ES2541302T3 - Anticuerpos anti-integrina alfa2 y sus usos - Google Patents

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ES2541302T3 ES06804739.8T ES06804739T ES2541302T3 ES 2541302 T3 ES2541302 T3 ES 2541302T3 ES 06804739 T ES06804739 T ES 06804739T ES 2541302 T3 ES2541302 T3 ES 2541302T3
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Elias Lazarides
Catherine Woods
Mark A. Bernard
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Glenmark Pharmaceuticals SA
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Abstract

Un anticuerpo anti-integrina α2 humanizado que comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR1 (GFSLTNYGIH, SEQ ID NO: 1), (b) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO: 2) y (c) HCDR3 (ANDGVYYAMDY, SEQ ID NO: 3); y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCDR1 seleccionada entre SANSSVNYIH (SEQ ID NO: 4) o SAQSSVNYIH (SEQ ID NO: 112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO: 5) y (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, SEQ ID NO: 6).

Description

Anticuerpos anti-integrina alfa2 y sus usos.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a anticuerpos dirigidos contra la integrina 0:2131 y sus usos, que incluyen anticuerpos anti-integrina alfa2 (0:2) humanizados y métodos de tratamiento con anticuerpos anU-integrina
02.
Antecedentes de la invención
La integrina n2131 (antígeno muy tardío 2; VLA-2) se expresa sobre una diversidad de tipos celulares, que incluyen plaquetas, células endoteliales vasculares, macrófagosfmonocitos activados, fibroblastos, leucocitos, linfocitos, neutrófilos activados y mastocitos (Hemler, Annu. Rev. Immunol., 8:365:365-400 (1999); Wu y Santoro, Dev. Dyn., 206:169-171 (1994); Edelson e1. al., Blood, 103(6):2214-2220 (2004); Dickeson et al., Cell Adhesion and Communication. 5:273-281 (1998». Los ligandos más tipicos para 0:2¡}1 incluyen el colágeno y la laminina, encontrándose ambos en la matriz exlracelular. Generalmente, el dominio I de la integrina 0:2 se une al colágeno de una manera dependiente de cationes divalentes, mientras que el mismo dominio se une a la laminina a través de mecanismos independientes y dependientes de cationes divalentes (Dickeson et al., Cell Adhesion and Communication. 5:273-281 (1998)). La especificidad de la integrina 0:2pl varía según el tipo celular y actúa como receptor del colágeno y/o la laminina para tipos celulares concretos, por ejemplo, la integrina 0:2131 se conoce como receptor del colágeno en plaquetas y como receptor de la laminina en células endoteliales (Dickeson et al., J. Biol Chem., 272: 7661-7668 (1997)). La ecovirus-1, la decorina, la E-caderina, la metaloproteinasa de matriz I (MMP-I), la endorrepelina y múltiples colecUnas y la proteina del complemento Clq también son ligandos para la integrina 0:2131 (Edelson et al., Blood, 107(1):143-150 (2006» . Se ha implicado a la integrina a2¡}1 en varios procesos biológicos y patológicos, que incluyen la agregación de plaquetas inducida por colágeno, la migración celular sobre el colágeno, la reorganización dependiente de células de las fibras de colágeno, así como las respuestas celulares dependientes de colágeno que producen aumentos en la expresión de citoquinas y la proliferación (Gendron, J. Biol. Chem., 278:48633-48643 (2003); Andreasen et al., J. Immunol., 171 :2804-2811 (2003); Rao et al., J. Immunol., 165(9):493540 (2000)), aspectos de la función de células T, mastocitos, y neutrófilos (Chan et al., J. Immunol,. 147:398-404 (1991); DusUn y de Fougerolles, Curro Opino Immunol., 13:286-290 (2001); Edelson et al., Blood, 103(6):2214-2220 (2004); Werr et al., Blond, 95:1804-1809 (2000), aspectos de la hipersensibilidad por contacto de tipo retardado y la artritis inducida por colágeno (de Fougerolles et al., J. Glin. Inves1., 105:721-720 (2000); Kriegelstein et al., J. Clin. Invest., 110(12):1773-1782 (2002)), la mortogénesis ductal de glándulas mamarias (Keely et al., J. Cell Sci., 108:595-607 (1995); Zuller et al., Am. J. Pathol., 155(3):927-940 (1995)), la curación de heridas epidérmicas (Pilcher et al., J. Biol. Chem., 272:181457-54 (1997)), y procesos asociados con la angiogénesis inducida por VEGF (Senger et al., Am. J. Pathol., 160(1):195-204 (2002))
La integrinas son heterodimeros formados por una subunidad o: y una subunidad ¡}, y comprende una gran familia de proteínas que median en la adherencia celular a la matriz exlracelular (ECM), así como proteínas plasmáticas, y son fundamentales para algunos tipos de interacciones entre células. Las integrinas interaccionan con los componentes de la ECM, a través de sus dominios extracelulares (Poni y Zent, Exp. Nephrol., 94:77-84 (2003» Tras la unión a los ligandos, las integrinas transducen las señales intracelulares al citoesqueleto, que modifica la actividad celular en respuesta a estos acontecimientos de adherencia celular, denominados señalización exlracelular (~outside-in signaling") (véase, p. ej., Hemler, Annu. Rev. Immunol., 8:365:365-400 (1999); Hynes, Cell, 110(6):673687 (2002)). Esta señalización también puede activar otros subtipos de integrinas expresados sobre la misma célula, conocidos como señalización intracelular ("inside-out signaling"). La señalización intracelular también se produce a través de señales reguladoras que se originan dentro del citoplasma celular, tales como la interrupción de la conexión entre la subunidad o: y ¡}, que después se transmiten al dominio de unión al ligando externo del receptor Las integrinas pueden desempeñar papeles importantes en los acontecimientos de adherencia celular que controlan el desarrollo, la morfogérJesis de órganos, la fisiología y la patología, así como la homeostasis de tejidos normales y las respuestas inmunológias y trombóticas y, además, actúan como detectores ambientales para la célula. Estas proteínas se caracterizan por tener conformación cerrada bajo condiciones normales que, tras la activación, sufren un cambio conformacional rápido que expone el sitio de unión al ligando. La estructura de cristales por rayos X es una herramienta reciente que se ha empleado en el estudio de la estructura de la integrina y los mecanismos de activación. La comprensiÓfl de las características estructurales de la integrina facilita un mejor entendimiento de los sitios de unión, los estados diferenciados y sus formaciones activas e inactivas. En general, el sitio de unión para el ligandofcontrarreceptor para todas las integrinas se encuentra dentro del dominio o: y está formado por un sitio de unión dependiente de iones metálicos, denominado dominio MIDAS (Dembo et al., J. Biol. Chem., 274, 32108-32111 (1988); Feuston et al., J. Med. Chem., 46:5316-5325 (2003); Gadek et al., Science, 295(5557):1086-1089 (2002); Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210:911 -921 (1992». En las subunidades o: de las integrinas que se unen al colágeno, que incluyen las integrinas a l , a2, a10 y al1, el sitio MIDAS está localizado dentro de un dominio insertado extra en el N-terminal conocido como el dominio t, A o l/A, una característica que comparten con las
subunidades a de la familia (32 de leucocitos de las integrinas (Randi y Hogg, J. Biol. Chem., 269: 12395-12398 (1994); Larson et aL, J. Cell Biol., 108(2):703-712 (1989); Lee et aL, J. Biol. Chem., 269: 12395-12398 (1995); Emsley et al., J. Bial. Chem., 272:28512-28517 (1997), y Cell. 100:47-56 (2000)). Los dominios I son estructuralmente homólogos con el dominio A1 del factor de von Willebrandt, con una topología de plegamiento de Rossman de seis hebras en lámina f3, rodeadas por siete a-hélices (Colombatti y Bonaldo, Blood, 77(11 ):2305-2315 (1991); Larson et aL, J. Cell Biol., 108(2):703-712 (1989); Emsley et aL, J. Biol. Chem., 272:28512-28517 (1997); Nolte et al., FEBS LeHers, 452(3):379-385 (1999». Las integrinas que se unen al colágeno tienen una a-hélice adicional conocida como hélice aC (Emsley el aL, J. Biol. Chem., 272:28512-28517 (1997), y Cell, 100:47-56 (2000); Nolte et al., FEBS Letlers, 452(3):379-385 (1999))
Las interacciones de integrina/ligando pueden facilitar la extravasación de leucocitos hacia tejidos inflamados (Jackson el al., J. Med. Chem., 40:3359-3368 (1997); Gadek et al., Science, 295(5557):1086-1089 (2002), Sircar et aL, Bioorg. Med. Chem., 10:2051-2066 (2002)), y desempeñan un papel en acontecimientos corriente abajo después de la extravasación inicial de los leucocitos desde la circulación hacia tejidos en respuesta a estímulos inflamatorios, que incluyen la migración, el reclutamiento y la activación de células proinflamatorias en el sitio de la inflamación (Eble J.A., Curro Phar. Des., 11(7):867-880 (2005» . Se ha ind icado que algunos anticuerpos que bloquean la integrina a2131 muestran un impacto sobre las respuestas de hipersensibilidad retardada y una eficacia en un modelo murino de artritis reumatoide y un modelo de la enfermedad del intestino inflamatoria (Kriegelstein et al., J. Clin. Invest., 110(12):1773-1782 (2002); de Fougerolles et aL, J. Clin. Invest., 105:721-720 (2000» y se ha indicado que atenúan la proliferación y la migración de células endoteliales in vitro (Senger et al.,
Am. J. Pathol., 160(1):195-204 (2002», lo cual sugiere que el bloqueo de la integrina a2131 puede prevenirlinhibir la angiogénesis anómala o superior a la normal, según se observa en diversos cánceres
Las plaquetas normalmente circulan en la sangre en un estado de reposo inactivo, aunque están cebadas para responder con rapidez en sitios de lesiones frente a una amplia variedad de agonistas. Después de la estimulación, sufren cambios en la forma y se convierten en muy reactivas con proteínas plasmáticas, tales como el fibrinógeno y el factor de von Willebrand (vWf), con otras plaquetas y con el revestimiento endotelial de la pared del vaso. Estas interacciones cooperan para facilitar la formación rápida de un tapón homeostático de plaquetas de fibrina (Cramer, 2002, en Hemostasis and Thrombosis, 43 edición). Tras unirse al ligando, los receptores de las plaquetas transducen las vías de señalización extracelulares que, a su vez, activan la señalización intracelular que produce la activación de receplores secundarios, tales como el receptor de fibrinógeno de plaquetas, la integrina allbf33, lo cual conduce a la agregación de las plaquetas. Se prevé que los anticuerpos o los miméticos de ligandos peptídicos que se unan o interaccionen con los receptores de plaquetas induzcan una cascada de señalización similar que conduzca a la activación plaquetaria. Incluso una pequeña activaciórJ de las plaquetas puede producir respueslas trombóticas plaquetarias, Irombocilopenia y complicaciones en el sangrado.
La integrina a2131 es la única integrina que se une al colágeno que se expresa sobre las plaquetas, y se ha implicado en el desempeño de algún papel en la adherencia de las plaquetas al colágeno y la hemostasis (Gruner et al., Blood, 102:4021-4027 (2003); Nieswandt y Watson, Blood, 102(2):449-461 (2003); Santoro et aL, Thromb Haemost., 74:813-821 (1995); Siljander et al., Blood, 15: 1333-1341 (2004); Vanhoorelbeke el al., CUIT. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. OisOfd., 3(2):125-140 (2003». Además, la a2131 de plaquetas puede desempeñar un papel en la regulaciórJ del tamaño del agregado plaquetario (Siljander et al., Blood, 103(4):1333-1341 (2004)).
La integrina a2f31 también ha aparecido como una integrina de unión a la minina expresada sobre células endoteliales (Languino et aL, J. Cell Bio., 109:2455-2462 (1989». Se cree que las células endoteliales se unen a la laminina a través de un mecanismo mediado por integrinas, aunque se ha sugerido que el dominio I de a2 puede actuar como una secuencia específica de ligando implicada en la mediación de las interacciones de células endoleliales (Bahou el al., Blood, 84(11 ):3734-3741(1994)).
Se prevé que un anticuerpo terapéulico que se una a la inlegrina a2¡31, que incluyen la integrina a2¡3 1 sobre las plaquetas, pueda producir complicaciones en el sangrado. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a otros receptores plaquetarios, tales como GPlb (Vanhoorelbeke et aL, Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord., 3(2):125-140 (2003)) o GP IIb/llla (Schell el aL, Ann. Hematol., 81 :76-79 (2002); Nieswandl y Walson, Blood, 102(2):449-461 (2003); Merlini et al., Circulation, 109:2203-2206 (2004» se han asociado con la trombocitopenia, aunque los mecanismos subyacentes a esto aún no se comprenden bien. Se ha establecido la hipótesis de que la unión de un anticuerpo a un receptor de plaquetas puede alterar su estructura tridimensional, y exponer epítopos que normalmente no están expuestos, lo cual conduce a la eliminación de las plaquetas (Merlini et aL, Circulation, 109:2203-2206 (2004)). En efecto, las complicaciones en el sangrado asociadas con dosis orales de antagonistas de GP lIa/lllb se han descrito como el ~Iado oscuro· de esta clase de compuestos (Bhatt y Topol, Na!. Rev. Drug
Discov., 2(1): 15-28 (2003». Si la integrina a2131 desempeña un papel importante en el movimiento de los leucocitos a través del tejido inflamatorio, sería deseable desarrollar agentes terapéuticos que pudieran dirigirse a 02131 para enfermedades y trastornos asociados con la integrina a2(31 ylo procesos celulares asociados con los trastornos, que incluyen cáncer, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunita rias, si estos agentes no activan las plaquetas. Por tanto, en la técnica es necesario el desarrollo de compuestos capaces de dirigirse a la integrina a2(31, tal como la integrina a2J31 sobre leucocitos, que no estén asociados con complicaciones de sangrado adversas
El anticuerpo de bloqueo anti-integrina a2131 humana BHA2.1 fue descrito por primera vez por Hangan et aL, (Gancer Res., 56:3142-3149 (1996)). Se conocen otros anticuerpos anti-integrina a2131, y se han empleado in vitro, tales como los anticuerpos disponibles en el mercado AK7 (Mazurov et aL, Thromb. Haemost., 66(4):494-499 (1991)), P1E6 (Wayner et al., J. Gell Biol., 107(5):1881-1891 (1988», 10G11 (Giltay et aL, Blood, 73(5):1235-1241 (1989)) Y A2-11E10 (Bergelson et al., Cell Adhes. Commun., 2(5):455-464 (1994». Hangan et al. (Cancer Res., 56:3142-3149 (1996)) han empleado el anticuerpo BHA2.1 in vivo para estudiar los efectos de la función de bloqueo de la integrina a2131 sobre la extravasación de células tumorales humanas en el hígado, y la capacidad de estas células tumorales para desarrollar focos metastásicos tras un tratamiento con anticuerpos. El anticuerpo Ha1/29 (Mendrick y Kelly, Lab Invest., 69(6):690-702 (1993)), que es específico para la integrina a2131 de rata y murina, se ha empleado in vivo para estudiar la regulación al alza de la integrina a2131 sobre células T después de una activación vírica con LCMV (Andreasen et al., J. Immunol., 171 :2804-2811 (2003», para estudiar las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado inducidas por SRBC y de hipersensibildad inducida por contacto inducida por FITG y la artritis inducida por colágeno (de Fougerolles et al., J. Glin. Invest., 105:721-720 (2000», para estudiar el papel de la integrina a2131 en la angiogénesis inducida por VEGF (Senger et al., Am. J. Pathol., 160(1):195-204 (2002); Senger et al., PNAS, 94(25):13612-13617 (1997», y para estudiar el papel de la integrina a2131 en la locomoción de PMN en respuesta al factor activador de plaquetas (PAF) (Werr et al., Blood, 95:1804-1809 (2000)).
El uso de anticuerpos monoclonales murinos, tales como los descritos anteriormente, como agentes terapéuticos humanos en pacientes no inmunocomprometidos, se ha visto limitado por las robustas respuestas inmunitarias dirigidas contra los anticuerpos murinos administrados, en particular en la administración repetida. Esta respuesta no solo puede reducir la semivida eficaz del anticuerpo murino en la circulación, sino que también puede conducir a unas respuestas profundas en el sitio de inyección yfo anafilácticas (Shawler et al., J. Immunol., 135(2):1530 (1985)). Además, las funciones efectoras en roedores asociadas con las regiones constantes (Fc) son mucho menos eficaces que sus homólogas humanas cuando se administran a seres humanos, lo cual da como resultado una pérdida de la activación del complemento, potencialmente deseable, y la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADGC).
Así, es necesario el desarrollo de anticuerpos dirigidos contra la integrina a2131, que incluye el tratamiento de trastornos, mecanismo y procesos celulares asociados con la integrina a2131, que incluyen enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias. Además, sería deseable desarrollar anticuerpos anti-integrina «21}1 que no estén asociados con el desarrollo de una respuesta anti-anticuerpos murinos en un paciente.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 Resultados gráficos de estudios de los efectos de un anticuerpo anti-integrina a2 sobre la enfermedad paralítica en un modelo EAE de ratón cuando se administra al primer signo de enfermedad (véase el ejemplo 7).
Figura 2: Resultados gráficos de estudios de los efectos de un anticuerpo anti-integrina a2 sobre la enfermedad paralitica en un modelo EAE de ratón cuando se administra durante la fase de inducción (véase el ejemplo 7) .
Compendio de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos anti-integrina alfa 2 (al) Y métodos para su uso, especialmente anticuerpos anti-integrina alfa 2 (a2) humanizados y métodos para su uso
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-integrina a2 incluye una o más regiones constantes humanas (p. ej., Q yfo CH) y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 , o sus variantes de secuencia de aminoácidos. En la presente memoria se contemplan diversas formas del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-integrina a2 puede ser un anticuerpo de longitud completa (p. ej., que comprende regiones constantes de inmunoglobulina humanas) o un fragmento de anticuerpo (p. ej., fragmentos Fab o F(ab'h o Fab' o Fv o scFv). Además, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador detectable, estar inmovilizado sobre una fase sólida yfo conjugado con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico)
Se contemplan los usos de diagnóstico y terapéuticos para los anticuerpos anti-integrina a2, así como sus usos profilácticos o preventivos. Para unos usos de diagnóstico, se proporciona un método para determinar la presencia de una proteína integrina «2131, que comprende exponer una muestra sospechosa de contener la proteína inlegrina «2131 a un anticuerpo anti-inlegrina «2, y determinar la unión del anticuerpo a la muestra. Para este uso, se proporciona un kit que comprende un anticuerpo anti-integrina a2 e instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la proteína integrina «2131. Los usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan al tratamiento de trastomos, mecanismos y procesos celulares asociados con la integrina «2131, que incluyen enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias, en particular la esclerosis múltiple.
Se contemplan aplicaciones de terapia génica para anticuerpos anti-integrina a2. Diversos vectores (p. ej.,
vectores retrovíricos, cromosomas) que codifican las secuencia genética de cadena pesada y ligera anti-a2f31, pueden trasladarse a células (p. ej., fibroblastos, mastocitos) para generar poblaciones de células que segregan MAb anti-a2f31. Estas células pueden poseer propiedades de ~alojamiento" para diferentes tipos de células, tejidos y/u órganos. Estas células productoras de anticuerpos, a su vez, pueden introducirse en un paciente para la adminislración localizada del MAb anti-a2[31 Como ejemplo, células madre mesenquimáticas modificadas con un vector de MAb anti-«2f31 pueden inyectarse en el cerebro de un paciente que padece esclerosis múltiple. Las células madre se diferencian a células neurales y segregan el MAb anti-a2f31 para tratar la inflamación asociada coo la esclerosis múltiple. Además, pueden introducirse por vía intravenosa a un paciente productos inmunoconjugados compuestos por complejos de liposoma-anticuerpo anti-a2f31 que encapsulan ácidos nucleicos que codifican genes terapéuticos. El producto inmunoconjugado anti-o.2[31 puede unirse a las células que expresan la integrina «2[31 y facilitar la captación eficaz de los genes terapéuticos
Además, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-integrina «2; un vector que comprende este ácido nucleico, opcionalmente unido operablemente a secuencias control reconocidas por una célula anfitriona transfOfmada con el vector; una célula anfitriona que comprende este vector; un proceso para producir el anticuerpo anti-integrina «2 que comprende cultivar la célula anfitriona de modo que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de células anfilrionas (p. ej., a partir del medio de cultivo de la célula anfitriona). También se proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-integrina «2 humanizado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones para usos terapéuticos pueden ser estériles y pueden estar liofilizadas. También se proporciona un método para tratar un trastorno asociado con una integ rina a2f31, que comprende administrar a un sujeto una cantidad farmacéutica eficaz de un anticuerpo anti-integrina «2, tal como un anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, al mamífero. Para estos usos terapéuticos, pueden coadministrarse otros agentes (p. ej., olro antagonista de la integrina «2[31) al mamífero antes, después, o al mismo tiempo que el anticuerpo anti-integrina a2
También se proporciooa un anticuerpo anti-integrina «2 humanizado que comprende una región va riable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEO ID NO:2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, SEO ID NO:1 ), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEO ID NO:2) y HCOR3 (ANOGVYYAMOY, SEO ID NO:3), o (e) SEO ID NO:40
En una realización, la región variable de cadena pesada mencionada anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:185.
En otra realización, la región variable de cadena pesada menciooada anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:185, en la que (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (c) la posición 78 es Val, o (d) cualquier combinación de (a)-(c).
En otra realización, la región variable de cadena pesada menciooada anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEO ID NO:70-79 y SEO ID NO:109-111 .
En una realización, el anticuerpo anti-integrina «2 mencionado anteriormente comprende además una región FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos WGOGTLVTVSS (SEO ID NO:13)
En una realización, el anticuerpo anti-integrina «2 mencionado anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de HCDR1 (SEO ID NO:1 ), HCOR2 (SEO ID NO:2) y HCDR3 (SEO ID NO:3).
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente comprende además una cadena ligera
En una realización, el anticuerpo anti-integ rina a2 mencionado anteriormente comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCOR1 seleccionada de SANSSVNYIH (SEO ID NO:4) o SAOSSVNYIH (SEO ID NO:112), (b) LCOR2 (DTSKLAS; SEO ID NO:5) y, (c) LCOR3 (OOWTTNPL T, SEO ID NO:6).
En una realización, la región variable de cadena ligera mencionada anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:186.
En una realización, la región variable de cadena ligera mencionada anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:186, en la que (a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a)-(c)
En una realización, la región variable de cadena ligera mencionada anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEO ID NO:41 , SEO ID NO:80-91 y SEO ID NO:108
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente comprende además una región ' FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos FGQGTKVEIK del SEO ID NO:38
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos de LCOR1 (SEO ID NO:4), LCOR2 (SEO ID NO:5) y LCoR3 (SEO ID NO:6)
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente comprende además una cadena pesada
La invención proporciona también un anticuerpo anti-integrina a2 humanizado que comprende también:
(i)
una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCoR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEO 10 NO:2), (b) HCOR1 (GFSLTNYGIH, SEQ ID NO:1), HCoR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEO ID NO:2) y HCOR3 (ANOGWYAMOY, SEO ID NO:3), o (e) SEO ID NO:40; y
(ii)
una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCoR1 seleccionada de SANSSVNYIH (SEO ID NO:4) o SAOSSVNYIH (SEO ID NO:112), (b) LCoR2 (oTSKLAS; SEO ID NO:5) y (e) LCoR3 (OOWTTNPL T, SEO ID NO:6).
También se proporciona el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado mencionado anteriormente, en el que
(a)
la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:185, (b) la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:186, o (e) ambos (a) y (b)
También se proporciona el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado mencionado anteriormente, en el que
(i)
la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:185, en la que (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (e) la posiciórl 78 es Val, o (d) cualquier combinación de (a}-(c); (ii) la región variable de cadena ligera pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:186, en la que(a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a}-(c); o (iii) ambos (i) y (ii).
También se proporciona el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado mencionado anteriormente, en el que
(a)
la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEO ID NO:7079 y SEO ID NO: 109-111, (b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEO ID NO:41, SEO ID NO:80-92 y SEO ID NO:108; o (e) ambos (a) y (b).
En una realizaciórl, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente reconoce el dominio 1 de la integrina a2 humana.
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente se une a la integrina a2p1.
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente se une a un epítopo de la integrina a21 , comprendiendo dicho epítopo:
(a)
un residuo de Lys que se corresponde con la posición 192 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 40 de la secuencia de aminoácidos del dominio 1 de la integrina a2 indicada en SEO ID NO: 11 ;
(b)
un residuo de Asn que se corresponde con la posición 225de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 73 de la secuencia de aminoácidos del dominio 1 de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:11,
(e)
un residuo de Gln que se corresponde con la posiciórl 241 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 89 de la secuencia de aminoácidos del dominio 1 de la integrina a2 indicada en SEO ID NO: 11 ;
(d)
un residuo de Tyr que se corresponde con la posiciÓfl 245 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 93 de la secuencia de aminoácidos del dominio 1 de la integrina a2 indicada en SEO ID NO: 11 ;
(e)
un residuo de Arg que se corresponde con la posición 317 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 165 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:11 ;
(f)
un residuo de Asn que se corresponde con la posiciórl 318 de la secuencia de aminoácidos de la integ rina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 166 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:11, o
(g) cualquier combinación de (a) a (f)
(a)
un residuo de Lys que se corresponde con la posición 192 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 40 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina
También se propOfciona un anticuerpo anti-integrina a2, en el que el anticuerpo se une a un epítopo de integrina a2, comprendiendo dicho epítopo·
0:2 indicada en SEO ID NO: 11 ;
(b) un residuo de Asn que se corresponde con la posición 225 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 0:2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 73 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina
0.2 indicada en SEO ID NO:11 ;
(c) un residuo de Gln que se corresponde con la posición 241 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 89 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina
0.2 indicada en SEO ID NO: 11 ;
(d)
un residuo de Tyr que se corresponde con la posiciÓfl 245 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 93 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:11,
(e)
un residuo de Arg que se corresponde con la posición 317 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 0:2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 165 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina 0:2 indicada en SEO ID NO:11 ;
(f)
un residuo de Asn que se corresponde con la posiciÓfl 318 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 0:2 indicada en SEO ID NO:8, o la posición 166 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de la integrina a2 indicada en SEO ID NO:11 , o
(9) cualquier combinación de (a) a (f).
En una realización, el anticuerpo anti-integrina 0.2 umanizado mencionado anteriormente es un anticuerpo de longitud completa.
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado mencionado anteriormente es un fragmento de anticuerpo
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado mencionado anteriormente está unido a un marcador detectable.
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado mencionado anteriormente está inmovilizado sobre una fase sólida
En una realizaciÓfl, el anticuerpo anti-integrina 0:2 humanizado mencionado anteriormente inhibe la unión de la integrina 0.2 o 0:2[3.1 a un ligando de integrina 0.2[3.1
En una realización, el ligando de la integrina 0:21}1 mencionado anteriormente se selecciona de colágeno, laminina, ecovirus-1, decorina, E-cadherina, metaloproteinasa de matriz I (MMP-I), endorrepelina, colectina y la proteína del complemento C1q.
La invención propOfciona también un método para determinar si una muestra contiene la integrina 0:2, la integrina 0:21}1, o ambas, que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo anti-integrina 0:2 humanizado mencionado anteriormente, y determinar si el anticuerpo se une a la muestra, siendo dicha unión una indicación de que la muestra contiene la integrina 0.2, la integrina a21}1, o ambas
La invención proporciona también un kit que comprende el anti-integrina 0:2 humanizado mencionado anteriormente, y opcionalmente contiene además instrucciones para su uso para detectar una proteina integrina 0.2 0 0:21}1
La invención proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-integrina 0:2 humanizado mencionado anteriormente
La invención proporciona también un vector que comprende el ácido nucleico mencionado anteriormente
La invención proporciona también una célula anfitriona que comprende el ácido nucleico o el vector mencionados anteriormente.
La invención propOfciona también un proceso para producir un anticuerpo anti-integrina a2 humanizado, que comprende cultivar la célula anfitriona mencionada anteriormente bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo. En una realización, el método comprende además recuperar el anticuerpo anti-integrina 0:2 humanizado de la célula anfitriona. En otra realización, el método comprende además recuperar el anticuerpo antiintegrina 0:2 humanizado del medio de cultivo de la célula anfitriona
La invención proporciona también un método de selección que comprende: detectar la unión de una integrina 0.2 o u2P1 a un anticuerpo que comprende la región VL de SEQ ID NO:19 y la región VH de SEQ ID NO:21, en presencia, frente a la ausencia, de un anticuerpo de ensayo, y seleccionar el anticuerpo de ensayo si su presencia se correlaciona con una menor unión de la integrina 0.2 o u2p1 al anticuerpo que comprende la región VL de SEO ID NO:19 y la región VH de SEO ID NO:21. En una rea lización la integrina 0.2 o a.2p1 se inmoviliza sobre un soporte sólido.
La invención proporciona también un método de selección que comprende detectar la unión de la integrina
0.2131 al colágeno en presencia de un anticuerpo de ensayo, en el que el anticuerpo de ensayo es un anticuerpo que
se une a un dominio I de a2; detectar la unión del anticuerpo de ensayo al dominio I de a2 en presencia de iones Mg"; detectar la unión del anticuerpo de ensayo al dominio I de 0.2 en presencia de iones Ca++; detectar la unión del anticuerpo de ensayo al dominio I de 0.2 en presencia de un medio sin cationes; y seleccionar el anticuerpo de ensayo si inhibe la unión de la integrina 0.2131 al colágeno y se une al dominio I de 0.2 en presencia de iones MgH e iones Ca" y medio sin cationes.
La invención proporciona también una composición que comprende el anticuerpo anti-integrina 0.2 humanizado mencionado anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona también un método para tratar un trastorno asociado a la integrina u2131 en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti· integrina a2 o la composición mencionados anteriormente.
La invención proporciona también un método para inhibir la unión de leucocitos al colágeno, que comprende administrar a un sujeto una cantidad del anticuerpo anti-integrina u2p1 mencionado anteriormente eficaz para inhibir la unión de los leucocitos al colágeno.
La invención proporciona también el uso del anticuerpo anti-integrina 0.2 humanizado mencionado anteriormente como medicamento.
La invención proporciona también el uso del anticuerpo anti-integrina 0.2 humanizado o la composición mencionados anteriormente para el tratamiento de un trastorno asociado con la integrina 0.2131.
La invención proporciona también el uso del anticuerpo anti-integrina 0.2 humanizado o la composición mencionados anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastomo asociado con la integrina 0.2P1
La invención proporciona también una composición para el tratamiento de un trastorno asociado con la integrina u2131, comprendiendo dicha composición el anticuerpo anti-integrina 0.2 humanizado mencionado anteriormente, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona también un envase que comprende el anticuerpo anti-integrina 0.2 humanizado o la composición mencionados anteriormente, junto con instrucciones para el tratamiento de un trastorno asociado con la integrina 0.2131.
En unas realizaciones, el trastorno asociado con la integrina 0.2p1 se selecciona de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, y una enfermedad caracterizada por una angiogénesis anómala o aumentada
En unas realizaciones, el trastorno asociado con la integrina 0.2p1 se selecciona de enfermedad del intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a transplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, síndrome de Sjorgen, escleroderma, diabetes de inicio juvenil, retinopatia diabética, degeneración macular retacionada con la edad, enfermedades cardiovasculares, psoriasis, cáncer, asi como infecciones que inducen una respuesta inflamatoria
En unas realizaciones, el trastorno asociado con la integrina 0.2p1 se selecciona de esclerosis múltiple (p ej., caracterizada por recaídas, tratamiento agudo, tratamiento retrasado), artritis reumatoide, neuritis óptica y traumatismo de la médula espinal.
En unas realizaciones, el método mencionado anteriormente no está asociado con (a) la activación de plaquetas, (b) la agregación de plaquetas, (c) un disminución en el recuento de plaquetas en la circulación, (d) complicaciones en el sangrado, o (e) cualquier combinación de (a) a (d)
En una realización, el anticuerpo anti-integrina 0.2 mencionado anteriormente comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO:174 o SEQ ID NO:176, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 178
En una realización, el anticuerpo anti-integrina a2 mencionado anteriormente inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende la región UL de SEa ID NO:19 y la región VH de SEa ID NO:21 con la integrina u2p1 humana o su dominio I
En una realización, el método mencionado anteriormente está asociado con el alivio de un brote o de secuelas neurol6gicas asociadas con la esclerosis múltiple.
En una realización, el anticuerpo anti-integrina u2 mencionado anteriormente inhibe la unión de la integrina 0.2131 al colágeno y no es un mimético de ligando
También se proporciona un método dirigir un residuo, tal como una molécula, proteina, ácido nucleico, vector, composición, complejo, etc., a un sitio que se caracteriza por la presencia de un ligando de integrina 0.2131, comprendiendo dicho método unir o ligar el residuo al anticuerpo anti-integrina u2 humanizado mencionado anteriormente.
También se proporciona un epitopo de integrina 0.2 que se une a un anticuerpo anti-integrina 0.2, en el que
el epítopo no comprende el sitio de unión al ligando de la integrina 0.2. En unas realizaciones, la unión al epítopo no está asociada con (a) la activación de plaquetas, (b) la agregación de plaquetas, (c) un disminución en el recuento de plaquetas en la circulación, (d) complicaciones en el sangrado, (e) la activación de la integrina 0.2, o (f) cualquier combinación de (a) a (e).
Los anticuerpos preferidos se unen al dominio I de la integrina 0.2p1. En particular, los anticuerpos preferidos son capaces de bloquear la adherencia dependiente de 0.2 de células a la matriz exlracelular (ECM), en particular al menos a uno o ambos de colágeno y laminina. Se proporcionan anticuerpos humanizados, que incluyen anticuerpos basados en un anticuerpo denominado en la presente TMC-2206. Se proporcionan anticuerpos antiintegrina 0.2 que son muy especificos para la integrina 0.2131 humana, y cuya administración no está asociada con efectos indeseables, tales como complicaciones en el sangrado o complicaciones debidas a la activación celular La especificad de unión (p. ej., la especificidad de epítopo) de estos anticuerpos está asociada con su perfil no hemorrágico inesperado.
El anticuerpo anti-integrina 0.2131 humanizado puede tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de HCoR1 (GFSLTNYGIH; SEa ID NO:1) ylo HCOR2 (VIWARGFTNYNSALMS; SEa ID NO:2) ylo HCOR3 (ANOGVYYAMOY; SEa ID NO:3). El anticuerpo anti-integrina u2131 humanizado puede tener una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCOR1 (SANSSVNYIH; SEa ID NO:4 o SAaSSVNYIH; SEa ID NO:112) ylo LCOR2 (OTSKLAS; SEa ID NO:5) ylo LCOR3 (aaWTTNPLT; SEa ID NO:6). En ciertas rea lizaciones, los anticuerpos anti-integrina 0.2131 humanizados tienen una cadena pesada que comprende HCOR1 (GFSLTNYGIH; SEa ID NO:1) ylo HCOR2 (VIWARGFTNYNSALMS; SEa ID NO:2) ylo HCOR3 (ANOGVYYAMOY; SEa ID NO:3) y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de LCOR1 (SANSSVNYIH; SEa ID NO:4) ylo LCOR2 (OTSKLAS; SEa ID NO:5) ylo LCOR3 (aaWTTNPLT; SEa ID NO:6). En otras realizaciones, el anticuerpo comprende una variante de secuencia de aminoácidos de una o más de estas COR, y dicha variante comprende una
o más inserciones de aminoácidos dentro o adyacentes a un residuo de COR ylo una o más deleciones dentro o adyacentes a un residuo de COR ylo una o más sustituciones de residuos de COR (siendo dicha una o más sustituciones el tipo preferido de alteración de aminoácidos para generar dichas variantes).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos específicamente reactivos con la integrina alfa 2 (0.2 ) humana, que incluyen anticuerpos humanizados, y métodos para su uso. Los anticuerpos humanizados pueden tener regiones de marco (RW) humanas y regiones determinantes de la complementariedad procedentes de un anticuerpo no humano, generalmente un ratón, que sean específicamente reactivas con la integrina 0.2 humana. Se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos de cadena pesada y ligera y secuencias de aminoácidos que comprenden las comprenden. En rea lizaciones preferidas, una o más de las regiones COR se obtienen o se basan en el anticuerpo murino segregado por el clon de hibridoma BHA2.1 (denominado en la presente memoria anticuerpo TMC-2206). También se proporcionan anticuerpos que tienen propiedades de unión similares y anticuerpos (u olros antagonistas) que tienen una funcionalidad similar a los anticuerpos descritos en la presente memoria. Los anticuerpos anti-integrina 0.2 preferidos incluyen los que (a) se unen al dominio I de la integrina 0.2 , (b) inhiben la función de la integrina 0.2 (p. ej ., la unión al colágeno o a la laminina), (c) se unen a la integrina u2 sobre plaquetas en reposo sin inducir la activación de las plaquetas, y (d) reconocen el epítopo de unión de TMC-2206 (p. ej., compiten con el TMC-2206 por la unión a la integrina 0.2 ). Estos anticuerpos pueden unirse preferentemente a la confonnación inactiva o cerrada de la molécula de integrina u2 diana sin competir por el sitio de unión al ligando. Las ventajas inesperadas de los anticuerpos anti-integrina 0.2, según se describen en la presente, que se unen preferentemente a la conformación cerrada de la integrina 0.2131 ylo se unen a la integrina
0.2131 sin competir por el sitio de unión al ligando (p. ej., no son un mimético de ligando) incluyen la prevención de la activación potencial de las plaquetas, la agregación plaquetaria, la disminución en el recuento de plaquetas en la circu lación ylo complicaciones en el sangrado en un sujeto tratado.
Las ~complicaciones en el sangrado", según se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier efecto adverso sobre los niveles y la fisiología de la sangre, que incluyen las respuestas trombóticas de las plaquetas, trombocitopenia, mayor tiempo hasta la coagulación, mayor tiempo de sangrado y pérdida de sangre que limiten el uso terapéutico del anticuerpo anti-integrina a2_
La integrina a2131 es una molécula formada por una subunidad de integrina a2 (véase, p ej., SEO ID NO:7 para la secuencia de ADN, y SEO ID NO:8 para la secuencia de proteína de la «2 humana) de la familia de las integrinas alfa, y una subunidad de integrina 131 (véase, p. ej., SEO ID NO:9 para la secuencia de AON, y SEO ID NO:10 para la secuencia de proteína de la 131 humana) de la fami lia de las integrinas beta, y pueden proceder de cualquier sujeto, que incluye un mamífero, pero preferiblemente proceden de un ser humano. La integrina a2p1 puede purificarse a partir de cualquier fuente natural, o puede producirse de modo sintético (p. ej., empleando la tecnología del ADN recombinante). Las secuencias codificantes de ácidos nucleicos para la integrina a2 y la integrina 131 se describen en Takada y Hemler, J. Cell Biol., 109(1):397-407 (1989; GenBank Núm. de registro X17033; posteriormente actualizada para la entrada NM 002203), Y Argraves, W.S, J. Cell. Biol., septiembre, 105(3): 1183-1190 (1987; Genbank Núm. de registro X07979.1 y las secuencias relacionadas que representan los variantes de corte y empalme alternativo), respectivamente
El dominio ~I" de la molécula de integrina a2p1 se refiere a una región de la molécula de integrina alp1 dentro de la subunidad a2, y se describe, por ejemplo, en Kamata et al., J Biol. Chem., 269:9659-9663(1994); Emsley el al., J. Biol. Chem., 272:28512 (1997) y Cell, 101 :47 (2000). La secuencia de aminoácidos de un dominio I humano de integrina al se muestra en SEO ID NO:11 (véase también, por ejemplo, SEO ID NO:107). El dominio I de la integrina a2 contiene un sitio de unión al ligando de tipo MIDAS (Metal loo .Qependant Adhesion §ite, sitio de adherencia dependiente de iones metálicos) que tiene un requisito y una especificidad para un catión divalente concreto para apoyar la unión al ligando. Las secuencias de aminoácidos para un dominio I de una integrina al en rata se muestran en SEO ID NO:93 (véase también, por ejemplo, SEO ID NO:113) y en ratón se muestran en SEO
ID NO:94 (véase también, por ejemplo, SEO ID NO:114) y aparecen en la tabla 28. Las secuencias del dominio I de mono cynomolgus y mono rhesus se clonaron a partir de la fracción leucocitaria derivada de sangre completa , y se indican en SEO ID NO:103 (AON), SEO ID NO:171 (aminoácidos) para mono cynomolgus, y en SEO ID NO:104 (AON) y SEO ID NO:172 (aminoácidos) para mono rhesus, respectivamente.
Un epitopo de TMC-2206 (BHA2.1) se refiere a una región del dominio I de la integrina a2 humana a la cual se une el anticuerpo TMC-2206. Este epitopo abarca una región que incluye los residuos de aminoácidos K40, N73, 089, Y93, R165, YN166 y, opcionalmente otros residuos de aminoácido del dominio 1 de integrina a2
Un trastorno asociado a la integrina a2 se refiere a un trastorno, enfermedad o afección que implica a una función! procesos dependientes de integrina al (p. ej., unión, actividad) que median reacciones celulares aberrantes dentro del tejido diana. Los ejemplos de procesos dependientes de integrina a2 implicados en enfermedades incluyen respuestas celulares dependientes del colágeno, tales como las implicadas en aumentos en la e:xpresión y la proliferación de citoquinas, aspectos de la función de células T, mastocitos y neutrófilos, trastomos inflamatorios, morfogénesis ductal de glándulas mamarias, curación de heridas epidérmicas y angiogénesis. Los ejemplos de trastornos asociados a la integrina a2 incluyen, pero no se limitan a enfermedades o trastornos inflamatorios que incluyen, pero no se limitan a enfermedad inflamatoria intestinal (tal como enfermedad de Crohn, y oolitis ulcerosa), reacciones a transplantes (que incluye rechazo a transplantes), neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, esclerosis múltiple (que incluye el tratamiento de secuelas neurológicas asociadas con esta, así como la esclerosis múltiple caracterizada por recaídas), enfermedades o trastornos autoinmunol6gicos (que incluyen lupus eritematoso sistémico (SLE), diabetes mellitus, sindrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmunitaria e:xperimental, síndrome de Sjorgen, escleroderma), diabetes de inicio juvenil, y trastornos asociados con una angiogénesis allÓmala o mayor que la normal (tales como retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades cardiovasculares, psoriasis, artritis reumatoide y cáncer), así como infecciones que inducen una respuesta inflamatoria.
El tratamiento de un trastorno asociado con la integrina a2p1 se refiere al uso terapéutico y al uso profiláctico o preventivo de los anticuerpos anti-integrina «2 descritos en la presente memoria. Aquellos que necesitan un tratamiento incluyen los que ya han sido diagnosticados con el trastorno, asl como aquellos en los que la aparición del trastomo debe prevenirse o retrasarse
Un mamífero, que incluye para el objetivo de un tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales en zoológicos, deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
La dosificación intermitente o periódica des una dosificación que es continua durante un cierto periodo de tiempo y que se produce en intervalos regulares que están separados entre sí preferiblemente por más de un día.
Los términos anticuerpo o inmunoglobulina se utilizan en su sentido más amplio, y abarcan anticuerpos monoclooales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, y fragmentos de anticuerpos con la condición de que muestren la actividad biológica deseada Los fragmentos de anticuerpos comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general una de sus regiones de unión al antigeno o variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de un solo dominio (p. ej., procedentes de camélidos), anticuerpos de un solo dominio de NAR de tiburón, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos también pueden referirse a residuos de unión que comprenden CDR o dominios de unión al antígeno que incluyen, pero no se limitan a regiones VH (VH, VWVH), anticalinas, PepBodiesT!.l, fusiones de epitopo de células T-anticuerpo (troyacuerpos) o pepticuerpos
Un anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presenten en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, por constaste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (p. ej., poli clona les), que generalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (p. ej., epitopos) sobre un antígeno, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra al menos un único determinante sobre el antígeno. El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que ha sido obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe considerar que el anticuerpo deba producirse mediante un método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante el método del hibridoma, que fue descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o puede prepararse mediante métodos de AON recombinante (véase, p. ej ., la patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de bancos de anticuerpos de fagos, por ejemplo, empleando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991 ), y Mar1<s et al.,
J. Mol. BioL, 222:581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse empleando las técnicas descritas en las Patentes de EEUU Núms. 6.025.155 y 6.077.677, así como en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos Núm. 200210160970 y 200310083293 (véase también, por ejemplo, Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research, 32 (21 ):0177 (2004».
Los anticuerpos monoclonales también incluyen anticuerpos quiméricos en los que una porción de la cadena pesada ylo ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie concreta o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo concreta, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas u homólogas a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. NatL Acad ScL USA, 81· 6851-6855 (1984) para anticuerpos quiméricos de ratónhumano).
Una región hipervariable se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácido procedentes de una región determinante de la complementariedad o CDR (p. ej., los residuos 24-34 (L 1), 50--56 (L2) Y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 31-35 (H1), 50-65 (H2) Y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 53 ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991» ylo los residuos procedentes de un bucle hipervariable (p. ej., los residuos 26-32 (L1), SO-52 (L2) Y 91·96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 26-32 (H1 ), 53-55 (H2) Y 96·101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. BioL , 196:901-917 (1987». Los residuos de marco o FR son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable. Para los anticuerpos descritos en la presente memoria, las regiones CDR y de marco se identifican basándose en el sistema de numeración de Kabat, excepto que la CDR1 de la cadena pesada se define mediante la definición de AbM de Oxford Molecular y abarca los residuos 26 a 35. El soporte lógico de formación de modelos de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (http://people.crystcck.ac.ukl-ubc07s/) (Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268--9272 (1989); Martin et al., Methods EnzymoL, 203, 121-153 (1991 ); Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126 (1992); Y Rees et al., en Sternberg M.J.E. (ed .), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172) (1996» combina los sistemas de numeración de la región CDR de Kabat y de la región hipervariable de Chothia para definir las COR
Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) pueden ser anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o aceptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor están reemplazados por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. Además, residuos individuales o grupos de residuos de la región de marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana pueden ser reemplazados por los correspondientes residuos no humanos Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor
o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más la actuación del anticuerpo. En generat, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y generalmente dos, dominios o regiones variables, en las que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (p. ej., Fc), generalmente de una inmunoglobulina humana (véase, p. ej., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029 (1989), y Foote y Winter, J. Mol. Biol., 224:487 (1992))
Los fragmentos de anticuerpos Fv monocatenarios o scFv pueden comprender las regiones o dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende también un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno (para un análisis, véase, p. ej., Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994».
Un diacuerpo se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, y estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vd en la misma cadena polipeptidica (VwVd. Empleando un conector que sea demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena y se crean dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más a fondo, por ejemplo, en el documento EP 404,097; el documento WO 93111161 , y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)
Los anticuerpos lineales se refieren a anticuerpos, tales como los descritos en Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden una pareja de segmentos Fd en tándem (VHCH1-VH-CH1) que forman una pareja de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Un anticuerpo aislado se refiere a un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podría interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En rea lizaciones preferidas, el anticuerpo estará purificado (1) hasta más del 95% en peso del anticuerpo, determinado mediante el método de LOlM"y, y más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras empleando tinción con azul de Coomassie o, preferiblemente, de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entomo natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo marcado con epítopo se refiere a un anticuerpo en el que el anticuerpo de la invención está fusionado a una etiqueta epitópica. El polipéptido de la etiqueta epitópica tiene los residuos suficientes como para proporcionar un epítopo contra el cual puede fabricarse un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para no interferir en la actividad del anticuerpo anti-integrina a2¡31. La etiqueta epitópica preferiblemente es suficientemente exclusiva para que el anticuerpo contra ella no presente sustancialmente reacción cruzada con otros epitopos. Los polipéptidos de las etiquetas adecuadas en general tienen al menos 6 residuos de aminoácido y habitualmente tienen entre aproximadamente 8-SO residuos de aminoácido (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 residuos). Los ejemplos incluyen el polipéptido marcador HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 Y 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5(12):3610-3616 (1985)); y la etiqueta de glicoproteína D del virus del herpes simplex (gD) y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)). En ciertas realizaciones, la etiqueta epitópica es un epítopo de unión al receptor de reciclaje, que es un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgGI, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.
Un agente citotóxico se refiere a una sustancia que inhibe o p'reviene la función de células ylo provoca la destrucción de células. Puede incluir isótopos radiactivos (p. ej ., 13\ 12 1, 90y Y 1u Re), agentes quimioterapéuticos, y toxinas, tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos. Un agente no citotóxico se refiere a una sustancia que no inhibe ni evita la función de las células y/o no provoca la destrucción de las células. Un agente no citotóxico puede incluir un agente que se activa para convertirse en citotóxicos. Un agente no citotóxico puede incluir una esfera, liposoma, matriz o partícula (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 200310028071 y 2003/0032995 ). Estos agentes pueden estar conjugados, acoplados, unidos o asociados con un anticuerpo anti-«21}1 integrina, según se describe en la presente memoria
Un agente quimioterapéutico se refiere a un compuesto químico útil para el tratamiento del cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido (~Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, taxótero (docetaxel), busufano, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase la patente de los Estados Unidos Núm 4.675.187), melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas
Un profármaco se refiere a un precursOf o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico para las células tumorales comparado con el fármaco de origen, y que es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma de origen más activa (véase, p_ ej _, Wilman, ~Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactioos, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986); y Stella et al., ~Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Orug Oelivery,~ Directed Orug Delivery, Borchardt et al., (ed _), pp_ 247267, Humana Press (1985)_ Los profármacos incluyen, pero no se limitan a profármaros que contienen fosfato, profármacos que cootienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con O-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen 13-lactamas, profármacos que cootienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida, o profármacos que cootienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, t-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citolóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco pueden ser los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente
Una marca se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado o acoplado directa o indirectamente al anticuerpo_ La marca en si misma puede ser detectable (p_ ej _, marcas radioisotópicas o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración quimica de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable.
Una fase sólida se refiere a una matriz no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Los ejemplos de fases sólidas incluidas en la presente memoria incluyen las formadas total o parcialmente de vidrio (p. ej ., vidrio de tamaño de poro controlado), polisacáridos (p. ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcohol vinílico) y siliconas _ En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (p_ ej _, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como las descritas en la patente de los Estados Unidos Núm_ 4_275_149
Un liposoma se refiere a una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para el transporte de un fármaco (tal como los anticuerpos de la invención y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes delliposoma normalmente están dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas
Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo_ Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o del emplazamiento en que se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente que las de las células naturales.
Un vector vírico se refiere a un vehiculo para la transferencia de un ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN) a las células mediante transducción o infección vírica. Los ejemplos de vectores víricos incluyen retrovirus, adenovirus, poxvirus y baculovirus
Un vector no vírico se refiere a un vehículo de ácido nucleico tal como un CAN, plásmido o cromosomas que se transportan a las células mediante métodos no víricos, tales como electroporación, inyecciones y transfección med iada por reactivos catión icos .
Las secuencias de control de la expresión se refieren a las secuencias de AON necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operablemente en un organismo anfitriona concreto. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y intensificadores
Un ácido nucleico está unido operablemente cuando están colocado en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico_ Por ejemplo, un ADN para una presecuencia o líder de la secreción está unido operablemente al AON para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operablemente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operablemente a una secuencia codificadora si está colocado de modo que facilite la traducción. En general, las secuencias de AON unidas operablemente son contiguas y, en el caso de un líder de la secreción, son contiguas y están en fase de lectura _Sin embargo, los intensificadores no deben ser necesariamente contiguos _La unión se logra mediante acoplamiento en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se emplean conectores o adaptadores oligonucieotídicos sintéticos según la práctica convencional
otro aspecto de la presente invención es el tratamiento de trastomos asociados a la a2131 integrina mediante la administración a un sujeto de una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti--{l2 integrina de la invención Los métodos adecuados para la administración incluyen métodos de terapia génica (véase a continuación).
Un ácido nucleico de la invención puede transportarse a las células in vivo utilizando métodos tales como la inyección directa de ADN, la captación de ADN mediada por receptores, la transfección medida por virus o la transfección no virica y la transfección basada en lípidos, todas las cuales pueden implicar el uso de vectores de terapia gérlica. La inyección directa se ha empleado para introducir ADN desnudo en células in vivo (véase , p. ej., Acsadi et al. (1991), Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990), Science, 247:1465-1468). Puede emplearse un aparato de transporte (p. ej ., una ~pistola de genes") para inyectar ADN en células in vivo. Este aparato puede adquirirse en el mercado (p. ej., en BioRad). También puede introducirse ADN desnudo en las células formando un complejo del ADN con un catión, tal como polilisina, que se acopla a un ligando para un receptor de la superficie celular (véase, p ej., Wu, G. y Wu, C. H. (1988), J. Biol. Chem., 263:14621; Wilson el al. (1992), J. Biol. Chem., 267:963-967; y la patente de los Estados Unidos Núm. 5.166.320). La unión del complejo de ADN-ligando al receptor puede facilitar la captación del AND mediante endocitosis mediada por receptores. Puede emplearse un complejo de AON-ligando unido a cápsidas de adenovirus que alteran los endosomas, liberando con ello el material hacia el citoplasma, para evitar la degradación del complejo por los lisosomas intracelulares (véase, p. ej., Curiel el al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8850; Cristiano et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2122-2126).
Los retrovirus defectuosos están bien caracterizados para su uso como vectores de terapia génica (para un análisis véase Miller, A. D. (1990), Blood 76:271). Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar célu las in vitro o in vivo con estos virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.), Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio convencionales. Los ejemplos de estos retrovirus incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM, que son muy conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de líneas de virus encapsulantes incluyen.psi.Crip, .psi.Cre, psi.2 and .psi.Am. Los retrovirus se han empleado para introducir una diversidad de genes en muchos tipos celulares diferentes, que incluyen células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula ósea, in vitro y/o in vivo (véase, p. ej., Eglitis, et al. (1985), Science 230:1395-1398; Danos y Mulligan (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464; Wilson et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3014-3018; Armentano et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6141-6145; Huber et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8039-8043; Ferry et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991), Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992), Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 89:7640-7644; Kay et al. (1992), Human Gene Therapy, 3:641-647; Dai et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10892-10895; Hwu et al. (1993), J. Immunol., 150:4104-4115; patente de los Estados Unidos Núm. 4.868 .116; patente de los Estados Unidos Núm 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; Y solicitud PCT WO 92/07573)
Para su uso como vector de terapia génica, el genoma de un adenovirus puede manipularse de modo que codifique y exprese un compuesto de ácido nucleico de la invención, pero que esté inactivado en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida vírico lítico normal. véase, p. ej., Berkner et al. (1988), BioTechniques, 6:616; Rosenfeld et al. (1991), Science, 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992), Cell, 68:1 43-155. Los vectores adenovíricos adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad de tipo 5 dl324 u otras cepas de adenovirus (p. ej." Ad2, Ad3, Ad7 etc.) son muy conocidos por los expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes son ventajosos porque no requieren de células en división para ser vehículos de transporte de genes eficaces y pueden emplearse para infectar una amplia variedad de tipos celulares, que incluyen el epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld et al (1992), citado supra), las células endoteliales (Lemarchand et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486», los hepatocitos (Herz y Gerard (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2812-2816) y las células musculares (Quantin el al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584).
Pueden emplearse los virus adenoasociados (AAV) como vector de terapia génica para el transporte de ADN para fines de terapia génica. El AAV es un virus defectuoso natural que requiere de otro virus, tal como un adenovirus o un herpes virus, como virus auxiliar para una replicación eficaz y un ciclo de vida productivo (Muzyczka et aL, Curro Topics in Micro. and Immunol. (1992), 158:97-129). El AAV puede emplearse para integrar ADN en células que no están en división (véase, p. ej., Flotte et al. (1992), Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 7:349-356; Samulski et al. (1989), J. Viral., 63:3822-3828; y McLaughlin et al. (1989), J. Viral., 62:1963-1973). Un vector de AAV, tal como el descrito en Tratschin et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, puede emplearse para introducir ADN en células (véase, p. ej., Hermonat et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; Tratschin et al (1985), Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988), Mol. Endocrinol., 2:32-39; Tratschin et al. (1984), J ViraL, 51:611-619; y Flotte et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:3781-3790). También pueden adaptarse vectores de terapia génica lentivíricos para su uso en la invención.
Los métodos generales para la terapia génica son conocidos en la técnica. véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos Núm. 5.399.346 de Anderson et al. Una cápsula biocompatible para transporter material genético se describe en la publicación PCT WO 95/05452 de Baetge et al. También se han descrito previamente métodos de trasferencia de genes hacia células hematopoyéticas (véase Clapp, D. W., et aL, Blood, 78: 1132-1139 (1991); Anderson, Science, 288:627-629 (2000); y Cavazzana-Calvo et al., Science, 288:669-672 (2000»
Célula, línea celular y cultivo celular a menudo se emplean de modo intercambiable y todas estas denominaciones incluyen su progenie. Los transformantes y células transformadas (p. ej., obtenidos mediante transfección, transformación o transducción de ácidos nucleicos, vectores, virus, etc.) incluyen la célula primaria en cuestión y los cultivos derivados de ella independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no tiene por qué ser exactamente idéntica en su contenido en ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tenga la misma función o actividad biológica, según se seleccionó en la célula originariamente transformada. Cuando se pretenda una denominación diferenciada se indicará claramente en el contexto
En la presente memoria se describen anticuerpos humanizados que incluyen anticuerpos que tienen marcos de región variable derivados de una molécula de anticuerpo aceptora humana, secuencias hipervariables o de COR procedentes de un anticuerpo murino donante, y regiones constantes, si están presentes, derivadas de secuencias humanas
Los anticuerpos de la presente invención se han construido comprendiendo COR de las regiones variable de cadena pesada y variable de cadena ligera del clon de anticuerpo monoclonal murino BHA2.1 (Hangan et al., Cancer Res., 56:3142-3149 (1996». Los materiales de partida preferidos para construir anticuerpos son anticuerpos anti-u1 integrina, tales como los segregados por el hibridoma BHA2.1 (p. ej., TMC-2206), que son anticuerpos que b bloquean la función dirigidos contra la 0.2 integrina humana, y dependen para su unión y actividad de la presencia de un dominio I intacto dentro de la 0.2 integrina diana. Se prefieren los anticuerpos con la especificidad de epitopo de TMC-2206 (o BHA2.1), que incluyen anticuerpos que se unen a la conformación inactiva de la molécula de 0.2 integrina y/o que no actúan como miméticos de ligando. Se prefieren los anticuerpos con la especificidad de epítopo de TMC-2206 (o BHA2.1) que, aunque interaccionan con la 0.2131 integrina presente en leucocitos y plaquetas, no provocan la activación de las plaquetas, impiden la agregación de las plaquetas activadas sobre el colágeno, no tienen efecto o tienen efectos minimos sobre el sangrado y/o no están asociados con complicaciones en el sangrado a las concentraciones administradas, que incluyen las dosis terapéuticas in vivo
Pueden construirse anticuerpos en los que la molécula aceptora humana para la región variable de cadena ligera se selecciona basándose en consideraciones de homología entre las regiones variables de la molécula aceptara potencial y con la región cadena variable de la cadena del anticuerpo murino. Se prefieren moléculas aceptaras humanas candidato de la linea germinal para reducir la antigenicidad potencial. Las bases de datos de la línea germinal se componen de secuencias de anticuerpos que leen hasta el extremo de la región FW3 de cadena pesada y parcialmente hasta la secuencia CDR3. Para la selección de una región FW4, se prefiere buscar bases de datos de secuencias de anticuerpos maduros que han sido obtenidos de la molécula de la línea germinal seleccionada, y también se prefiere seleccionar una región FW4 razonablemente homóloga para su uso en la molécula de anticuerpo recombinante. Las moléculas aceptoras humanas se seleccionan preferiblemente de la misma clase de cadena ligera que la molécula donadora murina, y de la misma clase estructural canónica de la región va riable de la molécula donadora murina. Las consideraciones secundarias para la selección de la molécula aceptora humana para la región variable de la cadena ligera incluyen la homología en longitud de COR entre la molécula donadora murina y la molécula aceptora humana. Las moléculas de anticuerpo aceptor humano se seleccionan preferiblemente mediante búsquedas de homología para la base de datos V-BASE, y otras bases de datos tales como las bases de datos de Kabat y también se pueden utilizar las bases de datos NCBI públicas. Para los anticuerpos anti-integrina a2 humanizados con la misma o similar especificidad de epítopo y/o propiedades funcionales que TMC-2206, una molécula aceptora de cadena ligera humana preferida es el SEQ ID NO: 37 con la secuencia de anticuerpo de la linea germinal A14 para la región FW 1-3 Y la secuencia FGQGTKVEIK para FW4 (SEO 10 NO: 38), que representa un FW-4 de cadenas ligeras kappa 1 maduras común (p. ej., la secuencia de la cadena ligera AAB24132 (entrada NCBI, gif259596/gb/AAB24132)
Se pueden construir anticuerpos en donde la molécula aceptora humana para la región variable de cadena pesada se selecciona basándose en consideraciones de homología entre las regiones variables de la molécula aceptora potencial y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo murino. Se prefieren moléculas aceptoras humanas candidato de la linea germinal para reducir la antigenicidad potencial. Las bases de datos de la linea germinal se componen de secuencias de anticuerpos que leen hasta el extremo de la región FW3 de la cadena pesada y parcialmente hasta la secuencia COR3. Para la selección de una región FW4, se prefiere buscar bases de datos de secuencias de anticuerpos maduros que han sido obtenidos de la molécula de la línea germinal seleccionada, y también se prefiere seleccionar una región FW4 razonablemente homóloga para su uso en la molécula de anticuerpo recombinante. Las moléculas aceptoras humanas se seleccionan preferiblemente de la misma clase de cadena pesada que la molécula donadora murina, y de la misma clase estructural canónica de la región variable de la molécula donadora murina. Las consideraciones secundarias para la selección de la molécula aceptora humana para la región variable de la cadena pesada incluyen homologia en la longitud de las COR entre la molécula donadora murina y la molécula aceptora humana. Las moléculas de anticuerpo aceptor humano se seleccionan preferiblemente mediante búsqueda de homología con la base de datos V-BASE, aunque también se pueden utilizar otras bases de datos tales como las bases de datos de Kabat y las bases de datos NCBI públicas Para los anticuerpos anti-integrina a2 con la misma o similar especificidad de epítopo y/o propiedades funcionales que TMC-2206, una molécula aceptora de cadena pesada preferida es el SEO ID NO: 39 con la secuencia del anticuerpo de la línea germinal 4-59 para la región FW 1-3 (SEO ID NO: 12) y el anticuerpo, CAA48104.1 (entrada NCBI, gif33583/emb/CAA48104.1) un anticuerpo maduro derivado de la secuencia de la línea germinal 4-59 para la región FW 4 (SEO ID NO: 13) (hltp:/Iwww.ncbi.nlm.nih.gov).
Los métodos para humanizar un anticuerpo contra integrina 02 no humana se describen en la presente memoria, incluyendo los Ejemplos siguientes. Con el fin de humanizar un anticuerpo anti-integrina 02, se obtiene el material de partida de anticuerpo no humano, incluyendo la preparación a partir de la inmunización o mediante la adquisición de anticuerpos disponibles comercialmente. Las técnicas ilustrativas para la generación de anticuerpos se describen en la presente memoria
El antígeno integrina 02131 que se va a utilizar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble de la integrina a2131 u otro fragmento de integrina a2131 (p. ej., un fragmento de integrina 02131 que comprende un dominio 1 de integrina a2 humana (SEO 10 NO: 11 ); véase también, p. ej., el SEO ID NO: 107). Otras formas de integrina 02 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica basándose en la secuencia de la integrina 02 (p. ej., un integrina 02 humana como en el SEO ID NO: 8)
Los anticuerpos policlonales se originan preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se), intravenosas (iv) o intraperitoneales (ip) del antigeno relevante con o sin un coadyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en las especies que se van a inmunizar, p. ej., hemocianina de lapa califomiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteina), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R1N=C=NR, en doode R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales pueden ser inmunizados contra el antígeno, productos conjugados inmunogénicos, o derivados mediante la combinación del antígeno o el producto conjugado (p .. ej., 100 I-Ig para conejos o 5 I-Ig para ratones) con 3 volúmenes de coadyuvante completo de Freund e inyectando la disolución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales se refuerzan con el antígeno o producto conjugado (p. ej., con 1/5 a 1110 de la cantidad original utilizada para inmunizar a) en coadyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 dias más tarde los animales se toman muestras de sangre y se analiza el suero para determinar el título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta las mesetas de título. Preferiblemente, para las inmunizaciones con producto conjugado, el animal se refuerza con el producto conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los productos conjugados también se pueden elaborar en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteinas. Asimismo, se utilizan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et aL, Nature, 256: 495 (1975), o se pueden elaborar por métodos de AoN recombinante (p ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 6.204.023). Los anticuerpos monoclonales también se pueden elaborar utilizando las técnicas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.025.155 y 6.077.677 así como Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núms. 200210160970 y 2003/0083293 (véase también,
p. ej., Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research 32 (21 ): 0177 (2004».
En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado, tal como una rata, hámster o mono, se inmuniza (p. ej., como se ha descrito anteriormente en este documento) para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno utilizado para la inmunización. Altemativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (véase, p. ej., Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986))
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforTibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT
Células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, apoyan una producción de alto nivel estable de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11 disponibles en el Salk Institute Cell
oistribution Center, San Diego, Calif. USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 asequibles de la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Md. USA. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos moooclonales humanos (p. ej., Kozbor, J. Immunol,
133: 3001 (1984); Brodeur et aL, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel oekker, Inc., Nueva York, 1987))
El medio de cultivo en el que células de hibridoma están creciendo se somete a ensayo para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELlSA)
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por medio del análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)
Después de identificar que las células de hibridoma producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y hacer crecer mediante procedimientos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986». Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D·MEM
o RPMI· 1640 Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo en forma de tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascitico, o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas incluyendo, por ejemplo, cromatografia de proteína A, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y{o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de semejante AON. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, que luego son transfectados a células anfitrionas tales como células de E Goli, célu las COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma, incluyendo aquellas que de otro modo no producen proteina inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describe con más detalle a continuación
Los ejemplos de la presente memoria describen métodos para la humanización de un anticuerpo anti· integrina 02 ilustrativo. En ciertas realizaciones, puede ser deseable generar variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado, concretamente cuando éstas mejoran la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-integrina 02131 humanizado se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un ADN de anticuerpo anti-integrina 02131 humanizado, o mediante síntesis de péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, y/o inserciones y{o sustituciones, de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para el anticuerpo anti-integrina 02 TMC-2206 (p. ej., derivado de o basado en secuencias de la región variable como se muestra en los SEO ID NO: 19 y 21 ). Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-integrina 02 humanizado, por ejemplo cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación.
Hay una serie de métodos utilizados para producir anticuerpos humanos o de tipo humano (p. ej., la "humanización"). Los enfoques para humanizar anticuerpos han variado a lo largo de los años. Un enfoque consistía en generar regiones variables murinas fusionadas a regiones constantes humanas, llamadas quimeras de Fcmurinas-humanas (véanse, p. ej., Morrison et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA 81 . 6851 -6.855 (1984); Patente de los Estados Unidos Núm., 5.807.715). Otro enfoque explotaba el hecho de que las CDR podrían ser fácilmente identificadas en función de su naturaleza hipervariable (Kabat et al., J. BioL Chem. 252: 6609-6616 (1977», Kabat, Adv. Protein Chem. 32:1-75 (1978» y de la estructura canónica (Chothia y Lesk, J. Mol. BioL 196 (4):901-17 (1987); Lazakani et al., J. Mol. BioL 272: 929 (1997) Y humanizadas injertando sólo regiones CDR no humanas (referidas como CDR donantes) sobre un marco humano (referido como marcos aceptares) como muestran, por ejemplo, Jones et al., Nature 321 (6069):.522-5 (1986); (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539; la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.548.640). Los seis bucles de CDR se presentan en un racimo, y se basan en el análisis cristalográfico, residuos del marco críticos dentro de la llamada zona "Vemier" que flanquea las COR o en la interfaz de la cadena pesada-ligera se pueden identificar fácilmente (véase, p. ej., Chothia y Lesk, J. Mol. BioL 196 (4):901-17 (1987); Chothia et al., J. Mol. BioL186 (3):651-63 (1985); Chothia et al., Nature 342 (6252): 877-83 (1989». Estos residuos se pueden volver a mutar al residuo murino para restaurar la orientación relativa correcta de las seis CDR (véanse p. ej., Verhoyen et al., Science 239 (4847):1534-6 (1988); Reichman et al., Nature 332 (6162):323-7 (1988); Tempest et al., Biotechnology (NY) 9(3):266-71 (1991)). Puesto que las regiones variables pueden clasificarse en familias que tienen una homología relativamente alta entre ratón y ser humano (revisado p. ej., por Pascual y Capra Adv. ImmunoL49: 1-74 (1991», estos primeros estudios también indicaron que el potencial de pérdida de afinidad podría ser minimizado en el anticuerpo injertado mediante la selección de la secuencia de la linea germinal humana con la mayor homologia con el anticuerpo murino de interés para uso como molécula aceptara humana (véanse, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539; Verhoyen et al., Seience 239 (4847):1534-6 (1988».
Se han referido homologías en las familias y relaciones estructurales entre los marcos que tienen impacto en la correcta presentación de un determinado tipo de estructura callÓnica de CDR (véase, p_ej_, AI·Lazakani et al., J_Mol. 8iol.273 (4):927-48 (1997) y las referencias de la misma)_ Preferiblemente, se elige una secuencia humana o de la línea germinal que mejor se ajuste. Las bases de datos disponibles de las secuencias de la línea germinal de anticuerpos pueden ser utilizadas para determinar el subtipo de la familia de una cadena pesada y ligera murina dada y para identificar las secuencias que mejor se ajustan útiles como marcos aceptares humanos dentro de esa subfamilia humana _Preferiblemente se tienen en cuenta la homologia lineal de los aminoácidos de los marcos tanto donador como aceptar, así como la estructura canónica de las COR
Residuos de la cadena pesada ilustrativos que pueden ser sustituidos en un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado incluyen uno cualquiera o más de los siguientes números de residuos del marco: H37, H48, H67, H71, H73, H78 Y H91 (sistema de numeración de Kabat). Preferiblemente, al menos cuatro de estos residuos del marco están sustituidos. Un conjunto particularmente preferible de sustituciones para la cadena pesada de anticuerpos antiintegrina a2 humanizados como se ilustra en la presente memoria es H37, H71, H73 Y H78_Del mismo modo, los residuos de la cadena ligera también pueden ser sustituidos. Los residuos de la cadena ligera ilustrativos para la sustitución incluyen uno o más de los siguientes números de residuos: L 1, L2, L4, L6, L46, L47, L49 Y L71. Preferiblemente, al menos tres de estos residuos estructurales están sustituidos. Un conjunto particularmente preferible de sustituciones de la cadena ligera de anticuerpos anti-integrina 02 humanizados como se ilustra en la presente memoria es L2, L46 Y L49.
Un método útil para la identificación de algunos residuos o regiones de un anticuerpo anti-integrina a2 humanizado que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" (Véase, p. ej., Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1969)). Aqui, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (p_el. residuos cargados tales como arg, asp, his, Iys, y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno integrina a2¡31 Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan después introduciendo más u variantes u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, mientras que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada_ Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se realiza el barrido con ala o la mutagénesis al azar en el codón o la región diana y se escrutan las variantes de anticuerpos anti-integrina 02 humanizados expresadas para determinar la actividad deseada
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino-y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta epitópica _Otras variantes de inserción de una molécula de anticuerpo anti-integrina a2 humanizada incluyen la fusión a los extremos N-o C-terminales de un anticuerpo anti-integrina a2 humanizado de un enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo (véase más abajo)
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en una molécula de anticuerpo anti-integrina 02 humanizado eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen los bucles hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones del marco_ Los residuos de la región hipervariable o residuos del marco implicados en la unión al antígeno están generalmente sustituidos de una manera relativamente conservadora_ Tales sustituciones conservadOfas se muestran a continuación bajo el titulo de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, en ese caso se introducen cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ilustrativas" o como más se describen a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y se escrutan los productos
Residuo original
Sustituciones ilustrativas Sustituciones preferidas
Ala (A)
va l; leu; ile Vel
Arg (R)
Iys; gln; asn Ly,
Asn (N)
91n; his; Iys; arg Gln
Asp (O)
Glu Glu
Cys {C)
,e, S",
Residuo original
Sustituciones ilustrativas Sustituciones preferidas
Gln (O)
a>o A,n
Glu (E)
a,p A,p
Gly IG)
pro; ala Ala
His (H)
asn; gln; Iys; arg A'9
lIe (1)
leu; va l; met; ala; phe; norleucina Leu
Leu (L)
norleucina; ile ; val ; mel; ala; phe lIe
Lys IK)
arg; gln; asn A'9
Mel (M)
leu; phe; ile Leu
Phe IF)
leu; val; ile; ala; tyr Leu
Pro (P)
a la Ala
Ser (S)
th, Th,
Th, IT)
,e, Se,
Trp(W)
tyr; phe T y,
Tyr (Y)
trp; phe; thr; Ser Phe
Val IV)
ile; leu; mel; phe; ala; norleucina Leu
Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoida l, (b)
5 la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) alcalinos: asn, gin, his, Iys, arg; (5) residuos que influyen orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra
10 clase. Cualquier residuo de cisteina no implicado en el mantenimiento de la confirmación apropiada de un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, se pueden añadir uno o varios enlaces de cisteina al anticuerpo para mejorar su estabilidad (cOflcretamente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
15 otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilacíón original del anticuerpo Por alteración se entiende la eliminación de uno o más radicales carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o la adiciÓfl de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de anticuerpos está típicamente ligada a N o ligada a o . Ligada a N se refiere a la uniÓn del radical carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparragina. La secuencias tripeptídicas de asparragina-X20 serina y asparragina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del radical carbohidrato a la cadena lateral de asparragina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiamino ácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5
hidroxilisina.
La adición o deleción de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga o carezca de una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición, sustitución, o deleción de, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O). Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-integrina 02 humanizado se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucle6tidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, o mutagénesis de casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-integrina 02 humanizado.
Habitualmente, las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado tendrán una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 75% con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humanizado original de cualquiera de la cadena pesada o ligera (p. ej., secuencias de la región variable como en el SEO ID NO: 21 o SEQ ID NO: 19, respectivamente), más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95%, incluyendo, por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, Y 100%. La identidad u homologia con respecto a esta secuencia se define en la presente memoria como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idérJticos a los residuos del anticuerpo anti-integrina anti-a2 humanizado, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa (como se ha descrito anteriormente) como parte de la identidad de secuencia. No se deberá interpretar que ninguna de las extensiones, deleciones o inserciooes N-terminales, Cterminales, o intemas en la secuencia del anticuerpo afecta a la identidad u homología de la secuencia. Así, la identidad de secuencia puede ser determinada por métodos convencionales que se utilizan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Utilizando un programa de ordenador como BLAST o FASTA, dos polipéptidos son alineados para un emparejamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos (ya sea a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias), Los programas proporcionan una pena lización de apertura por defecto y una penalización por hueco por defecto, y se puede utilizar una matriz de puntuación tal como PAM250 (una matriz de puntuación convencional, véase Dayhoff el al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3 (1978)) junto con el programa de ordenador. Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede calcular como: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y luego dividido por la suma de la longitud de la secuencia más larga en el tramo emparejado y el número de huecos introducidos en las secuencias más largas con el fin de alinear las dos secuencias
Los anticuerpos que tienen las características identificadas en la presente memoria como deseables en un anticuerpo anti-integrina a2 humanizado son escrutados mediante métodos como los descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se proporcionan métodos para el escrutinio de anticuerpos anti-integrina a2 cand idato para determinar las características preferidas y las funcionalidades que incluyen el escrutinio de anticuerpos que se unen al epítopo sobre la integrina 02[31 unida por un anticuerpo de interés (p. ej., aquellos que compiten con, inhiben o bloquean la unión del anticuerpo TMC-2206 a la integ rina a2[31). Los métodos y materiales ilustrativos se describen en el Ejemplo 13. Se pueden realizar análisis de entrecruzamiento y se describen, por ejemplo, en Antibodies, A Laboratory Manua l, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Además, o alternativamente, se puede realizar el mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem.270: 13881394 (1995) para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés (véase, p. ej., el Ejemplo 12 para estudios de mapeo de epítopos de TMC-2206).
De un modo similar se puede utilizar integrina a2[31 inmovilizada para determinar las potencias de unión relativa mediante la mediciÓfl de los valores de K¡ en ensayos de competición (véase, p. ej ., el Ejemplo 2). Por ejemplo, se utiliza Eu-TMC-226 marcado con fluorescencia en presencia de concentraciones variables de anticuerpo candidato no marcado, por ejemplo, utilizando un sistema de análisis similar al descrito anteriormente. Después de un tiempo de incubación especificado, se determina la cantidad de Eu-TMC-2206 unido. Las curvas de inhibición se ajustan coo el modelo de "competición por un sitio" utilizando el soporte lógico Prism (GraphPad, Inc. CA) para obtener valores de Clso y para calcular la K; utilizando la ecuación de Cheng y Prusoff (Biochem, Pharmacol. 22
(23):3099-108 (1973».
Es deseable preparar, identificar y/o seleccionar anticuerpos anti-integrina a2 humanizados que tienen propiedades de unión beneficiosas, por ejemplo, bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 2, en donde los anticuerpos candidato se someten a ensayo para determinar su capacidad para bloquear la adherencia celular mediada por integrina a2[31 en comparación con TMC-2206 y el anticuerpo quimérico de ratón-humano derivado de TMC-2206 descrito en el Ejemplo 2. Por ejemplo, las células CHO que expresan la integrina 02 humana y [31 de hámster endógeno (Symington et al., J. Cell BioI.120(2):523-35 (1993)) se preparan y se marcan oon CFSE (Molécula Probes, ORlo Las células marcadas se preparan y se ajusta la concentración celular; células se mantienen en la oscuridad hasta su uso Se prepara una placa recubierta con colágeno (colágeno de cola de rata de Tipo 1; BD Biosciences) y cada disolución de anticuerpo diluido en serie se añade a la placa de colágeno. Las células marcadas se añaden a continuación al pocillo y la placa se incuba Después del lavado, las células se lisan y se lee la intensidad de fluorescencia (excitación, 485 nm; emisión, 535 nm). Se calcula la actividad inhibidora de cada anticuerpo.
Además, se pueden calcular las constantes de unión de los anticuerpos candidato para el ligando integrina a2131 inmovilizado como se describe en el Ejemplo 2. Los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos se recubren con a2131-integrina de plaquetas (recubiertos a medida con a2131 de plaquetas humanas por GTI Inc., WI) y después se bloquean. Por ejemplo, para determinar la afinidad de TMC-2206 por su antígeno integrina a2, se utilizan TMC-2206 marcado fluorescentemente o anticuerpo IgG de control de isotipo (véanse los Ejemplos de más abajo). El anticuerpo marcado con fluorescencia, incluyendo Eu-TMC-2206 o Eu-lgG de control de isotipo, se aplica a las placas de microtitulación de integrina 02131 bloqueadas. Después de incubar las placas selladas para permitir que la interacción anticuerpo-antígeno alcance el equilibrio, las muestras se transfieren desde cada pocillo a un pocillo nuevo que contiene una disolución de mejora para la medición de la marca libre (no unida). La disolución de mejora también se añade a los pocillos vacíos para la medición de la marca unida. Los valores K.t del anticuerpo anti-integrina a2 se calculan mediante análisis de Scatchard. La afinidad relativa de los derivados de TMC-2206 (incluyendo los anticuerpos humanizados derivados de o basados en TMC-2206) se puede determinar mediante la determinación del valor de Ki en un análisis de competición. Por ejemplo, para el análisis de competición, se añade TMC-2206 marcado con Eu a los pocillos recubiertos con a2131 en presencia de anticuerpos anti-integrina a2 no marcados, incluyendo anticuerpos TMC-2206 o quiméricos (incluyendo humanizados) derivados de o basados en TMC-2206, o anticuerpo IgG de control de isotipo a diversas concentraciones. Después de un período de incubación para alcanzar el equilibrio, los pocillos se lavan y se miden los niveles de anticuerpos marcados unidos marca Eu retenido en cada pocillo. El valor de Ki se puede obtener de los valores de CE50 utilizando el valor de Kd obtenido para el anticuerpo Eu-TMC-2206 por los estudios de unión directa como se ha descrito anteriormente
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-integrina a2 humanizado es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenian mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, p. ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) Y Brennan et al., Science 229: 81 (1985». Sin embargo, estos fragmentos pueden ser producidos directamente por medio de células anfitrionas recombinantes, tales como bacterias (véanse, p. ej., Betler et aL, Science 240 (4855):1041-1043 (1988); Patente de los Estados Unidos Núm.
6.204.023. Por ejemplo. los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y se pueden acoplar químicamente para fonnar fragmentos F(ab '}¿ (Carter et al., BiofTechnology 10: 163-167 (1992». Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células anfitrionas recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto en la materia.
En algunas realizaciones. puede ser deseable generar anticuerpos anti-integrina 02 humanizados multiespecíficos (p. ej .. biespecificos) que tienen especificidades de unión para al menos dos epitopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos (p. ej., con dos brazos de unión diferentes) se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína integrina 02131 Alternativamente. se puede combinar un brazo anti-integrina a2 con un brazo que se une a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T
(p. ej., C02 o C03), o receptores de Fe para IgG (FcyR), tales como FcyR1 (CD64), FcyRII (CD32) y FcyR1I1 (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en una célula que tiene integrina 02131 unida a su superficie. Los anticuerpos biespecíficos se pueden uti lizar para agentes citotóxicos localizados en las células con integrina a2131 unida a su superficie. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a integrina 02131 y un brazo que se une al agente citotóxico (p. ej., gelonina, saporina, anti-interferón alfa, alcaloide de vinca, cadena A de ricina, o hapteno radio isotópico ). Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar en fonna de anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., anticuerpos biespecíficos F(ab'h).
De acuerdo con otro enfoque para la elaboración de anticuerpos biespecíficos, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, se remplazan una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos por cadenas laterales más grandes (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensatorias de tamaño idéntico o menor a la cadena o las cadenas laterales grandes en la interfaz del segundo anticuerpo mediante remplazo de las cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento de los heterodímeros sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros (véase, p. ej., el documento W096/27011 ).
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o heteroconjugados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del producto heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar ut ilizando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980 junto con una serie de técnicas de entrecruzamiento
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliograf ía Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar utilizando conexiones químicas Por ejemplo, Brennan et al., (Science 229:81 (1985)) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito sódico para estabilizar los ditioles de vinca y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab 'generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas
Los fragmentos Fab'-SH, recuperados de E. Coli, se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, Shalaby el al., (J. Exp. Med.175:217-225 (1992» describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab'n. Donde cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E. Coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico asi fonnado fue capaz de unirse a células que expresaban el receptor HER2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
También se han descrito diversas técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (véase, p. ej., Kostgelny et al., J. Immunol.148 (5):1547-1553 (1992». Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fas y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de heterodímeros de anticuerpo. La tecnología de diacuerpos (véase, p. ej., Hollinger el al., Proc. Nall. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden una región variable de cadena pesada (VH) conectada a una región variable de la cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para pennitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios del otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado sobre otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) (véase, p. ej., Gruber et aL, J. Immunol.152: 5368 (1994)). Alternativamente, el anticuerpo biespecífico, puede ser un anticuerpo lineal, por ejemplo, producido como describen Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos (véase, p. ej., Tult et al., J. Immunol.147:6D (1991))
Se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos anti-integrina 02 humanizados. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, a fin de aumentar o disminuir la eficacia del anticuerpo, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer. Se pueden introducir uno o varios residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en la región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una mayor capacidad de internalización y/o aumento de la muerte celular mediada por complemento (CMC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véanse, p. ej., Caron et al., J. Exp. Med.176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunot.148:2918-2922 (1992)). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumoral también se pueden preparar utilizando entrecruzadores heterobifuncionales (véanse, p. ej., los descritos por Wolff et aL, Cancer Research 53:2560-2565 (1993». Altemativamente, se puede modificar por ingeniería genética un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y de ese modo puede tener mejores capacidades CMC y/o AOCC (véanse, p. ej., Stevenson et al., Anti-Cancer Orug Oesign 3:219-230 (1989)).
Los productos inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado conjugado con un radical, por ejemplo, una molécula, una composición, un complejo, o un agente, por ejemplo, un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (p. ej., un producto radioconjugado), para el redireccionamiento del agente a una célula, tejido u órgano que expresa anti-integrina 02. Semejante producto inmunoconjugado se puede utilizar en un método de redireccionamiento del radical o agente a un sítio partícular de acción caracterizado por la presencía de íntegrína 02 o 02~1
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos productos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomoflas aerugiflQsa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, Y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina o los tricotecenos. Se encuentra disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos anti-integrina alfa 2 radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131 1n, 90y o lURe .
Los productos conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCI de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bisazido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil) etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), o compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como describen Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionúc1idos al anticuerpo (véase,
p. ej., el documento W094/11026).
En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar con un receptor (tal como estreptavidina) para la utilizaciórJ en el predireccionamiento de células, tejidos u órganos que expresan integrina a2 cuando el producto conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del producto conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de limpieza y después de la administración de un ligando (p. ej., avidina) que está conjugado a un agente, por ejemplo, un agente citolóxico (p. ej., un radionúclido).
Los anticuerpos anti-integrina a2 descritos en la presente memoria también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos por Epstein et al., Proc. Nall. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); Y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.485.045 y 4.544.545. Se describen liposomas con tiempo de circulación mejorado en la Patenle de los Estados Unidos Núm. 5.013.556
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo anti-integrina a2 se pueden conjugar con liposomas como describen Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (p. ej., doxorrubicina) está opcionalmente contenido dentro del liposoma (véase, p. ej., Gabizon et al., J. National Cancer Inst 81(19): 1484 (1989))
Los anticuerpos anti-integrina a2 humanizados también pueden ser utilizados en la Terapia ProfármacoEnzima Dirigida por Anticuerpos (ADEPT) mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase, p. ej., el documento W081/01145) en un fármaco activo. (véanse, p. ej., el documento W088/07378 y la Palenle de los Estados Unidos Núm. 4.975.278). El componente enzimático del producto inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal forma que lo convierta en su forma más activa. Las enzimas que son útiles incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-canceroso, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyenles de O-aminoácidos; enzimas que cortan carbohidratos, tales como ¡3-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ¡3-lactamasa útil para convertir fármacos derivalizados con ¡3-lactamas en fármacos libres; y peniclina amidasas, como la penicilina amidasa V o la penicilina amidasa G, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrágenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamenle, en fármacos libres. Altemativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos como abzimas, se pueden utilizar para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, p. ej., Massey, Nalure 328: 457-458 (1987)). Los productos conjugados de anticuerpo-abzima se pueden prepararse como se describe en la presente memoria, incluyendo para la liberación de la abzima en una célula, tejido u órgano que expresa integrina a2
Las enzimas se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-integrina a2 por medio de mecanismos bien conocidos en la técnica, incluyendo el uso de los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales comentados anteriormente. Altemativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antigeno de un anticuerpo anti-integrina a2 ligada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima se pueden construir utilizando mecanismos de AON recombinante bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984».
En ciertas realizaciones de la invención, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo inlaclo, por ejemplo, para aumentar la penetración en el lejido o tumor. También puede ser deseable modificar el rragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su vida media en suero. Esto se puede conseguir mediante la incorporación de un epitopo de unión a receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en una etiqueta peptídica que a continuación se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis de AON o péptido (véase, p. ej., el documento W096/32478).
Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-integrina a2 humanizados se pueden realizar, por ejemplo, por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar los residuos de aminoácido diana del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N-o C-terminales. Los residuos cisteinilo, por ejemplo, muy comúnmente se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo también se derivatizan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-¡3-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, Nalquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-benzoato de cloromercurio, 2cloromercurio-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol. Los residuos de histidilo, por ejemplo, se derivatizan por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente especifico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. El lisinilo y los residuos amino terminales, por ejemplo, se hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen a-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo, por ejemplo, se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacciórJ se realice en condiciones alcalinas debido al alto pK.. del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo épsilon-amino de la arginina. Los residuos de tirosilo, por ejemplo, se modifican especificamente con particular interés en la introducción de marcas espectrales en los residuos de tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan utilizando 1251o 1311para preparar proteinas marcadas para su uso en radioinmunoanálisis. Los grupos laterales carboxilo, por ejemplo, aspartilo o glutamilo, se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (RN:::C=N-R '), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, se convierten residuos de aspartilo y glutamilo en residuos de asparraginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio. Los residuos de glutaminilo y asparraginilo se desamidan frecuentemente a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Estos residuos se desamidan en condiciones neutras o alca linas. La forma desamidada de esos residuos cae dentro del alcance de esta invenciórJ. Otras modificaciones incluyen la hidroxilaciórJ de prolina y lisina, la fosforilacién de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilaciórJ de los grupos a-amino de lisina, arginina, y cadenas laterales de histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W .H. Freeman & Ca., San Francisco, págs 79-86 (1983», la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal
otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento quimico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del anticuerpo en una célula anfitriona que tiene capacidades de glicosilación para la N-u O-glicosilación. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o los azúcares pueden estar unidos a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina (véanse, p. ej., el documento W087f05330; Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981 » .
La eliminaciórJ de cualquier radical carbohidrato presente en el anticuerpo se puede lograr, por ejemplo, quimica o enzimáticamente. La desglicosilación quimica requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría
o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el anticuerpo intacto (véanse, p. el. Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987); Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981». La escisión enzimática de grupos carbohidrato en los anticuerpos se puede conseguir mediante el uso de una variedad de endo-y exo-glicosidasas, (véase, p. ej., Thotakura et al., Meth Enzymol. 138: 350 (1987»
otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de una variedad de polimeros no proteicos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos (véanse, p ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337).
Los ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado, así como los vectores y células anfitrionas que comprenden el ácido nucleico, y las técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo se describen en la presente memoria. Para la producción recombinante del anticuerpo, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo se aíslan y se inserlan en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Se encuentran dispooibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento
intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.
Un anticuerpo anti-integrina a2 se puede producir de forma recombinante , incluyendo como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión especifico en el extremo N-terminal de la proteina madura o polipéptido. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (p. ej., (p. ej., escindida por una peptidasa señal) por la célula anfitriona. Para células anfitrionas procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal eucariota (p. ej., una secuencia de señal de inmunoglobulina), la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota incluyendo, por ejemplo, los líderes de pectato lisasa (tal como peIB), fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina 11 estable al calor. Para la secreción de levadura, se puede utilizar una secuencia señal de levadura, incluyendo, por ejemplo, el lider de la invertasa de levadura, lider del factor a (incluyendo líderes de factor o de Saccharomyces y Kluyveromyces), o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de G. a/bicans, o la señal descrita en el documento W090/13646. En la expresión de células de mamíferos, se encuentran disponibles secuencias señal de mamífero, asi como lideres secretores virales, por ejemplo, la señal gO del herpes simplex, y pueden ser uti lizadas. El ADN para tal región precursora (p. ej., la secuencia señal) se liga en el marco de lectura al ADN que codifica un anticuerpo anti-integrina a2.
Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células anfitrionas seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación, esta secuencia es una que permite al vector replicar independientemente del AON cromosómico del anfitrión, e incluye origenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas, el origen del plásmido 2 IJ es adecuado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSVo BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. En general, no se necesita el componente origen de replicación para los vectores de expresión de mamífero (p. ej., el origen de SV40 puede utilizarse típicamente sólo porque contiene el promotor temprano)
Los vectOfes de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección tipicos codifican proteinas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles en el medio complejo, (p. ej., el gen que codifica 0alanina racemasa para Bacilos)
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula anfitriona. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteina que confiere resistencia al fármaco y por tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina
Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo anti-integrina 02, tales como los genes de DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-I y -11, preferiblemente de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, omitina descarboxilasa, etc.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula anfitriona apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la de la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR
Altemativamente, las células anfitrionas (particularmente anfitriones de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transfonnadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpo anti-integrina a2, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionadas por un crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, incluyendo un antibiótico aminoglicosídico, tal como kanamicina, neomicina, o G418 (véase,
p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.965.199).
Un gen de selección adecuado para el uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Núm. 44076 o PEP4-1 (véase, p. ej., Jones, Genetics, 85: 12 (1977». La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula anfitriona de levadura proporciona en ese caso un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptáfano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan med iante plásmidos conocidos que portan el gen Leu2
Además, los vectores derivados del plásmido circular de 1,6 IJ pKD1 se pueden utilizar para la transformación de levaduras KJuyveromyces. Alternativamente, Van den Berg, BiofTechnology, 8:135 (1990) informó de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de temera recombinante para K. lactis. También se han descrito vectores de expresión de múltiples copias estables para la secreción de albúmina de suero
humano recombinante maduro por cepas industriales de Kluyveromyces (véase, p. ej., Fleer et al., Biorrechnology,
9: 968-975 (1991 »
Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo anfitrión y está unido operativamente al ácido nucleico del anticuerpo anti-integrina 02. Los promotores adecuados para uso con anfitriones procariotas incluyen el promotor de arabinosa (p. ej., araB), el promotor phoA, los sistemas promotores de ¡3-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos tales como el promotor taco Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de ShineOalgamo (S.O.) unida operativamente al AON que codifica el anticuerpo anti-integrina 02
Las secuencias promotoras para eucariotas son conocidas. La mayoría de los genes eucariotas lienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases aguas arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT (SEO ID NO: 115) donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA (SEO ID NO: 116) que puede ser la señal para la adición de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Tales secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con anfitriones de levadura incluyen pero no se limitan a los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción cootrolada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en el documento EP 73.657 Los intensificadores de levadura también se utilizan ventajosamente con promotores de levadura.
La transcripción de anticuerpo anti-a2 integrina a partir de vectores en célu las anfitriooas de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B o Virus de Simios 40 (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células anfitrionas. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral de replicación de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción Hindlll E. Un sistema para expresar AoN en anfitriones de mamífero utilizando el virus del papiloma bovino como vector se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.419.446, y una modificación de este sistema se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.601.978 (véase también Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) acerca de la expresión del AoNc de ¡3-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple). Altemativamente se puede utilizar la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.
La transcripción de AoN que codifica un anticuerpo anti-integrina a2 por eucariotas superiores se incrementa frecuentemente mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Se conocen ahora muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). A menudo, sin embargo, se utiliza un intensificador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, e intensificadores de adenovirus (véase, también, p. ej., Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para la activación de promotores eucariotas). El intensificador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo anti-integrina a2, pero se encuentra preferiblemente en un sitio 5' del promotor. Otros sistemas de regulación de genes bien conocidos en la técnica (p. ej., sistemas inducibles, tales como sistemas inducibles tetraciclina y GeneSwitch TId ) se pueden utilizar para controlar la transcripción de AON que codifica anti-integrina 02
Los vectores de expresión utilizados en las células anfitrionas eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de AON o AONc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo anti-inlegrina a2. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (véase, p ej., el documento W094/11026 y el vector de expresión descrito en él).
las células anfitrionas adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria son las células procariotas, de levaduras, o eucariotas superiores descritas anteriormente. los procariotas adecuados para este propósito incluyen las eubacterias, incluyendo organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, p. ej., E. coli, Enterobacler, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p. ej., Sa/monella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacilos tales como B. subtilis y B. /icheniformis, Pseudomonas ta les como P. aeruginosa, y Streptomyces. los anfitriones de clonación de E. Coli adecuados incluyen E. Coli 294 (ATCC 31.446), E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC 31 .537), y E Co/iW3110 (ATCC 27.325).
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son anfitriones de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos anti-integrina alfa 2. Saccharomyces cerewsiae, o levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos anfitriones eucariotas inferiores. Sin embargo, se encuentran disponibles y son útiles otros numerosos géneros, especies y cepas , tales como Schizosaccharomyces pombe; anfitriones de Kluyveromyces incluyendo K. /actis, K. fragilis(ATCC 12.424), K. bulgaricus(ATCC 16.045), K. wickeramii(ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophi/arum (ATCC 36.906), K. Thermotolerans, o K. Marxianus; Yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183,070); Candida; Trichoderma freesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidenta/is; y hongos fi lamentosos incluyendo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, o anfitriones de Aspergillus tales como A. nidulans o A. niger.
las células anfitrionas adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-integrina 02 glicosilado derivan de organismos multicelulares. los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos Numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células anfitrionas de insectos permisivas de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (Oruga), Aedes aegypti (Mosquito), Aedes a/bopictus (Mosquito), Drosophila melanogaster (Mosca de la fruta), y Bombyx mori han sido identificados. Se encuentran disponibles públicamente una variedad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante l-1 de Autographa ca/ifornica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden util izar, en particular para la transfección de células Spodoptera frugiperda
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales de algodón, maiz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco como anfitriooes.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados, incluyendo una variedad de células de mamífero, se ha convertido en un procedimiento de rutina. los ejemplos de células anfitrionas de mamlferos útiles incluyen: una línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (p. ej., CeS-7, ATCC CRl 1651); una línea de riñón embrionario humano 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión (véase, p. ej., Graham et al., J. Gen Virol.36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (p. ej.,BHK, ATCC CCl 10); células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO que carecen de DHFR (véase, p. ej., DHFR Urlaub et al., Proc. Na!1. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980»; células de Sertoli de ratón «p. ej., TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980»; células de riñón de mono (p. ej.,eV1 ATCC CCl 70); células de riñón de mono verde africano (p. ej.,VERO-76, ATCe CRl-1587); células de carcinoma cervical humano (p. ej.,HELA, ATCC CCl 2); células de riñón canino (p. ej.,MDCK, ATCC CCl 34); células de hígado de rata búfalo (p. ej., BRl3A, ATCC CRl 1442); células de pulmón humano (p. ej., W138, ATCC CCl 75); células de hígado humano (p. ej., Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (p. ej., MMT 060562, ATCC CCl51); células TRI (véase, p. ej., Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; o una línea de hepatoma humano (p. ej., Hep G2).
las células anfitrionas se transforman con vectores de expresión o clonación anteriormente descritos o para la producción de anticuerpos anti-integrina 02 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes y/o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas
las células anfitrionas utilizadas para producir un anticuerpo anti-integrina 02 se pueden cultivar en una variedad de medios. los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo «MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco «DMEM), Sigma) son apropiados para cultivar las células anfitrionas. Además, cualquiera de los medios descritos por Ham et al., Meth Enz. 58: 44 (1979), Sames et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos W090103430; WO 87/00195; o Patente de los Estados Unidos Re. Núm. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES ), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMICINA "'), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente a concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también se puede incluir a concentraciooes apropiadas que serian conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son seleccionados por los expertos en la técnica, induyendo aquellas cond iciones de cu ltivo utilizadas previamente con la célu la anfitriona seleccionada para la expresión
Los anticuerpos anti-integrina 02 se pueden purificar a partir de células, incluyendo células microbianas o de mamífero utilizando, por ejemplo, cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis y/o cromatografía de afinidad. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2, o y4 humanas (véase, p. ej., Lindmar1\ et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G es útil para los isotipos de ratón y para y3 humana (véase, p. ej., Guss et al., EMBO J. 5: 1516-1517 (1986». La matriz a la que se une el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se puede lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, es útil para la purificación Bakerbond ABX"'(J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Purificación de proteínas puede incluir una o más de las siguientes técnicas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC de fase inversa, la cromatografía sobre sílice, la cromatografía sobre heparina SEPHAROSE"', la cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (p. ej.,una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, la SOS-PAGE, la precipitación con sulfato de amonio y/o cromatografía de interacción hidrófoba. Por ejemplo, puede ser útil después de cualquier etapa de purificación, someter una mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes a una cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente realizado a bajas concentraciones de sal (p. ej., aproximadamente sal 0-0,25 M)
Las formulaciones de un anticuerpo anti-integrina 02, incluyendo aquellas para la administración terapéutica, se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, diluyentes, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 1611 edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones o disoluciones acuosas liofilizadas. Los portadores, diluyentes, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, Y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metilo propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, u otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EOTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (p. ej.,complejos de Zn-proteina); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN"', PLURONICS"'o polietilenglicol (PEG)
La formulación de anticuerpo también puede contener más de un compuesto activo para la indicación particular que esté siendo tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Puede ser deseable utilizar anticuerpo anti-integrina a2 además de uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. Además, puede ser deseable proporcionar un agente inmunosupresor. Tales moléculas están presentes adecuadamente combinadas en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido
Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización inteliacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcáspulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (p. ej., liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas o nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 16" edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones que se van a utilizar para la administración in vivo son preferiblemente estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas, o microcápsulas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinilico)), polilactidas (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.773.919), copolímeros de ácido Lglutámico y y-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como Lupron Oepot"'(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-O-(-}-3-hidroxibutírico. Mientras los polímeros tales como el etilenacetato de vin ilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 3rC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces SS intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas
Los anticuerpos anti-a2 se pueden utilizar como agentes de purificación por afinidad En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan sobre una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína integrina 02131 (o un fragmento de la misma) que se va a purificar, y, posteriormente, el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto la proteina integrina 02131 , que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina a pH 5,0, que liberará la proteína integrina 02131 del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-integrina 02 también pueden ser útiles en análisis de diagnóstico para la proteína integrina 02131, p. ej., detectando su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Para aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo típicamente se marca con un radical detectable. Se encuentran disponibles numerosas marcas que pueden ser agrupadas generalmente en las siguientes categorías de radioisótopos, marcadores fluorescentes y marcas de enzima-sustrato. Los radioisótopos, tales como 35S, 14C, 1251, 3H, e 131 1, son marcas útiles. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, NY, Pubs.(1991) y la radiactividad se puede medir, por ejemplo, utilizando el recuento de centelleo. Las marcas fluorescentes, tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas también son útiles. Las marcas fluorescentes se pueden conjugar con el anticuerpo, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, más arriba. La fluorescencia se puede cuantificar, por ejemplo, utilizando un fluorímetro. También son útiles varias marcas de enzima-sustrato (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.275.149 para una revisión). La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y puede entonces emitir luz que se puede medir (p. ej.,utilizando un quimioluminómetro) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (p. ej., luciferasa de luciémaga y luciferasa bacteriana; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO). fosfatasa alcalina, l3-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (p. ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterociclicos (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos han sido descritas, por ejemplo, por O'Sullivan et al., Methods for the Preparation os EnzymeAntibody Conjugates para su uso en inmunoanálisis enzimático, en Methods in Enzym. (ed J. Langone y H. Van Vunakis), Academic Press, NY, 73: 147-166 (1981 ). Los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrogenoperoxidasa como sustrato, en donde la hidrogenoperoxidasa oxida un precursor colorante (p. ej.,ortofeniléndiamina (OPO) o hidrocloruro de 3,3',5,5'tetrametilbencidina (TMB»; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y
(iii) ¡3-D-galactosidasa (¡3-D-Gal) con un sustrato cromogénico (p. ej., p-nitrofenil-¡3-D-galactosidasa) o sustrato f1uorogénico 4-metilumbeliferil-I3-D-galactosidasa. Otras numerosas combinaciones enzima-sustrato se encuentran disponibles para los expertos en la técnica (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.275.149 y
4.318.980 para una revisión general).
A veces, una marca se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto en la materia será consciente de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcas mencionadas anteriormente se puede conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y por lo tanto, la marca se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. Altemativamente, para conseguir la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo se puede conjugar con un pequeño hapteno (p. ej.,digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados anteriormente se pueden conjugar con un anticuerpo anti-hapteno (p. ej.,anticuerpo anti-digoxina). Por lo tanto, se puede lograr la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo
No es necesario que el anticuerpo anti-integrina 02 esté marcado, y la presencia del mismo se puede detectar utilizando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo anti-integrina 02. Se pueden emplear anticuerpos anti-integrina 02 en cualquier procedimiento de análisis conocido, tales como análisis de unión competitiva, análisis sándwich directos e indirectos, y análisis de inmunoprecipitación (véase, p. ej., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs.147-158 (eRC Press, Inc. 1987)). Los análisis de unión competitiva dependen de la capacidad de un patrón marcado para competir con el ana lito de la muestra de ensayo por la unión
con una cantidad limitada de anticuerpo. Por ejemplo, la cantidad de proteína integrina 02131 en la muestra de ensayo es inversamente propOfcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el patrón y el analito que se unen a los anticuerpos se pueden separar convenientemente del patrón y el analito que permanecen sin unir. Los análisis sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteina a detectar En un análisis sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une a un primer anticuerpo que está inmovilizado sobre un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo de tres partes insoluble (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.376.110). El segundo anticuerpo puede estar marcado a su vez con un radical detectable (p. ej.,análisis sándwich directos) o pueden medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un residuo detectable (p. ej., análisis sándwich indirecto). POf ejemplo, un tipo de análisis sándwich es un análisis ELlSA, en cuyo caso el radical detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, una muestra de tejido, induyendo una muestra de tumor, puede ser fresca o congelada o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante tal como formalina.
Los anticuerpos anti-integrina 02 también se pueden usar para análisis de diagnostico in vivo Generalmente, el anticuerpo se marca con un radionúclido ("'In, w,-c, ''''c , '3\ ' 251, 3H, 32p o 35S) de modo que el tejido, por ejemplo, un tumor, puede ser localizado utilizando la inmunoescintografía.
Por razones de conveniencia, un anticuerpo anti-integrina 02 se puede proporcionar en un kit, tal como una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones, incluidas para rea lizar un análisis de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (p. ej. ,un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Se pueden incluir otros aditivos en el kit, tales como estabilizantes, tampones (p. ej., un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos suministrados en el kit pueden variar ampliamente, por ejemplo, para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del análisis. Los reactivos se pueden proporcionar en forma de polvos secos, generalmente liofilizados, incluyendo excipientes, por ejemplo, que en disolución proporcionarán una disolución de reactivo que tenga la concentración apropiada.
Se puede utilizar un anticuerpo anti-integrina 02 para tratar diversos trastomos asociados con la integrina 02131 como se describe en la presente memoria. El anticuerpo anti-integrina 02 se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, o intranasal. Si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, se realiza la administración intralesional del anticuerpo (incluyendo la perfusión o contactando el injerto con el anticuerpo antes del trasplante de otra manera). La administración parenteral incluye intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-integrina 02 se administra convenientemente mediante infusión por pulsos, por ejemplo, con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas. Esto puede depender en parte de si la administración es breve o crónica
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se define anteriormente, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo anti-integrina 02 se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo, y de la discreción del médico que atienda. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.
Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad [desde aproximadamente 1 glkg a aproximadamente 15 mg/kg o de aproximadamente 0,05 mglkg a aproximadamente 20 mglkg] de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al sujeto, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar [desde aproximadamente 1 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg] o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es fácilmente controlada por los expertos en la técnica
Una composición de anticuerpo anti-integrina 02 se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se vaya a tratar, el mamífero particular que se vaya a tratar, la condición clínica del paciente individual, la causa deltrastomo, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programaciÓll de la administración, los resultados de los estudios farmacológicos y de toxicidad y otros factores conocidos por los médicos. la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo que se va a administrar se determina por la consideración de los mismos, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar un trastomo asociado con integrina 02131 . Tal cantidad es preferiblemente inferior a la cantidad que es tóxica para el anfitrión o hace que el anfitrión sea significativamente más susceptible de infecciones.
No es necesario que el anticuerpo anti-integrina 02 sea, pero puede ser formulado, co-administrado o utilizado opcionalmente como una terapia coadyuvante con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir
o tratar el trastorno en cuestión. Por ejemplo, en la artritis reumatoide, el anticuerpo se puede administrar junto con un glucocorticosteroide, Remicade® o cualquier tratamiento aprobado para la artritis reumatoide. Para la esclerosis múltiple, el anticuerpo se puede administrar junto con un interferón 13, Avonex, Copaxon, u otras terapias aprobadas para el tratamiento de los signos y sintomas de la esclerosis múltiple. Para los trasplantes, el anticuerpo se puede administrar simultáneamente o por separado con un agente inmunosupresor tal como se define anteriormente, tal como ciclosporina A, para modular el efecto inmunosupresor. Alternativamente, o además, los antagonistas de la integrina a2131 se pueden administrar al mamífero que padece un trastorno asociado a integrina a2131 La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-integrina a2 presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento, y de otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con vías de administración como las utilizadas anteriormente en esta memoria o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis empleadas hasta ahora.
Se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales, incluyendo un anticuerpo anti-integrina a2, útiles para el tratamiento de los trastomos descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, tubos, botellas, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es un anticuerpo anti-integrina alfa 2. La etiqueta sobre, o asociada con, el recipiente indica que la composición se utiliza para tratar la afección de elección El artículo de manufactura puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer o disolución de delClrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso
Los principios descritos anteriormente se han aplicado, por ejemplo, al anticuerpo anti-integrina a2 secretado por el hibridoma BHA2.1 (Hangan et al., Cancer Res, 56(13): 3142-9 (1996». Este anticuerpo se une a la integrina a2131 humana y de rata, pero no se une al homólogo murino. El anticuerpo así producido por el hibridoma BHA2.1 se denomina en la presente memoria TMC-2206 y está comercialmente disponible de Chemicon (ahora parte de Millipore, número de catálogo MAB1998), Se produjeron variantes de TMC-2206 quiméricas, incluyendo humanizadas, y se sometieron a un análisis in vitro. Los estudios también se llevaron a cabo in vivo, utilizando el anticuerpo TMC-2206 o un anticuerpo similar, incluyendo uno capaz de reconocer la integrina 02131 murina. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación
Ejemplo 1
Se diseñaron y prepararon anticuerpos con especificidad para integrina a2131. Las secuencias previamente desconocidas de las regiones variables de un anticuerpo murino designado TMC-2206 secretado por el hibridoma BHA2.1 se determinaron como se describe en la presente memoria. Los ADNc de VH y VL se clonaron a partir de ARNm de células de hibridoma BHA2.1 por RT-PCR utilizando un conjunto de cebadores que correspondían a los aminoácidos del extremo N-terminal de la región variable murina de la cadena pesada (VH) o ligera (VL) y un segundo conjunto de cebadores correspondientes a la respectivas regiones constantes de la cadena pesada y1 y ligera K. La secuencia se determinó a partir de ADNc que se había sintetizado a partir de ARNm aislado de acuerdo con métodos convencionales descritos en la presente memoria
Se aisló ARNm citoplásmico a partir de aproximadamente 1 millón (1 x 106) células de hibridoma BHA2.1 que expresaba TMC-2206 utilizando mecanismos moleculares convencionales para los expertos en la técnica. Para aislar el ARNm de poli A, las células se lisaron en tiocianato de guanidinio 5M, mezclado con oligo (dT) celulosa (Ambion, TX) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 minutos. Et poli A unido a oligo (dT) celulosa se sedimentó, se lavó, después se aplicó a una columna de centrifugación de lavado (Ambion, TX). La columna se centrifugó a 3000 xg durante 1 minuto, a continuación, el ARN se hizo eluir con 200 IJL de Tris 10 mM, tampón EDTA (TE) 1 mM, pH 8,0 Y se precipitó con 0,1 volúmenes de acetato de amonio 5 M (NH4Ac) Y 2,5 volúmenes de etanol del 100% a -20QC. El ARN se sedimentó por centrifugación, se secó y se disolvió en agua tratada con DEPC
Los ADNc fueron sintetizados a partir de ARNm de BHA2.1 aislado a través de la transcripción inversa iniciada con cebadores basados en el extremo N de la región variable murina de la cadena pesada (VH) o ligera (VL), y un segundo conjunto de cebadores correspondientes a regiones constantes murinas de la cadena pesada y1
o ligera K. La secuencia del anticuerpo de BHA2.1 era desconocida, por lo tanto, se utilizaron cebadores degenerados de anticuerpos comerciales para el extremo N de las regiones variables murinas de las cadenas ligeras y pesadas (mezcla de cebador Ligero, núm. 27-1583-01 y mezcla de cebador Pesado, núm. 27-1586-01, de Amersham Biosciences) como se muestra en la Tabla 1 Se informa que estos cebadores abarcan la composición heterogénea de aminoácidos en el extremo N de las cadenas ligeras y pesadas murinas, respectivamente. Las reacciones de RT-PCR (kit Oiagen RT) se establecieron de la siguiente manera: 0,51Jg de ARNm, 10 IJL de tampón RT 5x, 2IJL de 10 mM de mezcla de dNTP, 5 IJL de cada disolución de cebador 10 mM y 2 IJLde mezcla de enzimas en 50 j.JL de volumen total La reacción se inició con la transcripción inversa a 50QC durante 30 minutos seguido por una etapa de activación de PCR a 95Q C durante 15 minutos y terminó con un programa de PCR adecuado para las mezdas de cebadores degenerados utilizadas para amplificar las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras: 94Q C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72Q C durante 1 minuto durante 28 cidos con una ronda de extensión final de 10 minutos a 72Q C. Las posteriores reacciones de PCR utilizaron los pares de cebadores enumerados en la Tabla 2, que fueron sintetizados por Retrogen (San Diego, CA) Todos los cebadores se enumeran 5' a 3'
Tabla 1
Nombre del cebador
Secuencias de nudeótidos (5' -3')
VHL-for (SEO ID NO: 14)
CCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT
HC-rev (SEO ID NO: 15)
GGGGCCAGTGGATAGAC
VLL-for (SEO ID NO: 16)
CCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG
LCK-rev (SEO ID NO· 17)
GTTGGTGCAGCATCAGC
Tabla 2
Nombre del cebador
Secuencias de nudeótidos (5' -3')
IgK-S (SEO ID NO:27)
TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTCCll\TGGGTACTGCTGCTCTGGG lTCCAGGTTCCl\CTGGl\GACGCG
IgK-AS (SEO ID NO: 28)
AAT1CGCGTCTCCAGTGGAACC TGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGG AGTGTGTCTGTCTCCATGGTGGC
TMC-2206-r5' (SEO ID NO:22)
CCCGAATTCACAGGTGCAGTTGAAGGAGTCA
TMC-2206-r3' (SEO ID NO: 23)
CGGGATCCTTAGGATCATTTACCAGGAGAGTGGGA
TMC-2206-k5' (SEO ID NO: 24)
CCCGAATTCACAATTTGTTCTCACCCAGTCT
TMC-2206-k3' (SEO ID NO: 25)
CGGGATCCTTATCTCTAACACTCATTCCTGTTGAA
TMC-2206VH-hlgGII4Fc-Sall
CTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT
Nombre del cebador
Secuencias de nucle6tidos (5' • 3')
(SEO ID NO: 29)
TMC2206VL·hKc·Sall (SEO ID NO: 32)
TCGTTTGATGTCGACCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGAG
hlgG1 /4Fc-Sall-F (SEO ID NO:30)
TCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCSGTCTTC
hlgG1 /4Fc-Notl-R SEO ID NO: 31 )
AAGGGAAGCGGCCGCTTATCATTTACCCYGAGACAGGGAGAGGCTCTT
hKc-Sall-F (SEO ID NO: 33)
ACCAAGGTCGACATCAAACGAACTGTGGCTGCACC
Kappa-F (SEO ID NO: 95)
CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTT
Kappa-BamHI-R (SEO ID NO: 96)
AATTCGGATCCTTACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
hKc-Notl-R SEO ID NO: 34)
AAGGGAAGCGGCCGCTTATCARCACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
TI iC-2206VLwt-hKc-F (SEO ID NO: 35)
AGGGTGGAGCTGAAACGAACTGTGGCTGC
TMC-2206VLwt-hKc-R (SEO ID NO: 36)
TCGTTTCAGCTCCACCCTGGTCCC
Se obtuvieron productos de PCR de aproximadamente 350 pb de longitud tanto para VH como para VL. Estos productos de PCR se recuperaron de un gel de agarosa a11 %, se donaron en el vector de clonación pCR2.1TOPO (Invitrogen, CA) y se secuenciaron
5 La secuenciación se realizó en un secuenciador de AON CEO utilizando cebadores M13 directo e inverso (Invitrogen, CA). El AON del plásmido se elaboró a partir de 1,5 mi de cultivos bacterianos utilizando kits Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente se utilizaron 300 ng de AON para cada reacción de secuenciacián por PCR, típicamente en un volumen de 10 IJL. El AON se desnaturalizó a 9S"C durante 2 minutos y luego se mezcló con cebador de secuenciación a una concentración final de 0,3 mM. Se añadieron 4 IJL de OTCS
10 Ouick Star Master Mix (Beckman Couller, Fullerton, CA) a la mezcla y la secuenciaciÓfl continuó durante 30 ciclos· 9S"C durante 20 segundos, 50°C durante 20 segundos y 6O"C durante 2 minutos. Las reacciones de secuenciación se precipitaron con etanol en presencia de acetato de sodio (NaAc), EOTA y glucógeno. El sedimento se lavó dos veces con etanol del 70%, se secó al aire y se resuspendió en 20 IJL de la Disolución de Carga de Muestras (proporcionada en el kit). Se secuenciaron ocho clones de VH y VL individuales mediante técnicas convencionales, y
15 las secuencias de aminoácidos deducidas de VH (SEO ID NO: 21 ) Y VL (SEO ID NO: 19) se muestran en las Tablas 3 y 4, respectivamente. Las secuencias obtenidas a partir de los ocho clones fueron idénticas excepto para los primeros uno o dos aminoácidos. En los clones de VL, Glu-Asn o Gln-Phe aparecían con la misma frecuencia. En los clones de VH, Gin o Glu aparecian con la misma frecuencia. Las secuencias se cotejaron con la base de datos BLAST de proteínas de NCBI (http:fMww.ncbLnih.govfBLASTf, Ye et al., Nucleic Acids Res, JuL 1· 34 (Web Server
20 Issue): W6-9). Todas las secuencias junto con la consulta (p. ej.,VH o VL de TMC-2206) se alinearon por CLUSTALW (Alineamiento de Secuencias Múltiples) en http://clustalw.genome.jpf (Aiyar, Methods Mol Biol, 132:
221-41 (2000)). Los insertos clonados mostraron el mejor emparejamiento con las cadenas murinas pesada (lgG1) Y ligera (K), que era del isotipo esperado. Las secuencias de las regiones VH y VL clonadas sugirieron un Uder probable y secuencias de la región constante limitrofe, que se utilizaron para diseñar cebadores más exactos para clonar toda la región variable pesada y ligera de TMC-2206 a partir del ARNm del hibridoma. Todos los cebadores fueron sintetizados por Retrogen (San Diego, CA). El par de cebadores, VHL-for CCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT (SEO ID NO: 14) y HC-rev GGGGCCAGTGGATAGAC (SEO ID NO: 15; a partir de Fcy CHl de ralón), se utilizó para volver a clonar la región variable de la cadena pesada y el par de cebadores, VLL -for CCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG (SEO ID NO: 16) y LCk-rev GTTGGTGCAGCATCAGC (SEO ID NO: 17), se utilizó para volver a clonar la región variable de la cadena ligera a partir del ARNm del hibridoma utilizando las mismas condiciones de PCR descritas anteriormente. La secuenciación de los productos oonfirmó que la identidad de los dos primeros residuos en VL de TMC-2206 era 11--Q y L2-F Y la identidad de los dos primeros residuos en la cadena pesada era Hl-0 y H2-V. Las secuencias de nucleótidos restantes fueron idénticas a las clonadas utilizando las mezclas de cebadores degenerados .
. TABLA 3
TABLA 4
La región VL clonada fue de 106 aminoácidos y la VH fue de 119 aminoácidos de longitud. Como se muestra en las Tablas 3 y 4, hay tres COR (CORl-3) y cuatro marcos (FW1-4) en las regiones variables de las cadenas tanto pesada (VH) como ligera (VL) clonadas. Los marcos y la COR se identificaron basándose en el sistema de numeración de Kabat (Kabat el al.,1983), excepto que la CORl de la cadena pesada se definió por medio de la definición de AbM de Oxford Molecular como la que abarca los residuos 26 a 35. El soporte lógico de modelado de anticuerpos AbM de Oxfore:! Molecular (htlpJ/people.crysl.bbk.ac.uk/-ubcg07sJ, Martin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1.989); Martin el al., Melhods Enzymol., 203, 121-153 (1991 ); Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126 (1992); Y Rees et al., En Stemberg M.J.E. (Ed.), Protein Slructure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)) combina los sistemas de numeración de la CDR de Kabat y la región hipervariable de Chothia para definir las CDR. Para una concordancia de la numeracioo, las inserciones tanto en las regiones marco como en las CDR con respecto a los patrones se nombran como la posición del residuo seguida por una secuencia alfabética (p. ej., los residuos 82A, 828, 82C se insertan entre los residuos 82 y 83 en la cadena pesada como se mueslra en Tabla 3). Las secuencias lanto de VH como de VLlienen CDR3 relalivamente cortas. Hay un sitio de glicosilación potencial (Asp-Ser-Ser, NSS) dentro de la CDRl de la cadena ligera clonada. Eslo es coherente con la observación de que la cadena ligera de TMC-2206 tiene un peso molecular de 29 kD por medio de SDS-PAGE que puede ser desplazado por el tratamiento endoglicosidasa a 25 kD (peso molecular I¡pico de cadenas ligeras de anticuerpos).
Para confirmar que las secuencias clonadas representaban la VH y la VL bioactivas del anticuerpo TMC2206, el anlicuerpo purificado a partir del medio de hibridoma se sometió a secuenciación péptido N-terminal por degradación de Edman. La secuencia de aminoácidos deducida de ambos los clones VH y VL indicó la presencia probable de una glutamina N-terminal en cada uno, que planteó la posibilidad de bloqueo N-terminal derivado de la ciclación del residuo de glutamina N-terminal para producir piroglutamato (pGlu). Por lo tanlo, para eliminar cualquier glutamina terminal ciclada potencialmente, la proteína se sometió a digestión oon piroglutamato aminopeptidasa utilizando una enzima tolerante calor de Pyrococcus furiosus termófilo antes de someter las cadenas pesada y ligera a secuenciación peptídica N-terminal. La piroglutamato aminopeptidasa purificada (0,01 U) de Pyrococcus furiosus (Sigma, St. Louis, MO) se reconstituyó en 50 IJL de Tampón de Digestión (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM y ditíotreitol (DIT) 10 mM). Una preparación de TMC-2206 se digirió uti lizando una razón molar 1:100 de piroglutamato aminopeptidasa:proteína a 95Q C durante 1 hora. Las proteínas digeridas se resolvieron utilizando un gel de SDS-PAGE al 10% patrón (Tris-glicina, BioRad l aboratories, Hercules, CA) con mercaptoacetato de sodio (0,1 gen 150 mi de Tampón de Migración) en el depósito superior. El gel se transfirió a una membrana Immobilon P PVDF (Millipore, Billerica, MA) en Tampón de Transferencia (CAPS 10 mM, pH 10,5, 0,5 gi L de DIT y 15% de metanol) a 250 mAmp durante 1 hora. La transferencia se tiñó utilizando una disolución fresca de Ponceau S al 0,1% en ácido acético al 1% durante 1 minuto seguido por decoloración en ácido acético al 1 %. La transferencia se sometió a secuenciación de péptidos, donde se encontr6 que 20 de los primeros 21 aminoácidos N-terminales de la cadena ligera se secuenciaron con éxito y mostró una identidad exacta con la secuencia peptídica deducida obtenida por clonación. Esto confirmó que la identidad del primer aminoácido en el VL clonado era Glu. La VH digerida con piroglutamato aminopeptidasa no pudo proporcionar datos de la secuencia peptidica
Ejemplo 2
Los anticuerpos quiméricos con especificidad para integrina a2131 fueron diseñados y preparados, incluyendo anticuerpos quiméricos ratón-humano. Las regiones VH y VL del TMC-2206 clonado como se describe en el Ejemplo 1 se utilizaron para diseñar y preparar cadenas pesadas y ligeras quiméricas, respectivamente, utilizando técnicas de clonación molecular convencionales (véase, p. ej., Molecular Biology Manual por Sambrook y Russell, 2001)
las cadenas pesadas y ligeras fueron clonadas con la introducción de sitios de restricción como sigue. los cebadores, TMC-2206-r5' CCCGAATTCACAGGTGCAGTTGAAGGAGTCA SEO ID NO: 22) y TMC-2206-r3' CGGGATCCITAGGATCATITACCAGGAGAG TGGGA (SEO ID NO: 23), se utilizaron para clonar la cadena pesada de TMC-2206 por med io de RT-PCR a partir de ARNm de hibridoma BHA2 y se utilizaron los cebadores TMC-2206k5' CGGGATCCTTAGGATCATTTACCAGGAGAG TGGGA (SEC ID NO· 24) Y TMC-2206-k3' CGGGATCCTTATCTCTAACACTCATTCCTGTTGAA (SEO ID NO: 25) para clonar la cadena ligera de TMC-2206 Estos cebadores introdujeron sitios EcoRI y BamHt en los extremos 5' y 3', respectivamente, para permitir la clonación de las cadenas pesada y ligera clonadas en los vectores de expresión de mamífero pIRES2-GFP y pIRES2-Ds Red (Clontech, núms. catálogo. 632306 y 632420), respectivamente. Ambos vectores fueron diseñados para llevar una secuencia lider de Ig. METOTLLLWVlLLWVPGGSTGO (SEO ID NO: 26)
Para aislar el ARNm, se sedimentaron aproximadamente 1 millón de células de hibridoma que expresaban TMC-2206 a baja velocidad (10 minutos a 800 rpm), se lavaron con PBS, y se lisaron con 1 mL de Trizol (Invitrogen, CA). Después de someter a vórtice vigorosamente, la suspensión celular se extrajo con 0,2 mi de doroformo y después de la centrifugación (14.000 rpm durante 5 minutos a 4Q C), el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo donde el ARN se precipitó mediante la mezcla con 0,5 mL de isopropanol seguido de centrifugación (14.000 rpm durante 10 minutos a 4"C). El sedimento de ARN se lavó con 1 mi de etanol del 75% y se disolvió en 50 IJL de H20 tratada con DEPC
Se llevó a cabo la reacción de RT-PCR (kit oiagen RT) como se ha descrito anteriormente utilizando 0,5 j.lg de ARN , 10 j.lL de tampón de RT 5x, 2 j.lLde 10 mM de mezcla de dNTP, 5IJL de cada disolución de cebador 10 mM y 2 j.lL de mezcla de enzima en un volumen total de 50 IJL. Los productos de PCR fueron digeridos con las enzimas de retricción EcoRI y BamHI y los fragmentos purificados a partir de gel de agarosa a11 % se ligaron a continuación en los sitios EcoRIIBamHt de los vectores pIRES2-GFP (cadena pesada) y pIRES2-Ds Red (cadena ligera). La posterior secuenciación de las regiones va riables confirmó que no se hablan introducido mutaciones por la RT-PCR.
Se eligió pCI -neo (Promega, núm. catálogo E1841) como vector de expresión para la clonación de moléculas de anticuerpo quiméricas, incluyendo humanizadas, basándose en o derivadas de TMC-2206 como se describe a continuación. Para reducir la posibilidad de introducir mutaciones en las regiones constantes a través de PCR, se prepararon casetes de donación tanto para VH como para VL. En primer lugar, el AON que codifica un líder de IgK (SEO ID NO: 26 ) se clonó en los sitios de clonac ión Xhol y EcoRt de pCI-neo utilizando los oligonudeótidos IgK-S (SEO ID NO: 27) e Ig.-AS (SEO ID NO: 28) enumerados en la Tabla 2, que se hibridaron entre si y luego se ligaron directamente en pCI-neo digerido con Xhol-EcoRI utilizando la ligasa de T4. Esto proporcion6 el vector parental para todas las etapas de clonación posteriores. A partir de esto, se elaboraron dos casetes de expresión: una para la clonación en las regiones VH adyacentes a un Fc de IgG1 humana (hFc) y la segunda para la clonación en las regiones VL aguas arriba de la región constante de la cadena kappa humana (hKc)
No se encuentran sitios EcoRI , Xbal , Hindlll o San en las secuencias de Fc de IgG1 humana (hFc) o la región constante de la cadena kappa (hKC), por lo tanto, cualquiera de estos sitios de restricción podria ser introducido en el extremo 5' de las regiones constantes para facilitar la clonación. Se eligi6 Sall elegido como sitio de clonación ya que esto reduciría al mínimo el número de cambios de aminoácidos en la unión variable-constante. Para la quimera de la cadena pesada, la introducción de un sitio Sall en la unión de VH de ratón-Fe humano se llevó a cabo sin causar ningún cambio en la secuencia de aminoácidos. En primer lugar, se elaboró un fragmento de VH EcoRI Sall por medio de PCR utilizando los pares de cebadores TMC-2206-R5 '(SEO ID NO: 22) y TMC2206VHhlgG1I4Fc-Sall (SEO ID NO: 29) que se muestran en la Tabla 2 para introducir un sitio de restricción Sall en el extremo 3' de la secuencia de VH murina utilizando la cadena pesada clonada en el vector pIRES-GFP como molde El Fc de IgGl humana se obtuvo de la amplificación del ADN del clan IMAGEN 20688 (Invitrogen, núm. de catálogo 4764519) utilizando los cebadores mostrados en la Tabla 2, hlgG1f4Fc-Sall-F (SEO ID NO: 30) y hlgG1/4Fc-Notl-R (SEO ID NO: 31). Los dos productos de PCR fueron digeridos con EcoRI/Sall y Saft/Notl , respectivamente , se purificaron, y se ligaron con pCI-neo-lgK digerido con EcoRllNotl. El vector resultante se denominó pCI-neo-lg.TMCVH-hFc
Para la quimera de la cadena ligera, no fue posible diseñar un sitio salo sin cambiar dos aminoácidos en la unión VL-KC , El0SD y L 1061. Esto se logró med iante la generación de un producto de PCR uti lizando los cebadores mostrados en la Tabla 2, TMC-2206-k5 ' (SEO ID NO: 24) y TMC2206VL-hKc-Sall (SEO ID NO: 32) para amplificar la región 2206VL a partir del plásmido, pIRES-OsRed2-TMC-2206LC anterior. El producto de la PCR se digirió con EcoRlISa/l, se separó en un gel de agarosa al 1%, se purificó con un kit de Extracción de Gel (Oiagen) y se ligó con la región constante de la cadena ligera de IgK humana amplificada a partir del clon IMAGE núm. 4704496 (ATCG) utilizando los cebadores hKc-Sall-F (SEO ID NO: 33) y hKc-Notl-R (SEO ID NO: 34) y el vector descrito anteriormente, PCL-neo-lgK .EI plásmido resultante se denominó pCI-neo-lgK-TMC2206VL-hKc
Para evaluar si el cambio de dos aminoácidos en la unión VL-KC tendría impacto en la actividad del anticuerpo, se construyó una segunda quimera cadena ligera que codificaba el plásmido quimera de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos parental. En primer lugar, las regiones constantes de VL y kappa humana fueron amplificadas con el par de cebadores TMC-2206VLwI-hKc-R y TMC-2206-k5' (SEO ID NOS: 36 y 24) Y el par de cebadores TMC-2206VLwt-hKc-F y hKc-Notl-R (SEO ID NOS: 35 y 34), respectivamente, utilizando el vector pIRES2-0sRed2-lgk-TMC2206LC anterior como un molde. En segundo lugar, el empalme mediante OCR de extensión solapante (Horton et al., Gene 77 (1):. 61-8 (1989» con los cebadores TMC-2206-kS' (SEO ID NO: 24) y hKc-Notl-R (SEO ID NO: 34) se realizó para enlazar los dos productos, y el producto final de la PCR se digirió y se clonó en pCl-neo-lgK.
Para confirmar que el anticuerpo quimérico ratón-humano clonado tenia la misma especificidad que el anticuerpo monoclonal TMC-2206 original secretado por el hibridoma BHA2.1, el anticuerpo quimérico de ratónhumano se expresó en células 293F utilizando la metodología de transfección transitoria utilizando una mezcla de transfección compuesta por partes iguales de AON/OptiMEM y 293fectinafOptiMEM (Invitrogen). Cada disolución se elaboró con OptiMEM precalentado a temperatura ambiente. La mezcla de AON/OptiMEM contenía 20 ~g del plásmido de expresión de la cadena pesada (HG), 20 ~g del plásmido de expresión de la cadena ligera (LG), y OptiMEM hasta un volumen total de 1,3 mL. La mezcla de OptiMEM 293fectina contenía 53 ~L de 293fectina y OptiMEM hasta un volumen total de 1,3 mL. La mezcla 293fectin se añadió a la mezcla de AON, se mezclaron y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de transfección de 2,6 mL se añadió a un matraz que contenía 40 mL de cultivo de células 293F en 106 célulaslmL. El matraz se incubó a 37"C, 8% de C02 con agitación a 120 rpm. Después de 3 días, la suspensiórJ celular se centrifugó y se sometió inmediatamente a cromatografía de afinidad con proteína A para purificar el anticuerpo. El producto final se concentró, se analizó pOI" SDS-PAGE y se determinó la concentración de proteína mediante análisis de LoWf}'.
Para confirmar que el anticuerpo quimérico ratón-humano purificado tenía la misma actividad de unión que el anticuerpo TMC-2206 parental, se sometió a ensayo el anticuerpo quimérico ratón-humano purificado para determinar su capacidad para bloquear la adherencia celular mediada por integrina 02131 . Las células CHO que expresaban una integrina a2 humana (SEO ID NO:. 8) y 131 de há~ster endógeno (Symif!.~ton +~t al. , J Cell ~iol. 120
(2): 523-35 (1993)) se separaron del matraz de cultiVO por Incubaclon en PBS libre de Ca IMg que contenla EDTA 5 mM. Las células se centrifugaron después (1200 rpm durante 8 minutos en un rotor Beckman GH 38) Y el sedimento se resuspendió en 10 mL de RPMI-1640. Se añadieron 30 ¡JL de CFSE 17 mM (Molecular Probes, OR) a la suspensión celular y la mezcla se incubó a 37"C durante 15 minutos. Las células marcadas se sedimentaron a baja velocidad, se resuspendieron en 10 mL de RPMI-1640 con BSA al 0,1% y se contaron. La concentración celular se ajustó a 8 >< 105 célulasfml y se mantuvieron en la oscuridad hasta su uso. Una placa recubierta con colágeno (colágeno de cola de rata Tipo 1; BO Biosciences) se bloqueó con 100 ¡JUpocillo de BSA al 0,1% en PBS y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras de proteína se diluyeron seriadamente en medio libre de suero y se añadieron 50 ¡JL de cada disolución de anticuerpo diluido seriadamente a la placa de colágeno. A continuación se añadieron 50 ¡JUpocillo de células marcadas al pocillo y la placa se incubó durante 1,5 horas a 3rC. Después del lavado, las células se lisaron con Triton X-100 al 0,1% y la intensidad de fluorescencia (excitación, 485 nm; emisión, 535 nm) se leyó uti lizando un contador multi-marca Victor2 1420 (Per1<in-Elmer). La quimera TMC-2206 clonada fue un potente inhibidor de la adherencia celular al colágeno de tipo 1 mediada por 02131 y mostró una potencia equivalente a TMC-2206 con un valor de CESO de 1,8 nM en comparación con 1,2 nM, respectivamente. En estos experimentos, el uso de IgG de control no produjo ninguna inhibición de la unión mientras que el uso de TMC-2206 murino o el anticuerp,o quimera mostró inhibición de la uniórJ cuando se sometió a ensayo en un intervalo de concentración molar de 10· 1 a 10~.
La afinidad del anticuerpo quimérico de ratón-humano por la integrina 02131 inmovilizada también se comparó con el anticuerpo parental TMC-2206 para determinar su capacidad para competir por la unión de TMC2206 marcado con Eu a placas recubiertas con 01321 , p_ej., mediante la determinación de los valores de Ki. En primer lugar, se determinó la afinidad del anticuerpo parental TMC-2206 por la integ rina 02[31 inmovilizada mediante la unión de equilibrio. Los pocillos de una placa de microtitulación de 96 poci llos se recubrieron con inlegrina 02[31 de plaquetas (recubiertos a medida 02[31 de plaquetas humanas por GTI Inc., WI) y luego se bloquearon con leche sin grasa. Para los análisis de unión y competición, se utilizaron TMC-2206 marcado nuorescentemente o anticuerpo IgG de control de isotipo. Para marcar los anticuerpos con reactivo Eu-N1-ITC, se suspendieron aproximadamente 2 mg de cualquiera de TMC-2206 o control de isotipo, MOPC-21 (Invitrogen) y se sometieron a diálisis frente a disolución salina tamponada con fosfato (PBS; KH2P041,47 mM, MM Na2HP04 8,1 mM; pH 7,4, NaCI138 mM y KCI 2,67 mM). Después de la concentración en los concentradores Microsep prelavados (corte 30-kDa; Pall life Sciences a 9500 rpm (7000 xg) en un rotor JA-20 (Beckman Instruments, Inc.) durante 20 minutos a 4Q C), los anticuerpos se ajustaron a 4,0 mg/mL con PBS que contenía una concentración final de NaHC03100 mM, pH 9,3. La mezda de mAblbicarbonato (0,250 mL} se mezcló suavemente en un vial que contenía 0,2 mg de ácido N' -(Pisotiocianatobencil)-dietilentriamino-N\ fIi,t.f,t.f-tetraacético quelado con Eu3+ (Eu-N1-ITC; Perkin Elmer Life Sciences) y se hizo reaccionar durante la noche a 4Q C sin agitación. Cada mezda de anticuerpo marcado se aplicó a una columna separada PD-10 (GE Biosciences, Piscataway, NJ) pre-equilibrada Tampón de Migración (Tris 50 mM, pH 7,4 Y NaCI 138 mM). Las fracciones (0,5 mL) se recogieron y se ana lizaron para determinar la proteína total (reactivo de Bradford; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) utilizando un lector de placa para la absorbancia SpectraMax 384 y el europio después de una dilución 1 :10.000 dilución en DELFIA Enhancement Solution (PerkinElmer) por fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) utilizando un lector de placas multi-marca Viclor2 (Perkin Elmer). Las fracciones que fueron positivas tanto para la proteína como para la marca de Eu se reunieron y se aplicaron a las nuevas columnas PD-10 y las muestras recogieron y se analizaron para determinar la proteina total y el contenido de europio por TRF calibrado frente a una disolución patrón de europio (Perkin-Elmer) para calcular la razón de núor: proteina. El anticuerpo marcado con nuorescencia, ya sea Eu-TMC-2206 o Eu-lgG de control de isotipo, se aplica a continuación a las placas de microtitulación de integrina a2p1 bloqueadas en un volumen de 10 ~Upocillo. Después de incubar las placas selladas durante 1 hora a 3J<'C para permitir la unión hasta alcanzar el equilibrio, se transfirieron muestras de 2 ~L de cada pocillo a un pocillo nuevo que contenía DELFIA Enhancement Solution (100 ~UpociIlD; Perkin-Elmer) para la medición de la marca libre (no unida). Se añadió Enhancement Solution (100 ~UpociIlD) a los pocillos vacíos para la medición de marcador unido. La placa se agitó (ajuste de velocidad de Titer Plate Shaker de 5 durante 5 minutos a temperatura ambiente) y las intensidades de fluorescencia resueltas en el tiempo (TRF) se leyeron utilizando un lector de placa multi-marca Victor2 (Perkin-Elmer Wallac, Bastan, MA). Se calculó mediante el análisis de Scatchard que el valor de Kc era de 0.374 nM para TMC-2206
Las potencias de unión relativa para integrina a2¡31 inmovilizada se analizaron midiendo los valores de K¡ en un ensayo de competición utilizando Eu-TMC-2206 marcado con nuorescencia 100 pM en presencia de concentraciones variables de anticuerpo no marcado TMC-2206 o anticuerpo quimérico como competidores, utilizando un sistema de análisis similar al descrito anteriormente. Combinaciones de anticuerpos de ensayo se aplicaron después a los ~illos recubiertos con integrina a2¡31 , sometidos a ensayo en un intervalo de concentración de lO"' a 10' M, Y tras el tiempo especificado, se determinó la cantidad de Eu-TMC-2206 unido. Las curvas de inhibición se ajustaron con el modelo de "competición por un sitio" utilizando el soporte lógico Prism (GraphPad, Inc.) para obtener valores de Clso y para calcular la K; utilizando la ecuación de Cheng y Prusoff (1973) y el va lor para Kc de 0,374 nM de arriba. El anticuerpo TMC-2206 parental mostró una K¡ de 0,22 ± 0,04 nM (n = 10) en comparación con un valor de 0,27 ± 0,07 nM (n = 5) para la quimera de tipo salvaje (wt). La actividad de la quimera wt fue comparable a la de la forma quimérica que llevaba las dos mutaciones LC introducidas diseñando un sitio Sal1 (K¡ también 0,27 nM), lo que confirma que estas mutaciones no afectaban a la actividad. En estos experimentos, los pocillos de control recubiertos con BSA, ya sea con IgG de control o con TMC-2206 no demostraron un ión a ningún anticuerpo
Ejemplo 3
Se diseñaron y prepararon anticuerpos humanizados con especificidad para integrina a2p1 Los residuos del anticuerpo TMC-2206 clonado que comprenden las regiooes CDR de las cadenas pesada y ligera se determinaron y se prepararon variantes humanizadas como sigue. Tres regiones de hipervariabilidad dentro de las regiones marco menos variables se encuentran en las regiones variables tanto de la cadena pesada como ligera. En la mayOfia de los casos, estas regiones hipervariables corresponden a las CDR, pero pueden extenderse más allá Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de TMC-2206 se especifican anteriormente en las Tablas 3 y 4, respectivamente. Las regiones CDR y marco fueron aclaradas generalmente de acuerdo con Kabat por la alineamiento con otras regiones VH y VL utilizando búsquedas generales de homología utilizando la base de datos BLAST de proteinas de NCBI (http://I..v...\..\v.ncbLnih.90v/BLAST/, Ve el al., Nucleic Acids Res, JuL 1· 34 (Web Server Issue): W6-9», excepto para HCDR1 La HCDRI fue definida por la definición de AbM como la que abarca los residuos 26 a 35. El soporte lógico de modelado de anticuerpos Oxford Molecular's AbM (hllp:/lpeople.cryst.bbk.ac.ukl-ubcg07s/, Martin el al., Proc. Na!L Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1.989); Martin et al., Methods EnzymoL, 203, 121-153 (1991); Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126 (1992); Y Rees et al., En Sternberg M.J.E. (Ed.), Protein Structure Prediction. Oxford Universily Press, Oxford, 141-172 (1996» combina los sistemas de numeración de Kabat y Chothia en la definición de las CDR. Así, las regiones CDR de la cadena pesada
se definieron como sigue: Del mismo modo, las regiones COR de la cadena ligera se definen como sigue:
HCOR1
aa26 -aa 35
HCOR2
aa50 -aa65
HCOR3
aa95 -aa102
LCOR1
aa24 -aa34
LCOR2
aa50 -aa56
LCOR3
aa89 -aa97
5 Es deseable conservar la afinidad de unión del anticuerpo murino en el anticuerpo homólogo humanizado. Puede ser deseable elegir una molécula aceptora humana que comparta homología con el anticuerpo murino. Los aceptares humanos preferidos son los marcos de la línea germinal humana debido a que la falta de mutaciones somáticas puede disminuir el grado de inmunogenicidad, sin embargo, los marcos de anticuerpos maduros individuales también pueden ser utilizados como moléculas aceptaras. La base de datos V-BASE (http://base.mrc
10 cpe.cam.ac.uk) proporciona una lista completa de las secuencias de la linea germinal de la cadena pesada y ligera humanas y se utilizó como una fuente de secuencias de la Hnea germinal humana para comparar con la VH y la VL de TMC-2206; también se utilizó la base de datos de Kabat (http://kabatdatabase.com/, Johnson, G. y Wu, T.T. (2001), Nucleic Acids Res., 29, 205-206).
La VH de TMC-2206 VH se alineó bien con tres de las 51 secuencias de la Hnea germinal humana en la
15 base de datos V-BASE, 4-59, 4-61 Y 4-30.4, sin secuencias que muestren un buen ajuste en el marco 3. Las longitudes de las COR H1 y H2 4-59 fueron idénticas a las de la VH de TMC-2206, y se seleccionó 4-59 (SEO ID NO: 39) como un marco aceptar. Portaba la misma clase de estructura canónica 1 para la COR H1 y la COR H2 que COR H1 y COR H2 de TMC-2206. Las regiones COR3 y FW4 de VH no se incluyen en las secuencias de la Hnea germinal VBASE, porque parte de la COR3 y 4 regiones marco derivan de un gen diferente y no contiguo que varia
20 durante la maduración de cada anticuerpo. Se utilizó la secuencia del anticuerpo, CAA48104 (NCBI entry: gil335831emb/CAA48104; hllp:/lwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para proporcionar las secuencias de CDR3 y FW 4 para el alineamiento, y una secuencia de la molécula aceptara FW4. Una comparación de la VH de TMC-2206 con 4-59 y la región CDR3 y FW4 de la secuencia del anticuerpo CAA481 04 se proporciona en la Tabla 5.
TABLA 5
NO!I't:1.re
.., ---------1---------,---- "',.. --1--- .., ----4-------' "'''"'' ~--------6-----
NoJn . Kabat
12)456"90123(56"9012)45 6119012)(S 61"0121456119 011)4561"0123' )
'rMC-2206
OVOUtsGPGLYI\PSQSLSITCTYS GrsLTIIYGIH W~PGKGLtIlLG YIWARGFTHYH5~
IStO ID 110,211
'-S9 esto ID MO,)9)
QYOI.OtS<iPGLYK'S&"TULTCTV s GC,tS$Y""S WI lIQ'rGI\GLtlfIG YIYYSGSTMYH,St.KS
Nombr e
Nombre
.., ltCoU n"
Num. KX¡aI :
"e'012)' ~"'9012~SC1~)6"901 23( S,7"O~OEU 3U'1U012)
1"1«:-2206
RLl l fKDIISOSQVrLKKHSLQ.DOSIITYrcAK IIJIQGYYYI\I'I --OY WGOGTSVTYSS
eStO ID NO:211
(-$9H¡tÓ JO NO,)9
~YtI SYOTSK~fS~~~SSYT~OTAVTT~ N~SSMTGlIlfOY "IIGWTLYTYSS
CMU10'(W I D. tUI
Nt'$$Sw,CII'f"OY ItGOGT~YTY$S
la secuencia de la línea germinal, A14 (SEO ID NO: 37), fue una de 38 secuencias de anticuerpo Vl humano en la base de datos V-BASE y fue seleccionada como un marco VL aceptar. A14 está en la familia VK VI y su LCDRl y lCDR2 están dentro de las clases canónicas 2 y 1, respectivamente. lCDR2 de TMC-2206 es también de la dase 1, aunque lCDRl de TMC-2206 es similar, pero no idéntica, a una estructura canónica de clase 1. las secuencias de Vl de la línea germinal se extienden a través de CDR-l3, por lo que se seleccionó una secuencia adicional para FW4 de una Vl humana. la secuencia seleccionada representa un gen del marco 4 utilizado comunmente para las cadenas ligeras kappa en anticuerpos humanos maduros (p. ej ., MB24132, entrada NCBI gi/259596/gb/MB24132;http://www".ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Aunque con la introducción del sitio San , se hicieron dos cambios de aminoácidos en la secuencia durante la construcción de la quimera de la cadena ligera (El05D y L1061, que no afectan a la unión de los anticuerpos, véase más arriba), el aceptador de la cadena ligera humana FW-4 ya tenia una isoleucina en la posición 106 por lo que este cambio sólo introdujo una mutación única conservativa de aminoácidos (E105D) en las variantes humanizadas. Una comparación de la Vl de TMC-2206 con A14 y la región FW4 de la secuencia del anticuerpo MB24132 se proporciona en la Tabla 6.
TABLA 6
Se prepararon variantes humanizadas de TMC-2206 utilizando secuencias de CDR de las secuencias VH y Vl de TMC-2206 y los marcos humanos seleccionados como se describe anteriormente. Para mantener la adecuada presentación de CDR, algunos residuos canónicos de marcos aceptores (véanse, p. ej., Chothia et al., 1985, 1992; Queen el a'-.1989: Foote y Winter. 1992; http://people.aystbbk.ac.ukl-ubcg07s)pueden ser intercambiados por los residuos canónicos murinos donadores homólogos, un proceso llamado retro-mutación. las Tablas 7 y 8 enumeran los residuos que pueden afectar a la conformación de CDR y al empaquetamiento entre cadenas, respectivamente, y muestran diferencias entre los residuos de VH y Vl de TMC-2206 donador y los correspondientes residuos del marco aceptor humano (resaltado en negrita y cursiva). El residuo l46 marcado con un asterisco en la Tabla 8 puede jugar un papel tanto en la presentación de la estructura canónica de CDR como en el empaquetamiento entre cadenas.
Como se muestra en las Tablas 7 y 8, once residuos del marco que afectan a la presentación canónica de CDR y dos residuos que afectan al empaquetamiento entre cadenas difieren entre el TMC-2206 donador y las secuencias de la Ifnea germinal aceptora humana A14 y 4-59, estando el residuo l46 en ambas categorlas. Especificamente, estas diferencias son las posiciones H37, H48, H67, H71, H73, H78, Y H91 para la cadena pesada y l2, l4, l46, l47, l49, Y l71 en las regiones del marco variable de la cadena ligera. Estos residuos fueron identificados y seleccionados como candidatos para la relro-mutación.
Tabla 7
VL
VH
Residuos Kabal Núm.
TMC-2206 Aceptor A14 Residuos Kabal Núm. TMC-2206 Aceptar 4-59
2
F V 2 V V
4
L M 47-49 W, A, G W , I, G
35-36
W, Y W, Y 67 L V
VL
VH
Residuos Kabat Núm.
TMC-2206 Aceptor A14 Residuos Kabat Núm. TMC-2206 Aceptar 4-59
46-49
K,W, I, y L, L,I, K 69 I I
64
G G 71 K V
66
G G 73 N T
68-69
G, T G, T 78 V F
71
Y F 93-94 A, R A, R
98
F F 103 W W
Tabla 8
VL
VH
Residuos Kabat Núm
TMC-2206 Aceptar A14 Residuos Kabal Núm TMC-2206 AceptOf 4-59
34
H Y 35 H S
36
Y Y 37 V I
38
Q Q 39 Q Q
44
P P 45 L L
46·
K P 47 W W
87
y Y 91 F Y
89
Q Q 93 A A
91
W G 95 A H
96
L L 100c M R
98
F F 103 W W
.. Mutación que también afecta a la conformación de CDR
Las 13 retro-mutaciones candidato identificadas, con 11 que afectan a la presentación de una estructura
5 canónica apropiada y 2 que afectan al empaquetamiento entre cadenas, se incluyeron en la primera variante humanizada de TMC-2206. Además una Q amino terminal se mantuvo en la VL humanizada. Esta posición se mantuvo con la identidad murina debido a que es adyacente a la Phe en L2, que es un aminoácido inusual para esta posición. Estas variantes de cadena ligera y cadena pesada humanizadas se denominaron TMC-2206VH1 .0 y TMC2206VL 1.0. Se prepararon variantes humanizadas adicionales con un menor número de retro-mutaciones
10 cambiando los residuos murinos de nuevo a los residuos del marco humano. De esta manera, se identificaron los residuos del marco que fueron sensibles a una reversión al residuo humano (en términos de mantenimiento de la potencia de los anticuerpos). En paralelo, se realizó un modelado por ordenador para ayudar en la selección de los residuos candidato para cambiar de nuevo al homólogo humano.
Se utilizaron los vectores de expresión pCI-neo quimera de la cadena ligera y la cadena pesada descritos en el Ejemplo 1 para la expresión de todas las variantes humanizadas. La versión 1.0 de la VH de TMC-2206 humanizada (hVH1 .0, SEQ ID NO: 40) y la versión 1.0 de la VL humanizada (hVL1 .0, SEQ ID NO: 41) que incorporan las 14 retro-mutaciones definidas anteriormente se tradujeron a una secuencia de nucleótidos optimizada para la expresión en células de mamífero utilizando el soporte lógico Vector NTL Estas secuencias se sintetizaron a medida en tándem dentro de un único constructo plasmídico por medio de Retrogen (San Diego, CA) y se clonaron en los sitios EcoRI y Sal de los vectores de expresión LC y HC de TMC-2206 parentales reemplazando las regiones VH y VL de ratón. Específicamente, la digestión con EcoRI-Sall del ADN plasmídico dio como resultado dos fragmentos de diferentes tamaños, siendo el más grande hVH1 .0 y el fragmento pequeño hVL 1.0. Estos dos fragmentos se clonaron a continuación en los sitios EcoRI y Sal de los vectores de expresión LC y HC quiméricos de pCI-TMC-2206 parentales, remplazando las regiones VH y VL de ratón, respectivamente, después de la digestión con EcoRI y Sall y la purificación en gel del fragmento grande de pCI-neolgk-TMC2206VG-hFc y pCI-neolgK-TMC2206VLhKC, respectivamente. Esta estrategia se utilizó para la preparación de variantes posteriores. Los plásmidos resultantes contenían el líder de IgK, la secuencia de inicio de la traducción de Kozak óptima, la región variable y una región constante humana.
La variante con la versión 1.0 de la VH de TMC-2206 humanizado (SEO ID NO: 40) y la versión 1.0 de la VL humanizada (SEO ID NO: 41 ) como se describe anteriormente se sometió a ensayo para determinar la actividad en un análisis de adherencia celular mediada por integrina 02131 y en un análisis de competición para determinar la unión a la integrina 02131 inmovilizada junto con la quimera y el anticuerpo TMC-2206 original tal como se describe en el Ejemplo 2. El valor de }(¡ para el prototipo humanizado fue de 0,32 nM, que era comparable con la K.. medida del anticuerpo TMC-2206 parental (0,21 nM), así como con la quimera (0,27 nM), indicando que esta primera versión humanizada conservaba la afinidad de unión. Del mismo modo, el primer prototipo humanizado mostró una actividad inhibidora comparable con el anticuerpo TMC-2206 parental en el bloqueo de la adherencia celular mediada por 02131 al colágeno (p. ej.,CEso de 1,5 nM para ambas)
Utilizando los datos generados por la variante de la versión 1.0, se realizaron una serie de mutaciones de nuevo a los residuos del marco de VH y VK humanas utilizando la metodología de PCR y se determinó un número mínimo de retro-mutaciones (residuos murinos) para evitar comprometer la especificidad y la afinidad del mAb TMC2206 original. Las variantes humanizadas deseables incluyen aquellas que conservan la actividad biológica del anticuerpo murino parental y también contienen menos residuos murinos para disminuir la inmunogenicidad potencial
Las secuencias cebadoras individuales se sintetizaron por medio de Sigma-Genosys y sus secuencias se enumeran en la Tabla 9. Los pares de cebadores y los moldes utilizados para las variantes generadas se muestran en las Tablas 10 y 11. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo uti lizando las siguientes condiciones: Cebador 1 y 2 (concentración final 0,6 IJM), dNTP (concentración final 1 mM), molde de ADN (1 a 10 ng), y 1 unidad de AON polimerasa Pfx (Invitrogen, CA) típicamente en un volumen final de 50 ¡JL El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 95Q C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos siendo cada ciclo de 95Q C durante 30 segundos, 56"C durante 45 segundos y 68Q C durante un minuto y medio La etapa final fue a 68Q C durante 10 minutos
Tabla 9
Nombre del cebador
Secuencias de nucleótidos (5' -3')
hVH3.0-F (SEO ID NO: 42)
AGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTG
hVH3.0-R (SEO ID NO: 43)
GTTCTTGCTGGTGTCCACGCTGATGGTCACGCGGGACATGAGAGCGCTGTT
hVH4.0-F (SEO ID NO: 44)
CCTCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATATGGGCTCGCGGC
hVH4.0-R (SEO ID NO: 45)
CTCCAGGCCCTTGCCTGGAGGCTGGCGTATCCAGTGGATGCCATAGTTGGT
hVL3.0-F
CCCAAGCTCCTGATCTATGACACTTCCAAGCTG
Nombre del cebador
Secuencias de nucleótidos (5' . 3')
(SEO ID NO: 46)
hVL3.0·R (SEO ID NO: 47)
AGTGTCATAGATCAGGAGCTTGGGGGCCTGGTCGGGCTTCTG
hVL4.0-F (SEO ID NO: 48)
GACGCGAATTCAGACGTGGTGATGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
hVH2.0-F (SEO ID NO: 49)
GTGACCATCAGCAAGGACAACAGC
hVH2.0-R (SEO ID NO: 50)
GCTGTTGTCCTTGCTGATGGTCACGCGGGACATGAGAGCGCTGTT
hVH5.0-F (SEO ID NO: 51)
ATCGGCGTGATATGGGCTCGCGGCTTC
hVH5.0-R (SEO ID NO: 52)
GCCGCGAGCCCATATCACGCCGATCCACTCCAGGCCCTTGCCTGG
hVH6.0-F (SEO ID NO: 53)
ATATGGGCTCGCGGCTTCACAAAC
hVH6.0-R (SEO ID NO: 54)
GTTTGTGAAGCCGCGAGCCCATAT
hVH7.0-F (SEO ID NO: 55)
GCCGCGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGCCAACGACGGG
hVH7.0-R (SEO ID NO: 56)
GTAGTACACGGCGGTGTCCGCGGCGGT
hvh8 .0-f (SEO ID NO: 57)
ATATCCAACTATGGCATCCACTGGGTT
hVH8.0-R (SEO ID NO: 58)
CCAGTGGATGCCATAGTTGGATATGCTAAATCCAGAGACGGTACAGGT
VH12.0.(K71V)-F (SEO ID NO: 97)
GCCTGACCATCAGCGTGGACAACAGCAAGAACCAGGTGAG
VH12.0-(K71V)-R (SEO ID NO: 98)
CTCACCTGGTTCTTGCTGTTGTCCACGCTGATGGTCAGGC
VH 13.0-(N73T)-F
CTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGAGCC
Nombre del cebador
Secuencias de nucleótidos (5' . 3')
(SEO ID NO: 99)
VH13.0·(N73T)-R (SEO ID NO: 100)
GGCTCACCTGGTTCTTGCTGGTGTCCTTGCTGATGGTCAG
VH14.0-(V78F)-F (SEO ID NO: 101)
GCAAGGACAACAGCAAGAACCAGTTTAGCCTGAAGCTGAGC
VH14.0-(V78F)-R (SEO ID NO: 102)
GCTCAGCTTCAGGCTAAACTGGTTCTTGCTGTTGTCCTTGC
hVL2.0-R (SEO ID NO: 59)
CAGCTTGGAAGTGTCATAGATCAATTTCTTGGGGGCCTGGTCGGG
hVL5.0-F (SEO ID NO: 60)
GACGCGAATTCAGACTTCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
hVL6.0-F (SEO ID NO: 61)
GACGCGAATTCACAG TTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
hVL7.0-F (SEO ID NO: 62)
GACGCGAATTCAGACTTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
hVL8.0-F (SEO ID NO: 63)
TTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGGAG
hVL8.0-R (SEO ID NO: 64)
CTCCAGGCTGCTGATGGTGAAGGTGAAGTCGGTGCCGCTGCCGCTGCC
VH12.0-(K71V)-F (SEO ID NO: 97)
GCCTGACCATCAGCGTGGACAACAGCAAGAACCAGGTGAG
VH12.0-(K71V)-R (SEO ID NO: 98)
CTCACCTGGTTCTTGCTGTTGTCCACGCTGATGGTCAGGC
hLCQ3-F (SEO ID NO: 65)
CCAATCAAGCGTGAACTACATTCACTGG
hLCQ3-R (SEO ID NO: 66)
CCAGTGAATGTAGTTCACGCTTGATTGGGCGCTGCAGGTGATGGTCAC
IgK-For (SEO ID NO: 67)
ACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC
hlgG1 Fc-CH 1-R
GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG
Nombre del cebador
Secuencias de nucleótidos (5' -3')
(SEO ID NO: 68)
CI-neo-msc3' (SEO ID NO: 69)
TTTCACTGCATTCTAGTTGTGG
Tabla 10
Variantes VH
Cebadores PCR para Fragmento 1 Cebadores PCR para Fragmento 2 Cebadores PCR para VH completa
2 .0
Igk-For y hVH2.0-R hVH2.0-F y hlgG1 Fc-CH1-R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
3.0
Igk-For y hVH3.0-R hVH3. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
4 .0
Igk-For y hVH4.0-R hVH4. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
50
Igk-For y hVHS.O-R HVHS.O-F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
6 .0
Igk-For y hVH6.0-R hVH6. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
70
Igk-For y hVH7.0-R hVH7. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
8 .0
Igk-For y hVH8.0-R hVH8. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
9 .0
Igk-For y hVH7.0-R hVH7. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
10.0
Igk-For y hVH7.0-R hVH7.0-F y hlgG1 Fc-CH1-R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
11 .0
Igk-For y hVH2.0-R hVH2.0-F y hlgG1 Fc-CH1-R Igk-For8 hlgG1 Fc-CH1-R
12.0
Igk-For y VH12.0-R VH12.0-F y hlgG1Fc-CH1-R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
13.0
Igk-For y VH13.0-R VH13.0-F y hlgG1Fc-CH1-R Igk-For y hlgG1 Fc-CH1-R
14.0
Igk-For y VH1 4.0-R VH14. 0~F y hlgG1 Fc-CH1 -R IgK-For y hlgG1 Fc-CH1-R
Tabla 11
Variantes VL
Cebadores PCR Fragmento 1 para Cebadores PCR Fragmento 2 para Cebadores PCR para VL completa
2 .0
Igk-For y hVL2.0-R hVL2.0-F y CI-neo-msc3' Igk-For y CI-neo-msc3'
3.0
Igk-For y hVL3.0-R hVL3.0-F y CI-neo-msc3' Igk-For y CI-neo-msc3'
4 .0
NIA NIA hVL4.0-F y CI-neo-msc3'
50
NIA NIA hVLS.O-F y CI-neo-msc3'
Variantes VL
Cebadores PCR Fragmento 1 para Cebadores PCR Fragmento 2 para Cebadores PCR para VL completa
6.0
NIA NIA hVL6.0-F y CI-neo-msc3'
70
NIA NIA hVL7.0-F y CI-neo-msc3'
8.0
Igk-For y HVL8.0-R hVL8.0-F y CI-neo-msc3' Igk-For y CI-neo-msc3'
9.0
Igk-For y hVL2.0-R hVL2.0-F y CI-neo-msc3' Igk-For y CI-neo-msc3'
10.0
Igk-For y hVL8.0-R hVL8.0-F y CI-neo-msc3' Igk-For y CI-neo-msc3'
11 .0
Igk-For y hVL8.0-R HVL8 .0-F y CI-neo-msc3' Igk-For y CI-neo-msc3'
12.0
Igk-For y VL12.0-R VL12.0-F y CI-neo-msc3' IgK-For y CI-neo-msc3'
La Tabla 12 enumera variantes de VH y la Tabla 13 enumera variantes de VL y compara los marcos aceptores humanos seleccionados con las variantes de VH y VL iniciales (1 .0). Las variantes de VH enumeradas en la Tabla 12 incluyen: hVH1 .0 (SEO ID NO:21 ); hVH2.0 (SEO ID NO:70); hVH3.0 (SEO ID NO:71 ); hVH4.0 (SEO ID
5 NO:72); hVH5.0 (SEO ID NO:73); hVH6.0 (SEO ID NO:74); hVH7.0 (SEO ID NO:75); hVH8.0 (SEO ID NO:76); hVH9.0 (SEO ID NO:77); hVH10.0 (SEO ID NO:78); hVH11 .0 (SEO ID NO:79); hVH12.0 (SEO ID NO:109); hVH13.0 (SEO ID NO:110); hVH14.0 (SEO ID NO:111). Las variantes de VL enumeradas en la Tabla 13: hVL1 .0 (SEO ID N0:41); hVL2.0 (SEO ID NO:80); hVL3.0 (SEO ID NO:81 ); hVL4.0 (SEO ID NO:82); hVL5_0 (SEO ID NO:83); hVL6.0 (SEO ID NO:B4); hVL7.0 (SEO ID NO:85); hVL8.0 (SEO ID NO:86); hVL9.0 (SEO ID NO:87); hVL10.0 (SEO ID
10 NO:BB); hVL11 .0 (SEO ID NO:B9); hVL12.0 (SEO ID NO:10B). Los residuos murinos conservados se indican en negrita_También se muestra cada variante adicional construida (véase más abajo). Cada variante mostrada en la Tabla 12 de más abajo VH1 .0 tiene la misma secuencia que VH1.O (indicada por un guión {-]) a menos que se muestre una sustitución de aminoácido específica, que cambia el residuo murino conservado al homólogo del marco humano. De un modo similar, cada variante de VL mostrada en la Tabla 13 tiene la misma secuencia que la variante
15 VL1.0 excepto por las sustituciones de aminoácidos específicas indicadas.
Ta bla 12
Nombr@ fWI Kabat _._-• • --1...--.---2-.--
CORt----3--- FWZ __ _ CDJU5---------6----
TMC-2206 VH OVQLICESCr<:LVAPSQSLSJ1CTIJS
GPSUfl YGIK WRQl'PGKGLt'WLC VJ"'ARGM'NYNS ALM S
4-Si VH OVOLOESCPCLVKPSETLSL~CTYS
GGSl: SSYY"V$ WI RO" GKGL[.'WIG YJ YYSGSTNY~PSLKS
hVt1 1.0 QVOLOt$G~L~P$~LSLTCTVS
WVR01'PGKGLDfLG
hVH2.0
11\1'113.0 nVfol4.0 hVt-l5.0
-1---------1-_____ _____ _ _1 _
h\lHli.O
IIVH1.0
hVH8.0
---) $ ---
hVl19.0
IIVH10.0
IlVH1LQ hVH1 2.0 h,,"1J.0 hVH1 4.0
-1----·-_·----------1 -1---------
TABLA 13
Nombre
FW1 CDA:1 PN' ce",
...., 2206 YO.
--------1---------¡-- ------3···- ----.._------- 5-----
__
Of'Vl.TQS'An.:IAnGr:,W'Tlfl'C SI'IIISS Vlnlll WYQOKSGTSPII.'I;Wll' M'''''''
A'4 Vl
tlVVIfI'OSPArt.SVT'GEkVTITC O,,"SEGIGlfYLY WY~PflQJlPkLLIK YASQSI$
hVLI .O
OFVl.TQ5 . l't.!'LSVTl'GZIlVT l 'I'C " "ns vlntH WYQQII¡ POQA.lt'tW l 't M SKU$
NombrE!
CO'"
hVl.2.0
I'lVL3.0
••••••••-••l.t.-.
IIVU.O
DII-H--------. -------
0------------------·-
O--H--------
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_________ _
1IVl.i.D'
.--------------1\
IIVL10.0
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IIVl11.0
_____ __
IIVL12.0
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-t------
--10-----cYtvktSGSGSG'SYSLTJSSM&TCOAATYYC AI4 Vl. H\l1I.0
()OIITTIIPLT
n;;oc;;TI\lEU
IIVl..2.0 .
hVl..J.O hlAA.O
IIVU.O
"\1\.8.0 11\1'\.7.0 "VUI.O
"'\1'\.9.0
nVLlo.o nVLII .O
-----------_·-c-------------·_·
-----------
___ c___ _____________ _
11\1\.12.0
El alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TMC-2206 con secuencias de la línea germinal mostró
una agrupación de residuos del marco que habían sido retro-mutados al equivalente murino en la variante de TMC
2206 humanizada inicial (TMC-2356»). Como se muestra en el alineamiento, hubo dos agrupaciones que cayeron
5 dentro FlN2 y FlN3 en la cadena pesada, y de manera simi lar hubo dos agrupaciones, uno situado en FlN1 y uno en FlN2, en la cadena ligera. Dos variantes de hVH y hVL que contenían retro-mutaciones a residuos humanos en los sitios de interés fueron las variantes 3.0 y 4.0, diseñadas para transportar agrupaciones de mutaciones para ayudar a definir las regiones en las que los residuos de interés podrían mentir (Tablas 12 y 13). Además de las diferencias en los residuos resaltados en las Tablas 7 y 8 para las regiones VL, la posición L 1 se cambió a Asp humano en
10 VL4.0, ya que este es un residuo común para las cadenas ligeras 1( humanas. Las cadenas pesadas hVH3.0 y hVH4.0 fueron co-transfectadas con las cadenas ligeras hVL3.0 y hVL4.0 en varias combinaciones VHNL y los anticuerpos resultantes se compararon con el anticuerpo hVH1.0fhVL 1.0 descrito anteriormente para determinar la afinidad por el ligando afinidad mediante comparaciones de cabeza a cabeza con el anticuerpo monoclonal TMC2206 sin marcar. En la Tabla 14, los residuos de la versión 1.0 de VH o VL humanizadas que se revirtieron a los
15 residuos humanos se ind ican en negrita y cursiva. Los números entre paréntesis en la Tabla 14 representan la multiplicidad de cambio de potencia en comparación con la variante hVH1.0, hVL 1.0
TABLA 14
hVHI.O
IIVH3.0
nVH4.a
IJ.Iloru K¡
(If,r. H4f)
(Her. H71. H1J. mI)
Valores K¡ 1nM]
IJ.Ilores K¡ fnMl
[.""
~
hVl..t.O
"3
,~,
12t.l
".
".
lO'
',"
',"
.,.
f~~t!n
631d
".
hVlA.~
~a.,
!~.
~:
'HZ
A partir de los valores de K¡ resultó evidente que los cambios en la variante VH 3.0 (residuos humanos insertados en H67, H71, H73 Y H78, denominada agrupación FIN-3) indujeron una gran disminución en la potencia 20 en los anticuerpos que contenían hVH3.0; del mismo modo, también se observó una disminución para las variantes hVL4.0 (residuos humanos insertados en L 1, L2 Y L4, denominada agrupación FIN-1). Excepto para los anticuerpos combinados hVH1.0/hVL3.0 y hVH4.0/hVL 1.0, que mostraron una multiplicidad de cambio de 1,9 Y 1,3 en la potencia cuando se compararon con el anticuerpo hVH1.0fhVL 1.0, respectivamente, todas las combinaciones restantes mostraron una disminución mayor que 4 veces en la potencia (Tabla 14). Estos datos indicaron que las
25 retromutaciones H37 (Val) y H48 (L a 1), ambas las cuales son cambios de aminoácidos conservativos, fueron bien toleradas. Los cambios L46 (K a L) y L47 (W a L) de los residuos murinos de nuevo a los residuos humanos fueron razonablemente bien tolerados en combinación con hVH 1.0 pero tuvieron un efecto adverso sinérgico marcada sobre la afinidad de los anticuerpos cuando se combinaban con la variante hVH3.0
El examen de las diferencias en los residuos que existían entre los marcos de VH y VL humanas y murinas
30 indicó que había algunos cambios conservativos. Adicionalmente, se realizó un modelado tridimensional por ordenador de VH y VL de TMC-2206 murino, las moléculas aceptaras humanas, y las estructuras hVH 1.0 y hVL 1.0 Para guiar el modelado por ordenador, se realizó una búsqueda BLAST para identificar las estructuras de la base de datos que se ajustaban más a VL y VH de TMC-2206. La estructura ISY6.pdb (resolución 2,0 A) se seleccionó para la VL de TMC-2206 y la estructura IGIG.pdb (resolución 2,3 A) se seleccionó para la VH de TMC-2206. Para la molécula aceptara de la cadena ligera humana A1 4, se seleccionó la estructura ICE1 .pdb (resolución 1,9 A) mientras para la molécula aceptora de la cadena pesada VH humana, se seleccionó 4-59, IONO (resolución 2,3 A)
El modelado predijo que era probable que los residuos murinos conservados en al VL 1.0 humanizada
5 contactaran con el antígeno, excepto dos (L 1 Y L4). Los modelos también indicaron que los residuos del marco de la línea germinal humana conservados no cootactaban con las COR mientras los residuos del marco murino conservado se agrupaban generalmente en torno a las CDR
En las regiones variables de cadena pesada, se identificaron tres áreas de diferencia entre las regiones VH murinas y humanas modeladas. La primera área eran los residuos H27 -H33 que se predijo que era probable que
10 contactaran con el antígeno y CDR H1 . Estos residuos también pueden afectar el ángulo de la interfaz VLNH y tener efectos indirectos adicionales sobre la unión al antígeno. La segunda área fue el primer bucle de CDR H2 que puede requerir el residuo H71 de FW. La tercera área fue CDR H3
Para las regiones de cadena ligera, también se observaron tres áreas de diferencia entre las estruduras de VL murinas y humanas modeladas. La primera estructura era CDR1 que era un residuo más larga en la VL de TMC15 2206 murino. La Y murina en L71 (F en A1 4) fue útil para dar cabida a esta diferencia. La segunda área era el bucle murino L40 a L43 que fue empujado hacia afuera aún más en el disolvente en comparación con el humano lo que indicó que L40-43 humano podría ser problemático, aunque la actividad del primer prototipo humanizado demostró que estas retro-mutaciones fueron toleradas en hVH 1.0. La tercera área eran los residuos del marco humano L55 a L59 que estaba desplazado con relación a la estructura murina. Se pred ijo que el residuo L73 del marco (L en el
20 murino, F en el humano) era respoosable de esta diferencia, aunque la retro-mutación fue tolerada en hVL 1.0
Utilizando el análisis in si/ico, se pred ijeroo los resultados para los residuos de la cadena pesada específica de interés y se resumen en la Tabla 15 a continuación. Resultados similares para los residuos de la cadena ligera de interés se enumeran en la Tabla 16
Tabla 15
Residuo
Murino Humano Posición Tipo de cambio
H37
V I Posiblemente en la interfaz VHNL Conservativo
H4B
L I Interior, lejos del sitio de unión, cerca de H67 Conservativo
H57
L V Interior, lejos del sitio de unión, cerca de H48 Conservativo
H71
K V Detrás de los residuos H53-H55 de CDR H2 Grande
H73
N T Detrás de CDR H2 , solvatado, cerca deH71 Moderado
H7B
V F Contada con el residuo H34 de CDR H1 , enterrado Grande
H91
F Y En la interfaz VHNL Conservativo
Tabla 16
Residuo
Murino Humano Posición Tipo de cambio
L1
Q O Detrás de CDR L3, solvatado Conservativo
L2
F V Contados profundos con CDR L3, parcialmente solvatado Grande
L4
L M Detrás de CDR L3, parcialmente salva lado Conservativo
L45
K L En la interfaz VHNL Grande
Residuo
Murino Humano Posición Tipo de cambio
L47
W L Interior VL detrás de CDR L2 Grande
L49
y K Posibles contactos directos con el antígeno Grande
L71
y F Detrás de CDR L 1 Conservativo
Utilizando el análisis in silico, se accedió a las posiciones y se clasificaron con el fin de reflejar la probabilidad de que una sustitución humana pudiera causar un efecto sobre el rendimiento del anticuerpo: H48, H67 < H37, H91 < H73 < H78, H71. En esta clasificación, se predijo que muy probablemente una retro-mutación humana en la posición H48 seria la mejor tolerada, mientras que se predijo que una retro-mutación en las posiciones H78 o H71 seria la menos tolerada. Del mismo modo, se pred ijo el orden siguiente para las posiciones de interés dentro de la región de la cadena ligera: L 1 < L4 < L71 < L2 < L47 < L46 < L49. En general, estas clasificaciooes estaban de acuerdo con los valores de K¡ obtenidos con las variantes hVH3.0, hVH4.0 y hVL4.0. Sin embargo, se observó una diferencia entre los efectos de la sustitución pronosticados por el modelado por ordenador y los efectos observados encontrados con las va riantes construidas en la actividad para la variante hVL3.0. Pof ejemplo, la va riante de anticuerpo que comprendía una combinación entre VH1 .0N L3.0 dio una actividad razonable, aunque los datos del ordenador anteriores pronosticaban que la variante hVL3.0 tendría una actividad enOfmemente disminuida. El impacto de los residuos del marco mu rino conservados se evaluaron adicionalmente mediante la construcción de variantes humanizadas adicionales, incluyendo ocho variantes VH y seis VL, cada una con una sola mutación del murino conservado con respecto a su homólogo humano. Se midieron las contribuciones relativas de los cambios a la actividad. La Tabla 12 enumera las variantes VH y la Tabla 13 enumeran las variantes VL
Los valores de K; que se obtuvieron para estas variantes indicaron que los residuos de ratón en H71, H78, L2 Y L46 se conservaban preferiblemente para maximizar la actividad, mientras que H37, H48, H67, H91, L1, L4 Y L71 se podrian cambiar por sus homólogos humanos sin dar como resultado una pérdida significativa en la actividad. El uso del modelado por ordenador, pronosticó que el cambio del residuo de ratón, L47 (Triptófano, un residuo raro para esta posición en anticuerpos humanos) y H73 tendría impacto en la unión al antígeno. Sin embargo, se predijo que el cambio a Val-L47 humano no afectaría significativamente a la unión del antígeno, y el cambio a Thr-H73 sólo causaría un cambio menor (disminución de 1,6 veces) como se mide mediante la K¡. Se predijo que L49 (Tirosina) se uniría al antígeno por medio del modelado in silico y se predijo que el cambio a una lisina humana causaría un gran cambio en la potencia. Sin embargo, el cambio a la lisina humana para esta posición causó solamente una disminución de 3,3 veces en la potencia medida por K,..
Se observó un cambio significativo en la VH para el cambio en H78 de la valina murina a la fenilalanina humana, lo que causó una disminución de 70 veces en la potencia para hVH11.0, variante de hVL1.0 en comparación con hVH1.0, variante de hVL 1.0 medida por K;. El modelado indicó que este residuo juega un papel en la estructura canónica de HCDR1 . Estos resultados sugieren que HCDR1 juega un papel importante en la unión al antigeno. Para maximizar la actividad, H71 también está conservado. El cambio de este residuo de Lys a Val dio como resultado una disminución de 6,4 veces la observada con hVH9.0, variante de anticuerpo hVL1.0. Además, entre los residuos canónicos de la cadena ligera, la fenilalanina de L2 fue sensible al cambio como se evidencia por la pérdida marcada en la afinidad de unión observada con la variante hVL4.0 en comparación con las variantes hVL5.0, hVL6.0 y hVL7 .0. El modelado por ordenador indicó que esta Phe-L2 podía hacer un amplio contacto con LCDR3. Las búsquedas en las bases de datos de anticuerpos humanos y murinos, además, indicaron que esta Phe en la posición L2 es rara, lo que sugiere que puede representar una mutación somática que tiene un impacto en la unión al antígeno
Esos residuos seleccionados después del análisis como se describe anteriormente por ser tolerantes a una relro-mutación se combinaron en las variantes de hVH 12,0 a 14,0 y las variantes de VL VL 10.0 a 12 y la actividad de estas variantes se comparó con el anticuerpo monoclonal TMC-2206 original y el anticuerpo TMC-2206 quimérico ratón-humano. Los resultados indicaroo que el número de residuos murinos en hVL podria reducirse a tres (p. ej., l2 [Phe], L46 [Lys] y L49 [Iyr]) sin causar ninguna pérdida de actividad de las variantes. Del mismo modo el número de residuos murinos en hVH se podría reducir de siete a Ires (p. ej.,H71 [Lys], H73 [Asn] y H78 [Val]) sin causar cambios estadisticamente significativos en la afinidad y la potencia Estos resultados se resumen en la Tabla 17
Tabla 17
VH
VL Cambios de nuevo a humano Núm. residuos murinos K¡ (nM) Media :t DT CE~(nM) Media :t DT
VH
VL Cambios de nuevo a humano Núm. residuos murinos K; (nM) Media ± DT CE~(nM) Media ± DT
mAb TMC-2206
NIA O,22±O,O4 118±O,3S
Quimera
NIA O,26t O,Ol 1,66t O,64
10
1,0 NIA ,. O,27±O,O6 2,70±1 ,66
10
1,OQ NIA ,. O,35±O,O3 3,OO±1 ,20
12 _0
10,0 H37, H48, H91 , L 1. L4, L47 8 O,29±O,OS 2,20±O,58
12.0
10,00 H37, H48, H91 , L 1, L4, L47 8 031±OO5 2,36±1 ,06
14.0
10,0 H37, H48, H91 , H91 , L1 , L4, L47 7 O,32±O,O7 2,90±2,71
14.0
10,00 H37, H48, H91 , H91 , L 1, L4, L47 7 O,29±O,OS 2,98±1 ,98
14.0
12,0 H37, H48, H67, H91 , L1 , L4, L47, L71 6 O,38±O,10 2,93±1 ,37
14.0
12,00 H37, H48, H67, H91 , L1 , L4, L47, L71 6 O,33±O,11 2,95±O,32
[El análisis ANOVA con ensayo de comparación significativas con TMC-2206 o la quimera]
mú ltiple de Dunnett no mostró diferencias estadísticamente
S 10
En paralelo, se construyeron homólogos a estas variantes en los que se cambió la secuencia de glicosilación consenso dentro de LCDRI. La eliminación del sitio de glicosilación (NSS a QSS) puede ser útil para la producción aguas abajo y el desarrollo del proceso. El cambio N260 en las variantes de hVL 1.0, hVL10.0 y hVL 12.0 (indicado como hVL 1.00 [SEO ID NO: 90), hVL 10.00 [SEO ID NO: 91) y hVL 12.00 [SEO ID NO: 92 ]) se introdujo en la variante VL relevante utilizando los pares de cebadores ind icados en la Tabla 18 cuyas secuencias se proporcionan en la Tab la 9. El cambio N260 no tuvo ningún efecto estadísticamente significativo sobre la actividad de cualquiera de los anticuerpos resultantes, como se muestra en la Tabla 17. Aunque este sitio de glicosilación existe en la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo TMC-2206 de tipo salvaje , estos datos indican que no parece jugar un papel en la afinidad de la actividad de la función de bloqueo del anticuerpo TMC-2206.
Tabla 18
Variantes VL
Cebadores de PCR para Fragmento 1 Cebadores de PCR para Fragmento 2 Cebadores de PCR paca VL completa
1.00
IgK-For y hLC03-R hLC03-F y CI-neo-msc3' IgK-For y CI-neo-msc3'
1000
IgK-For y Hlcq3-R Hlcq3-F y CI-neo-msc3' IgK-For y CI-neo-msc3'
12.00
IgK-For y Hlcq3-R Hlcq3-F y CI-neo-msc3' IgK-For y CI-neo-msc3'
15 Ejemplo 4
Los anticuerpos humanos de clase y1 portan funciones efectoras asociadas con el complemento y funciones mediadas por el receptor Fc. Los expertos en la técnica apreciarán que, para evitar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y las respuestas del complemento, se prefiere una cadena y que carezca de esta funcionalidad, tal como una región constante y4 humana. Para generar una versión y4 de los anticuerpos
20 VH12.D, VL 10.00 Y los anticuerpos VH14.0, VL10.00, se remplazó una secuencia de la región constante y1 por una secuencia de la región constante y4 en la cadena pesada VH12.0 y VH14.0 de la siguiente manera. La secuencia de la regiÓfl constante y4 se obtuvo de la secuencia K01316 de Genbank. Tanto una secuencia y1 Fc derivada del don
IMAGE 20688 utilizada para generar las cadenas pesadas intactas de anticuerpos IgG1 con regiones hVH y hVL como se describe en la presente memoria como el Fc y4 derivado de la secuencia K01316 contienen un sitio de restricción Apa1 de origen natural cerca de la unión de las regiones variables y constantes. Este sitio se utilizó para clonar una región coostante y4 para reemplazar la región constante y1 . Se colocaron sitios de restricción BamH1 y Not1 en el extremo 3' de la secuencia para facilitar la subclooación en el vector de expresión pCI -neo. La secuencia y4 (SEO ID NOS: 105 y 106), se sintetizó a cootinuación como un gen sintético de novo por medio de Blue Heron Biotecnology (Bothell, WA). El plásmido de Blue Heron Biotechnology, que contenía la región coostante de IgG4 sintetizada de novo, se digirió con Apal y NoM, el fragmento de la región constante de y4 de 1 kb se purificó en gel y se ligó en los plásmidos PCI-VH12.0 y pCI-VH14.0 digeridos con ApalfNotl para producir plásmidos que codificaban VH12.0-y4 y VH14.0-y4. Estos se combinaron individualmente con el plásmido pCI -VL10.00 y se transfectaron en células CHO. Cuatro días después de la transfección, los sobrenadantes de cultivo se recogieron y los isotipos de IgG4 de los anticuerpos VH12.0, VL 10.00 y VH14.0, VL 10.00 se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Proteina A. Se realizaron paralelamente nuevas transfecciones transitorias de los constructos y1 de estas variantes.
Después de la elución con ácido y la neutralización, la cromatografía de exclusión por tamaño analítica mediante HPLC indicó la presencia de formas oligoméricas de orden superior en las preparaciones de IgG4 purificadas con Proteína A. Por lo tanto, se llevó a cabo una segunda etapa de purificación mediante cromatografía de exclusión de tamaño Sephacryl S-300 26f60 para obtener la fracción monomérica. Para esto, la columna de Sephacryl S-300 26f60 fue pre-equililxada en 660 mi de Tampón de Migración SEC (HEPES 40 mM, pH 6,5, Lhistidina 20 mM, NaCI 100 mM y Tween-80 al 0,02%). Las fracciones reunidas que contenían la proteína eluida de la columna de Proteína A se cargaron (inyección de 12,5 mi de muestra) a través de un Superloop (Amersham Biosciences). Las fracciones SEC (5 mi cada una) se recogieron a una velocidad de flujo de 2,0 mlfmin. Las fracciones correspondientes a la forma monomérica (elución pico a 168,4 mi) se reunieron, y el contenido de proteína se determinó por medio de análisis de Lowry
Los anticuerpos IgG1 ilustrativos tienen una cadena pesada hVH 14,0 y (SEO ID NO: 181) o una cadena pesada hVH12.0 y1 (SEO ID NO: 182) y una cadena ligera hVL10.00 (SEO ID NO: 178). Los anticuerpos IgG4 ilustrativos tienen una cadena pesada hVH14.0 y4 (SEO ID NO: 174) o una cadena pesada hVH12.0 y4 (SEO ID NO: 176) y una cadena ligera hVL 10.0Q (SEO ID NO: 178). Los anticuerpos purificados se sometieron a ensayo en el análisis de competición para comparar la potencia por medio de los valores de Kj, así como en el análisis de adherencia celular a colágeno, donde la potencia se mide como valores de CEso, No se observó una diferencia significativa entre los isotipos de las diferentes variantes ni tampoco se diferencian significativamente del mAb original TMC-2206 en cualquiera de análisis como se muestra en la Tabla 19
Tabla 19
Isotipo
VH VL K; (o M) CEso (nM)
TMC-2206
IgG1 fK Mu rina Murina 0,22 1,03±0,29
hlgG1IK
14.0 10.00 0,24 1,30±0,10
hlgG1IK
12.0 10.00 0,27 2,20±012
hlgG4fK
14.0 10.00 0,36 2,82±1 ,04
hlgG4fK
12.0 10.00 0,27 1,83±0,27
Ejemplo 5
El efecto de anti-a2 sobre la extravasación de neutrófilos se estudió en un modelo de inflamación de peritooitis murino y de rata. La administración intraperitoneal de ciertos antígenos tales como caseína, carragenano o tioglicolato induce una respuesta de mastocitos rápida que inicia una respuesta de peritonitis aguda (Edelson et al., Blood 103 (6): 2214-2220 (2004)). Esta peritonitis se caracteriza por una rápida infiltración de neutrófilos (en cuestión de horas) seguido de una infiltración más lenta y proliferación de los macrófagos (3-5 días). Por lo tanto, se empleó este modelo para evaluar por primera vez el uso de anticuerpos anti-integrina 02 en la prevención o disminución funcional de la respuesta de los neutrófilos.
El modelo de peritonitis aguda se realizó en ratas y en ratones. El anticuerpo TMC-2206 reconoce la integrina a2¡31 de rata , pero no su homólogo murino_ Sin embargo, muchos modelos in vivo de los modelos inflamatorios se llevan a cabo en ratones y se utilizó un anticuerpo anti-02 sustituto, Ha 1129 (Pharmingen, Becton Oickinson, CA, núm de catálogo 559987), en el modelo de peritonitis aguda mu rino
Se inyectó a los animales IV o IP un anticuerpo anti-integrina a2 o de control de isotipo a dosis que oscilaban de 0,1 a 10 mglkg 15 minutos antes de la sensibilización. Se suministró una inyección de 1 mL de cualquiera de caseína al 9% (ratones) o carragenano (ratas) IP y los animales se devolvieron a su jaula durante períodos de tiempo específicos: 3 horas (ratones) o 5 horas (ratas) (n = 4 por grupo). Los animales fueron sacrificados a continuación con halotano y la cavidad peritoneal se lavó con 5 mL (ratones) o 10 mL (ratas) de PBS que contenia EDTA 5 mM. Las células se recogieron por cenlrifugación a baja velocidad, se resuspendieron en 5 mL de PBSfEDTA y se observó una alícuota de 100 ¡JL mediante microscopía, donde se observó que la mayoría de las células tenían una morfología polimorfonudear coincidente con la de los neutrófilos. Las células de la suspensión restante se sometieron a centrifugación a baja velocidad para obtener un sedimento celular lavado.
Contenido de neulrófilos se cuantificó analizando el nivel de actividad mieloperoxidasa (MPO) (p. ej., Speyer et al., Am J PathoI.163(6): 2319-28 (2003». El sedimento celular recuperado del fluido de lavado se resuspend ió en 500 IJL de tampón de KH2PO~ 50 mM tampón (pH 6,0) que contenia bromuro de hexadecH-trimetilamonio al 0,5% (HTAB; Sigma-Aldrich, MI). Las muestras se sometieron a sonicación durante 60-90 segundos y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4Q C. Se llevó a cabo una dilución seriada 2:1 del sobrenadante aclarado mediante la transferencia de 50 IJL de muestra aSO ¡JL de tampón HTAB en el pocillo de una placa de microtitulación. A continuación, se transfirieron 50 IJL de esta solución del pocillo a otros 50 IJL de tampón, y así sucesivamente hacia a lo largo de la serie de dilución. Se añadieron 200 ¡JL de tampón de sustrato (tampón KH2P04 50 mM (pH 6,0) que contenía 0,168 mg/mL de o-dianisidina y H20 2 al 0,0005%) a cada muestra para iniciar la reacción colorimétrica, que se conlroló con un lector de placa Molecular Devices ajustado a una longitud de onda de 460 nm. Después se calculó el número de Unidades de actividad enzimática en la suspensión celular original (500 ¡JI de suspensión celular lavada para cada animal individua l). Una curva de calibración, creada para titular los neutrófilosfmL (evaluada por conteo directo de neutrófilos) frente a la actividad MPO indicó una fuerte correlación lineal entre UfmL y el número de neutrófilosfmL dentro del intervalo medido
Como se muestra en la Tabla 20, tanto el anticuerpo anti-integrina 02[31 murino Ha1/29 como TMC-2206 tenían un efecto marcado sobre la infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal después de la sensibilización con caseína al 9% en ratones o carragenano a11% en ratas como se mide por la actividad total de MPO recuperada en el fluido de lavado peritoneaL El valor de DEso obtenido en ratón con Ha1f29 fue -0,07 mglkg, mientras la DEso para TMC-2206 en la rata fue -5 mg/kg. Esta diferencia se correspoode en parte con la afinidad relativa del anticuerpo anti-integrina a2~1 humano para integrina a2~1 de rata en comparación con la afinidad del anticuerpo Ha1129 por la integrina a2¡31 de ratón, y en parte con las diferencias en el antígeno utilizado en los modelos de rata y ratón (carragenano y caseína, respectivamente)
Tabla 20
Dosis
Contenido MPO (U)
(mglkg)
Med ia ± ETM (n)
Ha 1129
0,0 44,6 ± 10,1 (4)
0,05
28,1±3,4 (3)
Ratón
0,1 13,6 ± 0,8 (4) P<0,01
(caseína aI 9%)
0,5 7,3 ± 2,7 (3) P<0,01
1,0
7,5±1,6 (4) P<0,01
TMC-2206
0,0 362 ± 49 (5)
5,0
172 ± 41 (6) P<0,01
Rata
10,0 136 ± 24 (5) P<0,01
(carragenano al 1%)
15,0 82 ± 18 (6) P<0,01
Ejemplo 6
Se estudió el efecto de los anticuerpos anti-integrina a2 en un modelo de ratón (colitis inducida por sulfato de dextrano) de enfermedad inflamatoria intestinal. En este modelo, la colitis se induce en ratones mediante la administración de una disolución de sal de sodio de sulfato de dextrano al 5% (DSS) en el agua de bebida (Elson et al., Gastroenterology 109(4): 1344-1367 (1995); Egger B., et al., Digestion 62(4): 240-8 (2000)). Se evaluó el efecto del tratamiento con un anticuerpo anti-integrina a2~1 murino sobre el desarrollo de los signos dinicos y los sintomas de colitis, así como el efecto sobre la infiltración de leucocitos pro-inflamatorios en el colon
Se alojaron ratones BalbfC (Har1an, IN) con un peso de 16-21 gramos por parejas Los animales recibieron agua destilada o agua que contenía sal de sodio de sulfato de dextrano al 5% (DSS); (ICN, Irvine, CA) ad libitum durante 7 días. En esta etapa los ratones presentaban diarrea y pérdida de peso notable. El diseño del estudio fue de cuatro grupos de seis ratones cada uno; uno que servía como control sin tratamiento previo, uno que servia como control de DSS y dos asignados a recibir inyecciones intraperitoneales de 2 ó 5 mg/kg de dosis de anticuerpo antiintegrina a2 PSf2 en los Días O, 2, 4 Y 6. Los ratones fueron sacrificados el dia 7 (168 horas después del inicio de la alimentación con DSS). Se pesaron para observar cualquier cambio desde el inicio del estudio, se midió la longitud del colon y luego puntuaron en una escala de O a 2, siendo 2 la más severa, para la diarrea, el sangrado de colon y el sangrado rectal como sigue:
sangrado rectal:
puntuación de O-no hay sangre visible; 2 -sangre visible
Consistencia de las heces:
puntuación de °=nonnal; 1 =suelta; 2 =acuosa
sangrado de colon:
puntuación de °=no hay sangre visible; 2 =sangre visible.
Los cólones fueron procesados a continuación para la inmunohistoquímica. Los cólones, desde el ciego hasta el recto, se retiraron cuidadosamente y se fijaron durante 2 horas a 4Q C en paraformaldehído (PFA) al 4%, se dejaron durante la noche en sacarosa al 20% y luego se congelaron rápidamente en compuesto de congelación OCT (Tissue Tek). Se cortaron secciones finas (grosor 10 ¡..1M) seriadas utilizando un criostato Leica, se secaron al aire, se bloquearon durante 2 horas en suero de cabra al 3% en PBS y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en anticuerpo primario. Los anticuerpos primarios utilizados incluían anti-CD11bfmac-1 murino de rata (un marcador para macrófagos y neutrófilos activados, Clone M1f70, BD-Pharmingen) anti-CD3 murino de hámster (un marcador de células T, BD-Pharmingen), y el clan F4/80 (un marcador de macrófagos, Research Diagnostics, Inc). Los portaobjetos se lavaron a continuación, se incubaron 2 horas en el correspondiente anticuerpo secundario marcado con Alexa 488 o TRITC (Molecular Probes, OR) y se lavaron tres veces durante 5 minutos en PBS y se montaron en medio Vectashield que contenia DAPI (Vector Labs, CA). Las secciones se observaron con un microscopio de epifluorescencia Leica coneelado a una cámara Spot RT (Research Diagnostics). Se cuantificó la intensidad de la fluorescencia y el número de células fluorescentes dentro de una región seleccionada de interés (ROl) que delineaba la región entre la lámina propia y las puntas de las vellosidades, pero eliminaba la superficie serosa (alta autofluorescencia) y ellumen entérico, de un total de 5 campos de visión en cinco secciones separadas, para cada animal utilizando el soporte lógico ImagePro (Media Cybemectics, MD).
Como se muestra en la Tabla 21 , el tratamiento con el anticuerpo anti-integrina 02 murino tuvo un efecto de la dosis estadísticamente significativo sobre revertir la pérdida de peso y la consistencia de las heces asociada con la alimentación con DSS. Ambos grupos de tratamiento (2 mgfkg y 5 mg/kg) tuvieron efectos significativos sobre el sangrado rectal y el sangrado de colon, pero ningún efecto significativo sobre el acortamiento de colon asociado con el desarrollo de colitis. El tratamiento también se correspondía con una marcada disminución en el número de leucocitos infiltrantes (datos no mostrados).
Tabla 21
Agua
DSS
Disolución salina
2 mgflo;g anti-02 5 mgflo;g anti-02
Ganancia peso (gm)
3,O2±1,19 -9,16 ± 0,63 -0,44 ±0,81 u , -2,30 ± 0,64"
Longitud colon (cm )
7,43 ± 0,26 5,22 ± 0,17 5,35 ± 0,17 5,32 ± 0,43
Sangrado rectal
O 1,67 ± 0,21 0,83 ± 0,31 0,83 ± 0,31
Sangrado colon
O 1,0± 0,45 O· O·
Agua
DSS
Disolución salina
2 mgfkg anti-a2 5 mgfkg anti-a2
Consistencia heces
O 1,0 ± 0,0 0,50 ± 0,22* 0,17 ± 0,17**
·p<0,05 · ·p<0,01
En otro estudio, se examinaroo el efecto del anticuerpo anti-integrina a4 (clan PS/2; Southem Biotech, AL),
anti-integrina 02 (clon Ha1/29, BD Pharmingen, CA) y anti-integrina 01 (clon Ha8/31; Invitrogen, CA) en comparación
con ratones tratados solamente con DSS (n::8 por grupo). Las dosis del tratamiento con anticuerpo fueron 5 mgfkg
5 Se ha informado de que estos anticuerpos anti-integrina de bloqueo de la función modulan la colitis experimental (Kriegelstein et al., J Clin Inves!. 110(12):1773-82 (2002); Watanabe et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 283(6):G1379-87 (2002)). Como se muestra en la Tabla 22, los tres anticuerpos anti-integrina se asociaron con una reversión en el acortamiento de colon, pero solamente el tratamiento con anti-a2 se asoció con una mejora significativa en la consistencia de las heces (diarrea). El tratamiento tanto con anti-a2 como con anti-a4 dio como
10 resultado una mejora significativa en el sangrado de colon. En este estudio, ninguno de los tratamientos con anticuerpo indujo un efecto significativo sobre la pérdida de peso. Cuando el número de células T residentes, macrófagos y neulrófilos se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta uti lizando anti-CD3, F4/80 y anti-Mac1 (como se ha descrito previamente), los tres grupos tratados con anti-integrina mostraron un descenso significativo en comparación el control con Disolución salina como se muestra en la Tabla 23. Estos datos apoyan la conclusión de
15 que suscitar antagonismo sobre 02 tiene un profundo efecto sobre los niveles en estado estaciona rio de estas células efectoras inmunitarias que se acumulan en el colon inflamado en respuesta a DSS y que estos cambios se corresponden coocurrentemente con una mejora en las mediciones clínicas asociadas con la colitis.
Tabla 22
Signos clínicos
Ganancia de peso (gm)
Longitud coloo (cm)
Sangrado recta l
Sangrado colon
Consistencia heces
·p<0,05 u p<0,01 Agua
7,10 ± 0,70
7,43 ± 0,26
0,0
0,0
0,0
DSS
Disolución salina
-
1 ,67± 0,76
4,73±0,16
2,00 ± 0,21
1,5±0,33
1,0 ± 0,0 Anti-a2
-
1 ,10 ± 1,69
6,08 ± 0,25**
0,50 ± 0,33*
0,25 ± 0,25··
0,38 ± 0,182· Anti-a1
-
0,43 ± 1,17
5,85 ± 0,22**
0,50 ± 0,33*
0,75 ± 0,37
0,63 ± 0,18 Anti-a4
1,62 ± 0,69
5,92 ± 0,09**
0,83 ± 0,31
0,00··
0,67 ± 0,21 Tabla 23
Agua
DSS
Recuentos celulares
Disolución salina A nti-a2 Anti-a1 Anti-a4
Células T (células CD3 positivas)
6,1±1,5 618 ± 160 211±78" 174 ± 48"" 112±36""
Macrófagos (células F4/80 positivas)
21 ± 3 778±94 298 ± 45"" 510 ± 132 328 ± 53""
Neutrófilos +Macrófagos (células CD11b1Mac-1 positivas)
19 ± 5 1937 ± 239 499 ± 144"" 524 ± 141 " 574±192""
·p<0,05 u p<0,01
Ejemplo 7
Se estudiaron los efectos del anticuerpo anti-integrina 02 sobre los signos clínicos y los sintomas en un
5 modelo experimental de encefalomielitis alérgica (EAE) de la esclerosis múltiple. El modelo de EAE de esclerosis múltiple, inducida por inyección del péptido sintético encefalogénico PLP139-151 junto con coadyuvante de Freund en ratones SJL, se considera que es un modelo predictivo de esclerosis múltiple de recaída-remisión (Encinas el al., J Neurosci Res. 45(6): 655-69 (1996».
En un estudio de 4 grupos de ratones (8/grupo; véase la Figura 1), a dos grupos se les admin istraron dosis
10 de 5 mglkg en los días 10, 11 , 12, 14, 15, 18 Y20 , control de isotipo o con el anticuerpo anti-integrina 02 mu rino, Ha1 f29, desde la aparición de sintomas de la enfermedad hasta el Día 20, que es a lo largo del primer brote agudo. Este fue un régimen de dosis agudo. El Dia O se definió como la aparición del cebado con el péptido sintético PLP139-151 más coadyuvante de Freund. El inicio de la enfermedad se definió como el segundo día consecutivo de pérdida de peso. Los otros dos grupos fueron asignados a un régimen de dosis retardada donde recibieron 5 mg/kg
15 de anticuerpo anti-integrina 02 murino o disolución salina tres veces a la semana desde el Día 18 hasta el Día 36, que vino a coincidir con el segundo brote/primera recaída. Los ratones se puntuaron en cuanto a los signos y síntomas clinicos de la siguiente manera·
puntuación de 0,5
=2 días consecutivos de pérdida de peso
puntuación de 1
=cola lacia
puntuación de 2
-ataxia
puntuación de 3
:: parálisis de miembros traseros
puntuación de 4
:: moribundo
puntuación de 5
-muerto
Como se muestra en la Tabla 24, el tratamiento con 5 mg/kg del anticuerpo anti-a2 desde el inicio del
20 primer brote (p. ej., el tratamiento agudo) mitigó el alcance del primer brote y también limitó el grado del segundo brote. Cuando la dosificación se inició después del final del primer brote en el Dia 18 (p. ej., retraso en el tratamiento; véase la Figura 1), los ratones tralados con 5 mglkg de anticuerpo anti-integrina 02 murino también mostraron puntuaciones clínicas más bajas durante la primera recaída hasta el Día 32, momento en el que los dos grupos mostraron puntuaciones de enfermedad similares como se muestra en la Tabla 24. Cuando los ratones recibieron
25 dosis sólo durante la fase de inducción, como se muestra en la Figura 2, el mAb anti-inlegrina 02 tuvo poco o ningún efecto sobre el primer ataque o las fases posteriores del modelo de EAE y los ratones desarrollaron una enfermedad esencialmente equivalente a la de los animales tratados con el control de isotipo. Estos resultados contrastan con los obtenidos previamente usando el anticuerpo anti-a4, PS/2, en el modelo de EAE (Yednock et al., Nature 356(6364): 63-6 (1992); Theien et al., J. Clin. Inves!., 107(8): 995-1006 (2001», que se utiliza para apoyar el tratamiento de la esclerosis múltiple recidivante con el anticuerpo anti-04 natalizumab (Miller et al, N. Engl J. Med 348 (1): 15-23 (2003 ».Estos resultados indican que en contraste con el papel que juega la integrina 04 en los trastomos neuroinflamatorios, donde el antagonismo de este receptor puede retrasar el inicio de las recaídas-brotes asociados oon la esclerosis múltiple, suscitar antagonismo sobre la integrina a2 es una modalidad de tratamiento útil para mitigar y tratar los brotes cuando se producen
Tabla 24
Puntuaciones clínicas
Estudio Media ± ETM (n-6-8)
Estudio 2 Media±ETM (n-17-20)
Día 15
IgG control
1,56 ± 0,42 2,22 ± 0,29
anti-a2
1,00 ± 0,37 0,88 ± 0,21 (p<0,01 )
anti-a4
- 1,64 ± 0,25
Día 20
IgG control
1,13±0,48 1,25 ± 0,28
anti-a2
0,58 ± 0,41 0,61 ± 0,20
anti-a4
- 1,11 ± 0,22
Día 35
IgG control
1,13 ± 0,48 1,49 ± 0,29
anti-a2
0,33 ± 0,33 1,08 ± 0,29
anti-a4
- 1,47 ± 0,27
Día 55
IgG control IgG
1,63 ± 0,63 2,00 ± 0,28
anti-a2
1,00 ± 0,59 0,75 ± 0,31 (p<0,001 )
anti-a4
- 1,33 ± 0,35
Se realizó un análisis histológico en cerebros y médulas espinales obtenidos de los ratones cuando estaban
10 moribundos (fase 4) o al final del estudio. Los ratones fueron sacrificados con halotano cuando estaban moribundos (puntuación clínica 4), o después del período de observación de 55-60 días. Los animales fueron perfundidos con PBS, seguido de una disolución de paraformaldehído al 4%. Los cerebros se dividieron en cinco cortes coronales, la médula espinal en diez a doce cortes transversales y los tejidos fueron incluidos en parafina y las secciones de 4 ~ de grosor se tiñeron con azul Luxol para visualizar la mielinización. Los tejidos se puntuaron de una manera ciega
15 para detenninar el grado de mielinización, infiltración (meningitis) y acumulaciones perivasculares. Para puntuar las secciones de la médula espinal, cada sección de la médula espinal se dividió en cuadrantes: el funículo anterior, el funículo posterior y cada funículo lateral. A cualquier cuadrante que contuviera meningitis, acumulación perivascular
o desmielinización se le dio una puntuación de 1 en esa clase patológica. Se detenninó el número total de
cuadrantes positivos para cada clase patológica, a continuación, se dividió por el número total de cuadrantes 20 presentes en el portaobjetos y se multiplicó por 100 para dar el porcentaje de participación para cada clase
patológica. También se determinó una puntuación patológica general dando una puntuación positiva si se encontraba presente en el cuad rante cualquier lesión
Se observaron lesiones desmielinizantes inflamatorias notables en la médula espinal, con más frecuencia en el fascicullus gracilis del funículo posterior y la zona de salida de la raíz ventral en el funículo anterolateral. Sólo se observó leve acumulación perivascular. La meningitis y la desmielinización mostraron una fuerte correlación con los signos clínicos (r = 0,84 Y 0,79, respectivamente) y mostraron puntuaciones significativamente más bajas en el grupo tratado con anti-a2 (P <0,01 entre los grupos tratados con anti-02 e IgG de control para ambos parámetros) Estos datos indican que el tratamiento con anticuerpo anti-integrina 02 inhibe la meningitis y la desmielinización asociadas con un brote y/o facilita la remielinización y la reparación. El resultado global es un resultado clínico mejorado
Se realizó otro estudio (n = 17 a 20 por grupo) para comparar el anticuerpo anti-integrina-a2 con el antiintegrina a4, PS/2 (obtenido de Southem Biotech), tratamiento durante el primer brote agudo hasta la aparición de remisión (Días 10 a 20). Se trataron dos grupos adicionales con IgG de control o anti-integrina 02 desde el inicio de la remisión (Día 18) hasta la primera recaída (Día 36) y en el inicio de la fase crónica de la enfermedad. Una vez más el tratamiento anti-integrina 02 tuvo un marcado efecto sobre la incidencia de secuelas neurológicas (parálisis) y una reducción estadisticamente significativa en la puntuación clínica media máxima durante el primer brote de EAE, así como en la fase de recaída posterior (fase crónica de la EAE; Tabla 24). Hubo un ligero efecto de mejora del tratamiento anti-a2 retardado en las puntuaciones clínicas durante la fase crónica de la enfermedad. La incidencia de la enfermedad durante el primer ataque (anti-a2, el 61%; IgG de control 85%) y durante la fase crónica (anti-a2, 77%; IgG de control 100%) fue menor en el grupo de ratones tratados con anti-a2 en comparación con el control. En el caso del grupo tratado con anti-a4, la incidencia de la enfermedad durante el primer ataque (tratamiento anti-a4, 94%; control 82%) y la recaída (tratamiento anti-a4, 89%; control, 92%) fue similar entre el grupo tratado con anticuerpo anti-a4 frente al control. Sin embargo, el grado de recaídas posteriores se redujo notablemente. Estos datos con respecto a un anticuerpo anti-a4 son comparables con los informes anteriores sobre el efecto del tratamiento con anticuerpo anti-a4 en el resultado clínico en EAE (Theien et al, J. Clin Invest 107 (8): 995-1006 (2001 ».
Ejemplo 8
Se estudiaron los efectos de la unión a la integrina a2¡31 de plaquetas (a2¡31 se expresa en la superticie de las plaquetas), incluyendo los efectos sobre la función plaquetaria. Se realizaron diferentes conjuntos de ensayos para estudiar estos efectos.
Los primeros estudios evaluaron si la unión de TMC-2206 conducía a la activación de plaquetas medida por la regulación al alza de P-selectina o la activación de la integrina allb¡33 de plaquetas que se midieron utilizando un anticuerpo-específico de la de allb¡33 tal como PAC-l. Se recogió sangre venosa humana utilizando una aguja de calibre 21 de la vena cubital de donantes sanos que se habían abstenido de medicamentos durante al menos 10 días en 1110 de volumen de tampón de citrato-dexlrosa acidulado (ACD: citrato de sodio 85 mM, dextrosa 111 mM y ácido cítrico 71 mM, sin ajuste de pH) que contenía SOO ng/ml de prostaglandina 12 (PGlz, Sigma-Ald rich) en caso de ser utilizado para la elaboración de plaquetas lavadas. La sangre completa se centrifugó a 160 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente y el plasma rico en plaquetas (PRP) se retiró sin alterar la capa leucocitaria. Las plaquetas lavadas se prepararon diluyendo el PRP 2,5 veces con tampón sa lino de glucosa con citrato añadido (CGS; citrato lrisódico 13 mM, cloruro de sodio 120 mM y dextrosa 30 mM, pH 7,0) Y PGlz (500 ng/ml) y centrifugando a 160xg durante 20 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier leucocito contaminante. El sobrenadante se recogió y se centrifugó a 1100 """g durante 10 minutos y el sedimento de plaquetas resultante se resuspendió suavemente en tampón CGS, se lavó y se resuspendió en tampón normal de Tyrodes-Hepes (NaHC03 12 mM, NaCI138 mM, glucosa 5,5 mM, KC12,9 mM, HEPES 10 mM, CaCIz 1 mM, MgCI2 1 mM, pH 7,4). Se permitió que las plaquetas se recuperaran durante un máximo de 30 minutos a 37"C. Las plaquetas lavadas se contaron a continuación antes de la adición de CaC2 y MgCI2 a 1 mM Las plaquetas lavadas de rata se prepararon de una manera similar, aunque se extrajo sangre de la vena cava para minimizar la activación de plaquetas durante la extracción de sangre
Se incubaron 50 ~L de PRP recién preparado de PRP con 5 IJg/mL de TMC-2206 o anticuerpo de control IgG de ratÓn durante 30 minutos, se lavaron y después se incubaron con anti-ratón de cabra marcado con Alexa-594 en presencia o ausencia de anticuerpo contra selectina P marcado con Alexa 488 (SO Pharmingen, núm. de catálogo. 555523), anticuerpo PAC-l marcado con Alexa-488 (BD Pharmingen, núm. de catálogo. 340507) o ISO ng de fibrinógeno marcado con Alexa-488 (Molecular Probes) durante 40 minutos a temperatura ambiente. P-selectina y PAC-l son marcadores de la activación de las plaquetas, y las plaquetas activadas son capaces de unirse al fibrinógeno. Al final del periodo de incubación, las plaquetas se fijaron con l /ID de volumen de paraformaldehido al 4% y se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACScalibur™ Los resultados de estos experimentos demostraron inesperadamente que aunque las plaquetas se unian claramente a TMC-2206, como se indica por un desplazamiento log en un aumento de la intensidad de fluorescencia observado en las plaquetas tratadas con TMC2206 pero no en las tratadas con IgG de control; no hubo un aumento concomitante en la tinción con P-selectina o PAC1 , lo que indica que la unión a TMC-2206 no activó las plaquetas.
Los siguientes estudios evaluaron si la unión de TMC-2206 conduce a la activación de las plaquetas, medida por los efectos sobre la agregación plaquetaria inducida por colágeno. El colágeno soluble es un potente agonista de la agregación plaquetaria y se utiliza como una medida rutinaria de la capacidad de respuesta de las plaquetas (véase, p. ej., Hemostasis and Thrombosis; (2001 ), ed. Colman et aL). Los estudios con ratones con el gen 02 desactivado han sugerido que las plaquetas de estos ratones muestran una respuesta alterada leve al colágeno (Holtkotter et aL, J. BioL Chem. 277(13): 10789-94 (2002) E. pub ene, 11,2002; Chen et al., Am. J. Pathol 161(1): 337-344 (2002)). Para someter a ensayo si TMC-2206 tendría algún efecto adverso sobre las respuestas de las plaquetas al colágeno, se realizaron análisis de agregación de plaquetas humanas y de rata por agregometría de transmisión de luz clásica usando un agregómetro Bio-data PAR4. Se preparó PRP como se ha descrito anteriormente y el recuento de plaquetas se ajustó a 3 >< 108f mL Se agitaron 450 f.l1 de PRP o de plaquetas lavadas con un lecho magnético durante 1 minuto a 37"C en presencia de 5 ¡JgfmL de TMC-2206 antes de añadir colágellO de piel temera de Tipo I (Biodata Corp) para iniciar la agregación. El volumen final hasta 500 ¡JL se alcanzó con lampón Tyrodes para la agregación de las plaquetas lavadas y con plasma pobre en plaquetas (PPP) para los análisis de plasma rico en plaquetas (PRP). Se utilizaron 500 ¡JL de tampón Tyrodes o PPP como blanco para los análisis. El PPP se preparó sedimentando plaquetas en PRP mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos en una microcentrifuga. La velocidad y el grado de la agregación plaquetaria después de la adición de colágeno soluble fueron comparables en presencia o ausencia de TMC-2206. Los resultados de estos experimentos demostraron que la unión de TMC-2206 a las plaquetas no tenía inesperadamente ningún efecto sobre la agregación plaquetaria inducida por colágeno cuando se sometió a ensayo in vitro a las concentraciones sometidas a ensayo
Los siguientes estudios evaluaron si la unión de TMC-2206 conducía a trombocitopenia, una consecuencia potencial de anticuerpos que se unen a las plaquetas in vivo. (Hansen y Balthasar, J Pharmacol Exp Ther. 298(1): 165-71 (2001 )). Para someter a ensayo si se produciría trombocitopenia tras la administración de TMC-2206n, se administró a las ratas una dosis de 10 mglkg de TMC-2206 o IgG de control murina mediante inyección IP. Antes de la inyección, se utilizó una muestra de sangre de la cola para medir los recuentos de células de sangre de referencia Las muestras de sangre fueron tomadas en puntos especificos de tiempo después de la administración del fármaco IP (p. ej., 10, 30, 60 minutos y 4, 24 Y 72 horas) de ratas no anestesiadas mediante recogida de muestras retroortJital utilizando una Unopipet capila r. Aproximadamente 40 f.lL de sangre se transfirieron a un tubo que contenía 5 ¡JL de ACD y de inmediato se tomaron muestras en un contador de células sanguíneas Hemavet (Orew Scientific) Los resultados de este estudio no mostraron inesperadamente ningún cambio significativo a partir de los recuentos de plaquetas de referencia a las dosis de 5 mg/kg o 10 mg/kg de TMC-2206. En contraste, la inyección de 0,1 mg/kg de un anticuerpo a otro receptor de plaquetas (ollb, anticuerpo anti-C041 (BO Pharmingen, CA» indujo trombocitopenia, con un recuento de plaquetas que disminuyó casi un 80% a los 15 minutos de la administración del anticuerpo
Ejemplo 9
Se estudiaron los efectos de los anticuerpos anti-integrina 02 sobre la adherencia de las plaquetas al colágeno incluyendo la adherencia a varios subtipos de colágeno. La integrina 02131 es la única integrina de unión a colágeno, aunque no el único receptor de colágeno, que es expresada por las plaquetas. Sin embargo, como se comentó anteriormente, existen otros mecanismos, especialmente después de la activaciórl de plaquetas, para facilitar la adherencia firme a una matriz de colágeno. En este ejemplo, se evaluó la capacidad del anticuerpo TMC2206 para bloquear la adherencia de las plaquetas a los colágeno de Tipo 1, 11, 111, IV Y VI, tanto plaquetas en reposo como para plaquetas activadas coo el agonista moderado de plaquetas, ADP.
Se recubrieron plaquetas Immulon 11 con colágeno de los tipos " 11, 111, VI (Rockland Immunochemical) y IV (Sigma, SI. Louis, MO) que se habían solubilizado sin formaciórl de espuma en ácido acético 5 mM, a una concentración final de 1 mgfmL Los pocillos se lavaron dos veces usando tampón HEPES -Tyrode modificado sin Ca" o BSA, pero con 2 mMfMgH y se bloquearon con 100 f.lUpocillo de tampón HEPES -Tyrode que contenía 2 mMfMgH y BSA al 0,35%, pero sin Ca"
Se utilizó sangre venosa humana para la preparación de las plaquetas, incluyendo PRP, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 8. Se elaboró plasma pobre en plaquetas (PPP) por centrifugación del PRP a 1100 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de plaquetas resultante se resuspendió suavemente para el marcaje en 1,0 mL de CGS (citrato trisódico 13 mM, cloruro de sodio 120 mM y dextrosa 30 mM pH 7,0), se transfirió a un tubo de fondo redondo de 5 mi y se le anadieron 3 ¡JL de solución de partida de CFSE (concentración final 53,7 ¡JM) con balanceo suave durante exactamente 20 minutos. Las plaquetas marcadas se diluyeron en tampón CGS y se lavaron. El sedimento de plaquetas se resuspendió en 1 mi de tampón CMFTH (HEPES 5 mM, pH 7,3, bicartJonato de sodio 12 mM, NaCI137 mM, KCI 3 mM, NaH2P04 0,3 mM, dextrosa 5 mM y BSA al 0,35%) y se mantuvo en la oscuridad tanto como fue posible. Las plaquetas lavadas de rata se prepararon de una manera similar, aunque se extrajo sangre de la vena cava en una jeringa que cootenia 500 ngfmL de PGE1 en ACO para minimizar la activación de plaquetas durante la extracción de sangre.
Se diluyeron plaquetas marcadas coo CFSE a 20 x 10sfIJL utilizando tampón HEPES -Tyrode que contenia BSA al 0,35%. Las plaquetas marcadas (1,0 x 107 pocillo) se aplicaron a los pocillos que contenían ADP 20 mM en lampón HEPES -Tyrode con BSA al 0,35% y concentraciones variables de inhibidor de ensayo. Las placas de microtitulaciórl que cootenian mezclas de plaquetas se centrifugaron a 550 xg durante 10 minutos a temperatura
ambiente seguido por incubación en la oscuridad durante 10 minutos adicionales. Los pocillos se lavaron con tampón HEPES -de Tyrode. La fluorescencia se leyó usando un lector de placa de fluorescencia Victor2. Para determinar la relación de la intensidad de fluorescencia frente al número de plaquetas, las plaquetas marcadas se diluyeron a diferentes niveles en tampón de HEPES -Tyrode que contenía BSA al 0,35% (sin Ca++ o AOP), se aplicaron a pocillos recubiertos con colágeno de Tipo I o Tipo IV, se centrifugaron, y se tomaron medidas de la fluorescencia CFSE. Como se muestra en la Tabla 25, TMC-2206 bloqueó la unión a colágeno en estas condiciones estáticas, con una CESO de 1,7 nM. Se realizaron estudios similares con plaquetas de rata utilizando TMC-2206. Los valores de CE50 para inhibir la unión de las plaquetas de rata a colágeno de rata de Tipo I fueron de 6,3 nM, lo que indicaba un cambio de aproximadamente 5 veces en la afinidad para la rata en comparación con 02131 humana sobre las plaquetas
Tabla 25
Tipo de colágeno
Fuente de colágeno humano Estim. AOP (..,M) CE:;o (nM)
npo l
placenta O 1,7
20
9 ,5
npou
cartílago de rod illa O 1,9
20
27
npoUI
placenta O 1,6
20
11
Tipo IV
placenta O 10
20
> 1000
Tipo VI
placenta O 2,3
20
23
Como se muestra en la Tabla 25, TMC-2206 fue un potente inhibidor de la adherencia de las plaquetas a los colágenos fibrilares, pero fue menos potente para el colágeno de Tipo IV no fibrilar (10 nM en comparación con 1-2 nM). Inesperadamente, en presencia de AOP, hubo una disminución de aproximadamente 10 a 20 veces en la potencia para inhibir la unión a los colágenos fibrilares y el anticuerpo ya no fue eficaz en la prevención de la adherencia al colágeno de Tipo IV. Estas observaciones inesperadas sugieren que el TMC-2206 y los anticuerpos con la especificidad de unión al epítopo de TMC-2206 son menos activos en la inhibición de las interacciones de las plaquetas activadas al colágeno fibrilar, y tendrían poco o ningún efecto [en el intervalo de dosificación terapéutico] sobre la unión al colágeno de Tipo IV, el subtipo predominante de colágeno de la pared vascular endotelial.
Ejemplo 10
Se estudiaron los efectos de los anticuerpos anti-integrina 02 sobre el tiempo de sangrado. Existe la expectativa por parte de los expertos en la técnica de que la administración de un anticuerpo contra una integrina plaquetaria podría causar trastomos de la coagulación y conducir a un mayor tiempo para coagular en un sujeto que reciba semejante anticuerpo después de una lesión aguda. Para evaluar si los anticuerpos dirigidos contra la integrina 02 aumentarían la propensión a la hemorragia in vivo, se determinó el efecto de TMC-2206 sobre el tiempo de sangrado en rata .
Se administró a las ratas una inyección IP o IV de TMC-2206 15 minutos antes del ensayo para determinar el tiempo de sangrado. Las ratas no anestesiadas fueron inmovilizadas en un dispositivo de contención y se les cortaron 0,8 cm de la punta de la cola rápidamente para iniciar el sangrado. La cola se insertó rápidamente en un vaso de precipitados que contiene 30 mL de PBS se mantuvo a 3rC. El tiempo requerido para que la cola dejara de sangrar se registró como el tiempo de sangrado. Como se muestra en la Tabla 26, los datos demostraron que la administración de dosis de TMC-2206 de hasta 10 mgfkg no tuvo ningún efecto significativo sobre el tiempo de sangrado
45 Tabla 26
Dosis de TMC-2206 mg/kg
Tiem po de sangrado (n) minutos
0,0
3 ,86 ± 0,32 (5)
5,0
4 ,51 ± 0,32 (4)
10,0
4 ,62 ± 0,67 (7)
Ejemplo 11
Se estudiaron los efectos de los anticuerpos anti-integrina 02 en un modelo de trombosis arterial. Otra manifestación potencial de trastornos del sangrado de la administración de anticuerpos reactivos con la 02131 sobre las plaquetas podria ser un mayor tiempo para que se produzca la oclusión trombótica después de una lesión arterial aguda debido a efectos no deseados de la función plaquetaria. Por lo tanto, los anticuerpos anti-integrina 02 tales como TMC-2206, se sometieron a ensayo en un modelo de trombosis arterial en rata inducida por cloruro férrico Este es un modelo convencional que ha sido utilizado para el desarrollo de agentes anti-trombóticos y la actividad se manifiesta como un retraso en el tiempo de oclusión después de la exposición del revestimiento endotelial del vaso sanguíneo a una disolución de FeCh (Kurz et al., Thromb Res. 60(4): 269-80 (1990); Hoekstra et al., J Med Chem 42(25), 5254-65 (1999».
Se administró anticuerpo TMC-2206 se administró a las ratas a través de inyección en la vena de la cola aproximadamente 30 minutos antes de la inducción de lesión arterial a dosis que oscilaban de 1 mg/kg a 15 mg/kg. Para inyecciones IV, la mayoria de los anticuerpos se concentraron a 4-5 mgfmL para reducir los volúmenes de inyección necesarios para las dosis más altas. Los grupos de tratamiento fueron 1,0, 2,5, 5,0, 10,0 Y15 mgfkg de TMC-2206, 5,0 mg/kg IgGI(K) murina de control (clan MOPC21) 5,0 mgfkg de anti-vWF policlonal de conejo (DAKO)
o solución salina; había 3-4 animales en cada grupo de tratamiento
Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley (Hartan) que pesaban 220-270 gramos con 60 mgfkg de pentobarbital de sodio. Una vez que alcanzaron un plano suficiente de anestesia, se expuso la arteria carótida y se colocó sobre un trozo de papel de filtro (4 mm x 5 mm), que se plegó a lo largo de 4 mm para acunar la arteria carótida y proporcionar una superficie para que el cloruro férrico (35%) bañara la carótida. Se aplicaron doce IJL de FeCJ3 al 35% durante 5 minutos, a continuación, el papel de filtro se retiró y la sonda de flujo de un sistema de flujo Transonic Systems Inc. (Ithaca, NY) se colocó alrededor de la arteria carótida. El flujo se midió durante un máximo de 45 minutos.
Se registraron los valores medios y el ETM para las velocidades de flujo de varios animales por grupo en los puntos de tiempo específicos después de la administración de cloruro férrico. No hubo diferencias significativas en el tiempo hasta la oclusión obsel\lado con cualquiera de las dosis de TMC-2206 sometidas a ensayo, incluso tan altas como 15 mglkg, en comparación con el control de disolución salina lo que indicó que no parecía haber ningún efecto adverso sobre la trombosis debido a administración de TMC-2206. Aunque los valores de flujo de partida pueden variar sustancialmente entre los animales, el tiempo hasta la oclusión se produjo constantemente entre 10 y 16 minutos después de la administraciÓfl de cloruro férrico en los grupos tratados con TMC-2206, que fue muy similar al de los grupos tratados con disolución salina e IgG de control, que tuvieron tiempos medios hasta la oclusión de 12 y 14 minutos, respectivamente. El único tratamiento sometido a ensayo que estuvo asociado con la prevención de la oclusiÓfl fue el control positivo, un anticuerpo policlonal anti-vWF, que no dio como resultado ninguna reducción en los parámetros de flujo por períodos tan largos como 45 minutos después de la adición de FeCJ3
Ejemplo 12
Se estudiaron las propiedades de unión de los anticuerpos anti-integrina 02, incluyendo estudios de mapeo de epítopos, para caracterizar la naturaleza del sitio de unión a TMC-2206 sobre la subunidad de integrina 02. Se puede esperar que un anticuerpo anti-integrina 02 que se une directamente al sitio de unión a la diana y sil\le como competidor directo para la unión del ligando produzca la activación de plaquetas tras la unión de la integrina 02131 Alternativamente, un anticuerpo anti-integrina 02 que se une a la integrina 02131 en un estado inactivo y no hace que la integrina sea activada podria tener un perfil no activador de plaquetas similar al que se encontró inesperadamente para TMC-2206. Los anticuerpos con el mismo o similar epítopo de unión que TMC-2206 inhibirían la adherencia celular de los leucocitos a colágeno, y por lo tanto tendrian una utilidad terapéutica significativa, pero no estarian asociados con las complicaciones hemorrágicas que podría tener un anticuerpo que se une a, y activa, la integrina 02131 .
Se realizaron estudios para investigar si el epítopo reconocido por TMC-2206 estaba dentro del dominio I de
unión a ligando de la subunidad de integrina a2, o si era dependiente simplemente de la presencia de un dominio I
intacto (Hangan et al., Cancer Res. 56: 3142-3149 (1996» . Para estos estudios, se elaboró una proteína de fusión
de GST-dominio I de a2 utilizando una versión modificada del protocolo descrito por Tuckwell et al. , J. Cell Sci.108 (Pt 4): 1629-1637 (1995). El dominio I de a2 humana se clonó a partir de ARNm aislado de aproximadamente 106
5
célu las CHO que expresaban la integrina a2 humana (Syminglon et al., J Cell Biol 120 (2): 523-35 (1993). Las
célu las se lisaron en reactivo Trizol (Gibco) y se añadió cloroformo para extraer la fase acuosa antes de la adición de
0,2 volúmenes de isopropanol para precipitar el ARN que se recogió por centrifugación y se resuspend ió en agua
libre de ARNasa
Los cebadores que nanqueaban el dominio I de a2 humana fueron sintetizados por Sigma-Genosys. Los
10
cebadores fueron diseñados con sitios BamHI y EcoRI en los extremos 5' y 3' , respectivamente, para la clonación en
el vector pGEX-2TK (GE Biosciences). Se utilizaron los cebadores halphal F
(5'GGGGATCCAGTCCTGATTTTCAGCTCTCAG; SEO ID NO: 117) 'f halphal R (5'
GGGAATICAACAGTACCTICAATGCTG; SEO ID NO: 118) (véase la Tabla 27) para una reacción de RT-PCR de
un solo paso utilizando un kit de Oiagen convencional para amplificar los aminoácidos 123 a 346 de la subunidad de
15
la integrina a2 madura y para incorporar un sitio BamHI en el extremo amino (que añade GS aguas arriba del
residuo 124 del dominio 1) y un hexapéptido EFtVTD adicional como parte del sitio de clonación EcoRI a través del
codón de parada. Se detectó una sola banda por electroforesis en gel de agarosa. La reacción de PCR se limpió
usando un Kit Qiagen PCR Ou ick, el producto se digirió con enzimas de restricciórJ y se clonó en el vector pGEX
2TK (Amersham, GE) utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Las bacterias transfonnadas se
20
escrutaron para determinar los insertos y varios clones se secuenciaron utilizando un sistema CEO de 8eckman
Coulter. La secuencia de aminoácidos deducida como clonada era idéntica a la secuencia disponible de un dominio I
de a2 humana (SEO ID NO: 11 , que se muestra en la Tabla 28). Un solo clon que contenia el inserto de ADN
correcto se amplificó en células DH5a (Invitrogen) y se volvió a transformar en bacterias electro--competentes BL21
(Invitrogen)
~
~~V
Nombre del cebador
Secuencias de nucleótidos (5'-3')
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halphal R
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malphal R
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ralphal R
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Secuencias de nucleótidos (5'-3')
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Nombre del cebador
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ha lphal R69D F
CAGTATGCCAATAATCCAGACGTTGTGTTTAACTTGAAC
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I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I I
I
I
I I
La protelna de fusión de GST con el dominio 021 humano se expresó en bactenas BL21 con crecimiento logarítmico utilizando IPTG como un agente inductor. Aproximadamente 4 horas después de la inducción, las bacterias se recogieron y se sedimentaron a 3000 RPM en tubos cónicos de 50 mL El sedimento se resuspendió en PBS que contenía Trilon X-100 al 1% e inhibidores de proteasa_ El producto homogeneizado se sometió a
5 sonicación durante 1 minuto y se centrifugó a 3000 RPM para aclarar el producto lisado de los desechos celulares. La proteína de fusión GST se purificó a partir de productos lisados bacterianos utilizando penas de glutatión. Sefarosa (GE-Amersham) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se hicieron eluir en TBS (pH 8,0) que contenía glutatión libre 20 mM_El dominio I de GST --02 purificado se unió al colágeno con misma especificidad que se ha informado anteriormente (Tuckwell et al., J Cell Sci. 108 (PI 4): 1629-1637 (1995)), es decir, una mayor
10 afinidad por el colágeno de Tipo I en comparación con el de Tipo IV_Este se unía a TMC-2206 inmovilizado con una Ks aparente por medio de ELlSA de 0,31 nM, que era comparable a la afinidad observada en la unión de TMC-2206 a integrina 02131 intacta de 0,37 nM derivada de los estudios de unión directa descritos en el Ejemplo 2. La proteína de fusión de GST -dominio I de 02 soluble se evaluó a continuación para determinar su capacidad para competir con TMC-2206 marcado con Eu por la unión a placas recubiertas de 02131 como se describe en el Ejemplo 2_Se encontró
15 que el valor de K; para el dominio GST -dominio I de 02 soluble era similar (0,18 nM en comparación con 0,28 nM) a la obtenida para TMC-2206 no marcado, lo que indica que el sitio de unión para TMC-2206 estaba dentro del dominio I de 02 y no requería la presencia de la subunidad 131.
Se realizarOfl estudios para investigar la dependencia de cationes de la unión por TMC-2206_ La dependencia de cationes indica que un radical de unión se está dirigiendo al sitio de unión al catión diva lente 20 (MIDAS) de una integrina, y actuando de ese modo como un mimético de ligando_La unión de colágeno a 02 es dependiente de Mg" en condiciones fisiológicas normales, mientras que no se produce ninguna unión cuando Mg" se sustituye por Ca++ (Staatz et al., Cell Biol108 (5): 1917-1924 (1989); Emsley et al., CeIl101(1): 47-56 (2000)). Para estos estudios, la proteína de fusión de GST-dominio I de 02 se inmovilizó sobre placas de microtitulación recubienas con glutationa Reacti-Bind (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL) y se determinó la capacidad de TMC25 2206 marcado con Eu para unirse en diferentes condiciones de cationes (libre de Ca y Mg, Ca" o Mg" a concentraciones que varían de 0,1 ¡JM a 3 mM)_ Las placas se recubrieron incubando 100 IJUpocillo de proteína de fusión de GST--021 (2,0 IJg/mL en Tampón de Lavado libre de cationes diva lentes: HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCI 1S0 mM y Tween-20 al 0,5%) durante 1 hora a la temperatura ambiente y los pocillos se lavaron cuatro veces en Tampón de Lavado libre de cationes divalentes Los pocillos se bloquearon usando 100 ¡JUpocillo de Tampón de Bloqueo
Nombre del cebador
Secuencias de nucleótidos (5'-3')
halphal R69D R
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halphal N73D F
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malphal H93Y F
CACATCTGAGACGCGCCAATATGGTGGGGACCTCACAAAc l
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malphal H93Y R
GTTTGTGAGGTCCCCACCATATTGGCGCGTCTCAGATGTG I
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(Tampón de Lavado que contenía 3,0 mg/mL de BSA libre de IgG [Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA]) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó cuatro veces en Tampón de Lavado libre de catión divalente, y se empapó en Tampón de Lavado libre de catión divalente (300 IJUpocillo) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se equilibraroo adicionalmente en Tampón de Lavado (300 IJUpocillo) que contenía el nivel deseado de cationes diva lentes durante 30 minutos y después se incubaron durante 1 hora a 37"C en presencia de o TMC-2206 marcado con Eu 41 pM, 199 pM, 345 pM o 1 nM, o anticuerpo de control. El anticuerpo TMC-2206 murino se unió de una manera dependiente de la concentración, con una potencia similar en todas las condiciones, lo que indica que su unión al dominio I de 02 era independiente de cationes, y por lo tanto no implicaba al sitio MIDAS. El IgG de control marcado con Eu no se unió a los pocillos recubiertos con integrina 02131 confirmando que la unión era especifica
Se llevaron a cabo estudios adicionales para investigar el sitio de unión de TMC-2206. Los ligandos de integrina tienen tipicamente un ácido clave que fonna el enlace quelante final para el ion de metal divalente (Haas y Plow, Curro Opino Cell Bio. 1994; Lee et al., Structure1955) una característica compartida por muchos antagonistas de integrina, incluyendo el mAb anti-integrina 01 , AOC2 ( Karpusas el al., J. Mol. Biol. 2003 ) en el que el ácido es proporcionado por el residuo 0101 dentro de CDR-H3. Por analogía, el 0100 de TMC-2206 COR-H3 podría proporcionar una interacción de este tipo con el MIDAS de 02. Por lo tanto, se generaron dos anticuerpos que contenían VH murina variante, uno que llevaba una mutación D100A y uno una mutación D100R. Su capacidad para competir por la unión a Eu-TMC-2206 se evaluó a continuación en el ensayo de Kr en comparación con el anticuerpo quimérico ratón-humano TMC-2206. El mutante D100A era completamente inactivo a concentraciones de hasta 0,9 IJM que representaba un cambio mayor de 1600 veces en la potencia con respecto a la del anticuerpo quimérico ratón-humano TMC-2206. En cootraste, el mutante de carga inversa 0100R fue casi tan potente como el anticuerpo quimérico TMC-2206 ratón-humano como se pone de manifiesto por los valores de Kj similares (0,41 nM en comparación con 0,52 nM). Esto proporciona una evidencia en contra de cualquier papel para el residuo 0100 de TMC-2206 en el acoplamiento en el complejo de quelante metálico que forma el sitio del ligando MIDAS
Se llevaron a cabo estudios adicionales para investigar la especificidad de unión de TMC-2206, incluyendo los estudios de mapeo de epítopos, con este anticuerpo monoclonal murino que se dirige contra el dominio I de la integrina 02131 humana. TMC-2206 presenta reacción cruzada con la integrina 02131 de rata, pero no presenta reacción cruzada con la integrina 02131 de ratón. Puesto que las proteínas integrina 02131 comparten una alta homología entre especies, los residuos de 02131 que son importantes para la unión a los anticuerpos fueron identificados por medio de métodos que identificarían las diferencias que existen entre las especies que presentan reacción cruzada con el anticuerpo en comparación con aquellas que no lo hacen (p, ej., Champe et al., J. Biol Chem. 270(3): 1388-1394 (1995); Karpusas et aL, J. Mol. Biol. 327 (5): 1031 -1041 (2003); Bonnefoy et al., Blood 101(4): 1375-83). Se ha analizado la estructura cristalina I del dominio de la integrina 02 solo y cuando forma complejo con su ligando diana, el colágeno ( Emsley et al., J. Biol. Chem. 272(45): 28512-7 (1997); Emsley et aL, Cell 101(1): 47-56 (2000)). En la Tabla 28 se muestra una comparación de la secuencia de los dominios de 02 I humana (SEO ID NO: 11), 02 I de rata (SEO ID NO: 93), y 02 I de ratón (SEO ID NO: 94), obtenidos a partir de presentaciooes de Genbank. Este análisis revela que el dominio I de ratón que contiene 14 residuos que difieren de los dominios 02 1 tanto humano como de rata (mostrados en negrita y subrayados en la Tabla 28) Estos residuos se utilizaron para estudiar más a fondo el ep itopo de unión de TMC-2206
021 humano
1 SPDFQLSASF SPATQPCPSL IDWWCDES NSIYPWDAVK NFLEKFVQGL DIGPTKTOVG
021 de rata
1 SPDFQSL TSF SPAV---QOWW COES NSIYPWEAVK NFLEKFVQGL DIGPKKTOVA
021 de ratón
1 SPDFQ-EL TSF SPAVQACPSL YPWWCDES NSIYPWEAVK NFLy:KFVIGL OIGPKKTOVA
021 humano
61 LIQYANNPRV VFNLNTYKTK EEMIVATSQT SQYGGDLTNT FGAIQYARKY AYSAASGGRR
021 de rata
61 LIQYANDPRV VFNLTTYKNK EDMVQATSET ROYGGDLTNT FKAIQFARDI AYLPESGGRP
021 de ratón
61 LIQYAN~PR! !FNLNDFETK EDMVQATSET RQ.!:!GGDLTNT FRAI~FARDYAYSQTSQTSSGRP
021 humano
121 SAT KVMVWT DGESHOGSML KAVIOOCNHD NILRFGIAVL GYLNRNALOT KNLlKEIKAI
021 de rata
121 GATKVMVWT OGESHOGSKL OTVIOOCNOO EILRFGIAVL GYLNRNALOT KNLlKEIKAI
021 de ratón
121 GATKVMWVT OGESHOGSKL KTVIOOCNOO EILRFGIAVL GYLNRNALOT KNLlKEIKAI
021 humano
181 ASIPTERYFF NVSOEAALLE KAGTLGEOIF SIEGTVQGGO NFOMEM
021 de rata
181 AST PTERYFF NVAOEAALLE KAGTLGEHIF SIEGTVOGGO NFOMEMAO
021 de ratón
181 AST PTERYFF NVSOEAALLE KAGTLGEOIF SIEGTVOGGO NFOMEMSO
Se clonaron tanto el dominio 1 de GST -02 de ratón como el de rata en forma de proteínas de fusión con GST para confirmar que se conservaba la reactividad cruzada apropiada por los respectivos dominios 1 mediante la metodología de PCR tal como se describe en el Ejemplo 3. El dominio 1 de 02 mu rina se clonó a partir de ARNm aislado de riñón de ratón BalbfC por medio de RT-PCR utilizando los cebadores malphal F (SEO ID NO: 121) y malphal R (SEO ID NO: 122) y el dominio 1 de 02 de rata a partir de un riñón de rata Sprague Oawley por medio de RT-PCR utilizando los cebadOfes ralphal F (SEO ID NO: 123) y ralphal R (SEO ID NO: 124). Además se clonaron dos dominios 1 de 02 de primates a partir de sedimentos de glóbulos blancos de la sangre obtenidos por centrifugación a baja velocidad de la sangre fresca extraída de monos rhesus y cynomol~us individuales. Los glóbulos blancos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Un lotal de 5 x 10 (rhesus) y 2 x 106 (cynomolgus) células se lisaron en 1 mi de Trizol (Invitrogen, núm. de Cat 15596-026) y el ARN total se preparó como se ha descrito anteriormente. El sedimento de ARN final se resuspendió en 50 ¡JI de HzO tratada con OEPC Este sirvió como molde para la primera etapa de la transcriptasa inversa (RT). La reacción RT consistió en 8 ¡JI de ARN celular (2,24I-1g para ARNm de Rhesus, 1,441-19 para ARNm de cynomolgus), 11-11 (10 mM) de dNTPs y 1 ¡JI (2 I-IM) del cebador directo para el dominio I humano (GGGGATCCAGTCCTGATTI; SEO ID NO: 119). Esta mezcla se incubó a 65Q C durante 5 min, se enfrió en hielo. A continuación se utilizaron Cinco ¡JI de esle AoNc como molde para la reacción de amplificación por PCR, utilizando los cebadores directo e inverso humallOs (Directo· GGGGATCCAGTCCTGATTI, SEC ID NO: 119; Inverso: GGAATICAACAGTACCTI, SEC ID NO: 120). Los tiempos del ciclo fueron 1 ciclo a 94Q C durante 30 seg, 94Q C durante 30 seg ., 55Q C durante 30 se9., 40 ciclos a 68" C durante 1 mino y 1 ciclo a 68"C durante 5 mino Los productos de la PCR se separaron por eleclroforesis en gel de agarosa al 1% y la banda (del tamaño esperado) se purificó directamente a partir del gel de agarosa, se digirió con BamHI y EcoRI y se clonó en los mismos sitios en el vector pGEX-2TK y se transformó en bacterias BL21
Se aislaron colonias individuales y los insertos se secuenciaron utilizando un analizador de AON Beckman CEO 8000 para verificar la identidad del dominio I de 02 murino y de rata y determinar la homología de secuencia de las dos especies de mallOs con la humana. La secuencia murina clonada mostró una identidad exacta con la región del dominio I de la secuencia depositada, NM _008396.1 Del mismo modo, la secuencia de rata clonada era idéntica a la entrada de Genbank para integrina de rata, XM_34156.1, con la excepción de que la secuencia clonada contenía 6 residuos adicionales con respecto a la secuencia depositada, lo que permitió que la región entre los residuos 16 y 21 (residuos 139 a 144 de la integrina 02 intacta) del dominio rata fuera traducida con precisión. Esta secuencia de aminoácidos, ACPSLV, era idéntica a los residuos de ratón en estas posiciones
A nivel de nucleótidos las dos secuencias de primate mostraron una homología muy alta con las secuencias del dominio 1 de 02 humana. El dominio I de 02 de rhesus en la secuencia de nucleótidos (SEO ID NO: 104) mostró sólo una diferencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos humana, dentro de codón 50, un cambio de cn a CTG, pero ya que ambos codificaban una leucina, las secuencias de proteínas deducidas fueron idénticas a la humana. La secuencia de nucleótidos del dominio 1 de 02 de cynomolgus (SEO ID NO: 103) fue idéntica a la humana, excepto para el codón 40, donde había un cambio de la AAG humana a GAC. Esto da como resultado un cambio de lisina a un residuo de ácido aspártico en esta posición. Sin embargo, estudios posteriores revelaron que este cambio de nucleótido es debido a un pol imorfismo que no se conserva a traves de los animales, ya que otros cynomolgus mostraron una homología de 100% para el dominio I de 02 humana (véase el Ejemplo 18).
A continuación se expresaron las proteínas de fusión y se purificaron como se ha descrito anteriormente para la proteina de fusión de GST -dominio I de 02 humana. El análisis del material eluido de la columna de glutationa-Sefarosa indicó que las proteínas de fusión de roedores contenían formas agregadas. Por lo tanto, estas y las proteínas de fusión de primates se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Sephadex 75 10f30 (GE-Amersham) (primate) por FPLC en un sistema Akta-Basic FPLC (GEAmersham) para producir una fracción monomérica. Las proteinas de fusión GST se sometieron a ensayo a continuación para determinar su capacidad para unirse a TMC-2206 inmovilizado, así como su capacidad para competir con TMC-2206 marcado con Eu por la unión a la integrina 02131 humana inmovilizada. Los análisis de Kj se realizaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Para evaluar la unión directa a TMC-2206, se
recubrieron 4 placas Immulon utilizando 50 ~I de una disolución de bicarbonato (pH 9,0) que contenía 5 ~g/ml de TMC-2206. Las placas se sellaron y el recubrimiento se produjo durante la noche a 4"C. A la mañana siguiente, las placas se lavaron dos veces con di solución de TBS y luego se bloquearon utilizando 200 ~L de la solución de bloqueo descrito anteriormente durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después del bloqueo, la solución de bloqueo se retiró pero los pocillos no se lavaron. En lugar de ello, se llevó a cabo una dilución en serie de proteina de fusión con GST, se añadió a los pocillos y después se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Los pocillos se aspiraron después y se aplicó un tampón de lavado de TBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. La etapa de lavado se repitió dos veces más antes de aplicar el anticuerpo secundario. La etapa del anticuerpo secundario consisti6 en anticuerpo anti-GST de conejo conjugado con HRP de Amersham diluido 1 :2000 en tampón de bloqueo. Se añadieron cien ~I de anticuerpo secundario a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas con sacudimiento. Los pocillos se aspiraron de nuevo y se lavaron tres veces con tampón de lavado antes de añadir la mezcla de reacción del sustrato. Después se añadieron 100 ~I de mezcla de reacción de sustrato (dilución 1:1 del kit TMB), a cada pocillo durante 6 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 ~I de H2S04 0,1 M. La reacción dentro de los pocillos se leyó a continuación y se cuantificó mediante absorción espectrofotométrica utilizando el lector de placas de Molecular Dynamics y el soporte lógico Soflmax asociado, respectivamente. A continuación se estimaron los valores de K.J a partir de los valores de CEso utilizando el soporte lógico Prism (GraphPad, CA).
Hubo un cambio de 3 veces en Kd para la unión de I de 02 de a TMC-2206 en comparación con a2 humana, mientras que la proteína de fusión de GST-I de a2 murina mostró sólo una ligera unión especifica a la mayor concentración, lo que representa un cambio mayor de 1500 veces en la afinidad (véase la Tabla 29). La GST-I de a2 de rhesus mostró una afinidad comparable a la humana, mientras que de forma inesperada, la GST-I de a2 de mono cynomolgus no mostró ninguna afinidad detectable por TMC-2206 hasta concentraciones de 1 ~Ma. Estas clasificaciones relativas también se observaron en el análisis de la 1(;. La falta de reactividad cruzada de la proteína de fusión de GST-dominio I de cynomolgus I hacia TMC-2206 indica que el residuo K40 puede ser un factor determinante del epítopo. La diferencia en la afinidad de la GST-I de 02 de rata clonada (valor de Kd de 0,54 nM y de 1(; de 3,8 nM) en comparación con la proteína de fusión de GST-I de a2 humana (valor de Kd de 0,18 y de K,. de 0,33 nM) es consistente con el cambio en los valores de CEso encontrados en los análisis de TMC-2206 para determinar su capacidad para suscitar antagonismo sobre la adherencia de las plaquetas de nueva aportación de rata en comparaciÓfl con las plaquetas humanas a colágeno de Tipo 1, tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo
9. Del mismo modo la falta de reactividad cruzada de la proteína de fusión de GST-I de a2 ratón con TMC-2206 es consistente con la falta de reactividad cruzada del anticuerpo intacto con la integrina 02[31 de ratón
Tabla 29
Proteína de fusión
Kd(nM) k¡ (nM)
ha21
0,18 0,33
02 de rata
0,54 3,8
02 de ratón
ND' ND'
a2 de Cynomolgus
ND@40nM ND'
02 de Rhesus
0,04 4,4
GST
ND' ND'
· ND indica no detectable hasta concentraciones de -1 ~M
En estudios adicionales, los 14 residuos correspondientes a las diferencias únicas en el dominio I de 02 murina en comparación con los dominios I de a2 humana y de rata se mularon individualmente en la proteina de fusión del dominio I de a2 humana clonada por PCR utilizando métodos convencionales de la biología molecular (las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 30). Los clones bacterianos individuales se secuenciaron para verificar que la mutación correcta se había incorporado al dominio l. Una variante pretendida, el mutante G101 R, no proporcionó un clon correcta y no se estudió más. Los cebadores diseñados para crear la mutación Y93H dieron como resultado una serie de clones que llevaba en su lugar una mutación Y93D. Se evaluaron ambas variantes de Y93. Todos los demás tenían una secuencia correcta. Las variantes de proteínas resultantes se expresaron y se purificaron como se ha descrito anteriormente para las proteínas de fusión de dominio I de 02 humana wt-GST Éstas se sometieron a ensayo a continuación para determinar la actividad de tres maneras: primero por su capacidad relativa para unirse a diferentes colágenos para asegurar que las mutaciones no introducían perturbaciones conformacionales brutas que pudieran intel1erir en la unión del ligando; segundo, por su afinidad aparente para TMC-2206 (unión directa a TMC-2206 inmovilizado medida por EUSA) y tercero, por su capacidad para actuar como ligandos competitivos en el análisis de K¡. Los datos de K.¡ I<.J aparente también se resumen en la Tabla 30
Tabla 30
Mutaciones de la proteína de fusión
Kd apafente (nM) K¡(nM)
Dominio I de ha2
0,31 0,18
Dominio I de ha2 121V
0,28 0,24
Dominio I de ha2 E44V
0,23 0,35
Dominio I de ha2 Q48T
0,19 0,73
Dominio I de ha2 N67E
0,28 0,40
Dominio I de ha2 V701
0,44 0,86
Dominio I de ha2 V711
0,19 0,83
Dominio I de ha2 T76D
0,17 0,15
Dominio I de ha2 Y77F
0,22 0,39
Dominio I de ha2 K78E
0,16 0,51
Dominio I de ha2 Y93D
ND@440nM ND'
Dominio I de ha2 Y93H
6,1 ND'
Dominio I de ha2 Q105E
0,15 0,38
Dominio I de ha2 A 11 4Q
0,19 0,64
Dominio ' de ha2 A115T
0,19 0,76
*ND = no detectable hasta concentraciones de -1 ~M.
De los 13 residuos evaluados, 12 se cambiaron al homólogo murino con efectos menores sobre la afinidad, pero los cambios en Y93 causaron una marcada pérdida en la afinidad como se muestra en la Tabla 31 La mutación 10 Y93D abolió la capacidad de unirse a antígeno incluso a concentraciones de 3-logs por encima del valor de la K,j para la proteína de fusión de dominio I wt con GST. El cambio a la histidina murina (Y93H) causó una disminución de 23 veces en la afinidad aparente hacia el antígeno de TMC-2206. Ambas mutaciones abolieron la capacidad de GST-dominio I para suscitar antagooismo sobre la unión del anticuerpo marcado con Eu a su antígeno. El cambio de la H93 murina a Y confirió la capacidad del dominio I de a2 murina para unirse a TMC-2206, aunque con una 15 disminución de 200 veces en la potencia con respecto al dominio I de 02 wt humana, como se muestra en la Tabla
31 .
Tabla 31
Mutaciones de la proteína de fusión
Cebadores utilizados K¡(nM)
Dominio 1 de ha2
0,28
Domin io 1 de ha2 E195W
halphalE195W F (SEO ID NO: 159) 12,8
halphalE195W R (SEO ID NO: 160)
Domin io 1 de ha2 R165D
halphalR165D F (SEO ID NO: 155) 1987
halphalR165D R (SEO ID NO: 156)
Dominio 1 de ha2 N1660
halphalN166G F (SEO ID NO: 157) ND
halphalN166G R (SEO ID NO: 158)
Dominio 1 de ha2 Y93F
Ha lphalY93F F (SEO ID NO: 145) ND
halphalY93F R (SEO ID NO: 146)
Dominio 1 de ha2 K40D
halphalK400 F (SEO ID NO: 161 ) ND
halphalK400 R (SEO ID NO: 162)
Dominio 1 de ha2 N730
halphalN730 F (SEO ID NO: 165) 2,17
halphalN730 R (SEO ID NO: 166)
Domin io 1 de ha2 089H
halphal089H F (SEO ID NO: 167) 4,46
halphal089H R (SEO ID NO: 168)
Mutaciones de a21 murina
Dominio I de ma2 H93Y
malphalH93Y F (SEO ID NO: 169) 20 ,2
malphalH93Y R (SEO ID NO: 170)
La comparación de las estructuras cristalinas para el dominio 1 de a2 humana en la cooformación cerrada (entrada 1AOX de POB de NCBI) y abierta, unida al ligando (entrada 1 OZI de PDB) revela que Y93 se encuentra en 5 una cara del dominio I que está detrás de la hélice a7, que se mostró que experimentaba un gran movimiento hacia abajo tras la unión del liganclo (Emsley et al., J. Biol. Chem. 272:28512 (1997) y CeIl 100:47 (2000)). Aunque no se identificó previamente como un cambio conformacional asociado con la unión del ligando, el examen de las estructuras cristalinas indica que en la conformación cerrada, el anillo aromático de Y93 se extiende hacia fuera de la superficie de la proteína, pero se voltea hacia los lados y hacia abajo para alinearse a lo largo de la cara del 10 dominio 1 en la conformación unida al ligando, abierta. Para investigar si la unión de TMC-2206 a la integrina 02[31 depende de un estado conformacional dado, se introdujeroo mutaciones en el dominio I para favorecer una conformación abierta del dominio 1. Se ha informado de que la mutación E19SW (E318 en la integrina a2 intacta) bloquea el dominio I de a2 humana en la conformación abierta (Aquilina et al., Eur. J. Biochem. 269(4): 1136-1144 (2002)} por lo que su uso permite hacer una distinción en cuanto a si un anticuerpo reconoce una conformación 15 dependiente de la activación o no. Además, los estudios cristalográficos han demostrado que E19S forma un puente salino enterrado con el residuo R165 situado en el bucle aC, que sirve para sujetar el bucle aC en una conformación que protege el sitio de unión del ligando (Emsley et al., Cell 100:47 (2000)). El bucle oC adopta una conformación extendida en la posición abierta y se ha postulado que tanto el residuo R165 como el R166 adyacente contribuyen a la unión a colágeno (Emsley et al. , J Biol Chem. 272:28512 (1997) y Ce1l100:47 (2000); Kapyla et al., J Biol Chem
275:3348 (2000)). Por lo tanto, se construyeron cuatro mutaciones, la E195W; una mutación R165D para invertir la carga y, por tanto interrumpir el puente salino que se forma con E195W en la conformaciÓfl cerrada, y una mutación N166D, de nuevo para invertir la carga dentro de la hélice oC. El cambio E195W causó una disminución de 45 veces en los va lores de K; como se muestra en la Tabla 31 que indica que el anticuerpo TMC-2206 exhibe una mayor afinidad por la conformación cerrada. Tanto el cambio R165D como N166D abolieron la capacidad del dominio I de unirse al epitopo de TMC-2206 incluso a concentraciones tan altas como 1 IJM, sugiriendo de nuevo que el anticuerpo TMC-2206 reconoce una conformación cerrada
A partir de los estudios de muta génesis y de conformación, parece que el Y93 en la conformación cerrada puede desempeñar un papel en la unión de TMC-2206, y puede proporcionar un factor determinante para la especificidad de unión de la especie. Los resultados inesperados obtenidos con el dominio I de cynomolgus polimórfico indicaron que el residuo K40 también puede jugar un papel en la interacción antígeno -TMC-2206. El modelado por ordenador del anticuerpo TMC-2206 indicó que las CDR foOllan un sitio de unión relativamente plano, lo que sugiere que el anticuerpo hace varios contactos con el antigeno. Puesto que varios residuos dentro de las CDR están cargados, se identificaron los residuos cargados que rodean el Y93 en la posición cerrada que también muestran marcados cambios de posición en la conformaciórJ abierta a partir de las estructuras de POS de los dos confÓfmeros abiertos y cerrados como K40, R69, N73 Y 089. Las cargas de tres de estos residuos se invirtieron mediante la generación de los siguientes mutantes, K40o, R69o, y N730 Y se modificaron en el cuarto mediante la generación de una variante 089H, como se muestra en la Tabla 31. Además, se elaboró una tercera variante del residuo 93, un cambio de tirosina a fenilalanina, para determinar si el carácter aromático de la tirosina era la característica estructural importante, o si la actividad era dependiente del carácter hidroxilico aromático que es característico de tirosina. En el caso de este conjunto de mutaciones, todas fueron sometidas a purificación por HPLG para enriquecer la fracción monomérica de las preparaciones de proteína obtenidas fuera de la columna de afinidad de glutationa-Sefarosa. Cada variante se sometió a ensayo primero para determinar la funcionalidad mediante la evaluación la unión al colágeno. Todas, excepto la variante R690 se unieron al colágeno con un valor de CEso parecido al del dominio I de 02 humana wt. En consecuencia, la R69D no se estudió más. De los mutantes restantes, la introducción de la variante K400 abolió la capacidad para competir por la unión al epítopo de TMC2206. Esto fue coherente con los resultados obtenidos con el dominio I de cynomolgus donado que muestra polimorfismo en este residuo (cambio de lisina a ácido aspártico). Del mismo modo, la mutación Y93F también abolió la capacidad de competir por la uniórJ de EU-TMC-2206. N73D y 089H mostraron una disminución de 7,8 y 15,9 veces en los valores de Ki respectivamente (Tabla 30). Tomados en conjunto los datos de mutación indican que los residuos K40, Y93, R165 Y N166 pueden ser factores determinantes para la unión de TMC-2206 a su epítopo, y que N73 y Q89 también contribuyen a la energla de uníórJ.
Estos datos indican que el anticuerpo TMC-2206, sus derivados y anticuerpos de tipo TMC-2206 (p. ej. AK7) que reconocen el mismo epítopo o epítopos similares a TMC-2206, (véase p. ej., el Ejemplo 13) son antagonistas miméticos no ligandos, atípicos de interacciones a2¡31-colágeno. Esta conclusión está apoyada por i) su capacidad para bloquear la adherencia a colágeno mediada por la integrina a2¡31 de una manera independiente de cationes divalentes, ii) esta inhibición no implica la interacción de un grupo ácido crítico, tal como 0100 dentro de H-CoR3, con MIDAS, iii) el anticuerpo se une a una super1icie del dominio I que está en una posición distal con respecto al sitio de unión al ligando directo, iv) el sitio de unión a TMN -2206 favorece la confoOllaciórJ cerrada del receptor y abarca los residuos de aminoácido K40, N73, 089, Y93, R165 Y N166. Por consiguiente, la unión de TMC-2206 y anticuerpos de tipo TMC-2206 (p. ej., que reconocen el mismo epitopo o epitopos similares a TMC 2206) no soportarán la señalizaciórJ extracelular mediada por integrina que se produciría normalmente después de la intervención del ligando de colágeno cognado, y es este modo de unión el que puede contribuir al per1i1 de no sangrado de este anticuerpo y anticuerpos de tipo TMG-2206.
Ejemplo 13
Se realizaron estudios para comparar la unión de otros anticuerpos anti-integrina a2 con bloqueo de la función con TMG-2206. Los resultados de los estudios de mapeo descritos en el Ejemplo 12 indicaron que el anticuerpo TMC-2206 parecía unirse a una conformación cerrada del dominio I de la integrina 02 ylo no actuaba como un mimético de ligando. Estos resultados inesperados, junto con los resultados inesperados de los estudios relacionados con las plaquetas descritos en los Ejemplos 8, 9, 10 y 11 , demostraron que el epítopo TMC-2206 es particularmente ventajoso y que anticuerpos similares en sus propiedades funcionales a TMC-2206 son particularmente útiles Los métodos de escrutinio para la identificación de tales anticuerpos similares se desarrollaron como se describe en el presente documento, y los anticuerpos fueron identificados mediante tales métodos.
Para determinar qué anticuerpos anti-integrina a2 con bloqueo de la función se unían de una manera similar a TMC-2206, se realizaron una serie de estudios de competición cruzada. Para los estudios de anticuerpos antiintegrina 02 humana comercialmente disponibles, se inmovilizó proteína de fusión de GST-I 02 humana sobre placas de microtitulación como anteriormente. Los anticuerpos sometidos a ensayo fueron AK7 (Mazurov et al., Thromb. Haemost. 66(4):494-9 (1991», P1E6 ( Wayner et al., J. CeJl SioL 107(5):1881-1891 (1988 )), 10G11 (Giltay et al., Blood 73(5):1235-1241 (1989)) y A2-11E10 (Bergelson et al., Gell Adhes. Commun. 2(5):455-64 (1994» disponible comercialmente de Chemicon, (Temecula, CA; números de catálogo, GBL477 (AK7 ); MAB1950 (P1E6); MAB1988 (10G11) Y Upstate, (Waltham, MA; A2-IIE10, número de catálogo 05-227), respectivamente. Los anticuerpos se
sometieron a ensayo junto con el mismo lote de placas de microtitulaciórJ recubiertas con 02131 de plaquetas utilizadas en los estudios de mapeo epitópico para determinar su capacidad para suscitar antagonismo sobre la unión de TMC-2206 marcado con Eu _En otra serie de estudios, se determinó la capacidad de los anticuerpos para suscitar antagonismo sobre la unión de plaquetas en reposo recién aisladas a colágeno de Tipo 1. Por lo tanto, la capacidad de los diferentes anticuerpos dirigidos contra la integrina 02 humana para suscitar antagonismo sobre la unión del anticuerpo marcado con Eu TMC-2206 a placas de microtitulación recubiertas con 02131 de plaquetas se midió en forma de valores de J(¡, y para suscitar antagonismo sobre la adherencia de las plaquetas en reposo a colágeno tipo I se midió en condiciones estáticas en forma de valores de CEso_Los resultados, presentados en la Tabla 32, demuestran que el anticuerpo AK7 es un competidor eficaz de TMC-2206. El clone 10G11 mostró una clara competencia bifásica de TMC-2206, lo que sugiere que no actuaba como un simple antagonista competitivo A2-lIE10 mostró un cambio de 10 veces en comparación con TMC-2206 en el bloqueo de la adherencia de las plaquetas, pero un cambio de aproximadamente 350 veces en su capacidad para competir con TMC-2206 marcado con Eu, lo que indica de nuevo que no había una concordancia directa entre los dos anticuerpos. P1E6 no mostró ningún efecto en ninguno de los análisis, lo que indica que reconoce una conformación activa
Tabla 32
Anticuerpo competitivo
K¡ (n M)
CE~
TMC-2206
0 ,11
AK7
0 ,07
Alta afinidad· 0,05
10G11
>200
Baja afinidad: 7,7
A2-IIE10
29,6
P1E6
"[Sin competición]
"[Sin efecto]
ControllgG
"[Sin competición]
'[Sin efecto]
"No detectado en las condiciones de análisis descritas.
Estos datos demuestran por primera vez que no todos los anticuerpos de bloqueo de la funciórJ se unen a la integrina 02 de la misma manera, y demuestran adicionalmente métodos para la identificación de un nuevo subgrupo de anticuerpos similares en especificidad de epítopo a TMC-2206 con actividades de bloqueo de la función similares Estos datos también demuestran que este nuevo subgrupo de anticuerpos anti-a2, que incluye TMC-2206 y anticuerpos similares en especificidad de epítopo a TMC-2206, se caracterizan por una falta inesperada de complicaciones hemorrágicas in vivo y/o por la falta de activaciórJ de la integrina 02131 de plaquetas_La especificidad de epítopo, actividades de bloqueo de la función, y ventajas (p_ ej _, no activación de plaquetas) no son características de todos los anticuerpos de bloqueo de la función anti-a2j31 humana, sino más bien la característica novedosa de un nuevo subgrupo de anticuerpos que incluyen TMC-2206 y anticuerpos similares, incluyendo derivados y/o variantes de TMC-2206 que pueden ser identificados y/o seleccionados como se describe en la presente memoria.
Habiendo mostrado que no todos los anticuerpos con bloqueo de la función que se unen al dominio 02 I se unen al mismo o similar (p_ ej_, solapamiento) epitopo TMC-2206, se realizaron estudios para determinar si el anticuerpo sustituto utilizado para los estudios de eficacia en múridos tenía propiedades similares a TMC-2206. Puesto que el anticuerpo Ha1/29 reacciona de forma cruzada con la integrina 02 de rata y ratórJ, y el anticuerpo TMC-2206 se une tanto a la integrina a2 humana como de rata, se uti lizó la proteína de fusión GST de rata para determinar si los dos anticuerpos se unían a los sitios de solapamiento (p_ ej _, compartían especificidad de epítopo) Para esto, la proteína de fusión GST -dominio I de 02 de rata se inmovilizó sobre placas de microtitulación recubiertas con glutatión Reacti-Bind (Pierce Biotechoology, Inc_Rockford, IL)_ Primero se determinó la Kd de la unión de Eu-TMC-2206 a GST-dominio I de 02 inmovilizada de ser humano y de rata a 37"C como se describe en el Ejemplo 2. El análisis de Scatchard de la unión frente a Eu-TMC-2206 libre indicó que valores de Kd eran de 0,2 nM para el dominio 02 I humano y 1,3 nM (una disminución de 6 veces) para el dominio 02 1 de rata_ A continuación, se evaluó la capacidad de TMC-2206 marcado con Eu para unirse al dominio 02 I de rata en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpo competidor como se describe en el Ejemplo 2 utilizando el valor de Kd de 1,3 nM para obtener el valOf de Ki a partir de los valores de CE 50 observados_El anticuerpo Ha1129 ( Mendrick y Kelly, Lab Invest. 69(6):690-702 (1993», pero no el HM02 (Miyake et al., Eur J. Immunol. 24:2000-2005 (1994» fue un antagonista eficaz de la uniórJ de Eu-TMC-2206, lo que indica que el anticuerpo Ha1/29 se unía a sitios similares (p. ej_, solapamiento) al sitio de unión de TMC-2206
Ejemplo 14
Se realizó otro estudio sobre anticuerpos IgG4 ilustrativos que tenían una cadena pesada hVH14.0 y4 (SEO ID NO: 174) o una cadena pesada hVH12.0 y4 (SEO ID NO: 176) y una cadena ligera HVL 10.00 (SEO ID NO: 178). Este estudio evaluó si la unión de estos anticuerpos IgG4 conduce a la activación de las plaquetas, medida por los efectos sobre la agregación plaquetaria inducida por colágeno. Se recogieron muestras de sangre a través de venopunciórJ de la vena antecubital en tubos de llenado de vacío que contenían 3,8% de citrato de sodio después de descartar los primeros 3,0 mi de sangre de flujo libre. Todos los anticuerpos se diluyeron en solución salina a concentraciones finales de 140 mglml. Cada cubeta desechable (que contenía un conjunto de electrodos desechable) se dividió en alícuotas con sangre completa con 0,5 mi de citrato añadido y con 0,5 mi de solución salina o una disolución de anticuerpo_ Cada cubeta se pre-calentó a 37"C durante 5 minutos en el pocillo de calentamiento del agregómetro (Modelo 591A, Chrono-Log, Havertown, PA), después se colocó en el pocillo de reacción, se añadió el conjunto de referencia, ya continuación, o 20 ~I de solución salina o colágeno (1 mg/ml ; tipo I equino, Chrono-Log» para iniciar la reacción de agregación_ Durante la agregación se formó una acumulación de plaquetas en las superficies expuestas de los electrodos, lo que dio como resultado un aumento de la impedancia. La adquisición de datos prosiguió durante 6 minutos con el cambio de impedancia (.6.0, Ohms) registrado con un registrador de gráficos (Modelo 707, Chrono-Log).
Los datos (Tabla 33) se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, que sometió a ensayo la hipótesis de que las medianas de población de cada uno (solución salina o colágeno) de los cuatro grupos eran equivalentes, y rechazarían esta hipótesis (95% de confianza) si los va lores P eran de menos de o iguales a 0,05_ Para el grupo de solución salina (valor P = 0,148) ni el control de isotipo ni los dos anticuerpos humanizados indujeron la agregación de plaquetas humanas en comparación con el control negativo de solución salina. Para el grupo de colágeno (valor P = 0,201), ni el control de isotipo ni los dos anticuerpos humanizados inhibieron la agregación inducida por colágeno en comparación con el control negativo de solución sa lina. Los resultados de este estudio y los del Ejemplo 8 muestran que la unión de TMC-2206 y de las dos variantes de anticuerpos IgG4 humanizados no tiene ningún efecto sobre la agregación plaquetaria inducida por colágeno cuando se somete a ensayo in vitro en todas las concentraciones sometidas a ensayo.
Tabla 33
Agonista
Artícu lo de ensayo Valor P
Solución Salina
hlgG4/K hlgG4/K VH14 _0NL 10_00 hlgG4/K VH12 _0NL10_00
Solución Salina
1,0, 2,4, 2,8 , 2,8, 2,8, 3,8 2,4, 5,2, 5,6, 5,6 2,2, 3,0, 3,4, 4,2 2,8 , 3,6, 3,8, 5,2 0,148
Colágeno
17,8, 18,2, 19,4, 20,4, 21 ,1, 21 ,6 15,3, 17,2, 18,4 15,0, 15,2, 16,0 , 21 ,8 13,2,14,8, 18,1, 20,0 0,201
Ejemplo 15
Se sometió a ensayo TMC-2206 humanizado (hlgG4/KVH12.0NL10.00) para determinar su capacidad para bloquear la unión en la adherencia celular mediada por integrina a2¡31 a colágeno de tipo I utilizando células CHOa2, células HT1080 (fibrosarcoma humano), y plaquetas humanas siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. TMC-2206 humanizado era un potente inhibidor de la unión celular a colágeno con valores de CEso comparables a TMC-2206 (Tabla 34)
Tabla 34
Fuente de Colágeno de Tipo I
Células TMC-2206 CEso (nm) (Media ± ETM) T MC-2206 Humanizado ECso (nm) (media ± ETM)
Cola De Rata
Plaquetas humanas 3,1±O,3 4,7 ± 0,3
HT1080
0,90 ± 0,02 0 ,90 ± 0,27
CHO-a2
0,58 ± 0,51 1,9t1 ,5
Placenta Humana
Plaquetas humanas (n = 1) 8 ,44 13,1
Ejemplo 16
Se evaluó TMC-2206 humanizado por su capacidad para unirse a a1¡31 humana inmovilizada en un formato ELlSA_ La integrina a1¡31 humana (Chemicon Intemational) se diluyó en Tampón de Recubrimiento (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCI 1S0 mM, MgCI2 1 mM) a una concentraciórJ final de 0,5 ~g/ml. Se recubrieron inmunoplacas de 96 pocillos con a1 131 a 50 ng/pocillo y se incubaron durante la noche a 4"C Las placas se lavaron tres veces con tampón de
lavado (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, MgCI2 2 mM, Tween-20 al 0,5%) y se bloquearon con leche desnatada al 5% pfv en Tampón de Lavado durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos TMC-2206 humanizado, IgG4fK humano (control de isotipo), anti-a1 humana de ratón (FB-12, Chemicon Intemational) se diluyeron seriadamente en Tampón de Unión (0,1 mgfml de BSA, libre de IgG, en tampón de lavado). Se añadieron cincuenta microlitrosfpocillo de las disoluciones diluidas de anticuerpos a las placas recubiertas de a1 ~1 , se incubaron durante una ho ra a temperatura ambiente, y a continuación se lavaron tres veces. Se añadió anti-lgG humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (anticuerpo secundario; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a los pocillos que contenía el control de isotipo y TMC-2206 humanizado; se añadió anti-lgG de ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) a los pocillos que contenían FB-12. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces, se incubaron en disolución de sustrato (1 mgfml de fosfato de 4-nitrofenilo, dietanolamina 0,1 M, MgCI2 5 mM, pH 9,8) durante 20 minutos, y se terminó con NaOH. La absorbancia (405 nm) se leyó utilizando un lector de placas Spectramax Plus utilizando el soporte lógico Softmax Pro. Similar a TMC-2206, TMC-2206 humanizado y los anticuerpos IgG4/[3 no se unían a 01 [31 . El anticuerpo de control anti--a1 ~1 (FB-12) se unió a a1~1 con una CE50 de 0,79 t 0,15 nM_
Ejemplo 17
Los valores de Ko y K; para unión de los Mab TMC-2206 y TMC-2206 humanizado a a2~1 inmovilizada se determinaron utilizando el análisis de unión competitiva. Los pocillos en una placa de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron con integrina a2~1 de plaquetas (recubiertos a la medida con a2~1 de plaquetas humanas por GTI Inc., WI) y a continuación se bloquearon con leche desnatada. El anticuerpo TMC-2206 humanizado se marcó con reactivo Eu-N1-ITC, aproximadamente 2 mg se suspendieron en y se dializaron contra tampón fosfato salino (PBS; KH2P04 1,47 mM, Na2HP04 8,1 mM; pH 7,4, NaCI 138 mM y KCI 2,67 mM). Después de la concentración en concentradores Microsep prelavados [corte a 30 kDa; Pall Life Sciences a 9500 rpm (7000 xg) en un rotor JA-20 (Beckman Instruments, Inc.] durante 20 minutos a 4Q C), el anticuerpo se ajustó a 4,0 mg/ml con PBS, NaHC03 100 mM, pH 9,3. La mezda de Mab/bicarbonato (0,250 mi) se mezdó suavemente en un vial que contenía 0 ,2 mg de ácido N'-(p-isotiocianatobencil)--dietilentriamino-N',";,rI,tI-tetraacético quelatado con Eu3+ (Eu-N1-ITC; Per1<in Elmer Life Sciences) y se incubó durante la noche a 4Q C sin agitación. La mezcla de anticuerpo marcado se aplicó a una columna PD-10 (GE Biosciences, Piscataway, NJ) pre--equilibrada con Tampón de Migración (Tris 50 mM, pH 7,4 Y NaCI138 mM). Las fracciones (0,5 mi) se recogieroo y se analizaron para determinar la proteína total (reactivo de Bradford; Bio-Rad LabOfatories, Hercules, CA) usando un lector de placa de absorbancia SpectraMax 384 y para el europio después de dilución 1:10.000 en DELFIA Enhancement Solution (Per1<in-Elmer) mediante fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) usando un lector de placas multi-marca Victor2 (Per1<in Elmer). Las fracciones que fueroo positivas tanto para la marca de la proteína y europio se reunieron, se aplicaron a una nueva columna PD-10, y las muestras recogieron y se analizaron para determinar la proteína total y el contenido de europio por TRF calibrado frente a una disolución patrón de europio (Perkin-Elmer) para calcular la razón de fluor:proteína. A continuación, se aplicó el Eu-TMC-2206 humanizado a las placas de microtitulación de integrina a2~1 bloqueadas en un volumen de 10 ~l/pocillo. Después de incubar las placas selladas durante 1 hora a 3rC para permitir la unión para alcanzar el equilibrio, se transfirieron muestras de 2 ~I desde cada pocillo a un nuevo pocillo que cootenía DELFIA Enhancement Solution (100 ~lfpocillo) para la medición de la marca libre (no unida). Se añadió Disolución Intensificadora (100 ¡Jlfpocillo) a los pocillos vacíos para la medición de marcador unido. La placa se agitó (Titer Shaker Plate, ajuste de velocidad de S, 5 minutos a temperatura ambiente) y las intensidades de TRF se leyeron utilizando el lector de placas multi-marca Victor2. Los valores de Ko se calcularon mediante los análisis de Scatchard.
Las potencias de unión relativa a integrina 02[31 inmovilizada se analizaron mediante la medición de los valores de K.; en un análisis de competición utilizando Eu-TMC-2206 humanizado 100 pM en presencia de concentraciones variables de anticuerpo TMC-2206 no marcado o TMC-2206 humanizado como competidores, utilizando un sistema de análisis similar al descrito anteriormente en este ejemplo. A continuación se aplicaron combinaciones de anticuerpos de ensayo a los pocillos recubiertos con integrina a2~1, se sometieron a ensayo a lo largo de un intervalo de concentración de 10.11 a 10.7 M, Y tras el tiempo especificado, se determinó la cantidad de Eu-TMC-2206 humanizado unido. Las curvas de inhibición se ajustaron coo el modelo de "competición por un sitio" utilizando el soporte lógico Prism (GraphPad, Inc.) para obtener los valores de CI50 y para calcular la Kj utilizando la ecuación de Cheng y Prusoff (1973) y los respectivos valores para Ko anteriores
Los valores de Ko Y K; para TMC-2206 y TMC-2206 humanizado casi fueron un múltiplo de 2 (Tabla 35) Por lo tanto las afinidades de unión de TMC-2206 y TMC-2206 humanizado a 02[31 inmovilizada fueroo similares.
Tabla 35 5
Para metro de afinidad
TMC-2206 TMC-2206 Humanizado
Ko
0,72 ± 0,18 nm 1,29±0,17nm
K,
0,21 ± 0,08 nm 0,41 ± 0 ,06 nm
TMC-2206 y TMC-2206 humanizado se sometieron a análisis de resonancia de plasmón superficial (RPS) para determinar las constantes de disociación y de asociación cinética, k.J y ka (también conocidas como koff y kon), respect ivamente, para el dominio 02 I La RPS, un método para la caracterización de las interacciones macromoleculares, es una técnica óptica que utiliza el fenómeno de onda transitoria para medir exquisitamente cambios minimos en el índice de refracción muy cerca de una superticie del sensor. La unión entre un antígeno en disolución (p. ej., proteína de fusión) y su MAb receptor (inmovilizado en la superticie de un chip sensor) da como resu ltado un cambio en el índ ice de refracción. La interacción se verifica en tiempo real y la cantidad de antígeno unido y las constantes de velocidad de asociación y disociación se pueden medir con alta precisión. La constante de equilibrio de disociación se puede calcular fácilmente a partir de: Ko = k.JJk" = kon/kon. La clonación del dominio 02 I humano y la purificación de la proteína de fusión de GST-dominio I de 02 humana expresada se describió en el Ejemplo 12. Los análisis se realizaron a 20"C utilizando un sensor óptico Biacore 2000 con un chip sensor CM5 (life Sciences Biacore, Uppsala, Suecia) de calidad investigación y se equilibró con tampón (HEPES 50 mM, NaCI 150 mM, MgCI2 0,25 mM, CaCi2 0,25 mM, Tween-20 al 0,5%, 0,1 mg/ml de BSA, pH 7,4). Para la captura de TMC-2206 en el chip sensor, dos de las superticies celulares de flujo del chip se recubrieron con IgG anti-ratón; las otras dos células de flujo se recubrieron con proteína A para la captura de TMC-2206 humanizado. Cada ciclo de unión del antígeno (proteína de fusión de GST/dominio J de 02 humana) a las IgG anti-ratón coneeladas a la superticie implicó tres etapas. En la primera etapa, TMC-2206 fue capturado en una superficie anli-ratón y a continuación TMC-2206 humanizado fue capturado en una superticie de Proteína A. [Las otras dos superficies (una anti-ratón y una Proteína A) sirvieron como referencias analíticas[. En el segundo paso, la proteína de fusión de GST-dominio I de 02 humana se inyectó a través de las cuatro superficies. Las respuestas obtenidas a partir de las superficies de referencia (debido a desajustes del índice de refracción entre el antígeno y el tampón migración) se restaron de las respuestas obtenidas de las superficies de reacción. En la tercera etapa, los complejos antígeno/anticuerpo fueron desprendidos de las superficies de tal manera que las superticies podrian utilizarse para otro ciclo de unión. La coocentración de proteína de fusión de GST-dominio I de 02 humana más alta fue de 41 nM. La disolución de antígeno se hizo fluir sobre las superficies durante 2 minutos a 50 ~I/min y la disociación del antígeno de la superficie se controló durante seis minutos. Se determinaron las constantes de velocidad para la unión de proteína de fusión de GST-dominio 1 de 02 humana a TMC-2206 y TMC-2206 humanizado y se encontró que eran similares (Tabla 37)
Los ensayos de unión competitiva y los análisis de RPS confirman ambos que el proceso de humanización no afectó a la afinidad de unión de TMC-2206 humanizado al dominio I de 02 humana.
Ejemplo 18
Se evaluó la reactividad cruzada entre especies con TMC-2206 humanizado mediante técnicas analíticas bioquímicas. En el primer estudio, se determinaron las afinidades de unión (valores de K.) de TMC-2206, TMC-2206 humanizado, y las proteínas de fusión de GST-dominio 1de 02 derivadas de diferentes especies (valores de Ki) mediante unión competitiva con TMC-2206 humanizado marcado con europio a placas recubiertas con a2¡31 (Ejemplo 17). La clonación de dominios I de 02 de ser humano, macaco rhesus, rata, y ratón se describen en el Ejemplo 12. Se clonaron los dominios I de 02 de Cynomolgus y mono rhesus adicional a partir de ADNc derivado de ARN total extraído de tejido cutáneo (MediCorp, Inc., Montreal, QC). Hubo una disminución de 9 veces en K. para la unión de I de a2 de rata a TMC-2206 humanizado en comparación con el dominio I de 02 humana, mientras que la proteína de fusión GST-I de 02 murina mostró solo una ligera unión específica a la mayor concentración (4 M; Tabla 36). [Ni el control negativo de la proteína de fusión de GST ni el control negativo de isotipo IgG4/k mostraron ningún efecto de unión competitiva a concentraciones 0,4 M). Las proteínas de fusión de I de a2-GST de rhesus, cynomolgus, y humanas mostraron una unión comparable. Por lo tanto, las cuatro especies demostraron reaelividad cruzada con TMC-2206 humanizado.
Tabla 36 5
Competidor
K. (n M)
TMC-2206
0,14 ± 0,01
TMC-2206 Humanizado
0,34 ± 0,00
proteína de fusión de GST-dominio I de 02 humana
0,57 ± 0,06
proteína de fusión de GST-dominio I de 02 de cynomolgous
0,47 ± 0,00
proteína de fusión de GST-dominio I de 02 de rhesus
0,40 ± 0,02
proteína de fusión de GST-dominio I de 02 de rata
5,23±0,14
proteína de fusión de GST-dominio I de 02 de ratón
No detectada a 4,0 ~M
Competidor
K. (n M)
proteína de fusiÓfl de GST (control negativo)
No detectada a 0,4 ~M
IgG4/K Humana (control de isotipo negativo)
No detectada a 0,4 ~M
En un segundo estudio, se evaluaroo las constantes de velocidad y de equilibrio de uniÓfl de TMC-2206 y TMC-2206 humanizado, y proteínas de fusión de t de a2-GST seleccionadas mediante análisis de RPS (Tabla 37). Todas las constantes cinéticas y de equilibrio derivadas de TMC-2206 parental y humanizado para los dominios I de 02 humanos y ratas fueron similares. Además, las constantes de velocidad de TMC-2206 humanizado para los dominios I de 02 humanos y de cynomolgus fueron similares. TMC-2206 humanizado no se unió al dominio I de 02 de ratón a concentraciones 4,0 M de la proteína de fusión de I de 02 de ratón-GST. La unión comparable de la proteína de fusión de GST-dominio I de 02 de cynomolgus a TMC-2206 humanizado no era coherente con el resultado en el Ejemplo 12 -donde no se observó unión competitiva a concentraciones de hasta 1 ~M (Tabla 29) Sin embargo, los análisis de la secuencia de AON realizados sobre poblaciones de AONc derivados de ARNm extraído de monos (Medicorp Inc.) reveló un polimorfismo en un solo am inoácido (posición 40) en comparación con el dominio I de a2 humana. Este polimorfismo no se conservó a través de los animales, ya que un cynomolgus y un mono rhesus mostraron un heteromorfismo mientras que los otros animales mostraron una homología de 100% para el dominio I de a2 humana. La GST-dominio I de a2 de cynomolgus estudiada en este ejemplo mediante la unión competitiva y análisis de RPS codificó la secuencia idéntica a la de dominio I de 02 humana. Estos estudios bioquímicos demostraron que TMC-2206 humanizado presentaba reacción cruzada con los dominios I de 02 derivados de ser humano, rhesus, cynomolgus, y rata, pero no con el dominio I de a2 de ratón. Se realizaron estudios celulares in vitro de reactividad cruzada (Ejemplo 20) para verificar que TMC-2206 humanizado presentaba reacción cruzada coo las diferentes especies de células de la sangre
MAb
GST-Dominio I de a2 k(I (s·') ka (M·'s·') Ko (=koIka;nM)
TMC-2206
Humano (11 ,0 ±0,5) x 10""" (3,8±0,1)x105 2,9 ± 0 ,1
Rata
(8,2 ± 0,1) x 10""" (4,2 ± 0,1) x 105 2,0±0,1
TMC-2206 humanizado
Humano (8,2 ± 0,3) x 10""" (3,5 ± 0,0) x 10~ 2,3 ± 0 ,1
Rata
(5,7 ± 0,4) x 10""" (3,3 ± 0,3) x 105 1,7±0,1
Humano
(2,4 ± 0,9) x 10""" (5,8 ± 0,6) x 10~ 4 ,0 ± 0 ,1
Cynomolgus
(3,0±0,1)x104 (5,0±0,1)x105 5,0 ± 0,1
Ratón
No detectada a 4,0 tJM No detectada a 4,0 IJM No detectada a 4 ,0 ~M
Se evaluó adicionalmente la reactividad cruzada entre especies mediante la unión de TMC-2206 humanizado a células de la sangre de diferentes especies mediante citometría de flujo. En el primer estudio, se evaluó la reactividad cruzada de TMC-2206 humanizado con plaquetas de diferentes especies. La sangre se obtuvo a través de veni-puntura de donantes humanos, ratas y monos rhesus/cynomolgus. La sangre humana se recogió en citrato de sodio al 3,8%; la sangre de rhesus y cynomolgus se recogió en EDTA 10 mM; y la sangre de las ratas se recogió en heparina. La sangre completa de los primates (humanos, rhesus, cynomolgus) se incubó con TMC-2206 humanizado a una concentración final de 140 tJg/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación de 10 minutos con el MAb de ratón anti-lgG4 humana coojugado con FITC (Clan HP6023; Soulhem Biotech), seguido de una incubación con anticuerpos marcadores de plaquetas específicos de especie conjugados
con moléculas fluorescentes. Las plaquetas humanas se identificaron con anti-C042b humano de ratón conjugado con PE (BO Biosciences) y las plaquetas de rhesus/cynomolgus se identificaron con anti-C041a humano de ratón conjugado con PE (BO Biosciences). La sangre completa de rata se incubó con 500 tJg/ml de TMC-2206 humanizado conjugado con Alexa-488 (kit Alexa Fluor 488 Protein Labeling, A10235, Molecular Probes) durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con el anti-C061 de ratón de hámster conjugado con PE (marcador de plaquetas de rata; BO Biosciences) Todas las muestras se lavaron una vez, se suspendieron en
solución salina tamponada con fosfato, ya continuación se sometieron a análisis de citometría de flujo. [Los portales de dispersión frontal y de dispersión lateral se ajustaron a escalas logarítmicas para discriminar adicionalmente las plaquetas de los glóbulos rojos y leucocitos más grandes]. El TMC-2206 humanizado se unió a las plaquetas de las cuatro especies (Tabla 38).
En el segundo estudio, se evaluó la reactividad cruzada de TMC-2206 humanizado con diferentes especies de leucocitos. Se obtuvo sangre de las mismos cuatro especies, excepto que la sangre humana se recogió en EDTA 10 mM. Se añadió TMC-2206 humanizado conjugado con Alexa 488 a la sangre completa (concentraciones finales de 225-400 ¡..Ig/ml) durante 10 minutos, seguido de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos marcadores. Los anticuerpos anti-CD45 se utilizaron para teñir todos los leucocitos [para los leucocitos humanos anticuerpo de ratón anti-humano conjugado con PE-Cy5 (clon H130, SD Biosciences); para los leucocitos de rhesus y cynomolgus anticuerpo de ratón anti-humano conjugado con PE-Cy5 (clon Tü116, SD Biosciences); y para los leucocitos de rata anticuerpo de ratón anti-rala conjugado con PE-Cy5 (BD Biosciences). Se utilizaron anticuerpos marcadores para teñir plaquetas: para las plaquetas humanas anticuerpo de ratón anti-humano conjugado con PE-Cy5-CD42b (BD Biosciences); para las plaquetas de rhesus y cynomolgus anticuerpo de ratón anti-humano conjugado oon R-PE-CD41a (BD Biosciences); y para las plaquetas de rata anticuerpo de hámster anti-ratón conjugado con R-PE-CD61 (BD Biosciences]. Se añadió 1 mi de agua a la mezcla de reacción (aproximadamente 250 ¡JI), se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos, seguido de la adición de 2 mi de PBS (para llevar tonicidad a niveles que impidan la lisis de leucocitos), y se centrifugó. El sedimento celular se resuspendió en 0,5 mi de PSS y se sometió a análisis de citometría de flujo. [El canal de dispersión lateral se ajustó a escala lineal y el canal de CD45 se ajustó a escala log para discriminar granulocitos, monocitos y linfocitos.] Puesto que los diversos niveles de la activación plaquetaria endógena dará lugar a la formación de micro-agregados de plaquetas-leucocitos, fue fundamental identificar los leucocitos que no se unian a las plaquetas (que expresan constitutivamente la integrina a2p1). Por lo tanto solo se evaluaron aquellas células que fueron CD45'¡CD41a-, CD45+¡D42b·, o CD45+¡CD61" para la unión a TMC-2206 humanizado. El TMC2206 humanizado se unió a los linfocitos, monocitos y granulocitos de las cuatro especies (Tabla 38)
Estos resultados son coherentes con los resultados del Ejemplo 19 en el que TMC-2206 humanizado reacciona de forma cruzada con las proteínas de fusión de GST-dominio I de 02 de ser humano, rhesus, cynomolgus, y rata (mediante K; y análisis de RPS). Había porcentajes relativamente bajos de células de la sangre de rata que se unían a TMC-2206 humanizado en comparación con las células de la sangre de primate. En tres estudios anteriores (Ejemplos 9, 19 Y 12), se demostró que las afinidades de unión de los anticuerpos TMC-2206 parental y humanizado a la subunidad de la integrina a2 de rata, eran de un orden de magnitud menor que las afinidades de unión a la subunidad 02 humana. En el primer estudio, Ejemplo 9, los valores de CEso para TMC-2206 que inhiben la unión de plaquetas de rata y plaquetas humanas a colágeno tipo I de rata fueron de 6,3 nM y 1,7 nM, respectivamente. En el segundo estudio, Ejemplo 19 (Tabla 38), los valores de K; para la inhibición de la unión de TMC-2206 humanizado a a2p1 inmovilizada por los competidores GST -dominio I de a2 humana y proteinas de fusión de GST -dominio I de a2 de rata fueron de 0,57 nM y 5,23 nM, respectivamente. Del mismo modo, en el tercer estudio, Ejemplo 12 (Tabla 29), los valores de K; para la inhibición de la unión de TMC-2206 a a2131 por las proteínas de fusión de GST-dominio I de a2 humana y de GST-dominio I de 02 de rata fueron de 0,33 nM y 3,8 nM, respectivamente. Además, en ambos estudios de plaquetas y leucocitos, todas las muestras celulares se lavaron antes de ser sometida a análisis de citometria de flujo, retirando mediante lavado más TMC-2206 humanizado de la subunidad a2 de rata de menor afinidad en comparación con las subunidades a2 de primate. Combinados con los resultados anteriores, esto condujo a puntuar como ~positivo~ un porcentaje relativamente bajo de glóbulos rojos de rata en comparación con los glóbulos rojos de primate (suponiendo densidades de los receptores de a2p1 similares) En resumen, las plaquetas, linfocitos, monocitos y granulocitos de las cuatro especies sometidas a ensayo (humana, mono rhesus, mono cynomolgus, y rata) se unieron todas a TMC-2206 humanizado
Tabla 38
Especie Humana Rhesus Cynomolgus Rata
N 3 4 4 3 Porcentaje de Unión Celular (Media ± ETM) Plaquetas Linfocitos Monocitos Granulocitos 94,5 ± 0,9 63,7 ± 8,9 78 ,6 ± 9,1 75,5 ± 9,3 97,2 ± 0,0 7,2 ,3 ± 9,7 90,4 ± 4,9 95,3 ± 2,2 96,5 ± 0,3 73 ,5 ± 12,1 87 ,4 ± 7,0 95,2 ± 3,0 21 ,5±2,3 38,2t1,7 37,4t1 ,6 43,2 t 2,1
Ejemplo 20
Otro estudio evaluó si la unión de TMC-2206 humanizado a a2J31 condujo a la activación de las plaquetas, medida mediante citometria de flujo. La activación de las plaquetas se midió como la regulación al alza de Pselectina o la activación de la integrina GPllbllla (allbJ33). Se recogieron muestras de sangre a través de venopunciórJ de la vena antecubital en tubos de llenado de vacío que contenían citrato de sodio al 3,8% después de descartar los primeros 3,0 mi de sangre de flujo libre. La sangre se diluyó 1:10 en TBS (pH 7,4) Y esto estuvo seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con solución salina, control de isotipo IgG4/K (concentración final de 132 I-Ig/ml), o TMC-2206 humanizado (concentración final de 144 mgfml). Para la activación de las plaquetas se aí'iadió, o péptido---6 activador del receptor de trombina (TRAP-6, concentración final10 mM; AnaSpec Inc., San Jase, CA) o difosfato de adenosina (AOP Sigma, concentración final 20 mM) a las muestras, seguido de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se sometieron a tratamiento para la citometría de Hujo mediante incubación con anticuerpos marcadores: anticuerpo de ratón anti-humano conjugado con PE-Cy5-C042b (SO Siosciences) para teñir las plaquetas; anticuerpo de ratón anti-humano conjugado con PEC062P (BO Biosciences) para teñir P-selectina; y PAC-1 conjugado con FITC (BO Biosciences) para teñir GPllbllla activada (PAC-1 se une a la conformación activa de la integrina GPllbllla). El error de muestreo para cada muestra fue de menos de 5% (nivel de confianza del 95%).
Los primeros experimentos evaluaron si la unión de TMC-2206 humanizado conduce a la activación de plaquetas medida por la regulación al alza de P-selectina. La activación se puntuó como el porcentaje de plaquetas (C042b+) que fueron teñidas por el marcador de P-selectina (C062P) (Tabla 39). Mediante análisis ANOVA (una sola vía, intervalo de confianza de 95%), la expresión de P-selectina de plaquetas incubadas con solución salina, IgG4/K, Y TMC-2206 humanizado no fue estadísticamente diferente (P = 0,96). Por lo tanto, la unión de TMC-2206 humanizado a las plaquetas no indujo la activación de las plaquetas. En experimentos rea lizados paralelamente, TRAP-6 indujo aumentos significativos de la expresión de P-selectina. La adición de TMC-2206 humanizado no afectó estadísticamente la expresión de P-selectina inducida por TRAP-6 en comparación con solución salina o el control de isotipo (P -0.96; ANOVA de una vía, intervalo de confianza de 95%) Por lo tanto la unión de TMC-2206 humanizado no inhibió la activación plaqueta ria inducida TRAP-6
Tabla 39
Expt.
Artículos de Ensayo Incubados con Sangre Completa
Solución Salina
IgG4/K huTMC-2206 TRAP-6 TRAP-6 + IgG4fK TRAP-6 + huTMC-2206
1
2,44 1,21 0,85 76 ,60 80,35 79,50
2
8,40 9,10 5,29 97 ,01 86 ,73 83,32
3
29,54 30,08 25,70 92 ,71 95,63 96,88
Media ± ETM
13,5 ± 8,2 135 ± 8,6 10,6 ± 7,7 88 ,8 ± 6,2 87 ,6 ± 4,4 86,6 ± 5,3
El siguiente estudio evaluó la regulación al alza de P-selectina después de la incubaciórJ con/sin el agonista AOP (porcentaje de plaquetas que expresan P-selectina, Tabla 40). Como antes, la expresión de P-selectina sobre plaquetas incubadas con TMC-2206 humanizado, IgG4/k, y solución salina fueron comparables, por lo tanto TMC2206 humanizado no indujo la activación de las plaquetas. La expresión de P-selectina inducida por AOP fue comparable a la inducción con TRAP-6. Parecía haber un aumento adicional en la expresión de P-selectina con las plaquetas incubadas con AOP y a continuación con IgG4fK o TMC-2206 humanizado. Sin embargo, el aumento de la regulación al alza de P-selectina fue similar tanto para el control de isotipo como para TMC-2206 humanizado; indicando de nuevo que la unión de TMC-2206 humanizado a las plaquetas no induce la activación plaquetaria. Al mismo tiempo, la expresión de P-selectina de plaquetas inducidas con AOP incubadas con IgG4/K o TMC-2206 humanizado no disminuyó. Por lo tanto la unión de TMC-2206 humanizado no inhibía la activación plaquetaria inducida por AOP
Tabla 40
Agonista
Artículos de Ensayo Incubados con Sangre Completa
Solución Salina
IgG4/K huTMC-2206
Solución Salina
29,54 30,08 25,70
ADP
79,90 96,24 96 ,87
El siguiente estudio evaluó la activación de GPllbllla después de la incubación con/sin agonistas TRAP-6 o ADP puntuando el porcentaje de plaquetas que se unian al anticuerpo marcador PAC-1 (que se une a la confOfmación activa de GPllbllla; Tabla 41). El nivel de expresión de GPllbllla activada sobre las plaquetas incubadas con TMC-2206 humanizado, IgG4fk, y solución salina fueron comparables-TMC-2206 humanizado no indujo la activación plaquetaria IgG4/k y TMC-2206 humanizado no inhibieron la activación inducida por TRAP-6 ni por ADP
Tabla 41
Agonista
Artículos de Ensayo Incubados con Sangre Completa
Solución Salina
IgG4/K huTMC-2206
Solución Salina
26,5 24,3 18,6
TRAP-6
79,9 93,8 88 ,9
ADP
69,1 93,1 86,0
En resumen, TMC-2206 humanizado no indujo la activación de plaquetas (sin aumento de la regulación al alza de P-selectina o activación de GPllbllla), ni inhibió la activación plaquetaria inducida por agonistas (TRAP--6, 10 ADP). Este dato complementa el estudio de la agregación plaquetaria (Ejemplo 15, Tabla 34) que mostró que TMC
2206 humanizado no indujo la agregación plaquetaria ni inhibió la agregación inducida por colágeno
Ejemplo 21
El TMC-2206 humanizado se evaluÓ para determinar su efecto tanto en las rutas de coagulación tanto extrínseca como intrínseca mediante la mediciórJ de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial 15 activada (TTPa). Se utilizó una preparación liofilizada calificada de plasma humano (Citrex 1, Bio/Data Corporation, Horsham, PA) para la medición tanto de TP como de TTPa. Se añadió TMC-2206 humanizado al plasma para alcanzar concentraciones finales de 179, 214, Y 286 ~g/mL (correspondientes a la Cmax de una sola dosis de anticuerpo a 12,5, 15,0, Y 20,0 mglkg, respectivamente) antes de someter las muestras a los ensayos de coagulación. Se siguieron procedimientos convencionales para Tp y TTPa con los tiempos de coagulación medidos 20 mediante un fibrómetro de BBL (BD, Franklin Lakes, NJ). La Tabla 42 resume los datos para una serie de seis experimentos (3 TP Y TTPa) 3. Se ejecutó un control de solución salina para cada experimento. Los análisis estadísticos de la t de Student de cada par emparejado (TMC-2206 humanizado y solución sa lina) demostraron para cada experimento que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos de coagulación medios para TMC-2206 humanizado en comparación con solución salina. (Las hipótesis de que los tiempos de coagulación 25 eran diferentes sería rechazada con niveles de confianza de 95% si los valores de p calculados individuales fueran
menores de 0,05). Por lo tanto TMC-2206 humanizado no afectó la coagulación medido mediante TP y TTPa.
Tabla 42
Parámetro de Coagulación
TMC-2206 Humanizado Solución Salina Valor P
Concentración
Tiempo de Coagulación (segundos , media ± ETM) Tiempo de Coagulación (segundos, media ± ETM)
179 ¡Jg/mL
10,8±O,1 10,8±0,1 1,00
Tiempo de Protrombina
214 ¡Jg/mL 11 ,3±O,1 11 ,1 ±0,1 0,67
286 IJgfmL
11 ,5±O,2 11 ,6±0,1 0,62
179 ¡Jg/mL
25,6 ± 0,7 24,8 ± 0,6 0,43
Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada
214 ¡JgfmL 24,1±O,3 23,5 ± 0,5 0,30
286 ¡JgfmL
27,9 ± 0,2 27,9 ± 0,4 1,00
Ejemplo 22
30
Se evaluaron los efectos de TMC-2206 humanizado sobre los tiempos de sangrado en rata. A ratas
84
Sprague-Daw1ey (190 -200 g) se les inyectaron por vía intravenosa (vena de la cola) solución salina, heparina (0,6 mg/kg, control positivo), o TMC-2206 humanizado a dosis de 5 y 15 mg/kg una hora antes de la transección normalizada de la punta (0,5 mm) de cada cola. Las ratas no se anestesiaron y estuvieron conscientes durante la medición del tiempo de sangrado. La punta de la cola cortada de cada rata se sumergió de inmediato a 2 cm de 5 profundidad en un tubo de ensayo que contenía solución salina a 37"C. Se puntuó el tiempo requerido para el inicio de un período de 15 segundos de cese de sangrado como tiempo de sangrado. Se utilizó un tiempo máximo de corte de 20 minutos. La pérdida de sangre se puntuó mediante la cantidad de hemoglobina liberada después de la hemólisis (espectrofotométricamente) a partir de la sangre recogida en el tubo de ensayo. El TMC-2206 humanizado presentó un efecto no estadísticamente significativo sobre el tiempo de sangrado en ambas dosis sometidas a
10 ensayo en comparación con los controles no tratados previamente y de solución salina (Tabla 43; P =0,08, análisis ANOVA de una vía). El TMC-2206 humanizado muestra ningún efecto estadísticamente significativo sobre la pérdida de sangre en ambas dosis sometidas a ensayo en comparación con los controles no tratados previamente y de solución salina (P = 0,22, análisis ANOVA de una sola vía. Por lo tanto TMC-2206 humanizado no afecta a los tiempos de sangrado o pérdidas de sangre in vivo
15 Tabla 43
Artículos de Ensayo Inyectados intravenosamente a ratas
Sin
tratamiento Solución Salina TMC-2206 Humanizado Heparina
previo
5 mg/kg 15 mg/kg
n
10 10 10 10 10
Tiempo de Sangrado (minutos, media ± ETM)
35 ± 0,4 4,5 ± 0,4 5,2 ± 0,6 4,3 ± 0,3 17,8±1 ,1
Pérdida de Sangre hemoglobina, media ± ETM)
(mg de 10,3 ± 3,0 17,6:± 2,0 20,5:± 4,1 21 ,2±5,9 115±31
Ejemplo 23
Se realizó un estudio para determinar el efecto de una dosis única de TMC-2206 humanizado sobre los niveles circulantes de citoquinas en ratas como un medio para determinar si TMC-2206 humanizado causaba la 20 activación in vivo detectable de los leucocitos. Se administraron a ratas por vía intravenosa solución salina (control negativo), control de isotipo IgG4/K humano (15 mg/kg), TMC-2206 humanizado (15 mglkg) o lipopolisacárido (LPS, control de inflamación positivo; 0,75 mg/kg). Se utilizaron ratas no inyectadas como controles sin tratamiento previo. A las 2, 4, 6, Y 8 horas de la inyección, se recogieron muestras de sangre a través de la vena safena y se procesaron para obtener plasma. Las muestras de plasma se sometieron a inmunoanálisis múltiplex basado en cuentas (MIA; 25 Linco Diagnostics, St. Charles, MO) para determinar los niveles de IL-1a, IL-1¡3, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, GM-CSF, IFN-y, y TNF-a (Tabla 44; pg/ml , media ± ETM). El MIA implica la detección simultánea de analitos (hasta 100) en el mismo volumen de muestra (25 ¡JI) combinando varias reacciones de unión antígeno/anticuerpo individuales en conjuntos de microesferas espectralmente distintas. Dependiendo del antígeno, la sensibilidad del MIA esté entre 1,5 y 50 pg/ml. Cada conjunto de datos de citoquinas fue sometido a análisis ANOVA de dos vías, intervalo de confianza 30 de 95%, sometiendo a ensayo la hipótesis de que los niveles de citoquinas individuales para los cuatro puntos temporales y para las cuatro condiciones (sin tratamiento previo, vehículo, IgG4/k, y TMC-2206 humanizado) eran equivalentes. Las hipótesis serían rechazadas si los valores P fueran inferiores a 0,05. No hubo diferencias estadísticamente significativas en cada uno de los diez conjuntos (todos los valores P variaron de 0,18 a 1,0, Tabla 44) de niveles de citoquinas observados en ratas a las que se había inyectado vehículo, IgG4/K, TMC-2206
35 humanizado, o no inyectadas (sin tratamiento previo). Por lo tanto, la inyección intravenosa de una dosis única (15 mg/kg) de TMC-2206 humanizado no indujo un aumento en la expresión de citoquinas implicadas en la inflamación
Tabla 44
Cit.
Tiempo Sin tratamiento previo (n = J) Vehículo (n ' 3) IgG4 (15mglkg) =6) (n huTMC-2206 (15mg/kg) (n 6) :lE LPS (0,75 mg/kg) (n = 4) Valores P, ANOVA de 2 vías
Il-1a
2-hr 6 1 ± 30 84±37 75± 29 133:±66 788 ± 550 1,00
Aunque la invención ha sido descrita en la presente memoria con referencia a realizaciones concretas, se debe entender que estas realizaciones son meramente ilustrativas de diversos aspectos de la invención
LISTA DE SECUENCIAS
<110> CHROMOS MOLECULAR SYSTEMS INe. LAZARIDES, Elias WOODS, Catherine BERNARD,Mark
<120> ANTICUERPOS ANTI-INTEGRINA ALFA 2 Y SUS USOS
<130> 14575.2
<150> US 60f738 ,303
<151> 2005-1 1-18
<160> 186
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_ MISC
<223> hCDR1 [CDR1 de la reg ión variable de cadena pesada]
<400> 1
Gl y Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gl y rle His 1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO MISC
<223> hCDR2 [CDR2 de la región variable de cadena pesada]
<400> 2
Val Ile Trp Ala Aeg Gly Phe Thr Asp. Tyr Asn Ser A.la Leu Het Ser 1 5 10 15
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> hCDR3 [CDR3 de la reg ión variable de cadena pesada]
<400> 3
Al a Asn A,p Gly Val Tye Tye Ala Met. A, p Tyr 1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> 1CDR1 [CDR1 de la región variable de cadena ligera)
<400> 4
Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile His 1 5 10
<210>5 <211>7
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO MiSe
<223> 1CDR2 [CDR2 de la región variable de cadena ligera]
<400> 5
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 ,
<210> 6
<211>9
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> 1CDR3 [CDR3 de la región variable de cadena ligera]
<400> 6
Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 1 5
<210> 7
<211> 5361
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ADN de integrina alfa2 humana
<400> 7
ctgcaaaccc agcgcaacta cggtcccccg gtcagaccca ggatgqggcc agaacgqaca
qqgqccgcgc cgctgccgct gctqctggtg ttagcqctca gtcaaggcat tttaaattgt 120 tgtttggcct acaatgttgg tctcccagaa gcaaaaatat tttccqgtcc ttc.!,tl:gtgaa 180 cagtttgggt <ltgc<lgtqca gcagttti!lta aatccaaaag gca"ctgqtt actggttggt 240 tCi!lccctqga gtggctttcc tg"gaaccga atgggaqatg tgtat"aa.tg tcctgttg"c 300 ctatccactg ccacatgtga aaaactaaat tt:gcai!lactt caacaagcat tccaaatgtt 360 actgaCjlatga aaaccaacat gagcctcggc: ttgatc:c:tca ccaggaacat gggaactgga 420 ggttttctca catgtggtcc tctgtgggca c<lgcaatgtg ggaatcagta ttacacaacg .80 99t9t9tgtt ctgacii!ltcaq tcctgatttt caqctctcag ccagcttctc acctgcaact 540 cagccctgcc cttccctcat aCjlatgttgt:g gttgtgtgtg atgaatcaaa tagtii!ltttat 600 ccttqqgatg cagtaaagaa ttttttgg"a aaatttgtac aaggccttga tataggcccc 660 acaaagacac aqgtgqggtt aattcagta.t qccaataatc caagagttgt gtttaacttg 720 aacacatata aaaccaaagao aqaaatgatt gtagcaacat cccagacatc ccaatatggt '"O qgggacctca caaacacatt cqqagcaatt caatatqcaa gaaaatatgc ctattcagca 840 gcttctggt.g ggcgacgaa9 tgctacgaaa qtaatggtag ttgtaactga cggtgaatca 900 catg8tggtt caatgtt:ga8 agctgtgatt gatcaatgca accatgac:aa tatac:tgag9 960 tttggc:atag c:agttcttgg gtacttaaac agaaacgccc ttgatactaa aaatttaata L020 aaagaaataa aagcgatcgc tagtattcca acagaaagat actttttcaa tgtgtctgat 1080 gaagcagctc tactagaaaa ggctgggaca ttaggagaac ilaattttcag c:attgaaggt 1140 actgttcaag gaggagacaa ctttcagatg gaaatgtcac aagtgggatt cagtgcagat 1200 tactcttctc llaaat9óltólt tCtgóltgctg ggtgCólgtgg gólgcttttgg ctggagtggg 1260 accattgtcc agaagacatc tcatggccat ttgatcttt.c ctaaacaagc ctttgilccaa 1320 attctgcagg acagaailtca cagttcatat ttaggttact ctgtggctgc aatttctact 1380 ggagaaagca ctc:actttgt tgctggtgct cctcg99caa attataccgg ccag8tagtg :' 440 ctatatagtg tgaatgagaa tggcaatatc acggttattc aggctcaccg aggtgaccag :_500 attggc:tcct attttggtag tqtgctgtgt tCagttgatg t9gataaaga caccattaca :'560 gacgtgctct tggtaggtgc accaatgtac atgagtgacc taaagaaaga ggólaggaaga ~620 gtctacctgt ttactatcaa aaagggcat t t tgQgtcagc acc:aatttc:t tgaaggcc:cc: 1680 ga9ggcattg aaaacactcq atttggttca gcaattgcag ctctttcaga catcaacatg 1.740
gatggct1:1:a a1:g8tg1:ga1: t9tt9gttca ccac1:agaaa a1:cagaattc 1:g9a9ct9ta 1800
tacatttaca atgg1:catca gqgc.1ctatc cgCóJc.1.:lagt attcccag.1a a3tC1:1:g9ga 1860 tcc9a1:ggag cct1:1:aggag ccatctccag tacl:tt999a ggtccttgqa 1:qgctatgga 1920 gat1:taaat9 gggattccat caccgatgtg tctattggtg cctttggaca agtggttcaa 1980 ctct99tcac aaagtattgc tgatgtagct a1:a9aagctt cattc.1cacc agaaaaaatc 2040 aottt99tCa acaagaatgc tca9ata4tt ctC¡laactct 9cttc.19tgc aaagttcaga 2100 cctactaagc aaaacaatca agtggcoatt gtal:acaaca tcacaC1:tga tgco.gatggo. 2160 ttttc3tcca gagtaacctc caggg99tta tttaaagaaa acaatgaaag gtgcctgca9 2220 aagaatatgg tagtaaatca agcacagagt tgcl:ccgagc aC;l.tc.1ttta t8tacaggag Z280 ccctct9at9 ttgtca;l.ctc ttt99att1:9 c9t9t99ac8 tcagtctgga a8accctggc 2340 ;l.ctagccctg cccttgaagc ctattctg.1g actqccaagg tcttcagtat tcctttcc.1C HOO aaagact9t9 9tga9gat99 8:Ctttgc3tt tctl~atct3g tccta9atgt ccgacaaata 2460 cc.agctgctc: aagaac:aacc ctttattgtc agcaaccaaa acaaaaggtt aacattttca 2520 gt.1acactga aaaataaaag 9gaaagtgca tac;lacactg gaattgttgt tgatttttca 2580 gaaaacttgt tttttgcatc attc:tcccta ccg~~ttgat9 g9aoa9aa9t aac.1tgocag :2 640 gtggctgcat ctcagaagtc tgttgcctgc gat9t8ggct acoctgcttt aaagagagaa :noo caaca9gtga ct1:ttactat taactttgac ttc;,.1tcttc a,¡¡,a.1ccttca 9;1.iltCilggCg 2160 tctctcagtt tcc.1.1gcctt .1agtga.1.1gc c.1.1qaaga.1a .1caaggctga taattt99t C 2820 aacctcaa.1il ttcctctcct gtatgatgct gaail1:tcact taacaagatc taccaacilta 2880 .1atttt1:atg aa.1tctcttc ggat9gg.1at gttccttcaa tcgtgcac.1g ttttgilagat 2940 gttggtccaa aattc8tctt ctccctgaag gta;!caac.1g gaagtgttcc agtaagcatq 3000 gcaactgtaa tcatcc.1cat ccctcagtat acc;!aagaaa agaacccact gatgtaccta 3060 actggqqtgc aaacaqilcaa ggctggtgac atcaqttgta atgcagatat caatccactq 3120 aaaatagg8c aaacatcttc ttctgtatct ttcaaaagtg aaaatttCilq gcacaccaaa Jl80 gaattgaact <jcagallctgc ttcetgtaqt aatqt tacet gctgqttgaa agacqt tc8c 3240 o.tqao.o.gg;l.q ailtóilctttgt l'hltglgdCt acc'lqao.t t t <j"9;1.acgggac tttc9catca 3300 tc:aacgttcc agacagtac:a gctaacggca gct1}cagilaa tcaacilccta taac:cctgag ])60 atatat9tqa ttgaagataa cactgttacg a t t,:ccctga tgataatgaa .1cct9atga9 1420 aaaogcc<jaoaq t accaoaocaqq aqttataoata qqao"qtataa tt9ct<,lgo.at ccttttgctg 3480 ttagctctgg tt9ca8tttt "t99889ctc ggclttcttca "aagaaaata tqaaaaqaotg )540 accaaaaatc cagatqagat tgatqagacc ac.19agctca gtaqctgaac c.1gcagacct 3600
acctgcagtq qqaaccqqca qcatcccagc cagqgtttgc tqtttgcgtg catggatttc 3660
tttttaaatc ccatattttt tttatcatgt cgt.aqqtaaa ctaacct9qt attttaagéig 3720 ilaaactgcaq gtcaqttt 99 atqaaqaaat tqtqggqggt Q'g9gQ'aggtg cggggggcag 3780 gtagggaaat aatagggaaa atacctattt tatatg",tgg gggaaaaaaa gtaatcttta 3840 aClct99ctg9 cccClgagttt aCClttct;¡¡at ttgcattgtg tCilgaailcilt gaaatgcttc 3900 caagcatgac aacttttaaa gaaaaatatg atactctcag attttaagg9 ggaaaactgt 3960 tctctttaaa atatttgtct ttaaacagca actacagaag tg9aagtgct tqatatgtaa 4020 gtacttccac ttgtgtatat tttaatgaat attgatgtta acaaqaggg9 aaaacaaaac 4080 acaggttttt tcaatttatg ctgctcatcc aaaqttgcca cagatgatac ttccaaqtga 4140 taatttlat.t tataaactag gtaaaatttg ttgttggttc cttttatacc acggctgccc 4200 cttccacacc ccatcttgct ctaatgatca aaacatgctt gaataactqa gcttagagta ~260 tacctcctilt atqtccattt aagttaggag agggggcgat atagagacta aggcacaaaa 020 ttttgtttaa aactcagaat ataacattta tgtaaaatcc catctgctag aagcccatcc B80 tgtgccaqag gaaggaaaag gaqgaaattt cctttctctt ttaggaqqca caacaqttct -1440 cttctagg"t ttgtttggct gactggcagt aaccta9tga atttttqaaa q"tgagtaat 4500 ttctttggca accttcctcc tcccttactg aaecaet.ctc ccacet.cetg gtggtaeeat ·1560 tattatagaa qccctctaca gcctgacttt ctctccagcg gtccaaagtt atcc:cctcct a20 ttacccctca tccaaagttc ccactcettc aggacagc tg ctgtqcatta gatat.taggg ·1680 gggaaaqtca tctgtttaat ttacacactt gcatgaatta ctgtatataa actccttaac .J740 ttcagggagc tattttcatt tagtgctaaa caaqtaagaa aaataagcta gagtqaattt 4800 ctaaatgttg gaatgttatg gqatgtaaac aatqtClaagt aaaacactct ca......CltttCiJ 4860 ccagaagtta cagatgaggc actggaaacc accaccaaat tagcaggtgc aecttccgtg -1920 gctgtcttgt ttctgaagta cttttt cttc cacaagagtg aatttgacct aggcaagt tt ·1980 gttcailugg tagatCctga gatgatttgg tcagattg99 ataa9gccca gcu.tctgcil !:I040 ttttaacaag caccccagtc actaggatgc agatqgacca cactttqaqa aacaccaccc S100 atttctaett tttqcacctt attttctctg ttcctgagcc cccacattct ctilgqagaaa ~,160 cttagatt.l.l aattc.ac.aga cact.acatilt cta.lagcttt gacaagtcct tgacctctat ;;220 aaacttcaga gtcctcattll taaalltggga agacLglIgct ggagt tcagc agtglltgctt ;;280 tttagtt tta aaagtctatg acctgatctg gacttcctat aatacaaata cacaatectc 'i340 caagaatttg acttg9aaaa 9 :;361
<210> 8
<211> 1181
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> Integrina alfa2 humana
<400> 8
Met Gly Pro Glu Arg Thr Gly Ala Jl.la Pro Leu Pro J,eu Leu Leu Val 1 S "lO 15
Leu Ala Leu Ser Gln Gly Ile Leu Asn Cys Cys Leu Ala Tyr Asn Val 20 25 30
Gly Leu Pro Glu Ala Lys Ile Phe Ser Gly Pro Ser Ser Glu Gln Phe 35 40 45
Gly Tyr Ala Val Gln Gln Phe Ile Asn Pro Lys Gly Asn Trp Leu Leu 50 55 60
Val Gly Ser Pro Trp Ser Gly Phc Pro Glu Asn Arg Mct Gly Asp Val 65 70 15 80
Tyr Lys Cys Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Thr Cys Glu Lys Leu Asn 85 90 95
Leu Gln Thr Ser Thr Ser lle Pro Aso Val Thr Glu Met Lys Thr Jl.sn 100 105 110
Mal Ser Leu Gly Leu Ile Leu Thr Arg Aso Mal Gly Thr Gly Gly Phe 115 120 125
Leu Thr Cys Gly Pro Leu Trp Ala Gln Gln Cys Gly Asn Gln Tyr Tyr 130 135 140
Thr Thr Gly Va l Cys Ser Asp Ilc Ser PrO Asp Phe Gln Leu Ser Ala 145 150 155 160
Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro Cys Pro Ser Leu I le Asp Val Val 165 170 175
Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys 180 185 190
Asn Phe Leu Gl u Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp rle Gly Peo The Lys
195 200 205
Thr Gln val Gly Leu Ile Gln Tye Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe 210 215 220
A,n Leu A.sn Thr Tyr Lys The Lys Glu Glu He' Ile Val Ala Thr Ser 225 230 235 240
Gln The Ser Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala He 245 250 255
Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tye Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arq Acg 260 265 2'0
Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp 215 280 285
Gly Ser Met Leu Lys Ala Val lle Atlp Gln Cys ~n lIi s Asp Asn rle 290 295 300
Leu Arg Phe Gly 1le Ala Val Leu Gly Tyr Leu Asn Aeg Asn Ala Leu 305 310 315 320
Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu Ile Lys Ala lle Ala Ser 11. Pro 325 330 335
Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu 340 3<5 350
Lys Ala Gly Thr Leu Cly Glu Cl n Ile Phe Ser lle Clu Gly Thr Val 355 360 365
Gln e ly Gly Asp Asn Phe Gln Met Glu Met Ser Gln val ely Phe Ser 370 375 360
Ala Asp Tyr Ser Ser eln Asn Asp Ile Leu He< Leu Gly Ala Val Gly
385 390 .00
"5
Ala Phc ely Trp Ser ely Thr Ile Val eln Lys Thr Ser His ely His
.05 410 415
Leu Ile Phe pro Lys Gln Ala Phe Asp Gln lle Leu eln Asp Arg Asn <20 <25 <30
Mis Ser Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Ala Ala Ile Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Ser Thr His Phe Val Ala Gly Ala Pro Arg Ala Asn Tyr Thr Gly Gl" 450 455 460
11e Val Leu Tyr Ser Val As" Glu Asn Gly As" l1e Thr Val I le Gln 465 410 415 480
Ala His Arg Gly Asp Gln Ile Gly Ser Tyr Poe Gly Ser V~l Leu Cys 485 490 495
_nl_hl_~_n,'l.n,_nl~~nlGly
500 505 510
Ala Pro Met Tyr Met Ser Asp Leu Lys Lys elu Glu ely ~rq Val Tyr 515 520 525
Leu Phe Thr 11e Lys Lys ely Ile Leu Gly Gln His Gln Phe Leu Glu 530 535 540
ely Pro elu Gly 11e Glu Asn Thr Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Ala 545 550 555 560
Leu Ser Asp Ile Asn Met Asp Gly Phe Asn ASp Val Ile Val Gly Ser 565 510 575
Pro Leu Glu Asn Gln Asn Ser Gly Ala Val Tyr Ile Tyr Asn Cly His 580 585 590
Gln Gly Thr Ile Arg Thr Ly5 Tyr Ser Gln LY5 ¡le Leu Gly Ser ~p 595 600 605
Gly Ala Phe Arg Ser His Leu Gln Tyr Poe Gly Arq Ser Leu Asp Gly 610 615 620
Tyr Gly Asp Leu Asn Gly Asp Ser !le Thr Asp Val Ser !le Gly Ala 625 630 635 640
Phe Gly Gln Val Val Cln Leu Trp Ser Gln Ser Ile Ala Asp Val Ala 645 650 655
Ile Glu Ala Ser Phe Thr Pro Glu Lys Ile Thr Leu Val Asn Lys Asn 660 665 610
Ala Gln 1le Ile Leu Lys Leu Cy5 Phe Ser Ala Lys Phe Arg Pro Thr
6" 6" 6"
Gln Asn Aso Gln Val Al. 11e Val Tyr Asn Ue Thr Leu Asp Ala
.., 700
"O
Asp Gly Phe Ser Ser Arg Val Thr Ser Arg Gly Leu Phe Lys Glu Asn 705 710 715 720
Asn Glu Arg Cys Leu Gln Lys As n Met Val Val As n Gln Ala Gln Ser 725 730 735
Cys Pro Glu His Ile Ile Tye Ile Gln Glu Pro Ser Asp Val Val Asn 140 745 750
Ser Leu Asp Leu Arg Val Asp 'lo Ser Leu Glu Aso Pro Gly Thr Ser 75> 760 765
Pro Ala Leu Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Ala Ly4 Val Phe Ser Ile Pro 770 775 780
Phe His Lys 1\.sp Cys Gly Glu Asp Gly Leu Cy' lle Ser Asp Leu V" 785 790 795 '00
Leu Asp Val 1\.rg Gln Ile Pro Ala Ala Glo Glu Glo Pro Phe Ilc Val 805 BIO 815
Ser Asn Gln Aso Lys Arg Leu Thr Phe Ser Val Thr Leu Lys Asn Lys 820 825 830
Arg Glu Ser Ala Tyr Asn Thr Gly Ile Val Val Asp Phe Ser Glu Aso 835 840 845
Leu Phe Phe Ala Ser ?he Ser Leu Pro Val Asp Gly Thr Glu Val Thr 850 855 860
Gln Val Ala Ala Ser Gln Lys Ser Val Ala Cys Asp Val Gly Tyr
Pro Ala Leu Lys Arg Glu Gln Glo Val Thr Phe Thr Ile Asn Phe Asp 885 890 895
Phe As n Leu Gln Asn Leu Gln Aso Gln Ala Ser Leu Ser Phe Gln Ala '00 '05
"0
Leu Ser Glu Ser Gln Giu Giu Asn Lys Ala Asp Aso Leu Val Asn Leu 915 920 925
Lys Ile Pro Leu Leu Tyr Asp Al~ Glu Ile Mis Leu Thr Arg Ser Thr 930 935 940
Asn 11e Asn fhe Tyr Glu 11e Ser Ser Asp Gly Asn V41 Pro Ser Ile 945 950 955 960
Val His Ser Phe Glu Asp Val Gly Pro Lys Phe Ile Phe Ser Leu Lys 965 970 975
Val Thr Thr Gly Ser Val Pro Val Ser Met Ala Thr Val 11e 1le Mis 980 98S 990
lle Pro Gln Tyr Thr Lys Glu Lys Asn Pro Leu Met Tyr Leu Thr Gly 995 1000 1005
Val Gln Thr Asp Lys Ala Gly Asp Ile Ser Cys Asn Ala ASp l1e 1010 1015 t02<l
Asn Pro Leu Lys rIe Gly Gln Thr Ser Ser Ser Yal Ser Phe Lys 1025 1030 1035
Ser Glu Asn Phe Arg His Thr Lys Glu Leu Asn Cys Arg Thr Ala 1040 1045 lOSO
Ser Cys Ser Aso Yal Thr Cys Trp Leu Lys Asp Yal Mis Mct Lys 1055 1060 1065
Gly Glu Tye Phe Val Asn Val the Thr Arg Ile Trp Asn Gly thr 1070 1075 1080
Phe Ala Ser Ser Thr Phe Gln Thr Val Gln Leu Thr Ala Ala Ala 1085 1090 1095
Glu 11e Asn Thr Tyr Aso Pro GIu Ile Tyr Yal Ile GIu Asp Asn 1100 1105 1110
Thr Val Thr Ile Pro Leu Met Ile Met Lys Pro Asp Glu Lys Ala 1115 1120 1125
Glu val Pro Thr Gly Val 11e Ile Gl y Ser Ile Ile Ala Gly Ile 1130 1135 1140
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Ala Ile Leu Trp Lys Leu Gly Phe 1145 1150 1155
Phe Lys Arg Lys Tyr Glu Lys Met Thr Lys Asn Pro Asp Glu 11e 1160 ll65 11,0
Asp Glu Thr Thr Glu Leu Ser Ser 1175 1190
<210> 9
<211> 3700
5 <212> AON
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<223> ADN de integrina bela1 humana 5 <:400> 9 agccgccgcc acccgccqcg cccg~caccc g99a99CCcc gccaqcccgc gggagaggcc 60 cagcgggagt cqc9g~~cag caggcccgag cccaccgcgc cgggccccgg acgccgcqcg 120 gaaaagatga atttacaacc aattttctgg attggactga tcagttcagt ttgctgt gtg 180 tttgctcaaa cagatgaaaa tagatgttta aaagcaaatg ccaaatcatg tggagaatgt 240 atacaaqcaq qgccaaattg t999t99tgc acaaattc&a cattt.tt....ca 9gaaggaatg 300 cctacttctg cacgatgtga tgatttagaa gcctt.aaaaa agaa9ggtt 9 ccctccagat 360 gacatagaaa atcccagagg ctccaaagat ataaagaaaa ataaaaatgt aaccaaccgt 420 agcaaaggaa cagcagagaa gctcaagcca gaggatatta ctcagatcca accacagcag 480 ttggttttgc gattaagatc aggggagcca cagacattta cattaaaatt caagagagct 540 ga...gactatc ccattgacct Cl:actacctt atggacctgt cttactcaat gaaagacgat 600 ttggagaatg taaaaagtct tggaacagat ctgatgaat.g aaatgaggag gatt.acttcg 660 gact.tcagaa t.tggatttgg ctcatttgtg gaaaagactg tgatgcctta cattagcaca 720 acaccagct:a agctcaggaa cccttgcaca agtgaacaga actgcaccag cccatttagc 780 tacaaaaatg tgctcagtct tactaataaa ggagaagtat ttaatgaact tgttgqaaaa 840 cagcgcatat ctggaaattt ggattctcca gaaggt.ggtt tcgatgccat catgcaagtt 900 gcagtt:tqtg gatcactgat t99c tggagg aatgttacac ggctgctggt gttt.tccaCa 960 gatgccgggt ttcactttgc t.9ga gatggg aa.actt9gt9 gcattgtttt accaaa~gat 1020 g9acaatgtc acctggaaaa taatatgtac ac-aatgagcc attattatga ttatccttct 1080 attgctcacc ttgtccagaa actgagtqaa aataatattc agacaatttt tgcllgttact L14 0 gaagaatttc agcctqttta caagqagctg aaaaacttga tccctaaqtc agcagtaqga 1. 200
acattatctg caaattctag caatgtaatt cagrttgatca ttgatqcata caattccctt 1260
tcctcagaag tcatttt:gga aaacggcaaa ttg'tcagaaq gagtaacaat aagttacaaa 1320 tcttactgca agaacggggt gaatggaaca qgg'gllaaatg gaaqaaaatg ttccaatatt 1380 tccattggag atgagqttca atttgaaatt aqcataactt caaataaqtg tccaaaaaag 1440 gattctgaca gctttaaaat taggcctctg ggctttacgg aggaagtaga ggttattctt: 1500 caqtacatct gtgaatgtga atgccaaagc gaa.9'gcatcc ctgaaagtcc caagtgtcat 1560 gaaggaaatg gg/'lcatttga 9t9tg9cgc9 tgcaggtgca atgaa9g9c9 tgttggtaga 1620 catt9tgaat gcagcaca9a tgaagttaac a9tgaagaca tqqatgctta c:tgcaggaaa 1690 gaaaacagtt cagaaatctg cagtaacaat qga,gagtgcg tctgcggaca gtgtgtttgt 1740 aggaagaggg ataatacaaa tgaaatttat tctggcaaat t ctgcgagtg tgataatttc 1800 aactgtgatll gatccaatgg cttaatttgt gga,9qaaatq 9t9ttt gcaa gtgtcgtgtg 1860 tgtgagtgca accccaacta cactggcagt gca,tgtgact qttctttgga tactagtact ,1920 tgtgaagcca 9caacggaca gatctgcaat 99C:C99ggca tctgcgagtg tggt9tct9t 1980 aagtgtacag atccgaagtt tcaagggcaa acgrtgtgaga tgtgtcagac ctgccttggt 2040 gtctgtgctg agcataaaga atgtgttcag t9c:agagcct tcaataaa9g agaaaagaaa 2100 gacacatgca cacaggaatg ttcctatttc aac:attacca aggtagaaag tC999acaaa 2160 ttaccccagc c9gtccaacc tqatcctgtg tcc:cattgta aggagaagga tgttgacgac 2220 tgttggttct attttacgta ttcagtgaat gg9'aacallcg IIggt.catggt tcatgtt9t q ;!280 gagaatccag aqtgtcccac tggt.cClIgac atc:at tccaa ttgtagctgg tgtggttgct 2340 g9aattqttc t tattqqcct tgcattactg ctgatatqga agcttctaat 9ataattcat :! 400 9a caqaaggg agtttgctaa atttgaaaag gagraaaatga a.tqccaa.atq qga.eaegggt :!460 qaaaatccta tttataagag tqccgtaaca act,gtggtca atccgaagta tgag9gaaaa 2520 tgagtactgc ccqtgcaaat ccca.caac:ac tga,atgcaaa qtagcaattt ccatagt:cac :!580 aqttaggtllg cltta9ggca atattqccat ggt,tttactc atgtgcaggt tttgaaaatq :!640 tacaatatgt a t aattttta aaatgtttta tta,ttttgaa aataatgttg taattcatgc :!100 cagggactqa ca.aaagactt gagacaggat ggttattctt gtcagctaaq gtcacllttgl n60 gcctttttga ccttttcttc ctggactatt qaa,atcaagc ttattggatt aagtgatatt :!820 tctatagcga ttgaaagqgc aatagttaaa gtaatqagca tgatgagagt ttctgttaat ;:880 catgtattaa aactgatttt: tagcttta.cll aat atgtcag tttgcagtta tgca.gaa.tcc ;~940 aaagtaaatq tcctqctagc tagttaagqa ttg'ttttaaa tctgttattt tqctatttgc ;1000
ctgttaqaca tgactqatga catatctgaa agacaagtat gttgaqagtt gctggtgtaa 3060 aatac9ttt9 aaatagttga tctacaaagg ccat9ggaaa aattcagaga 9ttag9aagg 3120 aaaaaccaat agctttaaaa cctgtgtgcc attttaagag ttacttaatg ttt9gtaact 3190 tttatgcctt cactttacaa a~tcaagcct tagataaaag aaccgagcaa ttttctgcta 3240 aaaagtcctt gatttagcac tstttacsta ca9gccatac tttacaaagt atttgctgaa 3300 tg999acctt ttgagttgaa t~tattttat tatttttatt ttgtttaatg tctggtgctt 3360 tctatcacct cttctaatct tttaatgtat ttgtttgcaa ttttggggta agactttttt 3420 atgagtactt tttctttgaa gttttagcgg tcaatttgcc tttttaatga acatgtgaag 3490 ttatactgtg gctatgcaac agctctcacc tacgcgagtc ttactttgag ttagtgccat 3540 aacagaccac tgtatgttta cttctcacca tttgagttgc ccatcttgtt tcacactagt 3600 cacattcttg ttttaagtgc ctttagtttt aacagttcac tttttacagt gctatttact 3660 gaagttattt attaaatatg cctaaaatac ttaaatcgga 3700
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<223> Integrina beta1 humana
<400> 10
Met Asn Leu Gln Pro ¡le Phe Trp ¡le Gly Leu ¡le Ser Ser Val Cys l 5 10 15
Cys Val Phe Ala Gln Thr Asp Glu Asn Arg Cys Leu Lys Ala Asn Ala 20 25 30
Lys Ser Cys Gly Glu Cys lle Gln Ala Gly Pro Asn Cys Gly Trp Cys 3S 10 45
Thr Asn Ser Thr Phe Leu Gln Glu Gly Met Pro Thr Ser Ala Arq Cys 50 55 60
Asp Asp Leu Glu Ala Leu Lys Lys Lys Gly Cys Pro Pro Asp Asp Ile
65 70 75 90
Glu Asn Pro Arg Gly Ser Lys Asp Ile Lys Lys Asn Lys Asn Val Thr 10 85 90 95
Aso Arg Ser Lys Gly Thr Ala Glu Ly5 1.eu Lys Pro Glu Asp He Thr
100 105 110
Gln Ile Glo Pro Gln Glo Leu Val L@u ."'rg L@u Arq Sar GIl' Glu Pro 115 120 125
Glo Thr Phe Thr Leu Lys Phe Lys Arg ;!\.la Glu ",p Tyr Pro Ile ASp 130 135 140
Leu Tyr Tyr Leu Met Aop Leu Ser Tyr Ser ..., Lys Asp Asp Leu Glu 145 150 155 160
Asn Val Lys Ser Leu Gly Thr Asp Leu l'Iet Aso Glu Met Arg Arg Ile 165 170 175
Thr Ser Asp Phe Arg Ile Gly Phe Gly :Ser Phe Val Glu Ly, Thr Val 180 185 190
Met Pro Tyr Ile Ser Thr Thr Pro Ala I.ys Leu Arq Asn Pro CyS Thr 195 200 205
Ser Glu Gln Asn Cys 1hr Ser Pro Phe Ser 1yr Ly' Aso Val Leu Ser 210 215 220
Leu Thr Asn Lys GIl' Glu Va 1 Phe Aso 1:;1u Val GIl' Lys Gln Ar. 225 230 2. O
Ile Ser GIl' Aso Leu Asp Ser Pro Glu GIl' GIl' Phe Asp Ala He Me' 245 250 25'
Glo Val Ala Val Cys GIl' Ser Leu 11a 1:;11' Trp Arg Asn Val Thr Arg 260 265 270
Leu Leu Val Phc Ser 1he Asp Alil GIl' Phe His Phe A" GIl' Asp GIl' lOS 280 285
Lys Leu GIl' GIl' Ile Val Leu Pro Aso ;I\.sp Gly Glo Cys lIis Leu Glu 290 295 300
Asn Asn Met 1ye Thr Met Ser His Tyr ~ryr ASp Tyr Pro Ser 11e Ah 305 310 315 320
Hi:s Leu val G~n Ioys Lo;tu sec Glu A=m ¡lUIn rle Gln ThC l~e PhI! Al~
325 :330 335 Val Thr Glu Glu Phe Gln Pro Val 1yr Lys Glu Leu Lys Aso Leu Ile
3.0 3'5 350
Pro Lys Ser Ala val Gly Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Asn Val ¡le 355 360 365
Gln Leu tIe ¡le Asp Ala Tye AsO Ser Leu Ser Ser Glu Val ¡le Leu 370 375 380
Glu Asn Gly Lys Leu Ser Glu Cly Val Thr ¡le Ser Tye Lys Ser Tye 385 J~O 395 400
Cys Lys ASO Cly Val Asn Gly Thr Gly Glu Asn Gly Arg Lys Cys Ser 405 410 415
Asn Ile Ser Ile Gly Asp Glu Val eln Phe Glu Ile Ser lle Thr Ser 420 425 430
Asn Lys Cys Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Phe Lys Ile Arq Pro Leu 435 440 445
Gly Phe Thr Glu Glu Val Glu Val lle Leu Gln Tye Ile Cys Glu Cys 450 455 460
Glu Cys eln Ser Glu Gly l le Pro Glu Ser Pro Lys Cys His Glu Gly 465 470 475 480
_m.Thr_~~ru••la~_~b.ruum._hl
485 490 495
Gly Arg His Cys Glu Cys Ser Thr Asp Glu Val Asn Ser Glu Asp Met 500 505 510
~p Ala Tye Cys Arg Lys Glu Asn Ser S~r Glu Ile Cys Ser Asn Asn 515 520 525
Gly Glu Cys Val Cys Gly Gln Cys Val Cys Arg Lys Arg Asp Asn Thr 530 535 540
Asn Glu ¡le T~r Ser Gly ~_~G~~M.M. __ ~ 545 550 555 560
A3p Axq Ser A3n Gly Leu Ile Cy5 Gly Gly A3n Gly Val Cy3 Ly3 Cy3 565 510 515
Arg Val Cys Glu Cys Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Ser Ala Cys Asp Cys 580 565 590
Ser Leu Asp ~hr Ser Thr Cys Glu Ala Ser Asn Gly Gln Ile Cys Asn
595 600 605
Gly Arg Gly Ile Cys Glu Cys Gly Val Cys Lys Cys Thr Asp Pr o Lys 610 615 620
Phe Gln Gly e ln Thr Cys Glu Met Cys Gln Thr Cys Leu Gly Val Cys 625 630 635 640
Ala Glu Mis Lys elu Cys Val Gln Cys Arg Ala Phe Asn Lys ely Glu 645 650 655
Lys Lys Asp Thr Cys Thr Gln Glu Cys Ser Tyr Phe Asn ¡le Thr Lys 660 665 670
Val Glu Ser Arg Asp Lys Leu Pro Gln Pro val Gln Pro Asp Pro Val 675 680 685
Ser His Cys Lys Glu Lys Asp Val Asp As p Cy s Trp Phe Tyr Phe Thr 690 695 700
Tyr Ser Val Asn Gly Asn Asn Glu Val Met Val His Val Val Glu Asn 70S 110 715 720
Pro Glu Cys Pro Thr Gly Pro Asp Ile Ile Pro Ile Val Ala Gly Yal 725 730 735
Yal Ala Gly Ile Val Leu Ile Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ile Trp Lys 740 745 750
Leu Leu Met Ile Ile Mis Asp Arg Arg Clu Phe Ala Lys Phc Glu Lys 755 760 765
Glu Lys Met Asn Ala Lys Trp Asp Thr Cly Glu Asn Pro Ile Tyr Lys 770 775 780
Ser Ala Val Thr Thr Val Val Asn Pro Lys Tyr Glu Gly Lys 785 790 795
<210> 11
<211> 226
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_M iSe
<223> Domin io I alfa2 humano
<400> 11
Ser Fro Asp Fhe Gln Leu Ser Ala Ser Pr-e Ser Pro Ala Thr Gln Pro 1 S 10 15
Cys Fro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser 20 25 30
¡le TVr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln 3S 40 45
Gly Leu Asp lle Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val G1y Leu I1e Gln Tyr 50 55 ~
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr LVS 65 70 75 80
Glu Glu Met Ile Val Al~ The Ser Gln The Ser Glo Tyr Gly Glv Asp 85 90 95
Leu Thr Asn The Phe Gly Ala lle Glo Tye Ala Arg Lys Tyr Ala Tye 100 105 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val 115 120 125
Val Thr Asp Gly G1u Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Yal Ile 130 135 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn lle Leu Arg Phe Gly Ile Ala Yal Leu 145 150 155 160
Gly Tye Leu Asn Arg Asn Al~ Leu Asp Thr Lys Asn Leu 11e Lys Glu 165 170 1?5
Ile ~ys Ala lle Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tye Phe Phe Aso val 180 185 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly elu eln 195 200 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val Cln G1y Cly Asp Aso Phe Gln Met 210 215 220
Glu Met
<210> 12
5 <211>71
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> FW1-3 4-59 [FW=1-25; FW2=26-39; FW3=40-71]
<400> 12
Gln
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro ser Gl u
1
5 10 15
Thr
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp I le Arg Gln Pro Pro Gly
20
25 30
Lys Gly Leu Glu
Trp ¡le Gly Arg Val Thr I l e Ser Val Asp Thr Ser
35
40 45
Lys
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
50
55 60
Ala Val
Tyr Tyr Cys Ala Arq
65
70
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
5
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> FW4 4-59 [entrada NCSI gif33583]
<400> 13
Trp Gly Gln
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
10
1 5
10
<210> 14
<211>27
<212> AON
<213> Horno Sapiens
15
<220>
<221> rasgo_mise
<223> VHL-for [cebador directo]
<400> 14
ccatggclgl ctlggggclg ctctlcl
27
20
<210> 15
<211>17
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
25
<221> rasgo_mise
<223> He-rev [cebador inverso]
<400> 15
ggggccagtg gatagac
17
<210> 16
30
<211> 28
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
105
<221> rasgo_mise
<223> VLL-for [cebador directo]
<400> 16
ccatggatlt tcaagtgcag atltlcag 28 5 <210> 17 <211>17
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
10 <221> rasgo_mise
<223> LCkappa-rev [cebador inverso]
<400> 17
gtlggtgcag catcagc 17
<210> 18 15 <211> 318
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise 20 <223> TMC-2206 VL
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 18
c•• tu 'u ctc .cc c., tct cc. 'c. ttc tt, tct ,ct tct cc. go, .S Gln Phe v.l Leu Th, Gl n Se' "o Al. Phe Leu Se, Al. Se< "O Gly 1 5 la 15
,., ,., , t c ,cc .t, .cc t,c .,t ,cc .,c tc, "t ,t, aot tac ott Glu Ly. vo< Th, Het Thc Cy. So< Al. Aan se, Se, Val Aan Ty' Il. " 20 2S 30
... ... tgg aU
cac tgg t.e c.g cag aag tc. ggc .cc tcc ccc ta< l4<
lIis T'p Tyr Gln Gln Ly. Sec Gly Th, Se' p,o Ly. .Lys T,p He Ty' 35 40 45
qac: .ct tce aa. e<g get tct gg' gtc cct gU cgc tte .gt ggc .gt lO' Asp Th, Ser Lyo Lou Al. Ser Gly V.l Pro V.l A,g Phe Su Gly Se, 50 55 60
gg' tct ggg • cc tct t.c tct ctc .c• ",c .gc .gc .tg g.g oct g.g 240 Gly Ser Gly Thr Ser Ty' Ser Leu Th, Ue Se, Se, Met Glu Th' Glu 65 70 75 .0
gat gct gce .e< tat tac tgc c.g e.g tg. .ct .ct ••c cc. ctc .cg 2B. A,p Al. Ala Th, Ty, Ty, Cy, Gln Gln "p Th, Th, A,n p,o Lou Th, 85 'O
"
ttc ggt gct ggg .cc .gg gtg g.g ctg ... 318 Phe Gly Al. Gly Th, Ar. Val Gl u Leu Ly, 25 100 lOS
<210> 19
<211> 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<400> 19
Gl~ Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Ly~ Val Thr Met ~hr Cy~ Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn ~yr t~e 20 25 30
His Trp Tye Oln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 'O 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly S@r 50 55 ~
Gl y Ser Gly Thr Ser Tye Ser Leu Thr tle Ser Ser Mee Clu Thr Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tye Cys Gln Gln Trp The Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gl y Ala Gly Thr Arg Val Glu Leu Lys 100 105
5 <210>20
<211> 357
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<220> 10 <221> CDS
<222> (1 )..(357)
<220>
<221> rasgo_mise
<222> (1 )..(357)
15 <223> TMC-2206 VH <:400> 20
c•• • t. c•• tt• ••• .a. tca ••• cct "C ct. gtg gcg ccc tc. ca. 4B Gln Val Gln Leu Ly' Glu Sor Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15
agc ctg tcc ate oct tgt act gtc tct .ga ttt tca tta .cc aac t.t 96 Ser Ceu Ser ne Thr Cy, Thr V.l Ser Gl, Phc Ser Leu Thr A,n Tyr 20 25 30
ggt att c.c t •• .tt c.c C" cct ce• ••• .....t ct. ••• t •• cc,
'"
Gl, Ile His Trp Val Ar. Gln Pro Pro Gly Ly, Gly Leu Glu Tr? Leu 35 40 45
••• gt. ata tO. .ct cot g.' ttc .c. aat tat ••t tco gct etc .tg 192 Oly Val Ile Tr? Al. Ar. Oly Phe Thr "n Tyr A,n Ser Al. Leu Met 50 55 60
tcc ••• ct. atc atc .ca ... ••c a.t tcc c.g ••t cae .tc ttc tt. 240 Ser Ar. Leu Ile Ile Thr Lya Aa? "n Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80
.aa ato ••e agt cla cae cct gat ••c tca .cc act laC ttc tgt gcc 288 Lys Mot Aan Ser Leu Gln Pea Asp Asp See Ala The Tye Ph. Cy, Ala 85 90
"
• g. .C• aae o·e .00 otc tat tat .ct ato ._c tac tgg ggt c'g g.-336
Arg Al. Aan A'P Oly Val Tye Tyr Al. Met A'? Tye Trp Gly Gln Oly 100 lOS 110
.cc tc. gte .cc ." tec ". 357
Thr See V.l The V.l See See 115
<210> 21
<21 1> 119
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
<400> 21
Oln v.l Gln Leu Lys GIl,] Ser Cly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu The Asn Tyr 20 25 30
Gly 11e His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
.,
35 'O
Gly V" Ile Trp Ala Arg-Gly Phe Thr Asn Tyr A,n Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Leu Ile Ile The Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Aso Ser Leu Gln Pro Asp Asp Ser Al.. Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Acg Ala Asn As? ely Val Tyr Tyr Ala Met Asp Trr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Ser v,l The val Ser Ser 115
<210> 22
<211>31
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC-2206-r5' [cebador d irecto) <:400> 22 cccgaattca caggtgcagl tgaaggagtc a 31
<210> 23 <211>35
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC-2206-r3' [cebador inverso) <:400> 23 cgggatcctt aggatcattt accaggagag tggga 35 <210>24 <211>31
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC-2206-k5' [cebador directo) <:400> 24 cccgaattca caatttgttc tcacccaglc t 31
<210> 25 <211>35
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC-2206-k3' [cebador inverso) <:400> 25 cgggatcctt atctctaaca ctcattcctg ttgaa
<210> 26 <211>22
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> secuencia líder Igkappa (Igk) <:400> 26
Met Glu Th~ Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu ~eu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gl y G1y Ser Thr Gly Asp 20
<210> 27 <211>76
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Oligonucleótidos Igkappa-S [Cebador]
<400> 27
tcgagccacc atqgaqacag acacactcct qctatgqgta ctqctqctct gqqttccaqq
"
ttccactgga gacgcg 16
<210> 28
<211> 76
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Oligonucleótidos Igkappa-AS [Cebador]
<400> 28
aattcgcgtc tccagt9gaa cctggaaccc agagcagcag tacccatagc agg3gtgtgt 60
ctgtctccat qqtggc 76
<210> 29
<211> 33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC2206VH-hlgGI/4Fc-Sall
<400> 29 cttggtcgac gctgaggaga cggtgactga ggl 33
<2 10> 30 <211>30
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hlgG1f4Fc-Sall-F [cebador directo]
<400> 30 Icagcgtcga ccaagggccc atcsglcttc 30
<210> 31 <211>48
<212> AON
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hlgG1f4Fc-Notl-R [cebador inverso]
<400> 31 aagggaagcg gccgcttatc atttacccyg agacagggag aggctctt
<210> 32 <211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC2206VL-hKc-Sall [cebador inverso]
<400> 32 tcgtttgatg tcgaccttgg tcccagcacc gaacgtgag 39
<210> 33 <211>35
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_misc
<223> hKc-Sall-F [cebador directo]
<400> 33 accaaggtcg acatcaaacg aactgtggct gcacc 35
<210> 34 <211>45
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hKc-Notl-R [cebador inverso]
<400> 34 aagggaagcg gccgcttatc arcactctcc cctgttgaag ctctt 45
<210> 35 <211>29
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC-2206VLwt-hKc-F [cebador directo]
<400> 35 agggtggagc tgaaacgaac tgtggctgc 29
<210> 36 <211>24
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> TMC-2206VLwt-hKc-R [cebador inverso] <:400> 36 tegtttcage tecaccctgg teee 24
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> proteína de la línea germinal A14 VL <:400> 37
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr l1e Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly I le Gly Asn Tyr 20 2~ 30
Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Ly~ Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly val Pro Ser Arq Phe Se~ Gly ~O 55 60
Ser G1y Ser Gly Thr Asp phe Th~ Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu 85 90 95
Thr fhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu l1e Lys 100 105
<210>38
<211> 10
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> FVI/ 4 de la cadena ligera kappa madura <:400> 38
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10
<210>39
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221 > RASGO_MiSe 5 <223> proleina de la línea germinal 4-59 VH
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln GIu Ser Gly Pro GIy Leu Val Lys Pro Ser GIu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr V..,l Ser Gly GIy Ser l1e Ser Ser Tyr 20 25 30
Tyc Trp Ser Trp l1e Arq Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu GIu Trp 11e 3S 40 45
GIy Tyr lle Tyr Tyr Ser GIy Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 A
Ser Arg Val Thr l1e Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 6S 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala A.sp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
'5 • U
Arg His Asn Ser Ser Ser Trp Tyr GIy Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gln GIy Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 40
<211 > 119 10 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> RASGO MiSe
<223> hVH1 .0
15 <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln GIu Ser Gly Pro Gly Leu Val ~y5 Pro Ser Glu
s 10 15 Thr Leu Ser Le u The Cys The Val Ser Gly Phe Ser Leu The Asn Tye 20 25 30 Gl y lle Hi s Trp Val Arg GLn Pro Pro Gly Lys Giy Leu Glu Trp Leu
35 40 \15
Gly val I le Trp Ala AIg GLy Phe The As n Tye Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Leu The lle Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gl n val Ser Leu 65 70 75 BO
Lys Leu Ser Ser Val The Ala Ala As p Th¡; Ala Va l T ye Plle Cys Ala 85 90 95
Acg Ala Asn As p Gly val Tye Tye Ala Met Asp Tye Trp Gly Gin Gly 100 105 110
The Leu Val The Val Ser Ser 115
<210> 41
<211> 106
<212> PRT 5 <213> Homo Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL1.0
<400> 41
Gi n Phe Val Leu The Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val The Pro Giy
1 5 10 15
Glu Lys Val The I1e The Cys Ser Ala As n Ser Ser Val Asn Tye lle 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gin Ala Pro Ly! Lys Trp 11e Tyr 35 40 45
Asp The Ser Lys Leu ~la Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly The Asp Tyr The Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 10
6S 10 15 80
Asp Ala Ala Thr Tye Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly The Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 42
<211> 48
<212>
AON
<212>
AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH3.0-F [cebador directo]
<:400> 42
agcgtggaca ccagcaagaa ccagtlcagc ctgaagctga gcagcgtg
48
<210> 43
<211>51
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH3.0-R [cebador inverso]
<400> 43
gtlcttgctg gtgtccacgc tgalgglcac gcgggacalg agagcgclgl 1
51
<210> 44
<211> 48
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH4.0-F [cebador directo]
<:400> 44
cclccaggca agggcclgga glggalcggc gtgalatggg ctcgcggc
48
<210> 45
<211>51
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221 > rasgo_mise
<223> hVH4.0-R [cebador inverso]
<:400> 45
ctccaggccc t1gcctggag gctggcgtat ccagtggatg ccatagttgg t
51
<210> 46
<211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL3.0-F [cebador directo]
<:400> 46
cccaagctcc tgatctatga cactlccaag ctg 33
<210> 47
<211> 42
115
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL3.0-R [cebador inverso]
<400> 47
agtgtcatag atcaggagcl tgggggcclg gtcgggcttc Ig
42
<210> 48
<211> 45
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL4.0-F [cebador directo]
<400> 48
gacgcgaatt cagacglggl galgacccag Ictccagcat tcctg
45
<210> 49
<211>24
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH2.0-F [cebador directo]
<400> 49
gtgaccatca gcaaggacaa cagc
24
<210> 50
<211>45
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH2.0-R [cebador inverso]
<400> 50
gctgttgtcc ttgctgalgg tcacgcggga catgagagcg ctgtt
45
<210> 51
<211>27
<:212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH5.0-F [cebador directo]
<400> 51
atcggcgtga tatgggctcg cggcttc
27
<210> 52
<211>45
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH5.0-R [cebador inverso)
<:400> 52
gccgcgagcc catatcacgc cgatccactc caggcccttg cctgg
45
<210> 53
<211>24
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH6.0-F [cebador directo)
<:400> 53
atatgggctc gcggcttcac aaac 24
<210> 54
<211>24
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH6.0-R [cebador inverso)
<:400> 54
gtttgtgaag ccgcgagccc atat 24
<210> 55
<211>45
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH7.0-F [cebador directo)
<:400> 55
gccgcggaca ccgccgtgta ctactgcgcc agagccaacg acggg
45
<210> 56
<211>27
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH7.0-R [cebador inverso)
<:400> 56
gtagtacacg gcggtgtccg cggcggt 27
117
<210>57
<211> 27
<212> AON
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH8.0-F [cebador directo]
<400> 57
atatccaact atggcatcca ctgggtt 27
<210> 58 <211>48
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVH8.0-R [cebador inverso]
<400> 58
ccagtggatg ccatagttgg atatgctaaa Iccagagacg gtacaggt
<210> 59 <211>45
<212> AON
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL2.0-R [cebador inverso]
<400> 59
cagcttggaa glgtcataga tcaatttctt gggggcctgg tcggg 45
<210> 60
<211>45
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL5.Q-F [cebador directo)
<400> 60 gacgcgaatt cagacttcgt gclgacccag tclccagcat Icclg
<210> 61
<211>45
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL6.0-F [cebador directo]
<400>
61
<400>
66
gacgcgaatl cacagttcgt gatgacccag tctccagcat tcctg
45
<210> 62
<211> 45
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL7.0-F [cebador directo]
<:400> 62
gacgcgaatt cagacttcgt gatgacccag tctccagcat tcctg
45
<210> 63
<211>27
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL8.0-F [cebador directo]
<:400> 63
ttcaccttca ccatcagcag cctggag 27
<210> 64
<211> 48
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hVL8.0-R [cebador inverso]
<:400> 64
ctccaggctg ctgatggtga aggtgaagtc ggtgccgctg ccgctgcc
48
<210> 65
<211>28
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hLCQ3-F [cebador directo]
<:400> 65
ccaatcaagc gtgaactaca ttcactgg 28
<210> 66
<211> 48
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hLCQ3-R [cebador inverso]
119
ccagtgaatg tagttcacgc Itgattgggc gctgcaggtg atggtcac
<210>67
<211>23
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Igk-For [cebador directo]
<400> 67 actcclgcta Igggtactgc Igc 23
<210> 68 <211>22
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> hlgG1 Fc-CH1-R [cebador inverso)
<400> 68 gaagtaglcc ttgaccaggc ag 22
<210> 69
<211>22
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> CI-neo-msc3' [Cebador]
<400> 69
ttlcactgca ttctagttgt gg 22
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO MiSe
<223> hVH2.0
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu T~r Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30
Gi y Ile Hi$ Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Giy Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Giy Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys As? Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 10 15 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Pne Cys Al~ 85 90 9S
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Tnr Leu Val Thr val Ser Ser
11 5
<210> 71
<211> 119 5 <212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH3.0 10 <400> 71
Gl" Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys The Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyt 20 25 30
Gly Ile His Trp Val Ar9 Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu )5 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arq Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Het 50 55 60
Ser Arg Val Thr ¡le Ser Val Asp Thr Ser Lvs Asn Gln Phe Ser Leu 65 lO 15 80
LV' Leu Ser Ser Val Tnr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Aso Asp Gly Val Tye Tve Ala Met Asp Tye Trp Gly Glo Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 11>
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL4.0
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 S 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phc Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arq Gln Pro Pro Cly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arq Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 15 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tye Tyr Ala Het Asp Tye Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
11.
<210> 73
<211> 119
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH5.0
<400> 73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 10 1 S 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly [le His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile JS 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys ASp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 6~ 70 75 80
Lys Lcu Ser Ser Val Thr Ala Al~ A5p Thr Ala Val Tye Phe Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Mct Asp Tye Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Lcu Val Thr Val Ser Ser 11>
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
5 <220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH6.0
<400> 74
Gln V~l Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Th~ Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tye 20 2S 30
Gly Ile His Trp Val Arq eln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 3S 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arq Gly Phe Thr A~n Tye Asn Ser Ala Leu Het ~ 55 W
Ser Arq Val Thr 11& Ser Lys Asp Aso Ser Lys Aso eln Val Ser Leu 65 10 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly val TVe Tye Ala Met Asp Tye Trp Gly eln Gly 100 lOS 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 10 115
<210> 75
<211> 119
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
15 <220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH7.0
<400> 75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gl u 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Sc~ Gly Phe Ser Leu Thr ~sn Tyr 20 25 JO
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 3S 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr A~n Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 lOS 110
Thr Leu Val Thr Va l Ser Ser 115
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
5 <213> Horno sapiens
Gln v~l Gl~ leu Gln elu Ser Gly pro ely Leu v~l lys Pro Ser Glu 1 S 10 15
TI" Leu Ser leu Thr CYs Thr val ser Gl, phe ser Ile Ser AS" Tyr
20 2S JO
l~u
Gly Ile His Tr. v~l Arg eln Pro pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
15 40 45
Gl, val 11e Trp .la .r9 Gl, Phe Thr Asn Tyr AS" Ser Ala Leu Met 50 SS 60
ser Arg leu Thr Ile Ser lys ASp Asn Ser l7YS Asn Gln phe Ser ~eu 6S 70 5 80
LyS Leu Ser ser val Thr Ala Ala ASp Thr Ala val Tyr phe C.YS Ala 8S 90 5
Arg Ala Asn ASp Gly val Tyr Tyr Ala Met ASp Tyr Trp Gly eln Gly
100 105 110
Thr Leu val Thr val Ser ser 115
<210> 77
<211> 119
<212> PRT
10 <213> Horno sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH9.0
<400> 77
61n val 61n Leu 61n c;lu ser c;ly pro Gly Leu val Lys Pro Se.. Glu 1 5 10 15
Th .. Leu ser Leu Thr Cys Thr val Ser G1y phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly 11e His Trp val Arg G1n Pro Pro Gly lys Gly Leu G1u Trp x1e 35 40 45
Gly Yal Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
W 55 60 se.. Arg leu Thr Xle ser val ASp Asn Ser lys AS" Gln val Ser leu
65. ro 75 80
lys Leu Ser Ser val Thr Ala Ala ASp Thr Ala Yal lyr Phe c.ys Ala 8S .. S
Arg Ala Asn ASp Gly val Tyr Tyr Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu val Thr Yal Ser Ser 115
<210>78
<211> 119
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO MiSe
<223> hVH10.0
<400> 78
G1n val G1n Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp val Arg Gln pro Pro Gly lys Gly Leu Glu Trp Leu 3S 40 45
Gly val Ile Trp Ala Arg G1y phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Net 50 55 60
ser Arg LI!!U Thr xl e Ser Lys ASP Thr Sl!!r ~Is Asn G1n val Sl!!r Leu
.S 70 80 Lys leu Ser Ser val Thr Ala Ala ASp Thr Ala val Tyr phe Ala
~~s
8S 90 Arg Ala Asn As. .,y Val Tyr 1)11" Ala Met ASp Tyr Trp G1y Gln Gly 100 lOS 110 Th .. Leu Val lh.. val Ser ser
llS
<210> 79
<211> 11 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH11 .0
<400> 79
eln val Gl" Leu eln Glu Ser ely Pro ely Leu val Lys Pro Ser Glu
1 S 10 15
Gl)' Ile His Trp val Ar'g eln pro pro ely Lys Gly U!U Glu Trp Ile lS 40 4S
Gly val Ile Trp Ala Ar'9 ely phe Thr Asn Tyr AS" ser Ala Leu Met ro 55 ~
Ser Arg leu Thr Ile Ser Lys ASp Asn ser LYS Asn eln phe Ser Leu
65 70
lys Leu Ser Ser val Thr 85
Arg Ala Asn ASp Gly val 100
Thl'" Leu v~l Thr val SI!l'"
11'
10 <210> 80 <211>106
<2 12> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
15 <221> RASGO_MiSe
<223> hVH2.0
<400> 80
75 80
Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr PhI! Cys Ala 90 95
TYr Tyr Ala Met ASp Tyr Trp ely Gln ely105 110
Ser
.,.Phe val eeu Th. Gln Ser pro Ala ph. Leu ser val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Olu lys val Th. 11. Th,. Cys Ser Ala AS. ser ser val AS. Tyr Ile 20 25 30
His Trp T)'r eln el" Lys pro AS' 01. Ala Pro l ys ceo Ile Tyr
~!S
35 40
ASP Thr Ser lys Leu Ala Ser Gly val pro Ser Arg phe ser Gly ser
SO SS 60
Oly ser Gly Thr ASp n;' Thr phe Thr lle Ser Ser Leu Glu Ala olu 65 75 80
ASP Ala Ala Thr ~. Tyl" Cys Gl" Gl " Trp Thr Thr Asn Pro eeu Thr
90 95
Pne Gly eln Gl~ Thr Lys val elu Ile eys 10 lOS
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL3.0
<400> 81
01. Phe Va 1 Leu Thr eln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Oly 1 S 10 15
Clu Lys V",l Thr Ile Thr Cys Ser Ala Aso Ser Ser Val A.sn Tyr Il e: 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys PrQ Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tye 3S 40 4S
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arq Phe Ser ely Ser 50 SS 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220> <221> RASGO_MiSe
<223> hVL4.0
<400> 82
Asp Val Val Mee Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val 'l'hr Pro Gly 1 5 10 lS
Glu Lys Val Thr I1e Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val As n Tye I1e 20 25 JO
Mis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 ..O 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arq Phe Ser Gl y Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Gl n Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
5 <210> 83
<211 > 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220> 10 <221> RASGO_MiSe
<223> hVL5.0
<400> 83 Asp Ph. Val Loo Thr Gln Sor Pro Ala Phe ·Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 , la l'
G'u Lys Val Thr Ile Thr ey. Sor Ala Aso Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30
His Trp Tyr Glo Gln Ly~ Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Va l Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tye Tyr Cys Glo Gln Trp Thr The Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe
Gly Gln Gly Thr Lys 100 Val Glu l1e Lys 105
15
<210> 84
<211 > 106
129
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221 > RASGO_MiSe
5 <223> hVL6.0
<400> 84
eln Phe VaL Met Th~ Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tye Ile 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tye 3S 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arq Ph~ Ser Gly Ser SO 55 w
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 7S 80
Asp Ala Ala Thr Tye Tye Cy5 eln eln Trp Thr Thr Asn Pro Leu The 85 90 9S Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 85
10 <211> 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe 15 <223> hVL7.0
<400> 85
Asp Phe Val Het 'I'hr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Va I 'I'hr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Va l Thr Ile 'I'hr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn 'I'yr Ile 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp tle Tyr
35 40 <15
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arq Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Tnr Asp Tyr Tnr Phe Thr tIe Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 60
_~__ ~Tp~~.G~_Th._~._WuTh. 85 90 95
Pne Gly Gln Gly Tnr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210>86
<211> 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO MiSe
<223> hVL8.0
<400> 86
Gln Pne Val Leu Tnr Gln Ser Pro Ala fne Leu Ser val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Tnr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr tle 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr tle Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly eln Gly Thr Lys Val Glu 11e Lys 100 105
<210> 87
<211> 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL9.0
<400> 87
Gln Ph. Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Lcu Ser Val Thr Pro Gly 1 S 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr tIe 20 2S 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp eln Ala Pro Lys Lys Trp 11. Lys 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Lcu Ala Ser Gly Va l Pro Ser Ar9 Phe Ser Gly Ser SO SS 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser ~u e lu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 88
<21 1>106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL 10.0
<400> 88
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr PrO Gl y 1 5 10 IS
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr lle 20 25 30
Mis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp eln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr 35 40 4S
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser AC9 Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr ASp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Se~ Leu elu Ala Cl u 65 70 15 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys eln Gln Tr p Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly eln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<2 10> 89
<211>106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL11 .0
<400> 89
Asp Phe Val Me' Th, Gln Se< ",o Al. Phe Leu Se< Val Th, p,o Gly 1 S 10 15
Glu Ly. Val Th, Ue Th, Cy. Se< .lo Asn Se< Se< Val Asn Ty' Ile 20 2S 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp eln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tye 35 40 4~
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg ~he Ser Cly Ser SO 55 60
Gly Ser Gly Thr As p Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 6S 70 75 SO
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105
<210> 90
<211> 106
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL1.0Q
<400> 90
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phc Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tye Ile 20 25 30
His Trp Tyr eln eln Lys Pro Asp eln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg ~hc Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Sar Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Clu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Al. Th, Tyr Tyr Cyo Gl" Gln T,p Thr Thr Asn Pro Leu Th, 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lya 100 lOS
<210>91
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
5 <220>
<221> RASGO_MiSe
<223> hVL10.0Q
<400> 91
ASp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gl y 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr 1le Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tye Ile 20 25 30
H~s Tep Tye Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Lcu Ile Tye
35 40 45
ASp Tl\r Ser Lys Leu Al a Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser SO 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Ty< 'I'hr Phe Th e He Se< Ser Leu Gl u Ala Glu 65 10 .0
"
Asp Ala Al a Thr Ty< 'Tye Cys eln Gln T<p The Tl\r Asn Pro Leu Th< 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Ly, 100 105
10 <210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220> 15 <221> RASGO MiSe
<223> hVL12.0Q
<400> 92
A,p Phe val. Met Th< Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr P<o Gl y 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr ¡le Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tye Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr 35 40 45
As? The Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arq Phe Ser Gly Ser SO 55 60
Gly Ser Gly The Asp Phe The Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala The Tye Tye Cys Gln Gln Trp The The Aso Pro Leu The 85 90 95
Phc Gly Gln Gly The Lys Val Glu Ile Lys 100 lOS
<210> 93
<211> 222
<212> PRT
5 <213> Ratlus rattus
<220>
<221> RASGO MiSe
<223> Proteína del dominio I de integrina alfa2 de Rata
<400> 93
Ser Pro Asp Phe "In Ser Leu The Ser Phe Ser Pro Ala Val Gln Asp 1 S la 15
val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Aso Ser [le Tye Pro Trp Glu Ala 20 25 30
Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val eln Gly Leu Asp [le Gly Pr o 35 40 45
Ly5 Lys The Gln Val Ala Leu I le Gln Tye Ala Asn Asp Pro Arg Val 50 55 60
Val Phe Asn Leu The The Tyr Lys Asn Ly5 Glu Asp Met Val Gln Ala 65 10 15 80
Thr Ser Glu Thr Arg Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe Lys 85 90 95
Ala Ile Gln Phe Ala Arg Asp Ile Ala Tyr Leu Pro Glu Ser Gly Gly 10 100 105 110
Arg Pro Gly Ala Thr Lys Val Met Val Val Val Thr Asp Gly Glu Ser 115 120 125
His Asp Gly Ser Lys Leu Gln Thr Val lle Gln Gln Cys Asn Asp Asp 130 135 140
Glu l l e Leu Arg Phe Gly lle Ala Val Leu Gly Tyr Leu Asn Arg Asn 14 5 150 155 160
Ala Leu ASp Thr Lys Asn Leu lle Lys Glu ¡le Lys Ala lle Ala Ser 165 170 175
Thr Pro Thr Glu Arg Tye Phe Phe Asn Val Ala Asp Glu Ala Ala Leu 180 185 190
Le u Glu Ly s Ala Gly Thr Leu Gly Glu His lle Phe Ser Ile Glu Gly 195 200 205
Thr Val Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gl n Mct Glu Met Ala Gln 210 215 220
<210> 94
<211> 228
<212> PRT
5 <213> Mus musculus
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> Proteína del dominio I de integrina alfa 2 de ratón
<400> 94
Ser Pro Asp Phe Gln Phe Leu Thr Ser Phe Ser Pro Ala Val Gln Ala 1 5 10 15
Cys Pro Ser Leu Val Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser 20 25 30
lle Tyr Pro Trp Glu Ala Val Lys Asn Phe Leu Val Lys Phe Val Thr 35 40 45
Gly Leu Asp lle Gly Pro Lys Lys Thr Gln Val Ala Leu lle Gln Tye 50 55 60
Ala Asn Glu Pro Arg lle Ile Phe Asn Leu As n Asp ehe Glu Thr Lys 10
65 70 75 80
Glu Asp Het Val Gln Ala Thr Ser Glu Thr Arg Gln His Gly Gly ASp 85 90 95
Leu Thr Aso Thr Phe Arg Ala 11e Glu Phe Ala Arg Asp Tyr Ala Tyr 100 105 110
Ser Gln Thr Ser Gly Gly Arg Pro Gly Ala Thr Lys Val Met Val Val 115 120 125
Val Thr A$p Gly Glu Ser Mis Asp Gly Ser Lys Leu Lys Thr Va l 11e 130 135 140
G1n Gln Cys Asn ASp Asp Glu Ile Leu Arg Phe Gly lle Ala Val Leu 145 150 155 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Aso Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu lle Lys Glu 165 170 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Thr Pro Thr Glu Arq Tyr Phe Phe Asn val 180 185 190
__ ~~~~~Qu~U.Qy_~QyGlu~ 195 200 205
118 Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met 210 215 220
Glu Met Ser Gln
<210>95 <211>26
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Kappa-F
<400> 95
egaaetglgg elgeaccate Igle!1 26 <210>96
<211>41
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Kappa-BamHI-R
<400> 96 aatteggate ettaetaaea eteleecctg ttgaagelet t 41 <210>97
<211> 40
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> VH12.0-(K71V)-F
<:400> 97
gcctgaccat cagcgtggac aacagcaaga accaggtgag
40
<210> 98
<211> 40
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> VH12.0(K71V)-R
<400> 98
ctcacctggt tcttgctgtt gtccacgctg atggtcaggc
40
<210>99
<211> 40
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> VH 13.0-(N73T)-F
<:400> 99
ctgaccalca gcaaggacac cagcaagaac cagglgagcc
40
<210> 100
<211>40
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> VH13.0-(N73T)R
<:400> 100
ggctcaeetg gttettgctg glgleettge Igatggtcag
40
<210> 101
<211> 41
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> VH14.0-(V78F)-F
<:400> 101
gcaaggacaa cagcaagaae cagtttagee tgaagctgag e
41
<210> 102
<211> 41
138
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
5
<223> VH14.0 (V78F)-R
<400> 102
getcagette aggctaaaet ggttettget gttgtcctlg e 41
<210> 103
<211> 648
10
<212> ADN
<213> Macaea fasdcularis
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Dominio 1 alfa2 de Cynomolgus
15
<400> 103
agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc
60
atagatgttg tggttgtgtg tgatgaatca ."atagtattt atccttggga tgcagtagac
120
aattttttgg aaaaatttqt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg
180
t taattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa
240
gaagaaatg/l. t tgtagcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaaCAca
300
ttcqgaqcaa ttcaatatqc a aqililailtat gcctattcólq ca9cttctqq tgggcgacqa
36.
aqt.qct.acga aagtaat.ggt agttqtaact. gacggtgaat. cacatgatgg ttcaatqttq
420
aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agc:agttctt
48.
g99tacttaa acagaaacqc: ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc
540
qctaqtattc caacagaaag cst.csctttttc aatgtgtctg atgaagCagc tctactagaa
600
aaggctggga cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt
648
<210> 104
<211> 648
20
<212> ADN
<213> Macaca mulatta
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Dominio 1 alfa2 de Rhesus
25
<400> 104
agtectgatt
ttciilgctctc agccagettc tcacctgcaa cteagccctg cccttccctc 60
atagatgttg
tggttgtgtg tgatgaatca aatagtattt atcctt999a tgcagtaaag 120
lIattttttgg lIaaaatttgt
acaaggcctg gatataggce ccacaaagac acaggtggqg 180
ttaatteagt
atgccaataa tccaagagtt gtqtttaact tgaacacata taaaaccaaa 240
gaagaaatga
ttgtagcaac ateccagaca teccaatatg gtgqggacct cacaaacaca 300
tteggaqcaa
ttcaatatge aaqaaaoatat gcctattcilg cagct tctqq tqqqcgacga 360
agtgctacga
aagtaatggt agttgtaact gacggtgaat cacatgatgg ttcaatgttq <20
aaagctgtga
ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcaqttctt 460
gggtacttaa
acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc 540
gctagtattc aaggctggga <210> 105
caacagaaag cattaggaga atactttttc aatqtgtctg atgaagcagc tctactagaa acaaattttc agcattgaag gtactgtt 600 ".
<211> 997
<212> AON
5
<213> Homo Sapiens <220>
<221> rasgo_mise <223> Región constante de IgG4
<220>
10
<221> COS
<222> (1) ..(978) <400> 105 ccc acc aag OOc cca Cec OCe Ser Thr Lys ely Pro Ser Val 1 5
cec Phe ccc a, OcO Pro L.u Ah 10 ccc cOc Cec aOO Pro Cy, Ser Aro 15 aoc Ser "
acc Cec oa, a,c aca occ Thr Ser elu Ser Thr Ala 20
,cc ct, O,c t,c ct, ,tc aa, ,ac tac ttc Ala Leu ely Cy, L.u Val Lys Asp Tyr Phe 25 30 96
cee gaa eeg gtg aeq qtg teq tg9 aae tea gge gee etg .ce 89c gge Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser GLy Ala Leu Th, Ser Gly 35 'O 45
gtg cae aee tte eeg get ,ce eta eag tee tea gga cCc cae t.ee etc 192 Val Hls Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Le, Ty' Ser Leu
50 SS 'O
age age gtg gtg aee gtg cee tee age age ce, gge aeg aag aee cae 240 Ser Ser Val Val Thr Val P,o Ser Ser Ser Le, Gly Thr Lys Thr Tyr .5 70 .0
"
aee tge aae gta gat cae aag eee age aac aee aag 9t9 ,ac aag aga ". Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser A," Thr Lys VOll As. Lys Arg 85 90 95
gtt gag cee aaa tat ggt eee cea tge cea tea tge cea gea cct gag 336 Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu 100 105 110
t te etg 999 gga cea tea gte tte et.g tte cee cea aaa eee aag gae 384 Phe Leu Cly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp " 5 120
aet. etc atg ace cee eg9 aee eet gag "gte aeg tge gtg gtg qtg gae 432 Thr Leu Met !le Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140
,c, age eag gaa gae cee gag gte eag tte aae tgg tae gtg gat 9gc 480 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Aso Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 lOO
gtg gOlg gtg eat aat gee aa, aca aa, eeg eg9 gag gOlg cago tte aae 528 Val Glu Val His Asn Ala Ly. Th, Ly' Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 "O "5
agc aeg tae eqt gtg gte age gte etc aee gte e tg cae eag gae t99 Ser Thr Tye Aeg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Mis Gln Asp Trp '" 180 lBS 190
etg aae gge aag gag tae aag tge aag ,Ce tee aae aaa 9ge e tc eeg 62. Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205
tee t.ee ate gag aaa aee at.e tee aaa qee aaa 999 eag cee ega gag
'12
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys lUa Lys Gly Gln Pro Arg Glu 110 215 220
cea eag gtg tae aee etg cee cea tcc eag ,a, gag atg aee aag aae no Pro Gl.. Vdl Ty~ Tlu: Leu Pro Pro Ser Gln Gl, Glu Ht.t. Thr Lys Asn 225 230 235 240
eag gte agc etg aee tgc etg gte aaa ggc ttc tae cee agc gae ate Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile ". 245 250 255
gee gtg 9a9 tgg gag age aat ggg eag eeg gag <I<Ie aae tac .., occ Ala Val Glu Tep Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Th,
L" ."
260 265 270
86.
.c. cct ccc • t. ct• ••c tcc ••c ••c tcc nc nc ctc t.c ••c Thr Pro Pro V.l Leu Asp Ser "p Gl, Sor phe phe Leu Tyr Ser Ar.
215 280 285
cta occ • t. .oc .a. ••c a•• r •• ca. • a. ••• aa< qtc nc tc. tgc Leu Thr Vol Asp Lya Ser Arq Trp Glo Glu Gly Asn v.l Phe Ser C,.
290 295 300 toc • tg at• oat .a. • ct ..c cac tac aca caq aa• a.c ctc 960
ct. cac
Sor Val Met His Glu Ala Leu His Aso His Tyr Thr eln Lys Ser Leu 305 310 315 320
toc ctg tcr ct. ggt ..a t9i!.taggatc cgc'99ccg c '91 Sor Leu Ser Leu ely Ly. 325
<210> 106
<211> 326
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<400> 106
Sor The Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arq Ser 1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30
Pro Glu Pro V.l Thr Val Sor Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 '0 45
Val HilO The Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gl, Leu Tyr Ser Leu 50 55 60
Ser Ser Val Val The Vol Pro Ser Ser Ser Leu Gly The Lys The Tyr 65 70 75 80
The Cys As .... Val Asp His Lys Pro Ser ..n The Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95
Val Glu Ser Lys Tye Gly Pro Pro Cys Pro Ser CyS Pro Ala Pro Glu 100 105 110
Phe Leu Gl, Gl, PI"O Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lya Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr C,a Val Val Val A.sp 130 135 140
Val Ser Gln 145
Glu Asp Pro Glu Val Glo Phe Asn 150 155 Trp Tyr Val Asp Gly 160
Val Glu
Val His Aso Ala 165 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val 180
Val Ser Val Leu Thr Val 185 Leu His Gln Asp Trp 1M
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 1950 200
Ser Asn Lys Gly 205 Leu Pro
Ser Ser 210
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 215 Lys Gly Gln 220 Pro Arg Glu
Pro Gln Val 225
Tyr Thr Leu 230 Pro Pro Ser Gln Glu 235 Glu Met Thr Lys Asn 240
Gln Val
Ser Leu Thr Cys 245 Leu Val Lys Gly 250 Phe Tyr Pro Ser Asp 255 Ile
Ala
Val Glu Trp Glu Ser Asn 260 Gly Gln 265 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 270 Thr
Thr
Pro Pro Val 275 Leu Asp Ser Asp GLy Ser Phe 290 Phe Leu Tyr Ser Arg 295
Leu Thr Val 290
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 295 300 Val Phe Ser Cys
Ser Val 305
Met His Glu Ala 310 Leu His Asn His Tyr 315 Thr Gln Lys Ser Leu 320
5 10
Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 107 <211> 648 <212> ADN <213> HOMO SAPIENS <220> <221> rasgo_mise <223> Dominio I alfa2 humano <400> 107 agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctq cccttccctc 60
5
atagatgtt g tggtggtgtg tgat gaatca aatagtattt atccttggga tgcagta aag aatttttt gg aaaaatttgt acaa9gcct9 gatataggcc ccacaaagac acag9t g999 ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtt taact tgaacacata taaaaccaaa gaagaaatga ttgt agcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaacaca ttcggagcaa ttcaatatgc aagaaaatat gcctattcag cagcttctgg tgggcqacqa agtgctacga aagtaatggt agt t gtaact gacggtgaat cacatgatgg t tcaatgttg aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcagttctt gggtacttaa acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc gctagtattc caacagaaag atactttttc aatgtgtctg atgaagcagc tctactagaa aa99ctgg9a cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt <210> 108 <211> 106 <212> PRT <213> Horno Sapiens <220> <221> RASGO_MiSe <223> hVL 12.0 <400> 108 ASp Phe val Met Thr eln Ser Pro Ala Phe leu Ser val Thr Pro Gly 1 5 · 10 15 120 180 240 300 360 420 480 540 600 648
Glu Lys val Thr Ile Thr Cys ro
ser Ala Asn Ser Ser val Asn Tyr Ile 2S ro
His Trp i~r Gln Gln Lys pro :~p Gln Ala pro Lys
~~s Leu ¡le Tyr
ASp Thr Ser lyS leu Ala Ser ely val SO SS
pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Gly Ser Gly Thr ASP Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
ASp Ala Ala Thr
~r Tyr Cys eln Gln ~~p Thr Thr Asn pro ~~u Thr
10 15
Phe Gly eln Gly Thr Lys val Glu ¡le Ly$ 100 105 <210> 109 <211> 119 <212> PRT <213> Horno Sapiens <220> <221> RASGO_MiSe <223> hVH12 .0 <400> 109
144
Gln val Gln Le.., ciln Glu Ser Gly pro Gly Leu val Lys pro ser Glu 1 S 10 15
n.r Leu ser leu n.r Cys Thr val Ser Gly phe Ser Leu 11>r Asn Tyr
10 2S 3.
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ·Leu
4.
35 es
Gly Vol Ile Trp Ala Arq Gly Phe Thr Aso Tyr A>n Ser Ala Leu He< 55 60
Ser Arq Leu Thr tle Ser Lys Asp Aso Ser Lys Aso Gln Val Ser Leu
65 70 15 BO
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arq Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln GIy 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 110
<211:;.119
5 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220:;.
<221> RASGO_MiSe
<223> hVH13.0
10 <400:;.110
Gln Val GIn Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys ~ro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu The Asn Tyr 20 25 30
Gly Ile His Tep Val Ar q Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Gl u Trp I le 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arq Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arq Val Thr I le Ser Lys Asp Aso Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80
Lys Lcu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Al a Val 1yr Tyr Cys Al a 8S 90 95
Arg Ala Aso Asp GI r Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Glr 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210>111
<211> 119
<212> PRT
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> hVH14.0 <:400> 111
Gln val Gln Leu <>ln Glu Ser <>ly pro Gly Leu val LyS pro Ser Glu 1 5 10 15
Th, Leu ser leo Th, Cys Ttlr val Ser Gly phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30
Gly Ile His Hp Ile Arg <>," ",o pro Gly LyS Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly val ,le Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Me1: 50 55 60
~;r Arg val Ttlr Ile ~~r Lys ASp Asn Ser ~~s AS" Gln val Ser i~U
Lys Leu Ser Ser ~;l Thr Ala Ala ASp ~Sr Ala val Tyr Tyr ~~S Ala
Arg Ala As" Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr leu val Thr val Ser ser 115
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> LCDR1 [N26Q]
<400> 112
ser Ala Gln Ser ser val Asn Tyr Ile His 1 S 10
<210> 113
<211> 681
<2 12> ADN
<213> Rattus rattus
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Dominio I alfa 2 de rata <:400> 113
agtccagact ttcagtcgtt gacaagcttc tcacctgcag ttcaagcttg ccctt.ccct.c 60 gtagatgtcg tagttgtctg tgiltgaa~c8 aacagtattt at.ccctggga agcagtaaag 120 aatt.tettgg aaaagt.tt.gt gcaaggcctg gatataggac ctaaaaagac acaggt.ggcg 180 ttaat.tcaat atgccaacga cccaagagtt gtct.t.taact tgaccactta caaaa<lcaaa 240
gaagatatgg ttcaggccac atccga.gacg cgccagtat g gtggggacct cac"-aacacc 300 ttcaaggcta tccaattt.gc aagagacatt: gcttat.tt:ac cggagtctgq C:999cgcCca 360 ggtgctaCU. aagtcatggt agttgtgact. gatggggaat cccatgatgg gtcgaagctg 420 caaactgtga tccagc<latg ci!tatgatgac gagatactCjla q9ttt99cat agcqgttctt 480 ggat atttaa acagaaat.gc tcttgatact aaa,,-at.c!;aa tcaaagaaat taaagcaatc 5<0
gct8gcac:tc caacggagag qtactttttc aatgtgqc:cg atgaggcggc tcttctggag 600
aaagctCjlgca ct:ct.agggqa gcac:atattc agcattgaag gcactgttca a9ga99"-93c 660
aacttccaga tggaaatggc a 681
<210> 114
<211> 648 5 <212> AON
<213> Mus musculus
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Clan del dominio I alfa 2 de ratón 10 <400>114 agtccagact ttcagttctt gaccagcttt tcacctgcaq ttcaggctt.g cccttccctc 60
gtggatgttg tagttgtatg tgatgaatca aacagtattt atccctgqga agcagtaaag 120 aactttttgg taaagtttgt gacaggcctg gatataggac ctaaaaa9ac acaggtggcg 180 ttaattcaat atgccaatga qccgagaatt ata t ttaact tgaacgattt cgaaaccaaa 240 gaggatatgg tccaggccac atctgagacg cgccaacatg 9t999'9acct cacaaacacc 300 ttcagagcta tcgaattcgc aagagactac: gcttattcac agacttctgg c99gcgccc9 360 ggtgctacaa aagtcatggt agttgtgacc gatggcgagt cccatgatgg gtcgaagctg 420 aaaactgtga tccagcaatg caatgatgac gagatactga gqttcgqcat agcaqt'tctt 480 g9gtatttaa acaqaaatgc tcttgatact aaaaatttaa tcaaagaast aaaagc~att 540 gctaqtactc caaccgagag atactttttc aatqtg9ccq acqaagcggc tcttctqgag 600 aaqqctggaa ctc:tagggga gcaaatattc agcattgaag gcaecgtt 648
<210> 115 <211>6
<212> ADN 15 <213> Horno sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Secuencia aguas arriba ilustrativa del comienzo de la transcripción del gen
<220> 20 <221> rasgo_mise
<222> (2)..(2)
<223> n es a, e, g, 01 <400>115
cncaat 6
<210> 116
<211>6
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Secuencia ilustrativa en el extremo 3' del gen
<400>116 aataaa 6
<210> 117
<211>31
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal F
<400>117 ggggatccag Icctgaatlt lcagclctca 9 31
<210> 118
<211> 27
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal R
<400>118 gggaattcaa cagtaccttc aatgclg 27
<210> 119
<211> 19
<212> AON
<213> Horno sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Cebador directo de dominio I humano
<400>119 ggggatccag Icctgattl 19
<210> 120
<211> 18
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Cebador inverso del dominio I humano <:400> 120 ggaattcaae agtaeett 18
<210> 121 <211>29
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> malphal F
<400> 121 ggggatecag tecagaettt cagttettg 29
<210> 122 <211>28
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> malphal R
<400> 122 tgggaatlca aeaglgcctt caalgelg 28
<210> 123 <211>31
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ralphal F <:400> 123 ggggatecag lecagaeltt cagtegttga e 31
<210> 124 <211>31
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ralphal R
<400> 124 tgggaatlcl gecattteca Iclggaagtt 9 31
<210> 125 <211>34
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal 121V F <:400> 125 eagecctgce ettccctegl agalgttglg gttg
<210> 126 <211>34
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal 121V R
<400> 126 eaaecaeaae alclaegagg gaagggcagg gelg
<210> 127 <211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal E44V F <:400> 127 eaglaaagaa ttttttggla aaalttglca agg 33
<210> 128 <211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal E44V R <:400> 128 eettgacaaa ttttaecaaa aaatteltta elg 33
<210> 129 <211>35
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal Q48T F <:400> 129 ttttggaaaa attlglaaea ggectggala lagge
<210> 130 <211>35
<212>
AON
<211>34
<212>
AON
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Q48T R
<400> 130
gectatalee aggcclglta caaattttte cgggg
35
<210> 131
<211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal N67E F
<400> 131
eagtalgcca algageeaag agttgtgltt aae
33
<210> 132
<211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal N67E R
<400> 132
gttaaaeaca aetettggct cattggcata elg
33
<210> 133
<211>34
<212> AON
<213> horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal V701 F
<400> 133
tgeeaataat eeaagaattg tgtttaaett gaae
34
<210> 134
<211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal V701 R
<400> 134
gttcaagtta aeacaattet Iggattattg gea
33
<210> 135
151
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal V711 F
<400> 135 ecaataatee aagagttate tttaaettga acae
<210> 136 <211>34
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal V711 R
<400> 136 gtgttcaagt taaagataae tcttggatta ttgg
<210> 137 <211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal n60 F
<400> 137 gtgtttaact tgaacgaeta taaaaecaaa gaa
<210> 138 <211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> haplhal n60 R
<400> 138 ttetttggtt ttatagtcgt tcaagttaaa cae
<210> 139 <211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Y77F F
<400> 139 tttaaettga acaeatttaa aaecaaagaa gaa
<210> 140
<211> 33
<212> AON
<213> Hamo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Y77F R
<:400> 140
ttettetttg gttttaaatg tgttcaagtt aaa 33
<210> 141
<211>33
<212> AON
<213> Hamo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal K78E F
<:400> 141
aacttgaaca eatatgaaae eaaagaagaa atg
33
<210> 142
<211>33
<212> AON
<213> Hamo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal K78E R
<:400> 142
eatttettet ttggtttcat atgtgttcaa gtt 33
<210> 143
<211>33
<212> AON
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal Y93H F
<:400> 143
teeeagacat cccaacatgg tggggaeete aea
33
<210> 144
<211>33
<212> AON
<213> Hamo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Y93H R
<400> 144
153
tgtgaggtee eeaecatgtt gggatgtctg gga
<210> 145 <211>39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> ras90_mise
<223> halphal Y93F F
<400> 145 acat99gaga eateccaatt t99t99g9ae etcacaaae
<210> 146 <211>39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Y93F R
<400> 146 gtttgtgagg tcceeaeeaa attgggatgt eteecatgt 39
<210> 147 <211>33
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Q10SE F
<400> 147 ttcggagcaa ttgaatatge aagaaaatat gee 33
<210> 148 <211>33
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal Q10SE R
<400> 148 ggcalallll ellgealall caallgelcc gaa 33
<210> 149 <211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal A 114Q F
<400> 149
aaatatgcct attcacaagc ttctggtggg cgacgaagt
39
<210> 150
<211>39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal A11 4Q R
<400> 150
aettegtege eeaccagaag ettgtgaata ggcatattt
39
<210> 151
<211> 39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal A115T F
<400> 151
aaatatgcct atteagcaae ttetggtggg cgacgaagt
39
<210> 152
<211>39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal A115T R
<400> 152
aettegtege eeaccagaag ttgctgaata ggcatattt
39
<210> 153
<211> 39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal A115Q F
<400> 153
aaatatgcct atteagcaca gtctggtggg cgacgaagt
39
<210> 154
<211>39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal A115Q R
<400> 154
aettegtege eeaccagaet gtgetgaata ggcatattt
39
<210> 155
<211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal R1650 F
<:400> 155
gttcttgggt acttaaacga caaegccett gataetaaa
39
<210> 156
<211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal R1650 R
<:400> 156
tttagtatea agggcgttgt egtttaagta eecaagaae
39
<210> 157
<211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal N1660 F
<:400> 157
ettgggtaet taaaeaggga cgeeettgat aetaaaaat
39
<210> 158
<211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal N1660 R
<:400> 158
atttttagta tcaagggcgt eeetgtttaa gtacccaag
39
<210> 159
<211> 40
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
156
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal E195W F
<400> 159
ttcaalglgl etgaltggge ageletaeta gaaaaggelg
40
<210> 160
<211> 40
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal E195W R
<400> 160
eageettlle tagtagagel geecaalcag acacallgaa
40
<210> 161
<211>38
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal K40D F
<400> 161
alccllggga Igcaglagae aalllttlgg aaaaalll
38
<210> 162
<211>38
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal K40D R
<400> 162
aaatllllee aaaaaattgl elaelgeate ccaaggat
38
<210> 163
<211>39
<212> AON
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal R69D F
<400> 163
cagtalgcca alaalccaga egltglgttt aactlgaae
39
<210> 164
<21 1>39
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
157
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal R69D R <:400> 164 gttcaagtta aacacaaegt ctggattatt ggeataetg 39
<210> 165 <211>36
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> halphal N73D F
<400> 165 aatccaagag ttglgttlga ettgaacaea lataaa 36
<210> 166 <211>36
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal N73D R
<400> 166 tttatatgtg ttcaagtcaa acacaaetct tggatt 36
<210> 167 <211>39
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal Q89H F
<400> 167 algattglag caacaleeca cacaleccaa lalgglggg 39
<210> 168 <211>39
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> ha lphal Q89H R
<400> 168 atgattgtag caacateeca cacateccaa latggtggg 39
<210> 169
<211> 40
<212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> malphal H93Y F
5 <:400> 169 eacalclgag acgegccaal algglgggga ecleacaaac 40
<210> 170
<211>40
<212> AON 10 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> malphal H93Y R
<400> 170 15 glllglgagg Iccccaceal allggegcgl elcagalglg 40
<210> 171
<211> 216
<212> PRT
<213> Macaea fascicu laris 20 <220>
<221> RASGO_MiSe
<223> Cynomologus <:400> 171
Ser Pro Asp Pne Gln Leu Ser Ala Ser Pne Ser Pro Ala Thr Gln p~o 1 5 10 15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser 20 25 JO
rle Tyr Pro Trp Asp Ala Val Asp Aso Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln 35 40 45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Le u Ile Gln Tyr 50 55 60 Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Aso Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys 65 70 75 80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Glo Tyr Gly Gly Asp 85 90 95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala ¡le Gln Tyr Ala Arq Lys Tyr Ala Tyr 100 105 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val 115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile 130 135 140
Asp Gln Cys Aso Mis Asp Asn lle Leu Arg Phe Gly lle Ala Val Leu 145 150 ISS 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Ly~ Glu 165 170 175
lle Lys Ala 11e Ala Ser lle Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phc Asn Val 180 185 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu G1y Glu Glo 195 200 205
Ile Phe Ser lle Glu Gly Thr Va l 210 215
<210> 172
<211> 216
<212> PRT
5 <213> Macaca mu latta
<220>
<221> RASGO_MiSe
<223> Rhesus
<400> 172
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro 1 5 10 15
Cys Pro Ser Leu lle Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser 10 20 25 30
lle Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln 35 40 45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr 50 55 60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys 65 70 75 80
Glu Glu Met lle Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp 85 90 95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala I le Gln Tyr Ala Arg Lys Tye Ala Tyr 100 105 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arq Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val 115 120 125
Val Thr Asp Gly Clu Ser His ASp Cly Ser Met Leu Lys ALa val 11e 130 135 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu 145 150 155 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Aso Ala Leu Asp Thr Lys As n Leu lle Lys Glu 165 170 175
lle Lys Ala lle Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr ph~ Phe Aso Val 180 185 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln 195 200 205
I l e Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val 210 215
<210> 173
<211> 1435
<212> AON 5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Cadena Pesada de hvH14.0 IgG4
<220> 10 <221> COS
<222> (22) .. (1416)
<400> 173
tctcgagaag ctteeaccat 9 gag aea gae aea etc etg eta tgg gta c'. 51 Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu 1 5 10
ctg cte tgg gtt cc, ggt tec aet 9ga eag gtg eag ttg eag ,C. 99 Leu Leu Trp Val P,o Gly Ser Thr Gly Gln vdl Gln Leu Gln Glu Se<
.'.
15 20 25
9gc eet gge etg gtg aag eee age gag aee etg age ctg acc t gt .cc Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Th, 30 35 '0
gte tet gga ttt age tta aee aae tat ••c otc cae tgg ata ege cag 195 Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 11e His Trp Ile Arg Gln 45 50 55
eet cea gge aag gge etg tgg etg ••c ," tgg get c.c ..c 243
.'. .'.
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vol 11e Trp Ala Ar. Gly 60 65 70
tte aea aae tat aac agc get etc atg tee ege gtg dec atc agc aag 291 Phe Thr Aso 'l'yr Aso Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys 75 80 85 90
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<210> 174
<211> 465
<212> PRT
5 <213> Horno Sapiens
<400> 174
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 210 215 220
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Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 1le S e r 260 265 270
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Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Yal Asp Gly Yal Glu Val His Asn 290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arq Val 305 310 315 320
Yal Ser Yal Leu Thr Yal Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 11e Glu Lys 340 J45 350
Thr [le Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arq Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 315 380
Cys Leu Yal Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 38S 390 395 400
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Asp Ser Asp Gly Ser Poe Phe Leu Tyc Ser Arq Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430
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Lys
46'
<210> 175
<211> 1435
5 <212> ADN
<213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Cadena Pesada de hvH12.0 IgG4
<220>
5 <221> CDS
<222> (22) .. (1 416)
<:400> 175
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255 260 265
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<210> 176
<211> 465
<212> PRT
5 <213> Horno Sapiens
<400> 176
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115 120 125
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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Se< Val Val Thr 195 200 205
V.l Pro Ser Ser Ser Leu Gly The Lys Thr Tyr Thr Cvs ",so Val ",sp 210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lvs Val Asp LVs Arq Val Glu Ser Lys Ty< 225 230 235 240
Gly Pro Pro Cys ",o Ser Cys Pro Al a Pro Glu Phe Leu Gly Gly 245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 11e Ser 260 26S 270
Arg Thr Pro Glu Val The Cvs V.l Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 215 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tye Val Asp Gly val Glu Val His Asn 290 295 '00
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 30S 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415
Asp Ser ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430
Ser Arg Trp Gln GIu Gly Aso Val Phe Ser Cys Ser Val Met Mis Glu 435 440 445
Ala Leu Mis Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460
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4.5
<210> 177
<211> 744
<212> ADN
5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Cadena ligera de VL 10.0Q
<220>
10 <221> CDS
<222> (22) .. (720)
<400> 177
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tgc c.g c.g tgg .cc .cc aac cc. ctg .cc Uc ggc c., ggc .cc aag 387 Cy, Cln Cl n Trp Thr The ASn · Pro Leu The Phe Cly eln e l y The Ly, 110 115 120
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Pro Ser A.p Cl u Cl n Leu Ly' Ser Gly Thr A" Ser V.l Val Cy, Leu
140 145 150
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ggc ctg 'gc tcg cec gte ... "g .gc Uc aac .gg gga g.g tgt 720 elV Leu S.. Ser Pea v.l The LV' Ser Phe Asn Arg Cly Clu Cy, 220 225 230
tqataqqatc cgcqqccqca taqq
'44
<210> 178
<211 > 233
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<400> 178
Met Glu Thr A,p Thr Leu Leu Leu 'I'rp V.l Leu Leu Leu Trp v" Pro 1 S 10 15
Glv Ser Thr Gly Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser 20 25 30
Val Thr Pro GIV Glu Lys Val Thr ¡ le Thr CVs Ser Ala Gln Ser Ser 35 40 45
Val Asn TVr ¡le His Trp Tvr eln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys 50 55 60
Lys Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Lcu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser 85 90 95
Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Glo e lo Trp Thr Thr 100 105 110
Aso pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 11e Lys Arg Thr lIS 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glo keu
130 135 140
Lys Ser Gly The Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Aso ASO Phe Tye Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gl y 165 170 175
Aso Ser Gln Glu Ser Val 1-hr elu Glo Asp Ser Lys Asp Ser The Tye 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205
Lys Val Tye Ala Cys Glu Val Thr His Glo Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gl y Glu Cys
225 230
<210> 179
<211> 1460
<212> AON
5 <213> Homo Sapiens
<220>
<221> rasgo_mise
<223> Cadena Pesada de h2206-VH1 9 IgG1 (OANS); Posiciones -24 a -5 es la secuencia líder; Posición-4
a -1 son aminoácidos extra; DANS en las posiciones -4 a -1 es suprimido preferiblemente
10 <220>
<221> COS
<222> (22)..(1440)
<220>
<221> malyéplido
<222> (94) ..(1440)
<:400> 179
at.aggct.agc ct.cqagccac e a<g g.g .c. g.c aca ctc ct, cta tgg ,ta 51
Met Glu The ...The Lou Leu Leu Te. val
-20 -15
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cag ttg cag gag cea g,c ce< g,c e<g gtg aag ccc agc gag acc e<g 141 Gl n Leu Gln Glu Se< Oly Peo Gly Leu Val Ly. Peo Ser Glu The Leu 5 10 15
agc ctg acc tgt .cc gtc tct gga <tt .gc tte .cc aec tat ggc otc 195 See Leu To< Cy' Thr Val See Gly Phe See Leu The A,n Tye Gly !le 20 25 30
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55 60 65
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His A,n Mis Ty' Th, Oln Lya S" L,u Se< Leu se, P,o Oly Ly' 435 440 44'
tgataaqcg9 ccgcttccct. 1460
<210> 180
<211> 473
<212> PRT
5 <213> Homo Sapiens
<400> 180
Met Glu Thr Aa, Th, Leu I.eu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val ",o -20 -15 -10
Gly Ser Thr Oly Asp Ala Aso Se< Oln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly -S -1 1 5
P,o Oly Leu Val Ly, P,o Se, Glu Th:r: Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 10 lS 20
Se< Gly Phe Ser Leu Th, ASTI Tyr Gly Ile His Trp !le Arg Gln 'ro 25 30 35 .0
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly V"
Ile Trp Ala Arg Oly 'he
.,
'O
"
Thr Aso Tye A,n Ser Ala Leu Met. S.. Arg Val Thr 11. se, Lys Asp 60 70
"
Aso Ser Ly, Asn Gln Val Ser Leu Ly, Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 80 85
Aap Thr Al.. val Tyr Tyr Cy' Ala Arg Ala Asn A" Gly Val Tyr Tyr 90 95 100
Ala Met ASp Tyr Trp G1y eln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala lOS 110 120
11'
Ser Thr Lys G1y Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 125 130 135
Thr Ser G1y G1y Th r Ala Ala Leu G1y Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 140 150
14'
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser G1y Ala Leu Thr Ser G1y 155 160 16'
Val His Thr Phe Pro Ala V.l Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 1'0 180
'75
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu G1y Thr Gln Thr Tyr 190 195 200
'8'
Ile Cys Asn Val Asn lIis Lys Pro Ser A!'In TIH ' Ly!l Val As p Lya
Lya 20' 210
val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Peo 220 225 230
Ala Pro Glu Leu Leu G1y Gly Pro Ser Val ?hliJ Leu Phe Pro Pro Ly:s
,.,
235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met !l. Ser ArQ Thr Pro Glu Val The Cys Val 250 255 260
Val Val Asp Val Ser Mis Glu Asp Pro Clu val Lys P~e Asn Trp Tyr 265 270 275 280
Val Asp G1y Val Glu val His Asn Ala Lys Tnr Lys Pro Arg Glu Glu 285 290
",
Gln Tye Asn Ser Thc Tye Acg Val Val See Val Leu Thr Val Leu Hi! 300 305 310
Gln Asp Trp Leu Asn Gl y Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys31' 320 32'
>la Leu Pro A.la Pro Ile Glu Lys The Ile Ser Lys A.la Lys Gly Gln 330 33' 340
Pro Arg Glu Pro Gln v~l Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 345 350 355 360
Thr Lys Asn Gln V~l Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 365 370 375
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Aso Gly Gln Pro Glu Aso Asn 380 385 390
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 395 400 -405
Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly ASA Val 410 415 420
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Mis Asn His Tyr Thr Glo -4 25 430 -435 440
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro G1y Ly,
44'
<210> 181
<211> 469
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO MISC
<223> Cadena Pesada de hVH14.0 IgG1 [DANS-Suprimido]
<400> 181
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cy5 Thr Val Ser Gly Phe Ser 35 40 45
Leu Thr Asn Tyr Gly Ile Mis Trp lle Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly 50 55 60
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tye Asn 10 65 70 75 80
Ser Ala Leu Met Ser Ar9 Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 lOS 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn A,p Cly Val Tyr Tyr Ala Het Asp Tyr 115 120 125
Trp Gly cln Gly Thr Leu V.l Thr Val Ser Ser Alo Ser Tnr Lys Gly 130 1'5 140
Pro Ser Val Pne Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Pne Pro Glu Pro Val 165 170 175
Thr va l Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val Hi.:¡¡ Tnr Phe 180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205
Thr Va.l pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr J le Cys As n Val 210 215 220
As:'! His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Va l Asp Lv> Lys Val Glu Pro Ly, 225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cya Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Tnr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285
Ser His Glu As p Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val 290 295 '00
Glu Val His Asn Ala Lv> Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser '05 "0 315 320
Thr Tyr Arq Val Yal Ser Yal Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu ~ro Ala 340 345 350
Pro rle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arq Glu Pro 35S 360 365
Gln Val Tyr Thr L8u Pro Pro Ser Arq Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tye Ser Lys Leu 420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser AIg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 44S
Val Met Mis Glu Ala Leu Mis Asn Mis Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
<210> 182
<211> 469
<212> PRT 5 <213> Horno Sapiens
<220>
<221> RASGO_MISC
<223> Cadena Pesada de hVH12.0 IgG1 [DANS-suprimido]
<400> 182
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 lO 15
Gly Ser Thr Gly Gln Yal Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly ?he S~r
35 40
Leu Thr Aso Tye Gly Ile His Trp Ile Arq Glo ''0 Pro Gly Lys Gly 50 55 60
Leu Glu Trp Leu ely Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Tne Aso Tye .s. 65 70 75 80
Ser Ala Leu Me t Ser AIq Leu Tnr Ile Se, Lys Asp Aso Ser Lys Aso 85 90 95
Glo val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val The Ala Ala Asp The Ala Val 100 105 110
Tye Tye Cys Ala Arg Ala Aso Asp Gl)' Val Tye Tye ." Met Asp Tye 115 120 125
Trp Gly Gln Gly The Leu Val The Val Ser Ser .lo Ser The Lys Gly 130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser The Ser Gly Gly 145 150 155 160
The Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys ASp Tye Phe Pro Glu 'm val 165 170 175
The Val Ser Trp Aso Ser Gly Ala Leu Toe Ser Gly Val His The Phe 160 185 190
Pro Ala Val Leu Glo Ser Ser Gly Leu Tye Ser Leu Ser Ser Val val 195 200 205
The Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly The Cln Thr Tye Jle Cys Aso voll 210 215 220
Aso His Lys Pro Ser 'sn The Lys Val Asp Ly. Lys Val Glu Pro Ly. 225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Th, His Thr Cys Pro ",o Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 2'10
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Va l Thr Cys Val Val Val Asp Val 215 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Ly5 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335
Asn Gly Ly5 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350
Pro Ile Glu Ly5 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365
eln val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Ly5 Asn Gln 370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Ly~ Gly Phe Tye Pro Ser Asp rle Ala 385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp G1y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ly5 Leu 420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr G1n Lys Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
<210> 183
<211>24
<212> PRT
5 <213> Hamo sapiens
<400> 183
His Asn Ser Ser Ser Trp Tyr 01y Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Cly Gln 5 10 15
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 20
<210> 184
10 <211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 184
Glu Glu Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 1 5 10 15
Glu He Lys
<210> 185
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región VH humanizada
<220>
<221> VARIANTE
<222> (30) .. (30)
<223> Xaa en la posición 30 puede ser Thr o lIe
<220>
<221> VARIANTE
<222> (31) .. (31)
<223> Xaa en la posición 31 puede ser Asn o Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (37). .(37)
<223> Xaa en la posición 37 puede ser Val o lIe
<220>
<221> VARIANTE
<222> (48) .. (48)
<223> Xaa en la posición 48 puede ser Leu o lIe
<220>
<221> VARIANTE
<222> (67) .. (67)
<223> Xaa en la posición 67 puede ser Val o Leu
<220>
<221> VARIANTE
<222> (71 ) .. (71)
<223> Xaa en la posición 71 puede ser Lys o Val
<220>
<221> VARIANTE
<222> (73) .. (73)
<223> Xaa en la posición 73 puede ser Asn o Thr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (78) .. (78)
<223> Xaa en la posición 78 puede ser Val o Phe
<220>
<221> VARIANTE
<222> (94) .. (94)
<223> Xaa en la posición 94 puede ser Phe o Tyr
<400> 185
Gl n Val GI" Leu Gln Glu Ser Gly P~o Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 S 10 15
Thr Le u Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa Tyr 20 25 ~
Gly 11e His Trp Xaa Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met SO SS 60
Ser Arg Xaa Thr 11e Ser Xaa As p Xaa Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu 6S 70 15 80
Lys Leu Ser Ser val Thr Al a Ala Asp The Ala Val Tyr Xaa Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gl y 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 11 5
<210> 186
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región VL humanizada
<220>
<221> VARIANT
<222> (1). _(1)
<223> Xaa en la posición 1 puede ser Gin o Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)__ (2)
<223> Xaa en la posición 2 puede ser Phe o Val
<220>
<221> VARIANT
<222> (4) __ (4)
<223> xaa en la posición 4 puede ser Leu o Met
<220>
<221> VARIANT
<222> (45) .. (45)
<223> xaa en la posición 45 puede ser Lys o Leu
<220>
<221> VARIANT <222> (46) ..(46)
<223> xaa en la posición 46 puede ser Trp o Leu
<220>
<221> VARIANT 5 <222> (48) __(48)
<223> Xaa en la posición 48 puede ser Tyr o Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> (70) ..(70) 10 <223> Xaa en la posición 70 puede ser Tyr o Phe
<400> 186
xaa xaa val xaa Th,. Gln ser pro Ala phe Leu ser val Thr pro Gly
1 5 10 15 Glu lys val Th,. Ile Th,. Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 ro His Trp TY, r eln Gln Lys Pro ASP eln Ala pro Lys xaa Xaa Ile Xaa
35 40 45 ASp Thr ser Lys Leu Ala Ser Gly val Pro Ser Arg phe Ser Gly ser SO 55 00
Gly Ser Gly Thr ASP Xaa Thr phe Th,. ¡le Ser ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 ASp Ala Ala Thr ~r Tyr Cys el" Gln ~óP Thr Thr Asn Pro ~;u Thr
phe Gly eln Gly Thr Lys val Glu xle lys

Claims (36)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado que comprende:
    (i)
    una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) HCOR1 (GFSLTNYGIH, SEO ID NO: 1), (b) HCOR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEO ID NO: 2) y (e) HCDR3 (ANOGYYYAMDY, SEO ID NO: 3); y
    (ii)
    una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de (a) una LCOR1 seleccionada entre SANSSYNYIH (SEO ID NO: 4) o SAOSSVNYIH (SEO ID NO: 112), (b) LCOR2 (OTSKLAS; SEO ID NO: 5) y (c) LCOR3 (OQWTTNPLT, SEO ID NO: 6)
  2. 2.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 185, (b) la región va riable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO: 186, o (c) tanto (a) como (b).
  3. 3.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde (i) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 185 en la que (a) la posición 71 es Lys, (b) la posición 73 es Asn, (c) la posición 78 es Yal, o (d) cualquier combinación de (a) -(e); (ii) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 186 en la que (a) la posición 2 es Phe, (b) la posición 45 es Lys, (c) la posición 48 es Tyr, o (d) cualquier combinación de (a) -(c); o (iii) tanto (i) como (ii).
  4. 4.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los SEO ID NO: 70-79 y los SEO ID NO: 109-111, (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el SEO ID NO: 41 , los SEO ID NO: 80-92 y el SEO ID NO: 108; o (c) tanto (a) como (b)
  5. 5.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada comprende adicionalmente una regiÓfl FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos WGOGTLVTVSS (SEO ID NO: 13)
  6. 6.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena ligera comprende adicionalmente una región FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos FGOGTKVEIK (SEO ID NO: 38).
  7. 7.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo reconoce el dominio I de la integrina 02 humana.
  8. 8.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a la integrina a2131.
  9. 9.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a un epitopo de la integrina 02, comprendiendo el epítopo·
    (a)
    un residuo de Lys correspondiente a la posición 192 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posición 40 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 11 ,
    (b)
    un residuo de Asn correspondiente a la posición 225 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 02 mostrada en el SEa ID NO: 8 o la posición 73 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 11 ;
    (c)
    un residuo de Gln correspondiente a la posición 241 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posición 89 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEa ID NO: 11 ;
    (d)
    un residuo de Tyr correspondiente a la posición 245 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 mostrada en el SEa ID NO: 8 o la posiciÓfl 93 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 11 ;
    (e)
    un residuo de Arg correspondiente a la posición 317 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posición 165 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina a2 mostrada en el SEO ID NO: 11 ;
    (f)
    un residuo de Asn correspondiente a la posición 318 de la secuencia de aminoácidos de la integrina a2 mostrada en el SEa ID NO: 8 o la posición 166 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEO ID NO· 11 ; o
    (g)
    cualquier combinación de (a) a (f).
  10. 10.
    Un anticuerpo anli-integrina 02 humanizado, en donde el anticuerpo se une a un epílopo de la inlegrina 02, comprendiendo el epitopo·
    (a)
    un residuo de Lys correspondiente a la posición 192 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 02 mostrada en el SEQ ID NO: 8 o la posición 40 de la secuencia de aminoácidos del dominio 1de integrina 02 mostrada en el SEa ID NO: 11 ;
    (b)
    un residuo de Asn correspondiente a la posición 225 de la secuencia de aminoácidos de la integTina 02 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posicioo 73 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEQ ID NO: 11 ;
    (e)
    un residuo de Gln correspoodienle a la posición 241 de la secuencia de aminoácidos de la inlegrina 02 mostrada en el SEQ ID NO: 8 o la posición 89 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 11 ;
    (d)
    un residuo Tyr correspondiente a la posición 245 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posición 93 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 11 ,
    (e)
    un residuo de Arg correspondiente a la posición 317 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posición 165 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 11 ; Y
    (f)
    un residuo de Asn correspondiente a la posición 318 de la secuencia de aminoácidos de la integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 8 o la posición 166 de la secuencia de aminoácidos del dominio I de integrina 02 mostrada en el SEO ID NO: 11
  11. 11 . El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, que es un anticuerpo completo. 12 El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, que es un fragmento de anticuerpo
  12. 13. El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1 unido a una marca detectable. 14 El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1 inmovilizado sobre una fase sólida
  13. 15.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe la unión de la integrina 02 o 02[31 a un ligando de la integrina 02[31 .
  14. 16.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 15, en donde el ligando de la integrina 02[31 se selecciona entre colágeno, laminina, Ecovirus-1 , decorina, E-cadherina, metaloproteinasa I de la matriz (MMP-I), endorrepelinas, colectina y proteina del complemento Clq
  15. 17.
    Un método para determinar si una muestra contiene integrina 02, integrina 02[31, o ambas, que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1, y determinar si el anticuerpo se une a la muestra, siendo dicha unión una indicación de que la muestra contiene integrina 02, integrina 02[31 , o ambas
  16. 18.
    Un kit que comprende el anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1 e instrucciones para su uso para detectar la proteína integrina 02 o 02[31 .
  17. 19.
    Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-integrina 02[31 humanizado de la reivindicación 1.
    20 Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 19
  18. 21 . Una célula anfitriona que comprende:
    (a)
    el ácido nudeico de acuerdo con la reivindicación 19;
    (b)
    el vector de acuerdo con la reivindicación 20; o
    (c)
    cualquier combinación de (a) y (b)
  19. 22.
    Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-integrina 02 humanizado que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 21 en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo
  20. 23.
    El procedimiento de la reivindicación 22 que comprende adicionalmente recuperar el anticuerpo antiintegrina 02 humanizado de la célula anfitriona
  21. 24. El procedimiento de la reivindicación 23, en donde el anticuerpo anti-integrina 02[31 humanizado se recupera del medio de cultivo de células anfitrionas.
  22. 25. Un método de escrutinio que comprende:
    (a)
    detectar la unión de integrina 02 o 02p1 a un anticuerpo que comprende la región VL del SEO ID NO: 19 y la región VH del SEO ID NO: 21 en presencia frente a ausencia de un anticuerpo de ensayo; y
    (b)
    seleccionar el anticuerpo de ensayo si su presencia se correlaciona con la disminución de la unión de la integrina 02 o 02p1 al anticuerpo que comprende la región VL del SEO ID NO: 19 y la región VH del SEO ID NO: 21
    26 El método de la reivindicación 25, en donde la integrina 02 o 02p1 se inmoviliza sobre un soporte sólido.
  23. 27. Un método de escrutinio que comprende:
    (a)
    detectar la unión de la integrina 02p1 a colágeno en presencia de un anticuerpo de ensayo, en donde el anticuerpo de ensayo es un anticuerpo que se une a un dominio I de 02;
    (b)
    detectar la unión del an1icuerpo de ensayo al dominio I de 02 en presencia de iones Mg" ;
    (c)
    detectar la unión del anticuerpo de ensayo al dominio I de 02 en presencia de iones Ca";
    (d)
    detectar la unión del anticuerpo de ensayo al dominio I de 02 en presencia de los medios libres de cationes; y
    (e)
    seleccionar el anticuerpo de ensayo si éste inhibe la unión de la integrina 02p1 al colágeno y se une al dominio I de 02 en presencia de iones Mg" e iones Ca" y medios libres de cationes.
    28 Una composición que comprende el anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  24. 29.
    El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 10 para su uso en un método in vivo para inhibir la unión de leucocitos a colágeno que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de dicho anticuerpo para inhibir la unión de los leucocitos al colágeno.
  25. 30.
    Un método para dirigir una molécula, una composiciÓfl o un complejo a un sitio que se caracteriza por la presencia de un ligando de integrina 02p1 , comprendiendo el método anclar o unir la molécula, composición o complejo al anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de la reivindicación 1.
  26. 31 . El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 16 para su uso como medicamento.
  27. 32. El anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16
    o la composición de la reivindicación 28 para su uso en un método para el tratamiento de un trastorno asociado con la integrina 02p1 seleccionado entre enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, una enfermedad asociada con angiogénesis anormal o mayor que la normal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, sindrome de Sjorgen, esclerodermia, diabetes de inicio juvenil, retinopatia diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades cardiovasculares, psoriasis, cáncer, así como infecciones que inducen una respuesta inflamatoria.
  28. 33.
    El uso del anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para la preparaciÓll de un medicamento para el tratamiento de un trastomo asociado con la integrina a2p1 seleccionado entre enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, una enfermedad asociada con angiogénesis anormal o mayor que la normal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, diabetes de inicio juvenil, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades cardiovasculares, psoriasis, cáncer, así como infecciones que inducen una respuesta inflamatoria
  29. 34.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el trastorno asociado a la integrina 02p1 se selecciona entre esclerosis múltiple, artritis reumatoide, neuritis óptica y traumatismo de la médula espinal.
  30. 35.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el trastorno asociado a la integrina 02131 no está asociado con (a) activación plaquetaria, (b) la agregación plaquetaria, (c) una disminución en el recuento de plaquetas circulantes, (d) complicaciones de sangrado, o (e) cualquier combinación de (a) a (d).
  31. 36.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 33, donde el anticuerpo anti-integrina 02 comprende una cadena pesada que comprende el SEO ID NO· 174 o el SEO ID NO: 176 y una cadena ligera que comprende el SEO ID NO· 17B
  32. 37.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-integrina 02 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende la región VL del SEO ID NO: 19 y la región VH del SEO ID NO: 21 a la integrina 02131 humana o el dominio I de la misma.
  33. 38.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 34, en doode la esclerosis múltiple se caracteriza por la recaída
  34. 39.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-integrina 02 inhibe la unión de la integrina 02131 a colágeno y no es un mimético de ligando
  35. 40.
    Una composición para su uso en el tratamiento de un trastomo asociado con la integrina 02131 seleccionado entre enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, una enfermedad asociada con angiogénesis anormal o mayor que la normal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, diabetes de inicio juvenil, retillOpatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades cardiovasculares, psoriasis, cáncer así como infecciones que inducen una respuesta inflamatoria, comprendiendo la composición el anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables
    41 La composición para su uso en el tratamiento de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el trastomo asociado a integrina 02131 se selecciona entre esclerosis múltiple, artritis reumatoide, neuritis óptica y traumatismo de la médula espinal.
  36. 42. Un paquete que comprende el anticuerpo anti-integrina 02 humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 40 o 41 junto con instrucciones para el lralamiento de un trastomo asodado a integrina 02131
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