JPH09507490A

JPH09507490A - 増殖性障害、転移および薬物耐性腫瘍の治療用バナジン酸塩化合物

Info

Publication number: JPH09507490A
Application number: JP7518749A
Authority: JP
Inventors: クルーズ，トニー
Original assignee: マウント・サイナイ・ホスピタル・コーポレイション
Priority date: 1994-01-18
Filing date: 1995-01-18
Publication date: 1997-07-29
Also published as: WO1995019177A1; CN1140997A; CA2181444A1; NZ278028A; BR9506619A; AU1410795A; US5843481A; EP0740551A1; MX9602846A

Abstract

(57)【要約】本発明は、バナジン酸塩化合物またはバナジン酸塩化合物の誘導体またはアナログの抗増殖剤および抗転移剤としてのおよび／または動物における薬物耐性腫瘍を治療するための用途、かかる用途に適合するバナジン酸塩化合物を含有する組成物、増殖性障害の治療方法、腫瘍の転移能を減少させる方法、および薬物耐性腫瘍の治療方法に関する。また、本発明は細胞増殖に影響を及ぼす物質の試験方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】増殖性障害、転移および薬物耐性腫瘍の治療用バナジン酸塩化合物発明の分野本発明は、バナジン酸塩化合物またはバナジン酸塩化合物の誘導体またはアナログの抗増殖剤および抗転移剤としてのおよび／または動物における薬物耐性腫瘍を治療するための用途、かかる用途に適合するバナジン酸塩化合物を含有する組成物、増殖性障害の治療方法、腫瘍の転移能を減少させる方法、および薬物耐性腫瘍の治療方法に関する。また本発明は、細胞増殖に影響を及ぼす物質の試験方法に関する。発明の背景癌は毎年世界中の推定５９０万人を冒す世界的課題である。多数の型の癌があり、北米で最も一般的なもののいくつかには、乳癌、肺癌、結腸癌およびリンパ管癌が含まれる。ここ３０年間で化学療法は癌患者の生存率に好ましい影響を及ぼしているが、ほとんどのヒト癌は化学療法に対して耐性であるか耐性となる。したがって、より有効で薬物耐性腫瘍に作用しうる抗癌薬が大いに必要とされている。癌細胞の２つの重要な特徴は、腫瘍形成および増殖につながるその異常増殖能、および転移につながる他の組織への侵入能である。特定の遺伝子に対する遺伝的損傷がヒトにおける細胞の形質転換および癌の発生の原因となると考えられている。ヒト癌細胞で見いだされている遺伝的損傷は、２つの型に分類できる。その第１は、連続的な癌原遺伝子活性化につながる癌遺伝子の突然変異を含む。その第２は、腫瘍抑制遺伝子の機能喪失につながる腫瘍抑制遺伝子の突然変異を含む。癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に対する遺伝的損傷は、刺激の非存在下で癌遺伝子活性化に、また非制御細胞増殖につながる。損傷は、種々のヒト悪性癌においてある程度一貫して１つまたは別の癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子で見いだされている。２個の癌遺伝子転写因子ｆｏｓおよびｊｕｎが、細胞増殖および特に多数の腫瘍細胞系での細胞増殖に関与する遺伝子の誘導に関与しており、これに必要であることが示されている。これら２個の遺伝子の発現の阻害は、細胞増殖の阻害につながる。癌の最も生命を脅かす側面の１つは転移の発生である。一般に、ほとんどの固形腫瘍は主要部位から外科的に除去でき、局所的に治癒する。しかし、癌細胞が血管チャンネルに侵入し異なる器官に転移すれば、完全治癒の可能性は減少する。したがって、癌細胞の転移性を減少させる薬剤があれば癌の治療に有用である。転移において重要な役割を果たしていると考えられる細胞過程には、細胞接着の増大、宿主組織の腫瘍細胞タンパク質分解、腫瘍細胞移動およびコロニー形成が含まれる。これらの過程は連続的に起こる。第１に、基底膜中のコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどのリガンドに対してインテグリンおよび非インテグリン型の表面受容体を介して腫瘍細胞が基底膜に接着する。接着後、基底膜の溶解の局所域は細胞接着点で生じる。腫瘍細胞は、基底膜を分解し宿主器官への腫瘍細胞の湿潤および移動を許容するコラゲナーゼ、ゲラチナーゼなどの分解酵素を生成し分泌する。腫瘍攻撃性と細胞が侵入過程に関与する１群の酵素、マトリックスメタロプロテアーゼを生成する能力との間には正の相関がある。メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼなどのある種のプロテアーゼの阻害が侵入および転移を防ぐことが示されている（アルバレズ（Alvarez）ら、1990．J．Na t．Cancer Inst．82: 589-595; シュルツ（Schultz）ら1988、Cancer Res．48， 5539-5545、およびワン（Wang）およびスターンズ（Stearns）1988、Cancer Res ．48，6262-6271）。チオ硫酸塩または亜硫酸塩化合物と組み合わせたバナジル、バナジン酸塩などのイオン性バナジウム化合物が老年の悪性腫瘍、動脈硬化症および精神性症候群の治療に有用であると報告されている（カプラン（Kaplan）に対する米国特許第５,０４５,３１６号）。カプラン（Kaplan）は、バナジルまたはバナジン酸塩０ .００４３ｍｇ／ｋｇ〜０.１４ｍｇ／ｋｇの１日用量を開示する。開示されている治療におけるバナジン酸塩およびチオ硫酸塩の作用機構についてはカプランは全く開示していない。カプランの特許の発明の背景において、バナジウム塩が抗腫瘍作用を有することがカプラン以外の者により報告されており、食餌性硫酸バナジルがラットにおいて化学的に誘導された乳房発癌を抑制すると報告されていることが開示されている。サクセナ（Saxena）ら（Biochem．Pharmacology 45(3): 539-542，1993）は、対照およびアロキサン糖尿病ラット肝臓の抗酸化状態に対するバナジン酸塩のインビボ効果について検討した。飲料水中のオルトバナジン酸塩０.６ｍｇ／ｍｌを糖尿病ラットに投与した。本発明者がオルトバナジン酸塩０.５ｍｇ／ｍｌの動物への経口投与が胃毒性につながることを見いだした（本明細書中実施例９参照）ことは注目されるべきである。 β−カロテン、α−トコフェロール、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオンなどの抗酸化剤は、抗癌活性を有すると報告されている（ジー・シュクラー（G ．Shklar）ら、Nutrition and Cancer，1993，p.145）。また、抗酸化剤（β− カロテン、dl−α−トコフェロール酸スクシナート（ビタミンＥ）、ビタミンＣおよび還元型グルタチオン）の混合物がインビボ癌モデルにおける発癌の予防に非常に有効であり、癌化学予防剤としての該混合物の個々の成分より有効であったと開示されている。発明の概要本発明者は、細胞内のスーパーオキシドまたはＨ₂Ｏ₂の濃度がｆｏｓおよびｊｕｎ発現の誘導において重要な役割を果たしていることを見いだした。ジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ）でＨ₂Ｏ₂の生成を阻害することにより、またはＮ−アセチルシステイン、オルトバナジン酸塩などの細胞内還元剤の濃度を増加させることによりＨ₂Ｏ₂濃度を減少させることは、ＩＬ１、アラキドン酸などの因子に応答したｆｏｓおよびｊｕｎ発現を完全に阻害することが示された。検討したすべての条件下、ｆｏｓおよびｊｕｎ発現の阻害によりコラゲナーゼ発現が阻害された。また本発明者は、オルトバナジン酸塩およびそのアナログが、正常非増殖性細胞に対し非毒性な濃度において、増殖性細胞系に対し非常に毒性であることを見いだした。これは、オルトバナジン酸塩が化学療法剤として有用であり得ることを示すものである。また、本発明者は重要なことに、オルトバナジン酸塩がコルヒチン、ビンブラスチン、ドキソルビシンなどの通常の薬物に耐性の細胞系に作用することを見いだした。これは、該薬物が薬物耐性腫瘍の治療に有用であることを示すものである。薬物耐性癌細胞から化学療法剤を通常に除去する機構は該バナジン酸塩化合物を認識しない。また、オルトバナジン酸塩およびそのアナログが、インビボ動物モデル（ＭＤＡＹ−Ｄ２モデル）における腫瘍増殖を抑制することが示された。動物血清中のオルトバナジン酸塩またはそのアナログの癌細胞に非常に毒性な濃度に達するためには、少なくとも０.２ｍｇ／ｋｇの用量を要した。抗酸化剤であるＮ−アセチルシステインと組み合わせてオルトバナジン酸塩が投与された場合に、腫瘍増殖の有意な阻害が観察された。オルトバナジン酸塩およびＮ−アセチルシステインの作用は、オルトバナジン酸塩単独の場合に比べ、インビボでの腫瘍増殖の阻害により有効であった。また本発明者は、オルトバナジン酸塩または硫酸バナジルを投与された動物は検出可能な程度の転移を有さないことを見いだした。したがって幅広く言えば、本発明は、過酸化水素濃度を調節することによりｆｏｓおよびｊｕｎ発現を調節する方法に関する。本発明の具体例に従えば、過酸化水素および／またはスーパーオキシドを減少させるために化合物を使用して細胞増殖を減少させる。好ましくは、該化合物はバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログである。また本発明は、細胞増殖を減少させるのに有効な一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログ、および１個以上の医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤よりなる増殖性障害治療用医薬組成物も含む。本発明の好ましい具体例においては、該医薬組成物は腫瘍増殖を減少させるのに使用される。さらに、本発明は、細胞増殖を減少させるのに有効な一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを投与することを特徴とする増殖性障害の治療方法も含む。細胞増殖を減少させるのに有効なバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログの量は、少なくとも５μＭ、好ましくは５〜５０μＭ、最も好ましくは１０〜３０μＭの、血清、脳脊髄液、滑液などの細胞外体液中の該化合物の濃度を与える量である。一般に、ヒトおよび他の動物では少なくとも０.２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.２ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で適切な濃度となるであろう。本発明の好ましい具体例においては、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１.０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの投与量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを使用して最適投与量を得る。また本発明は、薬物耐性腫瘍の増殖を減少させるまたは阻害するのに有効な一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを投与することを特徴とする薬物耐性腫瘍の増殖を減少させるまたは阻害する方法に関する。さらに本発明は、転移を減少させるまたは阻害するのに有効な一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを投与することを特徴とする転移を減少させるまたは阻害する方法も含む。また本発明は、バナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログ、およびバナジン酸塩化合物の抗増殖および抗転移作用を増強し細胞増殖および転移を減少させる少なくとも１個の抗酸化剤、好ましくはＮ−アセチルシステインよりなる組成物も含む。また、本組成物を使用して増殖性障害を治療および予防し、薬物耐性腫瘍を治療し、転移を減少させる方法が提供される。また本発明は、細胞増殖を減少させる活性について薬物を試験する方法に関する。本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の詳細な記載および添付図面を参照することにより明らかとなるであろう。また本明細書中、種々の公開物を出典明示することによりこれを本明細書の一部とする。図面の簡単な記載本発明のさらに詳細は下記添付図面中の例示を参照して以下に記載される。図１は、ＩＬ１に応答したスーパーオキシド生成およびＤＰＩによるＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。図２は、ｆｏｓおよびコラゲナーゼ発現におけるスーパーオキシド生成の役割を示すノーザンブロットである。図３は、過酸化水素がｆｏｓ発現を刺激することを示すノーザンブロットである。図４は、オルトバナジン酸塩がｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現を阻害することを示すノーザンブロットである。図５は、Ｎ−アセチルシステインがｆｏｓおよびコラゲナーゼ発現のＩＬ−１誘導を阻害することを示すノーザンブロットである。図６は、増殖性細胞に対するオルトバナジン酸塩の効果を示すグラフである。図７は、オルトバナジン酸塩がＭＤＡＹ−Ｄ２およびＨＴＢ１４細胞に毒性であることを示すグラフである。図８は、細胞毒性に対する種々の形態のオルトバナジン酸塩の効果を示すグラフである。図９は、Ｈ₂Ｏ₂がオルトバナジン酸塩毒性を増強させることを示す棒グラフである。図１０は、オルトバナジン酸塩が種々の薬物耐性の細胞系に毒性であることを示すグラフである。図１１は、非処理およびオルトバナジン酸塩処理マウスからの腫瘍の写真である。図１２は、オルトバナジン酸塩投与がインビボで腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。図１３は、インビボ腫瘍増殖に対するオルトバナジン酸塩、硫酸バナジルおよびバナジルヒロドペルオキシド投与のインビボでの効果を示すグラフである。図１４は、オルトバナジン酸塩およびＮ−アセチルシステイン投与がインビボで腫瘍増殖を完全に阻害することを示すグラフである。図１５は、ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞による肝臓転移を示す写真である。図１６は、転移に対するオルトバナジン酸塩および硫酸バナジルの効果を示す写真である。図１７は、先行技術の処理と本発明のオルトバナジン酸塩／Ｎ−アセチルシステイン処理との比較を示すグラフである。図１８は、ＩＬ−１、ＰＭＡおよびＡＡ誘導ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ発現のオルトバナジン酸塩阻害を示すノーザンブロットである。図１９は、ｃ−ｆｏｓ mＲＮＡ濃度（Ａ）に対するＨ₂Ｏ₂の効果、および抗酸化剤ＮＡＣおよびＡｓｃがＴＮＦ−αおよびｂＦＧＦ誘導ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ濃度（Ｂ）を抑制することを示すノーザンブロットである。図２０は、ＤＰＩが軟骨細胞におけるＴＮＦ−αおよびｂＦＧＦ誘導ＲＯＳ生成を阻害することを示すグラフである。図２１は、ＤＰＩがＴＮＦ−アルファおよびｂＦＧＦによるｃ−ｆｏｓ発現の誘導を阻害することを示す免疫ブロットである。図２２は、細胞増殖に対するＤＰＩの効果を示すグラフである。図２３は、腫瘍増殖に対するＢＭＯＶの効果を示すグラフである。発明の詳細な記載上記のとおり、本発明は、過酸化水素濃度を調節することによるｆｏｓおよびｊｕｎ発現の調節方法に関する。過酸化水素濃度を増加させることは、ｆｏｓおよびｊｕｎの発現の増加、したがって細胞増殖の増加につながるはずである。細胞増殖の増加は、障害細胞を含む状態の治療に有用であり、特に、関節障害、骨吸収、炎症性疾患、中枢神経系変性障害などの組織変性が生じる状態の治療および創傷治癒促進に有用でありうる。本発明の具体例によれば、過酸化水素および／またはスーパーオキシドを減少させるために化合物を使用して細胞増殖を減少させる。好ましくは、該化合物は、バナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログである。本発明での使用に適切なバナジン酸塩化合物は酸化型のバナジン酸塩、好ましくはオルトバナジン酸塩である。また、バナジン酸塩化合物の誘導体、好ましくは、カリウム塩およびナトリウム塩、およびアミノ酸、炭水化物および脂肪酸複合体、例えばシステイン、ジヒドロキシアマートおよびグルクロナートと複合したバナジン酸塩を含む、バナジン酸塩化合物の医薬上許容される塩、エステルおよび複合体を本発明で使用してもよい。好ましい具体例においては、有機バナジウム化合物であるＢＭＯＶが本発明で使用される。過酸化水素と相互作用してヒドロキシルラジカルを生成する能力、または一般に過酸化水素を還元する能力を含む、バナジン酸塩化合物に対する官能基類似性に基づき適切なアナログが選択されてもよい。かかる化合物としては、例えば、鉄、チタン、コバルト、ニッケルおよびクロム複合体、スズ、グルタチオン、ジフェニルヨードニウムなどの金属イオンが挙げられる。バナジン酸塩化合物のアナログもまた、バナジン酸塩化合物に対する三次元構造類似性に基づき選択されてもよい。例えば、本発明ではバナジル型のバナジウム、好ましくは硫酸バナジルを使用してもよい。また本発明では、酵素を含有するフラベノイドの阻害剤などの過酸化水素および／またはスーパーオキシドの合成に影響を及ぼす化合物を使用して細胞増殖を調節してもよい。例えば、本発明においてＤＰＩを使用してもよい。最も好ましくは、オルトバナジン酸塩化合物および硫酸バナジルを本発明の医薬組成物、治療および方法に使用する。選択されたバナジン酸塩化合物の誘導体およびアナログは、動物モデルにおいて、それが過酸化水素を減少させる能力、それが増殖性細胞系、非増殖性細胞系および薬物耐性細胞系の増殖に作用する能力、およびそれが腫瘍増殖または転移を阻害する能力について本明細書の記載に従い試験されてもよい。本発明の組成物は、バナジン酸塩化合物またはそのアナログまたは誘導体と組み合わされた１個以上の抗酸化剤を含有していてもよい。該抗酸化剤は、本明細書に記載の方法を用いて、それが該バナジン酸塩化合物の効力を増加させ、正常細胞に対する毒性を減少させる能力に基づき選択される。本発明の組成物を増強させるのに使用される適切な抗酸化剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、ビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ベータ−カロテン、エルゴチオネイン、亜鉛、セレニウム、銅、マンガン、フラボノイド、エストロゲンまたはそれらの誘導体、好ましくはＮ − アセチルシステインが挙げられる。本明細書に記載の形式および方法でのバナジン酸塩化合物またはそのアナログまたは誘導体および所望により使用する１個以上の抗酸化剤の投与は、過酸化水素を減少させて細胞増殖を減少させ、また、腫瘍の転移も減少させる。したがって、該組成物は、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、肉腫、メラノーマ、アデノーマ、固形組織の癌腫、低酸素腫瘍、口、喉、咽頭および肺の扁平上皮癌、頚部癌、膀胱癌などの尿生殖器癌、造血癌、頭部および頸部癌、神経系癌などの種々の型の癌、乳頭腫などの良性障害、関節硬化症、血管形成、ウイルス感染症、特にＨＩＶ感染症などを含む増殖性障害の治療に使用しうる。本発明の組成物は、造血腫瘍、ヒト神経膠腫および星状細胞腫原発性腫瘍の増殖の阻害に特異的に有効であることが示されている。本明細書に記載の組成物中のバナジン酸塩化合物またはそのアナログまたは誘導体および所望により用いる１個以上の抗酸化剤は薬物耐性腫瘍の治療にも使用しうる。薬物耐性腫瘍としては、例えば、コルヒチン、ビンブラスチン、ドキソルビシンなどの複数の抗癌薬に対する耐性を付与することが知られている高レベルのｐ−糖タンパク質を発現する腫瘍、またはアール・デーリー(R．Deeley)ら、Science，258: 1650-1654，1992に記載されているとおりの多剤薬物耐性タンパク質を発現する腫瘍である。本発明の組成物は、バナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログ、および所望により１個以上の抗酸化剤を単独でまたは他の物質と共に含有する。かかる医薬組成物は、局所、非経口（静脈内、皮下、筋肉内または脊髄内）または局所で使用しうる。好ましくは、有効成分の遅い連続的放出につながる投与方法が使用される。これは、静脈内投与、皮下投与によりまたはインプラント、ポンプなどの放出制御機構を用いることにより行ってもよい。放出制御方法は、一般に、放出制御ポリマーを使用し、有効成分の放出は溶解特性、ポリマーの孔径および有効成分に基づく。非経口投与の場合、上記使用に適切であり生理学的流体に適合する浸透圧モル濃度を有する１個以上の医薬上許容される賦形剤、希釈剤を使用して、バナジン酸塩化合物および／またはその誘導体およびまたはアナログおよび所望により用いる抗酸化剤の溶液剤、懸濁剤、乳剤または散剤を使用することができる。局所使用には、局所用クリーム剤または軟膏剤の形態のまたはスプレー剤形態の製剤が考慮されるべきである。本発明の製剤は、ヒトおよびヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなどの他の種々の哺乳動物への投与が意図されうる。細胞増殖を減少させ、および／または転移を減少させ、または薬剤耐性腫瘍を治療するのに有効なバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログの量は、細胞増殖の減少、転移および／または薬物耐性腫瘍の増殖の減少または阻害を得るのに適した最小用量である。細胞増殖を減少させ、これにより増殖性障害の有効な治療をするためには、血清、滑液、脳脊髄液などの細胞外体液中の該化合物の濃度が少なくとも５μＭ、好ましくは５〜５０μＭ、最も好ましくは１０〜３０μＭとなる用量が必要である。一般に、少なくとも０.２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.２ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０.２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量が、ヒトおよび他の哺乳動物において適当な濃度を与えるであろう。本発明の具体例においては、少なくとも１.０ｍｇ／ｋｇおよび好ましくは１.０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの用量がヒトおよび他の哺乳動物において最適投与量を与えるであろう。転移を減少させ薬物耐性腫瘍を治療するのに上記用量を使用してもよい。また、選ばれた用量は、個々の必要性および投与法に依存する。該バナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログの細胞外体液中の濃度を定量するのに標準的な方法を使用してもよいと理解されるであろう。該バナジン酸塩化合物またはそのアナログまたは誘導体を１個以上の抗酸化剤と組み合わせて使用する場合、該バナジン酸塩化合物またはそのアナログまたは誘導体および抗酸化剤の用量は、該バナジン酸塩化合物および抗酸化剤が単独では完全な効果を示さないように選ばれる。一般に、バナジン塩化合物および抗酸化剤の有効用量は、抗増殖性または抗転移作用を増強させるのに適当な最小用量である。該バナジン酸塩化合物および抗酸化剤は、同時に、別々にまたは連続的に投与されてもよい。該バナジン酸塩化合物および抗酸化剤は複合体として調製、投与されてもよい。例えば、バナジン酸塩はグルタチオンまたはＮ−アセチルシステインと複合化してもよい。本発明の具体例においては、少なくとも５μＭ、好ましくは５〜５０μＭ、最も好ましくは１０〜３０μＭの、血清、滑液、脳脊髄液などの細胞外体液中のオルトバナジン酸塩化合物の濃度を与える該化合物の用量を投与する。オルトバナジン酸塩の投与前（好ましくは２０分前）および投与中に、０.５ｍＭ〜１５.０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜１２.５ｍＭのＮ−アセチルシステインの濃度を与える用量にてＮ−アセチルシステインを投与する。一般に、４０.０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇのＮ−アセチルシステインの用量がヒトおよび他の哺乳動物において適当な濃度を与えるであろう。該組成物は、患者に投与できる医薬上許容される組成物の調製のための自体公知の方法により、有効物質の有効量を医薬上許容される賦形剤との混合物中に組み合わせて調製することができる。適切な賦形剤は、例えばレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)( Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa .，USA 1985)に記載されている。これに基づけば、該医薬組成物としては、１個以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と組み合わされ、適当なｐＨおよび生理学的流体と等張の緩衝液に含有されている該バナジン酸塩化合物、その誘導体またはアナログの溶液などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。該組成物および治療法は、単独または他の治療剤または他の形式の治療法と組み合わされた治療剤または治療法として示される。特に、本明細書に記載の組成物および治療法は、他の治療剤の毒性を減少させるのに使用してもよい。例えば、本発明の組成物は、ホジキン病のための多薬剤化学療法または組み合わせ放射線療法、乳癌の治療のための化学療法などの放射線療法または化学療法と組み合わせて使用してもよい。本明細書中に既に記載したとおり、本発明はまた、細胞増殖に影響を及ぼす物質を検定する方法に関する。該方法は、非増殖性細胞の増殖に対する該物質の効果の測定、および該効果と増殖性細胞で該物質について観察された効果との比較を含む。１つの具体例においては、非増殖性の、好ましくはヒトまたはウシの軟骨細胞または脂肪細胞を高細胞密度にて、好ましくは６ウェル平板上２×１０⁶ 〜４×１０⁶細胞／ウェルにて平板培養することにより非増殖性初代細胞培養を調製し、増殖性細胞、好ましくは軟骨細胞を低密度にて、好ましくは６ウェル平板上５×１０⁵〜１×１０⁶細胞／ウェルにて平板培養することにより増殖性細胞培養を調製し、細胞増殖に影響を及ぼすことが疑われている物質を含有する培地中で該細胞培養の各々を好ましくは１〜４８時間、約３７℃でインキュベートし、細胞を収穫し、生存細胞数を定量し、増殖性および非増殖性細胞培養中の生存細胞数を比較することにより、細胞増殖に影響を及ぼすことが疑われている物質が検定される。下記の実施例により本発明を例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例実施例１ｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現を調節するシグナリング機構の同定ｆｏｓ、ｊｕｎ発現の刺激の原因となる事象の順序または二次メッセンジャーについて調べた。Ａ．ＩＬ１はｆｏｓおよびｊｕｎｍＲＮＡの一時的増加を誘導するサイトカインインターロイキン−１（ＩＬ１）を用いて、ｆｏｓおよびｊｕｎの発現を調節する中間体二次メッセンジャーを同定した。ＩＬ１を用いる理由は、それがｆｏｓおよびｊｕｎ発現を刺激し、マトリックス金属プロテアーゼの発現に必要なシグナルのすべてを生成することが示されているからである。ＩＬ１は、ｆｏｓおよびｊｕｎｍＲＮＡレベルの一時的な増加を誘導することが判明した。そのピークは３０分ないし１時間までであり、一方、コラゲナーゼｍＲＮＡの出現は９時間までに検出され、１２時間まで増加し続ける。このデータは、ｆｏｓおよびｊｕｎ発現がコラゲナーゼ生成に必要とされることを示す研究と矛盾しない。Ｂ．ＩＬ１は反応性酸素中間体の生成を刺激する軟骨細胞（すなわち、カンデル，アール・エイ（Kandel R.A.）ら、バイオキミ・バイフィジ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第１０５３巻、１３０〜１３４頁、１９９０年に記載されたようにプレーティングされたウシ・軟骨細胞）をジヒドロオキシローダミンと共に５分間（ＤＨＲ）、あるいはＩＬ１の不存在下（−ＩＬ１）または存在下（＋ＩＬ１）、あるいはＩＬ１およびＨＡＤＰＨ阻害剤であるジフェニルヨードニウム存在下（＋ＩＬ１，＋ＤＰＩ）で４時間インキュベーションした。図１は、ＦＡＣＳ分析によれば、ＩＬ１が反応性酸素中間体の生成を剌激することを示す。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤であるＤＰＩ（ジフェニルヨードニウム）は、軟骨細胞において、構成的かつＩＬ１により誘導された反応性酸素中間体を完全に阻害する。これらのデータは、ＩＬ１が細胞内スーパーオキシドおよび酸素反応性中間体の生成を刺激することを示す。Ｃ．ＩＬ１により誘導されるｆｏｓおよびｊｕｎｍＲＮＡレベルに対するＤＰＩの効果ＩＬ１はスーパーオキシド生成を刺激したが、ＩＬ１誘導ｆｏｓおよびｊｕｎ発現がスーパーオキシド生成に依存的か否かは知られていなかった。この可能性を明らかにするために、ＩＬ１により誘導されるｆｏｓおよびｊｕｎのｍＲＮＡレベルに対するＤＰＩの効果を調べた。ＤＰＩ存在下および不存在下でＩＬ１で処理された軟骨細胞からのＲＮＡを、ｆｏｓまたはコラゲナーゼいずれかのｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロット分析により分析した。その結果は、ｆｏｓおよびコラゲナーゼのＩＬ１誘導がＤＰＩにより抑制されることを示し、そのことは、スーパーオキシド生成がこれらの遺伝子の誘導において何らかの役割を果たしていることを示すものであった（図２）。同様のデータがＩＬ１誘導ｊｕｎ発現について得られた。さらに、ＤＰＩによるｆｏｓおよびｊｕｎ発現の阻害は、ＩＬ１に誘導される構造的なコラゲナーゼ発現を抑制するに十分であった。これらのデータは、スーパーオキシドまたはＨ₂Ｏ₂生成の阻害が、ｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現を防止することを示す。Ｄ．過酸化水素はｆｏｓ発現の誘導においてＩＬ１の効果を模倣するスーパーオキシドは細胞中でスーパーオキシドジスムターゼにより迅速に過酸化水素に変換されるので、過酸化水素がｆｏｓ発現の誘導においてＩＬ１の効果を模倣するか否かを調べた。３０、６０および９０分間Ｈ₂Ｏ₂処理されたＲＮＡを軟骨細胞（カンデルら、前掲）から抽出し、ｆｏｓｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロット分析により試験した。図３に示すように、軟骨細胞へのＨ₂ Ｏ₂の添加もｆｏｓの発現を剌激し、そのことは転写因子であるｆｏｓおよびｊｕｎの誘導においてこの分子が鍵二次メッセンジャーでありうることを示すものであった。Ｅ．ｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現に対するオルトバナジン酸塩およびＮ−アセチルシステインの効果ｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現に対するオルトバナジン酸塩およびＮ −アセチルシステインの効果を調べた。ウシ関節軟骨細胞を既に記載されているとおりに単離しプレーティングした（カンデル，アール・エイ（Kandel R.A.）ら、バイオキミ・バイフィジ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第１０５３巻、１３０〜１３４頁、１９９０年）。ＩＬ１およびＰＭＡ（ホルボールエステル）により誘導される応答に対するオルトバナジン酸塩の効果を調べるために、軟骨細胞をオルトバナジン酸塩（１００μＭ）と共に２時間インキュベーションし、次いで、ＩＬ１（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ（１００ｍｇ／ｍｌ）で刺激した。軟骨細胞をＩＬ１またはＰＭＡとともに２４時間インキュベーションすることによりコラゲナーゼ生成を調べ、既に記載されているように（カンデルら、上記）ＥＬＩＳＡ法を用いて細胞ならし培地をコラゲナーゼ活性に関してアッセイした。³Ｈ−アラキドン酸（³Ｈ−ＡＡ）を細胞中に取り込ませることによりＰＬＡ₂活性を測定し、次いで、既に記載されているとおりに（コンカー，Ｊ．Ａ．（Conquer,J.A.）、１９９２年、バイオキミ・バイオフィジ・アクタ、第１１３４巻、１〜６頁）、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有培地で、細胞のみ、またはＩＬ１もしくはＰＭＡ存在下で細胞を１０分間インキュベーションした。上清中に遊離した³Ｈ−ＡＡ量を測定した。ＰＧＥ₂生成を測定するために、軟骨細胞をハム（Ham）のＦ１２培地で、軟骨細胞のみ、またはＩＬ１もしくはＰＭＡとともに６時間インキュベーションした。ＰＧＥ₂に特異的な抗体（エス・エイ・ジョーンズ（S.A.Jones）博士、カナダ、トロント（Toron to）のマウント・シナイ・ホスピタル（Mount Sinai Hospital））を用いるＲＩＡにより上清を分析した。ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの発現を調べるために、軟骨細胞をＩＬ１、ＰＭＡまたはＡＡ（３μＭ）存在下で１時間インキュベーションした。軟骨細胞をＰＢＳ中で洗浄し、以前に記載されているようにして（クルス（Cruz）ら、１９９１年、バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.J.）第２７７巻、３２７〜３３０頁）全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料をホルムアミドアガロースゲル上で泳動し、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎに対するプローブを用いるノーザンブロット分析用のナイロン膜に移した。ＩＬ１およびＰＭＡは³Ｈ−ＡＡの誘導ならびに単層培養物における軟骨細胞によるＰＧＥ₂とコラゲナーゼの生成を誘導した。オルトバナジン酸塩（１００ μＭ）はコラゲナーゼ生成を完全に阻害したが、ＩＬ１またはＰＭＡにより誘導される³Ｈ−ＡＡの遊離またはＰＧＥ₂生成を阻害しなかった。これらのデータは、オルトバナジン酸塩の効果が³Ｈ−ＡＡ遊離の下流で起こるか、またはＰＬＡ₂ 活性ならびにＰＧＥ₂生成を調節する機構がコラゲナーゼ生成を調節する機構とは別個のものであるかのいずれかであることを示すものであろう。ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの発現は、ウシ軟骨細胞において、ＩＬ１、ＰＭＡ、ならびにＡＡ自身により刺激された。オルトバナジン酸塩は、ＩＬ１、ＰＭＡおよびＡＡにより誘導されるｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの発現を完全に阻害し、それは、コラゲナーゼ生産の阻害の原因でありうる。これらのデータ（図４および１８参照）は、コラゲナーゼ生成のオルトバナジン酸塩阻害が、軟骨細胞におけるＣ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ発現を阻害することによりＩＬ１誘導³Ｈ−ＡＡ遊離の下流で生じている可能性があることを示唆する。オルトバナジン酸塩がｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現の強力な阻害剤であることを示す該データは、細胞中のＨ₂Ｏ₂濃度を減少させる薬剤がｆｏｓおよびｊｕｎの発現の強力な阻害剤として働き得ることを示す。また、細胞を上記のとおり２０ｍＭＮ−アセチルシステインと共に２０分間インキュベートし、ついでＩＬ−１と共にさらに１または１２時間インキュベートした。ＲＮＡを抽出し、ｃ−ｆｏｓおよびコラゲナーゼについてのｃＤＮＡプローブを使用するノーザンブロット分析により検討した。細胞内でＧＳＨに変換されるＮ−アセチルシステインはＩＬ−１に応答してｆｏｓおよびコラゲナーゼ発現のレベルを減少させることが見いだされた（図５）。おそらく、ＧＳＨのより高い細胞内濃度がＨ₂Ｏ₂およびスーパーオキシド濃度を減少させ、ｆｏｓおよびコラゲナーゼ発現を抑制したのであろう。要約すると、得られた結果は、Ｎ−アセチルシステインおよびオルトバナジン酸塩が共に間接的に細胞内のスーパーオキシドおよびＨ₂Ｏ₂の濃度を減少させることを示す。実施例２インビトロでの強力な化学療法剤としてのバナジン酸塩化合物インビトロでの細胞増殖に対する一群のバナジル誘導体の効果を以下に記載する。Ａ．正常な非増殖性および増殖性細胞に対するバナジル誘導体のインビトロ効果実施例１に記載のとおり、オルトバナジン酸塩はｆｏｓ、ｊｕｎおよびコラゲナーゼ発現を阻害した。細胞増殖にｆｏｓおよびｊｕｎ発現が必要であれば、オルトバナジン酸塩は軟骨細胞増殖を阻害するはずである。非増殖性および増殖性軟骨細胞に対するオルトバナジン酸塩の効果を比較するために、軟骨細胞を高細胞密度（６ウェル平板上２×１０⁶〜４×１０⁶細胞／ウェル）(非増殖性)およびより低い細胞密度（６ウェル平板上５×１０⁵〜１×１０⁶細胞／ウェル）(増殖性)でプレーティングし、ついで４８時間維持した。ついで該細胞を、０〜５０ μＭオルトバナジン酸塩を含有する培地（ＨＡＭＳＦ１２）中でさらに４８時間インキュベートした。該細胞を収穫し、生存細胞数を測定した。図６は、オルトバナジン酸塩が高細胞密度で平板培養された軟骨細胞には影響を及ぼさなかったが、低細胞密度で平板培養された細胞には毒性であったことを示す。これらのデータは、増殖細胞がオルトバナジン酸塩に感受性であり、一方、非増殖性細胞はオルトバナジン酸塩毒性に抵抗性であることを示唆する。Ｂ．増殖性腫瘍細胞系に対するオルトバナジン酸塩のインビトロ効果ｆｏｓおよびｊｕｎ活性も多数の腫瘍細胞系における細胞増殖に必要である。したがって、接着細胞および細胞懸濁液に対するオルトバナジン酸塩の効果を検討した。ＭＤＡＹ−Ｄ２（懸濁液中で増殖したマウスリンパ様細胞系）およびＨＴＢ１４細胞（接着性ヒト初代星状細胞腫細胞系）を、０〜５０μＭオルトバナジン酸塩を含有する培地中で４８時間インキュベートした。該細胞を収穫し、生存細胞数を測定した。図７は、ＨＴＢ１４およびＭＤＡＹ−Ｄ２細胞に対するオルトバナジン酸塩の効果を示す。オルトバナジン酸塩処理により、細胞死が濃度依存的に増加した。細胞型によりオルトバナジン酸塩に対する感受性に若干の相違があったが、検討したすべての細胞系は、正常非増殖性細胞で研究した場合に使用した濃度(上記)より５〜１０倍低い濃度のオルトバナジン酸塩により死亡した。オルトバナジン酸塩誘導細胞死は２４時間まで観察され、連続処理の３日以内に完結(９８％以上)した。結局、オルトバナジン酸塩による癌細胞系の処理により、正常な非増殖性細胞に対する有意な毒性作用を及ぼさない濃度にて細胞死が得られた。実施例３種々の形態のオルトバナジン酸塩の効力癌細胞系の生存能に対する効果について、３個の異なる形態のバナジル化合物を検討した。０〜５０μＭオルトバナジン酸塩、硫酸バナジルまたはバナジルヒドロペルオキシドを含有する培地中、ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞を４８時間インキュベートした。該細胞を収穫し、生存細胞数を測定した。図８は、ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞に対するオルトバナジン酸塩、硫酸バナジルおよびバナジルヒドロペルオキシドの効果を示す。得られた結果は、これらすべての薬剤がこれらの細胞を殺すのに同等に有効であったことを示す。感受性に若干の相違があったが、全体の細胞死は同様であった。実施例４実施例１〜３に記載の研究を考慮して、オルトバナジン酸塩はＨ₂Ｏ₂と反応して非常に毒性であるヒドロキシルラジカルを形成すると考えられた。該オルトバナジン酸塩誘導ヒドロキシルラジカル形成が細胞毒性の原因となるのであれば、外因性Ｈ₂Ｏ₂の添加によりオルトバナジン酸塩の効果が増強されるはずである。したがって、培地単独または１ｍＭＨ₂Ｏ₂または１０μＭオルトバナジン酸塩またはその両方を含有する培地中で細胞を２４時間インキュベートした。該細胞を収穫し、細胞生存能を決定した。図９は、細胞毒性に対する低濃度のオルトバナジン酸塩とＨ₂Ｏ₂との組み合わせ効果を示す。Ｈ₂Ｏ₂単独の添加によりわずかな効果が得られたが、オルトバナジン酸塩と組み合わせたＨ₂Ｏ₂の添加により、オルトバナジン酸塩単独の場合に比べて細胞毒性が有意に増加した。Ｈ₂Ｏ₂による細胞毒性の増強は、オルトバナジン酸塩処理により生成したヒドロキシルフリーラジカルが細胞死の原因となりうることを示唆する。実施例５オルトバナジン酸塩は薬物耐性細胞系に毒性である多数の異なる癌では、腫瘍細胞は通常の化学療法剤によっては排除されず、これらの腫瘍は薬物耐性と称される。この過程に関与している機構はよくわかっていないが、これらの癌細胞は、細胞内から薬物を除去しその細胞内毒性を減少させるタンパク質を発現すると考えられている。薬物耐性腫瘍を有する患者は予後が非常に悪い。したがって、薬物耐性腫瘍に毒性である薬剤は、これらの患者の治療のための貴重な化学療法剤となるであろう。親細胞系ＫＢ３−１に対してそれぞれ薬物耐性が増大している３個の卵巣癌細胞系ＫＢ８、ＫＢ８−５およびＫＢ８５−１１に対するオルトバナジンの効果を比較した。これらの薬物耐性細胞系は、コルヒチン、ビンブラスチン、ドキソルビシンなどの数群の化学療法剤によっては死なかった。この研究では、０〜５０ μＭオルトバナジン酸塩を含有する培地（ＤＭＥＭ）中、薬物耐性を増加させる細胞系（ＫＢ８、ＫＢ８−５およびＫＢ−８５−１１）および親細胞系ＫＢ３− １を４８時間インキュベートした。該細胞を収穫し、生存細胞数を測定した。図１０に示されるとおり、オルトバナジン酸塩はすべての薬物耐性細胞系を殺すのに同等に有効であった。オルトバナジン酸塩に対する感受性の小さな相違が細胞系間で観察されたが、それはそれらの薬物耐性特性に依存せず、オルトバナジン酸塩投与の３日までにほとんどの細胞が死んだため、これらの相違は明らかではなかった。結局、データが示すところによれば、オルトバナジン酸塩は薬物耐性細胞系に致命的であり、薬物耐性腫瘍の治療に特に有用でありうる。実施例６バナジル化合物による治療のインビボ効果バナジル化合物が腫瘍形成、増殖および転移を減少させる能力を検討するために、同じ動物でこれらの過程のすべての研究を許容する特定の動物モデルを選んだ。このモデルは、転移造血細胞系ＭＤＡＹ−Ｄ２のマウスへの皮下注射を含む。これらの細胞は注射部位に腫瘍を形成し、その大きさは簡単に測定できる。また、これらの細胞は肝臓に転移し、１７〜１９日後に転移は組織学的に検出できる。このモデルは、腫瘍増殖および転移に対するバナジル化合物の作用を研究するための非常に鋭敏で再現性のあるアプローチである。Ａ．インビボでの腫瘍増殖に対するオルトバナジン酸塩処理の効果上記動物モデルを使用し、腫瘍増殖に対するオルトバナジン酸塩の皮下投与の効果を調べた。１日目に合計１５匹のマウスに１×１０⁵個のＭＤＡＹ−Ｄ２細胞を皮下注射した。５日目に、注射部位に小さな腫瘍を観察することができた。５匹のマウスに毎日５０μｌの水を単独で注射し、１０匹のマウスに毎日１０ｍｇ／ｍｌのオルトバナジン酸塩を含有する水を注射した。１４日目に、該マウスを犠牲にした。すべての動物から腫瘍を除去し、写真撮影し、秤量した。図１１で、２匹の非処理および２匹のオルトバナジン酸塩処理マウスからの腫瘍の大きさを比較する。オルトバナジン酸塩処理マウスの腫瘍は検出不可能な大きさであるか、それよりずっと小さかった。図１２は、各マウスの腫瘍の大きさ示す。水単独で処理された動物では、４匹のマウスが１.１８〜１.６８グラムの腫瘍を有していた。オルトバナジン酸塩処理マウスでは、２匹が検出可能な腫瘍を有しておらず、５匹のマウスが０.１６グラム未満の大きさの腫瘍を有していた。Ｂ．インビボでの腫瘍増殖の減少に対するオルトバナジン酸塩、硫酸バナジルおよびバナジルヒドロペルオキシド投与の効力同じ動物モデルを用いる別の実験で、インビボでの腫瘍増殖に対するオルトバナジン酸塩、硫酸バナジルおよびバナジルヒドロペルオキシド投与の効果を検討した。１日目に、２０匹のマウスに２×１０⁵個のＭＤＡＹ−Ｄ２細胞を皮下注射した。該マウスを５匹のマウスの４群に分けた。５日目に、該動物に、５０μ ｌの水単独または１０ｍｇ／ｍｌのオルトバナジン酸塩、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸バナジルまたは１０ｍｇ／ｍｌのバナジルヒドロペルオキシドを含有する水を皮下注射した。この処理を１６日間毎日継続した。２１日目に、該マウスを犠牲にし、腫瘍を切断し秤量した。オルトバナジン酸塩および硫酸バナジル処理の各群では１匹の動物が死亡し、バナジルヒドロペルオキシド処理群では５匹全部が死亡した。図１３に示されるとおり、非処理マウスでは、２.３２〜４.７９グラムの腫瘍がひろがった。硫酸バナジル処理の効果は非常に変化しやすいが、該処理はすべての動物で腫瘍の大きさを減少させた。該腫瘍は０.１４グラム〜２.１８グラムの大きさであった。オルトバナジン酸塩処理群では、１匹のマウスは検出可能な腫瘍を有しておらず、残りの３匹のマウスは０.１５〜０.３８グラムの大きさの腫瘍を有していた。これらのデータが示すところによれば、オルトバナジン酸塩は腫瘍増殖を減少させる最大効力を有し、硫酸バナジルはそれほど有効ではなく、バナジルヒドロペルオキシドは非常に毒性でありその効力を評価できなかった。実施例７オルトバナジン酸塩およびＮ−アセチルシステインの併用療法は腫瘍増殖および形成を完全に抑制した。上記実施例に記載の研究は、オルトバナジン酸塩がマウスでの腫瘍増殖を抑制するのに８０〜１００％有効であることを示した。Ｎ−アセチルシステインは細胞内でグルタチオンに変換されるため、より高濃度のグルタチオンはオルトバナジン酸塩誘導毒性を減少させうるだけでなく、腫瘍形成をも減少させうる。したがって、オルトバナジン酸塩と組み合わせたＮ−アセチルシステインの投与が、インビボでの動物毒性および腫瘍増殖を減少させるのにより有効であるか否かを検討した。１日目に２０匹のマウスに２×１０⁵個の細胞を皮下注射した。４日目に、該マウスを５匹のマウスの４群に分けた。第１群（対照）は５０μｌの水の皮下注射を受けた。第２群は毎日２５０ｍＭＮ−アセチルシステインの５０μｌの腹腔内注射を受けた。第３群は毎日１０ｍｇ／ｍｌのオルトバナジン酸塩の５０μ ｌの皮下注射を受けた。第４群は毎日２５０ｎＭＮ−アセチルシステインの５０μｌの腹腔内注射を受け、２０分後、１０ｍｇ／ｍｌのオルトバナジン酸塩５０μｌの皮下注射を受けた。１０日目に処理を中止した。１３日目に該動物を犠牲にし、腫瘍増殖について分析した。１匹のオルトバナジン酸塩処理動物が実験中に死亡した。対照マウスおよびオルトバナジン酸塩（ＶＯ４）またはＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはその両方（ＮＡＣ／ＶＯ４）で処理されたマウスから腫瘍を切断した。図１４に示すデータは各腫瘍の重量を表す。図１４に示されるとおり、非処理マウスは０.８７〜１.６９グラムの大きさの腫瘍を有していた。これに対し、Ｎ−アセチルシステイン処理マウスは０.２３〜１.１８グラムの腫瘍を有していた。これは、この薬剤が単独で腫瘍増殖をある程度減少させる能力を有することを示している。４匹のオルトバナジン酸塩処理マウスのうち、２匹は検出可能な腫瘍を全く有さず、残りの２匹は０.１３〜０.３５クラムの腫瘍を有していた。一方、オルトバナジン酸塩およびＮ−アセチルシステイン投与を受けた５匹の動物はすべて、検出可能な腫瘍を全く有さなかった。これらの実験は、オルトバナジン酸塩およびＮ−アセチルシステインの併用療法がインビボで腫瘍増殖を阻害する最も有効な療法であることを明らかに示す。さらに、Ｎ−アセチルシステインは、オルトバナジン酸塩単独で処理された動物で観察されたわずかの毒性作用を減少させるようである。実施例８抗転移剤としてのバナジル化合物バナジン酸塩化合物は、他の器官に侵入する能力を減少させることにより細胞系の転移潜在能を阻害することが見いだされた。特に、ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞の転移が実施例６に記載の動物モデルで起こることが見いだされた。図１５は、対照肝臓および転移を有する肝臓を示す。転移肝臓は、ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞の投与の２４日後の動物から得た。その結節は非常に多く大きい。１９〜２３日の間に犠牲にされた動物では、結節の数および大きさが動物により非常に変化に富んでいた。これは、オルトバナジン酸塩の抗転移潜在能を検討するためには、動物はＭＤＡＹ−Ｄ２細胞の注射後最低２３日間保たれるべきであることを示すものである。上記実施例６に記載の実験の１つの後で得られた肝臓の組織学的検査からの予備的結果は、オルトバナジン酸塩および硫酸バナジルが共に転移を防ぐのに有効であることを示唆した。肝臓を上記のとおり処理された動物から除去し、組織学的検査のために調製した。図１６では、非処理（Ｃ）、オルトバナジン酸塩（ＶＯ)(５００μｇ／日)および硫酸バナジル(ＶＳ)(５０μｇ／日)で処理された動物からの肝臓断面が比較されている。結節が矢印で特定されている。ＭＤＡＹ− Ｄ２の湿潤およびコロニー形成が非処理動物で観察された。オルトバナジン酸塩および硫酸バナジル投与動物は、検出可能な程度の転移を有さなかった。実施例９オルトバナジン酸塩０.５ｍｇ／ｍｌの経口投与により実験マウスにおいて胃毒性が示されることが判明した。さらに、高用量のオルトバナジン酸塩の腹腔内投与も該動物に毒性であることが判明した。しかし、５００μｇ以下のオルトバナジン酸塩の皮下注射は該動物において耐性であった。該オルトバナジン酸塩をゆっくり投与すると毒性が減少し、該動物はより高い用量で耐性でありうる。実施例１０カプラン（Kaplan）の米国特許第５,０４５,３１６号との比較カプランが使用したバナジン酸塩の濃度は、非常に低くて腫瘍増殖または転移の阻害に有効でないことが判明した。カプランの最適条件が有効であるか否かを決定するために、オルトバナジン酸塩単独、またはチオ硫酸塩単独または一緒に投与されるオルトバナジン酸塩およびチオ硫酸塩の最高濃度のマウスにおける腫瘍増殖に対する効果を調べた。カプランは、１日用量０.００４３ｍｇ／ｋｇ〜０.１４ｍｇ／ｋｇのバナジルまたはバナジン酸塩が治療に必要であると報告している。体液中の分布が同等で水分含量が５６％であると仮定すると、この用量での投与時の血清中オルトバナジン酸塩の最大濃度は０.０４μＭ〜１.３μＭである。図１７に示されるとおり、カプランに記載の用量のカプランに記載のいずれの薬剤の単独使用または併用によっても、腫瘍増殖の減少は全く観察されなかった。本発明の最適治療条件下では、腫瘍増殖は明らかには認められないかまたは対照の８０％未満であった。実施例１１図１９は、ｃ−ｆｏｓ発現に対するＨ₂Ｏ₂および抗酸化剤の効果を示す。特に、図１９Ａは、ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ濃度に対するＨ₂Ｏ₂の効果を示す。示されている異なる時点で軟骨細胞培養をＨ₂Ｏ₂（１００μＭ）で剌激した。図１９Ｂは、抗酸化剤ＮＡＣおよびＡｓｃがＴＮＦαおよびｂＦＧＦ誘導ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡレベルを阻害することを示す。ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ α（３０ｎｇ／ｍｌ）の添加前（３０分間）に、軟骨細胞培養をＮＡＣ（３０ｍＭ）またはＡｓｃ（１００μＭ）と２時間、前インキュベートした。ヒト組換えＴＮＦαおよびｂＦＧＦを共に、０.１％ウシ血清アルブミンリン酸を含有する緩衝食塩水に溶解した。まずＮＡＣおよびＡｓｃを５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含有するハム（Ham's）Ｆ１２培地に溶解し、ついで水酸化ナトリウムで中和した。ウシ関節軟骨細胞からの全ＲＮＡを単離し、本明細書に記載のノーザンブロット分析によりｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ濃度を測定した。該ブロットから順次ＤＮＡを取り出し、³²Ｐ標識ラットβチューブリンcＤＮＡで再プローブ化した。実施例１２図２０は、ＤＰＩが軟骨細胞でＴＮＦαおよびｂＦＧＦ誘導ＲＯＳ生成を阻害することを示す。パネルａからｃに示されるとおり、時間と共にＤＨＲ単独で右方向への蛍光の移動が生じた。点線は、ＤＨＲ単独の対照（パネルｃ）の平均蛍光強度を通って引かれている。ＤＨＲの存在下ＴＮＦαまたはｂＦＧＦと共に４時間インキュベートした後、パネルｄまたはｆに示されるとおり、対数蛍光強度がさらに移動した。パネルｅおよびｇでは、ＤＰＩがそれぞれＴＮＦαおよびｂＦＧＦにより剌激された蛍光の移動を打ち消した。実施例１３図２１は、ジフェニレンヨードニウムもＴＮＦαおよびｂＦＧＦによるｃ−ｆｏｓ発現の誘導を阻害することを示す。ＴＮＦα（３０ｎｇ／ｍｌ）またはｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加前（３０分間）、軟骨細胞培養をＤＰＩ(２μＭ) で３０分間前処理した。ｃ−ｆｏｓおよびチューブリンｍＲＮＡ濃度の測定は実施例１１に記載のとおりに行った。実施例１４図２２は、細胞増殖に対するジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ）の効果を示す。非増殖性細胞（軟骨細胞）および増殖性接着細胞（ＨＴＢ１４）または懸濁液（ＭＤＡＹ−Ｄ２）を２ｍＭジフェニルヨードニウムの存在下または非存在下で２４時間インキュベートした。培地を該軟骨細胞およびＨＴＢ１４細胞培養から除き、トリプシン処理し遠心分離した。該ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞を遠心分離した。トリパンブルーを含有するＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、細胞生存度を光学顕微鏡で測定した。結果は４重の典型実験を表す。実施例１５図２３は、ＭＤＡＹ−Ｄ２腫瘍増殖に対する有機バナジウム化合物ビス（マルトラート）オキソバナジウム(ＩＶ)(ＢＭＯＶ)の効果を示す。マウスに５×１０⁵ 個のＭＤＡＹ−Ｄ２細胞を皮下注射した。５日後、毎日２回、該動物を２５０ μｇのＢＭＯＶで処理した。１６日目に該動物を犠牲にし、その腫瘍を取り出し秤量した。結果は、各動物の腫瘍重量を表す。上記から、本発明の特定の具体例が例示のために本明細書に記載されているが本発明の精神および範囲から逸脱しなければ種々の修飾を行ってもよいと理解されるであろう。したがって、本発明は添付物による以外には限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/375 9454−4ＣＡ６１Ｋ 31/375 31/415 9454−4Ｃ 31/415 31/565 9454−4Ｃ 31/565 33/04 33/04 33/30 33/30 33/32 33/32 33/34 33/34 45/06 ＡＤＳ 8615−4Ｃ 45/06 ＡＤＳ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．バナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログの細胞外濃度が少なくとも５μＭとなる一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを投与することを特徴とする哺乳動物における増殖性障害の治療方法。２．バナジン酸塩化合物の濃度が５μＭ〜５０μＭである請求項１記載の方法。３．バナジン酸塩化合物がオルトバナジン酸塩または硫酸バナジルである請求項１記載の方法。４．薬物耐性腫瘍の増殖を減少させるまたは阻害するのに有効な一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物における薬物耐性腫瘍の増殖を減少させるまたは阻害する方法。５．転移を減少させるのに有効な一定量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログを哺乳動物に投与することを特徴とする患者において転移を減少させる方法。６．バナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログおよび少なくとも１個の抗酸化剤および１個以上の医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤よりなる、抗増殖および抗転移剤としての使用のための医薬組成物。７．バナジン酸塩化合物がオルトバナジン酸塩であり、抗酸化剤がＮ−アセチルシステインである請求項６記載の組成物。８．各投与単位についてバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログの濃度が少なくとも１.０ｍｇ／ｋｇ体重で抗酸化剤の濃度が約４０.０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である、１個以上の投与単位を含有する請求項６記載の医薬組成物。９．有効量のバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログおよび少なくとも１個の抗酸化剤を投与することを特徴とする増殖性障害を治療し、薬物耐性腫瘍を治療し、または転移を減少させる方法。１０．バナジン酸塩化合物がオルトバナジン酸塩または硫酸バナジルである請求項８記載の方法。１１．抗酸化剤がＮ−アセチルシステイン、グルタチオン、ビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ベータ−カロテン、エルゴチオネイン、亜鉛、セレニウム、銅、マンガン、フラボノイドまたはエストロゲンである請求項８または請求項９記載の方法。１２．オルトバナジン酸塩の投与前または投与中にＮ−アセチルシステインを投与する請求項９記載の方法。１３．オルトバナジン酸塩を少なくとも５μＭの細胞外濃度を与える用量にて投与し、Ｎ−アセチルシステインを０.５〜１５ｍＭの細胞外濃度を与える用量にて投与する請求項１０記載の方法。１４．増殖性障害治療用、薬物耐性腫瘍治療用または転移を減少させるための医薬組成物の製造におけるバナジン酸塩化合物またはその誘導体またはアナログ、および少なくとも１個の抗酸化剤の使用。