌ塩化ナトリウム、0.05％ Triton X-405、６ｇ／ｌ BSA)で５倍に希釈し、更に抗MBP コートプレート上で試料希釈液に10〜20倍、希釈し、そして２時間、インキュベートした。ビオチン化SW192 抗体をレポーターとして用いた。SW 192 ポリクローナル抗体をNHS −ビオチン（Pierce）で製造元の説明に従って、ビオチン化した。そのビオチン化抗体を約60〜800 ng／mlで用い、その抽出濃度を用いた抗体の各々のロットについてMBP-26SW（以下を参照のこと）に対して最適化した。レポーターとのプレートのインキュベーションの後、蛍光基質としてストレプトアビジン−標識アルカリホスファターゼ（Boeringer-Mannheim）及び４−メチル−ウンベルリフェリルホスフェートを用いてELISA を展開した。Cyto flour 2350 Fluorescent Measurement System で読みとった。βAP配列（MBP-26 ）の野生型（WT）及びSwedish 変異体（SW）に融合したマルトース結合タンパク質(MBP)を含むペプチドを、MPB-26標準を大腸菌が音波処理されている溶解緩衝液から精製したことを除き、MBP-C125基質について先に記載される方法によって、標準として調製した。MBP-26 SW 標準を用いて標準曲線を作り（図７）、その蛍光単位を形成された産物の量に変換した。このアッセイプロトコルを用いて、96−ウェルマイクロタイタープレート上にアセンブルされた化合物の“ライブラリー”を用いて、インヒビター構造についてスクリーニングした。化合物を250mM酢酸ナトリウム、５％ DMSO 中50μｇ／m lの保存濃度に希釈した。そのストックを５分、遠心して(1,000×ｇ)、不溶性の化合物を除去し、その上清を酵素及び基質混合物に加えて上述のアッセイフォーマットにおいて20μｌ／ml DMSO の最終濃度にした。形成された産物の程度を対照（２％ D MSO のみ）β−セクレターゼインキュベーション物と比較し、“阻害（％）”を計算した。“Hits”は、テスト濃度における酵素活性の35％超の阻害を生ずる化合物として定義した。このシステムを用いて、テストした最初の9944の化合物の中で14の“hits”が同定され、“hit”比は0.14％であった。これにより、そのアッセイは、“インヒビター”から“非インヒビター”（大抵の化合物）を区別することができることを示した。野生型MBP-C125 wt のβ−セクレターゼによる開裂を、以下の改良を伴う上述の手順により測定した。37℃でのインキュベーションは上述の通りであるが、マイクロフュージチューブ内で５時間とした。次にサンプルを試料希釈液で10倍に希釈し、更なる希釈なしに抗MBP コートプレートに移した。レポーター抗体はビオチン化野生型特異的192 であり、700 ng／mlで用いた。組換え野生型MBP-C26 を用いて、蛍光単位の産物の量への変換のために標準曲線を作った（図９）。β −セクレターゼ溶液の量を変えることにより、生産物はそれに対応して増加し（図９）、反応溶液50μｌ当り約６μｌの最適レベルであった。２．部分的に精製されたβ−セクレターゼ及び合成オリゴペプチド基質を利用するアッセイ β−セクレターゼ活性を、APP 中の開裂部位を含む合成オリゴペプチドと共に、部分的に精製されたβ−セクレターゼ調製物をインキュベートすることによっても測定した。その開裂産物は、これらに限定されないが、Ｎ−もしくはＣ−末端上の蛍光もしくは色原標識の使用、遊離Ｎ−もしくはＣ−末端の測定、又は開裂ペプチドとの抗体反応を含むいくつかの技術のいずれかによって検出することができた。以下の例において、その開裂産物は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて検出し、次のペプチドを用いた。 ADRGL TTRPG SGLTN IKTEE ISEVN LDAEF RHDSG YEVHH QK(26-16′SW) 〔配列番号：11〕 GSGLT NIKTE EISEV NLDAE FRHDS GYEVH HQK(17-16′SW) 〔配列番号：12〕 ADRGL TTRPG SGLTN IKTEE ISEVN LDAEF(26-4′SW) 〔配列番号：13〕 SEVNL DAEFR HDSGY EVHHQ K(5-16′SW) 〔配列番号：14〕 N-アセチル SEVNL DAEFR(5-5′SW) 〔配列番号：15〕ペプチドは、自動固相合成により調製した。26′−４′SW，５−16′SW、及び５−５′SWペプチドをt-BOC 化学で合成し、他方26−16′SW及び17−16′SWペプチドはFMOC化学により合成した。全てのペプチドを、Ｃ４カラム上で0.1 ％ TFA 中で、0.33％／分で、10〜50％アセトニトリル勾配を用いて、使用する前に逆相 HPLCにより精製した。そのペプチド基質をβ−セクレターゼと共に0.3 〜0.35mg ／mlでインキュベートし、ゲル排除クロマトグラフィーステップを通して上述のように調製した。そのβ−セクレターゼ含有ゲル排除画分を、100mM 酢酸ナトリウム、pH 5.5及び0.05％の還元Triton X-100の最終緩衝組成物で250 μｌの最終容量に４倍希釈した。そのサンプルを、ペプチド26−16′SW，26−４′SW、もしくは17−16′SWについて一晩（18〜20時間）、又は５−16′SWもしくは５−５′ SWについて70〜80時間、37℃でインキュベートした。インキュベーション後に、最終濃度1.0 ％になるようにトリフルオロ酢酸を加えた。そのサンプルをHPLCにより分析した。26−16′SW，17−16′SW、又は５−16′SW消化物を、５分、4.5 ％のアセトニトリル、次に40分、4.5 〜22.5％のアセトニトリル、５分、22.5〜 31.5％、そして10分、31.5〜90％の勾配を用いてVydac C4カラム(4.4mm×250mm、300 Ａ孔サイズ、５μビーズサイズ)で分析した。26−４′SW及び５−５′SW消化物を、５分、1.8 ％アセトリトリル、次に20分、1.8 〜10.8％アセトニトリル、24分、10 .8〜18％、36分、18〜36％、そして15分、36〜90％の勾配を用いて、Vydac C18 カラム(4.4mm×250mm、300 Å孔サイズ、５μビーズサイズ)で分析した。ペプチドの消化物の典型的な分離を図10Ａ〜10Ｅに示す。生成されたペプチドを、アミノ酸分析及びマススペクトル分析により、選択された消化物において同定した。更に、Ｃ末端のLeu／Asp 開裂産物（DAEFRHDSGYEVHHQK）〔配列番号：16〕を、合成ペプチドとの比較により確認した。開裂産物を、Ｎ末端（26−４′SW）又はＣ末端（全ての他のペプチド）産物をペプチドピークの強度又は領域の測定により定量した。合成DAEFRHDSGYEVHHQK〔配列番号：16〕を用いる標準曲線は、HPLC アッセイは直線状であり、再現性があることを示した。β−セクレターゼ調製物からの連続的ゲル排除画分をこの方法で分析した場合、その結果は、ELISA により決定されたβ−セクレターゼ活性に比例し（図11Ａ−11Ｃ）、両アッセイにおいて同じ活性が測定され、定量されることを確認した。17−16′SWペプチドは、それが最も高い産物シグナルを供するので、好ましい基質である。図12は、17− 16′SWペプチドを用い、２つの候補インヒビター（Congo Red 及びELISA アッセイにより不活性された不活性化合物）を含むアッセイの結果を示し、このアッセイがインヒビターについての他のスクリーンとして、又は他のアッセイで同定されたインヒビターを確認するために用いることができる。３．移入された細胞膜を利用するアッセイ内因性全長APP タンパク質からのβ−セクレターゼ開裂APP フラグメントの形成を、APP のSwedish 変異体（293SWE細胞）が移入された293 細胞からの膜における（上述の）192SW 抗体を用いて観察した。APP フラグメントは、免疫沈降により又はイムノブロッティングにより測定することができる。便利さの理由のため、後者の技術が好ましい。開裂活性がβ−セクレターゼから生ずることの確認は次の通りである。１）両方の活性は高度に選択的であり、（以下のように）192SWでのイムノブロットで同定され得る単一のＮ末端産物を形成した。２）両方の活性は膜結合性であった。３）膜活性は、先の表３に列記される標準プロテアーゼインヒビターに対して耐性がある。膜中のAPP のその場での（in situ ）β−セクレターゼ開裂を検出するための半定量的アッセイを、β−セクレターゼインヒビターを直接同定するために発展的に用いた。その膜アッセイは、上述のアッセイにおいて同定された潜在的インヒビターの阻害活性を確認するために第１のスクリーン又は第２のアッセイとして役立つ。細胞膜アッセイを次の通り行った。293SW 細胞を、普通の手順により、90％ D ulbecco's MEM、10％熱不活性化胎児ウシ血清、25mM HEPES、１mMピルベート、２mMグルタメート、及び0.4 mg／mlゼネチシンを含む培地中で増殖させた(例えばR.I.Freshney（1987）Animal Cell Culture : A Manual of Basic Technique （2nd Edition）Alan R.Liss，Inc.New York，NY)。その細胞を、リン酸緩衝塩類溶液(PBS)で１回、洗い次に静かに撹拌しながら２mM EDTA を含むPBS と共に５分間、インキュベートすることによって収集した。示した場合を除いて、全ての更なるステップを４℃又は氷上で行った。細胞を800 ×ｇで５分、遠心することによりペレット化し、次にPBS 中で２回、再懸濁し、再びペレット化した。その細胞ペレットを５容量の均質化緩衝液(20mM HEPES，pH 7.5，２mM EDTA，250m M スクロース、１mM PMSF、５μｇ／mlジクロロイソクマリン、１μｇ／mlペプスタチンＡ、及び５μｇ／ml E-64)中でホモジナイズした。そのホモジネートを80 0 ×ｇで10分、遠心した。その上清を保存し、他方そのペレットを更なる５容量の均質化緩衝液中に再懸濁し、再び遠心した。その結果生じた上清を先のものと一緒にプールし、1.0ml 部に分注し、20分、16,000×ｇで再び遠心した。そのペレット（Ｐ２）を−40℃で保存した。その場でのβ−セクレターゼ活性の測定を、内因性β−セクレターゼ開裂APP をサポニンで抽出することによって容易化した。Ｐ２ペレットを、30分、0.02％サポニンで、1.0ml の再懸濁緩衝液（20mM Tris，pH 7.5, ２mM EDTA，1.0mM P MSF、５μｇ／mlジクロロイソクマリン、１μｇ／mlペプスタチンＡ、及び５μ ｇ／ml E-64）中に抽出し、20分、16,000×ｇでペレット化し、次にサポニンを含まない上述の再懸濁緩衝液中でボルテキシングすることにより再懸濁した。 β−セクレターゼ阻害アッセイのために、500mM 酢酸ナトリウム、pH 5.5及び 20％ DMSO 中の、その要求される最終濃度の５倍の関心のテスト化合物10μｌを 40μｌの抽出されたＰ２懸濁液に加えた。サンプルを４時間、37℃でインキュベートした後、17μｌの濃縮充填緩衝液（30％グリセロール、12％ドデシル硫酸ナトリウム、400mM Tris，pH 6.7，40mM EDTA、400mM ジチオトレイトール、0.4mg ／mlブロモフェノールブルー）でその反応を停止させた。サンプルを煮沸して、 10〜20％アクリルアミドトリシン(Tricine)ゲル(Novex)で電気泳動し、Immobilo n 膜(Millipore)に移した。膜をNCS-TBS(10％の新生ウシ血清、150mM 塩化ナトリウム、50mM Tris，pH 7.5)中でブロックし、そして第１抗体としてのNCS-TBS 中0.5 μｇ／mlの192SW、第２抗体としてのNCS-TBS 中１：3000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG(Amersham)、及び化学発光デベロッパーとしてのECL 試薬（Amersham）を用いて分析した。オートラジオグラフィーによって同定された192SW −反応性バンドをデンシトメトリーによって定量した。図13のオートラジオグラムに示すように、２つの産物バンドをイムノブロット上で同定した。より低部の及びより上部のバンドは、それらの電気泳動での移動度及びニューラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼに対する異なる感受性により示されるように、各々APP の未成熟のコア−グリコシル化形態及び成熟したゴルジ処理された完全なグリコシル化形態に相当する。標準として用いたインキュベートしていない抽出していないＰ２膜に標準化した定量により示されるように（図 14）、シグナルは最初は低く、そしてインキュベーションと共に直ちに増加した。図15に示されるもののような更なる実験は、更なるインキュベーションでシグナルの少しの増加を示した。図16は、ELISA アッセイで同定された３つの推定されたインヒビターによる阻害の濃度依存性を示した。コンゴ−レッド及び化合物 31766(図17)は、ELISA 及びin situ アッセイの両方において、不活性化合物よりかなり効能があった。本発明は、理解を明快にする目的のために、実例及び例によりいくらか詳細に記載されているが、特定の変換及び改良が添付の請求の範囲の範囲内で行うことができることが明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/53 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＰ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シンハ，スカントアメリカ合衆国，カリフォルニア 94127, サンフランシスコ，ジュニペロセッラドライブ 808 (72)発明者ケイム，パメラエス. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94401, サンマテオ，カバナウストリート 420 (72)発明者アンダーソン，ジョンピー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94132, サンフランシスコ，ブカレリドライブ 21 (72)発明者ヤコブソン−クローク，クリステンエル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94066, サンブルーノ，チェストナットアベニュ 551 (72)発明者タン，ヒューアアメリカ合衆国，カリフォルニア 94015, ダリーシティ，ウィルシャーアベニュ 50 (72)発明者マコンログ，リサシー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94127, サンフランシスコ，ジュアニタウェイ 283

Claims

【特許請求の範囲】１．β−アミロイドペプチド開裂位置においてβ−アミロイド前駆タンパク質を特異的に開裂する単離され、精製された酵素を含む組成物。２．β−セクレターゼを含む組成物であって、ヒト293 細胞からの可溶化されているが豊富化されていない膜画分のそれより少くとも５倍大きいβ−セクレターゼ活性を有することを特徴とする組成物。３．前記β−セクレターゼ活性が、ヒト293 細胞からの可溶化されているが豊富化されていない膜画分のそれより少くとも約100 倍大きいことを特徴とする請求項２に記載の組成物。４．β−アミロイドペプチド開裂位置においてβ−アミロイド前駆タンパク質を開裂することができる酵素であって、（ａ）ゲル排除クロマトグラフィーにより測定された260kD 〜300kD の範囲の見掛け分子量；（ｂ）pH５における実効負電荷及びpH 7.5における実効負電荷；並びに（ｃ）表２に示される他のレクチンとの部分的な結合と共に、コムギ麦芽アグルチニンに結合することを特徴とする酵素を少くとも10重量％含む組成物。５．β−アミロイドペプチド開裂位置においてβ−アミロイド前駆タンパク質を開裂することができる酵素であって、配列番号：９、配列番号：10、又は配列番号：11に記載のペプチドのいずれか一に対して生じた抗体と反応性を有する酵素を少くとも10重量％含む組成物。６．前記酵素が、前記ペプチドの少くとも２つに対して生じた抗体と反応性を有することを特徴とする請求項５に記載の組成物。７．前記酵素が、前記ペプチドの３つ全てに対して生じた抗体と反応性を有することを特徴とする請求項６に記載の組成物。８．前記酵素が、電気泳動で測定した場合に60kD〜148kD の間の見掛け分子量を有することを特徴とする請求項５に記載の組成物。９．ネイティブβ−セクレターゼタンパク質と特異的に結合する抗体。 10．ポリクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。 11．モノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。 12．ヒトに適応された抗体である請求項９に記載の抗体。 13．抗体フラグメントである請求項９に記載の抗体。 14．ポリペプチド基質のβ−セクレターゼ開裂を検出するための方法であって、最初の量において存在するβ−セクレターゼ及びポリペプチド基質を含む反応システムを供するステップと、前記ポリペプチド基質の開裂産物へのβ−セクレターゼ開裂を許容する条件下に前記反応システムを維持するステップと、前記基質のβ−セクレターゼ開裂の結果として作られたβ−セクレターゼ開裂産物の少くとも１つの量を検出するステップと、を含む方法。 15．テスト化合物を前記反応システムに導入するステップと、前記テスト化合物が、形成されたβ−セクレターゼ開裂産物の量に影響を与えるか否かを決定するステップと、を更に含む請求項14に記載の方法。 16．前記β−セクレターゼ及び前記ポリペプチド基質が別個に得られ、前記反応混合物に混合されることを特徴とする請求項14に記載の方法。 17．前記β−セクレターゼが、（１）細胞のソースから少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼ、及び（２）組換えβ−セクレターゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項16に記載の方法。 18．前記ポリペプチド基質が、細胞のソースから少くとも部分的に精製された β−アミロイド前駆タンパク質(APP)、（２）APP のβ−セクレターゼ開裂部位を含む組換えポリペプチド、及び（３）APP のβ−セクレターゼ開裂部位を含む合成ポリペプチドからなる群から選択されることを特徴とする請求項16に記載の方法。 19．前記反応システムが、単一の細胞のソースから少くとも部分的に単離された、ネイティブβ−セクレターゼ及びネイティブβ−アミロイド前駆タンパク質 (APP)を含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。 20．前記セクレターゼ及びAPP が細胞膜から抽出されることを特徴とする請求項19に記載の方法。 21．前記開裂産物がアミノ末端フラグメント及びカルボキシ末端フラグメントを含み、そして前記開裂産物が、前記フラグメントと、前記アミノ末端フラグメントのカルボキシ末端又は前記カルボキシ末端フラグメントのアミノ末端に特異的に結合する物質と、の間の結合を観察することにより検出されることを特徴とする請求項14に記載の方法。 22．前記フラグメントの形成が、サイズ及び／又は電気泳動移動度に基づいてフラグメントを分離するゲルにおいて検出されることを特徴とする請求項19に記載の方法。 23．テスト物質がβ−アミロイド前駆タンパク質（β-APP）のタンパク質分解による開裂を阻害するか否かを決定するための方法であって、 β−セクレターゼポリペプチドが、開裂を阻害する物質の欠如下でポリペプチド基質をアミノ末端フラグメント及びカルボキシ末端フラグメントに開裂するであろう条件下で、テスト物質の存在下で、APP のβ−セクレターゼ部位を含む基質ポリペプチドを、少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼポリペプチドに露出するステップと、前記β−セクレターゼ部位における前記ポリペプチドの開裂を検出するステップと、を含む方法。 24．前記基質ポリペプチド及びテスト物質の存在下にある前記少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼポリペプチドが、ヒト293 細胞からの可溶化されているが豊富化されていない膜画分のそれより少くとも10倍大きい活性を有することを特徴とする請求項23に記載の方法。 25．前記ポリペプチドの開裂が、前記アミノ末端フラグメント及び前記カルボキシ末端フラグメントの少くとも１つの形成を検出することにより決定されることを特徴とする請求項23に記載の方法。 26．前記フラグメントの形成が、該フラグメントと、前記アミノ末端フラグメントのカルボキシ末端又は前記カルボキシ末端フラグメントのアミノ末端に特異的に結合する物質と、の間の結合を観察することにより検出されることを特徴とする請求項25に記載の方法。 27．前記フラグメントの形成が、サイズ及び／又は電気泳動移動度に基づいてフラグメントを分離するゲルにおいて検出されることを特徴とする請求項25に記載の方法。 28．前記ポリペプチドが、β-APPの125 カルボキシ末端アミノ酸を含む配列を含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。 29．前記基質ポリペプチドが、結合性エピトープを有するアミノ末端部分及び β−セクレターゼ部位を有するカルボキシ末端部分を含む融合ポリペプチドであることを特徴とする請求項28に記載の方法。 30．前記基質ポリペプチドの開裂が、前記融合ポリペプチドのアミノ末端部分の捕獲及び該アミノ末端部分のカルボキシ末端の検出により検出され、ここで前記カルボキシ末端が該カルボキシ末端に特異的に結合する物質への結合を観察することにより検出されることを特徴とする請求項29に記載の方法。 31．テスト物質がβ−アミロイド前駆タンパク質（β-APP）のタンパク質分解による開裂を阻害するか否かを決定するための方法であって、 β−セクレターゼポリペプチドが、開裂を阻害する物質の欠如下でポリペプチド基質をMet-Asp 又はLeu-Asp 開裂部位間でアミノ末端フラグメント及びカルボキシ末端フラグメントに開裂するであろう条件下で、テスト物質の存在下で、AP P のβ−セクレターゼ部位を含む基質ポリペプチドを、少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼポリペプチドに露出するステップと、前記β−セクレターゼ部位における前記ポリペプチドの開裂を検出するステップと、を含む方法。 32．前記基質ポリペプチド及びテスト物質の存在下にある前記少くとも部分的に精製されたβ−セクレターゼポリペプチドが、ヒト293 細胞からの可溶化されているが豊富化されていない膜画分のそれより少くとも５倍大きい活性を有することを特徴とする請求項31に記載の方法。 33．前記ポリペプチドの開裂が、前記アミノ末端フラグメント及び前記カルボキシ末端フラグメントの少くとも１つの形成を検出することにより決定されることを特徴とする請求項31に記載の方法。 34．前記フラグメントの形成が、該フラグメントと、前記アミノ末端フラグメントのカルボキシ末端又は前記カルボキシ末端フラグメントのアミノ末端に特異的に結合する物質と、の間の結合を観察することにより検出されることを特徴とする請求項33に記載の方法。 35．前記フラグメントの形成が、サイズ及び／又は電気泳動移動度に基づいてフラグメントを分離するゲルにおいて検出されることを特徴とする請求項33に記載の方法。 36．前記ポリペプチドが、β-APPの125 カルボキシ末端アミノ酸を含む配列を含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。 37．前記基質ポリペプチドが、結合性エピトープを有するアミノ末端部分及び β−セクレターゼ部位を有するカルボキシ末端部分を含む融合ポリペプチドであることを特徴とする請求項36に記載の方法。 38．前記基質ポリペプチドの開裂が、前記融合ポリペプチドのアミノ末端部分の捕獲及び該アミノ末端部分のカルボキシ末端の検出により検出され、ここで前記カルボキシ末端が該カルボキシ末端に特異的に結合する物質への結合を観察することにより検出されることを特徴とする請求項37に記載の方法。 39．前記β−セクレターゼが、βAPP の695 −異性体におけるアミノ酸残基59 6 と597 との間を開裂することを特徴とする請求項31に記載の方法。 40．細胞中のβ−アミロイド前駆タンパク質の開裂を阻害するための方法であって、β−セクレターゼ活性を少くとも部分的に阻害するのに有効な化合物の量を前記細胞に投与することを含むことを特徴とする方法。 41．哺乳動物ホストにおいてβ−アミロイド前駆タンパク質の開裂を阻害するための方法であって、β−セクレターゼ活性を少くとも部分的に阻害するのに有効な化合物の量を前記ホストに投与することを含むことを特徴とする方法。