JPH09506777A

JPH09506777A - 熱安定性の水痘帯状疱疹ウイルス

Info

Publication number: JPH09506777A
Application number: JP7517570A
Authority: JP
Inventors: プロボスト，フイリツプ・ジエイ; ワズウオース，キヤシー・ウオレーン
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1993-12-21
Filing date: 1994-12-19
Publication date: 1997-07-08
Also published as: US5728386A; AU1375095A; AU687497B2; EP0736089A4; WO1995017503A1; CA2177060A1; EP0736089A1

Abstract

(57)【要約】熱安定性の水痘帯状疱疹ウイルス（ｔＶＺＶ）は水痘に対するワクチンの製造に有用である。ｔＶＺＶはストリンジェント熱不活化条件に耐えたウイルスの集団から選択した。生存し続けるウイルスを使用して種ウイルスを提供し、高い安定性をもつ新規ワクチンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称熱安定性の水痘帯状疱疹ウイルス発明の背景本発明はワクチン製造用の熱的に安定な水痘ウイルスの提供に関する。水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は水痘と帯状疱疹（帯状ヘルペス）を誘発する。水痘はＶＺＶ免疫をもたないヒトに発生する感染性の高い疾病である。個体の９０％以上は出生から２０年間に感染する危険がある。この疾病は免疫抑制療法を受けた患者や高年者に重大な脅威となっている。多くの場合、ＶＺＶは後根神経節細胞に潜伏する。ＶＺＶが潜伏状態から再活性化されると、疼痛性慢性症状である帯状ヘルペスが発症する。ワクチン接種による水痘の予防は望ましい目標であり、幼児期の生弱毒水痘ワクチン接種の義務化が検討されている。従来技術には種々の細胞培養系におけるＶＺＶの増殖とワクチンとしての生弱毒無細胞ＶＺＶの使用が報告されている。米国特許第３，９８５，６１５号はモルモット一次胚細胞で弱毒水痘ウイルスを作製したと記載している。この方法により作製されたウイルスはＶＺＶのＯｋａ株と呼ばれ、ワクチンで使用するのに適しており、ＡＴＣＣにＶＲ−７９５として寄託されているが、米国特許第３，９８５，６１５号及び他の公知方法（米国特許第５，０２４，８３６号及び４，０００，２５６号参照）によると、他の水痘株を使用して弱毒ＶＺＶを作製することもできる。米国特許第４，００８，３１７号はＷＩ−３８細胞でＶＺＶの温度感受性突然変異体を培養したと記載している。生育可能なＶＺＶの保存に有用な組成物（例えばＳＰＧＡ）も当業者に公知である（例えば米国特許第４，１４７，７７２号、４，０００，２５６号、４，３３７，２４２号及び４，３３８，３３５号参照）。ＶＺＶはヘルペスウイルスファミリーに属する。ＶＺＶは分離されており、小児の水痘感染を予防するために有効な生弱毒ウイルスワクチンとして提供されている（米国特許第３，９８５，６１５号、４，０００，２５６号、５，０２４，８３６号参照）。しかし、有効な不活化ＶＺＶワクチンは開発されておらず、ＶＺＶは室温で短時間に生育力を失う。従って、従来のＶＺＶワクチンには依然として凍結点未満の温度でウイルスを保存しければならないという問題がある。一般に、生弱毒ワクチンは凍結乾燥しても−１５℃又は−２０℃ といった低温で安定化培地で保存しなければならない。これらの条件下で生弱毒ワクチンの生育力半減期は約３６カ月である。−７０℃では半減期はもっと長い（数年間のオーダー）。しかしながら、開発途上国などでは温度に関係なくワクチンの冷凍自体が困難であり、生弱毒ワクチンを例えば４℃以上といったより高い温度で保存しなければならないので、ウイルスの生育力は非常に短期間に低下する。そこで、より安定な生弱毒ＶＺＶワクチンが必要とされている。本発明はこの必要に応えるものである。発明の概要熱不活化に耐えるウイルスの選択及び増殖により、熱安定性の生弱毒水痘帯状疱疹ウイルス（ｔＶＺＶ）を作製する。熱安定性のＶＺＶを作製することは従来予測できなかった。ｔＶＺＶは、固有の高い熱安定性をもつ新規生弱毒水痘帯状疱疹ウイルスワクチンを製造するために有用である。図面の簡単な説明図１：３５℃における本発明の新規ｔＶＺＶの熱安定性を示す直線回帰曲線。発明の詳細な説明水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は水痘の急性段階にある小児の丘疹から分離できる。こうして分離したＶＺＶを複数世代にわたってｉｎｖｉｔｒｏ継代培養し、生弱毒ウイルスを作製する。これは、参考資料として本明細書の一部とする米国特許第３，９８５，６１５号に従って実施することができる。本発明の１態様によると、当業者に公知の方法に従って培養及び弱毒化して得た生弱毒ＶＺＶワクチンを凍結乾燥する。その後、凍結乾燥ウイルスを長時間（約５〜１９日間）昇温（２５〜７５℃）する。この不活化サイクル後、生存している残留ウイルスを回収し、組織培養基で選択する。こうして選択したウイルスを次に当業者に公知の方法に従って増殖し、液体又は凍結乾燥状態で製剤化し、改善された熱安定性をもつ生弱毒ＶＺＶワクチン（以下、本文中ではｔＶＺＶと呼ぶ）として提供する。弱毒無細胞ＶＺＶは水痘を予防するワクチンとして有効であることが立証されている。この有効性は臨床試験を重ねることにより確証され、このような証明は今日では従来技術の一部となっている［例えばＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ，８８（３），６０４−６０７（１９９１）；Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，８７（５），６０４−６１０（１９９１）］。本発明は、熱安定ＶＺＶ即ちｔＶＺＶを提供し、安定なワクチンの製造にウイルスを容易に利用できるようにする点で、業界に多大な貢献を与えるものである。熱安定ＶＺＶを分離することは従来予測できなかった。本発明により作製されるｔＶＺＶは、当業者に公知の方法によりワクチンとして製剤化し、今日までに確立されている処方により投与することができる。例えば、本発明の生弱毒無細胞ｔＶＺＶ生成物を安定剤に希釈し、びんに充填し、約４℃以下、好ましくは約−２０℃で保存後、使用時に約１０００ＰＦＵの薬量を利用できるように単位薬量に分けて凍結乾燥する。本発明の方法により製造したＶＺＶワクチンを単位薬量製剤として使用し、ヒトに接種してＶＺＶビルレント株による感染に対する免疫応答を誘発することができる。最低約２０００ＰＦＵ／ｍｌ薬量（１０００ＰＦＵ／０．５ｍＬ薬量）を皮下又は筋肉内投与するのが好ましい。合計１５，０００〜２０，０００ＰＦＵまでの弱毒ＶＺＶ薬量を投与することができ、許容可能である。本発明のｔＶＺＶは熱安定性の生弱毒ＶＺＶワクチンを製造するのに有用である。血清反応陽性個体でＶＺＶに対する免疫応答を誘発するための免疫原を製造するのにも有用である。ｔＶＺＶは更に、ウイルスに高い熱安定性を与える原因となったゲノム変異を分析するためのツールとしても有用である。即ち、本発明のｔｖＺＶゲノムを制限フラグメント長の多型性（ＲＦＬＰ）に関して分析するか、又は当業者に周知の方法によりゲノムを配列決定する。こうして、この高い熱安定性を与えるゲノムの変異を確認する。ＶＺＶのワクチン製剤は当業者に周知である。例えば米国特許第３，９８５，６１５号によると、ＶＺＶは滅菌５％スクロース溶液中で製剤することができる。ＳＰＧＡ（０．２１８Ｍスクロース、０．００３７６ＭＫＨ₂ＰＯ₄、０．００７１ＭＫ₂ＨＰＯ₄、０．００４９Ｍグルタミン酸カリウム又はナトリウム、１％ヒト血清アルブミン）などのようにＶＺＶの安定性を更に強化する複雑な調合物も当業者に知られている。例えば米国特許第４，０００，２５６号はスクロース、アルブミン、グルタミン酸塩及びリン酸塩を含有する安定剤を開示している。また、米国特許第５，０２４，８３６号は、ＶＺＶと麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹ウイルスを安定剤中に含み、ウイルス安定性を改善するように含水率を２〜８％に維持した凍結乾燥組成物を開示している。これらの調合物を本明細書では医薬的に許容可能なキャリヤーと総称し、これらの特許の開示内容は参考資料として本明細書の一部とする。ｔＶＺＶと医薬的に許容可能なキャリヤーに加えて、他のワクチン種をも含む混合ワクチンも製造できる。例えば麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹をも含む４価ワクチン（Ｍ−Ｍ−Ｒ−Ｖ）も本発明に含まれる。非熱安定性の弱毒ＶＺＶを使用したこの種の併用は当業者に公知である［Ｄ’Ｈｏｎｄｔ，ＥＰ−Ａ−０２５２０５９；Ａｒｂｅｔｅｒら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，７６（増補）：７４２ −７４７（１９８６）参照］。また、ｔＶＺＶを公知ＤＴＰワクチン、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、ヘモフィルスインフルエンザｂ多糖ワクチン、肺炎連鎖球菌多糖ワクチンと組み合わせてもよい。これらの製剤並びに他の公知製剤法及びＶＺＶの保存方法は、本発明のｔＶＺＶを含むワクチンの製造に適用することができる。従って、本発明は１態様において改善された安定性をもつ生弱毒熱安定性水痘帯状疱疹ウイルス（ｔＶＺＶ）の製造方法を提供するものであり、該方法は、ａ）高不活化条件下で生弱毒ＶＺＶの凍結乾燥調製物を加熱する段階と、ｂ）残留する生ＶＺＶを選択及び培養する段階を含む。本明細書中において使用する「高不活化条件」とは、所与の調製物中で１／１００〜１／１０００，０００の範囲でしかウイルス粒子が生育可能状態で生存できないような条件での熱処理を意味する。好ましくは、生存率を約１／１５００とする不活化を使用する。別の態様において、３５℃の同一条件下で未処理ＶＺＶが７９％／時の不活化速度を有するのに比較して、約５０％／時の不活化速度をもつ熱安定性水痘帯状疱疹ウイルスを提供する。従って、本発明によると、本明細書の開示に基づき所与のＶＺＶ株での３５℃の不活化速度は約３８％（５０／７９×１００）低下すると予想できる。更に、ウイルスを−１５℃以下で凍結乾燥状態で保存すると、半減期が約３６カ月から約６０カ月へと、少なくとも比例的に増加することも本発明から予想される。付加的熱不活化を加え、より高い熱安定性のＶＺＶ分離株を選択して本発明の熱安定ＶＺＶを処理することにより、熱安定性を更に高めることができる。本発明で３５℃で実証されたｔＶＺＶの安定性の３８％の増加は、４℃、−２０℃又は−４０℃といった低温でｔＶＺＶを保存した場合にも少なくとも比例的に適用できると予想される。更に、参考資料として本明細書の一部とする米国特許第５，０２４，８３６号の教示に従って凍結乾燥製剤中の含水率を２〜４％にするなど安定化溶液又は保存条件を最適化し、本発明のｔＶＺＶの安定性を更に強化することができる。別の態様において、本発明はｔＶＺＶを使用して抗ＶＺＶワクチンを製造する方法を提供し、該方法は医薬的に許容可能なキャリヤー中に最低約１０００プラーク形成単位を提供することを特徴とする。別の態様はｔＶＺＶを含むワクチンである。水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）調製物の感染性力価は、Ｋｒａｈら，（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０，２７：３１９−３２６）に記載のアガロースゲルオーバーレイ又は液体オーバーレイ法により得られる。要約すると、この方法はＶＺＶ感染に感受性のＭＲＣ−５細胞を活性複製状態、即ち細胞が約５０〜８０％集密になる点まで培養する。次に最少容量のウイルスを細胞単層に重層し、細胞に付着させた後、付加的成長培地を加える。数日間増殖後、細胞をタンパク質株に暴露し、透明領域、プラークを計数する。従って、既知容量のウイルス接種材料に対する１ｍｌ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）数は、ウイルス収率の良好な尺度である。所与のウイルス調製物から得られた無細胞ウイルスの合計容量を乗じると、ＰＦＵの合計数を計算することができる。本発明の方法により作製したｔＶＺＶはブダペスト条約に基づいて１９９３年１１月１５日付けでＡＴＣＣに寄託し、受託番号ＶＲ２４３７、ＶＲ２４３８及びＶＲ２４３９を付された。以上の説明は、改善された熱安定性をもつ本発明のＶＺＶワクチンの製造方法を一般論として教示するものである。以下、実施例により本発明の実施方法を具体的に教示する。但し、本発明は実施例の特定記載に制限されると解釈すべきでない。実施例１熱不活化及び熱安定性ＶＺＶの回収本出願人のＶａｒｉｖａｘ（登録商標）、ロットＣＲ４５３の無傷の未再構成バイアル５００個を５０℃に１２日間加熱した。加熱した全５００個のバイアルは、分析中−２０℃で保存した。その後の分析の結果は以下の通りであった。１．残留生ウイルスの力価は２．４ＰＦＵ／ｍｌ、標準非加熱ＣＲ４５３バイアルの力価は３８３０ＰＦＵ／ｍｌであった。従って、この熱不活化条件下で生育可能なＶＺＶは９９．９４％減少した。そこで、これと同様の処理を本明細書中では「高不活化条件」と定義する。２．ドットブロットアッセイによる合計ＶＺＶ抗原は加熱ワクチンでは９．８単位／ｍｌであった。標準非加熱ワクチンを同時に試験した処、９．４単位／ｍｌであった。１９８７年に最初に分離された時の値は９．５単位／ｍｌであったとされている。３．ウェスタンブロット：このアッセイによると、加熱ＣＲ４５３と非加熱ＣＲ４５３の間に肉眼で検出可能な相違は認められなかった。ヒト帯状疱疹血清（ポリクローナル抗ＶＺＶ血清）とウイルス糖タンパク質１に対するマウスモノクローナル抗体の両者を使用した。実施例２熱処理から回収した水痘ウイルスの安定性増加の実証実施例１に記載したように調製した熱不活化ＣＲ４５３のバイアル４個と標準ＣＲ４５３のバイアル１個を各々滅菌蒸留水０．７ｍｌで再構成し、氷上においた。各熱不活化バイアルから０．５ｍｌ（１．２プラーク形成単位と推定）及び非加熱バイアルから０．５ｍｌ（１９１５プラーク形成単位と推定）を使用し、各分離株当たり５個のプレートを用いて培養中のＭＲＣ−５細胞に６０ｍｍプレート当たり０．１ｍＬの割合で接種した。使用した培地はウシ胎児血清２％とネオマシイン及び２ｍＭグルタミンを含有するＥＭＥＭであった。０．２４ＰＦＵ／０．１ｍＬの既知力価に基づき、上記条件下で加熱ＶＺＶを接種した各プレートは１プラーク形成単位以下の生ＶＺＶを受容すると予想された。これらのサンプルを下表１に要約するように５世代継代培養し、その要点を以下に述べる。継代段階１，Ｐ１各ウイルス継代段階で接種する前にＭＲＣ−５細胞をほぼ集密まで培養増殖した。Ｐ１では５個の６０ｍｍプレートから構成される細胞培養組（各ＶＺＶ分離株当たり１組）から培地を吸引し、各プレートに０．１ｍｌ／プレートのウイルスサンプルを接種した。培養物を３５℃、５％ＣＯ₂下で１時間インキュベートし、５ｍＬ／プレートの培地を補充した。７日後にプレートを顕微鏡走査し、ＶＺＶプラークが形成されたかどうかを調べた（細胞変性効果、ＣＰＥ）。加熱バイアル１〜４からのＶＺＶ材料を接種したＰ１プレートは検出可能なＣＰＥを示さなかった。標準ＶＺＶを接種したプレートは９０％ＣＰＥであった（各継代段階の未接種プレートはＣＰＥがゼロであった）。各プレート組をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌ／プレートのトリプシンを加えて回収し、５分間インキュベートした。各５個組プレート（即ち分離株１のプレート５個、分離株２のプレート５個、以下同様）から細胞を取り出し、プールした。各分離株のプール細胞をペレット化し、上清を吸引した。次に培地（２５ｍＬ）をペレット化細胞に加え、Ｐ１懸濁液を形成し、これを用いてＭＲＣ−５プレートに接種し、継代段階２を形成した。継代段階２，Ｐ２ＭＲＣ−５細胞から培地を吸引後に、各分離株当たり５個の６０ｍｍプレートに各々Ｐ１細胞懸濁液５ｍＬを接種した。５日後にプレートを顕微鏡走査した。加熱バイアル１〜３からのプレートは各々１〜３個の可視プラークを示した。加熱バイアル４のＶＺＶを接種したプレートはＣＰＥの徴候を示さなかった。非加熱ＶＺＶを接種したプレートは９０％ＣＰＥであった。各プレート組をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄した後、トリプシン０．５ｍＬで処理した。各組毎に３個のプレートから細胞をプールし、ペレット化し、凍結希釈剤（ＥＭＥＭ、１５％ＤＭＳＯ、１０％ウシ胎児血清）６ｍＬに再懸濁し、分取し、１ｍＬアリコートにして液体窒素中で保存した。各組２個の残りのプレートをプールし、ペレット化し、培地（２０ｍＬ）に再懸濁してＰ２懸濁液を形成し、これを使用してＭＲＣ−５プレートに接種し、継代段階３を形成した。継代段階３，Ｐ３ＭＲＣ−５細胞から培地を吸引後に、各分離株当たり４個の６０ｍｍプレートに各々Ｐ２分離株５ｍＬを接種した。３日後にプレートを顕微鏡走査した。加熱バイアル１〜３からのプレートはそれぞれ４０％、２０％及び２０％ＣＰＥであった。加熱バイアル４のＶＺＶを接種したプレートはＣＰＥの徴候を示さなかった。非加熱ＶＺＶを接種したプレートは２０％ＣＰＥであった。各プレート組をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄した後、トリプシン０．５ｍＬで処理した。各組毎に５ｍＬ／プレートの培地を使用して全細胞をプールし、ペレット化し、凍結希釈剤（ＥＭＥＭ）１５％ＤＭＳＯ、１０％ウシ胎児血清）６ｍＬに再懸濁し、分取し、１ｍＬアリコートにして液体窒素中で保存し、Ｐ３ストックを形成し、Ｐ４で細胞に接種するのに使用した。継代段階４，Ｐ４２個の１５０ｃｍ²フラスコに解凍したＰ３分離株１ｍＬを接種した（但し分離株４はＰ３までにＣＰＥが現れなかったので使用しなかった）。３日後に加熱分離株１〜３を接種したフラスコは各々７０％ＣＰＥであった。非加熱ＶＺＶ分離株Ｐ３を接種したフラスコは４０％ＣＰＥであった。各フラスコをリン酸緩衝塩類溶液で３回濯ぎ、吸引し、各フラスコにトリプシン５ｍＬを加えて３５℃で５分間インキュベートすることにより細胞を回収した。各組のフラスコからの細胞をペレット化し、培地３０ｍＬに再懸濁し、Ｐ４ストックを形成し、Ｐ５で細胞に接種するのに使用した。継代段階５，Ｐ５各組６個からなる１５０ｃｍ²フラスコ組にフラスコ当たり５ｍＬのＰ４懸濁液を接種した。２日後に、分離株１〜３を接種したフラスコは各々５０〜６０％ＣＰＥであったが、標準Ｐ４ＶＺＶを接種したフラスコは各々約４０％ＣＰＥであった。各フラスコをリン酸緩衝塩類溶液で３回洗浄し、吸引した。ＶＺＶ安定化溶液（７ｍＬ）を各フラスコに加え、細胞を掻き取った後、５０ｍＬ遠心管毎に１５ｍＬずつ分取することにより回収した。次に各管を５分間超音波処理し、次いで２２００ｒｐｍで１０分間遠心した。各組からの上清をプールし、２．５ｍＬアリコートとして分取し、−７０℃で凍結した。各分離株と標準ＣＲ４５３のウイルス増殖に関する上記記載を表１に要約する。各継代段階における各加熱分離株の増殖は似通っていることが判明した。継代５で調製した分離株１、２及び３と標準ＣＲ４５３のウイルスストックを回収し、音波処理無細胞ウイルスとして−７０℃で保存した。分離株４は細胞変性（ＣＰＥ）が現れなかったため、継代３で増殖を打ち切った。各ストックのプラーク形成単位数を測定するために、プラークアッセイを行った。ウイルスストック力価分離株1(tVZV1) 86,200pfu/ml 分離株2(tVZV2) 69,000pfu/ml 分離株3(tVZV3) 10,840pfu/ml 対照453 35,000pfu/ml ＡＴＣＣに寄託するために、各ｔＶＺＶ分離株のＰ５ウイルスを継代段階６まで継代培養し、１ｍＬアリコートとして凍結した。ｔＶＺＶ１はＡＴＣＣ番号ＶＲ２４３７を付された。ｔＶＺＶ２はＡＴＣＣ番号ＶＲ２４３８を付された。ｔＶＺＶ３はＡＴＣＣ番号ＶＲ２４３９を付された。安定性分析ウイルスストックの各分離株（ｔＶＺＶ１、ｔＶＺＶ２、ｔＶＺＶ３、及び対照非加熱ＣＲ４５３）毎にＰ５材料を３５℃で安定化溶液で１：２０に希釈し、３５℃でインキュベートした。０時間、０．５時間、１．０時間、１．５時間、２．０時間、２．５時間及び３．０時間の時点で各希釈分離株からサンプルを取り出した。アリコートを凍結し、−７０℃で保存した。次に各時点からのサンプルをプラークアッセイで試験し、安定性を測定し、比較した。こうして６回の反復安定性アッセイを実施し、各分離株及び対照ワクチンの劣化速度を決定した。３種のｔＶＺＶは類似の劣化速度をもつことが明らかである（表２及び図１参照）。６回の安定性アッセイの平均値は、分離株間に有意差が存在しないことを示す（劣化速度＝５０％／時）。他方、対照ワクチンＣＲ４５３の劣化速度は７９％／時であった。凍結乾燥状態で対照ワクチンは３０ ℃で約２８％／日の速度で生育力が低下する。凍結乾燥ｔＶＺＶではこの速度は約３８％遅れると予想される（５０／７９、即ち１日当たりの低下は約１７％に止まる）。各分離株の傾きは、各安定性アッセイで対照ワクチンと比較すると一貫して低い劣化速度を示した。実施例３ＶＺＶ収率測定アッセイＫｒａｈら，（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０，２７：３１９− ３２６）により記載されているアガロースオーバーレイ又は液体オーバーレイ法を使用して水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）調製物の感染性力価を推定した。液体オーバーレイ及びアガロースオーバーレイ法のアッセイは次のように実施する。１０００ｍｇ／Ｌガラクトース、５０μｇ／ｍＬネオマイシン、２ｍＭＬ− グルタミンを含むＢＭＥ（Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液を補充した基礎イーグル培地）５ｍＬ容量中に６×１０⁵個の割合でＭＲＣ−５細胞を６０ｍｍ組織培養プレートに接種し、５％ＣＯ₂雰囲気下で３５℃でインキュベートする。２４〜４８時間インキュベーション後に細胞は５０〜８０％集密に達する。成長培地を吸引除去し、ＳＰＧＡ緩衝液又は液体保存培地（ＬＭＭ）などの適当なウイルス希釈剤で希釈したＶＺＶ溶液１００μｌで細胞に感染させる。ＳＰＧＡ緩衝液は７．５％（ｗ／ｖ）スクロース、１１ｍＭリン酸カリウム、０．１％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム及び１％ヒト血清アルブミンを含む。ウイルスを５％ＣＯ₂ 雰囲気下で３５℃で＞１時間付着させる。次にＶＺＶに感染した細胞培養物にアガロースオーバーレイ培地（ＡＯＭ）又は液体保存培地（ＬＭＭ）５ｍＬを重層する。アガロースオーバーレイ培地は、液体オーバーレイ培地（ＬＯＭ）とアガロース溶液の２種の溶液の混合物である。ＬＯＭはイーグル塩を補充した最少必須培地（ＭＥＭ）、２％熱不活化ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬ硫酸ネオマイシン及び２ｍＭＬ−グルタミンを含有する。アガロース溶液は低ゲル化温度アガロース４．５ｇをＭＥＭ１００ｍＬ中で１５分間１２１℃に加熱し、溶液を４５℃まで冷却することにより調製する。ＡＯＭはアガロース溶液１容量を４５℃でＬＯＭの１．２５倍濃縮液４容量と混合することにより調製する（液体オーバーレイ法では１倍濃度のＬＯＭを使用するので、加熱又は冷却は不要である）。プレートを２３〜２５℃まで冷却してＡＯＭを凝固させる。培養物をインキュベートしてプラーク形成させる。６〜７日後に、ＡＯＭを接種したプレートにリン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）５ｍＬを重層し、ガラスパスツールピペットで縁からアガロースを引き外す。ＬＭＭを接種したプレートから培地を吸引する。エタノール−１％酢酸中の０．２％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーＲ−２５０の溶液で細胞を染色することによりプラークを可視化する。プラーク計数値は４〜５個の反復プレートの平均であり、ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として表す。実施例４水痘帯状疱疹ウイルスのドットブロット定量アッセイ下記手順でＶＺＶ抗原を定量することができる。この手順はＸ線フィルムを使用するのでなく、反応したドットブロット中の放射能の実測毎分計数を測定することにより達せられる。この手順は清澄化計量ＶＺＶワクチンバルクサンプル中の合計ＶＺＶ抗原の推定を目的とする。材料と試薬Ａ．装置１．約8"×12"×1.5"のポリスチレンばね止め箱。２．ロッカープラットフォーム（Bellco Glass Co.，Model 6-044）。３．ニトロセルロース（ProMega Biotec，気孔寸法0.45μm，15×15cm）。４．4℃冷蔵庫又は冷蔵室。５．使い捨て先端付き0〜100μl分配用ピペッター。６．容積1.5mlの使い捨てポリプロピレンマイクロ遠心管。７．¹²⁵Ｉの計数に適したγカウンター。８．γカウンター用使い捨て試験管。Ｂ．試薬１．リン酸緩衝塩類。２．ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）Bio-Rad Catalog #161-0302。３．Nonidet NP-40（Sigma No.N6507）。４．ウシ胎児血清（FCS）。５．アルブミン、ウシフラクションＶ（BSA）Calbiochem # 12659。６．ナトリウムアジド（Sigma）。７．¹²⁵ＩプロテインＡ 0.1mCi/ml（Amersham）。製造日から１カ月以内に使用すること。８．−70℃で保存したVZV参照抗原(VZV Lot 851)。９．VZV陽性抗血清（O.L.I.高力価帯状疱疹血清、標識HSV143-80 O.I.,8/20/8 0）。ヒト。 10．集密MRC-5細胞の回転瓶4本。 11．Whatman 46cm×57cm - 3mm濾紙（ブロッティング紙）（カタログ#3030917 ）。 12．Triton X-100(TX-100)('Sigma No.T6878)。 13．VZV陰性対照抗原。Ｃ．試薬の調製１．停止緩衝液（Ｑ緩衝液）。ａ．RCM8 3L ｂ．SDS 6g ｃ．ナトリウムアジド0.6g ｄ．BSA 70g ｅ．Nonidet NP-40 30ml。２．1%FCSを含む停止緩衝液（ブロッキング緩衝液）。ａ．停止緩衝液50ml＋FCS 0.5ml。３．0.05% Triton X-100を含むRCM8。４．抗血清：O.L.I.ヒト帯状疱疹血清ａ．Ｑ緩衝液50mlで1:2500に希釈。５．MRC-5細胞抽出物の超音波処理：4本の回転瓶を各瓶5mlのRCM8で洗浄した後、全4本のびんを10mlのRCM8で濯ぎ、全部をプールする。4℃まで冷却し、3分間超音波処理し、RCM8を加えてで40ccとする。６．¹²⁵ＩプロテインＡ溶液：125μlをＱ緩衝液50mlで希釈（0.25μCi/ml）。手順Ａ．第１日１．超音波処理したMRC-5細胞抽出物（細胞溶液）を調製し、2枚のニトロセルロースシート［20cm×40cm（ブロッキング紙）］と共にばね止め箱に入れる。２．4℃で約3時間震盪する。３．停止緩衝液50mlを加えて更に1時間震盪する。４．抗体希釈液を調製し、ブロッキングシートを細胞溶液から取り出し、ブロッキングシート1枚を抗体溶液に入れる。4℃で一晩震盪する。注：ステップ１〜４はアッセイを行う数日前に実施することができ、ブロッキングした抗血清を4℃で保存する（この場合は、ブロッキングシートを取り出し、一晩震盪後にシートを廃棄する）。Ｂ．第２日５．Triton X-100を未希釈試験サンプルに0.05％まで加える。全サンプルをカバーするようにニトロセルロースシート上に碁盤目を描く（アタッチメントIII ）。0.05％ TX-100を含有するRCM8で参照ワクチン（851）と陰性対照を1:8に希釈する。2倍ずつ1:64まで順次希釈する。希釈比を1:16と1:32のみとする以外は同様に試験サンプルを希釈する。各希釈液毎に５μｌの抗原をニトロセルロースの碁盤目に２個ずつスポットする。15分間室温で乾燥する。６．1％FCSを含むＱ緩衝液にニトロセルロース試験シートを入れ（ゆっくりと均等に浸漬させ）、4℃で1.5〜18時間震盪する。７．抗体溶液からブロッキングシートを取り出し、試験ニトロセルロースシートを抗体溶液に入れて一晩4℃で震盪する。Ｃ．第３日８．20分毎に緩衝液を交換しながらニトロセルロースを震盪機上で停止緩衝液で約2時間洗浄する。各洗浄毎に約50mlを使用する。９．排液し、Ｑ緩衝液中の[¹²⁵Ｉ]プロテインＡ 50mlを試験シートに加え、2 時間震盪機で震盪する。全放射性材料を適当な放射線廃棄容器に入れて廃棄する。 10．10分毎に緩衝液を交換しながら試験シートをＱ緩衝液で約1.5時間洗浄する。最初の4回の洗浄液を放射線廃棄容器に入れて廃棄する。 11．試験シートをブロッティング紙でブロットする。 12．碁盤目に沿って試験シートを切断し、各希釈液のブロットを標識試験管に入れる。 13．¹²⁵Ｉγカウンターを用いて各試験管を1分間計数する。 14．結果の計算：標準抗原は26単位/mlのVZV抗原をもつ。1:8、1:16、1:32及び1:64の希釈比では3.25、1.63、0.81及び0.40単位/mlの抗原をもつ。既知の各抗原濃度で得られた平均c.p.m.をプロットすることによりアッセイの各回の標準曲線が求められる。試験サンプル中の抗原濃度は、各試験希釈比における平均c. p.m.に対応する横座標上の抗原濃度を求めることにより得られる。最終抗原推定値は各試験希釈比で得られた値の平均である。希釈比の適当な補正により未希釈試験サンプルの抗原値を計算する。上記手順では対照として各試験でMRC-5抗原を用いる。実際に、MRC-5ブロットは低いc.p.m.しか検出されなかったので、試験抗原c.p.m.の補正は行わなかった。実施例５ＶＺＶ抗原の定量のためのＥＬＩＳＡ迅速なＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡによりＶＺＶ抗原量を測定し、生水痘ワクチンの製造中にウイルス成長をモニターすることができる。また、この試験を使用して清澄化超音波処理ワクチンバルク中のＶＺＶ抗原量を推定し、潜在的に凍結乾燥ワクチンを充填したバイアル中の抗原を測定することができる。要約すると、このアッセイは試験サンプルからのＶＺＶ抗原を溶液中で抗ＶＺＶ血清と共にインキュベートすることにより行われる。残留する遊離抗体をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに固定したＶＺＶ抗原と結合させる。プレートに結合することが可能な抗体の量は試験サンプル中の抗原量に反比例する。プレートと結合する抗体は、酵素に関連する抗ヒト抗体及び適当な基質との反応により生じた着色生成物を分光分析して定量する。ＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡとＶＺＶプラークアッセイは一般に相関データを提供するはずであるが、ＶＺＶ抗原アッセイは生育可能なＶＺＶと共に生育不能なＶＺＶも検出することに留意されたい。死滅したＶＺＶにより生じる免疫応答が生弱毒ウイルスへの応答ほど有効であることは示されていないので、プラークアッセイはＶＺＶワクチンのウイルス接種材料薬量の決定に重要なアッセイである。他方、抗原アッセイもＶＺＶワクチンレシピエントに投与されている合計抗原薬量の尺度を提供するので有用である。試験手順１．ＶＺＶ感染又は非感染ＭＲＣ−５細胞からの糖タンパク質（ｇｐｓ）でＥＬＩＳＡプレートを被覆し、ウシ血清アルブミン［フラクションＶ，＃Ａ−９６４７，Ｓｉｇｍａ］、０．１％ＮａＮ₃でオーバーコートし、抗体の非特異的プレート吸着を減らす。１行置きにＶＺＶ又は対照抗原で被覆する（即ちＡ、Ｃ、Ｅ及びＧ行はＶＺＶｇｐで被覆し、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ行は非感染ＭＲＣ−５ｇｐ抗原で被覆する）。２．清澄化（３２５０ｇ−分）試験抗原を１２×７５ｍｍ管又はマイクロ管に入れて安定剤で希釈する。標準ウイルス抗原調製物（ドットブロットアッセイによるとＶＺＶ抗原２６単位／ｍＬ）を１：１０に希釈した後、１：１．２５倍ずつ順次希釈し、２．６、２．１、１．７、１．３、１．１、０．９単位／ｍＬの抗原濃度を提供する。更に希釈して０．７及び０．５単位／ｍＬの抗原濃度としてもよい。この希釈系を使用して試験サンプル中の抗原量の測定用標準曲線を作成する。３．ヒト抗ＶＺＶ血清を安定剤で所望の最終希釈比の２倍まで希釈する。４．希釈抗原３００ｍｌ容量をマイクロ管に分配し、希釈抗ＶＺＶ血清３００ｍｌと混合し、３５℃で１５〜２２分間インキュベートする。対照はヒト抗ＶＺＶと希釈剤を含む（抗原は含まない）。５．各血清−抗原混合物からの１００ｍｌのアリコートをＶＺＶ糖タンパク質（ＶＺＶｇｐ）で被覆したウェル２個と２ＭＲＣ−５ｇｐで被覆したウェル２個に加える（各サンプルにウェル４個）（例えば１列Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ行にサンプル１、２列Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ行にサンプル２、以下同様）。６．プレートを１５＋１分間３５℃でインキュベートし、（溶液中の抗原と結合していない）遊離抗体をプレートに固定したウイルス抗原と結合させる。７．未結合抗体を洗浄して除去し、アルカリホスファターゼとヤギ抗ヒトＩｇＧの結合体をウェルに加え、結合したヒト抗体を検出する。８．１５＋１分間３５℃でインキュベーション後、未結合の結合体を洗浄して除去する。ジエタノールアミン緩衝液に溶解したリン酸ｐ−ニトロフェニル基質と共に３５℃で１５分間インキュベートして結合した結合体を検出する。９．各ウェル５０ｍｌの３ＭＮａＯＨを加えて基質反応を停止した後、マイクロプレート分光光度計を使用して発色（４０５ｎｍの光学密度）を定量する。１．試験計算及び解釈ＶＺＶ及びＭＲＣ−５で反復被覆したウェルのそれぞれの反復光学密度値を平均する。実験の結果、ＭＲＣ−５の光学密度はサンプル及び希釈比を変えても一定していることが判明した。そこで、全プレートのＭＲＣ−５値を平均し、一次抗体又は結合体と非感染細胞抽出物との非特異的結合を補正するために使用する。それぞれの平均ＶＺＶの光学密度から平均ＭＲＣ−５光学密度を差し引くと、ＶＺＶ特異的光学密度（ΔＯＤ）値が得られる。２．抗原量の測定用標準曲線の作成標準曲線ΔＯＤ値を既知抗原濃度（ＶＺＶ単位／ｍＬ）に対してプロットする。データを適当なグラフィックスプログラム（例えばＣｒｉｃｋｅｔＧｒａｐｈｖｅｒｓｉｏｎ１．３，ＣｒｉｃｋｅｔＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）に入力し、曲線の直線部分を確認し（少なくとも４点を含む）、「線適合式」（ｙ＝ａ＋ｂｘ）を得る。３．試験サンプルの抗原量の計算ａとｂの値は線適合式により与えられ、ｙ（ΔＯＤ）は既知である。こうして抗原単位／ｍＬを表す残りの未知値ｘを計算することができ、サンプル希釈比により補正すると、未希釈サンプルの抗原濃度が得られる。報告した抗原濃度は標準曲線の直線部分の範囲内でΔＯＤを提供する最希薄サンプルで得られた濃度である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者ワズウオース，キヤシー・ウオレーンアメリカ合衆国、ニュー・ジャージィ・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．改善された安定性をもつ生弱毒熱安定性水痘帯状疱疹ウイルス（ｔＶＺＶ）の製造方法であって、ａ）高不活化条件下で生弱毒ＶＺＶの凍結乾燥又は液体調製物を加熱する段階と、ｂ）残留生ＶＺＶを選択して培養する段階とを含む前記方法。２．請求項１に記載の方法により得られる生弱毒ｔＶＺＶ。３．液体培地中で３５℃で約５０％／時に等しい不活化速度をもつ熱安定性の水痘帯状疱疹ウイルス。４．請求項２に記載のｔＶＺＶを使用して抗ＶＺＶワクチンを製造する方法であって、ワクチン接種日に医薬的に許容可能なキャリヤー中に最低約１０００プラーク形成単位のウイルスを利用可能とするに十分なｔＶＺＶを提供することを特徴とする方法。５．請求項３に記載のｔＶＺＶを使用して抗ＶＺＶワクチンを製造する方法であって、ワクチン接種日に医薬的に許容可能なキャリヤー中に最低約１０００プラーク形成単位のウイルスを利用可能とするに十分なｔＶＺＶを提供することを特徴とする方法。６．請求項２に記載のｔＶＺＶを含むワクチン。７．請求項３に記載のｔＶＺＶを含むワクチン。８．ＡＴＣＣＶＲ２４３７、ＡＴＣＣＶＲ２４３８又はＡＴＣＣＶＲ２４３９から分離されたウイルス。９．液体培地中３５℃でｔＶＺＶの選択源であるＶＺＶ集団よりも約３８％遅い不活化速度をもつｔＶＺＶ変異体の獲得方法であって、ａ）ほぼ全ＶＺＶを不活化する条件下で生弱毒ＶＺＶの凍結乾燥又は液体調製物を加熱する段階と、ｂ）残留生ＶＺＶを選択して培養する段階とを含む前記方法。１０．請求項９に記載の方法により得られたｔＶＺＶを含むワクチン。１１．請求項９に記載の方法により製造したｔＶＺＶを含む多価ワクチン。１２．選択したウイルスを１〜６継代培養する請求項１に記載の方法。１３．所与のＶＺＶ分離株で得られるよりも高い固有の熱安定性をもつＶＺＶの製造方法であって、ａ）ほぼ全ＶＺＶを不活化する条件下で生弱毒ＶＺＶの凍結乾燥又は液体調製物を加熱する段階と、ｂ）残留生ＶＺＶを選択して培養する段階とを含む前記方法。