JPH09508002A - 遺伝的に改変された細胞を含む生体適合性免疫隔離カプセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物宿主内の生物学的機能に影響を与えるまたは促進するために、生物学的活性分子の効果的な送達のための、遺伝学的に操作された細胞を含む生体適合性カプセルを用いて、生物学的活性分子の長期の安定な発現のための改良したデバイスおよび方法を提供する。本発明の新規のカプセルは、生体適合性であり、そして容易に回収される。本発明は、詳細には、改良した方法および組成物を提供し、これらは、生物学的活性分子をコードし、プロモーターに作動可能に連結したDNA配列を含む組換えDNA分子でトランスフェクトされた細胞を利用し、このプロモーターは哺乳動物宿主への移植の際にインビボでダウンレギュレーションを受けない。さらに、本発明の方法は、所定の哺乳動物内で生細胞から特定の部位への、生物学的活性分子の長期の安定な効率的な送達を可能にする。さらに、本発明は、維持のための一般的な手段、延長した期間の導入遺伝子のインビボの発現のための一般的な手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝的に改変された細胞を含む生体適合性免疫隔離カプセル 本発明の技術的分野 本発明は、生物学的活性分子を宿主へ送達するための改良された生体適合性カ プセルに関する。特に、この改良されたカプセルは、特定のマクロポア(macropo re)の分布ならびにマクロポアのサイズ範囲によって特徴付けられた外表面の形 態を有する。さらに本発明は、生物学的活性分子の長期間の安定な発現、および それら生物学的活性分子の送達、そして特にこのような発現および送達を達成す る生体適合性免疫隔離(immunoisolatory)カプセルに含有された遺伝的に改変さ れた細胞の使用のための改良されたデバイスおよび方法に関するものである。 本発明の背景 多くの臨床的状況、不全、および疾患の状態は、生きた細胞によって産生され る１つまたは複数の因子を患者に与えることによって、あるいは生きた細胞によ って代謝される有害な因子を患者から除去することにより処置されるか、または 軽減される。多くの場合これらの因子は、器官または組織の機能の損傷または損 失を回復させるか、あるいは補うことができる。疾患の原因が分泌性の器官また は組織の機能の損失を包含する疾患または不全状態の例は、(a)膵臓のランゲル ハンス島によるインスリンの産生が損傷または損失される糖尿病；(b)上皮小体 ホルモンの産生の損失が血清カルシウムのレベルを低下させ、その結果重篤な筋 肉のテタニーにつながる上皮小体機能不全症；(c)ドーパミンの産生が減少する パーキンソン病；および(d)エリスロポエチンの欠陥から派生する赤血球産生の 損失により特徴付けられる貧血症を包含する。器官または組織の機能の損傷ある いは損失は、結果としてさらなる代謝機能の損失になり得る。例えば、劇症的な 肝臓の機能不全において、肝臓組織は、毒物の除去、細胞の代謝産物の排泄、そ してアルブミンおよび第VIII因子のような必須産生物の分泌が不可能となる。Bo ntempo,F.A.ら(1987)Blood,69,pp.1721-1724を参照。 他の場合、これらの因子はリンホカインまたはサイトカインのような生物学的 応答修飾因子であり、これらは患者の免疫システムを高めるか、あるいは抗炎症 剤として作用する。これらは慢性寄生性または感染性疾患を持つ個人に特に有用 であり、そしてある種の癌の処置にも有用であり得る。 患者に次のような栄養因子を与えることも望ましい。例えば、神経成長因子(N GF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-３(NT-3)、ニューロトロ フィン-4/5(NT-4/5)、線毛性(ciliary)栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来栄養 因子(GDNF)、コリン作動性分化因子／白血病阻害因子(CDF/LIF)、表皮成長因子( EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、血小板 由来成長因子(PDGF)などである。 多くの疾患または不全状態において、冒された器官または組織は、常態では特 定の代謝物のレベルの変動に応答するよう機能し、それによって恒常性を維持す る。例えば、海馬のニューロンは高レベルのNGFを産生し、これが海馬を剌激す る前脳部コリン作動性ニューロンの基礎量を直接維持する。このニューロンによ り産生されるNGFのレベルが減少すると、この生体構造に対するコリン作動性の インプットが失われる結果になり、そしてアルツハイマー病に見られる老化に関 連した記憶の損傷にいたる。 神経系においては、絶え間なく低レベルの栄養因子を送達することは、成長因 子依存性細胞集団の健康を維持するのに十分である。アルツハイマー病およびハ ンチントン病のような慢性的疾患においては、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、CNTF 、GDNFおよびCDF/LIFのような神経栄養因子の１つまたはそれ以上を長期間送達 することが、神経の生存能力を維持するために要求され得る。この成長因子は脳 血液関門(blood-brain barrier)を越えることができないので、全身投与による 送 達は不可能である。従って、この神経栄養因子は中枢神経系(CNS)へ直接送達さ れなければならない。 多くの研究者が、分泌された産生物を提供するか、あるいは代謝機能に作用す るような全器官、組織または細胞を移植することによって、器官または組織の機 能を再構成、増加あるいは置換することを試みた。さらに、移植は劇的な恩恵を 与えることはできるが、移植に適する入手可能な器官の数がかなり少ないので、 その適用には限界がある。一般的には、患者は移植による免疫拒否を回避するた めに免疫抑制されなければならない。この拒否反応は一般に移植物の機能を損失 させ、そして最終的には移植された組織または細胞の壊死を起こす結果になる。 しかし、多くの場合において移植物は、たとえ患者の生涯の残された時間の間で あっても、長期間機能し続けることが望ましい。患者をかなりの期間免疫抑制の 状態に維持するのは、望ましくなくそして経費もかかる。 移植の手法に用いられる別のアプローチは、細胞または組織を半透過性の天然 のバリア内に移植することであるが、このバリアは、栄養物、老廃物そして分泌 産物を拡散させるが、免疫拒否反応を起こす細胞性および分子性エフェクターの 有毒な影響を最小にする。選択された産生物を産生する組織または細胞を免疫系 から保護する種々のデバイスまたはカプセルが探索された。これらは、血管外の 拡散チャンバー、血管内の拡散チャンバー、血管内の限外濾過チャンバーおよび マイクロカプセル化された細胞の移植を包含する(Scharp，World J．Surg.,8,pp .221-9(1984)。このデバイスは、患者を免疫抑制の状態にしておく必要性を軽減 し、そのために従来の移植術では用い得なかった提供者の細胞または組織の使用 を許すことによって、より多くの患者が機能回復する移植または、別の有益な移 植を受けられるので、移植の分野における著しい進歩を提供するものであると予 見された。 カプセル化された細胞の使用は、免疫系の成分がカプセルへ入りこむのを防ぎ 、それによってカプセル化された細胞を免疫破壊から保護する。この技術は、処 置 に使用され得る細胞タイプの多様性を増加する。カプセル膜の半透性はまた、目 的の分子をカプセルから周囲の宿主組織へ容易に拡散させる。この技術は、腫瘍 の形成という固有の危険性を防ぎ、そしてレシピエントが免疫抑制を起こさずに 不適合なヒトまたは動物組織の使用を可能にする。さらに、移植物は必要あるい は所望ならば回収され得る。このような回収可能性は、多くの臨床状況において 必須である。 外表面の形態は、カプセルの強度、カプセルの回収可能な性質を包含する種々 のパラメーター、および長期間にわたって生存細胞を支持するためのカプセルの 能力に影響を与え得る。 長期間にわたってカプセル化された細胞が生存でき、そして破損することなく より簡単に回収されるようなカプセルを提供することが望まれる。 種々の外表面の形態を有するカプセル化のデバイスが非常に多く知られている 。カプセルは、その外表面の形態に応じて、タイプ１(T1)、タイプ２(T2)または タイプ４(T4)に分類されてきた。このような膜は、例えばLasyら，「カプセル化 された膵臓ランゲルハンス島の皮下異種移植片による糖尿病マウスの正常血糖の 維持」,Science,254,pp.1782-84(1991)および Dionneら,PCT/US92/03327に記載 されている。本発明の新規な膜は、T1/2と表されるものであり、そしてその全表 面部がマクロポアで占められたハイブリットの外表面形態、およびマクロポアの 直径が選択された範囲内であることによって特徴付けられている。 必要とされる生物学的な機能を供給するために分裂細胞および細胞系を使用す ることにより、十分に分化した組織および／または器官に対して数多くの有意な 利点が提供される。細胞は、インビトロで多量に増殖させ得、そして貯蔵し得、 病原体に関してスクリーニングし得る。さらに細胞および細胞系は、初めの器官 または組織よりも遺伝子操作がより容易にできる。非相同的組換えDNAを導入す る能力は、移植される細胞の機能あるいは表現型の改変について多くの新たな可 能性を与える。これは、移植細胞の処置的使用により広い多様性を与える。 このような操作に使用される細胞を遺伝的に改変するには、レトロウイルスベ クターが一般に利用されてきた（Gageら,米国特許第5,082,670号）。しかし、レ トロウイルスの発現ベクターは、異種タンパク質の高レベルで長期間にわたるイ ンビボの発現を提供しないことが知られている。種々の因子が、レトロウイルス のプロモーターの制御下で観察される導入遺伝子(transgene)発現のダウンレギ ュレーションに寄与している。この因子は、遺伝的に改変された細胞の休止状態 、プロモーター内のCpG対のメチル化、および選択圧の除去を包含する。哺乳動 物のプロモーターにより駆動される大抵の発現ベクターはまた、固有のプロモー ターの活性が低レベルであるため、従来の移植の凡例(paradigm)に最適であるわ けではない（M.SchinstineおよびF.Gage,神経性疾病の処置に対する分子的およ び細胞的研究アプローチ 、S.G.Waxman編、Ravan Press pp.311-323(1993)を参照 ）。 CNSにおけるレトロウイルスのプロモーターのダウンレギュレーションに関す る問題に加えて、遺伝子処置でレトロウイルスを使用するには、別の不利益があ る。例えば、遺伝的要素を含有するウイルスに予め曝されるか、または現在感染 されるかによって、移植された哺乳動物の宿主内で組換え事象が起こり、その結 果、複製欠損ウイルスが生きたウイルスに改変するようになる可能性についての 深刻な問題がある。さらに、感染性ウイルス粒子を用いての作業は、その試薬を 生産しそして投与する研究室の作業員および専門医に対する安全性を損なうとい う問題がある。最終的には、これらの問題によって、研究者および専門医ならび に監視当局の間で危険性についての理解が深められた。 遺伝子操作された細胞をカプセル化するか、あるいはカプセル化しない両方の 形態でインビトロ移植が行なわれたが、非相同DNAの長期間の安定な発現は、満 足すべき結果が得られなかった。例えば、最近公表された研究（Hoffmanら,Expe rimental Neurology ,122,pp.100-106(1993年８月)）は、ラットの中枢神経系(CN S)へNGFを送達させるため、マウスNGFを分泌するように遺伝子操作された同種異 系の細胞をカプセル化して使用する方法に言及している。記載された系における NGF遺伝子の発現は、レトロウイルスのプロモーターによって制御された。上記 のように、レトロウイルスのベクターは、インビボで長期間の安定な導入遺伝子 の発現を引き起こさない。従って、その研究に報告された方法は、長期間の処置 的適用に適さない。 従って、適切な量の必要物質（例えば、成長因子、酵素およびホルモン）を遺 伝的に改変された細胞から長期間にわたって送達する方法は未だ利用し得ず、そ して長期間の処置が必要なときには極めて有益となる。さらに、移植された細胞 中の導入遺伝子のインビボでの長期間の安定な発現を維持する方法も利用し得ず 必要とされている（例えば、SchinstineおよびGage(1993)、前出、321頁を参照 ）。 従って、インビボでの導入遺伝子の長期間の安定な発現を容易にする遺伝的改 変を受けた細胞を導入するデバイスおよび送達方法の必要性が残っている。 発明の要旨 本発明は、宿主哺乳動物に移植されたときカプセル化された細胞を長期間生存 させることができ、そしてより簡単に回収し得る新規なT1/2ハイブリッドカプセ ルを提供する。 本発明は、生体適合性のカプセルを用いて、生物学的活性分子を長期間安定に 発現させるためのデバイスおよび方法を提供する。このカプセルは、哺乳動物宿 主内で生物学的機能をもたらすか、または高めるような生物学的活性分子の効果 的な送達のために遺伝子操作された細胞を含有する。本発明は、組換えDNA分子 を移入した細胞を利用する改良された方法および組成物を特に提供するし、哺乳 動物宿主に移植されたときインビボでダウンレギュレーションを受けないプロモ ーターと作動可能に連結された生物学的活性分子をコードするDNA配列を含有す る。さらに本発明の方法は、生物学的活性分子を生きた細胞から所定の哺乳動物 内の特定部位へ長期間安定でそして有効な送達を提供する。本発明は、長期間に わたってインビボでの導入遺伝子の発現を維持する一般的な手段を提供する。さ らに本発明は、老化に関連する(age-related)認識障害を処置するデバイスおよ び方法を提供する。定義 本明細書に用いられる「生体適合性カプセル」は、カプセルが宿主の哺乳動物 に移植されたとき、結果としてカプセルを排除するか、またはカプセルが作用で きないようにする（例えば分解によって）のに十分な有害な宿主応答を誘い出さ ないことを意味する。 本明細書に用いられる「免疫隔離カプセル」は、このカプセルが哺乳動物宿主 に移植されたとき、カプセルのコア内の細胞に宿主免疫系が与える有毒な影響を 最小限に抑えるカプセルを意味する。 生物学的活性とは、特定の細胞に対する分子の生物学的に有用な効果をいう。 本明細書に用いられる「生物学的活性物質」は、細胞内で生物学的活性を発揮す る物質をいう。この物質はその細胞の中で作られるか（例えば、アポトーシスを 防止するbcl-2）あるいはその細胞表面上で発現され、そして他の細胞または生 物学的活性分子（例えば、神経伝達物質レセプターまたは細胞接着分子）とその 細胞との相互作用に影響を及ぼし得るか、もしくはこの物質を作る細胞から放出 または分泌され、そして別の標的細胞にその影響を及ぼし得る（例えば、神経伝 達物質、ホルモン、成長因子、あるいはサイトカイン）。 プロモーターのダウンレギュレーションは、導入遺伝子の産生物の発現が、イ ンビボでの移植後に導入遺伝子産物の有意な生物学的活性の欠乏につながるレベ ルまで減少することを意味する。「ダウンレギュレーションを受けないプロモー ター」は、哺乳動物宿主内にインビボ移植した後、生物学的に活性であるレベル で導入遺伝子の発現を駆動するかまたは駆動し続けるプロモーターを意味する。 本明細書に用いられる「生物学的活性分子の長期間の安定な発現」は、生物学 的活性分子を、その有用な生物学的活性が維持されるのに十分なレベルで、１ケ 月以上、好ましくは３ケ月以上そして最も好ましいくは６ケ月以上の期間連続し て産生することを意味する。 本明細書に用いられる「老化した」個体は、自然な加齢プロセスの結果、ある いは自然な加齢プロセスに関連した神経変性障害の結果のいずれかで神経の変性 が起こったか、または起こりつつある個体である。自然な加齢プロセスの結果と しての神経の変性は、以前の状態と比較して神経機能が損失または衰弱すること を意味するが、その原因はアルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチント ン病のような明らかな臨床的異常または神経学的／神経変性的障害ではない。 図面の簡単な説明 図１は、pNUT-β-NGFの発現ベクターの制限地図を表わす。 図２は、采−脳弓横断切開(fimbria-fornix transection)後、NGFのBHK細胞移 植物と一緒にまたは無しで生存する中隔コリン作動性ニューロンの％を表わす。 図３は、一側性損傷QAラットのアポモルヒネ誘導回旋運動に対するカプセル化 されたNGF分泌性BHK細胞の効果を表わす。動物は、３回の別々の場合の回旋運動 に対してに試験された。データは、30分の試験時間の間の、または各処置群の完 全な同側回旋運動の平均(±)SEM数として表わされる。黒丸／黒線は、QAのみを 与えた動物のデータを表わし、白丸／黒線は、QAおよびNGF分泌性BHK細胞移植物 を与えた動物のデータを表わし、そして黒丸／破線は、QAおよびNGF非分泌性BHK 細胞移植物を与えた動物のデータを表わす。 図４は、両側性損傷QAラットの自発的な歩行運動(locomotor activity)に対す る、カプセル化されたNGF分泌性BHK細胞の効果を示す。データは、それぞれの活 動測定について、予備手術の活動レベルの平均(±)SEM％として表わされる。図 中、HA＝水平活動量、TD＝合計距離、NM＝移動回数、AD＝平均距離、MT＝移動時 間、AS＝平均速度、VA＝垂直活動量、VM＝垂直移動の回数、VT＝垂直活動時間、 SC＝ステレオタイプ活動時間、そしてNS＝ステレオタイプ移動の回数である。パ ネルA-QA;パネルB-2A/NGFなし;パネルC-QA/NGF。 図５は、両側性損傷QAラットにハロペリドール（パネルＡ）およびSCH23390（ パネルＢ）で誘導したカタレプシーに対するカプセル化されたNGF分泌性BHK細胞 の効果を示す。データは、処置群のそれぞれについて、カタレプシーに罹ってい る時間の平均(±)量として表わされる。黒丸／黒線は、QAおよびNGF非分泌性BHK 細胞移植物を与えた動物のデータを表わし、白丸／黒線は、QAおよびNGF分泌性B HK細胞移植物を与えた動物のデータを表わし、そして黒丸／破線は、QAのみを与 えた動物のデータを表わす。 図６は、３種類の強度の張力のそれぞれに応答する接触によって測定されたvo n Freyの体性感覚閾値(Somatosensory Threshold)を図解する。パネルA−5.4mo. ;パネルB-20.6mo.;パネルC−26.7mo.。カプセル化されたBHK-NGF細胞を移植され た老齢ラット（26.7mos）は、コントロール群の老齢ラットよりも軽い刺激物質 に対して良く応答したが、若齢ラットより応答は良くなかった。黒丸はコントロ ールを表わし；四角はNGF-BHK細胞のデータを表わす。 図７は、試行間隔２時間の条件で、Morrisの水迷路テストのワーキングメモリ ーの結果を示す。パネルA-移植前より良好な50％(better 50% pre-implant)；パ ネルB-移植前より悪い50％(worse 50% pre-implant)。黒丸はコントロールを表 わし；四角はNGF-BHK細胞のデータを表わす。 図８は、カプセル化されたBHK-NGF細胞を与えた老齢サルでは、損傷により誘 導される中隔ニューロンの変性がコントロールに比べて顕著に弱められたことを 示す。 発明の詳細な説明 本発明は、カプセル化された細胞が長期間生存でき、そして容易に回収され得 る改良カプセルを指向する。本発明はまた、改良されたデバイスおよび方法を指 向する。このデバイスおよび方法は、生物学的活性分子を発現させ、そしてこの 分子を宿主の哺乳動物へ長期間安定に送達するために生体適合性カプセルに含ま れた遺伝的に改変された細胞を使用することである。 本発明のデバイスおよび方法は、広範な生物学的活性分子（200kDまでの高分 子量の産物を含む）を、それを必要とする個体に長期間安定に発現させ、および ／または有害な物質を除去する代謝機能をそれを必要とする個体に提供すること に有用である。本発明のデバイスおよび方法に用られる生物学的活性分子は、種 々の器官または組織が通常分泌する多種類の因子を包含する。例えば、インスリ ンは糖尿病患者に、ドーパミンはパーキンソン病の患者に、第VIII因子はA型血 友病患者に、あるいは鎮痛剤は疼痛の患者に送達され得る。 本発明の実施に使用され得る他の生物学的活性分子は、エリスロポエチン、成 長ホルモン、サブスタンス−P、ニューロテンシン、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、 CNTF、GDNF、CDF/LIF、EGF、IGF、PDGF、bFGF、およびaFGFのような栄養因子を 包含する。 本発明のデバイスおよび方法はまた、ヘモグロビン、チロシンヒドロキシラー ゼ、プロホルモンコンバターゼ、bcl-2、ドーパデカルボキシラーゼ、そしてド ーパミンβ-ヒドロキシラーゼを包含する生物学的活性分子を長期間安定に発現 させるのに有用である。 本発明による送達に適した別のファミリーは、リンホカインおよびサイトカイ ンを含む生物学的応答調節剤を包含する。 本明細書に記載のカプセル化された細胞は、肝細胞のような細胞による血流か らのトキシンまたは有害代謝物（例えば、コレステロール）の除去のような必須 の代謝機能を、回復または増強するのにも用い得る。本発明の方法は、レシピエ ントを処置する間に同時に免疫抑制する必要なしに細胞を移植することを可能に する。本発明の方法を用いることにより、特定の物質の恒常性が回復され、さら に長期間維持され得る。 本発明の範囲内に意図される生物学的活性分子は、カプセルまたは移植された 細胞から分泌される分子であって、直接的または間接的に哺乳動物宿主において 生物学的な効果をもたらす分子、および直接的または間接的にカプセル内に含ま れる細胞に生物学的な効果をもたらす分子を包含する。 本発明の好ましい実施態様は、宿主哺乳動物の中枢神経系(CNS)に神経栄養因 子を送達するための改良方法である。本発明の特定の実施態様では、神経成長因 子(NGF)の、哺乳動物宿主のCNSの特定の領域に対する長期間の安定な発現および 送達の改良方法が提供される。 多くの生物学的活性分子をコードする遺伝子がクローニングされ、それらのヌ クレオチド配列が公表されている。これらの遺伝子の多くは、アメリカンタイプ カルチャーコレクション(American Type Culture Collection(ATCC))のような寄 託機関または種々の販売元から一般に入手できる。本発明に有用な生物学的活性 分子をコードする遺伝子で一般に入手できないものは、PCR増幅、オリゴヌクレ オチドのプローブを用いるゲノムおよびcDNAライブラリーのスクリーニングのよ うな標準的組換えDNA法を用いて入手し得る。生物学的活性分子をコードする既 知の遺伝子であればいずれも本発明の方法に用い得る。例えば、米国特許第5,04 9,493号; Gageら,米国特許第5,082,670号;およびGenentech米国特許第5,167,762 号参照。 本発明に特に有用な遺伝子には、ヒトプロエンケファリンＡ、ヒトプロホルモ ンコンバターゼ２、ヒトプロホルモンコンバターゼ３、ヒトBDNF、POMC（プロ− オピオメラノコルチン）、β-エンドルフィン、プロジノルフィン、ヒトNGFシグ ナル配列を有する成熟ヒトBDNF、ヒトCNTF、ヒトNT3、ヒトNGF、ラットGDNF、ヒ トNGFシグナル配列を有する成熟ヒトNT5、ウシドーパミンβヒドロキシラーゼ、 ウシドーパミンデカルボキシラーゼ、およびチミジンキナーゼをコードする遺伝 子がある。 目的の遺伝子（すなわち、適切な生物学的活性分子をコードする遺伝子）は、 標準的な技術を用いて適切な発現ベクターのクローニング部位へ挿入し得る。１ 個より多い遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し得るということが認識される。 これらの技術は当業者に周知である。 次いで、目的の遺伝子を含む発現ベクターは、本発明の方法で用いる細胞系を トランスフェクトするのに用い得る。リン酸カルシウム共沈澱、DEAE-デキスト ラントランスフェクションまたはエレクトロポレーションのような標準的なトラ ンスフェクション技術を用い得る。市販の哺乳動物トランスフェクションキット は、例えばStratageneより購入し得る。 目的の生物学的活性分子をコードする遺伝子を発現するために、広範な種類の 宿主／発現ベクターの組合せが用いられ得る。長期間安定なインビボでの発現は 、その中で生物学的活性分子をコードする遺伝子が、哺乳動物宿主中にインビボ で移植されたときにダウンレギュレーションを受けないプロモーターに作動可能 に連結しているような発現ベクター（すなわち、組換えDNA分子）を用いて達成 される。従って、そのような発現ベクターは、典型的にはレトロウイルスのプロ モーターを含まない。 適切なプロモーターは、例えば、SV40の初期および後期のプロモーターまたは アデノウイルスのプロモーターおよび遺伝子発現を制御できる他の既知の非レト ロウイルスのプロモーターを含む。 有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成のDNA配列（例えば、SV4 0およびE.coli由来のpUC、pBlue Script^TMプラスミドのような既知の細菌プラス ミドの誘導体（例えば、pBR322、pCR1、pMB9、pUC、pBlue Script^TMおよびそれ らの誘導体）のセグメントからなる。 ゲネチシン（G418）またはヒグロマイシン薬剤選択遺伝子を含む発現ベクター （Southern,P.J.(1981)，In Vitro，18,p．315，Southern,P.J．および Berg,P. (1982),J.Mol.Appl.Genet.，1,p.327）もまた本発明の実施に有用である。これ らのベクターは、目的の生物学的遺伝子（例えば、NGF）、および／または、G41 8またはヒグロマイシンＢのようなトキシンによる選択に対する耐性を付与する 遺 伝子の発現を起動する種々の異なるエンハンサー／プロモーター領域を用い得る 。G418耐性遺伝子は、培養培地に添加されたG418(100-500μｇ／μl)を酵素的に 不活性化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)をコードする。A PH遺伝子を発現する細胞のみが薬剤選択から生き残り、第二の生物学的遺伝子を も発現するようになる。ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（HPH）遺 伝子は、ヒグロマイシントキシンを特異的に改変し不活性化する酵素をコードす る。ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子と同じプラスミドと同時 にトランスフェクトされるか、またはプラスミドに含まれる遺伝子は、50-200μ ｇ／mlの濃度のヒグロマイシンＢ存在下優先的に発現される。 種々の異なる哺乳動物のプロモーターが、G418およびヒグロマイシンＢの遺伝 子および／または目的の生物学的遺伝子の発現を導くために用いられ得る。これ らのプロモーターは、hDBH（ヒトドーパミンβヒドロキシラーゼ）のプロモータ ー（Mercerら,Neuron,7,pp.703-716,(1991)）、hTH（ヒトチロシンヒドロキシラ ーゼ）（Kanedaら，Neuron,6,pp.583-594,(1991)）、hPNMT（ヒトフェニルエタ ノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ）（Baetgeら，PNAS,85,pp.3648-36 52,(1988)）、mGFAP（マウスグリア線維酸性タン白質）（Besnardら，J．Biol． Chem. ,266,pp.18877-18883,(1991)）、ミエリン塩基性タン白質（MBP）、mNF-L （マウスニューロフィラメント軽鎖サブユニット）（Nakahiraら，J.Biol.Chem. ,265,pp.19786-19791,(1990)）、hPo（ヒトPo、末梢神経系の主要ミエリン糖タ ン白質をコードする遺伝子のプロモーター）（Lemkeら，Neuron,1,pp.73-83,(19 88)）、mMT、rNSE（ラットニューロン特異的エノラーゼ）（Sakimuraら,Gene,60 ,pp.103-113,(1987)）その他を包含するがそれに限定されない。 用いられ得る発現ベクターの例は、市販のpRC/CMV、pRC/RSV、およびpCDNAlNE O(InVitrogen)である。薬剤選択および目的の生物学的遺伝子の転写を支配する ウイルスのプロモーター領域は、CNSにおいてウイルスプロモーターが受けるダ ウンレギュレーションの対象とはならない上記のプロモーター配列の１つと置 換される。例えば、GFAPプロモーターは星状細胞および星状細胞系のトランスフ ェクションに用いられ、THプロモーターはPC12細胞に用いられ、またはMBPプロ モーターは乏突起膠細胞に用いられる。 １つの実施態様において、pNUT発現ベクターが用いられる（図１参照）。さら に、DHFRのコーディング配列がG418またはヒグロマイシン薬剤耐性のコーディン グ配列により置き換えられるように、pNUT発現ベクターを改変し得る。pNUT発現 ベクター中のSV40プロモーターも、上記のように適切に構造的に発現される哺乳 動物のプロモーターと置き換えられ得る。 広範な種類の細胞が用いられ得る。それらは、既知の一般に入手可能な不死化 細胞系および分裂中の初代細胞培養株を包含する。適切な一般に入手可能な細胞 系の例は、幼若ハムスターの腎臓（BHK）、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO ）、マウス線維芽細胞(L-M)、NIHスイスマウス胎児(NIH/3T3)、アフリカミドリ ザル細胞系(COS-1、COS-7、BSC-1、BSC-40、BMT-10およびVeroを含む)、ラット 副腎クローム親和性細胞腫（PC12およびPC12A）、AT3、ラットグリア腫（C6）、 星状細胞および他の線維芽細胞系を包含する。用い得る初代細胞は、哺乳動物の CNSに由来するbFGF-応答性神経プロジェニター幹細胞（Richardsら,PNAS 89,pp. 8591-8595(1992);Rayら，PNAS 90,pp.3602-3606(1993)）、初代線維芽細胞、Sch wann細胞、星状細胞、β-TC細胞、Hep-G2細胞、乏突起膠細胞、およびそれらの 前駆体、筋原細胞などを包含する。 本発明の範囲内のカプセル化細胞による処置に利用され得る細胞のタイプは、 同種異系および異種の供給源由来の細胞を包含する。本発明者らのカプセル化の アプローチの主要な利点の１つは、本発明の膜が有する免疫隔離の性質、および 移植に適合しない細胞（すなわち、ヒト以外の供給源、不死化および／または腫 瘍細胞系）を支持する能力に依存する。同種異系細胞よりも異種細胞を使用する 特別の利点は、万一、膜に破損が生じた場合、異種細胞が同種細胞に比べ免疫系 による破壊の標的とされ易いということである。さらに、異種細胞の供給源は入 手が簡単であり、そしてその使用は、入手が困難でありそして社会的ならびに倫 理的考慮を伴うヒトの組織の使用の必要性を排除する。さらにヒトの組織は、移 植レシピエントへより容易に送達される外来性物質を含有することができる。最 終的に、ヒトに移植するために異種組織および細胞系を用いることは、ヒトの組 織の操作および処理に関連する危険性を除外する。 本発明の１つの実施態様において、pNUT増幅発現系を用いてBHK細胞をトラン スフェクトする。しかしながら、目的の遺伝子を含むるpNUTベクターはまた、前 述したようなCOS、L-細胞、CHOなどの多数の他の標準的な不死化または、形質転 換された組織培養細胞系をトランスフェクトするために用いられ得る。さらにpN UT発現ベクターは、初代の星状細胞、乏突起膠細胞または神経細胞系（例えば前 述したbFGF-応答性神経プロジェニター幹細胞）へトランスフェクトするために 用いられ得る。 本発明によって形質転換された細胞株は、生物学的に活性な分子の長期間の安 定な発現を提供し得る。このような長期間の安定な発現は、生物学的に活性な分 子をコードする導入遺伝子のコピー数を、当該分野で周知の増幅方法を用いて増 加または増幅させることにより達成され得る。このような増幅方法には、例えば 、DHFR増幅（例えば、Kaufmanら、米国特許第4,470,461号参照）またはグルタミ ンシンセターゼ(「GS」)増幅（例えば、米国特許第5,122,464号およびヨーロッパ 特許出願公開EP338,841号参照）が含まれる。 哺乳動物細胞で遺伝子の長期間の安定な発現を得るための別な方法は、２つの 異なる薬剤選択マーカーを用いる二重トランスフェクションによる。ヒグロマイ シンまたはG418耐性発現ベクターを用いて上記の多くの細胞株を連続的にまたは 同時にトランスフェクトし、種々の遺伝子コピーの挿入を達成し得、従って、目 的の遺伝子の発現レベルを達成し得る。 １つの実施態様においては、細胞は、β-NGFまたはGFAPプロモーター／エンハ ンサー因子（通常このベクターに見られるCMVプロモーター配列に取って代わっ ている）に作動可能に連結した他の目的の遺伝子のコーディング配列を含むプラ スミドpRC/CMVを用いてトランスフェクトされる。トランスフェクトされた導入 遺伝子を発現する安定なクローンの選択の際に、このクローンは、同じpRc/GFAP NGF発現ベクター(G418耐性遺伝子の代わりに細菌ヒグロマイシンBホスホトラン スフェラーゼ遺伝子(GritzおよびDavies、Gene、pp.179-188(1983))を有する)を 用いて再びトランスフェクトされる。安定なクローンをヒグロマイシンおよびG4 18の両方において再選択した後、この細胞は、RNAおよびタンパク質産物におい てトランスフェクトされた導入遺伝子の最大数の組み込まれたコピーおよび／ま たは発現を有するクローンに関してアッセイされ得る。この方式において、複数 のベクターを用いてトランスフェクトされた細胞株（高いコピー数の遺伝物質を 安定に組み込み、そして種々のレベルで目的の生物学的に活性な分子を発現する ）を産生するために、別の組み合わせの薬剤選択発現ベクターを用い得る。 ポリマー−カプセルの移植が有効量の必要な物質または機能を個体に提供する のに十分であり得るように、多数の細胞が本発明の方法において用いられ得る。 さらに、１より多い生物学的に活性な分子は、１つのカプセルから長期に亘って 安定に発現および／または送達され得る。 この結果に達する１つの方法は、１より多い異種遺伝子を発現するように遺伝 的に変更された単一の細胞株をカプセル化することである。 この結果に達する別の方法は、細胞の混合物を単一のカプセルに入れることで ある。ここで、ある細胞は１つの生物学的に活性な分子を発現するように遺伝的 に改変され、別の細胞は第２の生物学的に活性な分子を発現するように遺伝的に 改変されている。第２の生物学的に活性な分子を提供するために、遺伝子操作さ れていない細胞株も利用され得るということが認識されるであろう。 例えば、ある細胞株はまた、遺伝子操作されて異なる生物学的に活性な分子を 発現し得る。親細胞株のサブクローンは、それぞれが異なる導入遺伝子を発現す るが、このサブクローンはプールされ、カプセルに入れられて所望の効果を長期 間達成し得る。 これらのアプローチは、１より多い生物学的に活性な分子を１つの部位に長期 間、安定に発現および送達させるために複数の移植物を用いる必要性を排除する 。 本発明はまた、異種遺伝子（この遺伝子は、細胞が宿主哺乳動物内に移植され る際にカプセル内で生存可能のままであるようにし得る）によって遺伝的に改変 されている細胞を含むカプセルを用いることを意図する。言い換えると、本発明 の方法はまた、移植されたカプセル内の分子の送達方法に関する。 本発明の特定の実施態様において、本発明者らは、マウスメタロチオネイン プロモーターに作動可能に連結したヒトβ-NGF遺伝子を含むpNUT発現ベクターを 用いて、リン酸カルシウム共沈澱法によりBHK細胞をトランスフェクトした。 種々の生体適合性免疫隔離カプセルは、本発明による分子送達に適切である。 このようなカプセルは、宿主免疫系の有害な影響を最少にしながら代謝物、栄養 分および処置物質を通過させる。好ましくは本発明のカプセルは、Aebischerら 、PST公開WO 92/19195（本明細書中に参考として援用する）に記載のカプセルと 同じである。 最も好ましくは、本明細書に記載されたT1/2膜を用いて、本発明の方法に従っ て改変された細胞をカプセル化する。本明細書に記載されたT1/2膜はまた、他の いかなる適切な細胞または細胞株のカプセル化にも用いられ得ることが認識され るであろう。したがって、本発明のT1/2膜は初代細胞(primary cell)（非分裂細 胞）および分裂細胞をカプセル化するために用いられ得る。 有用な生体適合性ポリマーカプセルは、(ａ)１つの細胞または複数の細胞（液 体媒体に懸濁されているか、ヒドロゲルまたは細胞外マトリックス内に固定され ている）を含むコア、および（ｂ）単離された細胞を含まない選択透過性マトリ ックスまたは膜（ジャケット）（生体適合性であり、そしてコアに存在する場合 には、単離された細胞を有害な免疫学的攻撃から保護するのに十分である）の周 辺または末梢領域を含む。 ポリマーカプセルのコアは、コア内に隔離された細胞の連続した生存能力およ び機能のために適切な局所環境を提供するために構築される。 多くの形質転換された細胞および細胞株は、液体コアを有するカプセル内に非 常に都合よく隔離されている。例えば、細胞は、コアが栄養培地（任意に細胞の 生存能力および機能を維持するためのさらなる因子の液体供給源、例えば、胎児 ウシ血清、またはウマ血清を含有する）を有するカプセル内に隔離され得る。 マイクロカプセルもまた、時に本発明の方法および組成物における使用に適切 であり得る。マイクロカプセルの製造は、Espevikら、PCT公開WO 9107951号およ びSefton、米国特許第4,353,888号（本明細書中で参考として援用する）に記載 されている。 適切には、コアは、細胞凝集塊中の細胞の位置を安定させるヒドロゲルによっ て形成されるマトリックスから構成される。本明細書中の用語「ヒドロゲル」は 、架橋した親水性ポリマーの３次元網状組織をいう。この網状組織は、ゲルの形 態であり、実質的に水からなり、好ましくは90%以上が水であるゲルてあるが、 これに限定されない。 ヒドロゲルを形成する組成物は３つのクラスに分類される。第１のクラスは正 味で負の電荷(net negative charge)を有する（例えば、アルギネート）。第２ のクラスは正味で正の電荷(net positive charge)を有する（例えば、コラーゲ ンおよびラミニン）。市販の細胞外マトリックス成分の例は、Matrigel^TMおよび Vitrogen^TMを含む。繊維芽細胞は、一般に正に帯電したマトリックスにおいてよ く生存し、従って、細胞外マトリックスタイプのヒドロゲルに適切に封入される 。第３のクラスは、電荷的に正味で中性(net neutral in charge)である（例え ば、高度に架橋したポリエチレンオキシド、またはポリビニルアルコール）。任 意の適切なマトリックスまたはスペーサーをコア内で用い得る。これらは沈澱さ せたキトサン、合成ポリマー、およびポリマーブレンド、マイクロキャリアなど を含み、カプセルに入れられる細胞の成長特性に依存する。 好ましくは、カプセルは免疫隔離である。免疫隔離であるためには、カプセル の周辺または末梢領域は、宿主体内の有害な物質がビヒクルのコアに入るのを防 止することによって、および単離された細胞と宿主の免疫系との間の有害な免疫 学的接触を防止するのに十分な物理的バリアを提供することによって、カプセル が移植される宿主の免疫系からの細胞の保護を与えるべきである。この物理的バ リアの厚さは変化し得るが、それは、常にバリアの両側にある細胞および／また は物質の直接の接触を防止するのに十分な厚さである。この領域の厚さは、一般 に５ミクロンと20ミクロンとの間の範囲である；10ミクロン〜100ミクロンの厚 さが好ましく、そして20ミクロン〜75ミクロンの厚さが特に好ましい。このビヒ クルの使用によって防止されるかまたは最小化される免疫学的攻撃のタイプは、 マクロファージ、好中球、細胞性免疫応答（例えば、ナチュラルキラー細胞およ び抗体依存性Ｔ細胞介在性細胞溶解(antibody-dependent T cell-mediated cyto loysis:(ADCC))および体液性応答（例えば、抗体依存性補体介在性細胞溶解）に よる攻撃を含む。 免疫隔離カプセルの使用は、レシピエントを免疫抑制するという必要を伴わず に、異種細胞または組織の移植を可能にする。免疫隔離カプセルの使用はまた、 適合しない(unmatched)細胞（アログラフト）の使用を可能にする。異種細胞に 対する免疫応答のタイプおよび活動力は、同系のまたは同種の組織がレシピエン トに移植された場合に生じる応答とは異なることが予想される。この応答は、主 に細胞介在性の攻撃によって、または補体介在性の攻撃によって生じ得る；特定 の場合における決定(determining)パラメーターは、殆ど理解されていない。し かし、ビヒクルのコアからのIgGの排除は、免疫防御の規準ではない。なぜなら 、殆どの場合、IgG単独では標的細胞または組織の溶解を生じるには不十分だか らである。免疫学的攻撃の仲介に必要である重要な物質が免疫隔離カプセルから 排除されているならば、免疫隔離マクロカプセルを用いることによって、必要と される高分子量の産物を送達すること、または高分子量物質に適する代謝機能を 提供することが可能である。このような物質は、補体攻撃複合体成分(complemen t attack complex component)Clqを含み得るか、またはそれらは、食細胞または 細胞障害性細胞を含み得る；この免疫隔離カプセルは、これらの有害な物質と隔 離された細胞との間に防御的バリアを提供する。従って、免疫隔離カプセルは、 異種細胞からでさえ、広範な分子サイズを有する産生物（例えば、インシュリン 、副甲状腺ホルモン、インターロイキン３、エリスロポイエチン、アルブミン、 トランスフェリン、エンケファリン、エンドルフィン、カテコールアミン、ファ クターVIII、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、CNTF、GDNF、CDF/LIF、EGF、IGF、bFGF 、aFGF、PDGF、TGFなど）の送達に用いられ得る。 種々のポリマーおよびポリマーブレンドを用いてカプセルジャケットを製造し 得る。これらは、ポリアクリレート（アクリル酸コポリマーを含む）、ポリビニ リデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド 、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリスルホン、ポリホスファゼン、ポリア クリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロライド）、ならびにそ れ らの誘導体、コポリマー、および混合物を含む。 このカプセルは、生物学的活性を維持し、そして産生物または機能の送達のた めのアクセスを提供するのに適切な外形であり得る。たとえば、円筒形、矩形、 円盤形、パッチ型、卵形、星形、または球形を含む。さらに、このカプセルは、 メッシュ様またはネスト様構造にコイルまたはラップされ得る。カプセルが移植 された後に回収される場合には、外形は、カプセルの移植部位からの移動に導く 傾向の外形、例えはレシピエントの血管を移動するのに十分に小さい球形カプセ ルは好ましくない。特定の形、例えば矩形、パッチ形、円盤形、円柱形、および 平らなシート形は、より高い構造的に完全な状態を提供し、そして回収が望まれ る場合には好ましい。 本カプセルは、隔離された細胞の生存能および機能を維持するため、コア中の 任意の隔離された細胞がレシピエントの周辺組織(レシピエントの血流を含む)に 少なくとも１次元的に充分近くとなるように提供されなければならない。しかし 、カプセルを形成するために用いられる材料の拡散限界をもって、全ての場合に おけるその外形の限界を一通りに規定はしない。基本ビヒクルの拡散特性、即ち 栄養物または酸素輸送特性を変化し、あるいは増強する特定の添加物が使用され 得る。例えば、内部媒体は、酸素飽和ペルフルオロカーボン(oxygen-saturated perfluorocarbon)で補充され得、このため血液によって運搬された酸素と直接に 接触する必要性が減少する。このことにより、隔離された細胞は生存可能でいら れるが、一方、例えばアンジオテンシンの勾配がカプセルから周辺組織に放出さ れ、毛細血管の伸長を刺激する。ペルフルオロカーボンの使用についての参考文 献および方法は、Faithful，N.S.（1987）Anaesthesia,42,234〜242頁およびNAS A Tech Briefs MSC-21480，U.S．Govt．Printing Office，Washington，D.C．20 402により与えられ、この内容は本明細書中に参考として援用されている。 一つの実施態様において、移植可能なカプセルは、移植後の完全な回収のため に充分なサイズおよび耐久性がある。このようなマクロカプセルは、約１〜10μ lの好ましい最小容積のコアを有し、そして用途に依存して100μlを超える容積 を有するように容易に構成される。 好ましいカプセルは、60〜98%のBSA排除係数および50〜90%のオボアルブミン 排除係数の範囲の透過率である透過選択性(permselective)ポアサイズを有する 、内側の単一限外濾過膜を有する。カプセルは、PCT出願WO 92/19195に記載の通 り、外縁がシールされた平面シートの形態、または末端がシールされた中空のフ ァイバーの形態であり得る。平面シートの形式では、２枚の壁が1000ミクロン未 満、好ましくは300ミクロン未満の隙間の厚さで隔てられている。壁の厚さは約2 5〜200ミクロンの間、好ましくは約30〜75ミクロンの間であるべきである。 中空ファイバーの外形では、ファイバーは1500ミクロン未満、好ましくは300 〜600ミクロン未満の内径を有する。いずれの外形においても、流体透過率(hydr aulic permeability)は１〜100ml/分/M²/mmHgの範囲、好ましくは25〜70ml/分/M² /mmHgの範囲にある。Dionneら、ASAIO Abstracts，p.99(1993)およびColtonら 、The Kidney，Brenner BMおよびRector FC編、2425〜89頁(1981)に記載の通り 定義され、測定され、そして算出されたカプセルのグルコース物質移動係数は、 10^-6cm/秒より大きく、好ましくは10^-4cm/秒より大きい。 カプセルの外壁表面の形態は、変化しやすい。先に記載されたT1、T2、T4膜お よび本発明の新規のT1/2膜は、外壁表面の形態が異なる。これらの全ての膜は、 透過選択性の内皮により特徴付けられる。 T1膜は、「開いた」または窓のある非透過選択性の外壁表面および外壁表面と 内壁表面との間の柱状の壁構造により特徴付けられる。例えば、Lacyら、Scienc e ,254，1782〜84頁(1991)を参照のこと。T1膜の外壁表面の「マクロポア」の開 口部は、代表的には総外壁膜表面積の約20%〜40%を占める。代表的に、マクロポ アは、直径が10μm〜15μmであるかまたはより大きい。 T2膜は、内壁と外壁との間に類似の柱状構造(trabecular structure)を有する が、さらに「閉じた」またはより平滑な外表面壁によって特徴付けられる。T2膜 は、代表的には、外表面壁上に10%未満のマクロポアを有し、そして５〜15μmの 直径サイズの範囲では事実上マクロポアを有さないことを特徴とする。 さらにT4膜は、T1またはT2膜とは異なり、外表面も透過選択的である点でさら に異なる。T4膜は、脳室またはくも膜下腔ならびに液体に浸漬された他の移植部 位のようなCSF移植部位に有用である。 霊長類の脳実質または他の「固形の」組織移植部位に関しては、本発明者らは 、 細胞に対して実質的に非透過性の平滑壁カプセルを用いることを好む。微小血管 新生(microvascularization)を促進する開口壁について記載しているものもある (例えば、Braukerら、WO/92/07525を参照のこと)。T1およびT1/2カプセルは、長 期間移植物に特に適している。本発明者らはT1/2カプセルを好む。 T1/2カプセルは、総外表面壁面積の約２〜20%、好ましくは２〜15%の間の総マ クロポア分布によって特徴付けられる。マクロポアは、直径が約５μm〜約15μm のサイズ範囲内にあるべきである。この範囲内のポアサイズの相対的分布は変化 し得る。 １つの特定の実施態様において、PAN/PVCから作成されたT1/2中空ファイバー 膜カプセルが利用された。この実施態様によると、総マクロポア面積は、総外壁 表面積の約12%であった。マクロポアの約20%は、直径５〜10μmの範囲であり、 そしてマクロポアの約80%は直径が約10μmであった。 別の特定の実施態様では、総外壁表面積の約2.4%の総マクロポア面積を有する T1/2中空ファイバー膜カプセルが構成された。マクロポアの約17%は、直径が約 ５μmであり、約33%は直径が約10μmであり、そして約50%は直径が約15μmであ った。 別の特定の実施態様では、総外壁表面積の約10%の総マクロポア面積を有するT 1/2中空ファイバー膜カプセルが構成された。99%を超えるこれらのマクロポアは 、直径が10〜15μmの範囲であった。 任意の標準的な方法を用いて、外表面マクロポアの形態の定量化を行い得る。 本発明者らは、２つの方法を使用した。 一つの方法では、走査型電子顕微鏡に、中空ファイバー膜の切片を載せる。次 にファイバーの外表面を金でスパッタリングコート(sputter coated)した。1000 ×倍率の画像が生じる。1000×での走査型顕微鏡写真は、約9.2kμm²(115μm×8 0μm)の面積を含む。これらの画像上では、10μm直径のポアは直径が１cmである 。円形のテンプレートを用いて、全てのポアを15μm、10μm、５μm、または2.5 μmの直径のいずれかに分類し得る。外壁表面開口(即ちマクロポアとして)の総 パーセントを(全ポアが占める面積/顕微鏡写真の総面積)×100として算出する。 同様の計算を用いて、個々のポアサイズを決定する。 自動システムを用いて、定量化を行い得る。上記の通り、中空ファイバー膜切 片の1000×での走査型電子顕微鏡写真画像を調製する。イメージグラバー(image grabber)を用いて分析用に画像を保存する(SCION Image)。本発明者らは、NTH Image(バージョン1.55)と呼ばれるMacIntosh画像処理および分析プログラムを用 いて保存された画像を処理した。このソフトウエアは、組織学的サンプルの形態 的測定分析を実施するために開発され、そして本発明者らは、これを中空ファイ バーの形態測定分析に適応している。各ポアをカウントし、そして直径を割り当 てる。総マクロポア面積の算出および個々のポアサイズは上記の通りである。 本発明のT1/2ファイバーは、当該分野において既知である任意の適切な方法に よって調製され得る。ある方法では、Cabasso，I.，Encyclopedia of Chemical Technolology 、12、492〜517頁(1980)に記載の周知の方法を用いるルミナール(l uminal)およびキャスティング(casting)溶液の流速の適切な調整により、同軸紡 糸金口(coaxial spinneret)からポリマー性キャスティング溶液と凝集剤との共 押出成形を包含する。本明細書中に参考として援用されているDionne，WO 92/19 195および米国特許第5,158,881号、同第5,283,187号、および同第5,284,761号に 記載の通り、凝集剤は、生物学的組織断片、細胞小器官、または細胞および/ま たは他の治療剤の懸濁液を含み得る。 これらの方法に従って、T1膜は、急冷浴(quench bath)に入る前に空気を通し てのポリマー溶液および凝集剤溶液の共押出成形によって、形成され得る。T2膜 は、加湿空気またはミスト中そして次にバス中へのポリマー溶液および凝集剤溶 液の共押出成形によって、形成され得る。T4膜は、ポリマー溶液および凝集剤溶 液を直接凝集剤バスへ共押出形成することによって、形成され得、このため透過 選択性膜の形成が、外壁表面および内壁表面上で同時に起こる。 T1/2膜は、T2膜形成に用いられる同様の方法を用いて形成され得る。しかし、 所望の外表面形態を作成するための既知の方法に従って、共押出口でミストまた は湿度が制御され得る。あるいは、ルーチン法に従うと、急冷浴からのノズルの 距離は変化し得る。さらに、共押出形成を用いて膜をキャストする場合、ポリマ ーおよび凝集剤の絶対的および/または相対的流速を調整して所望の外壁表面形 態を達成し得る。最後に、ポリマーおよび凝集剤溶液の組成および温度を変化さ せ、所望の外壁表面形態を達成し得る。例えば、キャスティング溶液は、DMSO(w /w)中の10〜15% PAN/PVCであり得、そして凝集剤は水、またはその他の水性媒体 であり得る。あるいは、キャスティング溶液は、例えば、16% PAN/PVCであり得 、そして凝集剤は、例えば23℃で40% NMP、60% H₂Oであり得る。 カプセルをシールするいずれの適切な方法も用いられ得、この方法は、ポリマ ー接着剤および/またはクリンピング(crimping)、節止め(knotting)およびヒー トシールの使用を含む。これらのシール技術は当該分野において公知である。さ らに、いずれの適切な「乾燥」シール方法も使用し得る。このような方法におい ては、実質的に無孔性のフィッティング(fitting)が提供され、これにより細胞 含有溶液が導入される。充填に続いて、カプセルがシールされる。このような方 法は、本明細書中に参考として援用されている、同時係属中の米国特許出願第08 /082,407号に記載されている。 本発明の方法およびデバイスは、哺乳動物の宿主、レシピエント、被検体、ま たは個体、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトにおける使用が意図される。 本発明のデバイスおよび方法に関して、多くの異なる移植部位が意図される。 これらの移植部位は、脳、脊髄を含む中枢神経系、ならびに眼の眼房水および硝 子体液を含む。脳内の好ましい部位は、線条体体、大脳皮質、視床下核、および Maynert基底核を含む。他の好ましい部位は、脳脊髄液であり、最も好ましくは 、くも膜下腔および側脳室である。本発明はまた、腎被膜下部位、ならびに腹腔 内部位および皮下部位、または他の任意の治療的に有益な部位への移植を意図す る。 本発明の実施態様において、神経の変性によって引き起こされる疾患の処置の ための方法が提供される。神経の変性に関連すると考えられるヒト疾患の例とし ては、アルツハイマー病、ハンチントン病、AIDS関連痴呆、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、およびパーキンソン病が挙げられる。 神経変性状態のいくつかの動物モデルは、特定の傷害がニューロンを損傷また は死滅し得るという前提に基づいている。いくつかの場合において、このことは 、ニューロン死のカスケードを引き起こし得、特定の脳機能を担う経路に沿った 栄養的に相互独立したニューロンに影響する。 神経変性状態の処置のためのストラテジーは、 (１)シナプス後ニューロンに対するさらなる損傷を阻害し、そして (２)傷害を受けた細胞の生存能を改善するために、 成長因子または栄養因子の局所投与を包含する。ニューロンの生存能を改善する ことが知られている因子としては、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、CNTF、GDNF、CDF /LIF、bFGF、aFGF、IGF、ニューロテンシン、およびサブスタンス-Pが挙げられ る。 神経変性興奮性毒性(excitotoxicity)に対する動物モデルにおいて、グルタミ ン酸アナログであるキノリン酸を、線条体体および/または基底核と知られる脳 領域内に定位的に注入してハンチントン病を患う患者の神経病理および徴候と類 似の神経病理および徴候を生じさせる。モデルおよび実際のハンチントン病の両 者は、運動制御の局面に必要なニューロンに対する傷害によって特徴付けられる 。さらに、ハンチントン病の初期の徴候の一つは、体重の減少である(Sanbergf-Med J Aust. 、１、407〜409頁(1981))。同様の効果がモデル系においても認めら れる(SanbergらExp Neurol、66、444〜466頁(1979))。キノリン酸はまた、AIDS 関連痴呆を患うヒトにおいて異常に高いレベルで見出される。 ハンチントン病(HD)は、奇異な制御不能な運動および異常な姿勢を伴う進行性 の痴呆により特徴付けられる常染色体優性疾患である。HDは、ほぼ全ての民族お よび人種のグループに見出され、米国での罹患率は約50/1,000,000である(Emeri ch，D.F.およびSanberg，Neuromethods、21、65〜134頁(1992))。本疾患の症状 出現は、代表的には、中年(約35〜45歳)において生じ、続いて精神的低下および 進行性の運動異常の難治性の経過をたどり、通常15年以内に死を招く。HDの神経 病理学的研究により、関連し、そして相互に独立した神経化学的および組織病理 学的変異の複雑なモザイクが示されている。 HDの動物モデルを開発するために、種々の手段が検討されている。最近の研究 は、選択的細胞毒性化合物の使用から起こる線条体体損傷と歩行運動異常との間 の関係に集中している。グルタミン酸は、CNSに見出される主要な興奮性神経伝 達物質の一つである。しかし、それは強力な神経毒として作用し、そしてグルタ ミン酸およびその他の興奮性毒性化合物の比較的特異的な細胞毒性効果に基づく HDの動物モデルを開発するために、多くの試みが成されている。これらの化合物 として、カイニン酸(KA)、イボテン酸(IA)、および内因性トリプトファン代謝物 であるキノリン酸(QA)のようなグルタミン酸の構造的アナログが挙げられる。極 少量をラットの脳内に注入すると、これらの化合物は、通過線維の軸索および求 心性神経終末は残す一方で、著しくかつ局所的に限定された毒性効果を生産じる 。興奮性毒性の行動的、神経化学的、および解剖学的結果は、HDにおいて観察さ れた結果と類似し、そして内因性興奮性毒性化合物の異常な過剰生産または分解 が、HDの病因論的要因であるという推測が導き出された。 キノリン酸(2,3-ピリジンジカルボン酸でトリプトファンの代謝物)は、その強 力な興奮性毒性特性ならびにラットおよびヒト脳の両方における幅広い分布の故 に大いに注目されている(SchwarczおよびKohler、Neurosci．Lett.、38、85〜90 頁(1983)；およびSchwarczら、Science、219、316〜318頁(1983))。高濃度の異 化酵素(キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(QPRT))および直接の同化 酵素(3-ヒドロキシアントラニル酸(3HAO)が、尾状核(caudate)内に検出されたこ とから、これは、通常、線条体体の機能において役割を果たすことが示唆される (Fosterら、Brain Res.、336、207〜214頁(1985))。線条体体は、QAの興奮性毒 性効果に対して最も脆弱な構造にあり(SchwarczおよびKohler、(1983)、前出)、 そして新生の(成熟ではない)動物は、QAの毒性効果に耐性であるようである。こ のことは中年における代表的なHDの発症におおよそ対応する。 キノリン酸は、線条体体においてKAよりも選択的な変性効果を発揮すると報告 されている。KAは、HDの病理をより厳密にまねる(Beal、Synapse、３、38〜47頁 (1989)；およびRobertsおよびDiFiglia、Synapse、３、363〜371頁(1989))。KA と同様、QAの注入によりGABA感受性ニューロンの涸渇が生じ、一方、コリン作動 性ニューロンおよび外部起始の軸索を相対的に残す。KAまたはIAとは異なり、QA の線条体体内注入は、ソマトスタチン含有およびニューロペプチドＹ含有ニュー ロンを残すようであることから、このモデルは、本疾患において観察される神経 病理を最も厳密に再生することが示唆される(Bealら、J．Neuro Sci、８、3901 〜3908頁(1988)。 本発明に従って、細胞(適切な因子を分泌する遺伝的に改変した細胞を含む)を 含有するカプセルを移植することによって、適切な脳の領域に栄養因子が提供さ れる。ある場合において、遺伝的に改変した細胞は宿主に対して自己由来(autol ogous)であり、そしてカプセル化を必要としない。 ヒトNGFを発現するように操作されているBHK細胞のような神経成長因子分泌細 胞は、キノリン酸誘導性神経変性に対する療法の典型示す。 別の動物モデルでは、采-脳弓(齧歯類)または脳弓(霊長類)の傷害を包含する 。詳細には、中隔海馬系のニューロンを軸索切断して、中隔コリン作動性ニュー ロンのNGF-依存変性および細胞死を起こす。これらの傷害は、ヒトのアルツハイ マー病において影響されるのと同様の脳領域で変性変化を起こす。 本発明の方法に従って、NGFを分泌する遺伝的に改変した細胞を含むカプセル の移植によって、NGFが影響された領域に送達され得る。CNTF、BDNF、bFGF、CDF /LIFのような他の神経栄養因子もまた、中隔コリン作動性ニューロンの同様な集 団または重複しない集団を萎縮および/または死から保護し得る。好ましくは、 細胞は、組換えヒトNGFを産生するように遺伝子的に操作された線維芽細胞であ る。 脳弓の傷害もまた、動物被検体のモデルにおいて行動上の欠損(学習および記 憶に関する作業課題(task)において最も容易に観察される)を引き起こす。采-脳 弓の傷害を伴うラットへのNGFの慢性投与により動物の行動の回復が促進される ことが報告されている(WillsらBehav．Brain Res.、17、17〜24頁(1985))。本発 明において、NGF分泌細胞を含むポリマーカプセルの移植は、障害を受けた動物 の適切な脳領域に継続的にNGFを送達する実際的な方法を提供する。本発明のカ プセルは、病態が特定の脳領域へのNGFの継続的な送達によって改善され得るア ルツハイマー患者に対する治療および/または予防処置の実際的な形態を提供す る。 本発明の方法および組成物は、神経変性から生じる、年齢に関連した認識性欠 損の処置に用いられ得る。このような処置は、認識パフォーマンスを増大し得、 従って徴候的な利益を提供する。あるいは、処置は徴候的な利益はないものの、 神経保護効果を提供し得る。ヒトにおける年齢に関連した認識機能不全および痴 呆は、ニューロン変性、特にコリン作動性基底前脳ニューロンのニューロン変性 、ならびに皮質および海馬のChATのレベルの低下に関連付けられている(Coyleら 、Science 、219、1184〜90頁(1983)；Whitehouseら、Science、215、1237〜39頁(1 982)；Phelpsら、Neurobiol．Aging、10、205〜07頁(1989)；Gageら、Neurobiol ．Aging 、９、645〜55頁(1988))。コリン作動性基底前脳ニューロンを選択的に 破壊することによって痴呆の齧歯類モデルを作成する試みの前臨床研究では、広 範で持続的な認識機能の欠損を生じさせることに失敗した。老齢ラットは、老齢 かつ痴呆の患者において報告された神経病理と同様の神経病理を示す。Morris水 迷路による空間学習は、これらの病理学的プロセスの有害な効果に極めて敏感で ある(Morris、J．Neurosci．Meth.、11、47〜60頁(1984)；Morris、Learning an d Motivation 、12、239〜60頁(1981))。この作業課題は、年齢に関連した認識機 能の尺度として妥当化されている。この作業課題における老齢ラットのパフォー マンスは、それらの運動、感覚運動または視覚の欠損、学習および記憶に関する 他の試験を混同させる要因とは強くは関連していない(Gamzu、Ann．NY Acad．Sc i. 、444、370〜93頁(1985))。 空間地図の発達が要求される認識作業課題(Eichenbaumら、J．Neurosci.、10 、3531〜42頁(1990))として、Morris水迷路は、臨床的設定における老化および 痴呆傾向の障害に対して特に敏感な認識機能の非言語試験に類似すると思われる 。従って、この作業課題は、痴呆の潜在的な新しい処置の評価に有効と思われる 。例えば、いくつかの研究は、外因性NGFが老齢および学習障害ラットにおけるM orris水迷路のパフォーマンスを改善すると報告している。例えば、Fischerら、Nature 、329、65〜68頁(1987)；Fischerら、J．Neurosci.、11、1889〜1906頁(1 991)を参照のこと。 NGFは、容易には脳血液関門を横切らないため、そのCNSへの投与には、血液脳 関門の完全性を弱める侵入手順の使用を要する。例えば、外因性NGFの潜在的有 効性を示した齧歯類の前臨床試験においては、NGFは浸透圧ミニポンプで、また は慢性脳室内カニューレによって投与された。これらの技術は、カニューレによ る注射またはポンプ(これは、リザーバーが涸渇するごとに交換しなければなら ない)からのいずれかによる脳内への反復注入を要する。ポンプリザーバーを取 り替え、または注射シリンジをカニューレにより再挿入しなければならないが、 そのたびごとに混入物が特に感染を受けやすい脳内に導入され得る、別の機会が あることを示す。 滅菌手順を注意深く使用しても、感染の危険は存在する。集中治療室において でさえ、頭蓋内圧をモニターするために使用する脳室内カテーテルが、約３日後 に細菌に感染する(Saffran、Perspectives in Biology and Medicine、35、471 〜86頁(1992)。感染の危険性に加えて、注入手順に関連するいくつかの危険があ ると思われる。脳室への注入は水頭症を生じることが報告されており(Saffranら 、Brain Rresearch、492、245〜254頁(1989))、そして実質内への溶液の連続注 入は壊死に関連している。 胎児組織の使用は倫理的関心から明瞭にされておらず、そして非カプセル化非 胎児細胞は拒絶されるか、または腫瘍を生じ得る。さらに、胎児供給源(fatal s ource)から採取した組織は、高い生存能があり得る。NGF産生細胞をカプセル化 することによって、比較的低い感染の危険性で、胎児組織を使用することなく、 そして組織拒絶または腫瘍発生の危険性無く、外因性NGFが供給され得る。 最後に、既に使用されている用量での外因性NGFが、それ自体で有害または毒 性であるかどうかについての懸念が表明されており、おそらくアルツハイマー病 に関連する神経変性のプロセスを促進さえすると思われる(Saffran、Perspectiv es in Biology and Medicine 、35、471〜86頁(1992)。外因性NGFは、もつれ形成 (tangle formation)を促進し、脳血流の変化を潜在的に招く血管周囲の交感神経 軸索の軸索発芽を開始させ、あるいはまだ影響を受けていない基底前脳ニューロ ンは機能不全となり、従って、痴呆のプロセスが促進されるような外因性NGFに 応答する基底前脳ニューロンの投射をリモデリングする。(Saffran、Perspectiv es in Biology and Medicine 、35、471〜86頁(1992))。 本発明の１つの局面によると、年齢に関連した認識性の欠損(ハンチントン病 、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびALSを含む)の処置のための外因性 NGFの有益な効果は、外因性hNGF送達に効果的であると既に報告されている用量 よりもかなり低い用量で得られる。 既に報告された用量のNGFの投与は、所望しない副作用を有し得る。それらに は、著しい体重の減少、疼痛、意気消失、低食症(hypophagia)およびヘルペス感 染症の再発が含まれる。 本発明によると、(インビボで合成された)NGFの脳室、脳実質、または他の適 切なCNSの場所へのカプセル送達(１〜1500ng/日の範囲)が望ましい。NGFまたは 他の適切な因子の実際の用量は、より少ないまたはより多い数のカプセルを移植 することによって変化し得る。本発明者らは、脳室への送達については、１〜15 00ng NGF/ヒト/日、好ましくは10〜600ng NGF/ヒト/日、最も好ましくは50〜500 ng NGF/ヒト/日、そして実質への送達については１〜1500ng NGF/ヒト/日、好ま しくは10〜150ng NGF/ヒト/日を意図する。これらの用量の範囲は、特に、用量 を齧歯類、霊長類、およびヒト間の脳容積の差を考慮して規格化すると、齧歯類 の研究および霊長類の研究においてCBFニューロンのスペアリング(sparing)/発 芽(sprouting)に必要なNGFの既に報告された用量(17〜350μg/日)よりもかなり 低い。Tuzynskiら、J．Neurosci.、10、3604〜14頁(1990)；Koliatsosら、Ann． Neurol. 、30、831〜840頁(1991)、Koliatsosら、Experimental Neurol.、112、1 61〜73頁(1991)；Dekkerら、Neuroscience、60、299〜309頁(1994)。評価された １例の臨床患者においては、送達されたNGFの用量は75μg/日であった。(Olson ら、J．Neural Trans.、４、79〜95頁(1992))。１つの実施態様において、ヒトN GF(hNGF)を分泌する遺伝的に改変された細胞を半透過性膜内にカプセル化し、そ して適切な哺乳動物宿主、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトの脳室内また は実質内に移植する。 本発明をさらによく理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は 例示のみを目的とするものであって、そして如何なる様式によっても、本発明の 範囲を限定するように解釈してはならない。 実施例 実施例１：成体ラットのCNSに移植するカプセル化NGF分泌BHK細胞 ヒトβ-NGFの発現およびBHK細胞株の生産 プレ−プロ形態のNGFの完全なアミノ酸配列をコードするβ-NGFのヒト遺伝子 を、SV40プロモーターにより操作される変異形態のジヒドロ葉酸レダクターゼ( 例えば、Kaufmanの米国特許第4,470,461号を参照のこと)を含む発現構築物中の マウスメタロチオネインプロモーターの後に、サブクローニングした(図１)。 β-NGF遺伝子の５'末端および３'末端をコードする２つのヒトゲノムクローン をATCCから購入した(phbeta N8D8、phbeta N8B9)。phbeta N8D8由来の440bpのSc a1-EcoR1フラグメントの5'側を、phbeta N8B9から単離した2.0kbのEcoR1フラグ メントの３'側に連結した。スプライシングしたNGFゲノム配列は、第１イントロ ンの３'末端の約37bp、プレ−プロNGFのタンパク質翻訳を開始すると考えられる ２重のATG配列、ならびにヒト遺伝子の完全なコーディング配列および３'側の非 翻訳領域全体を含んでいた(Hoyleら、Neuron 10，pp.1019-1034(1993))。2.51kb の結合したβ-NGF構築物を、pNUT発現ベクターを基にしたDHFR(Baetgeら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA ，83，pp.5454-5458(1986))のマウスメタロチオネイン- Iプロモーター(-650〜+7)およびラットインスリンII遺伝子(Palmiter R.D.ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA ，88，pp.478-482(1991))の第１イントロンの直ぐ下 流にサブクローニングした。pNUT-β-NGF構築物(図１を参照のこと)を、標準的 なリン酸カルシウム介在トランスフェクション方法を用いて、BHK細胞に導入し た。トランスフェクトしたBHK細胞を、200μMメトトレキセート(Sigma)を含有す る培地で３〜４週間選択し、そして耐性の細胞を、200μMメトトキセレートとと もにまたは含まないのいずれかでポリクローナル集団として維持した。 NGF生物活性の定量 神経成長因子(NGF)は、PC12細胞で神経突起の顕著な伸長を引き起こし、そし てそれ自身が、NGF生物活性について迅速かつ感度の良いアッセイを提供する。N GFトランスフェクトしたBHK細胞により生産されたNGFの生物活性を試験するため に、親BHK細胞(BHK-コントロール)およびBHK-NGF細胞由来のならし培地(CM)を、 ６ウエルの標準組織培養プレートで生育したPC12A細胞(SchweitzerおよびKelly ，J．Cell Biol.，101，pp.667-676(1985))に添加した。コントロールとして、2 5SのマウスNGFをいくつかのウエルに添加し、神経突起を誘導した(50ng/ml)。PC 12A細胞を、１〜４日間にわたり細胞体の直径の長さを３回以上測定した神経突 起について記録した。NGFバイオアッセイはまた、移植したコントロールカプセ ルおよびNGF分泌性BHK細胞充填カプセルの修復に基づき、カプセル由来のCMを新 鮮な培地で24時間インキュベートしたカプセルから取り出した純粋なPC12A細胞 に添加することにより行った。全ての実験では、BHK-NGF細胞由来のCMは、24時 間以内にPC12A細胞で丈夫な神経突起伸長を生じ、このことはBHK細胞から生産さ れたNGFが生物活性であることを示す。BHKコントロールは、並行した実験でPC12 A細胞の神経突起伸長を起こすこのような能力を示さなかった。 神経突起伸長がbFGFのようなNGF以外の因子によるかどうかを決定するために 、本発明者らは、CMおよび組換えhNGFを組合せてNGFブロック抗体(マウス抗β-N GF；Boehringer-Mannheimカタログ番号1008-220)を添加した。このブロック抗体 の添加は、用量依存様式でPC12A細胞由来の神経突起伸長を十分に阻害した。最 後に、本発明者らは、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の存在について、ELISA によりBHKコントロール細胞のならし培地をプロービングする１組の実験を行っ た。bFGF ELISA(Research and Diagnostics Systems，Quantikine^TM，ヒトFGF塩 基性ELISAキット；Burgessら、Ann．Rev．Biochem，58，p.575(1989))を用いる と、本発明者らは、BHK細胞由来の多量のならし培地中の任意のbFGFを検出し得 なかった。これら両方の実験は、BHK-NGF CMに応じてPC12A細胞で見られる神経 突起伸長が分泌NGFの存在によることを明らかに示す。 NGF ELISA カプセル化および非カプセル化BHK-NGF細胞由来のNGF発現の定量を以下のよう に行った：全ての試薬は、他の記載がない場合、Boehringer Mannheim Biochemi calsから入手した。Nunc-Immuno MaxiSorp ELISAプレートを、コート緩衝液(CAC l₂およびMgCl₂/0.1％アジ化ナトリウムを含有しない１×PBS；pH9.6)中、１ng/m lの抗マウス-β(2.5S)神経成長因子を１ウエルにつき150μlでコートした。コー トしたプレートを、37℃で少なくとも２時間、あるいは４℃で一晩インキュベー トした。コート溶液をウエルから回収し、そしてウエルを300μlの洗浄緩衝液(5 0mM Tris-HCl/200mM NaCl/10mM CaCl₂/1% Triton X-100/0.1%アジ化ナトリウム ；pH7.0)で、３回洗浄した。次いで、ウエルを10mg/mlのウシ血清アルブミン(BS A)を含む300μlのコート溶液で、室温にて少なくとも30分間ブロックした。次い で、ウエルを300μl洗浄液で３回洗浄した。ならし培地のサンプルを、２×サン プル緩衝液(サンプル緩衝液は、2% BSA含有すること以外洗浄緩衝液と同じ である)中に１：１希釈した。100μlの調製サンプルを、ウエルに充填した。プ レートを覆い、次いで37℃で少なくとも２時間または４℃で一晩インキュベート した。溶液を、吸引によりウエルから除去し、そして300μlの洗浄緩衝液で３回 洗浄した。各ウエルに、4U/mlの抗マウス-β(2.5S)神経成長因子-β-gal結合体 を100μl添加した。プレートを少なくとも１時間37℃でインキュベートした。溶 液を吸引によりウエルから除去し、300μlの洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後に 、200μlのクロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド基質溶液(100mM H epes/150mM NaCl/2mM MgCl₂/0.1%アジ化ナトリウム/1% BSA中40mg CPRG；pH7.0) をウエルに添加し、そして37℃でインキュベートした。約30分〜１時間後または 発色が570nmでの光度測定に十分になった後、サンプルをプレートリーダー上で 分析し、そして組換えNGFタンパク質標準に対して測定した。 c-fos誘導アッセイ PC12A細胞へのNGF投与により起こる定量的なc-fos誘導を、免疫蛍光アッセイ により測定した。PC12A細胞を、１mlにつき100,000細胞の密度で、ポリオルニチ ン処理したガラスカバーグラス(12mm)上に播き、そして24ウエルプレートで少な くとも24時間平衡化した。細胞を、神経突起伸長バイオアッセイのセクションに すでに記載したように、同じ培地中で増殖した。 PC12A細胞におけるc-fos誘導について試験するために、BHKおよびBHK-NGF細胞 、または組換えヒトNGF(50ng/ml)を含有するカプセル由来のならし培地を、PC12 A細胞に２時間添加し、そして37℃かつ5% CO₂でインキュベートした。このイン キュベーションの後、カバーグラスを4%パラホルムアルデヒド(0.1M PBS、pH7.4 中)で固定し、PBS中の10mMグリシンで２回洗浄し、1% Triton X100(PBS中10分間 )および1% nonidet P40(PBS中10分間)で透過した。カバーグラス上の細胞をPBS で５分間の洗浄を３回行い、PBS中の5%正常ヤギ血清(NGS)で１時間ブロックし、 そしてPBS中1% NGSで1:10希釈したc-fosに対して生じたウサギポリクローナル抗 血清(Oncogene Science)中で３時間インキュベートした。次いで、カバーグラス をPBSで５分間の洗浄を２回行い、そしてフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギIgG抗 体とともにインキュベートした。最後に、カバーグラスをPBSで２回洗浄し、そ してCitifluor^Rアンチフェーデント(antifadent)で固定し、そして蛍光顕微鏡で 観察した。蛍光を顕微鏡によりモニターし、そしてc-fos誘導を、蛍光標識した 核の存在により測定した。 カプセル化の手順 不均斉な単一皮膚中空ファイバーを、ジメチルスルホキシド中12.5%ポリ(アク リロニトリル塩化ビニル、すなわちPAN-PVC)コポリマー(w/w)の溶液からキャス トした。製造プロセスは、Cabasso、Encyclopedia of Chemical Technology，12 ，pp.492-517(1980)によりドライーウエット(ジェット)スピニング技法を用いる 相転位として公知である。スピニングプロセス後、中空ファイバーを、25%グリ セロールを含有する蒸留水浴に無菌的に移した。このことは、乾燥手順の間に完 全なポアを維持する方法を提供する(Cabasso，1980，前出)。製造したファイバ ー(XP11)は、450±25μmの内径、53ml/(m²分mmHg)の液浸透性、88.7±2.1%のBSA 排除係数、82.0±1.7%のオボアルブミン排除係数、および約8×10^-4cm/秒のグル コース質量移動係数を有するT1/2膜タイプであった。乾燥後、デバイスを、６〜 ７mmの長さの乾燥中空ファイバーを遠位のシールで、近位末端に中隔定着物を有 する光硬化アクリレートハブ上にマウントすることにより製造した。近位末端は 、デバイスの内腔に注入される細胞のための充填アクセスを有する。グリセロー ルを、濾過滅菌した70%エタノールでデバイスから除去し、そしてカプセル化を 行う前にHBSS中に入れた。 細胞を以下のように予め製造したカプセル化デバイスに充填した：BHKコント ロール細胞またはBHK-NGF細胞のいずれかを、約10⁷/mlの密度で予め製造したデ バイスに充填した。２×10⁷/mlの密度のBHK細胞懸濁液を、生理学的Vitrogen^R(C eltrix，Palo Alto，CA)と１：１で混合し、そして中隔アクセスポートから予め 製造したデバイスに注入した。２〜2.5μlの細胞懸濁液を注入後、中隔を破り、 そしてアクセスポートを光硬化アクリレート(Zeneca)を用いてシールした。BHK 細胞充填デバイスを、移植前に、無血清培地であるPC1(Hycor)で４〜５日間維持 した。インビトロで３または４日後、細胞を充填したカプセルをHBSSで２回洗浄 し、そして1mlの新鮮な培地に入れ、ELISAによりNGFについて分析した。 成体ラットCNSにおけるβ-NGFの長期発現 本発明者らのインビトロでの実験は、BHK細胞でのヒトβ-NGFの長期で安定な 高レベルの発現を示した。この長期で安定な発現がインビボで達成され得るかど うかを決定するために、本発明者らは、BHK細胞を含有するカプセルを成体Lewis ラットのCNSに移植した。 移植前に、BHK-NGFカプセルおよびBHKコントロールカプセルから採取したなら し培地(CM)を、上記のようにNGFについて神経突起伸長アッセイに供した。BHK-N GF細胞由来の0.5mlのCMは、神経突起伸長の程度について、50ng/mlの外因的に添 加したNGFと同等であったが、BHKコントロール細胞由来のCMは、検出可能なレベ ルのNGFを含んでいなかった。 カプセルを、成体Lewisラットの線状体に１、３、および６カ月間移植した。 上記の説明に基づき、カプセルを、神経突起伸長アッセイによりNGFの生産につ いて試験した。 インビボで１、３、および６カ月後、BHK-NGFを充填したカプセルは、50ng/ml のNGFと同等またはより大きいPC12A細胞で神経突起伸長を生じ得た。NGF活性は 、BHKコントロールカプセル由来のCMで検出できなかった。表Ｉに示すように、 カプセル化BHK-NGF細胞由来のサンプルのELISA定量は、３および６カ月後のイン ビボにおいて、約20ng/24時間/カプセルまで放出した。 実施例２：ラットにおける采−脳弓損傷の研究 カプセル化NGF分泌BHK細胞(実施例１に記載のとおり)が、インビボで有効量の NGFを放出する能力を評価するために、采−脳弓吸引性損傷(aspirative lesion) を14匹のLewisラットで定位手術で行った。損傷の直後、実施例１に記載のよう に、BHKコントロールまたはBHK-NGF充填XP-11デバイスを損傷部位に定位手術で 移植した。 被験体 約３カ月齢であり、そして約300グラムの体重の成体の雄Lewisラット(Harlan Breeders，Indianapolis，IN)を以下の研究に用いた。動物を３つのグループで 温度および湿度を制御したコロニー部屋で飼育し、その部屋は、0700時に点灯す る12時間の明／暗サイクルで維持された。 定位手術 手術の直前に、ラットを、ケタミン、キシラジン、およびアセプロマジン混合 物の筋肉内注射で麻酔をかけ、そしてKopf定位手術器具(Emerichら、1992参照) に置いた。矢状切開を頭皮に行い、そしてブレグマから2.0mm後方に、そして3.0 mm側方にわたり開頭手術を行った。20ゲージのチップを有する吸引デバイスを、 定位手術フレーム(Kopf Instruments)にマウントし、そして内壁皮質(medial pa rietal cortex)、帯状皮質(cingulate cortex)、脳梁、海馬の背面、視床の背面 、および采−脳弓を、ブルグマの1.40mm後ろに吸引チップを置き、そして矢状洞 の直ぐ側方に5.0mmの深さまでそれを入れ込むことにより吸引した。次いて、ブ レグマの3.0mm側方の位置に達するまで、チップを0.5mmずつ側方に動かす。吸引 直後に、定位フレームにマウントした18ゲージのテフロンカテーテル内にカプセ ルを置くことにより、ラットに、トランスフェクト(N=8)または非トランスフェ クトBHK細胞含有カプセル(N=6)のいずれかを片側に移植した。各デバイスは、直 径600ミクロンで長さ0.7cmを測定し、そして約15〜25×10³細胞を含んでいた。 ステンレス鋼オブドュレーター(obdurator)をカニューレ内に置き、外側のカ ニューレが予め調製された窩内にカプセルを無抵抗に置けるようになるまで、オ ブドュレーターをその場所に保持した。移植のための定位手術座標は、ブレグマ より0.5mm後方、矢状縫合の1.0mm側方、および皮質表面より7.5mm下方であった 。 組織学 動物に手術後３週目に麻酔をかけ、そして組織学的分析用に調製した。動物を 、以下のものでペリスタポンプを用いて、心臓を介して(transcardially)灌流し た：20ml生理食塩水(0.9％、室温)、120mlのグルタルアルデヒド(0.1％)、500ml の0.1％グルタルアルデヒド/4％パラホルムアルデヒド、300mlのパラホルムアル デヒド(4％)、および最後に300mlの10％スクロース。全ての溶液を氷冷し(４℃) 、そして他に記載がない場合、リン酸緩衝化生理食塩水中(pH=7.4)で調製した。 固定後、脳を取り出し、25％緩衝化スクロース(pH=7.4)に入れ、そして24〜48 時間冷却した。組織を低温槽で20μmの間隔で切り、そしてポリリジンでコート したスライドにマウントした。中隔全体を通しての３番目毎の切片を保存し、以 下のプロトコールに従ってコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)免疫反応性 について処理した：(1)0.8％ Triton X-100＋10％正常血清を含むPBS中で一晩イ ンキュベーション、(2)1:1000の希釈した一次抗体(ChATに対するヤギ抗血清；Ch emicon)とともに48時間インキュベーション、(3)PBS＋0.2％ Triton X-100で６ ×５分のすすぎ、続いて、ビオチン化二次抗体(IgG)中で1.5時間インキュベーシ ョン、(4)PBS＋0.2％ Triton X-100中で６×５分のすすぎ、(5)1.5時間、アビジ ン−ビオチン結合体(ABC、Vector elite)とともにインキュベーション、(6)PBS 中で３×５分のすすぎ、(7)蒸留水で５分のすすぎ、(8)0.1％ Tris緩衝液に溶解 した3,3-ジアミノベンジジン(DBA)(0.05%)＋2%ニッケルアンモニウム硫酸塩とと もに５分間インキュベーションし、続いて５分間過酸化水素(0.01%)でインキュ ベーション、(9)反応をPBSで３×１分のすすぎにより停止した。 切片をマウントし、脱水し、そしてカバーグラスを載せた。隣接した切片をヘ マトキシリンおよびエオシン(H+E)で染色した。采−脳弓の吸引後に生じた損傷 の広がりを確認するために、10番目毎の切片を海馬全体を通して取り出し、そし てVan Ooteganら(Brain Res．Bull.，12，pp.543-553(1984))の方法に従ってア セチルコリンエステラーゼについて染色した。コリン作動性細胞の損失を定量す るために、ChAT陽性ニューロンを10×の倍率で対角帯(diagonal band)の中隔の 内側および鉛直肢(vertical limb)で計数した。各動物由来のブレグマから約0.7 、0.5、および0.2mm前方に位置する代表的な切片(脳あたり３つ)をこの分析のた めに用いた。 NGF放出の結果 移植後3.5週後、動物を麻酔し、そしてデバイスをシリコーン鎖をゆっくりと 引っ張ることにより回収した。各カプセルを、１mlの培地で24時間インキュベー トし、そしてCMをELISAによりNGFについてアッセイした。移植の前および後のNG F分泌レベルを表IIに掲げる。 全ての動物の海馬および中隔から採取した組織学的切片を、海馬ではアセチル コリンエステラーゼ(AchE)、中隔ではコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT) について免疫細胞化学により試験した。海馬でのAchE免疫反応性を、損傷の完全 性の第二の指標として用い、そして中隔でのChAT免疫反応性は、移植および損傷 の結果としてコリン作動性細胞体の減少または萎縮の証拠を提供した。海馬の損 傷対コントロール部位のAchE免疫染色の代表的な比較では、損傷部位へ求心性の AchEのほぼ完全な損失を示した。 BHKコントロールおよびBHK-NGF移植動物の損傷後3.5週の中隔に残っている総C hAT-陽性ニューロンを計数し、そして合わせた結果を図２に示す。ChAT-陽性ニ ューロンの定量は、BHKコントロールカプセルを用いると、非損傷側と比較して 、15±3％のみのニューロンが、脳の損傷側で陽性のままであり、一方、BHK-NGF カプセルを用いると、90±5％のコリン作動性ニューロンがChATについて免疫陽 性であった。カプセル化細胞の生存は、BHKコントロールとBHK-hNGF細胞充填カ プセルとの間で等しかった(データは示さず)。 実施例３：霊長類の脳弓損傷 実施例２は、本発明のBHK細胞から成体ラットの采−脳弓損傷を有する側脳室 へのhNGFの慢性送達が、損傷の結果死んでしまうであろう中隔内側のコリン作動 性ニューロンを保護することを示した。同様の実験をヒト以外の霊長類で行った ことを本明細書に記載する。サル(Cebus apella)の脳弓の損傷を起こさせること は、(KordowerおよびFiandaca，J．Comp．Neurol.，298，pp.443，(1990))に記 載されている。 成体カニクイザルを、これらの損傷実験で用いた。一側性損傷を完了した後、 実施例１に記載されるように5個のXP-11カプセルデバイス(番号により同定され る)を、中隔内側の、損傷に同側に近接する側脳室内に手で置いた。コントロー ルとして、いくつかの動物に、BHKコントロール細胞を充填したデバイスを移植 した。移植手順に続いて、手術部位を閉じ、そして動物を回復させ、そして3.5 週間綿密にモニターした。3.5週の生存期間に続き、番号を付けたカプセルを注 意深く取り出し、そして標準細胞培養培地に入れ、そして次いで、移植前である として、NGF放出についてELISAにより再アッセイした(表III)。次いで、動物を アルデヒド固定剤を灌流することにより屠殺し、そして脳を、組織化学および免 疫組織化学手順のために切片にし処理した。 表IIIに示すデータは、２匹のBHK-NGFを移植したサルおよび１匹のコントロー ルのサルの分析を示す。同じ研究で追加の６匹の動物からのNGF放出データのそ の後の分析は、移植前までにカプセルにより生じたhNGFの平均レベルが、NGF EL ISAにより測定されるように、回収したカプセルにおいて21.4±2.0ng/カプセル/ 24時間および8.5±1.2ng/カプセル/24時間であることが明らかになった。各サル に５つのカプセルを移植したので、動物１匹につき生じたNGFの総量は、移植前 および移植後１カ月ではそれぞれ107ng/24時間および41.5ng/24時間であった。B HKコントロールカプセルは、検出可能なhNGFを生産しなかった(25pg NGF/mlまで 感度のあるアッセイ)。 動物は、直ぐに手術から回復し、そして実験の間生存していた。BHK-hNGF含有 カプセルを受けている動物は、嗜眠状態であり、手術後数日間減少した食欲を示 した。これらの動物うち１匹はまた、複数の発作が手術後約２日で始まり、そし て手術後５日以内におさまることを示した。このような合併症は、BHKコントロ ール細胞移植物を受けたいずれの動物にも示されず、そしてBHK-hNGF動物とBHK コントロール動物との間の違いは、手術後の最初の１週間後では観察されなかっ た。 BHKコントロール移植物を受けている１匹の動物のポリマーのカプセルを、イ ンサイチュに残して置いた。全ての他のサルにおいては、BHK細胞充填デバイス を、移植後23〜28日の側脳室から、カプセルに宿主組織がほとんど付着しないよ うに回収した。 カプセル取り出し時の視覚的観察に基づき、全てのカプセルを、側脳室内に位 置させ、そして尾状核の頭および中隔外側の両方で隣接させた。全てのカプセル を完全に取り出し、いずれのカプセルもインサイチュまたは回収の手順のいずれ かの間で壊れなかったことを証明した。細胞充填デバイスを１匹のBHKコントロ ール動物にインサイチュで残したままにし、デバイスの位置を示し、そして宿主 組織の応答を評価した。この動物および全ての他の動物におけるカプセルへの宿 主の応答は最小であった。かなり少量の反応性グリアが存在し、これは、全て観 察された場合、移植片−宿主の界面で外接した位置でのみ見られた。さらに、マ クロファージのような他の非ニューロン細胞は、移植片の周辺領域内で観察され なかった。 全てのサルは、損傷の同側の海馬内のアセチルコリンエステラーゼ含有線維の 広い損失により示されるような、脳弓の完全な横断切開を示した。移植されてい ないか、またはBHKコントロール(NGF非分泌)細胞移植物を受けたかのいずれかで あるコントロールのサルは、互いに異ならず、そしてコリンアセチルトランスフ ェラーゼおよびp75 NGFレセプター(NGFr)−免疫反応性ニューロンの広い損失を 、損傷の同側の対角帯の中隔内側(MS;それぞれ53および54％)および鉛直肢(VLDB ;それぞれ21および30％)内で示した。対照的に、BHK-hNGF細胞の移植物を受けた サルは、コリン作動性ニューロンのあまり大きくない損失のみを中隔(それぞれ1 9および20％)およびVLDB(7％)内で示した。さらに、hNGF分泌細胞の移植物のみ が、中隔内でコリン作動性線維の稠密伸長を誘導し、これは、移植部位に隣接す る脳室の上衣内層に対して分岐した。回収したカプセルの試験は、検出可能なレ ベルのhNGFを、培養でPC12A細胞を分化するために十分な濃度で生産する大量の 細胞を示した。 実施例４： ハンチントン病動物モデルにおけるＢＨＫ−ＮＧF移植片の効果 Ａ．齧歯類 手術と移植 手術の直前に、Lewisラットをペントバルビタールナトリウム(45mg/kg，i.p.) で麻酔しKopf定位器に置いた。頭皮に矢状切開を施し、２ヶ所に穴をあけNGFを 分泌するBHK細胞を含有するXP-11ポリマー製カプセルを（実施例１に記載した様 に）側脳室に設置した。ラットの片側あるいは両側の移植は定位枠に取り付けた 18ゲージのテフロン製カテーテル中にカプセルを入れ、それを適切な位置に低下 させて行った。移植の定位座標は以下のとおりである：ブレグマ(Bregma)の0.5m m前方、矢状縫合の1.5mm側方、皮質表面の8.0 mm下方。 約1週間後、動物を麻酔し、定位器に設置して225(片側)または150(両側)nmol のQAあるいはリン酸緩衝化生理食塩水を賦形剤として、線条体に以下の座標で片 側に注射した：脳表面から下方にAP=+1.2mm、ML=±2.6mm、DV=5.5mm。QAを２Ｎ 水酸化ナトリウムに溶解してpH7.2のリン酸バッファーで希釈し、最終pHを7.4、 最終濃度を225nmol/μlとした。QAの各線条体への注入は28ゲージのハミルトン シリンジを用い５分間にわたって1μl量の条件で実施した。注射カニューレをそ の場所にさらに２分間放置し潅流の拡散を可能にした。この手順の結果３つの実 験グループが形成された：1)キノリン酸のみ(QA)、2)キノリン酸+NGF-分泌BHK細 胞(QA/NGF)、および3)キノリン酸+NGF非分泌BHK細胞(QA/NON-NGF)。手術後ただ ちに、動物に10mlの乳酸化リンガー溶液を腹腔内注射した。手術後、動物はマッ シュ飼料と水を自由摂取で飼育した。 行動試験 回旋行動： 片側のキノリン酸注射後10日目から、動物を、自動化されたデータ収集用に IBMコンピューターを接続した自動化回旋計測器(Rotoscan，Omnitech Instrumen ts)中でのアポモルヒネ誘導回旋行動試験に供した。まず動物を5分間の慣らし期 間のために試験チャンバーに置き、次いでアポモルヒネ(1.0 mg/kg、0.1%アスコ ルビン酸を含有する標準の生理食塩水中)を注射し、続く30分間の間に試験した 。 アポモルヒネにより誘導された回旋行動の増感作用は、線条体の刺激毒性損傷の 後で起こる。それゆえ、動物の試験は各セッションを３ないし４日の間隔を開け て４回実施した。回旋は完全な360度の同側の回旋で定義され、２方向間の正味 の差として報告された。 自発的運動能力： 手術前および両側QAの30日後に、それぞれの動物を自動化Digiscan-16 Anim al Activity Monitor System(Omnitech Electronics，Columbus，Ohio)の５個の 開放場ボックス中の１個に入れ、１時間の試験期間中の運動能力を試験した。以 下に示す行動変数を収集した：(1)水平活動(HA)：水平センサー中断の総数；(2) 総距離(TD)：インチで表現した動物の移動距離；(3)移動回数(NM)：移動１回毎 に増加するこのパラメーターは最後の中断から少なくとも１秒間分離された光線 の遮断によって記録された；(4)移動時間(MT)：秒で表現した動物の移動に要し た時間；(5)平均速度(AS)：cm/秒で表現した動物の移動の平均速度；(6)平均距 離(AD)：インチで表現した動物が１回の移動発作中に移動した平均距離；(7)垂 直活動(VA)：垂直センサーにおける光線中断の総数；(8)垂直時間(VT)：このパ ラメーターは動物が垂直センサーの光線を遮断する間に増加した；(9)垂直移動 回数(VM)：これは少なくとも１秒間分離された垂直センサーの光線中断により増 加する；(10)常同症的移動数(NS)：このパラメーターは同じ光線が１秒間隔で繰 り返し遮断されると増加した；(11)常同症時間(SC)：常同症に費やされた時間の 蓄積。 カタレプシー： 運動活動試験１日後、動物にD1およびD2ドーパミンレセプターのアンタゴニス トであるハロペリドールとSCH2388を投与した後、運動機能減少(カタレプシー) の試験を実施した。カタレプシーは、動物の後ろ足を台の上に置き、前足を台の 上9.0cmの所に吊るした水平棒(直径0.6cm)に置く棒試験により測定した。動物に 生じたカタレプシーの度合いは、自分自身を棒から引き離すのにそれぞれの動物 がどれだけの時間を要したかで測定した。許容範囲は最高300秒までとした。動 物を３つの処置グループの１つにランダムに割り当て、ハロペリドール(1.0 mg/ kg)、SCH23388(1.0mg/kg)あるいはコントロール賦形剤(0.9%生理食塩水)のい ずれかを注射した。棒試験は、薬物および／またはコントロール賦形剤の投与後 １、２、３、および４時間後に再度実施した。すべての動物の試験は、各処理条 件のもと３〜４日の間隔をおいて実施した。 結果 すべての動物は、試験セッションの繰り返しの中でアポモルヒネに対する感受 性を増した。図３に示す様に、QAはアポモルヒネで誘導した回旋行動の顕著な増 加を生じさせた。非NGFグループの動物は、QAのみを受けた動物と差がなかった 。しかし、QAと同時にNGF分泌BHK細胞を受けた動物は(表IV、QA片側を参照のこ と)すべての試験セッション期間の間、回旋行動の有意な減少を示した。 片側QA後に見られた行動保護と一致して、動物は、QAの両側注射により生じた 活動亢進状態の減少を示した。QAのみ、またはQAおよび非NGF分泌BHK細胞移植物 を受けた動物(即ちBHKコントロール)は、移植前のレベルの約100〜350%の範囲で 活動の増加を示した(図４)。対照的に、QAと同時にNGF分泌BHK細胞を受けた動物 (表IV、QA 両側)は、非NGF処理動物に比較して非常に減少した、移植前の値の 約25〜150%の範囲の行動レベルを示した。 同様の行動保護パターンが、両側QA動物をカタレプシーについて試験した時に も見られた。QAを単独で、あるいは非NGF分泌BHK細胞と組み合わせて受けた動物 は、４時間の試験期間中、ハロペリドールとSCH23390の後、約30〜60秒の継続時 間の範囲のカタレプシー時間を示した(図５)。対照的に、QAおよびNGF分泌BHK細 胞を受けた動物は、強いカタレプシー応答を、ハロペリドール(180〜220秒で)お よびSCH23390(150〜220秒で)の両方に対して示した。全体にまとめると、これら の結果より、ポリマーでカプセル化したBHK細胞の事前移植は、QAの片側、両側 いずれの注射後にも観察された行動結果を顕著に減少し得た。 Ｂ．霊長類 上記の研究を霊長類に拡張した。 ４匹のカニクイザル(cynomologous monkey)が、実施例１に記載した様にXP-11 ポリマーでカプセル化したBHK-hNGF細胞の移植物を受けた。４匹のコントロール のサルは、hNGF構築物を欠く同じカプセル化BHKコントロール移植物を受けた。 それぞれの動物において３個の移植物を尾状核の頭部に、そして３個の移植物を 後方被殻に設置した。座標はMRIガイダンスに基づいた。 手術は標準的な手法を用いて実施した。サルは麻酔した。無菌条件化で、正中 線に基づいたＵ字型の切開を行い、右側線条体の上にある頭蓋骨を露出させた。 高速ドリルを用いて線条体の上にある２cm×３cmの頭骨切開を行い、脳骨髄硬膜 はＵ字型の態様を反映した。次いで３個のポリマーカプセル移植物を右方尾状核 の頭部に定位的に設置し、そして３個のカプセルを右方被殻に定位的に設置した 。つなぎ綱(tether)は、後の検証と回収を容易にするために皮質の表面で切断し た。脳脊髄硬質と頭蓋帽を再び相接させてもとの場所に縫合し直した。皮下組織 は4-0 Coated Vicryl逆縫合糸で縫合し、皮膚は4-0 Ethilon縫合糸を用いて通常 の方法で閉じた。 カプセル移植の１週間後、サルは、尾状核と被殻のカプセル移植物の直ぐ近傍 に、キノリン酸注射を受け、サルのビデオテープ撮影を、通常の条件下およびア ポモルヒネ処置の後に、週に１回、移植の１週間前にはじまりそして損傷の後３ 週間に開始して２週間の間実施した。カプセルは屠殺の直前に取り出した。 それぞれのカプセルからのhNGF放出レベルはELISA法で定量した。回収の際の カプセルからのこのhNGF放出の生物的活性の適切さは、PC12細胞を用いたバイオ アッセイにより評価し、移植したBHK細胞の生存率はニッスル染色で評価し得る 。サルの脳は、ChAT、GAD、NADPH、NPY、ソマトスタチン、およびニッスルのた めに免疫組織学的に処理した。損傷領域はニッスル染色セクションで定量され、 ChAT-ir、GAD-ir、NPY-ir、ソマトスタチン-ir、NADPH染色細胞は両側で定量さ れる。 実施例５： ヒトCNSへのNGFの送達 近年Olsenら(J．Neural Transmission，4，pp．79-95(1993))は、ミニポンプ システム(Medtronic)を用いた脳室内注入によるマウスNGFの投与について報告し た。この注入システムを腹壁(abdominal wall)の皮下に移植し、皮下カテーテル によって脳室内カテーテルに接続した。この脳室内カテーテルは頭骨の2mmバー の穴を通して右側の脳室に挿入した。総量32.4mlのマウスNGFを３ヶ月の期間に わたって注入した。 1-10 XP-11からヒトNGFを放出するカプセル化BHK細胞を用いる臨床試験におい て、カプセルは中隔と尾状核の間に位置する脳室空間または選択した新皮質／海 馬領域に定位的に設置した。カプセルは24時間当たり50〜500ngのヒトNGFを放出 した。カプセルは３〜12ヶ月移植したままにしておき、その間患者は行動と生化 学的改善についてモニターされ得る。患者は以下を含まむがそれに限定はされな い一連の認識機能試験によって評価され得る：(1)ミニ精神状態試験(mini-menta l state examination)：これは認識機能のレベルを評価するために用いられる(F olsteinら，J．Psychiatr．Res.，12，pp．189-198(1975))；(2)顔認識試験(Bac kmanら，Psychol．Aging，6，pp．489-492(1991))；(3)即時および遅延(30分)空 間記憶試験。患者はまた多くの非侵害的な方法でコリン作動性機能および血流の 検査についてモニターされ得る。死後のインビトロ研究の結果、コリン 作動性ニコチンレセプターはアルツハイマー病では消失している事が示されてい る(NordbergおよびWinblad，Neuroscience Lett.，72，pp．115-119(1986))。陽 電子射出断層撮影（PET）を用いて、ニコチンレセプターの利用性と機能の指標 としての¹¹C-ニコチンの取り込みを視覚化し得る。さらに¹¹C-ブタノール(butam ol)を用いて、脳の様々な領域における脳血流を評価し得る(Herseovitchら，J． Cereb．Blood Flow Metab. ，7，pp．527-542(1987))。 実施例６： 鎮痛剤の送達 以下の実施例では、エンケファリンを分泌する自己細胞の使用により、末期ガ ン患者における慢性の痛みの緩和に対する本発明の使用を示す。神経幹細胞は、 将来の被験者より摘出した脳側室の側背面の脳室下領域から得た１mgの脳組織バ イオプシーから得た。胚海馬前駆細胞の増殖集団は、大脳皮質、海馬、間脳、線 条体、および／または中隔の組み合わせで、bFGFの存在下、Richardsの方法(Ric hardsら，Proc．Natl．Acsd．Sci．USA，89，pp．8591-8595(1992))に従って得 られる。増殖中の前駆細胞は、メタロチオネインのような構成的なプロモーター によって駆動されるエンケファリン遺伝子を含むpNUTベクターを用いてトランス フェクトされ、上述のとおりメトトレキセートによって選択される(例えば、Kau fmanら、米国特許第4,740,461号参照)。成功した形質転換体は、選択薬剤に対す るそれらの耐性によって同定され、異種遺伝子の発現レベルはラジオイムノアッ セイ(RIA)によって確認される。 約250,000の未分化前駆細胞をSagenの方法(Sagenら、米国特許第4,753,635号) で被験者のCSFに直接移植する。移植の後、幹細胞は複製の数サイクルの内に分 裂を停止し、エンケファリン発現グリア細胞へと分化する。CSF内における増加 したエンケファリンの持続的な存在は、数日から１ヶ月内にの被験者の鎮痛をも たらす。 上述した細胞、あるいはウシ副腎クロム親和性細胞は、例えば本発明のT1/2膜 カプセルでカプセル化して、ヒトの脳室あるいはクモ膜下腔に移植され得る。 実施例７： T1/2 膜の製作 T1、T2およびT1/2中空ファイバー膜の製作は、米国特許第5,158,881号、同第5 ,284,761号、および同第5,283,187号に記載された共押出成形紡糸技術と類似の 技術により行った。表ＶにこれらT1、T2およびT1/2膜の特徴を示す。これらの膜 の注型溶液は12.5% PAN/PVC(Dynel)のDMSO溶液(w/w)であった。溶液は使用前に0 .22μmフィルターで濾過した。ファイバーは凝固溶液としての脱イオン水(Milli Q)の入った23℃の水浴中で紡糸した。ノズルの寸法は以下のとおりである：口環 (面板)0.650mm、キャピラリー0.475mm。ポリマー流速(unitless)はGilmont ♯0 flowmeter(GFO)で計測した。凝固剤流速(unitless)はGilmont ♯4 flowmeter(GF 4)(unitless)で測定した。T2およびT1/2膜については、ノズルと冷却浴の間の空 気空隙の環境を、室内湿度調節装置を用いたミストチャンバー内で湿度調節した 。表Ｖ中のT1/2ファイバーの破壊強度は19.3±0.5グラムであった。 これらのカプセルは移植に際して組織の内部成長の低下を示し、破損なしに10 0%の回収率を示した(10中10)。 表Ｖに記載したT1/2 XP-11ファイバーは総外壁表面域の約12%の総マクロポア 域を有していた。約20%のマクロポアは直径が５〜10μmの範囲にあり、そして約 80%のマクロポアは直径約10μmであった。 やはり共押出成形で作製した第２のT1/2膜は、内径522.5±10μmで、外径670 ±11μmであった。 ポリマー性キャスティング溶液は、12.5% PAN/PVCのNMP溶液(w/w)であった。 ボア凝固溶液と浴は、23℃の水(MilliQ脱イオン化)であった。ポリマー流速はGi lmont flowmeter ♯0で測定したところ25psiで63であった。凝固剤流速はGilmon t ♯4 flowmeterで測定したところ58psiで69であった。ノズル口環(面板)直径は 650μmであった。キャピラリーO.D.は400μm、キャピラリーI.D.は310μmであっ た。ノズルと冷却浴の間の空気空隙は8.0インチであった。空気空隙の環境は雰 囲気空気であった(ミスト無し)。 応用流体力学的浸透率は約35.0ml/(m²分mmHg)であった。破壊強度は31.0±0.3 グラムであった。これらのファイバーは総外壁表面域の約10%のマクロポア域を 有していた。99%以上のこれらのマクロポアは、直径が10〜15μmの範囲にあった 。 第３のT1/2膜を共押出成形で作製した。重合注型溶液は16.0% PAV/PVC(Mw約40 K)のNMP溶液(w/w)で、10%の水を含んでいた。ボア凝固液と浴溶液は23℃の40%NM P、60%水であった。ポリマー流速はGilmont ♯0 flowmeterで測定したところ28p siで40であった。凝固剤流速はGilmont ♯4 flowmeterで測定したところ15psiで 97であった。ノズル寸法は以下のとおりであった：キャピラリーO.D．400μmお よび口環I.D.650μm。ノズルと冷却浴との間の空隙は10.3インチであった。 空気空隙の環境は室内湿度調節装置を用いてミストチャンバー内で湿度調節した 。 T1/2ファイバーは内径約545μm、外径約639μmであった。これらのファイバー の応用流体力学的浸透率は、約29ml/(m²分mmHg)であった。破壊強度は29.3±0.5 グラムであった。これらのファイバーは、総外壁表面域の約2.4%の総マクロポア 域を有していた。約17%のマクロポアは直径約５μm、約33%は直径約10μm、そし て約50%は直径約15μmであった。 これらのT1/2中空ファイバーは非対称である；これらは密な内側の選択透過性 障壁と大きなマクロヴォイド小柱壁構造とを有する。外側表面は宿主組織の浸潤 にはほんの僅か開放されているが、残りは多孔性(即ち選択的て無い)であるが宿 主組織の内部成長に対して閉鎖されている。 実施例８： 老齢ラットにおける認識機能の改善 本研究では、痴呆の齧歯類モデルにおける、カプセル化したNGF産生ベビーハ ムスター(BHK)細胞の潜在的な治療効能を評価した。さらに、ラットは、毒性の ような、処置による非認識効果についても試験された。その理由から、ラットの 苦痛閾値はホットプレート装置で評価した；そしてラットは有害な効果の証拠に ついて、それらの死亡率、体重、昼／夜サイクルを通しての活動レベルに関連し て調べられた。 細胞のトランスフェクションと培養 細胞は実施例１に記載のように調製した。 細胞のカプセル化 個々の長さ7.0±0.5 mmのT1/2(XP1193-001)カプセルを実施例７に記載のよう に作製した。カプセルの内径は425〜500μmのサイズ範囲にあり、壁の厚みは50 〜65μmの範囲であった。これらの膜の公称分子量カット・オフ値は、デキスト ラン運搬ふるい実験で測定したところ約100kDであった。 ファイバーデバイスは、細胞の添加接近について近位端で隔膜の固定物を持ち 、そして遠位端でシールされていた。BHK細胞は単細胞懸濁液として調製し、そ して隔膜口に10⁴細胞／μlの密度で、生理的コラーゲンと１：１で混合した後注 入した。202.5μlの細胞懸濁液を注入した後、隔膜を除去し、そして接近口をシ ールした。BHK細胞を添加したデバイスは、移植の前、PC-1培地に４〜５日間維 持した。３または４日後、カプセルをハンクス調節塩溶液でリンスし、そしてhN GFをELISAで分析するために一晩新鮮な１mlのPC-1培地中に置いた。 カプセルのNGF産生評価 BHK-NGFを添加したカプセルから放出されたhNGFの定量は、２部位の酵素免疫 アッセイで実施した。Boehringer Mannheimにより記載されたプロトコールを改 変し、Nunc-Immuno Maxisorp ELISAプレートを使用した。発色(30分)の後、サン プルをプレートリーダーで分析し、そして組換えマウスNGFタンパク質を標準と して測定した。カプセルは所定の範囲のhNGF産生を示した。すべてのラットが同 等量の外因性hNGFを受けることを保証するため、それぞれのラットに明白に高い hNGF産生カプセル１個と明白に低いhNGF産生カプセル１個を移植した。 ラット 雄性Fischer 344ラットをNational Institutes of AgingのHarlan Sprague Da wley aging rat colonyから購入した。比較的高齢のこのラットは引退した繁殖 動物であった。これらのラットは行動試験開始前の1.5ヶ月間コロニー室で慣ら し、その間ずっとNIH-31飼料で生命を維持した。カゼインを含む飼料を用いると F-344ラットにおける腎不全の発生が高く、問題となる老齢の動物モデルとして のそれらラットの使用を可能とする。NIH-31飼料は大豆蛋白を含むので寿命を伸 ばし、随意に飼料を与えたF-344ラットにおける重度の慢性腎臓病の発生を劇的 に低減させる。このことから、腎臓疾患が老化研究におけるそれらの使用を混乱 させることは無い。Winnら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，pp．2324-28(19 94)参照。行動試験開始時、ラットは3.3ヶ月(n=30)、18.5ヶ月(n=45)、および24 .6ヶ月(n=60)であった。結果におけるラットの年齢は、試験のその部分の間のそ れらの実際の年齢で表した。 カプセル移植 ラットの麻酔はケタミン(33mg/ml)、キシラジン(1.7mg/ml)、およびアセプロ マジン(10mg/ml)の混合物1.0ml/kgを注入して実施した。ラットはKopf定位器に 置き、頭皮に矢状切開を施し、脳室にポリマーカプセルを設置するために適切な 座標にバー穴をあけた。ラットへの移植はカプセルを定位枠に取付けた18-ゲー ジテフロン製カテーテルに入れて実施した。ステンレス鋼製のオブジュレーター (obdurator)をカニューレ内に入れ、デバイスを脳内に低下させ、側脳室内のカ プセルを動かない様に設置するために外のカニューレを上げる間、オブジュレイ ターを適所に維持した。移植のための定位座標は以下のとおりであった：ブレグ マの0.5mm前方、矢状縫合の1.5mm側方、および皮質表面の7.5mm下方。移植物を 受けていないラットには疑似手術を施した(麻酔、頭皮切開、頭蓋ドリル、およ び脳脊髄硬膜せん刺)。 死亡率 日付と一般的外観をそれぞれのラットについて死亡した日に記した。研究を完 了したラットの死亡した日付は潅流日付として記録した。 体重 ラットの体重は動物飼育施設到着時から、週に一度測定した。 モリス水迷路(Morris water maze) 装置： 直径1.5m、深さ76cmのガラス繊維製黒色タンクに、水深32cmまで水(2 1℃)を満たした。10cm×10cmの矩形の台を、参照およびワーキングメモリー試験 の間、水面下0.5cmに沈めた。指示試行試験(cued trial)の間、台は木製のジベ ルで出来た白色の筒(高さ39cm、直径1.2cm)を台から垂直に立てて印を付けた。 探試行試験(probe trial)には折り畳み式の台を使用した。Poly-Track Software を搭載したSA-3 Tracker(San Diego Instruments，San Diego，CA)を、白色のラ ットが黒色のバックグラウンドを移動するのを追跡して座標を記録するのに使用 した。カメラを水面の178cm上に設置し、タンクの中心に向けた。タンクは、部 屋の周囲でタンクの縁の下に位置する２個の18ワット蛍光灯と４個の50ワット白 熱灯で照明された部屋で、壁に向けて置いた。大きな122cm×183 cmの白黒視覚 指示(チェッカー盤と標的中心円)をタンクそばの反対側の壁に設置した。 参照記憶試験と処置の割り当て： 静止台を、タンクの中央と外壁との中間に すべての試験について設置した。４個の４分円弧のランダムな位置から開始する 方法を使用した。試験はラットが台を見つけたとき、または２分たった時点で終 了した。各試験の後、ラットを台の上に10秒間置いた。手術の前、ラットは最初 の７セッションについては１日あたり１回受け、次の８セッションについては１ 日あたり２回受けた。手術の後は、移植後15〜19日に１日あたり１セッションを ５日間受けた。 移植後探試験： 折り畳み式の台を参照記憶試験で使用したのと同じ４分円弧 の中央に設置した。台は試験開始時は低位置にあり、そして30秒後に高位置に上 昇させた。ランダムな位置から開始する方法を使用した。試験はラットが台を見 つけたとき、または２分たった時点で終了した。各試験の終了時、ラットを台の 上に10秒間置いた。データは最初の30秒間のみ収集した。最初の30秒間(台がタ ンクの底に折り畳まれているとき)にラットが台の位置を泳いで渡る回数を記録 した。ラットは、移植後参照記憶試験が行われたのと同じ日に、１日あたり１試 験を５日間受けた。探試験と参照記憶試験の順序は、ある日とその翌日で交互さ せた。 移植後指示試験： ゴムバンドで上部に固定された黒色カバーを有する静止台 を、参照記憶試験で使用したのと同じ４分円弧の中央に設置した。３個の木製ジ ベルを、１つを他の上部にテープでつなぎ、そして黒色カバーに取り付けた。ラ ンダムな位置から開始する方法を使用した。探試験完了の後、ラットは３回の試 験を試験間の間隔無しに受けた。 移植後のワーキングメモリー試験： 静止台を、セッション毎に４個の４分円 弧すべてからランダムに選択した新たな場所に設置した。ランダムな位置から開 始する方法を使用した。１セッションは試験間の間隔無しで３回の試験からなり 、移植後26〜29日目の４日間実施した。他のシリーズのワーキングメモリーモリ ス水迷路試験は、試験間の間隔を２時間とって、手術後30〜35日目の６日間行っ た。試験はラットが台を見つけたとき、または２分たった時点で終了した。最初 の２試験の終了時に、ラットを台の上に10秒間置いた。 ホットプレート侵害受容閾値 ホットプレートは50℃に熱してプレキシガラス製の箱で覆った。ラットをプレ ートに乗せ、不快の兆候(例えば、足をなめる、足を早く軽く打つ)が示されたら 直ちに取り出した。たとえなんら不快な兆候が示されなくても、試行は60秒後に 停止した。応答までの潜伏期間を依存する測定値として記録した。移植の45日前 に、ラットは１日１試行を５日間受け、これら５試行の平均をベースラインパフ ォーマンスとして計算した。手術の15日後に、別の５セッションを１日あたり１ 回行った。最後に、手術の35日後に別のセッションをホットプレートで実施した 。手術後のフォン・フレイ(von Frey)毛体知覚機能 計量した7.37、12.5および20.9gのフォン・フレイ毛を使用した。ラットをテ ーブルから45cm上に上げた網目状の床(120×45cm)にのせ、透明なプラスチック 製のケージ(24×14×13cm)で覆い、10分間順応させた。フォン・フレイ毛を、後 ろ足の底に対して、足の裏の皮膚に、曲がり始めるまで押し付け、１秒当たり約 ２回の接触の頻度で最高20回まで押し付けた。ラットが20回の接触の後応答しな くなった場合、21の値が割り当てられた。閾値において、ラットは足を早く軽く 打つ、足を引っ込める、足をなめるなどして応答した。毛は左右の後ろ足にラ ンダムな順序で存在した。ラットは手術後１セッションを受け、そして左側と右 側の平均値を使用した。 活動レベル ラットを、視野計の回りに赤外光線のならび(Integrated Animal Monitoring System，Omnitech Electronics，Inc.)を有し、ベータチップの薄層を底に敷い たプレキシガラス製のケージ(42cm×42cm×30cm)に、5:00pmから9:00amまで(消 灯は8:00pmから8:00amまで)、移植の前後に入れた。光線の遮断回数を変換して 、16時間のセッションの１時間当たりの総移動距離とした。 データ解析 データの解析にはSAS-PC^TMを使用した。分散の解析には、適所に繰り返し測定 値のためのオプションを用いて一般線形モデルに対する手順を使用して実施し、 クロンバックの係数αを内部信頼性の測定値として計算した(SAS Institute Inc .，1989)。ω²を、効果の大きさの測定値として計算した(DoddおよびSchultz，J r.，Psychol．Bull.，79，pp．391-95(1973))。積限界法を用いたSAC-PC PROC L IFETEST法を、階級に従った生存の分布を評価するために使用した。log-rankテ ストを、階級間の生存の同等性を検定するために使用した。死亡率以外、すベて の報告し解析したデータは、研究の終了まで生き残った実験動物のデータに限定 した。 カプセルのhNGF産生 14個すべての(非トランスフェクト・コントロールからの)カプセル化したBHK- コントロール細胞は、外植の時点で0ng/20時間のNGFを放出していた。43匹の、 両側にBHK-NGFカプセルを移植したラットが研究の終了まで生存した。移植前のB HK-NGFカプセルからのhNGF産生は0.80ng/20hrから17.4ng/20hrの範囲にあり、外 植後は0.00ng/20時間から12.1ng/20h時間であった。各動物の２個のカプセルか らのhNGF放出の総計は、移植前が11.5±0.56ng/20時間であり、外植後の測定で は7.3±0.75ng/20時間に減少した。移植前の２個のカプセルからのhNGF放出の総 計および外植後の総計のいずれもが、どの水迷路試験の反応性とも相関しなかっ た。 死亡率 動物飼育施設到着時のラットは1.8ヶ月(n=30)、17ヶ月(n=45)、および23.1ヶ 月(n=60)であった。最も若齢のラットの０匹、中齢ラットの45匹中７匹(15%)、 および最も高齢のラットの60匹中18匹(30%)が、動物飼育施設到着と約65日後の 手術予定時との間に死亡した。 手術および麻酔からの回復の間に死亡したラットはどの月齢集団にも無かった 。最も若齢のラットの０匹、カプセル化BHK-NGF細胞を移植した中齢ラットの18 匹中１匹(5.5%)、最も高齢のコントロールラット20匹中４匹(20%)、およびカプ セル化BHK-NGF細胞を移植した高齢ラットの22匹中６匹(27%)が、移植時と約40日 後の安楽死予定時の間に死亡した。 安楽死時点のラットの生存数とそれらの月齢は以下のとおりである：合計N=99 の研究の最後まで生存したラットについて、それぞれ5.4ヶ月(n=30)、20.6ヶ月( n=37)、および26.7ヶ月(n=32)。これら99匹の生存ラットについてのデータのみ が、以下に報告するデータのセットの解析に含まれた。 体重 最も若齢のラットは体重が最も軽く、中齢ラットは最も重く、そして最も高齢 のラットは中間の体重であった。年齢がデータの分散、ω²=0.89、F(2,81)=722. 6、p=.0001、の大部分を説明した。体重は手術前の８週間で有意に変化した。最 も若齢のラットが体重の増加を続けた一方で、中齢および最も高齢のラットは連 続的に体重を減少させた。ラットのグループ割り当ては、移植前の体重には基づ かず、モリス水迷路の参照試験における移植前の反応性に基づいて行った。その 結果、中齢ラットでは、カプセル化BHK-NGF細胞を移植する予定のラットは、コ ントロール群に割り当てられたラットほど(移植前の時点で)非常に重くはなかっ た。 体重は手術後の４週間で変化した。移植／疑似手術の後、最も若齢のラットが 体重の増加を続けた一方で、中齢および最も高齢のラットは体重の減少を続けた 。事後(post-hoc)の対比の結果、カプセル化BHK細胞を移植したラットは、疑似 手術を施したコントロールに比較して有意に軽量であった、F(1,81)=8.34、p=0. 005。その一方、カプセル化BHK-NGF細胞を移植したラットは、カプセル化BHK細 胞 を移植したラットと比較して軽量ではなかった、F(1.81,)=0.07、p=0.79。移植 後の平均体重を見ると、疑似移植ラットの体重は386.8±9.3 gであり、その一方 カプセル化BHK細胞を移植したラットの体重は疑似移植群より３%少なく(375.5± 11.0g)、そしてカプセル化BHK-NGF細胞を移植したラットの体重は２%少なかった (379.8±6.5g)。分散の比率の点から説明しても、処置の体重に対する影響は小 さい。さらに、体重変化の速度とパターンのいずれもが、移植後４週間の処置に よって影響を受けたという証拠はなかった。 活動レベル 5:00pmから9:00amまで(消灯は8:00pm〜8:00amまで)の16時間の期間にわたる１ 時間毎の総移動距離を見ると、移植前の活動レベルは最初高くて減少したが、箱 の中での第４時間目に照明が消えると劇的に増加した。若齢ラットは高齢ラット に比較してより活動的であった。活動レベルは１日単位の時間によっても有意に 影響された。 処置による主要な効果は、移植後の活動レベルについて統計的に有意であった 、F(2,81)=4.32、p=0.017。それぞれの月齢グループの移植後の活動レベルを事 後解析した結果、処置(BHK-NGF移植物)による有意な効果が、3.3ヶ月ラットにつ いて見られた、F(2,24)=4.18、p=0.027。処置による主要な効果は、中齢ラット 、F(2,31)=1.92、p=0.16、または最も高齢のラット、F(2,26)=2.12、p=0.14のい ずれでも有意では無かった。 ホットプレート カプセル化した、脳室内のBHK-NGF細胞により送達されるNGFは、ホットプレー トに応答する潜伏期間に影響しないように見受けられた。処置の主要な効果は統 計的に有意で無かった、F(1,87)=0.03、p=0.865。 フォンフレイ毛体知覚閾値 ラットはより堅いフォン・フレイ毛により早く応答した。若齢ラットはまた高 齢ラットに比較してより早く応答する傾向を見せた。外因性NGFは高齢ラットの より軽い刺激に対する反応性に影響したが、若齢グループには影響しなかった。 しかしながら、外因性NGFを受けた最も高齢のラットは若齢ラットに比較してよ り応答性ではなかった(図６)。 空間学習モリス水迷路 移植前参照記憶モリス水迷路反応性： 移植前の台への遊泳経路の距離は、11 日間の最初の試験で、すべてのグループについて減少した。高齢ラットは若齢ラ ットよりも大きく減少していた。すべての月齢に於いてパフォーマンスにはかな り大きな範囲が存在した。動物の処置グループへの割り当ては、移植前の参照記 憶モリス水迷路でのそれらのパフォーマンスに従ってそれらをマッチさせて行い 、移植前の処置の間には有意な差は存在しなかった。 移植後参照記憶モリス水迷路： ２つのコントロールグループ間には、移植後 のモリス水迷路の参照記憶試験におけるそれらのパフォーマンスに差は無かった 。それゆえこれら２つのグループ、カプセル化非トランスフェクトBHK細胞を移 植したグループと疑似手術を受けたグループとを統合して単一のコントロールグ ループとした。遊泳距離は、移植前の最後に獲得した到達距離より減少すること は無かった。 異なる月齢グループ間ではパフォーマンスに差が見られた。カプセル化BHK-NG F細胞はパフォーマンスについて統計的に有意な効果を及ぼさなかった。移植前 の参照記憶モリス水迷路でパフォーマンスがより良い50%とより悪い50%のラット 間では、これら移植後の試験で有意な差が見られた。 移植後探試験： ２つのコントロールグループ間では、移植後のモリス水迷路 探試験におけるそれらの反応性について差は見られなかった。それゆえカプセル 化した非トランスフェクトBHK細胞を移植したグループと疑似手術を受けたグル ープとを統合して単一のコントロールグループとした。若齢ラットは高齢ラット よりも、最初30秒の遊泳時間の間、台の位置をより頻繁に横断した。BHK-NGF細 胞は統計的に有意な効果をもたらさなかった。 0 ITIのワーキングメモリーモリス水迷路： 手術の26〜29日後、ラットにモ リス水迷路のワーキングメモリーバージョンを１日あたり３回試験した。台は試 験日毎に、プールの壁からの距離の差異を含めて、プール中のランダムに選択し た位置に移動させた。各試験間での遅延は無かった(0 ITI)。４日間のパフォー マンスを試行１、２、および３について平均した。BHKと疑似手術コントロール グループに差は見られなかったのでこれらのグループとを統合して１つのコント ロールグループとした。パフォーマンスは３回の試験を通して一貫して改善され た。試験における改善パターンは高齢ラットと若齢ラットで異なっていた。カプ セル化BHK-NGF細胞によって供給されるNGFはこの課題に於いて統計的に有意な効 果を示さなかった。 ２時間のITIのワーキングメモリーモリス水迷路： 手術後の30〜35日後、ラ ットにモリス水迷路のワーキングメモリー試験を１日あたり３試験実施した。台 は試験日毎に、プールの壁からの距離の差異を含めて、プール中のランダムに選 択した位置に移動させた。試験の間に２時間の間隔を取り、その間ラットを15分 間赤外熱ランプで乾燥し温めてからそれらをもとのケージに戻した。６日間のパ フォーマンスを試験１、２、３について平均した(図７)。BHKと疑似手術コント ロールグループとの間に差は見られなかったので、これらのグループを統合して １つのコントロールグループとした。 パフォーマンスは３回の試験を通して一貫して改善された。若齢動物は一般に 高齢ラットより良好なパフォーマンスを示した。 手術前にパフォーマンスのより劣っていたカプセル化BHK-NGF細胞を移植した ラットのパフォーマンスは、コントロールグループ内でパフォーマンスの劣るも のよりは良好であった(図７)。 これらの結果から、遺伝的に改変された異種の細胞を含むCNS-移植半透性膜は 、連続的にhNGFを産生して非免疫抑制ラットにおける老化に関連した認識障害(c ognitive defect)を弱めること、および手術による移植の手順と低用量のhNGFに 対する長期間の接触のいずれもが安全であるようであることを示唆する。 実施例９： カプセル化BHK-NGF細胞の悩弓損傷老齢サルへの移植 本研究では、ポリマーでカプセル化した、遺伝的に改変されたヒトNGF（hNGF ）を分泌する細胞の移植が、老齢サルにおける軸索が切断されたCBFニューロン の衰退を防止し得、そしてこれらの移植が移植物に近接するコリン作動性線維の 成長を誘発することを示す。 年齢24〜29歳の間(ヒトのほぼ75〜87歳に相当)の６匹の雌性アカゲザル(Macac a mullata)を本研究に使用した。すべてのサルは左の悩弓に片側の損傷を受けた 。 サルの麻酔はイソフラン(1.5〜2.0%)で行った。マンニトール(0.25g/kg，iv)を 用いた前処理の後、左悩弓の片側切断を実施した(J.H．Kordower，M.S．Fiandac a，J．Comp．Neurol.，298，pp．443(1990))。手術ドリルを用いて側矢状骨皮弁 (サイズ=1.5cm×4.0cm)を作り、前頭骨上矢状静脈洞を露出させた。脳脊髄硬膜 を引っ込め、自己保持性開創器を用いて半球間の列溝を露出させた。脳梁を縦軸 にそって切開した。モンロ開口のレベルで、悩弓は分離した２〜３mm幅の白色線 維束として容易に見ることが出来る。悩弓を先ず球状解剖器具を用いて切断した 。次いで悩弓の切断末端を吸引して損傷の終了を確実にした。 その後直ちに、各サルに(実施例１に記載したように)、hNGFを分泌するように 遺伝的に改変された(n=3)、またはされてない(n=3)ベビーハムスター腎臓(BHK) 繊維芽細胞を含むXP-11ポリマーカプセルの、左側脳室への移植を施した。BHK細 胞を含むXP-11カプセルを、個々に、手で側脳室内に精密鉗子を用いて尾状核の 頭部と中隔核との間に設置した。合計５個のデバイスを、各動物に吻尾状核(ros trocaudal)の方向に向けて１列に移植した。尾状核と中隔に隣接したカプセルは 、まっすぐなままであり、さらなる固定を必要としなかった。脳脊髄硬膜を再び 近づけ、骨皮弁をもとどおりに縫合し、そして帽状器官と皮膚を通常の方法で縫 合した。 すべてのサルを移植後３〜４週間後に屠殺し、そしてアセチルコリンエステラ ーゼ(AChE; Hedreenら，Cytochem.，33，pp．134(1985))の組織学的可視化、お よびコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、低親和性NGFレセプター(p75 NG Fr)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DβH)およびβアミロイドの免疫組織学的 可視化のために処理した。動物を再度定位枠に設置し、先に調製した骨皮弁を取 り除き、脳半球を引っ込めてBHK細胞添加カプセルを取り除いた。カプセル除去 の直後、動物にリン酸緩衝化生理食塩水(pH=7.4)による、心臓を経由する潅流と それに続く3.5リットルの4%ザンボニ固定剤による固定を施した。凍結したセク ションをスライド式ナイフミクロトームで切断(40μm)した。中隔／斜走(diagon al)列複合体を通るセクションを３番目毎に、先に記載された手法(例えば、J.H ．KordowerおよびFiandaca、上記; Kordowerら，J．Comp．Neurol.，277，pp．4 65(1988))を用いて、ChAT(1:7,500; Chemicon)、p75 NGFレセプター(1:80,000; Dr．Mark Bothwell)またはA4(1:1,000; Dr．Dennis Selkoe)のために免疫細胞化 学的に処理した。中間中隔内のコリン作動性ニューロンのカウントは手動で行っ た。中間中隔内のChAT-およびp75 NGFr-irニューロンの数は、両側について動物 あたりレベルにマッチさせた最低５セクションから定量した。コリン作動性ニュ ーロンの数は、グループを横断して両側スチューデントＴ検定を用いて比較した 。 手術後に始まりそして実験の間中継続していたが、NGF分泌移植物を受けたサ ルはコントロール移植サルに比較して昏睡状態にある様子であった。それぞれの 動物において多くのβアミロイド-免疫反応性斑様構造が、側頭と頭頂の新皮質 、扁桃状部および海馬に見られた。NGFの投与は、コントロール動物と比較した ところ、アミロイド斑の数または分布に影響を与えなかった(データ省略)。損傷 部位のニッスルおよびAChE-染色セクションの結果から、左悩弓はすべての動物 に於いてモンロの尾状開口のレベルで切断されており、その結果インタクトな対 側に比較して同側の海馬でのAChE-含有線維の広範囲にわたる欠失が生じている ことを示した。 BHK-コントロール移植片を受けたサルは、移植と同側の中間中隔内でChAT(57 〜75%)とp75 NGFr-ir(52〜53%)ニューロンの有意な減少を示した(図８)。中隔に 残存するニューロンの多くは、対側のChAT-およびp75 NGFr-ir中隔ニューロンに 比較して萎縮しているように見えた。損傷により誘発された中隔ニューロンの衰 退は、ポリマーでカプセル化されたBHK-hNGF細胞の移植片を受けたサルにおいて 軽減された。というのは、これらのサルでは、対側と比較して損傷と同側の中間 中隔内で、ChATニューロンの減少が０〜36%(p<.001)、そしてp75 NGFr-irニュー ロンの減少が７〜23%だけであったからである(図８)。 中隔ニューロンにおける生存率の維持とコリン作動性表現型の発現に加え、BH K-hNGF移植片によって同側中隔内でのコリン作動性線維の強い成長が誘発された 。BHK-hNGF移植片を受けたすべてのサルは、移植片近傍の中隔の側面に於いてp7 5 NGFr-ir線維の網目構造を示した。これらの線維は側脳室の上衣裏装(ependyma llining)に対して枝状に広がっていた。対照的に、いずれのBHK-コントロール移 植サルもコリン作動性成長応答を示さなかった。これらの線維はまた、ChAT-ir かつAChE-陽性であり、このことはこの成長応答のコリン作動性表現型を裏付け た。１例において、BHK-hNGFカプセルは側脳室を貫いて、吻側基底(rostral bas al)前脳の実質組織にとどまっていた。p75 NGFr-ir線維の病巣網目構造は、この 移植部位の近傍に観察された。後中隔と斜状帯(diagonal band)の垂直突起の後 外側部分から生じている僅かな線維がこの線維網目構造に貢献している様に見受 けられるが、この線維網目構造を引き起こす発生源の正確な細胞は確認されてい ない。明らかなのは、これらの線維は交感神経系に由来していないということで ある。なぜならこれらは薄く、拡張しており、そしてDBHに免疫反応性でなかっ たからである。興味深いことに、線維網目構造内に時おりp75 NGFr-irニューロ ンが見られたが、これらの細胞はこの線維システムに有意に貢献するには数が少 な過ぎた。 移植前、ELISAによる分析結果から、BHK-hNGF移植サルは、動物あたり24時間 あたり合計44.65±.95ng NGFを産生するカプセルを受けたことを示した。屠殺直 前の回収時、多くのニッスル染色BHK細胞が、hNGFを目下、動物あたり24時間あ たり9.6ngの速度で産生するカプセル内に見られた。老齢サル内に１ヶ月間移植 された後のこれらのカプセルから得た媒体は、インビトロでのPC12A細胞の強い 分化を誘導した。このことはこのレベルのNGF産生が生物学的に適切である事を 示す。 本研究は、NGFが老齢霊長類の脳におけるコリン作動性基底前脳(CBF)ニューロ ンの衰退に対して、栄養的および刺激的影響を提供し得ることを初めて示す。現 在観察されている栄養的および刺激的効果は高度の確実性で移植由来のhNGFに起 因し得る。なぜなら、それぞれBHK-hNGFおよびBHK-コントロール移植を受けたサ ルの２つグループにおける処置ストラテジーは、hNGF合成をコードする単一の遺 伝子によって全く異なるからである。軸索切断時、予想どおりのCBFニューロン の衰退がコントロール移植サルに観察された。対照的に、遺伝的に改変されたhN GFを分泌するBHK細胞を含むポリマーカプセルの移植物は、損傷されたコリン作 動性中間中隔ニューロンの衰退を防止した。 CBFニューロンは脳において唯一低親和性p75 NGFレセプターと高親和性trkAレ セプターの両方を発現することが示されている細胞である(Steiningerら，Brain Res. ，612，pp．330(1993))。興味深いことに、本研究はまた、老齢動物にお ける軸索切断に応答したこれら２種のコリン作動性マーカーの発現において、損 傷の効果に対してp75 NGFRよりChATの発現がより感受性であるという部分的な不 一致が示された。通常ChATとp75 NGFRの発現は高度に一致しているので、これは サルの中隔ニューロンが軸索切断後もなお生存しているが、検出可能なレベルの コリン作動性マーカーは発現していないことを示す。 さらに、hNGF分泌カプセルの移植物は、移植物近傍のコリン作動性線維の強い 成長を誘発した。重要なことに、hNGF分泌移植片の栄養的および刺激的効果の両 方が29歳の老サルに於いて観察された。これらのデータから、老齢霊長類におけ るCBFニューロンはその生涯の間hNGFに応答することを示唆する。 このデータからはまた、比較的低レベル(ng/day)のhNGFが、基底前脳ニューロ ンの衰退を援助するために十分であり得ることを示唆する。 本研究は老齢霊長類の脳への、遺伝的に改変されてhNGFを分泌するカプセル化 細胞移植の実現性を示す。このカプセル化手法は、免疫系を抑制する薬物を使用 した、潜在的に毒性のある処置の必要性無しに異種移植を使用することを可能に する。本研究に於いてカプセル化細胞は良好に受容されており、僅かに最小限の 星状細胞が移植物近傍で見られたのみであった。BHK細胞はカプセル内で生存を 維持しており、実験の期間中検出可能な生物的なレベルのhNGFを産生した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/21 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 38/22 ＡＡＨ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/27 ＡＥＥ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ 38/43 9051−4Ｃ 37/36 ＡＥＥ 38/44 9051−4Ｃ 37/24 ＡＡＨ 38/45 ＡＢＹ 9051−4Ｃ 37/14 ＡＤＰ 48/00 ＡＡＭ 9051−4Ｃ 37/52 ＡＢＹ Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ 37/48 Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/66 Ｇ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハマング，ヨセフ ピー. アメリカ合衆国 ロード アイランド 02806， バリントン，プロスペクト ス トリート ３ (72)発明者 ジェンタイル，フランク ティ. アメリカ合衆国 ロード アイランド 02888， ウォーイック，ローン アベニ ュー 57 (72)発明者 リンドナー，マーク ディ. アメリカ合衆国 ロード アイランド 02809，ブリストル，ビーチモント 62 (72)発明者 ウィン，シェリー アール. アメリカ合衆国 ロード アイランド 02917，スミスフィールド， ヘイブン ストリート 13 (72)発明者 エメリッチ，ドゥエイン エフ. アメリカ合衆国 ロード アイランド 02906，プロビデンス，イレブンス スト リート 13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物宿主に生物学的活性分子を送達する方法であって、該方法は生体適 合性のカプセルを該宿主に移植する工程を包含し、該カプセルが１またはそれ以 上の細胞を含有し、１または複数の該細胞が組換えDNA分子でトランスフェクト され、該組換えDNA分子が、生物学的活性分子をコードし、該生物学的活性分子 が長期の安定した発現をするような該宿主において、移植の際にダウンレギュレ ーションを受けないプロモーターに作動可能に連結したDNA配列を含む、方法。 ２．前記１または複数の細胞が前記宿主に対して異種である、請求項１に記載の 方法。 ３．前記カプセルが前記哺乳動物宿主の中枢神経系内に移植される、請求項１に 記載の方法。 ４．前記生物学的活性分子が神経栄養因子である、請求項１に記載の方法。 ５．前記神経栄養因子が神経成長因子(NGF)である、請求項４に記載の方法。 ６．前記プロモーターが、PNMTプロモーター、DBHプロモーター、GFAPプロモー ター、THプロモーター、NF-Lプロモーター、NSEプロモーター、P₀プロモーター 、MBPプロモーター、およびマウスメタロチオネイン-1プロモーターからなる群 から選択される、請求項１に記載の方法。 ７．前記組換えDNA分子がpNUT発現ベクターである、請求項１に記載の方法。 ８．前記細胞がBHK細胞である、請求項１に記載の方法。 ９．前記哺乳動物宿主が霊長類である、請求項１に記載の方法。 １０．前記１または複数の細胞がさらに第二の組換えDNA分子でトランスフェク トされ、該第二の組換えDNA分子が第二の生物学的活性分子をコードし、該第二 の生物学的活性分子が長期の安定した発現をするような前記宿主において、移植 の際にダウンレギュレーションを受けないプロモーターに作動可能に連結したDN A配列を含む、請求項１に記載の方法。 １１．前記カプセルが１または複数の第二の細胞をさらに含有し、該１または複 数の第二の細胞が第二の組換えDNA分子でトランスフェクトされ、該第二の組換 えDNA分子が第二の生物学的活性分子をコードし、該第二の生物学的活性分子も また長期の安定した発現をするような前記宿主において、移植の際にダウンレギ ュレーションを受けないプロモーターに作動可能に連結したDNA配列を含む、請 求項１に記載の方法。 １２．哺乳動物宿主においてインビボで移植したカプセル化細胞中での生物学的 活性分子の長期の安定した発現のための方法であって、該方法は生体適合性の免 疫隔離カプセルを該宿主に移植する工程を包含し、該カプセルが１以上の細胞を 含有し、該１または複数の細胞が組換えDNA分子でトランスフェクトされ、該組 換えDNA分子が生物学的活性分子をコードし、該宿主における移植の際にダウン レギュレーションを受けないプロモーターに作動可能に連結したDNA配列を含む 、方法。 １３．前記細胞が異種細胞である、請求項１２に記載の方法。 １４．前記カプセルが前記哺乳動物宿主の中枢神経系内に移植される、請求項１ ２に記載の方法。 １５．前記生物学的活性分子が、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、CNTF、GDNF、CDF/L IF、EGF、IGF、PDGF、bFGF、aFGF、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ヘモグ ロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、プロホルモンコンバターゼ、bcl-2、ドー パデカルボキシラーゼ、およびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼからなる群から 選択される、請求項１２に記載の方法。 １６．前記プロモーターが、PNMTプロモーター、DBHプロモーター、GFAPプロモ ーター、THプロモーター、NF-Lプロモーター、NSEプロモーター、P₀プロモータ ー、MBPプロモーター、およびマウスメタロチオネイン-1プロモーターからなる 群から選択される、請求項１２に記載の方法。 １７．前記哺乳動物宿主が霊長類である、請求項１２に記載の方法。 １８．哺乳動物宿主においてインビボでのカプセルの移植の際に、生物学的活性 分子の長期の安定した発現を提供するための移植可能な生体適合性の免疫隔離カ プセルであって、該カプセルは以下を含有する： （ａ）生体適合性マトリックス中で分散する１以上の細胞を含有するコアであ って、該１または複数の細胞が組換えDNA分子でトランスフェクトされ、該組換 えDNA分子が生物学的活性分子をコードし、該宿主における移植の際にダウンレ ギュレーションを受けないプロモーターに作動可能に連結したDNA配列を含む、 コア；および （ｂ）該コアを取り囲む外部拡散表面ジャケットであって、ここで該ジャケッ トが細胞の免疫学的拒絶に必須な物質の分子量以下の分子量カットオフを有する が、該哺乳動物宿主と該コアとの間を物質が通過することが可能である、ジャケ ット。 １９．前記１または複数の細胞が前記宿主に対して異種である、請求項１８に記 載のカプセル。 ２０．前記カプセルが前記哺乳動物宿主の中枢神経系内に移植される、請求項１ ８に記載のカプセル。 ２１．前記生物学的活性分子が、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、CNTF、GDNF、CDF/L IF、EGF、IGF、PDGF、bFGF、aFGF、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ヘモグ ロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、プロホルモンコンバターゼ、bcl-2、ドー パデカルボキシラーゼ、およびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼからなる群から 選択される、請求項１８に記載のカプセル。 ２２．前記プロモーターが、PNMTプロモーター、DBHプロモーター、GFAPプロモ ーター、THプロモーター、NF-Lプロモーター、NSEプロモーター、P₀プロモータ ー、MBPプロモーター、およびマウスメタロチオネイン-1プロモーターからなる 群から選択される、請求項１８に記載のカプセル。 ２３．前記哺乳動物宿主が霊長類である、請求項１８に記載のカプセル。 ２４．半透膜から形成されるカプセルであって、選択的透過性である内壁表面、 非選択的透過性の外壁表面、およびそれらの間の小柱壁を含有し、該外壁表面が マクロポアを含み、該マクロポアが外壁表面の総面積の約2.0〜20％の間を構成 し、そして直径が約５〜15μmの範囲である、カプセル。 ２５．前記カプセルが円柱中空ファイバーを形成するように成形される、請求項 ２４に記載のカプセル。 ２６．前記カプセルが平らなシートを形成するように成形される、請求項２４に 記載のカプセル。 ２７．前記マクロポアが前記外壁表面の総面積の約2.5％を構成する、請求項２ ４〜２６のいずれかに記載のカプセル。 ２８．前記マクロポアが前記外壁表面の総面積の約10％を構成する、請求項２４ 〜２６のいずれかに記載のカプセル。 ２９．前記マクロポアが前記外壁表面の約12％を構成する、請求項２４〜２６の いずれかに記載のカプセル。 ３０．前記カプセルが請求項２４〜２９に記載のカプセルである、請求項１に記 載の方法。 ３１．哺乳動物における神経変性の処置のための方法であって、該方法は該哺乳 動物に１以上の細胞を含む生体適合性カプセルを移植する工程を包含し、該細胞 が成長因子または栄養因子を生産し、該カプセルが該哺乳動物に１〜1500ng/日 の成長因子または栄養因子を送達し得るようにする、方法。 ３２．前記成長因子がヒト神経成長因子である、請求項３１に記載の方法。 ３３．前記哺乳動物がヒトである、請求項３２に記載の方法。 ３４．前記生体適合性カプセルがヒトの脳室内に10〜600ng NGF/日を送達し得る 、請求項３３に記載の方法。 ３５．前記生体適合性カプセルがヒトの実質内に10〜150ng NGF/日を送達し得る 、請求項３３に記載の方法。 ３６．哺乳動物のCNSへの移植の際に、成長因子または栄養因子の長期の安定し た発現を提供するための生体適合性カプセルであって、該カプセルは１以上の細 胞を含有し、該細胞が組換えDNA分子でトランスフェクトされ、該組換えDNA分子 が成長因子または栄養因子をコードし、ヒトでの移植の際にダウンレギュレーシ ョンを受けないプロモーターに作動可能に連結したDNA配列を含み、該カプセル が哺乳動物へ１〜1500ng/日の成長因子または栄養因子を提供し得る、生体適合 性カプセル。 ３７．前記成長因子が神経成長因子である、請求項３６に記載のカプセル。 ３８．前記哺乳動物がヒトである、請求項３７に記載のカプセル。 ３９．前記カプセルが、脳室内に移植された場合、ヒトに10〜600ng NGF/日を送 達し得る、請求項３８に記載のカプセル。 ４０．前記カプセルが、実質内に移植された場合、ヒトに10〜150ng NGF/日を送 達し得る、請求項３８に記載のカプセル。 ４１．前記ヒトが老化に関連する認識障害に罹患している、請求項３３〜３５の いずれかに記載の方法。 ４２．前記ヒトが老化に関連する認識障害に罹患している、請求項３８〜４０の いずれかに記載のカプセル。